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一種快速檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法

閱讀：625發(fā)布：2020-05-11

專利匯可以提供一種快速檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且本 發(fā)明 涉及 殺蟲劑 抗藥性檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測桃蚜對擬 除蟲菊 酯 類殺蟲劑抗藥性的方法。本發(fā)明基于桃蚜 電壓 門 控Na+通道突變設計了LAMP引物組，其包含序列如SEQ?ID?NO.1-2所示的外引物對和序列如SEQ?ID?NO.3-4的內引物對。利用本發(fā)明提供的LAMP引物組和檢測方法在60min內即可完成桃蚜對擬 除蟲菊酯 類殺蟲劑抗藥性的檢測，且特異性高、靈敏度高、準確性高，可實現(xiàn)桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的早期、快速、高效檢測，適于推廣應用。，下面是一種快速檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法專利的具體信息內容。

1.用于檢測桃蚜電壓門控Na+通道突變的LAMP引物組，其特征在于，包含外引物對和內引物對，其中，外引物對的序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，內引物對的序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。
2.包含權利要求1所述的LAMP引物組的試劑盒。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含選自反應緩沖液、鏈置換DNA聚合酶，dNTPs、MgSO4、丙三醇、二甲基亞砜中的一種或多種。
4.權利要求1所述的LAMP引物組或權利要求2或3所述的試劑盒在檢測桃蚜電壓門控Na++
通道突變中的應用；優(yōu)選地，所述電壓門控Na通道突變?yōu)長1014F突變。
5.權利要求1所述的LAMP引物組或權利要求2或3所述的試劑盒在檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性中的應用。
6.一種檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法，其特征在于，包括：利用權利要求1所述的LAMP引物組或權利要求2或3所述的試劑盒進行LAMP擴增反應。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述LAMP擴增反應的反應程序包括：60-64℃反應40-50min，85℃反應3～6min。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述LAMP擴增反應的反應體系包括終濃度為1～3μM的外引物對和終濃度為12～20μM的內引物對；
優(yōu)選地，所述反應體系還包括終濃度為1～3％的二甲基亞砜。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAMP擴增反應的25μL反應體系包括：
2.5μL?10×反應緩沖液、8U鏈置換DNA聚合酶，1μL待測桃蚜基因組DNA、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物對、終濃度16μM的內引物對、1.5μL的丙三醇和0.25μL的二甲基亞砜。
10.根據(jù)權利要求6～9任一項所述的方法，其特征在于，根據(jù)LAMP擴增反應的顏色變化或根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳檢測條帶判斷待測桃蚜是否存在電壓門控Na+通道突變。

說明書全文

一種快速檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法

技術領域

[0001] 本發(fā)明涉及殺蟲劑抗藥性檢測技術領域，具體涉及一種基于環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法。

背景技術

[0002] 農林有害生物會嚴重危害農業(yè)和林業(yè)的發(fā)展，目前已報道的農林有害生物種類繁多，其中，蝗蟲、桃蚜、草地貪夜蛾、小麥赤霉病、稻瘟病等均會對植物造成嚴重危害。目前，化學防治仍在有害生物防治中發(fā)揮主要作用，但是，化學農藥的不合理使用，如對單一藥劑品種的長期依賴和過量、頻繁使用，使有害生物抗性頻發(fā)，藥劑防治效果下降。目前，至少有30種農作物害蟲對40種殺蟲劑產(chǎn)生不同程度的抗性。病蟲害抗藥性的產(chǎn)生往往會導致病蟲害防治難度加大，易造成病蟲害的再猖獗。同時，病蟲害的抗藥性迫使投入更多的化學農藥，不僅易對環(huán)境造成多種污染，而且會殺傷多種非靶標生物。農藥殘留已經(jīng)成為農產(chǎn)品質量的主要威脅。
[0003] 桃蚜是重要的多食性經(jīng)濟害蟲，具有生活周期短、世代重疊嚴重、繁殖快、后代存活率高等特點，導致桃蚜的危害性十分嚴重。桃蚜危害到50個科的400多種植物，主要有十字花科的油菜、甘藍、辣椒、白菜、薺菜等，薔薇科的桃樹、杏樹、李樹等，茄科的馬鈴薯、煙草、番茄等，豆科的大巢菜、紫云英等。桃蚜以成蟲和若蟲的形態(tài)聚集在葉背面以及嫩莖、嫩梢上，刺吸大量的汁液，造成植物葉片卷縮變形、發(fā)黃、失水，使得植物營養(yǎng)缺失、發(fā)育不良、生長緩慢。除此以外，桃蚜分泌的蜜露還會引發(fā)煤污病，影響作物的質量。同時桃蚜作為植物病毒傳播的媒介，可傳播100多種植物病毒，如黃瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒、煙草花葉病毒等，直接影響到了經(jīng)濟作物的正常生長，造成大量減產(chǎn)。
[0004] 擬除蟲菊酯類殺蟲劑包括高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯等，對于桃蚜具有較好的殺滅作用，但是桃蚜會迅速產(chǎn)生抗藥性。導致害蟲抗藥性的一個主要形式是擊倒抗性。擊倒抗性最早被用來描述家蠅沒有被DDT擊倒并存活下來的現(xiàn)象，并且還與擬除蟲菊酯類殺蟲劑存在交互抗性。到目前為止幾乎所用的農業(yè)、衛(wèi)生害蟲中都存在擊倒抗性。對擊倒抗性的研究表明，這種抗性主要是由Na+通道特定位置的氨基酸突變所致。Williamson等最早通過遺傳分子標記的方法將家蠅擊倒抗性基因定位于Na+通道，通過測序發(fā)現(xiàn)位于家蠅Na+通道基因ⅡS6上的第1014位亮氨酸到苯丙氨酸的突變(L1014F)是擊倒抗性產(chǎn)生的原因。殺蟲劑靶標突變是害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要原因之一，如與有機磷殺蟲劑、氨基甲酸酯類殺蟲劑相關的乙酰膽堿酯酶突變、與新煙堿類殺蟲劑相關的乙酰膽堿受體突變。這些突變多為單堿基突變，因此可以利用單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)檢測技術確定抗性相關突變位點是否存在。
[0005] 環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)是利用具有很強的鏈置換能力的Bst?DNA?Polymerase，識別針對目標序列六個特定區(qū)域設計的兩對引物在等溫條件下實現(xiàn)擴增反應。兩對引物包括：外引物F3和B3，內引物FIP(forward?inner?primer)和BIP(backward?inner?primer)。LAMP反應首先在一對外引物的作用下擴增出內引物結合的片段，緊接著在一對內引物的作用下合成目的序列，由于內引物擴增的DNA產(chǎn)物包含與該引物5’端反向互補的序列，所以擴增產(chǎn)物內部會形成莖環(huán)結構。Bst?DNA?Polymerase將該產(chǎn)物置換下來之后，在另外一條內引物的作用下在DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結構，形成啞鈴結構，如此往復循環(huán)。由于內引物發(fā)生反應的起始時間不同，所以最終會形成大小不一的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中可以觀察到連續(xù)的條帶。在擴增反應中大量的焦磷酸根離子被解離下來，與反應體系中的鎂離子結合，形成焦磷酸鎂白色沉淀，使反應體系變得渾濁，可用肉眼觀察到沉淀的有無來判斷LAMP反應是否發(fā)生。LAMP技術在恒溫的條件下在60min內就可以實現(xiàn)目的片段的大量擴增，具有反應迅速、靈敏性高、特異性強、對設備要求低、結果易于觀察等優(yōu)點，非常適合昆蟲基因突變情況在田間的快速檢測。中國專利CN201510204854.6建立了一種多菌靈抗性基因型F200Y核盤菌的LAMP檢測技術。目前對于桃蚜的抗藥性的檢測方法存在靈敏度低、周期長、材料要求高、人力要求高等問題，尚沒有關于桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的快速高效的檢測方法。

發(fā)明內容

[0006] 為解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種LAMP快速高效檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明經(jīng)過多年的田間采集和室內選育獲得了桃蚜對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯的敏感品系和抗性品系，并發(fā)現(xiàn)桃蚜的抗性品系的電壓門控Na+通道(Sodium?Channel)存在抗性相關突變L1014F。電壓門控Na+通道的L1014F突變主要導致對DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性。本發(fā)明通過針對桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的靶標變異——電壓門控Na+通道L1014F突變設計2對LAMP特異性擴增引物，利用該LAMP引物組進行LAMP擴增反應，檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性。
[0008] 具體地，本發(fā)明的技術方案如下：
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供用于檢測桃蚜電壓門控Na+通道突變的LAMP引物組，包含外引物對和內引物對，其中，外引物對的序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，內引物對的序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。
[0010] 外引物F3：CAAAGACCACGAGCTTCC；
[0011] 外引物B3：CCGAGTAGTACATATTTATCATTCA；
[0012] 內引物FIP：GTCCCACATTGATTCTATCCATTCGAACTTCACCGATTTTTTGCA；
[0013] 內引物BIP：CTGTTTACACGTCGGAGAACCAAAGTACTTATACATACCACGAA。
[0014] 本發(fā)明所述的電壓門控Na+通道突變具體為第1014位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?L1014F)。
[0015] 上述引物組所針對的電壓門控Na+通道L1014F突變片段序列如SEQ?ID?NO.5所示，其中，Y代表C/T(該位點突變前為C，突變后為T)，對應L1014F突變。
[0016] 本發(fā)明中，擬除蟲菊酯類殺蟲劑包括但不限于高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯。
[0017] 第二方面，本發(fā)明提供所述LAMP引物組在制備用于桃蚜抗藥性檢測試劑盒中的應用。
[0018] 第三方面，本發(fā)明提供包含所述LAMP引物組的試劑盒。
[0019] 所述試劑盒還可包含選自反應緩沖液、鏈置換DNA聚合酶，dNTPs、MgSO4、丙三醇、二甲基亞砜中的一種或多種。上述試劑可以共同組成LAMP反應液，所述LAMP反應液可與所述LAMP引物組組成LAMP擴增反應的反應體系。
[0020] 第四方面，本發(fā)明提供所述LAMP引物組或包含所述LAMP引物組的試劑盒在檢測桃蚜電壓門控Na+通道突變中的應用。
[0021] 所述電壓門控Na+通道突變具體為L1014F突變。
[0022] 第五方面，本發(fā)明提供所述LAMP引物組或包含所述LAMP引物組的試劑盒在檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性中的應用。
[0023] 第六方面，本發(fā)明提供一種檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法，包括：利用所述LAMP引物組或包含所述LAMP引物組的試劑盒進行LAMP擴增反應。
[0024] 優(yōu)選地，所述LAMP擴增反應的反應程序包括：60-64℃反應40-50min，85℃反應3～6min。
[0025] 優(yōu)選地，所述LAMP擴增反應的反應體系包括終濃度為1～3μM的外引物對和終濃度為12～20μM的內引物對。
[0026] 更優(yōu)選地，所述反應體系還包括1～3％二甲基亞砜
[0027] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述LAMP擴增反應的25μL反應體系包括：2.5μL?10×反應緩沖液、8U鏈置換DNA聚合酶，1μL單頭待測桃蚜基因組DNA、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物對、終濃度16μM的內引物對、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亞砜。
[0028] 上述反應體系可加水補足至25μL。
[0029] 優(yōu)選地，所述檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥性的方法中，根據(jù)LAMP擴增反應的顏色變化或根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳檢測條帶判斷待測桃蚜是否存在電壓門控Na+通道突變。
[0030] 作為本發(fā)明的一種實施方式，在LAMP擴增反應結束后加入核酸染料SYBR?Green?I進行反應，若反應顏色為熒光綠色，則待測桃蚜為抗性突變個體；若反應顏色為淺褐色，則待測桃蚜為敏感未突變個體。
[0031] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性桃蚜存在電壓門控Na+通道的L1014F突變，針對該突變設計了高效特異的LAMP引物組，針對該引物組開發(fā)了LAMP檢測方法，實現(xiàn)了桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的快速高效檢測，對于抗性害蟲的準確檢測、抗性群體發(fā)展動態(tài)的信息獲得以及指導科學用藥、降低成本和減少環(huán)境污染具有重要意義。與傳統(tǒng)的桃蚜抗藥性檢測方法相比，本發(fā)明提供的檢測方法具有以下優(yōu)勢：
[0032] 1、特異性高、可重復性高：本發(fā)明提供的LAMP引物組具有高度的特異性，可特異檢+測電壓門控Na 通道L1014F突變，對于未突變的野生型則無法擴增，同時具有高度的可重復性。
[0033] 2、準確性高：本發(fā)明的LAMP檢測方法具有較高的準確性，判斷為陽性檢測結果的樣品與電壓門控Na+通道L1014F突變的符合率高。
[0034] 3、靈敏度高：本發(fā)明提供的LAMP檢測方法的靈敏度高，擴增模板所需量少，最少只需要10個拷貝數(shù)的模板就可以在短時間內擴增109-1010倍，比傳統(tǒng)的PCR擴增技術高100-1000倍。
[0035] 4、假陽性率低：本發(fā)明通過LAMP引物組的特異設計并配合在LAMP反應體系中加入二甲基亞砜有效降低了假陽性的產(chǎn)生。
[0036] 5、檢測周期短：本發(fā)明的LAMP檢測方法在60分鐘內即可完成檢測，極大地縮短了桃蚜抗藥性檢測的周期，提高了檢測的工作效率。
[0037] 6、簡單易行：本發(fā)明的LAMP檢測方法只需在恒溫下進行，水浴、金屬浴加熱即可完成檢測，不需要昂貴的儀器設備，且操作步驟簡單。
[0038] 7、結果易于鑒定：本發(fā)明的LAMP檢測方法可通過觀察是否有白色沉淀或者通過添加核酸染料SYBR?Green?I，觀察反應后的顏色變化，判斷反應是否進行，進而判斷桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性。附圖說明
[0039] 圖1為本發(fā)明實施例1中不同濃度二甲基亞砜對LAMP反應假陽性產(chǎn)生的影響分析結果；其中，M：DNA?marker，1-3為未添加二甲基亞砜，1：模板為水，2：模板為未突變質粒，3：模板為突變質粒；4-6為添加1％二甲基亞砜，4：模板為水，5：模板為未突變質粒，6：模板為突變質粒；7-9為添加2％二甲基亞砜，7：模板為水，8：模板為未突變質粒，9：模板為突變質粒；10-12為添加3％二甲基亞砜，10：模板為水，11：模板為未突變質粒，12：模板為突變質粒；13-15為添加4％二甲基亞砜，13：模板為水，14：模板為未突變質粒，15：模板為突變質粒。
[0040] 圖2為本發(fā)明實施例1中不同反應時間、溫度的LAMP反應電泳圖；其中，A為不同反應時間的LAMP反應電泳圖，M：DNA?marker1-6依次是63℃反應25min、30min、35min、40min、45min和50min；B為不同反應溫度的LAMP反應電泳圖，M：DNA?marke，1-7依次是56℃、58℃、
60℃、62℃、64℃、66℃和68℃反應40min。
[0041] 圖3為本發(fā)明實施例2中LAMP檢測方法的特異性及重復性分析；其中，A為LAMP檢測L1014F突變的核酸染料SYBR?Green?I顯色變化圖；B為LAMP檢測L1014F突變的瓊脂糖凝膠電泳圖；M：DNAmarker；1-3：模板為ddH2O；4-6：模板為野生型桃蚜DNA；7-9：模板為含L1014F突變的質粒。
[0042] 圖4為本發(fā)明實施例3中LAMP產(chǎn)物酶切驗證電泳圖；其中，M：DNA?marker，1：含L1014F突變的質粒，2：LAMP產(chǎn)物經(jīng)HinfI酶切的產(chǎn)物。

具體實施方式

[0043] 下面將結合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 實施例1?利用LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的方法的建立
[0047] 1、LAMP引物組設計
[0048] 針對桃蚜電壓門控Na+通道L1014F突變，本發(fā)明經(jīng)過大量實驗篩選和優(yōu)化獲得了具有高度特異性、結合力和擴增效率的LAMP引物組，其由一對外引物和一對內引物組成，其中，一對外引物的序列如SEQ?ID?NO.1-2所示，一對內引物的序列如SEQ?ID?NO.3-4所示，L1014F突變位點位于反向內引物BIP的3’端。
[0049] 外引物F3：CAAAGACCACGAGCTTCC；
[0050] 外引物B3：CCGAGTAGTACATATTTATCATTCA；
[0051] 內引物FIP：GTCCCACATTGATTCTATCCATTCG-AACTTCACCGATTTTTTGCA；
[0052] 內引物BIP：CTGTTTACACGTCGGAGAACCAA-AGTACTTATACATACCACGAA。
[0053] 2、LAMP反應體系的確定
[0054] 本發(fā)明通過在LAMP反應體系中加入二甲基亞砜并優(yōu)化其濃度，有效降低了假陽性率，并確定了最佳的反應體系。
[0055] LAMP反應的25μL體系如下：2.5μL?10×Bst?Buffer、8U?Bst?2.0DNA?Polymerase，1μL擴增模板、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物對、終濃度16μM的內引物對、1.5μL的丙三醇和二甲基亞砜，二甲基亞砜的加入量分別為0、0.25、0.5、0.75或1μL，加雙蒸水至反應總體積為25μL。
[0056] 每3個樣品為一組，其中1-3、4-6、7-9、10-12和13-15樣品的反應體系中二甲基亞砜的加入量分別為0、0.25、0.5、0.75和1μL，每組的3個樣品的擴增模板依次為水、未突變質粒和突變質粒。
[0057] 未突變質粒和突變質粒的構建方法如下：
[0058] (1)PCR擴增目的片段：采用基因組DNA提取試劑盒提取單頭無翅成蚜的基因組DNA，以L1014F雜合突變桃蚜的基因組DNA為模板，使用上游引物(kdr-S:5’-TATGCAGTTATTTGGAAA-3’)下游引物(kdr-A:5’-GTAGGTTCTGGATAGCAA-3’)對包含LAMP目的序列的DNA片段進行PCR擴增。PCR擴增反應體系(共25μL)如下：12.5μL?2×Phanta?Max?Master?Mix，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL基因組DNA。PCR擴增反應程序如下：94℃預變性3min；35個循環(huán)(94℃變性30s，46℃退火40s，72℃延伸40s)；72℃徹底延伸7min。
[0059] (2)質粒構建：將PCR產(chǎn)物進行膠回收后,將目的產(chǎn)物連接到質粒pClone007Blunt?Simple?Vector。反應體系：1μL純化產(chǎn)物，1μLpClone007Blunt?Simple?Vector，10×Topo?Mix?1μL，ddH2O?7μL。在室溫(22-30℃)條件下反應1-5min。
[0060] (3)細菌轉化和提取質粒：取100μL冰浴上融化的感受態(tài)細胞,加入連接產(chǎn)物輕輕混勻，冰上靜置25min；42℃水浴熱激30-45s，迅速轉移至冰浴中，靜置2min；向離心管中加入不含抗生素的無菌培養(yǎng)基，混勻后37℃、200rpm復蘇1h；吸取復蘇液均勻涂布到含抗生素的LB培養(yǎng)基上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，提取質粒送公司進行測序。將測序正確的、包含L1014F突變的質粒(突變質粒)和不包含L1014F突變的質粒(未突變質粒)于-20℃保存，待用。
[0061] LAMP反應程序為：63℃反應40min，85℃反應5min。
[0062] 反應體系中加入不同濃度的二甲基亞砜的擴增結果分析：取5μLPCR擴增產(chǎn)物，在2.0％的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外光下檢測，結果如圖1所示，1、4、7、10、13樣品無特異性條帶，以水為模板的對照組未發(fā)生假陽性擴增。2樣品有特異性條帶但不明顯，5、8、11、14樣品無特異性條帶，未加入二甲基亞砜的樣品發(fā)生假陽性擴增，而加入二甲基亞砜后，假陽性擴增被有效抑制。3、6、9、12樣品有特異性條帶，隨著二甲基亞砜濃度的升高條帶的亮度逐漸降低。15樣品無特異性條帶，當二甲基亞砜的濃度達到4％時，LAMP反應被徹底抑制，不發(fā)生反應。以上結果表明，不添加二甲基亞砜時，LAMP體系會發(fā)生非特異性擴增，1-3％的二甲基亞砜添加可以有效抑制假陽性的產(chǎn)生，4％及以上的二甲基亞砜添加會徹底抑制LAMP反應的發(fā)生。因此，確定在反應體系中加入1-3％的二甲基亞砜抑制假陽性的產(chǎn)生。
[0063] 3、LAMP反應條件的確定
[0064] 采用上述2中確定的LAMP反應體系，進行LAMP反應條件的優(yōu)化，具體如下：
[0065] LAMP反應體系(25μL)：2.5μL10×Bst?Buffer、8U?Bst?2.0DNAPolymerase，1μL突變質粒、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物、終濃度16μM的內引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亞砜，加雙蒸水至反應總體積為25μL。
[0066] LAMP反應程序：
[0067] 反應時間的確定：分別在63℃反應25min、30min、35min、40min、45min和50min(上述反應時間對應的樣品依次命名為樣品1-6)，85℃反應5min。
[0068] 反應溫度的確定：分別在56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃和68℃(上述反應溫度對應的樣品依次命名為樣品1-7)反應40min，85℃反應5min。
[0069] 結果分析：取5μL?PCR擴增產(chǎn)物，在2.0％的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外光下檢測，結果如圖2所示。圖2的A顯示，1-3樣品無特異性條帶或者特異性條帶不明顯，4-6樣品特異性條帶明顯，并且特異性條帶的亮度隨著反應時間的增加而增加。隨著反應時間的增加，LAMP反應產(chǎn)物逐漸增多。結果表明，在LAMP反應發(fā)生40-50min后，可以產(chǎn)生大量的反應產(chǎn)物。圖2的B顯示，1、2、6和7樣品無特性條帶或者特異性條帶不明顯，3-5樣品特異性條帶明顯。隨著溫度的升高LAMP反應開始進行，溫度進一步升高又會抑制LAMP反應。結果表明，當溫度在60℃-64℃時，LAMP反應可以有效的進行。
[0070] 綜合以上結果，確定利用LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的方法具體如下：采用序列如SEQ?ID?NO.1-4的引物組進行LAMP反應；LAMP反應體系(25μL)為：2.5μL10×Bst?Buffer、8U?Bst2.0DNA?Polymerase，1μL突變質粒、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物、終濃度16μM的內引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亞砜，加雙蒸水至反應總體積為25μL。LAMP反應程序為：60-64℃反應40-50min，85℃反應3～6min。
[0071] 實施例2?LAMP檢測方法的特異性及重復性分析
[0072] 為驗證實施例1提供LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性方法的特異性，分別以含L1014F突變質粒(陽性對照)、野生型桃蚜基因組DNA、雙蒸水(陰性對照)為模板，進行LAMP反應，每個模板設置三個重復。
[0073] LAMP反應體(25μL)系：2.5μL?10×Bst?Buffer、8U?Bst?2.0DNAPolymerase，1μL擴增模板、終濃度1.4mM的dNTPs、終濃度4mM的MgSO4、終濃度2μM的外引物、終濃度16μM的內引物、1.5μL的丙三醇、0.25μL的二甲基亞砜，加雙蒸水至反應總體積為25μL。
[0074] LAMP反應程序：63℃反應40min，85℃反應5min。
[0075] LAMP反應結束后在反應體系中加入SYBR?Green?I進行顯色反應。
[0076] 結果分析：根據(jù)反應體系顏色作為結果判斷標準，結果如圖3的A所示，以雙蒸水(陰性對照)為模板的樣品1-3呈現(xiàn)黃褐色；以野生型桃蚜個體(敏感個體)基因組DNA為模板的樣品4-6呈現(xiàn)黃褐色；以含L1014F突變質粒為模板的樣品7-9呈現(xiàn)熒光綠。
[0077] 為了進一步驗證上述顏色變化判斷結果的準確性，取5μL?PCR擴增產(chǎn)物，在2.0％的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外光下檢測，結果如圖3的B所示，以雙蒸水(陰性對照)和野生型桃蚜個體(敏感個體)基因組DNA為模板的樣品1-6樣品均無條帶，以含L1014F突變質粒為模板的樣品7-9呈現(xiàn)一系列不同大小的DNA片段，電泳結果與顏色檢測結果一致。以上結果說明，實施例1提供LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性方法具有較高的特異性。
[0078] 實施例3?LAMP檢測方法的準確性分析
[0079] 對實施例1提供LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性方法的準確性進行分析，具體如下：
[0080] 在實施例1提供的LAMP的內引物(SEQ?ID?NO.3-4)擴增區(qū)域上鑒定有HinfI限制性核酸內切酶酶切位點，因此，通過在LAMP反應結束后，用HinfI酶酶切LAMP產(chǎn)物，分析LAMP檢測的準確性。
[0081] HinfI酶酶切反應體系：2.5μL?10×NEBuffer，10U?HinfI，10μLLAMP反應產(chǎn)物，加雙蒸水至反應總體積為25μL。
[0082] 反應程序：37℃反應40min，80℃反應10min。
[0083] 結果分析：將酶切產(chǎn)物進行電泳檢測，結果如圖4所示。由于LAMP反應產(chǎn)物是由一系列重復的目標序列連接而成，使用HinfI限制性核酸內切酶降解后可得到160bp左右大小的DNA片段，表明實施例1提供LAMP檢測桃蚜對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性方法具有較高的準確性。
[0084] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
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