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[0001] 本發(fā)明涉及與多囊卵巢綜合征(PCOS)相關(guān)的SNP(單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)所述SNP的探針、芯片、引物和方法。另外，本發(fā)明涉及所述探針、芯片和引物在預(yù)測(cè)和診斷PCOS風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用。

[0002] PCOS是一種表現(xiàn)為存在以下兩種或多種特征的臨床癥狀：長(zhǎng)期排卵過(guò)少或排卵停止、雄激素過(guò)多和多囊卵巢1。作為無(wú)排卵性不孕癥的最常見(jiàn)原因，PCOS影響了6-8％的育齡
婦女2,3。另外，PCOS與重要的內(nèi)分泌代謝紊亂和廣泛范圍的不利后遺癥(包括血脂障礙、動(dòng)
4-6
脈粥樣硬化、胰島素抵抗和2型糖尿病)相關(guān) 。大約50％的患有PCOS的女性存在胰島素抵抗
。7在患有葡萄糖耐量降低(IGT)和糖尿病的女性中，約有20％被確認(rèn)在年輕時(shí)患有PCOS8-10。

[0003] PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到了可遺傳傾向，但遺傳因素和環(huán)境因素之間存在復(fù)雜的相互作用。已經(jīng)對(duì)至少70個(gè)候選基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性研究，這些基因主要涉及生殖激素、胰島素抵抗和慢性炎癥，例如，促卵泡激素受體(FSHR)、細(xì)胞色素P450家族11A(CYP11A)、胰島素受體(INSR)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)11-15；然而，沒(méi)有一個(gè)基因一致地與PCOS相關(guān)聯(lián)16。

[0004] 本發(fā)明涉及與PCOS相關(guān)的SNP。具體地，本發(fā)明提供了與PCOS相關(guān)的SNP標(biāo)記。此外，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)所述SNP的探針、芯片、引物和方法。另外，本發(fā)明還涉及所述探針、芯片和引物在預(yù)測(cè)和診斷PCOS風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用。

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供SNP標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示：SEQ?ID?NO.1，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.2，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.3，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.4，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.5，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.6，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.7，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.8，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.9，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.10，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.11，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.12，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.13，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.14，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.15，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.16，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.17，其中，N為A或T；SEQ?ID?NO.18，其中，N為C或G；SEQ?ID?NO.19，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.20，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.21，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.22，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.23，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.24，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.25，其中N為A或G；SEQ?ID?NO.26，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.27，其中，N為A或T；SEQ?ID?NO.28，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.29，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.30，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.31，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.32，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.33，其中，N為C或T；SEQ?ID?
NO.34，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.35，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.36，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.37，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.38，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.39，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.40，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.41，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.42，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.43，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.44，其中，N為A或G；或SEQ?ID?NO.45，其中，N為C或T。

[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于檢測(cè)在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的探針。

[0007] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供一種用于檢測(cè)在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的芯片，其中，所述芯片包含本發(fā)明的一種或多種探針。

[0008] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供用于確定在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的引物。

[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供一種用于檢測(cè)在SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的試劑盒，其包含本發(fā)明的探針、芯片或引物。

[0010] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供本發(fā)明的引物、探針、芯片和試劑盒在制備用于預(yù)測(cè)或診斷PCOS的試劑中的應(yīng)用。

[0011] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供本發(fā)明的引物、探針、芯片和試劑盒在預(yù)測(cè)或診斷PCOS中的應(yīng)用。

[0012] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供一種基于SNP標(biāo)記預(yù)測(cè)或診斷PCOS的方法，其中，所述方法包括確定在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。
附圖說(shuō)明

[0013] 圖1：GWAS?meta-分析(GWAS?meta-analysis)的全基因組Manhattan圖。通過(guò)質(zhì)量-5
控制的SNP標(biāo)記顯示為負(fù)log10P-值。水平實(shí)線表示10 的P值。對(duì)于那些在以前的GWAS中識(shí)
別的并在此處重復(fù)的標(biāo)記，在50kb與PCOS相關(guān)的SNP內(nèi)的標(biāo)記被標(biāo)記成紅色，而那些在當(dāng)前
研究中首次識(shí)別的標(biāo)記，在50kb與PCOS相關(guān)的SNP內(nèi)的標(biāo)記被標(biāo)記成綠色。

[0014] 圖2：來(lái)自GWAS?I的3個(gè)PCOS基因座(2pl6.3、2p21和9q33.3)的區(qū)域圖。(a-c)用作為基因組位置(hg18)的函數(shù)的P值(以-log10值計(jì))繪制在GWAS中的通過(guò)質(zhì)量控制措施的基
因分型的SNP(a)2pl6.3、(b)2p21、和(c)9q33.3。在各組中，索引關(guān)聯(lián)SNP以菱形表示。繪制估計(jì)的重組率(從HapMap得到)以反映局部LD結(jié)構(gòu)。基因注釋取自美國(guó)加州大學(xué)圣克魯斯分
?；蚪M瀏覽器。LD區(qū)塊是從HapMap計(jì)劃獲得(發(fā)布22，CHB+JPT)。

[0015] 圖3A-3H：8個(gè)新發(fā)現(xiàn)PCOS基因座的區(qū)域圖。用作為基因組位置(NCBI?Build?37)的函數(shù)的meta-分析P值(以-log10值計(jì))繪制通過(guò)質(zhì)量控制的基因分型和填補(bǔ)的(imputed)SNP。
在各組中，基因分型的SNP被繪制成圓，而填補(bǔ)的SNP被繪制成十字。索引關(guān)聯(lián)SNP以紫色表示，Pgwas-meta是初始數(shù)據(jù)集的合并結(jié)果，而PGWAS-REP-Meta是初始和后續(xù)的數(shù)據(jù)集的合并結(jié)果，以菱形(對(duì)于索引SNP)或方形(對(duì)于這一區(qū)域的另一獨(dú)立SNP)表示。繪制估計(jì)的重組率(從l000Genome?ASI得到)以反映局部LD結(jié)構(gòu)?；蜃⑨屓∽悦绹?guó)加州大學(xué)圣克魯斯分?；蚪M瀏覽器。

[0016] 圖4A-4B：45個(gè)SNP標(biāo)記的PCR電泳圖。

[0017] 如發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性”或“SNP”是指當(dāng)在基因組序列中一個(gè)核苷酸(例如，腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G))改變?yōu)榱硪粋€(gè)核苷酸時(shí)發(fā)生的
DNA序列變化或遺傳性變型。

[0018] 在本發(fā)明中，使用按照NCBI?dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)的rs識(shí)別碼(identifier?numbers)識(shí)別SNP。

[0019] 術(shù)語(yǔ)“基因型”指的是個(gè)體或樣品中所含的一個(gè)或多個(gè)基因的等位基因的描述。如發(fā)明中所使用的，對(duì)個(gè)體的基因型和源自該個(gè)體的樣品的基因型沒(méi)有加以區(qū)別。術(shù)語(yǔ)“比值
比(odd?ratio)”或“OR”是指具有所述標(biāo)記(多態(tài)性)的個(gè)體的患病可能性相對(duì)于沒(méi)有該標(biāo)
記(多態(tài)性)的個(gè)體的患病可能性的比率。

[0020] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供SNP標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示：SEQ?ID?NO.1，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.2，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.3，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.4，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.5，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.6，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.7，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.8，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.9，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.10，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.11，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.12，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.13，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.14，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.15，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.16，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.17，其中，N為A或T；SEQ?ID?NO.18，其中，N為C或G；SEQ?ID?NO.19，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.20，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.21，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.22，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.23，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.24，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.25，其中N為A或G；SEQ?ID?NO.26，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.27，其中，N為A或T；SEQ?ID?NO.28，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.29，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.30，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.31，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.32，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.33，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.34，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.35，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.36，其中，N為A或G；SEQ?ID?NO.37，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.38，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.39，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.40，其中，N為A或C；SEQ?ID?NO.41，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.42，其中，N為G或T；SEQ?ID?NO.43，其中，N為C或T；SEQ?ID?NO.44，其中，N為A或G；或SEQ?ID?NO.45，其中，N為C或T。

[0021] 該方面的一種實(shí)施方式提供選自以上標(biāo)記中大于一個(gè)的SNP標(biāo)記，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個(gè)SNP標(biāo)記。

[0022] 在本發(fā)明中，每個(gè)SNP標(biāo)記都是指被認(rèn)為與PCOS相關(guān)聯(lián)的SNP。如在本發(fā)明中所用，SNP標(biāo)記和對(duì)應(yīng)的SNP涉及在核苷酸片段中的相同位點(diǎn)。特別是當(dāng)適用于檢測(cè)在SNP標(biāo)記的N
位點(diǎn)的基因型時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，這意味著檢測(cè)在相應(yīng)SNP的相應(yīng)位點(diǎn)處的基因型，反之亦
然。各個(gè)SNP標(biāo)記的SNP列于下表1中。

[0023] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的探針。

[0024] 該方面的一種實(shí)施方式提供列于表1中的用于各個(gè)SNP標(biāo)記的探針。

[0025] 表1各個(gè)SNP標(biāo)記的SNP和探針

[0026]

[0027]

[0028]

[0029]

[0030] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的芯片，其中，所述芯片包含本發(fā)明的探針。

[0031] 在此方面的一種實(shí)施方式中，所述芯片用于檢測(cè)在本發(fā)明的45個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。更優(yōu)選地，所述芯片包括如SEQ?ID?NO.46-135所示的探針。

[0032] 在此方面的另一種實(shí)施方式中，所述芯片用于檢測(cè)在如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。更優(yōu)選地，所述芯片包含如SEQ?ID?NO.56、57、66、67、88、89、90、91、94、95、102、103、104、105、110、111、
112、113、114、115、118、119、126、127、128、129、130、131、132和133所示的探針。

[0033] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的引物。

[0034] 在此方面的一種實(shí)施方式中，各個(gè)SNP標(biāo)記的引物列于表2中。

[0035] 表245個(gè)SNP標(biāo)記的引物

[0036]

[0037]

[0038]

[0039]

[0040] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的試劑盒，其中，所述試劑盒包括本發(fā)明的探針、芯片或引物。

[0041] 在此方面的一種實(shí)施方式中，所述試劑盒用于檢測(cè)在本發(fā)明的至少15個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。優(yōu)選地，所述試劑盒用于檢測(cè)在本發(fā)明的45個(gè)SNP的N位點(diǎn)處的基因
型。更優(yōu)選地，所述試劑盒包含如SEQ?ID?NO.46-135所示的探針。

[0042] 在此方面的另一種實(shí)施方式中，所述試劑盒用于檢測(cè)在如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示的15個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。更優(yōu)選地，所述試劑盒包括由如SEQ?ID?NO.56、57、66、67、88、89、90、91、94、95、102、103、104、105、
110、111、112、113、114、115、118、119、126、127、128、129、130、131、132和133所示的探針組成的探針。

[0043] 在此方面的另一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包含用于檢測(cè)在本發(fā)明的45個(gè)SNP的N位點(diǎn)處的基因型的引物。更優(yōu)選地，所述試劑盒包含由如SEQ?ID?NO.136-221所示的引物組
成的引物。

[0044] 在此方面的另一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包含用于確定在本發(fā)明的15個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的引物，其中，15個(gè)SNP標(biāo)記如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、
34、35、37、41、42、43和44所示。優(yōu)選地，所述試劑盒包含由如SEQ?ID?NO.146、147、152、153、
174、175、176、177、180、181、188、189、190、191、196、197、198、199、200、201、204、205、212、
213、214、215、216、217、218和219所示的引物組成的引物。

[0045] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的引物、探針、芯片或試劑盒在制備用于預(yù)測(cè)或診斷PCOS的試劑中的應(yīng)用，其中，所述引物、探針、芯片或試劑盒用于檢測(cè)在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。在一種實(shí)施方式中，檢測(cè)本發(fā)明的至少15個(gè)SNP標(biāo)記，優(yōu)選本發(fā)明的
全部45個(gè)SNP標(biāo)記，的N位點(diǎn)處的基因型。在另一種實(shí)施方式中，檢測(cè)本發(fā)明的15個(gè)SNP標(biāo)記
的N位點(diǎn)處的基因型，其中，所述15個(gè)SNP如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、
37、41、42、43和44所示。

[0046] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的引物、探針、芯片或試劑盒在預(yù)測(cè)或診斷PCOS中的應(yīng)用，其中，所述引物、探針、芯片或試劑盒用于檢測(cè)在本發(fā)明的SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的
基因型。

[0047] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供一種預(yù)測(cè)或診斷PCOS的方法，其中，所述方法包括確定在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型。

[0048] 在此方面的一種實(shí)施方式中，所述方法包括確定在本發(fā)明的至少15個(gè)SNP標(biāo)記，優(yōu)選本發(fā)明的全部45個(gè)SNP標(biāo)記，的N位點(diǎn)處的基因型。

[0049] 在此方面的另一種實(shí)施方式中，所述方法包括：確定在本發(fā)明的15個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型，其中，所述15個(gè)SNP標(biāo)記如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、
37、41、42、43和44所示。

[0050] 在此方面的又一種實(shí)施方式中，確定在SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型是(例如，使用本發(fā)明的探針或芯片)通過(guò)雜交進(jìn)行的。

[0051] 在此方面的又一種實(shí)施方式中，確定在SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型是使用本發(fā)明的引物通過(guò)測(cè)序進(jìn)行的，例如，PCR、實(shí)時(shí)定量PCR或MassARRAY(Sequenom)。

[0052] 在此方面的又一種實(shí)施方式中，本方法包括以下步驟：從受試者的外周血或唾液中提取DNA，確定在一個(gè)或多個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型，以及分析結(jié)果以預(yù)測(cè)PCOS風(fēng)險(xiǎn)
或診斷PCOS。

[0053] 實(shí)施方式

[0054] 受試者

[0055] 所評(píng)估的全部中國(guó)漢族樣本是從中國(guó)多家協(xié)作醫(yī)院獲得。2254個(gè)中國(guó)漢族PCOS樣本和3001個(gè)對(duì)照的探索組(GWAS?I和II)主要是從中國(guó)北方招募。8226個(gè)病例和7578個(gè)對(duì)照
的后續(xù)重復(fù)樣本(REP?I和II)是從中國(guó)各地的29個(gè)省(山東、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、河南、天津、北京、山西、陜西、甘肅、寧夏、江蘇、安徽、上海、廣東、廣西、福建、浙江、湖北、湖南、江西、四川、重慶、新疆、云南、貴州和海南)收集。根據(jù)在200345中提議的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)(Rotterdam?Consensus)診斷PCOS患者。從醫(yī)療檔案中獲得患者的臨床數(shù)據(jù)。以月經(jīng)周期
長(zhǎng)度超過(guò)35天或一年內(nèi)≤8個(gè)月經(jīng)周期史來(lái)評(píng)價(jià)排卵過(guò)少/排卵停止。當(dāng)在卵巢中掃描到≥
12個(gè)測(cè)量直徑2-9mm小囊或卵巢體積在10ml以上時(shí)確定為多囊卵巢形態(tài)。如果有關(guān)于高雄
激素血癥和/或多毛癥的證據(jù)，則證實(shí)雄激素過(guò)多癥。排除具有其他原因的月經(jīng)稀發(fā)或雄激
素過(guò)多癥的患者。從經(jīng)過(guò)由內(nèi)科專家全面臨床檢查的病例中收集臨床資料。從通過(guò)結(jié)構(gòu)式
問(wèn)卷的病例和對(duì)照中收集附加人口統(tǒng)計(jì)信息。所有的參與者提供了書(shū)面知情同意書(shū)。該研
究得到了各醫(yī)院的制度倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言(Declaration?of?
Helsinki)的原則進(jìn)行。

[0056] DNA提取

[0057] 從所有參與者中收集EDTA抗凝結(jié)靜脈血樣本。使用Flexi?Gene?DNA試劑盒(Qiagen)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序從外周血淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA，并稀釋至用于全基因組基因
分型的工作濃度50ng/μL和用于驗(yàn)證研究的工作濃度15-20ng/μL。

[0058] GWAS基因分型和質(zhì)量控制

[0059] Affymetrix全基因組陣列(Affymetrix?Genome-Wide?Arrays)用于探索階段(discovery?phase)：使用Affymetrix全基因組人類SNP陣列6.0(Affymetrix?Genome-Wide?
Human?SNP?Array?6.0)進(jìn)行GWAS數(shù)據(jù)集(GWAS?Data?Set)1，以及使用Axiom全基因組陣列
對(duì)GWAS數(shù)據(jù)集2的樣品進(jìn)行基因分型。GWAS數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制過(guò)濾如下進(jìn)行：對(duì)于Contrast?
QC為0.4以上的SNP?6.0陣列不考慮進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析，而對(duì)于Axiom陣列，0.82以上的Dish?
QC(DQC)認(rèn)為是通過(guò)。對(duì)于SNP6.0使用鳥(niǎo)食算法(birdseed?algorithm)生成基因型數(shù)據(jù)，而
對(duì)于Axiom陣列使用Axiom?GT1算法。對(duì)于樣本過(guò)濾，排除產(chǎn)生少于95％的基因座的基因型
的陣列。對(duì)于SNP過(guò)濾(樣本過(guò)濾之后)，去掉在病例或?qū)φ諛颖局袡z出率(call?rate)<95％
的SNP。排除MAF(次要等位基因頻率)<1％的SNP，或在對(duì)照中明顯偏離哈迪溫伯格平衡
(HWE，P≤1E-5)的SNP。

[0060] 未分型SNP的填補(bǔ)(Imputation)分析

[0061] 使用MACH17-18對(duì)兩個(gè)GWAS數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行填補(bǔ)，以通過(guò)陣列類型進(jìn)行meta-分析。用于90CHB+JPT受試者的分階段單倍型(180個(gè)單倍型)用作填補(bǔ)基因型的參考。因?yàn)槿狈?br>效(power)，從關(guān)聯(lián)分析中排除用信息內(nèi)容r2<0.3填補(bǔ)的任何SNP。另外，使用1000個(gè)基因組
單倍型I期中期發(fā)布(Jun2011)作為參考，采用IMPUTEv219-20對(duì)8個(gè)新識(shí)別的區(qū)域(0.5MB實(shí)現(xiàn)
PGWAS-META<10-5的任何SNP的任一側(cè))進(jìn)行第二填補(bǔ)步驟。具有適當(dāng)信息<0.4填補(bǔ)的任何SNP被視為差的填補(bǔ)。SNP?QC過(guò)濾的標(biāo)準(zhǔn)與基因分型的標(biāo)準(zhǔn)相同。

[0062] 群體亞結(jié)構(gòu)(Population?substructure)分析

[0063] 使用如在軟件EIGENSTRAT21中實(shí)施的主成分分析(PCA)評(píng)價(jià)人群亞結(jié)構(gòu)。每個(gè)受試者生成20個(gè)主成分(PC)。進(jìn)行兩次PCA，第一次PCA用于結(jié)合HapMap數(shù)據(jù)分析研究數(shù)據(jù)(1510
個(gè)病例和2106個(gè)對(duì)照)。繪制前兩個(gè)主成分，排除43個(gè)病例和9個(gè)對(duì)照。對(duì)其余試驗(yàn)樣品進(jìn)行
第二次PCA。所述PC是為關(guān)聯(lián)分析生成的。

[0064] 關(guān)聯(lián)分析

[0065] 使用logistic回歸來(lái)確定在病例和對(duì)照之間是否存在PC分值上的顯著差異；顯著PC在關(guān)聯(lián)分析中用作協(xié)變量，以糾正群體分層(population?stratification)。調(diào)整后，觀
察到小的分層(λ＝1.07，λ1000＝1.04，標(biāo)準(zhǔn)化為100022的樣本量)。

[0066] GWAS數(shù)據(jù)集(GWAS?Data?Sets)的Meta-分析

[0067] 使用Meta分析來(lái)合并GWAS數(shù)據(jù)集。使用PLINK23進(jìn)行meta-分析。使用Q統(tǒng)計(jì)學(xué)P值對(duì)三個(gè)階段的異質(zhì)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用Mantel-Haenszel法計(jì)算固定效應(yīng)評(píng)價(jià)(fixed?effect?
estimate)。

[0068] SNP選擇和重復(fù)

[0069] 使用下列標(biāo)準(zhǔn)選擇SNP用于驗(yàn)證：來(lái)自GWAS-Meta分析的強(qiáng)顯著SNP(PGWAS-META≤10-5)被選定為重復(fù)I。一般來(lái)講，在重復(fù)I中顯示名義顯著性(P<0.05)或在重復(fù)I中不顯著，但
-6
GWAS-REP1meta-分析P值小于5×10 的那些SNP在重復(fù)II中仍然保持。除了rs2059807(其使
用TaqMan測(cè)定法(Applied?Biosystems)進(jìn)行基因分型)以外，大多數(shù)重復(fù)的研究使用
Sequenom?MassARRAY系統(tǒng)。

[0070] 統(tǒng)計(jì)分析

[0071] 使用PLINK23進(jìn)行單標(biāo)記水平的全基因組關(guān)聯(lián)分析以及病例-對(duì)照樣本的HWE分析；R套裝用于全基因組P值標(biāo)繪圖。使用LocusZoom24生成區(qū)域圖。在重復(fù)研究中，用SHEsis25進(jìn)行等位基因關(guān)聯(lián)分析。采用PLINK23使用meta-分析合并GWAS和重復(fù)數(shù)據(jù)。條件logistic回歸
用來(lái)測(cè)試單個(gè)SNP的獨(dú)立影響26-27。

[0072] 結(jié)果

[0073] 總共發(fā)現(xiàn)45個(gè)SNP與PCOS相關(guān)聯(lián)。詳細(xì)的分析信息列于表3-5。

[0074] 事實(shí)上，所述SNP表示與PCOS相關(guān)聯(lián)且可以包括許多SNP的區(qū)域。在這些區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)對(duì)于首次識(shí)別的基因座(2pl6.3、2p21和9q33.3)的顯著證據(jù)26，代表這些區(qū)域的SNP為
rs13405728(2p16.3；PGWAS-meta＝3.77×10-9)、rs13429458(2p21，PGWAS-meta＝4.17×10-13)、rs12478601(2p21，PGWAS-meta＝3.37×10-10)、rs2479106(9q33.3，PGWAS-meta＝5.14×10-10)和rs10818854(9q33.3，PGWAS-meta＝2.50E-04)。在GWAS-Meta分析中，在除報(bào)道的3個(gè)以外的其他19個(gè)區(qū)域中的SNP表現(xiàn)出與PCOS易感性相關(guān)聯(lián)(PGWAS-meta值<10-5)。然而，在位于2p16.3中但在之前的GWAS中不直接支持的FSHR基因中的變體，仍顯示PGWAS-meta值<10-5。條件logistic分析支持，在FSHR中的信號(hào)不依賴于先前的報(bào)告。因此，本發(fā)明人從全部的20個(gè)區(qū)域中選擇
最顯著的SNP用于驗(yàn)證(重復(fù)I研究)。

[0075] 在這20個(gè)區(qū)域中，在重復(fù)I期中驗(yàn)證7個(gè)(P<0.05具有相同的等位基因比值比趨勢(shì))，其他3個(gè)區(qū)域在GWAS-REP1meta分析中具有P<5×10-6的SNP。在一個(gè)獨(dú)立的樣品組(重復(fù)
Ⅱ)中將來(lái)自這10個(gè)區(qū)域的SNP再次分型。其結(jié)果是，通過(guò)在固定效應(yīng)模型下全部階段的
meta-分析，在8個(gè)區(qū)域(9q22.32、11q22.1、12q13.2、12q14.3、16q12.1、19p13.3、20q13.2和FSHR基因(2p16.3))的常見(jiàn)變體顯示出總體的關(guān)聯(lián)的組合證據(jù)(P值<5×10-8)。研究結(jié)果有
力地支持這些區(qū)域和PCOS之間的關(guān)聯(lián)性。

[0076] 在9q22.32上，最顯著的SNP是rs3802457(PGWAS-REP-Meta＝5.28×10-14，ORGWAS-REP-Meta＝0.77)，其位于C9orf3基因的內(nèi)含子區(qū)域(圖3)?？刂苧s3802457，rs4385527(PGWAS-REP-Meta＝5.87×10-9，ORGWAS-REP-Meta＝0.84)顯示在條件logistic回歸分析中的獨(dú)立關(guān)聯(lián)性，并且其也位于C9orf3。C9orf3是M1鋅氨基肽酶家族的成員。它是一種催化從蛋白質(zhì)或肽的氨基末端去除氨基酸的鋅依賴性金屬肽酶，并且可以在血管緊張素IV的產(chǎn)生中發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道，
在C9orf3內(nèi)的SNP?rs3802458與在接受前列腺癌放射性治療的非裔美國(guó)男子中的勃起功能
障礙(ED)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)28。當(dāng)人們發(fā)展成性激素的量不足或過(guò)剩的狀況時(shí)，在男性中發(fā)生
ED，而在女性中發(fā)生PCOS。有趣的是，F(xiàn)SHR基因(rs2268363)已被確定為與ED最顯著相關(guān)
聯(lián)28，F(xiàn)SHR和PCOS之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)性證據(jù)也被確定(下面討論)。

[0077] 在11q22.1上，rs1894116(PGWAS-REP-Meta＝1.08×10-22，ORGWAS-REP-Meta＝1.27)位于YAP1(MIM：606608)的內(nèi)含子區(qū)域(圖3)?？刂苧s1894116，條件logistic回歸分析表明，沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。含有WW結(jié)構(gòu)域的YAP1是能夠同時(shí)用作輔激活物和輔阻遏物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并且是在通過(guò)限制增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而在器官大小控制和腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用的
Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵下游調(diào)節(jié)靶標(biāo)。YAP過(guò)表達(dá)改變與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、粘附和上
29
皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)聯(lián)的基因的表達(dá) 。由于卵黃囊無(wú)血管發(fā)生(avasculogenesis)和尿囊和絨
毛膜之間的附著失敗，Yap1無(wú)效突變的小鼠胚胎在胚胎日E9.5和E10.5之間死亡30。

[0078] 在12q13.2上，最顯著的SNP?rs705702(PGWAS-REP-Meta＝8.64×10-26，ORGWAS-REP-Meta＝1.27)位于RAB5B(MIM：179514)和SUOX(MIM：606887)之間的基因間區(qū)域(圖3)?？刂?br>rs705702，條件logistic回歸分析表明，沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。RAB5B是RAS超家族的成員，
并且它與質(zhì)膜和早期內(nèi)涵體相關(guān)聯(lián)。SUOX編碼位于線粒體膜間隙的同源二聚體蛋白。有幾
個(gè)SNP顯示與PCOS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的證據(jù)。其中，rs2292239(PGWAS-REP-Meta＝2.72×10-22，
ORGWAS-REP-Meta＝1.25)似乎是最有趣的一個(gè)，據(jù)報(bào)道其與1型糖尿病31-33和1型糖尿病的自身抗體34相關(guān)聯(lián)。Rs2292239位于ERBB3的內(nèi)含子7。ERBB3，一種磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt途徑的活化劑，是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和囊泡運(yùn)輸?shù)谋砥どL(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體家族中的成員。ERBB3
在確定抗原呈遞細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用35。

[0079] 在12q14.3上，rs2272046(PGWAS-REP-Meta＝1.95×10-21，ORGWAS-REP-Meta＝0.70)位于HMGA2(MIM：600698)的內(nèi)含子區(qū)域，HMGA2編碼具有結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白并作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(圖3)?？刂苧s2272046，在這一區(qū)域沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。HMGA2先前已確定與成
36 37 38
人身高 、血管瘤(包括粘液瘤和肺錯(cuò)構(gòu)瘤) 和2型糖尿病 相關(guān)聯(lián)。有趣的是，在該基因中
的突變可導(dǎo)致具有體重顯著減少、減少脂肪組織量和兩性不育癥的“侏儒”鼠39，這表明其在生長(zhǎng)和繁殖中的重要作用。

[0080] 在16q12.1上，最顯著SNP是rs4784165(PGWAS-REP-Meta＝3.64×10-11，ORGWAS-REP-Meta＝1.15)(圖3)?？刂苧s4784165，條件logistic回歸分析表明，沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。TOX3
(MIM：611416)是距該最高信號(hào)(top?signal)最近的基因。TOX3屬于通過(guò)彎曲和解旋DNA而
在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾中充當(dāng)建筑因子的大而多樣的HMG-box蛋白家族40。

[0081] 在19p13.3上，rs2059807(PGWAS-REP-Meta＝1.09×10-8，ORGWAS-REP-Meta＝1.14)位于INSR基因(MIM：147670)的內(nèi)含子區(qū)域(圖3)?？刂苧s2059807，條件logistic回歸分析表明，沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。INSR在胰島素代謝中起重要作用。胰島素受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的突變已顯示出會(huì)引起嚴(yán)重的高胰島素血癥和胰島素耐受性41-43。在以前的研究中，據(jù)報(bào)
道，在INSR基因中的常見(jiàn)SNP與中國(guó)漢族人和高加索人中的PCOS有關(guān)聯(lián)44,45。INSR無(wú)效小鼠
生長(zhǎng)緩慢，7日齡死亡，伴有酮酸中毒、高血清胰島素和甘油三酯、低糖原儲(chǔ)備和脂肪肝46。

[0082] 在20q13.2上，最高信號(hào)是rs6022786(PGWAS-REP-Meta＝1.83×10-9，ORGWAS-REP-Meta＝1.13)，位于基因SUMO1P1和ZNF217(MIM：602967)之間的基因間區(qū)域(圖3)。控制rs6022786，條件logistic回歸分析表明，沒(méi)有額外的關(guān)聯(lián)信號(hào)。SUMO1P1是SUMO1假基因1。ZNF217，鋅指蛋白217，可以減弱由于端粒功能紊亂以及阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷導(dǎo)致的凋亡信號(hào)，可以在
端粒危機(jī)期間通過(guò)增加細(xì)胞存活促進(jìn)致瘤性轉(zhuǎn)化，并且可以在化學(xué)治療期間通過(guò)增加細(xì)胞
存活促進(jìn)晚期惡性腫瘤。

[0083] 此外，在先前的PCOS的GWAS中已經(jīng)報(bào)道了2p16.326。在該項(xiàng)研究中，在該區(qū)域的全球顯著性發(fā)現(xiàn)僅位于LHCGR基因(MIM：152790)，并且最高信號(hào)并沒(méi)有直接與FSHR基因(MIM：
136435)連鎖，這主要是由于重組熱點(diǎn)。然而，長(zhǎng)期以來(lái)FSHR一直被認(rèn)為是最引人注目的
PCOS候選基因之一48。FSHR無(wú)效突變的女性不育，伴有小卵巢、卵泡發(fā)育受阻、萎縮性子宮和陰道閉鎖，無(wú)效突變的男性盡管睪丸重量降低、少精子癥和睪酮水平降低，但可育49。在本次的研究中，在FSHR基因中的SNP滿足在初始階段進(jìn)行驗(yàn)證的選擇標(biāo)準(zhǔn)，在組合分析中獲得全
-13
球顯著性發(fā)現(xiàn)(最高信號(hào)是rs2268361，PGWAS-REP-Meta＝9.89×10 ，ORGWAS-REP-Meta＝0.87)(圖
3)。條件logistic回歸分析支持FSHR的關(guān)聯(lián)獨(dú)立于LHCGR中的那些先前信號(hào)。

[0084] 最后，選定獨(dú)立的15個(gè)SNP來(lái)代表這些與PCOS最關(guān)聯(lián)的區(qū)域。所述15個(gè)SNP是指SNP標(biāo)記號(hào)6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44。

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089] 基于上述研究和實(shí)踐應(yīng)用，檢測(cè)在至少15個(gè)SNP標(biāo)記(例如，本發(fā)明中的全部45個(gè)SNP標(biāo)記)的N位點(diǎn)處的基因型，對(duì)于預(yù)測(cè)或診斷PCOS是有用的。然而，檢測(cè)在6、11、22、23、
25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44號(hào)的15個(gè)獨(dú)立SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型也有效，同時(shí)花費(fèi)更少。

[0090] 檢測(cè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型

[0091] 有許多用于檢測(cè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型的方法，例如，通過(guò)雜交或測(cè)序。

[0092] 對(duì)于雜交，探針應(yīng)設(shè)計(jì)為特異性地與SNP的基因座雜交，然后雜交可以分析SNP是否存在。給出對(duì)于全部45個(gè)SNP的探針的一個(gè)實(shí)例，只是為了舉例說(shuō)明的目的，而并非意在
限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)出類似的與SNP雜交的探針，這些探針
也全部落入本發(fā)明的范圍。

[0093] 通常，探針應(yīng)當(dāng)存在于載體(例如芯片)中，從而可以一次檢測(cè)多于一個(gè)的SNP標(biāo)記。本發(fā)明還提供一種芯片，所述芯片包含檢測(cè)如SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、
34、35、37、41、42、43和44所示的SNP標(biāo)記(即rs13429458、rs12478601、rs13405728、
rs10818854、rs2479106、rs2268361、rs2349415、rs4385527、rs3802457、rs1894116、
rs705702、rs2272046、rs4784165、rs2059807和rs6022786的SNP)的探針。當(dāng)選定所述探針
時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何制造這種芯片。

[0094] 對(duì)于測(cè)序，引物應(yīng)設(shè)計(jì)為目的基因座的正向和反向的引物。給出對(duì)于(表2中列出的)全部45個(gè)SNP的引物的一個(gè)實(shí)例，只是為了舉例說(shuō)明的目的，而并非意在限制本發(fā)明的
范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)出類似的引物以進(jìn)行SNP標(biāo)記的測(cè)序，這也全部落
入本發(fā)明的范圍。此外，在測(cè)序中使用的方法和試劑也是公知的現(xiàn)有技術(shù)。

[0095] 另一種對(duì)SNP標(biāo)記進(jìn)行基因分型的可用方法采用Sequenom平臺(tái)的iPLEX(Sequenom公司，San?Diego，CA)。使用MassARRAY?Assay?Design?3.0軟件設(shè)計(jì)用于所述SNP的聚合酶
鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和延伸引物。根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行PCR和延伸反應(yīng)，并使用Sequenom?
iPLEX系統(tǒng)通過(guò)質(zhì)譜法確定延伸產(chǎn)物大小。

[0096] 預(yù)測(cè)或診斷PCOS的方法

[0097] 根據(jù)本發(fā)明的45個(gè)SNP標(biāo)記可用于預(yù)測(cè)或診斷PCOS。首先，從受試者的外周血或唾液中提取DNA，然后，(例如，通過(guò)用上述探針或芯片雜交或通過(guò)測(cè)序)檢測(cè)在SNP的N位點(diǎn)處
的基因型。最后，將對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以預(yù)測(cè)PCOS的風(fēng)險(xiǎn)。

[0098] 實(shí)施例

[0099] 以下的實(shí)施例只是用于舉例說(shuō)明的目的，而不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。

[0100] 實(shí)施例1

[0101] 使用表2中所列的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增全部45個(gè)SNP標(biāo)記。對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行下列步驟。

[0102] A、反應(yīng)體系

[0103]

[0104] B、反應(yīng)步驟

[0105]

[0106] 通過(guò)電泳和測(cè)序檢測(cè)并確認(rèn)產(chǎn)物。圖4示出了對(duì)全部45個(gè)SNP標(biāo)記的電泳圖。

[0107] 實(shí)施例2

[0108] 1、從受試者的外周血或唾液中提取DNA，純化DNA，并調(diào)節(jié)DNA的濃度至20ng/mL。

[0109] 2、通過(guò)測(cè)序檢測(cè)在15個(gè)SNP標(biāo)記的N位點(diǎn)處的基因型，所述15個(gè)SNP標(biāo)記顯示為SEQ?ID?NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44。所使用的引物列于表2中。

[0110] 3、方法：

[0111] I.PCR反應(yīng)

[0112] A、反應(yīng)體系

[0113]

[0114] B、反應(yīng)步驟

[0115]

[0116] C、PCR產(chǎn)物的純化

[0117] 在室溫下使用25μL?PEG(22％，w/v)和2μL?NaCl(5M)使PCR產(chǎn)物沉淀。然后，在4℃下將板儲(chǔ)存30分鐘。在4℃下，用80μL的75％乙醇通過(guò)離心將殘留的PEG洗滌3次。

[0118] D、純化的PCR產(chǎn)物的循環(huán)測(cè)序

[0119] 將純化的DNA溶于5μL?ddH2O。

[0120]

[0121] 然后，將板充分混合并短暫旋轉(zhuǎn)。通過(guò)快速加熱至96℃進(jìn)行初始變性過(guò)程并且持續(xù)1分鐘。進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)：96℃以上變性10秒鐘，50℃以上退火5秒，以及60℃以上延
伸4分鐘?？焖俳禍刂?℃。產(chǎn)物備用直到純化。

[0122] E、乙醇/EDTA/乙酸鈉沉淀

[0123] 2μL的125mM?EDTA和2μL的3M乙酸鈉加入到每個(gè)孔中。然后將50μL的100％乙醇加入到各孔中。將板密封并通過(guò)翻轉(zhuǎn)4次混合。將板在室溫下孵育15分鐘。然后用75％乙醇將
沉淀的DNA漂洗3次。

[0124] F、在ABI?3730XL遺傳分析儀上的毛細(xì)管電泳

[0125] 每孔中加入10μL的HI-DI甲酰胺并在95℃下變性5分鐘。將沉淀的DNA加樣到ABI?3730XL遺傳分析儀上用于毛細(xì)管電泳。

[0126] II.MassARRAY

[0127] A、主要儀器和試劑

[0128] 1)擴(kuò)增：ABI 9700?384Dual；

[0129] 2)機(jī)械手臂：MassARRAY?Nanodispenser?RS1000；

[0130] 3)分析：MassARRAY?Compact?System；

[0131] 4)試劑：用于 Compact?384的完整基因分型試劑盒

[0132] B、程序

[0133] 進(jìn)行384個(gè)PCR反應(yīng)(相同的多重測(cè)定，不同的DNA)。這些說(shuō)明涉及進(jìn)行用于整個(gè)384孔微孔板的反應(yīng)的PCR，其中，相同的測(cè)定將應(yīng)用到不同的DNA。

[0134] 如下表中所述制備PCR混合物

[0135] 1)對(duì)于多重PCR混合物，在不含DNA的情況下，按照試劑在表中出現(xiàn)的順序添加試劑，用于384個(gè)反應(yīng)(相同的多重測(cè)定，不同的DNA)。

[0136]

[0137] 2)在384孔微孔板(Marsh?Biomedical?Products公司#SP?0401Sequen)的每個(gè)孔中添加1μL適當(dāng)?shù)幕蚪MDNA(5-10ng/μL)。

[0138] 3)將4μL的PCR混合物分配給384孔板的每個(gè)孔中。

[0139] 4)將微孔板在1000RPM下離心1分鐘。

[0140] 5)輕輕混合或漩渦該板，并且在熱循環(huán)前旋轉(zhuǎn)減慢。

[0141] 6)384孔微孔板進(jìn)行如下熱循環(huán)：

[0142]

[0143] 制備SAP酶液

[0144] 1)按照試劑在下表中出現(xiàn)的順序添加試劑到1.5mL管中，以制備SAP酶液。

[0145] SAP酶溶液的體積

[0146]

[0147]

[0148] 2)將含有SAP的酶溶液的1.5mL管進(jìn)行漩渦五秒鐘以混合溶液。

[0149] 3)在5000RPM下，將1.5mL管SAP酶液離心十秒鐘。

[0150] 4)將2μL的SAP酶液加入到384孔樣品微孔板的每個(gè)孔中。

[0151] 5)用板密封膜密封384孔樣品微孔板。

[0152] 6)以1000RPM離心384孔樣品微孔板1分鐘。

[0153] 7)孵育384孔樣品微孔板如下：

[0154] 37℃? 40分鐘

[0155] 85℃? 5分鐘

[0156] 4℃?? 永遠(yuǎn)

[0157] 制備High?Plex?iPLEX黃金反應(yīng)混合物(相同的多重測(cè)定，不同的DNA)

[0158] 1)如下表中所述，在1.5mL管中，制備高plex?iPLEX黃金反應(yīng)混合物。按照試劑在下表中出現(xiàn)的順序添加試劑。

[0159] 多重High?plex?iPLEX黃金反應(yīng)混合物(相同的多重測(cè)定，不同的DNA)

[0160]

[0161] 2)將混合物微孔板以1000RPM離心一分鐘。

[0162] 3)添加2μL?High?Plex?iLEX黃金反應(yīng)到384孔樣品微孔板。

[0163] 4)用板密封膜密封所述384孔樣品微孔板。

[0164] 5)將384孔樣品微孔板以1000RPM離心一分鐘。

[0165] 6)將384孔樣品微孔板進(jìn)行熱循環(huán)如下：

[0166]

[0167] 提純High?Ple?iPLEX黃金反應(yīng)產(chǎn)物。High?plex?iPLEX黃金反應(yīng)產(chǎn)物的提純包括向樣品微孔板中加入水而后加入清潔樹(shù)脂。將清潔樹(shù)脂散布到384孔凹坑板上。加入超純水
(nanopure?water)至384孔樣品微孔板的每個(gè)孔中。向384孔樣品微孔板添加清潔樹(shù)脂。

[0168] 將384孔樣品微孔板旋轉(zhuǎn)并離心。

[0169] 獲取光譜

[0170] ACQUIRE模塊控制MassARRAY?Analyzer?Compact(Compact)以從SpectroCHIPs獲得光譜。由于每個(gè)SpectroCHIP由Compact處理，光譜數(shù)據(jù)自動(dòng)處理，并保存到MassARRAY數(shù)
據(jù)庫(kù)。

[0171] 該方法涉及與PCOS最相關(guān)的15個(gè)SNP標(biāo)記，其可信度是較高的。檢測(cè)過(guò)程能夠以更低成本更容易地進(jìn)行。

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