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[0001] 本發(fā)明屬于一種通過對膠原進(jìn)行酶處理來制備明膠的方法。

[0002] 明膠是通過使膠原增溶而獲得的肽和蛋白質(zhì)的混合物。膠原主要是通過使用堿或酸預(yù)處理從各種動物副產(chǎn)品(例如骨和表皮)提取而來。

[0003] 傳統(tǒng)上，明膠可使用熱水從膠原中提取，其中進(jìn)行多級提取以使膠原增溶成明膠。通常，可使用三個(gè)熱水提取溫度級：(1)50-55℃；(2)60-65℃；和(3)70-75℃。提取中所用的水溫越高，則獲得的膠原增溶越高，而明膠強(qiáng)度越低。膠原包含三條多肽鏈，所謂的α鏈(α、α
1和α2)，這些膠原肽在提取期間被增溶。增溶后，可對明膠(增溶的膠原)進(jìn)行進(jìn)一步的處理，例如過濾、澄清和干燥。

[0004] 使用熱水提取明膠的缺點(diǎn)是浸灰(liming)工藝和提取工藝需要大量的水和較長的時(shí)間。

[0005] 作為替代，已描述用于從膠原中提取明膠的酶法工藝。酶通常用于改進(jìn)或代替明膠工藝中的預(yù)處理步驟(例如浸灰)，或用于提高較低溫度下熱水提取期間的明膠產(chǎn)率。

[0006] CN102051130比較了酸性蛋白酶、胃蛋白酶(pepsin)和若干種中性蛋白酶用于從脫脂脫礦的骨中提取明膠的用途。CN102051130中所公開的方法的缺點(diǎn)是明膠提取中仍需要大量的水，并且要施加額外的加熱步驟來獲得高明膠產(chǎn)率。

[0007] CN102329843公開了來自黑曲霉(A.niger)的酸性蛋白酶用于從骨膠原中提取明膠的用途，其中酶促反應(yīng)需要小心控制以防止酶過度反應(yīng)。

[0008] 本領(lǐng)域中已知的用于明膠提取的酶法的缺點(diǎn)是膠原的非特異性蛋白水解裂解。所用廣譜蛋白酶如果未經(jīng)小心控制就會產(chǎn)生小的蛋白質(zhì)片段，并因此而降低明膠質(zhì)量。

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種用于酶法提取明膠的改進(jìn)的方法，其中以高產(chǎn)率獲得高質(zhì)量的明膠。

[0010] 本發(fā)明涉及一種制備明膠的方法，其包括用包含與SEQ?ID?NO:1具有至少70％同一性的酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料的步驟，以及制備明膠。

[0011] 出人意料地發(fā)現(xiàn)，在用本文所公開的包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料的步驟期間，明膠產(chǎn)率高于用本領(lǐng)域已知的酶法所獲得的明膠產(chǎn)率，同時(shí)保持了非常良好的明膠質(zhì)量。本文所用的高產(chǎn)率為至少為60重量％，或至少為70重量％，或至少為75重量％的產(chǎn)率，良好的質(zhì)量是指明膠的布盧姆值(Bloom?value)為至少200，例如至少240或至少260。無需諸如加熱處理的進(jìn)一步的提取步驟，在用酸性蛋白酶溫育膠原材料的步驟中存在這些高產(chǎn)率值。因此這些進(jìn)一步的提取步驟可省略，本文所公開的制備明膠的方法可有利地降低生產(chǎn)成本。

[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有相對于膠原α肽的重量至少10重量/重量％的大小為70至90kDa肽的明膠。

[0013] 發(fā)明詳述

[0014] 本發(fā)明涉及一種制備明膠的方法，其包括用包含與SEQ?ID?NO:1氨基酸序列具有至少70％同一性的酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料的步驟，以及制備明膠。

[0015] 本文所用的方法中的酸性蛋白酶為最佳pH值為酸性pH值(例如介于1和6之間，或介于2和5之間，或介于3和4之間)的蛋白酶。

[0016] 本文所公開的方法中有利地使用酸性蛋白酶，因?yàn)槠洚a(chǎn)生具有高布盧姆值和良好膠凝性質(zhì)的明膠。與已知的蛋白酶相比，本文所公開的方法中使用的酸性蛋白酶似乎可將膠原裂解成比本領(lǐng)域中已知的蛋白酶組合物更大的片段。

[0017] 酸性蛋白酶可為傾向于在蛋白質(zhì)或肽的某個(gè)特定氨基酸位置對所述蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行裂解的酶。酸性蛋白酶可例如為組氨酸特異性蛋白酶。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在本文所公開的蛋白酶中使用組氨酸特異性蛋白酶時(shí)，可獲得高質(zhì)量的明膠。

[0018] 本文所公開的方法中的酸性蛋白酶不是廣譜蛋白酶。

[0019] 酶組合物有利地包含酸性蛋白酶，其中所述酸性蛋白酶占所述酶組合物中的蛋白質(zhì)的重量百分比至少為80％，例如占所述酶組合物中的蛋白質(zhì)的重量百分比至少為85％、90％、95％、98％或99％。已發(fā)現(xiàn)，包含重量百分比至少為80％的酸性蛋白酶蛋白質(zhì)的酶組合物產(chǎn)生良好質(zhì)量的明膠。通過本文所公開的方法制備的良好質(zhì)量的明膠包含相對于明膠中膠原α肽的重量至少10重量/重量％的大小為70至90kDa的蛋白質(zhì)。

[0020] 因此，本文所公開的方法中的酶組合物包含呈純形式的酸性蛋白酶。

[0021] 所述酸性蛋白酶可與SEQ?ID?NO:1氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或100％同一性，或可包含SEQ?ID?NO:1。

[0022] 所述酸性蛋白酶可源自任何合適的微生物，例如源自Rasamsonia、青霉菌(Penicillium)或曲霉菌(Aspergillus)屬的真菌。優(yōu)選地，酸性蛋白酶源自以下的種：踝節(jié)菌屬埃默森藍(lán)狀菌(Rasamsonis?emersonii)、產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium?chrysogenum)、米曲霉(Aspergillus?oryzae)或黑曲霉(Aspergillus?niger)。

[0023] 用包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料可在介于40℃和65℃之間，例如介于45℃和60℃之間，例如介于50℃和59℃之間，或介于52℃和58℃之間的溫度下進(jìn)行。

[0024] 用酶組合物溫育含膠原的材料可在介于1.0和4.5之間的pH，例如介于1.5和4之間的pH，例如介于2.0和3.5之間的pH下進(jìn)行。

[0025] 已發(fā)現(xiàn)，本文所公開的制備制備明膠的方法與熱水、酸或堿工藝相比可在更短的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行，這具有較大的經(jīng)濟(jì)利益。用包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料可在介于0.5小時(shí)和10小時(shí)之間，例如于1小時(shí)和8小時(shí)之間或介于2小時(shí)和6小時(shí)之間的時(shí)段內(nèi)進(jìn)行。

[0026] 本文所公開的方法中制備的明膠包括使膠原增溶。使膠原增溶包括各個(gè)膠原鏈或肽之間的分子(例如氫)的部分水解或裂解。已發(fā)現(xiàn)，通過本文所公開的方法中的用酸性蛋白酶溫育膠原，與用本領(lǐng)域中已知的酸性蛋白酶獲得的增溶的膠原的量相比，可使更高量的膠原增溶。本文所公開的制備明膠的方法還可包括將增溶的膠原與不溶性膠原分離。

[0027] 所述制備明膠的方法可包括干燥明膠的另外的步驟。

[0028] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含相對于明膠中膠原α肽的重量至少10重量/重量％的大小為70至90kDa的肽的明膠。所述明膠優(yōu)選地包含量為相對于膠原α肽的重量至少10至90重量/重量％或至少20至80重量/重量％或至少30至70重量/重量％的大小為70至
90kDa的肽。所述肽的大小可介于72至88kDa，或介于74至86kDa，例如介于76至84kDa。

[0029] 本發(fā)明還涉及一種制備包含相對于明膠中膠原α肽的重量至少10重量/重量％的大小為70至90kDa的蛋白質(zhì)的明膠的方法，如本文上文中進(jìn)一步所定義的。

[0030] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及通過本文所公開的方法可獲得的明膠。

[0031] 定義

[0032] 來自IUMB的對酶的分類和命名的國際公認(rèn)的方案包括蛋白酶。該體系將蛋白酶分類成內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。內(nèi)切蛋白酶在本文中被定義為以內(nèi)切方式水解多肽中的肽鍵并且屬于EC?3.4類的酶。內(nèi)切蛋白酶根據(jù)催化機(jī)制分為亞-亞類。存在絲氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC?3.4.21)、半胱氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC?3.4.22)、天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC?3.4.23)、金屬內(nèi)切蛋白酶(EC?3.4.24)和蘇氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC?3.4.25)的亞-亞類。

[0033] 序列同一性在本文中被定義為通過比較序列測定的兩條或更多條氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序列之間的關(guān)系。通常，在所比較的序列的整個(gè)長度上比較序列同一性或相似性。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示氨基酸序列之間的序列相關(guān)度，這根據(jù)情況通過此類序列串之間的匹配來測定。

[0034] 測定同一性的方法被設(shè)計(jì)為在所測試的序列之間給出最大匹配。測定同一性和相似性的方法被編碼于公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。測定兩條序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括BLASTP，公眾可從NCBI和其它來源(BLAST?Manual,Altschul,S.等人,NCBI?NLM?NIH?Bethesda,MD?20894)獲得。使用BLASTP的氨基酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為空位開放11.0、空位延伸1、Blosum?62矩陣。

[0035] 含膠原的材料可為任何含膠原的物質(zhì)，例如動物的骨或表皮，但也可為提取的或純的膠原。膠原包含含有α肽(α、α1和α2)的鏈或肽。

[0036] 明膠是肽和蛋白質(zhì)的混合物并且提取自膠原，并且還可描述為膠原肽的膠原水解產(chǎn)物。

[0037] 肽在本文中被定義為通過肽鍵連接的至少兩條氨基酸構(gòu)成的鏈。詞語肽在本文中還可用于表示多肽。

[0038] 多肽為包含至少30個(gè)氨基酸殘基的鏈。

[0039] 蛋白質(zhì)由一個(gè)或多個(gè)折疊成球狀或纖維形式的多肽組成。

[0040] 組氨酸特異性蛋白酶為傾向于在肽或蛋白質(zhì)中存在組氨酸殘基的位置對肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行裂解的蛋白酶。對酶裂解包括C端組氨酸殘基的肽鍵的傾向性的測定使用Edans?Dabcyl底物通過LC-MC/MC來進(jìn)行，例如本文“材料和方法”章節(jié)中所述。

[0041] 具有廣譜活性的蛋白酶對裂解蛋白質(zhì)或肽時(shí)不對特定氨基酸表現(xiàn)出傾向性。附圖說明

[0042] 圖1：在pH2、3和4下用Aspergillopepsin?II于50℃、55℃和65℃溫育后的可溶性膠原的產(chǎn)率。

[0043] 圖2：用pH?2.5的Aspergillpepsin?I(AFP)和pH?4.5的木瓜蛋白酶獲得的來自骨材料的可溶性膠原的產(chǎn)率相對于用pH?2.5的Aspergillopepsin?II(HSP)獲得的來自骨材料的可溶性膠原的產(chǎn)率。為了比較，示出了pH4.5和pH?2.5下增溶而不添加酶的膠原的產(chǎn)率。

[0044] 圖3：Aspergillopepsin?II作用所產(chǎn)生的膠原片段的SDS-PAGE分析。泳道1至3(從左到右)：泳道1-在pH?4.5下不添加酶于50℃溫育4小時(shí)的I型膠原；泳道2–SeeBluePlus2分子量標(biāo)記；泳道3–在pH?4.5下用Aspergillopepsin?II于50℃溫育4小時(shí)的I型膠原。箭頭指示大約80kDa的肽片段。

[0045] 材料和方法

[0046] Aspergillopepsin?II的制備

[0047] 使用例如WO?98/46772中所述的方法使Aspergillopepsin?II(II型曲霉菌胃蛋白酶；An01g00530；蛋白質(zhì)序列SEQ?ID?NO:1)的基因在黑曲霉宿主中過表達(dá)。WO?98/46772公開了如何在含有乙酰胺的瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化體，以及選擇目標(biāo)多拷貝整合子。含有多拷貝表達(dá)盒的黑曲霉轉(zhuǎn)化體被選擇用來進(jìn)一步生產(chǎn)樣品材料。轉(zhuǎn)化的黑曲霉菌株在改良型CSM發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，pH?6.2(該培養(yǎng)基含有40g/l麥芽糖、30g/l?Bacto大豆蛋白胨、70g/l檸檬酸三鈉鹽二水合物、15g/l(NH4)2SO4、1g/l?NaH2PO4*2H2O、1g/l?MgSO4*7H2O、1g/l?L-Arg、0.25ml/l?Clerol防沫劑)。將所得的培養(yǎng)液過濾，過濾滅菌，然后超濾濃縮。將酶施加到Q-瓊脂糖FF?XK?26/20柱上，在50mmol/l?pH?5.6乙酸鈉中進(jìn)行層析，然后用鹽梯度洗脫。通過在4-12％的SDS-PAGE(NuPAGE?Bis-Tris?Gel,Invitrogen)之后判斷染色的蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度來定量各個(gè)級分中的Aspergillopepsin?II蛋白質(zhì)的存在。

[0048] Aspergillopepsin?II蛋白酶活性(HPU)的測定

[0049] 將20.0g來自牛血的血紅蛋白(西格瑪產(chǎn)品H2625)通過在室溫下攪拌10分鐘懸浮在大約700mL水中。在添加3.73g氯化鉀(KCl)之后，用0.5mol/L鹽酸將pH調(diào)節(jié)至1.75。用水將血紅蛋白懸浮液的體積調(diào)節(jié)至1L。再次檢查pH并調(diào)節(jié)至pH?1.75。

[0050] 通過將如上文所公開制備的純化Aspergillopepsin?II溶解于含有3.73g/l?KCl的KCl/HCl緩沖液(用2.0mol/L? HCl調(diào)節(jié)至pH?1.75)中來制備酶溶液。為測試Aspergillopepsin?II活性，將5ml血紅蛋白溶液在40℃下加熱，隨后添加1ml活性介于5個(gè)和25個(gè)組氨酸蛋白酶單位(HPU/mL)的酶溶液來開始反應(yīng)。30分鐘后，通過添加5ml三氯乙酸溶液(140g/l)來終止反應(yīng)以沉淀較大的肽片段。向5mL血紅蛋白溶液和5ml三氯乙酸溶液的混合物中添加1.0ml酶樣品來進(jìn)行空白測量。將管在40℃下溫育30分鐘以完成沉淀。離心后，測量含有小肽的澄清上清液在275nm的光密度。將結(jié)果與1.1μg/mL?L-酪氨酸溶液進(jìn)行比較。

[0051] 一個(gè)HPU是酶的量，該酶每分鐘水解的血紅蛋白的量使得溶液在275nm的光密度等于在0.1mol/L?HCl溶液中含有1.10μg?L-酪氨酸/ml的溶液的光密度。測試條件為：pH為1.75、溫度為40℃、溫育期間的血紅蛋白濃度為16.7g/l。

[0052] 活性(HPU/mL)＝(OD樣品–OD空白/S)×11/30

[0053] 其中：

[0054]

[0055] Aspergillopepsin?II裂解涉及組氨酸的肽鍵的特異性

[0056] 使用E(Edans)-AAXAAK-(Dabcyl)-NH2(SEQ?ID?NO:2)熒光底物試劑盒來測試Aspergillopepsin?II的裂解傾向性，其中“A”表示丙氨酸殘基，“X”表示19個(gè)不同的各個(gè)氨基酸殘基，均通過它們的單字母代碼來指明。Dabcyl在底物完整時(shí)淬滅Edans熒光，在底物裂解時(shí)便不再淬滅Edans熒光。所述底物因此被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)肽。底物儲液是用DMSO配成5mM濃度的溶液。反應(yīng)混合物包含：195微升的100mM乙酸鈉緩沖液(pH?4.0)或100mMTris-HCl緩沖液(pH7.0)，緩沖液中加入2微升底物儲液和5微升Aspergillopepsin?II(0.25mg/ml的50mM乙酸鈉溶液，pH5.6)。將反應(yīng)混合物在Tecan設(shè)備( 瑞士)中于37℃下溫育60分鐘(λex＝340nm，λem＝485nm)。酶活性以每毫克蛋白質(zhì)每分鐘的相對熒光單位(rfu)測定。在于pH?4下測試的各種E(Edans)-AAXAAK-(Dabsyl)-NH2(SEQ?ID?NO:2)底物中，底物E(Edans)-AAHisAAK-(Dabsyl)-NH2(SEQ?ID?NO:3)對Aspergillopepsin?II產(chǎn)生最高的rfu值，這意味著對裂解底物E(Edans)-AAHisAAK-(Dabsyl)-NH2的傾向性，即X位是組氨酸。

[0057] 實(shí)例

[0058] 實(shí)例1

[0059] 通過Aspergillopepsin?II進(jìn)行膠原增溶的最佳條件。

[0060] 源自牛跟腱的不溶性I型膠原獲得自Sigma-Aldrich?Chemie?GmbH。制備在蒸餾水中pH范圍在2至4的一系列2％(w/v)膠原懸浮液。在攪拌懸浮液期間通過添加1N硫酸來調(diào)節(jié)pH。將1.5％(v/w，以膠原干重計(jì))Aspergillopepsin?II酶(500HPU/ml)添加至膠原懸浮液。將膠原在搖振水浴中于設(shè)定溫度(從50℃至65℃變動)下溫育1小時(shí)。通過移除樣品并在攪拌下用1M氫氧化鈉使pH升至7來終止反應(yīng)。隨后，使懸浮液濾過沃特曼濾紙(Whatman?filter?paper)來移除固體殘余物。通過總氮測定的Kjeldhal分析來測量增溶的膠原材料的蛋白質(zhì)含量。僅在pH?2下測量未添加酶的膠原增溶。圖1中的結(jié)果表明，在所有測試溫度下，pH?2-3下所增溶的膠原的量高于pH?4下所增溶的膠原的量。65℃時(shí)pH?2下的未添加酶的膠原增溶高于50℃和55℃時(shí)的膠原增溶。

[0061] 實(shí)例2

[0062] 來自用Aspergillopepsin?II和胃蛋白酶增溶的膠原的明膠的質(zhì)量

[0063] 源自牛跟腱的不溶性I型膠原獲自Sigma-Aldrich?Chemie?GmbH。制備在蒸餾水中pH?2.5和pH?4.5的一系列4％(w/v)膠原懸浮液。在攪拌懸浮液期間通過添加1N硫酸來調(diào)節(jié)pH。將0.1％(v/w，以膠原干重計(jì))Aspergillopepsin?II(500HPU/ml)或0.1％的(v/w，以膠原干重計(jì))來自豬胃粘膜的胃蛋白酶(Sigma-Aldrich,500U/ml)添加到膠原懸浮液中。將膠原懸浮液在搖振水浴中于50℃下溫育4小時(shí)。通過從懸浮液中移除樣品并用1M氫氧化鈉使pH升至7來終止反應(yīng)。隨后，在約40℃使樣品濾過沃特曼濾紙來移除固體殘余物(以防止凝膠形成)。

[0064] 使用純牛明膠(Sigma-Aldrich)參考線通過折射計(jì)(便攜式折射計(jì)ATAGO?Tokyo)來測量以總固體百分比表示的增溶的膠原材料的蛋白質(zhì)含量(產(chǎn)率)。

[0065] 隨后，將用Aspergillopepsin?II和胃蛋白酶增溶的膠原樣品在40℃的真空烘箱(Heraeus?Instruments)中干燥，并將濃縮的明膠在溫水中重新溶解至所需的蛋白質(zhì)濃度。制備4％蛋白質(zhì)凝膠樣品來比較兩種所得明膠的凝膠強(qiáng)度。

[0066] 此外，制備兩種其它樣品：一種是來自Aspergillopepsin?II處理過的膠原的6.6％蛋白質(zhì)凝膠，另一種是來自商購牛表皮明膠(Sigma-Aldrich)的6.6％蛋白質(zhì)凝膠。

[0067] 冷卻至室溫后，將樣品在8-10℃下儲存過夜以凝膠定形。使用質(zhì)構(gòu)分析儀TA.XT?PLUS(stable?Micro?systems)根據(jù)布盧姆方法測量4％凝膠的凝膠強(qiáng)度(以壓縮克數(shù)計(jì))和6.6％凝膠的布盧姆值。

[0068] 表1示出了用Aspergillopepsin?II進(jìn)行膠原處理后的明膠(可溶性膠原)的產(chǎn)率為用胃蛋白酶進(jìn)行處理的約3倍。此外，用Aspergillopepsin?II獲得的明膠與用胃蛋白酶獲得的明膠相比凝膠強(qiáng)度增加。用Aspergillopepsin?II處理后所得到的明膠具有與市售明膠相似的凝膠強(qiáng)度(布盧姆值)。

[0069] 表1：用Aspergillopepsin?II、胃蛋白酶制備的明膠和商購明膠(來自牛表皮)的產(chǎn)率和凝膠強(qiáng)度的比較。

[0070]

[0071] 實(shí)例3

[0072] 使用Aspergillopepsin?II從牛骨材料提取的明膠的布盧姆值

[0073] 將100g牛骨切片用4％-6％鹽酸處理以移除礦物質(zhì)。鹽酸濃度在浸漬過程中逐漸降至0.5％。一旦鹽酸濃度保持不變，則終止脫礦質(zhì)過程。

[0074] 通過添加5-15％氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至4.2-4.4。

[0075] 將骨切片用水洗滌以清潔骨表面上剩余的雜質(zhì)，然后將骨粉碎至小于1-5mm的大小。

[0076] 向預(yù)處理的骨顆粒中添加額外的水至濕骨與水的比率為1:7。添加0.1％(g/g濕骨)Aspergillopepsin?II并在53℃下提取4小時(shí)。通過添加氫氧化鈉將提取過程中的pH保持恒定在約4.2。

[0077] 然后將材料以4000rpm(大約2800g)離心10分鐘并收集上清液。以7:1的比率向殘余物中加水并用0.1％(g/g濕骨)Aspergillopepsin?II對明膠進(jìn)行二次提取。二次提取在53℃下進(jìn)行4小時(shí)，然后以4000rpm(～2800g)離心10分鐘。

[0078] 離心后根據(jù)折射計(jì)所測得的總固體含量計(jì)算產(chǎn)率。一次提取的產(chǎn)率介于50％至62％；二次提取的產(chǎn)率介于15％至27％。

[0079] 將來自兩次酶法提取的上清液合并，將pH調(diào)節(jié)至6以使酶失活。隨后，使溶液濾過硅藻土并對過濾的溶液在70℃下進(jìn)行真空濃縮，直至使用折射計(jì)所測的總固體含量為大約6.6％。

[0080] 如上文所述使用質(zhì)構(gòu)分析儀測量所獲得的明膠的布盧姆值(關(guān)于測定凝膠強(qiáng)度的方法，請參見1995年10月1日實(shí)施的中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB6783-94食品添加劑明膠)。

[0081] 酶處理的骨材料的布盧姆值為約240g。

[0082] 實(shí)例3中的結(jié)果表明可在從骨中提取膠原后使用Aspergillopepsin?II獲得良好質(zhì)量(布盧姆值240)的明膠。

[0083] 實(shí)例4

[0084] 使用多種酶的骨材料明膠提取的產(chǎn)率。

[0085] 每12小時(shí)用6％(w/w)鹽酸溶液酸化骨切片，進(jìn)行3天，以移除礦物質(zhì)。在脫礦質(zhì)過程結(jié)束時(shí)，將骨用水洗滌并用15％氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至6。將脫礦質(zhì)的骨磨碎至直徑<5mm。向預(yù)處理的骨中加水至7:1的比率。在添加酶之前，用20％磷酸溶液將pH調(diào)節(jié)至所需的值。

[0086] 為測試明膠提取(膠原增溶)的產(chǎn)率，將膠原用以下劑量為0.02％(v/w，酶:濕骨)的酶在50℃下溫育4小時(shí)：

[0087] -Apergillopepsin?II(500HPU/ml)，pH?2.5；

[0088] -Aspergillopepsin?I( AFP? 1000L,DSM產(chǎn)品,1000SAPU/g；EC.3.4.23.18)，pH?2.5；和

[0089] -木瓜蛋白酶( L,DSM產(chǎn)品，80-90U/ml)，pH?4.5；和

[0090] 未添加酶的膠原樣品，pH?2.5；和

[0091] 未添加酶的膠原樣品，pH?4.5。

[0092] 通過用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至6來終止酶反應(yīng)，隨后使材料濾過濾紙。

[0093] 使用折射計(jì)來測量膠原增溶(總固體增溶)的產(chǎn)率。圖2示出了用Aspergillopepsin?II進(jìn)行膠原溫育導(dǎo)致最高產(chǎn)率的可溶性膠原(明膠)。

[0094] 實(shí)例5

[0095] Aspergillopepsin?II對膠原的特異性裂解

[0096] 源自牛跟腱的不溶性I型膠原獲自Sigma-Aldrich?Chemie?GmbH。制備在蒸餾水中pH?4.5的一系列4％(w/v)膠原懸浮液。在攪拌懸浮液期間通過添加1N硫酸來調(diào)節(jié)pH。向膠原懸浮液中添加0.1％(v/w，以膠原干重計(jì))Aspergillopepsin?II酶(500U/ml)或木瓜蛋白酶( L,DSM產(chǎn)品，80-90U/ml)或不添加酶。將膠原懸浮液在搖振水浴中于50℃下溫育4小時(shí)。通過從懸浮液中移除樣品并用1M氫氧化鈉使pH升至7來終止反應(yīng)。隨后，在約40℃使懸浮液濾過沃特曼濾紙來移除固體殘余物(以防止凝膠形成)。

[0097] 使用Aspergillopepsin?II酶(500U/ml)和胃蛋白酶(Sigma-Aldrich,500U/ml)在pH?2.5下進(jìn)行如本文所述的pH?4.5下的類似實(shí)驗(yàn)。

[0098] 使用Laemmli的方法通過SDS-PAGE來分析增溶材料中存在的肽產(chǎn)物。將樣品與NuPage?LDL樣品緩沖液(Invitrogen?Corp.)、還原劑混合并在70℃下加熱10分鐘。隨后使用NuPage?MES?SDS電泳緩沖液將10μl樣品加載到4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上。使用SeeBlue?Plus2(Invitrogen)作為分子量標(biāo)記。將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。使用OptiGO掃描儀(Isogen?life?sciences)通過Totallab分析軟件(Isogen?life?sciences)來測定蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度并計(jì)算蛋白質(zhì)的重量。

[0099] 圖3為在pH?4.5下用Aspergillopepsin?II獲得的增溶的膠原的SDS凝膠的一個(gè)實(shí)例。該圖示出了對應(yīng)于約80kDa大小的顯著的肽帶。約80kDa的顯著的肽帶也存在于在pH?2.5下用Aspergillopepsin溫育的增溶的膠原中。

[0100] 這種約80kDa的肽在用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶溫育后不存在或幾乎不可見(結(jié)果未示出)。