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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及與嵌合蛋白質(zhì)同二聚或多聚的，較好是非肽的有機(jī)分 子的低聚合有關(guān)的材料、方法及應(yīng)用。借助對(duì)宿主細(xì)胞的重組修飾及 其在基因治療中的應(yīng)用或可誘導(dǎo)基因表達(dá)的其他應(yīng)用，舉例說明了本 發(fā)明的若干方面。

引言

生物學(xué)特異性通常是由蛋白質(zhì)間高度特異性的相互作用而導(dǎo)致的。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)即是這一原理的實(shí)際例證，借助這一過程細(xì)胞外分子影響到 細(xì)胞內(nèi)行為。許多途徑都是隨著細(xì)胞外配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā) 生的。在許多情況下，受體二聚合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)磷酸化及補(bǔ)充，所 述蛋白質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。認(rèn)識(shí)到膜受體可經(jīng)過同二聚作用而 被激活是從受體可由交聯(lián)了兩個(gè)受體的抗體所激活這一觀察結(jié)果而得 出的。其后，發(fā)現(xiàn)許多受體都有這些性質(zhì)。據(jù)信許多受體的細(xì)胞外和 跨膜區(qū)域都通過配體依賴性二聚合或低聚合，將受體的胞漿區(qū)帶向密 切接近處而發(fā)揮功能的，而受體的胞漿區(qū)則將特定信號(hào)傳遞給細(xì)胞的 內(nèi)部對(duì)應(yīng)部分。

其他一些人已研究了配體-受體在不同的系統(tǒng)中的相互作用。例 如Clark等人(Science(1992)258，123)描述了B細(xì)胞抗原受體 復(fù)合物的胞漿效應(yīng)物。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8， 1715)、Verweij等人(J.Biol.Chem.(1990)265，15788)和 Shaw等人(Science(1988)241，202)報(bào)導(dǎo)NF-AT指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是 嚴(yán)格處于抗原受體控制下的。Emmel等人(Science(1989)246， 1617)和Flanagan等人(Nature(1991)352，803)報(bào)導(dǎo)了環(huán)孢素 A(cyclosporin?A)和FK506對(duì)NF-AT-指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的抑制作用。 Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)和Mattila等 人(EMBO?J.(1990)9，4425)描述了NF-AT結(jié)合位點(diǎn)。描述ζ鏈 的參考文獻(xiàn)包括Orloff，等人Nature(1990)347，189-191；Kinet， 等人，Cell(1989)57，351-354；Weissman，等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1988)85，9709-9713和Lanier，Nature(1989) 342，803-805。Byrn等人(Natcvre(1990)344，667-670)描述 了CD4免疫粘附蛋白(inmunoadhesin)。Irving等人(Cell(1992) 64，891)，以及Letourner和Klausner(Science(1992)255，79) 描述了CD8-ζ融合的蛋白質(zhì)。

描述與啟動(dòng)子區(qū)域關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子和不同的活化作用DNA結(jié)合的 及轉(zhuǎn)錄因子的文章包括：Keegan等人，Natuve(1986)231，699； Fields?and?Song，ibid(1989)340，245；Jones，Cell(1990) 61，9；Lowin，Cell(1990)61，1161；Ptashne?and?Gann，Nature (1990)346，329；Adams?and?Workman，Cell(1993)72，306。

描述孢囊擊靶和融合的文章包括：Sollner等人，(1993) Nature?362，318-324；和Bennett?and?Scheller(1993)Proc. Natl.Acad.Sci.USA90，2559-2563。

描述調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解的文章包括：Hochstrasser等人(1990) Cell61，697；Scheffner，M.等人(1993)Cell75，495；Rogers 等人(1986)Science?234，364-368。

提供合成技術(shù)和FK506及相關(guān)化合物的修飾方面的其他信息的公 開包括：GB2244991A；EP0455427A1；WO91/17754；EP 0465426A1；US5,023,263和WO92/00278。

然而，如從本說明書中可以看出的，前述作者都沒有描述或提示 本發(fā)明。下文中詳細(xì)公開的我們的發(fā)明包括利用蛋白質(zhì)在活細(xì)胞內(nèi)同 二聚合、異二聚合和低聚合的普遍適用的方法及材料。嵌合應(yīng)答蛋白 質(zhì)是作為有特異性受體區(qū)地融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的。用與受體區(qū) 域結(jié)合的細(xì)胞可透穿性多價(jià)配體試劑處理細(xì)胞，導(dǎo)致嵌合體的二聚合 或低聚合。與其他嵌合受體(如參見Weiss，Cell(1993)73，209) 相似，設(shè)計(jì)嵌合蛋白質(zhì)以使低聚合作用激發(fā)繼后的變化過程，如細(xì)胞 內(nèi)信號(hào)通過繼后的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用傳播，從而激活特異性亞 群的轉(zhuǎn)錄因子。可使用受體基因檢測(cè)法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的開始。由合成配體 在細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)嵌合蛋白質(zhì)對(duì)于各種細(xì)胞過程的基礎(chǔ)研究和在調(diào)節(jié)有治 療或農(nóng)業(yè)重要性之蛋白質(zhì)的合成中具有潛在作用。此外，配體介導(dǎo)的 低聚合目前已使調(diào)節(jié)的基因治療得以可能實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，它提 供了一種新方法以提高用基因治療得到的安全性、表達(dá)水平及總體效 果。

發(fā)明的概述

本發(fā)明提供新的嵌合的(或“融合的”)蛋白質(zhì)及能夠使嵌合蛋 白質(zhì)低聚合的小的有機(jī)分子。該嵌合蛋白質(zhì)至少含有一個(gè)與下文詳述 的附加(“作用”)區(qū)域融合的配體結(jié)合(或“受體”)區(qū)域。如下 文也將述及的，嵌合蛋白質(zhì)也可含有附加區(qū)域。就其各個(gè)區(qū)域是得自 不同的來源，因而并非一起見于自然界(即是異種的)這個(gè)意義上說， 嵌合蛋白質(zhì)是重組的。

基因，即RNA或更好是DNA分子，在本文中是指編碼新嵌合蛋白 質(zhì)，及可選擇的靶基因的“遺傳”(或“DNA”)構(gòu)建體，以對(duì)宿主 細(xì)胞進(jìn)行基因工程修飾。還提供了生產(chǎn)和使用這些經(jīng)修飾之細(xì)胞的方 法和組合物。本發(fā)明的經(jīng)工程修飾的細(xì)胞至少含有一個(gè)這樣的嵌合蛋 白質(zhì)或第一系列的編碼嵌合蛋白質(zhì)的遺傳構(gòu)建體。這些構(gòu)建體就其組 成部分，如編碼特定區(qū)域或表達(dá)控制序列的各部分并在自然界中未被 發(fā)現(xiàn)直接連接到另一個(gè)部分上(即，是異種的)這個(gè)意義上說，它們 是重組體。

本發(fā)明的一個(gè)DNA構(gòu)建體編碼一種包括(a)至少一個(gè)與(b)異 種附加(“作用”)蛋白質(zhì)區(qū)域融合的受體區(qū)域(能夠與選擇的配體 結(jié)合)的嵌合蛋白質(zhì)。重要的是，配體能夠與兩個(gè)(或多個(gè))受體區(qū) 域結(jié)合，即以任一順序或同時(shí)，較好以低于大約10-6，更好以低于 約10-7，甚至最好以低于大約10-8，并且在某些實(shí)例中以低于 10-9M的Kd值與含有這些受體區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合。較好的配 體是非蛋白質(zhì)并且具有小于大約5KDa的分子量。如此低聚合的嵌合 蛋白質(zhì)的受體區(qū)域可以是相同或不同的。嵌合蛋白質(zhì)能夠在暴露于配 體之后，即彼此低聚合后發(fā)動(dòng)生物學(xué)過程。被編碼的嵌合蛋白質(zhì)可進(jìn) 一步包含能夠?qū)⑶逗系鞍踪|(zhì)指向預(yù)期的細(xì)胞對(duì)應(yīng)部分的細(xì)胞內(nèi)擊靶區(qū) 域。擊靶區(qū)域可能是分泌性前導(dǎo)序列、跨膜序列、膜結(jié)合區(qū)或指導(dǎo)蛋 白質(zhì)例如與泡囊或與核聯(lián)系的序列。

嵌合蛋白質(zhì)的作用區(qū)域可以選自能夠在該嵌合蛋白質(zhì)低聚合后影 響所需生物學(xué)結(jié)果的多種不同蛋白質(zhì)的區(qū)域。例如，作用區(qū)可包含如 CD3?zeta(ζ)亞單位這樣的蛋白質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域在接觸配體并繼 而低聚后，能夠發(fā)起可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)；作用區(qū)還包含如Gal4這 樣的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，或如VP16這樣的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。本文提供了許 多其他的例子。可檢測(cè)之細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的一個(gè)例子是在可對(duì)低寡作用反 應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件(如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子元件等)的轉(zhuǎn)錄控制下，激活 基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。

如下文更詳細(xì)討論的，在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中，嵌合蛋白質(zhì) 能夠結(jié)合FK506型配體、環(huán)孢菌素A型配體、四環(huán)素或類固醇配體。 這種結(jié)合導(dǎo)致嵌合蛋白質(zhì)與其他可以相同或不同的嵌合蛋白質(zhì)分子的 低聚合。

細(xì)胞還可以含有第二個(gè)重組基因構(gòu)建體或第二系列的所述構(gòu)建體， 該構(gòu)建體包含處于轉(zhuǎn)錄控制元件(如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)的轉(zhuǎn)錄控制下 的靶基因，所說的轉(zhuǎn)錄控制元件對(duì)由配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚合， 即與配體接觸所激發(fā)的信號(hào)反應(yīng)。就靶基因并非天然處于反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄 控制元件的轉(zhuǎn)錄控制之下而言，這些構(gòu)建體是重組的。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，DNA構(gòu)建體含有(a)對(duì)上述嵌合蛋白質(zhì) 的低寡合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件，和(b)來自靶基因的側(cè)翼序列， 該序列允許轉(zhuǎn)錄控制元件同源重組到與靶基因相關(guān)聯(lián)的宿主細(xì)胞中。 在另一實(shí)施方案中，構(gòu)建體含有所需基因的允許靶基因同源重組到所 需座位中之靶座位的側(cè)翼DNA序列。構(gòu)建體還可含有反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制 元件，或可由座位提供的反應(yīng)性元件。靶基因可編碼表面膜蛋白質(zhì)、 分泌的蛋白質(zhì)、胞質(zhì)蛋白質(zhì)或核酶(ribozyme)或反義序列。

本發(fā)明的構(gòu)建體還可含有允許構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中并選擇含 有該構(gòu)建體之轉(zhuǎn)染體的可選擇標(biāo)志。本發(fā)明進(jìn)一步包括含有這種用于 附加體轉(zhuǎn)染(episomal?tranfection)或整合到宿主細(xì)胞染色體中之 構(gòu)建體的載體。該載體可以是病毒載體，例如包括腺病毒、腺樣病毒 載體或反錄病毒載體。

本發(fā)明還包括由我們的任何一個(gè)DNA構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)， 以及含有和/或表達(dá)它們的細(xì)胞，包括原核和真核細(xì)胞，特別是各種 類型和譜系的酵母、蠕蟲、昆蟲、小鼠或其他嚙齒動(dòng)物、以及包括人 在內(nèi)的其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其可以是冷凍的或呈活體生長的，或培養(yǎng) 中的或含有它們的整體生物。

例如一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有編碼嵌合蛋白質(zhì)第一個(gè)DNA構(gòu) 建體的細(xì)胞，較好但不一定是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說的嵌合蛋白質(zhì) 包含(i)至少一個(gè)能夠與本發(fā)明選擇的低聚配體結(jié)合的受體區(qū)域， 以及(ii)與受體區(qū)域異源的，但與一個(gè)或多個(gè)其他類似區(qū)域低聚后 能夠激活靶基因在對(duì)所說的低聚合起反應(yīng)之轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制 下的轉(zhuǎn)錄過程。這些細(xì)胞進(jìn)一步含有處在對(duì)所說的低聚配體起反應(yīng)的 轉(zhuǎn)錄控制元件之表達(dá)控制下的靶基因。在暴露于選擇的配體后表達(dá)靶 基因。

在另方面，本發(fā)明提供了含有編碼第一嵌合蛋白質(zhì)的第一組DNA 構(gòu)建體，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含DNA結(jié)合區(qū)和至少一個(gè)能與第一 個(gè)選擇的配體部分結(jié)合的受體區(qū)。細(xì)胞還進(jìn)一步包括含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 域及至少一個(gè)能與第二個(gè)選擇的配體(其可以與第一個(gè)選擇的配體部 分相同或不同)結(jié)合受體區(qū)的第二嵌合蛋白質(zhì)。細(xì)胞另外還含有編碼 處于異源轉(zhuǎn)錄控制序列的轉(zhuǎn)錄控制下之靶基因的DNA構(gòu)建體，靶基因 與DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合并對(duì)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)發(fā)生反應(yīng)，從而在細(xì)胞暴露于含 有選擇之配體部分的物質(zhì)后即表達(dá)靶基因。

還提供了含有編碼嵌合蛋白質(zhì)之第一DNA構(gòu)建體和編碼靶基因之 第二DNA構(gòu)建體的DNA組合物，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個(gè) 能與選擇的配體結(jié)合的受體區(qū)，該受體區(qū)則融合于能夠在暴露于低聚 配體后，即嵌合蛋白質(zhì)低聚合后發(fā)起生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)區(qū)； 且其中所說的靶基因處于對(duì)低聚配體起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控 制下。

本發(fā)明的另一個(gè)類型的組合物包含編碼第一和第二個(gè)嵌合蛋白質(zhì) 的第一系列DNA構(gòu)建體，以及編碼靶基因的第二DNA構(gòu)建體，所說的 靶基因處在對(duì)嵌合蛋白質(zhì)分子低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控 制下。編碼第一個(gè)嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體包含(a)至少一個(gè)能與 選擇的第一配體部分結(jié)合的第一受體區(qū)域，以及與受體區(qū)域融合的 (b)能夠在接觸低聚合配體，即第一嵌合蛋白質(zhì)低聚成第二嵌合蛋 白質(zhì)分子后起動(dòng)生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)區(qū)域。編碼第二個(gè)嵌合 蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體包含(i)至少一個(gè)能夠與選擇的第二配體部分 結(jié)合的受體區(qū)域，以及與該區(qū)域融合的(ii)能夠在接觸低聚配體后， 即與第一個(gè)嵌合蛋白質(zhì)低聚合后起動(dòng)生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)。 在這些情況下，第一和第二受體部分可以是相同或不同的，并且第一 和第二選擇配體部分也可以是相同或不同的。

我們的配體是能夠與本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合，以形 成其低聚體的分子，并有下列通式：

??????????接頭-[rbm1，rbm2，…rbmn] 其中n是2至大約5的正整數(shù)，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或 不同的并能與嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的受體結(jié)合部分。rbm共價(jià)連接到接頭 部分上，所說的接頭部分是能夠與兩個(gè)或多個(gè)rbm部分共價(jià)結(jié)合的雙 或多功能分子。優(yōu)選的配體分子量小于5kDa，并且不是蛋白質(zhì)。這 樣的配體的例子包括其中rbm部分相同或不同者，而且包含F(xiàn)K506- 型部分，環(huán)孢菌素型部分類固醇或四環(huán)素。環(huán)孢菌素型部分包括環(huán)孢 菌素及能夠與親環(huán)素(cyclophilin)結(jié)合的，天然或經(jīng)修飾的，較好有低于大 約10-6M之Kd值的其衍生物。在某些實(shí)施方案中，配體較好以大 于約10-6M，更好以大于約10-5M的Kd值結(jié)合到天然發(fā)生的受 體上。本發(fā)明的說明性配體是其中至少一個(gè)rbm包含F(xiàn)K506、FK520、 雷帕霉素或其在C9、C10或兩位置上經(jīng)修飾之衍生物的分子者， 這些配體以比其與天然存在之受體蛋白質(zhì)結(jié)合的Kd值放大至少1個(gè)， 較好2、更好3個(gè)，甚至最好4或5個(gè)或更大數(shù)量級(jí)的Kd值，與經(jīng) 過修飾的受體或含有經(jīng)過修飾之受體的嵌合分子結(jié)合。接頭部分也在 下面詳細(xì)描述，但作為說明其可包括如C2-C20亞烷基、C4- C18氮雜亞烷基、C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基，C6-C 18亞芳基，C8-C24芳基二亞烷基或C8-C36雙羧酰氨基 亞烷基部分。

本發(fā)明的單體rbm，以及含有單一rbm拷貝的化合物是低聚合拮 抗劑，其能夠與我們的嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合但不影響其二聚合或更高級(jí)的 低聚合(從個(gè)別rbm的單體性質(zhì)來看)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的遺傳工程化細(xì)胞調(diào)節(jié)所需蛋 白質(zhì)的產(chǎn)生。在該方案中，按照本發(fā)明方法經(jīng)工程化修飾，以在光誘 導(dǎo)的調(diào)節(jié)下表達(dá)所需基因的細(xì)胞，以常規(guī)方式生長于培養(yǎng)物中。向培 養(yǎng)基中加入配體，導(dǎo)致所需基因的表達(dá)和所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如下文 詳細(xì)描述的，然后向培養(yǎng)基中加入低聚拮抗劑即可關(guān)閉基因的表達(dá)和 蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。另外，可利用本發(fā)明在細(xì)胞中造成配體可誘導(dǎo)的細(xì)胞 死亡特征。在這些工程改造的細(xì)胞已完成其所要完成的使用目的(如 產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物)之后，可經(jīng)向培養(yǎng)基中加入配體而從細(xì) 胞培養(yǎng)物中清除這些細(xì)胞。本發(fā)明的工程化改造的細(xì)胞也可以在體內(nèi) 用于修飾整體生物，例如包括人在內(nèi)的動(dòng)物，以使含有這些細(xì)胞的動(dòng) 物體內(nèi)由這些細(xì)胞產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)或其他效果。這類應(yīng)用包括進(jìn)行基 因治療。另外，可以在細(xì)胞外使用嵌合蛋白質(zhì)和低聚分子，以將協(xié)同 發(fā)揮啟動(dòng)生理學(xué)作用的蛋白質(zhì)帶到一起。

因此本發(fā)明提供了在對(duì)加入低聚配體反應(yīng)中，在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)生物 學(xué)效應(yīng)的材料和方法。該方法包括按照本發(fā)明進(jìn)行工程改造的細(xì)胞， 并使細(xì)胞與配體接觸。

例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是激活細(xì)胞中靶基因轉(zhuǎn)錄的方法。 該方法包括提供含有并表達(dá)(a)至少一個(gè)編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)之 DNA構(gòu)建體和(b)靶基因的細(xì)胞。嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)能夠與 選擇的低聚合配體結(jié)合的受體區(qū)域。該受體區(qū)域融合到一個(gè)在暴露于 低聚配體之后，即與一個(gè)或多含有另一作用區(qū)域之拷貝的嵌合蛋白質(zhì) 低聚合后，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用區(qū)域上。此信號(hào)能夠激活基因 的轉(zhuǎn)錄，例如在這種情況下可激活處于對(duì)此信號(hào)起反應(yīng)之轉(zhuǎn)錄控制元 件控制下之靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此該方法包括使細(xì)胞暴露于能夠與導(dǎo)致 靶基因表達(dá)的有效量嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的低聚合配體。在細(xì)胞生長于培 養(yǎng)基中的情況下，向培養(yǎng)基中加入配體即可使細(xì)胞暴露于配體。在細(xì) 胞存在于宿主生物體內(nèi)的情況下，則將配體投藥于宿主生物體，即可 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與配體的接觸。例如，在宿主生物體是動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng) 物(包括人)的情況下，可將配體以其適當(dāng)?shù)妮d體，經(jīng)口服、直腸內(nèi)、 舌下、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或吸入等途徑對(duì)宿主動(dòng) 物給藥。

本發(fā)明進(jìn)一步包括一種醫(yī)藥組合物，該組合物含有與醫(yī)藥上可接 受的載體及可選擇的一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑混合形式的低 聚配體，其可用于在含有本發(fā)明基因工程處理之細(xì)胞的對(duì)象中，激活 靶基因的轉(zhuǎn)錄，例如或者影響本發(fā)明之另一種生物學(xué)后果。如在本文 另外的段落中詳細(xì)描述的，低聚合配體可以是同低聚合試劑或異低聚 合試劑。同樣，本發(fā)明還包括一種醫(yī)藥組合物，該組合物含有與醫(yī)藥 上可接受的載體并可選擇地與一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑混合 之本發(fā)明的低聚合拮抗劑，用于完全或部分地降低個(gè)體內(nèi)本發(fā)明工程 改造之細(xì)胞中嵌合蛋白質(zhì)的低聚合水平，并從而使靶基因的轉(zhuǎn)錄失活， 或者例如切斷本發(fā)明的另一個(gè)生物學(xué)后果。因此，使用低聚合試劑和 低聚合拮抗劑制備醫(yī)藥組合物包括本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明還貢獻(xiàn)一種提供對(duì)本發(fā)明的低聚合配體有反應(yīng)的宿主生物 體，優(yōu)選是動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括引入已按本發(fā) 明進(jìn)行工程化改造的，即含有編碼前述之嵌合蛋白質(zhì)之DNA構(gòu)建體的 生物體細(xì)胞。另外，亦可在允許轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 條件下將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入宿主生物體，如哺乳動(dòng)物體內(nèi)。

我們進(jìn)一步提供了產(chǎn)生對(duì)本發(fā)明的配體發(fā)生反應(yīng)之細(xì)胞的試劑盒。 一種試劑盒包含至少一個(gè)編碼我們的嵌合蛋白質(zhì)之一的DNA構(gòu)建體， 所說的嵌合蛋白質(zhì)則含有至少一個(gè)受體區(qū)和作用區(qū)(如前所述)。該 試劑盒可含有一定量能夠使由試劑盒中的DNA構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白 質(zhì)分子低聚合的本發(fā)明的配體，另外并可含有一定量的低聚合拮抗劑， 如單體配體試劑。在由構(gòu)建體編碼單一嵌合蛋白質(zhì)時(shí)，低聚配體是同 低聚合配體。如編碼一個(gè)以上這樣的嵌合蛋白質(zhì)，則可包括異低聚合 配體。試劑盒可進(jìn)一步包含“第二系列”DNA構(gòu)建體，該系列構(gòu)建體 編碼靶基因和/或?qū)η逗系鞍踪|(zhì)分子的低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件。 DNA構(gòu)建體較好是與一個(gè)或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)志，以及用 于在原核細(xì)胞中復(fù)制、在真核細(xì)胞中表達(dá)等的其他常規(guī)載體元件相聯(lián) 系的。對(duì)于每個(gè)不同的DNA構(gòu)建體來說選擇標(biāo)志可以是相同或不同的， 從而便于選擇含有各DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。

例如，本發(fā)明的一個(gè)試劑盒含有：編碼嵌合蛋白質(zhì)的第一DNA構(gòu) 建體，其中嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)融合到轉(zhuǎn)錄激活物區(qū)域上的受體 區(qū)域(能夠與選擇的配體結(jié)合)；編碼第二個(gè)嵌合蛋白質(zhì)的第二DNA 構(gòu)建體，其中第二個(gè)嵌合蛋白質(zhì)至少含有一個(gè)融合到DNA結(jié)合區(qū)域上 的受體區(qū)域(能夠與選擇的配體結(jié)合)；以及編碼靶基因的第三DNA 構(gòu)建體，其中靶基因處于含有一DNA序列的轉(zhuǎn)錄控制元件的控制下， 所說的DNA序列上結(jié)合了DNA結(jié)合區(qū)并且它是在第一和第二個(gè)嵌合蛋 白質(zhì)存在下經(jīng)暴露于配體而被轉(zhuǎn)錄激活的。

另外，用于導(dǎo)入處于反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制元件控制下之靶基因的DNA 構(gòu)建體可含有一代替靶基因的克隆位點(diǎn)，以為工程化細(xì)胞提供可誘導(dǎo) 地表達(dá)由實(shí)際工作者將提供的基因提供適用試劑盒。

本發(fā)明的其他試劑盒可包含一個(gè)或兩個(gè)(或多個(gè))表達(dá)嵌合蛋白 質(zhì)的DNA構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)建體含有克隆位點(diǎn)代替作用區(qū)域 (轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)發(fā)生元件、轉(zhuǎn)錄激活因子、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)等)，以 允許使用者插入她/他所希望的某一個(gè)作用區(qū)域。這樣的試劑盒亦可 包含上述的其他元件，如表達(dá)處于反應(yīng)性表達(dá)控制下之靶基因的DNA 構(gòu)建體、低聚合配體、拮抗劑等。

任何試劑盒還都可含有用本發(fā)明的構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的陽性對(duì)照 細(xì)胞，以使它們?cè)趯?duì)細(xì)胞與配體接觸發(fā)生反應(yīng)中表達(dá)報(bào)導(dǎo)基因(編碼 CAT、β-半乳糖苷酶或任何可方便地檢測(cè)的基因產(chǎn)物)。還可提供 檢測(cè)和/或定量報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

附圖的簡要描述

圖1是質(zhì)粒pSXNeo?IL2(IL2-SX)的示意圖。NF-AT-SX中， 來自含IL2增強(qiáng)子/啟動(dòng)子之IL2-SX的HindIII-ClaI?DNA片段， 被賦予基本轉(zhuǎn)錄的最小IL-2啟動(dòng)子和含有3個(gè)串聯(lián)NFAT結(jié)合位點(diǎn) 的可誘導(dǎo)元件所取代(詳見下述)。

圖2是制備細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳輸嵌合體質(zhì)粒p#MXFn和p#MFnZ的流程 圖，其中n是指示結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。

圖3A和3B是制備細(xì)胞外信號(hào)傳輸嵌合體質(zhì)粒p#1FK3/pBJ5 的流程圖。

圖4A、4B和4C是構(gòu)建主題發(fā)明所用質(zhì)粒中使用的引物的序 列。

圖5是具有不同增強(qiáng)子群的報(bào)導(dǎo)構(gòu)建體對(duì)受體TAC/CD3ζ與配 體反應(yīng)的反應(yīng)曲線。

圖6是各種配體與實(shí)施例1中所述TAg?Jurkat細(xì)胞的活性的曲 線圖。

圖7是配體FK1012A(8，圖9B)與細(xì)胞外受體1FK3(FKBPx3 /CD3ζ)之活性的曲線圖。

圖8是通過肉豆蔻?；腃D3ζ/FKBP12嵌合體經(jīng)信號(hào)傳遞激 活NFAT報(bào)導(dǎo)基因的曲線圖。

圖9A和9B分別是烯丙基連接的FK506變異體和環(huán)己基連接 的FK506變異體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖10是合成FK520的衍生物的流程圖。

圖11A和B是合成FK520衍生物的流程圖，和FK520的化學(xué) 結(jié)構(gòu)，其設(shè)計(jì)底部結(jié)構(gòu)以接到突變體FKBP12上。

圖12是圖解說明在假定的溝中的有經(jīng)修飾之FK520的突變體 FKBP。

圖13是合成FK520和環(huán)孢菌素之異二聚體的流程圖。

圖14是圖解顯示嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，舉例的嵌合蛋白質(zhì)含有 immunophilin部分作為受體區(qū)。

圖15說明配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，圖解顯示對(duì)轉(zhuǎn)錄起 始信號(hào)的激發(fā)。

圖16描繪基于FK-506型部分的HED和HOD的合成流程。

圖17描繪以CsA開始的(CsA)2的合成。

圖18是融合cDNA構(gòu)建體和蛋白質(zhì)MZF?3E的概觀。

圖19描繪在FK1012(En：Elu-epitop-tag，Elag-epitop -tag)存在下，MZF1Eh與MZF1Ef的共免疫沉淀。

圖20顯示FK1012誘導(dǎo)的，用肉豆蔻?；疐as-FKBPR融合蛋白 質(zhì)(MFF3E)轉(zhuǎn)染之Jurkat?T細(xì)胞的細(xì)胞死亡，根據(jù)降低的細(xì)胞的 轉(zhuǎn)錄活性指示結(jié)果。

圖21A是在瞬間轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中對(duì)親環(huán)素-Fas(和Fas- 親環(huán)素)融合構(gòu)建體的分析。在該系列中顯示MC3FE是最有效 的。

圖21B描繪Immunophilin-Fas抗原嵌合體，和在用大的T抗 原穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Jurkat?T細(xì)胞中瞬間表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Myr：取自編碼 殘基1-14之pp60c-src的肉豆蔻?；蛄?Wilson?et?al.Mol. εCell?Biol.94(1989)：1536-44)；FKBP：人FKBP12；CypC： 編碼殘基36-212的鼠親環(huán)素C序列；(Freidman?et?al. Cell?664(1991)：799-806)；Fas：編碼殘基因179-319之人 Fas抗原的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(Oehm?et?al，J.Biol.Chem.267?15 (1992)：10709-15)。細(xì)胞用編碼分泌的堿性磷酸酶報(bào)導(dǎo)基因 (該報(bào)導(dǎo)基因處于3個(gè)串聯(lián)AP1啟動(dòng)子控制下)的質(zhì)粒連同6倍摩爾 過量的immunophilin融合構(gòu)建體經(jīng)電穿孔而轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后用PMA (50ng/ml)(借以刺激報(bào)導(dǎo)基因的合成)和(CsA)2刺激細(xì)胞。 在第48小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)基因活性。在24小時(shí)用抗HA抗原 決定基抗體進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)。

圖22描繪實(shí)驗(yàn)例8的CAT試驗(yàn)結(jié)果。

圖23描繪經(jīng)修飾的FK-506型化合物的合成。

發(fā)明的詳細(xì)描述

I.一般性討論

本發(fā)明提供嵌合蛋白質(zhì)，用于低聚合嵌合蛋白質(zhì)的有機(jī)分子及使 用它們的系統(tǒng)。融合的蛋白質(zhì)有一個(gè)用于與(較好是小的)有機(jī)低聚 合分子結(jié)合的結(jié)合區(qū)域和一個(gè)作用區(qū)域，作為嵌合蛋白質(zhì)低聚合的結(jié) 果其可導(dǎo)致某生理學(xué)作用或細(xì)胞過程。

圖14中圖解說明了可誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聯(lián)系的基本概念。可發(fā)揮異 二聚合(或雜低聚合，“HOD”)劑的配體是啞鈴形結(jié)構(gòu)給出的。

同二聚和同低聚是指相似部分結(jié)合，例如它們借助本發(fā)明的配體 相連接而形成二聚體或低聚體。異二聚和異低聚是指不相似的組分結(jié) 合形成二聚體或低聚體。因此同低聚體包含特定成分的多個(gè)拷貝的結(jié) 合，而異低聚體包含不同成分之拷貝的結(jié)合。本文所使用的術(shù)語“低 聚合作用”、“低聚”和“低聚物”，如無明顯的相矛盾的指示，不 管有無字首，都意欲包括“二聚合作用”、“二聚”和“二聚體”。

圖14中描繪的是含有有用靶蛋白質(zhì)區(qū)域(“作用區(qū)域”)和一 個(gè)或多個(gè)可與配體結(jié)合之受體區(qū)域的融合蛋白質(zhì)分子。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)嵌 合蛋白質(zhì)，即定位于產(chǎn)生它們的細(xì)胞之內(nèi)的蛋白質(zhì)，較好還存在一細(xì) 胞擊靶序列(包括細(xì)胞器擊靶氨基酸序列)。配體與受體區(qū)域的結(jié)合 導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的異或同二聚合。低聚作用使得作用區(qū)域彼此密切靠 近，從而激發(fā)正常情況下與各個(gè)作用區(qū)域相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞過程-例如 TCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

可由低聚作用激發(fā)的細(xì)胞過程包括狀態(tài)的改變，例如構(gòu)象改變、 結(jié)合對(duì)象改變、細(xì)胞死亡、起始轉(zhuǎn)錄、通道開放、離子(如Ca+2等) 釋放等物理狀態(tài)的改變，或者例如化學(xué)反應(yīng)，如?；?、甲基化、水解、 磷酸化或去磷酸化、氧化還原狀態(tài)改變、重排等化學(xué)狀態(tài)的改變。因 此，任何這類可由配體介導(dǎo)的低聚作用激發(fā)的過程均包括在本發(fā)明范 圍內(nèi)。

作為主題發(fā)明的第一個(gè)應(yīng)用，細(xì)胞受到修飾以便對(duì)低聚分子有反 應(yīng)的。經(jīng)修飾的細(xì)胞可被用于基因治療中，以及其他一些期望出現(xiàn)可 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或翻譯(兩者統(tǒng)稱為表達(dá))的應(yīng)用中。這些細(xì)胞是根據(jù)其 基因組中至少含有第一或第一系列(該系列可能只包括一個(gè)構(gòu)建體) 基因構(gòu)建體，并可望包括第二或第二個(gè)系列(該系列可以只包括一個(gè) 構(gòu)建體)構(gòu)建體而確定特征的。

基因構(gòu)建體的性質(zhì)和數(shù)目將取決于嵌合蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其在細(xì)胞 中所起的作用。例如，在一些實(shí)例中嵌合蛋白質(zhì)是將與基因(其可含 有指導(dǎo)嵌合蛋白質(zhì)將與細(xì)胞表面膜或與核或泡囊等細(xì)胞器相聯(lián)系的細(xì) 胞內(nèi)擊靶序列或區(qū)域)的表達(dá)相聯(lián)系的，這樣正常情況下將至少有兩 個(gè)系列的構(gòu)建體：編碼嵌合蛋白質(zhì)的第一系列，該蛋白質(zhì)在配體介導(dǎo) 低聚合后起動(dòng)信號(hào)指導(dǎo)靶基因表達(dá)，以及更理想的是還有第二個(gè)包括 靶基因和/或其表達(dá)控制元件(該元件對(duì)信號(hào)有應(yīng)答)的構(gòu)建體。

在包括同低聚體通常是同二聚體時(shí)，第一系列中將只需要單一的 構(gòu)建體，而當(dāng)包括異低聚體時(shí)，則可能涉及兩個(gè)或多個(gè)且通常不多于 三個(gè)構(gòu)建體。由第一系列構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)將與基因轉(zhuǎn)錄的啟 動(dòng)相關(guān)并且通常將被指引向表面膜或核，在那里低聚的嵌合蛋白質(zhì)能 夠直接或間接地發(fā)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在導(dǎo)入外源基因，或 者為表達(dá)內(nèi)源基因而導(dǎo)入外源或重組表達(dá)控制序列時(shí)，將需要第二系 列的附加構(gòu)建體，每種情況下其轉(zhuǎn)錄均將因嵌合蛋白質(zhì)的低聚合而激 活。

在嵌合蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)的并且能直接起作用而沒有引發(fā)另一個(gè) 基因的轉(zhuǎn)錄的情況下，則利用不同的第一系列構(gòu)建體。例如，能夠可 誘導(dǎo)地或構(gòu)成上地表達(dá)與胞吐作用相關(guān)的蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)除非在 低聚分子存在下，一般將不發(fā)生復(fù)合。通過利用具有任何或所有下列 這些性質(zhì)的蛋白質(zhì)，即在宿主細(xì)胞中不復(fù)合；經(jīng)與其他蛋白質(zhì)復(fù)合而 受到抑制，且其抑制作用可因與配體低聚而得到克服；需要通過一個(gè) 宿主細(xì)胞中不可得到的過程來激活；或者通過修飾指導(dǎo)泡囊與胞漿膜 融合的蛋白質(zhì)以形成嵌合蛋白質(zhì)，此時(shí)復(fù)合物形成和膜融合的程度因 有低聚分子的存在而提高，胞吐作用具有將被低聚分子誘導(dǎo)的能力。

可以同樣地修飾和使用其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如激酶、磷酸酶及細(xì) 胞周期控制蛋白質(zhì)。

對(duì)本發(fā)明的各類基因構(gòu)建體描述如下：

(1)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中 結(jié)合區(qū)是細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的，作用區(qū)是細(xì)胞內(nèi)的，這樣配體介導(dǎo)的嵌 合蛋白質(zhì)的低聚作用，包括其自身的低聚(形成同低聚體)或與包含 不同作用區(qū)之不同融合蛋白質(zhì)的低聚(形成異低聚體)，即可誘導(dǎo)產(chǎn) 生導(dǎo)致一系列過程的信號(hào)，進(jìn)而激活一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄；

(2)編碼包括有結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其 中結(jié)合區(qū)和作用區(qū)在同一核內(nèi)，這樣配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚， 包括其自身(形成同低聚物)或與包括不同作用區(qū)之不同的融合蛋白 質(zhì)的低聚(形成異低聚物)，即可誘導(dǎo)直接通過低聚物與DNA轉(zhuǎn)錄起 始區(qū)的復(fù)合而發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程；

(3)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中 結(jié)合區(qū)和作用區(qū)是胞質(zhì)內(nèi)的，這樣配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)低聚作用，包括 其自身的低聚(形成同低聚體)或與包含有作用區(qū)之不同的融合蛋白 質(zhì)的低聚(形成異低聚體)，即可導(dǎo)致胞吐作用；和

(4)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其 中結(jié)合區(qū)和作用區(qū)是細(xì)胞外的，而且與發(fā)動(dòng)生物學(xué)活性相關(guān)聯(lián)(作為 非限制性舉例說明，作用區(qū)可以自身與一種物質(zhì)，即受體或其他膜蛋 白質(zhì)結(jié)合，在經(jīng)過配體介導(dǎo)的嵌合體低聚合之后，橋接一種或多種相 似或不相似的分子或細(xì)胞)；以及

(5)編碼去穩(wěn)定化的、失活的或短壽命的具有結(jié)合區(qū)和作用 區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，這樣一來配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與含有不同作 用區(qū)之靶蛋白質(zhì)的低聚合便導(dǎo)致所說低聚的靶蛋白質(zhì)的去穩(wěn)定和/或 降解或失活。

II.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

上述(1)和(2)類構(gòu)建體被看作是第一系列。(1)類構(gòu)建 體在其作用上不同(2)類構(gòu)建體。(1)類構(gòu)建體是稍有多效性的， 即能夠激活許多野生型基因，以及靶基因。另外，(1)類基因的表 達(dá)產(chǎn)物對(duì)配體的反應(yīng)相對(duì)較慢。(2)類構(gòu)建體可被導(dǎo)向特異性靶基 因并能夠限制將被轉(zhuǎn)錄之基因的數(shù)目。(2)類構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物對(duì) 配體的反應(yīng)十分迅速。

(1)和(2)類的主題系統(tǒng)將包括第一系列含有編碼嵌合蛋白 質(zhì)DNA序列的構(gòu)建體，通常包括一至三個(gè)，一般是一至兩個(gè)不同的構(gòu) 建體。該系統(tǒng)通常還包括第二系列將便于一個(gè)或多個(gè)基因，常常是外 源基因表達(dá)的構(gòu)建體?！巴庠椿颉笔侵覆煌谡Ｇ闆r下的由細(xì)胞 表達(dá)的基因，原因例如可以是由于細(xì)胞的性質(zhì)、細(xì)胞的遺傳缺陷、基 因來源于不同的種或者是突變的或合成的基因等情況。這樣的基因可 能編碼蛋白質(zhì)、反義分子、核酶等，或者可以是包含一表達(dá)控制序列 的DNA序列，所說的表達(dá)控制序列被連接或?qū)⒁B接到一個(gè)正常情況 下表達(dá)控制序列并不與之聯(lián)系的外源基因上。因此，如上所述，該構(gòu) 建體可含適于配體誘導(dǎo)的外源基因表達(dá)的外源或重組表達(dá)控制序列。

常常優(yōu)選的是，由(1)、(2)和(3)類構(gòu)建體編碼的嵌合 蛋白質(zhì)可以有一個(gè)細(xì)胞內(nèi)擊靶區(qū)，其包含將嵌向蛋白質(zhì)指向所需之區(qū) 如表面膜、核、泡囊膜或其他部位的序列，在這些部位由配體介導(dǎo)的 嵌合蛋白質(zhì)的低聚作用，至少是二聚合發(fā)動(dòng)所需的生理學(xué)活性。

嵌合蛋白質(zhì)含有能夠與至少一個(gè)配體分子結(jié)合的第二(“結(jié)合” 或“受體”)區(qū)域。由于配體可含有一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)或表位，所 以其可與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)形成二聚體或更高級(jí)的同或異低聚體。 嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)可具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，從而可與二價(jià)配體 形成同低聚體。因?yàn)橛袃蓚€(gè)或多個(gè)能結(jié)合第二區(qū)域的表位，故配體可 以以這種方式低聚嵌合蛋白質(zhì)，從而為嵌合蛋白質(zhì)的更高級(jí)低聚合作 好準(zhǔn)備。

嵌合蛋白質(zhì)還含有能夠在通過結(jié)合區(qū)實(shí)現(xiàn)配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì) 分子的低聚合后發(fā)動(dòng)生物學(xué)活性的第三(“作用”)區(qū)域。因此，作 用區(qū)可以作為配體介質(zhì)的低寡合的結(jié)果，與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)。所述 信號(hào)，例如可依據(jù)于參予信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定中間成分，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè) 基因轉(zhuǎn)錄的開始。圖15描繪了一個(gè)有代表性的嵌合蛋白質(zhì)，其中細(xì) 胞內(nèi)擊靶區(qū)包含肉豆蔻酸酯部；受體區(qū)包含三個(gè)FKBP12部分；且作 用區(qū)包含一個(gè)ζ亞單位。在其它嵌合蛋白質(zhì)中，作用區(qū)可含有轉(zhuǎn)錄因 子，其在低聚后導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)靶基因(內(nèi)源和/或外源的)的轉(zhuǎn)錄 開始。作用區(qū)可包含與泡囊膜同表面或其他膜的融合相關(guān)的蛋白質(zhì)或 其部分，如SNAP和SNARE組群的蛋白質(zhì)(參見Sollner?et?al.(1993) 362，318?anol?353；Cell(1993)72，43)。

A.表面膜受體

本發(fā)明的一個(gè)方面的嵌合蛋白質(zhì)與表面膜相關(guān)的并且是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo) 引起一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。該過程涉及許多在最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因 子與靶基因相關(guān)啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的一系列相互作用中的輔助蛋白質(zhì)。 在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到與其他基因相關(guān)的啟動(dòng)子區(qū)域上的情況下，此處也 發(fā)起轉(zhuǎn)錄。編碼本實(shí)施方案之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，可以編碼能受到 加工并因而可能不存在于成熟嵌合蛋白質(zhì)中的信號(hào)。嵌合蛋白質(zhì)在任 何過程中都將包括(a)能夠結(jié)合預(yù)定配體的結(jié)合區(qū)域，(b)并非必 要的(但在許多實(shí)例中又是優(yōu)選的)膜結(jié)合區(qū)，其包括為使融合的蛋 白質(zhì)向細(xì)胞表面/膜上轉(zhuǎn)移，和維持結(jié)合到細(xì)胞表面膜上的蛋白質(zhì)所 需的跨膜區(qū)或結(jié)合脂質(zhì)，以及(c)作為作用區(qū)的胞質(zhì)信號(hào)起始區(qū)。 胞質(zhì)信號(hào)起始區(qū)能夠發(fā)動(dòng)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)，所述基因在轉(zhuǎn)錄起始 區(qū)中有識(shí)別起始之信號(hào)的序列。

本文中所說的其表達(dá)受來自嵌合蛋白質(zhì)之信號(hào)調(diào)節(jié)的基因是指 “靶”基因，包括處于內(nèi)源或外源(或雜種)表達(dá)控制序列的表達(dá)控 制下的外源基因或內(nèi)源基因。促使與膜結(jié)合之嵌合蛋白質(zhì)的分子部分 也稱為“保留區(qū)域”。適當(dāng)?shù)谋Ａ魠^(qū)包括直接與膜的脂質(zhì)層結(jié)合的部分， 如通過脂質(zhì)參予膜中或通過膜延伸等。如圖15中所示，在這些情況 下蛋白質(zhì)逐漸向膜特別是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并與之結(jié)合。

B.核轉(zhuǎn)錄因子

另一個(gè)第一構(gòu)建體編碼含有細(xì)胞擊靶序列的嵌合蛋白質(zhì)，所說的 序列適于使蛋白質(zhì)向核轉(zhuǎn)位的需要。該(“信號(hào)共有序列”)序列具 有多個(gè)堿性氨基酸，稱為由兩部分組成的堿性重復(fù)序列(參見Garcia -Bustos?et?al.，Biochimica?et?Biophysica?Acta(1991)1071， 83-101)。該序列可以出現(xiàn)在分子內(nèi)部或接近于N或C末端的任何 部分，并可致使嵌合蛋白質(zhì)成為核內(nèi)的。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的實(shí)踐 將涉及至少兩種(“第一系列”)嵌合蛋白質(zhì)：(1)一種具有與靶 基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的DNA結(jié)合的作用區(qū)域，以及(2)含有作為作 用區(qū)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的另一種不同的嵌合蛋白質(zhì)其能夠與第一個(gè)嵌合蛋 白質(zhì)的DNA結(jié)合區(qū)聯(lián)合，發(fā)動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)作用區(qū)域或轉(zhuǎn)錄因 子可衍生于相同或不同的蛋白質(zhì)分子。

對(duì)于細(xì)胞宿主來說，轉(zhuǎn)錄因子可以是外源的或內(nèi)源。如果轉(zhuǎn)錄因 子是外源的，但在宿主內(nèi)發(fā)揮功能并且可以與內(nèi)源性RNA聚合酶(而 不是需要可導(dǎo)入基因的外源性RNA聚合酶)協(xié)同作用，一起提供隨融 合的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的外源性啟動(dòng)子元件則配有用于調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn) 錄的第二個(gè)構(gòu)建體。借助這一手段，可使轉(zhuǎn)錄的起始限制到與外源啟 動(dòng)子區(qū)域相聯(lián)系的基因，即靶基因。

已知大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子為發(fā)揮活性需要有兩個(gè)亞單位。另外，在單 一轉(zhuǎn)錄因子可以分成兩個(gè)獨(dú)立的功能區(qū)域(如轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合 區(qū))的情況下，每個(gè)區(qū)域可各自失活，但是當(dāng)使它們?cè)谝黄鹈芮薪咏?時(shí)，則又恢復(fù)了轉(zhuǎn)錄活性。可以使用的轉(zhuǎn)錄因子包括由Fields和 Song(文獻(xiàn)同上)描述的可分成兩個(gè)區(qū)域的酵母GAL4。作者使用了 GALA(1-147)-SNF1和SNF4-GAL4(768-881)的融合體，其 中SNF1和-4可以被主題結(jié)合蛋白質(zhì)(作為結(jié)合區(qū))所取代。可利 用GAL4和VP16或HNF-1的結(jié)合體。其他轉(zhuǎn)錄因子是Jun、Fos和 ATF/CREB家族的成員，Oct1、Sp1、HNF-3、類固酶受體總家庭 等的成員。

作為不同于的聯(lián)合使用DNA結(jié)合區(qū)和天然存在之激活區(qū)或其修飾 形式的可代用方式，可以用與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和RNA聚合酶(包括但不只 限于RNA聚合酶II)間的橋接有關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)之一取代激活區(qū)。這 些蛋白質(zhì)包括稱為TAF′的蛋白質(zhì)、TFII蛋白質(zhì)，特別是B和D等。 因此，可使用任何一種蛋白質(zhì)組合，例如融合蛋白質(zhì)或其結(jié)合部分， 用于橋接DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA聚合酶并用于發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在與DNA結(jié) 合區(qū)接合以發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄中，較好使用最接近RNA聚合酶的蛋白質(zhì)。如果 需要，主題構(gòu)建體可為將三個(gè)或更多個(gè)，通常不超過約4個(gè)，蛋白質(zhì) 帶到一起作好準(zhǔn)備，以提供轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。

可使用失活化區(qū)，如ssn-6/TUP-1或Krüppel家族阻遏區(qū)， 而不是有作為作用區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。以這種方式，調(diào)節(jié)導(dǎo)致構(gòu)成性表 達(dá)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉。例如，在基因治療情況下，可以提供構(gòu)成上表達(dá) 的一種激素(如生長激素)、血液蛋白質(zhì)、免疫球蛋白等。利用編碼 一種含有與配體結(jié)合區(qū)連接之DNA結(jié)合區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)，和另一種含 有與配體結(jié)合區(qū)連接之失活化區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，即可通過配 體介導(dǎo)的低聚作用抑制基因的表達(dá)。

設(shè)計(jì)編碼本身含有與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、轉(zhuǎn)錄失活化區(qū)或DNA結(jié)合區(qū)融 合之配體結(jié)合區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)或其亞單位的構(gòu)建體，并按照組裝其他 構(gòu)建體的同樣方式組裝之。轉(zhuǎn)錄因子的末端將常常結(jié)合到配體結(jié)合區(qū) 的C-末端上，盡管在某些情況下是反過來的，例如單一轉(zhuǎn)錄因子的 兩不同的區(qū)域分在兩個(gè)不同的嵌合體間。

III.胞吐作用

配體介導(dǎo)的低聚機(jī)制的另一個(gè)應(yīng)用是胞吐作用，其中蛋白質(zhì)的輸 出而不是轉(zhuǎn)錄作用受到配體的控制。此可與一種或多種有用蛋白質(zhì)的 表達(dá)相配合，作為一種可替代方式促成通過分泌信號(hào)序列分泌有用蛋 白質(zhì)。該實(shí)施方案涉及兩種不同的第一構(gòu)建體。一種構(gòu)建體編碼將蛋 白質(zhì)引向泡囊以整合到泡囊膜中的嵌合體(Sollner?et?al.，文獻(xiàn)出 處同上)?？捎米髋菽医Y(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)包括單獨(dú)或合用的VAMP (synaptobrevin)、SNC2、rab3、SEC4、Synaptotagmin等。細(xì) 胞膜蛋白質(zhì)可包括單獨(dú)或組合的syntaxin、SSO1、SSO2、neurexin 等。其他構(gòu)建體則為向表面膜運(yùn)輸作準(zhǔn)備，并利用上述的肉豆蔻酰信 號(hào)序列、其他胞漿膜擊靶序列(如用于異戊烯化)或跨膜保留區(qū)。上 述參考文獻(xiàn)中描述了所編碼的蛋白質(zhì)，作為作用區(qū)的全部或其功能性 部分?？稍谂c外源蛋白質(zhì)表達(dá)的配合中使用這些構(gòu)建體，適當(dāng)?shù)貫橄?泡囊運(yùn)輸或內(nèi)吞內(nèi)源性蛋白質(zhì)作好準(zhǔn)備，以提高內(nèi)源性蛋白質(zhì)的輸出。

有多種機(jī)制可用于胞吐作用。依據(jù)細(xì)胞類型以及何種蛋白質(zhì)對(duì)該 細(xì)胞內(nèi)的胞吐作用是限制性的，可由一種或多種具有被配體激活之反 應(yīng)性元件的構(gòu)建體編碼一種或多種泡囊結(jié)合的蛋白質(zhì)或細(xì)胞蛋白質(zhì)。 特別有用的是組合VAMP和Syntaxin。另外，亦可提供控制胞吐作用 的非限制性蛋白質(zhì)的構(gòu)成性表達(dá)，以及提供配體調(diào)節(jié)胞吐作用限制性 蛋白質(zhì)的表達(dá)。最后，可以提供與胞吐作用相關(guān)的嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)成 性表達(dá)，從而由嵌合蛋白質(zhì)與配體的低聚合控制胞吐作用。使用適當(dāng) 的結(jié)合區(qū)域，可以使不同的嵌合蛋白質(zhì)將在泡囊表面上低聚以形成活 性復(fù)合物，和/或通過配體使泡囊蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)連接。在 沒有配體的情況下，由于對(duì)配體的修飾如缺失、突變等，實(shí)質(zhì)上降低 了蛋白質(zhì)控制的胞吐作用間的結(jié)合親合性，嵌合蛋白質(zhì)沒有可能提供 胞吐作用?？梢允褂酶鱾€(gè)蛋白質(zhì)的交迭片段并確定那一個(gè)片段保留有 活性便可很容易地確定這些修飾的存在?？梢赃M(jìn)一步使用丙氨酸取代 修飾各片段，以確定實(shí)質(zhì)上影響結(jié)合的各個(gè)氨基酸(Beohncke?et al.，J.Immunol.(1993)150，331-341，Evarold?et?al.，出處 同上(1992)148，347-353)。

如上所述，可以在構(gòu)成上或可誘導(dǎo)地表達(dá)組裝在泡囊腔中的蛋白 質(zhì)，以及與胞吐作用相關(guān)的融合蛋白質(zhì)。是涉及內(nèi)源性或是外源性蛋 白質(zhì)，將被輸出的蛋白質(zhì)是構(gòu)成上表達(dá)還是可誘導(dǎo)地表達(dá)，是否可使 用同樣配體發(fā)動(dòng)與胞吐作用相關(guān)聯(lián)之融合蛋白質(zhì)以及將被輸出之蛋白 質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，或者是否不同的蛋白質(zhì)要受制于不同的可誘導(dǎo)信號(hào)，均可 依據(jù)胞吐作用的目的確定控制表達(dá)的方式。一個(gè)方面，胞吐作用機(jī)制 應(yīng)只是由配體控制的過程。在另一方面，至少一種蛋白質(zhì)的表達(dá)以及 胞吐作用均可受到配體控制。

通過引入使蛋白質(zhì)向泡囊轉(zhuǎn)位的細(xì)胞擊靶序列，而不丟失所述蛋 白質(zhì)的生理學(xué)活性來修飾各種蛋白質(zhì)?？墒褂冒伦饔米鳛獒尫艡C(jī)制， 依據(jù)宿主的性質(zhì)，在短時(shí)間內(nèi)釋放相對(duì)高的劑量蛋白質(zhì)，在維管系統(tǒng) 中產(chǎn)生高度定位水平的或高濃度的蛋白質(zhì)。令人感興趣的有意義蛋白 質(zhì)包括胰島素、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、細(xì)胞激活素、促紅細(xì) 胞生成素、集落刺激因子、生長因子、炎性肽、細(xì)胞遷移因子。

可從與胞吐作用相關(guān)的泡囊結(jié)合蛋白質(zhì)得到將蛋白質(zhì)導(dǎo)向泡囊的 編碼序列(如參見Sollner，et?al.，文獻(xiàn)出處同上)。

低聚機(jī)制的另一個(gè)應(yīng)用是控制蛋白質(zhì)降解或失活。例如，可以借 助與本發(fā)明不同嵌合蛋白質(zhì)(其具有相對(duì)短的半壽期或去穩(wěn)化或以趨 向于降解的低聚物的配體介導(dǎo)的低聚作用，使本發(fā)明的相對(duì)穩(wěn)定的或 有長壽期的嵌合蛋白去穩(wěn)定化或趨向于降解。在這一實(shí)施方案中，配 體介導(dǎo)的低聚合通過賦予蛋白質(zhì)以縮短的半壽期而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物 學(xué)功能。后來的嵌合蛋白質(zhì)可含有使蛋白質(zhì)對(duì)準(zhǔn)溶酶體的區(qū)域或使蛋 白質(zhì)易在細(xì)胞溶質(zhì)或核或非溶酶體細(xì)胞器中對(duì)蛋白水解裂解敏感的區(qū) 域。

可根據(jù)許多因素確定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的半壽期，這些因素包括在所 說的蛋白質(zhì)內(nèi)存在富含氨基酸殘基脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸 的短氨基酸序列(因此是“害蟲(PEST)”)、有相似功能的其他序 列、蛋白酶敏感性裂解位點(diǎn)及遍在蛋白化狀態(tài)。遍在蛋白化是由針對(duì) 蛋白質(zhì)降解的一個(gè)或多個(gè)短肽鏈單位、遍在蛋白完成的對(duì)蛋白質(zhì)的修 飾。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)遍在蛋白化的速率主要是由被加工蛋白質(zhì)N末端 氨基酸的同一性以及靠近氨基末端的一個(gè)或多個(gè)特有賴氨酸殘基決定 的。

IV.其他調(diào)節(jié)系統(tǒng)

可由與個(gè)別蛋白質(zhì)有關(guān)的特定活性的低聚作用控制的其他生物學(xué) 功能是蛋白質(zhì)激酶或酸酶活性、還原酶活性、環(huán)氧合酶活性、蛋白酶 活性或依賴于亞單位聯(lián)系的其他酶促反應(yīng)。另外，還可以提供與細(xì)胞周期 有關(guān)的G蛋白質(zhì)與受體蛋白質(zhì)的聯(lián)系，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白 (cyclins)和cdc激酶、多單位解毒酶。

V.構(gòu)建體的成分

與(1)和(2)類嵌合蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的第二或附加構(gòu)建體(靶 基因)包括有指明的靶識(shí)別序列或反應(yīng)性元件的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以便對(duì) 來自活化受體或活化轉(zhuǎn)錄因子的起始信號(hào)作出應(yīng)答，導(dǎo)致至少一個(gè)有 意義基因轉(zhuǎn)錄成有意義序列，通常是mRNA，其轉(zhuǎn)錄及適當(dāng)情況下的翻 譯可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)，和/或?qū)ζ渌虻恼{(diào)節(jié)，如反義鏈、轉(zhuǎn)錄 因子的表達(dá)、膜融合蛋白質(zhì)的表達(dá)等。

為不同的目的，可以使用不同的位點(diǎn)，不同的結(jié)合區(qū)域和不同的 胞質(zhì)區(qū)域。對(duì)于與表面膜相關(guān)聯(lián)的嵌合蛋白質(zhì)受體，如果配體結(jié)合區(qū) 是細(xì)胞外的，可以設(shè)計(jì)嵌合蛋白質(zhì)使之含有一個(gè)選自各種表面膜蛋白 質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)域。同樣，可以限據(jù)由胞質(zhì)部分調(diào)節(jié)的那個(gè)內(nèi)源性基因， 而使用能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的表面膜蛋白質(zhì)的不同的胞漿或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。如 嵌合蛋白質(zhì)是內(nèi)在的，在表面膜蛋白內(nèi)或與核、泡囊等細(xì)胞器相聯(lián)系的， 則配體結(jié)合區(qū)部分將受制于能夠與可穿過表面膜或其他膜(如果適宜 的話)的分子結(jié)合的區(qū)域。因此，這些結(jié)合區(qū)域一般將只小的天然發(fā) 生的或并不包括蛋白質(zhì)或核酸的合成的配體分子結(jié)合。

A.胞漿區(qū)域

(1)類似嵌合蛋白質(zhì)受體可以含有胞漿區(qū)域，后者來自各種細(xì) 胞表面膜受體之一，包括其突變蛋白，其中參予與胞漿區(qū)域相關(guān)聯(lián)之 起始轉(zhuǎn)錄的識(shí)別序列是已知的，或者對(duì)這些序列有反應(yīng)的基因是已知 的。有意義的突變受體將使靶基因的轉(zhuǎn)錄激活同可能與有害付作用 (如失調(diào)的細(xì)胞生長或細(xì)胞激活素的不適當(dāng)釋放)相關(guān)之基因的活化 脫離聯(lián)系。特別令人感興趣的受體相關(guān)的胞漿區(qū)域?qū)⒕哂邢铝刑卣鳎?對(duì)相對(duì)很少的(可望少于100)并且一般在細(xì)胞宿主中無害的基因， 受體活化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的起始；由受體活化發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄所必需的其他因子 存在于細(xì)胞宿主中；靶基因以外的基因被激活將不影響期望使用這些 細(xì)胞要達(dá)到的目的；胞漿區(qū)域的低聚作用或其他可利用的機(jī)制導(dǎo)致信 號(hào)發(fā)動(dòng)；胞漿區(qū)域連接到所需的配體結(jié)合區(qū)上將不干擾信號(hào)發(fā)送。許 多不同的胞漿區(qū)是已知的。其中許多是酪氨酸激酶或是與酪氨酸激酶 復(fù)合的，如CD3ζ、IL-2R、IL-3R等(參見Cantley，et al.，Cell(1991)64，281)。經(jīng)交聯(lián)如二聚合(基于首先由Yarden 和Ulrich[Annu.Rev.Biochem.(1988)57，443]提出的命名)而 活化的酪氨酸激酶受體包括I亞類：EGF-R、ATR2/neu、HER2/ neu、HER3/c-erbB-3、XmrK；II亞類：胰島素-R、IGF-1-R [胰島素樣生長因子受體]、IRR；III亞類：PDGF-R-A、PDGF-R- B、CSF-1-R(M-CSF/c-Fms)、c-kit、STK-1/F1K-2； 以及IV亞類：FGF-R、flg[酸性FGF]、bek[堿性FGF]；神經(jīng)營養(yǎng) 性酪氨酸激酶：Trk家族，包括NGF-R、Ror1，2。與交聯(lián)后酪氨 酸激酶相聯(lián)系的受體包括CD3ζ家族：CD3ζ和CD3η(主要見于T 細(xì)胞，與Fyn相聯(lián)系)；FcεRI的β和γ鏈(主要見于肥大細(xì)胞和 嗜堿性細(xì)胞中)；FcrRIII/CD16的γ鏈(主要見于巨噬細(xì)胞、嗜中 性細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞中)；CD3γ、-δ和-ε(主要見于T細(xì)胞 中)；Ig-α/MB-1和Ig-β/B29(主要見于B細(xì)胞中)。許多 細(xì)胞激活因子和生長因子受體與共同的β亞單位相關(guān)聯(lián)，β亞單位與 酪氨酸激酶和/或其他信號(hào)發(fā)送分子相互作用，并且可在本發(fā)明的嵌 合蛋白質(zhì)中用作胞漿區(qū)域。這些β亞單位包括(1)由GM-CSF、IL -3和IL-5受體分享的通用β亞單位；(2)與IL-6、白血病抑 制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)、制瘤素M和IL-11 受體相關(guān)的β鏈gp130；(3)也與IL-4、IL-7和IL-13(及可 能的IL-9)的受體相關(guān)的IL-C受體γ亞單位；以及(4)與G- -CSF受體之胞漿區(qū)域同源的IL-2受體的β鏈。

可以使用包括干擾素α/β和γ(其可以激活酪氨酸激酶之JAK、 TyK家族的一個(gè)或多個(gè)成員)在內(nèi)干擾素家庭的受體、以及生長激素、 促紅細(xì)胞生成素和催乳素(可能也激活JAK2)受體作為胞漿區(qū)域的 來源。

胞漿區(qū)域的其他來源包括細(xì)胞表面受體的TGF-β家族 (Kingslkey，D.，Genes?and?Development(1994)8，133)。該 受體家族在其胞漿區(qū)域包含絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，據(jù)信是經(jīng)交聯(lián) 而被激活的。

與轉(zhuǎn)錄因子的活化和去活化相關(guān)的酪氨酸激酶在提供可受控制的、 并可用以發(fā)動(dòng)或抑制外源基因表達(dá)的特殊途徑中是特別有用的。

下表中列出了一些受體和與受體相關(guān)的性質(zhì)，以及其激活基因的 反應(yīng)性元件。該表不是無遺漏的，所列出的只是可適用于本發(fā)明的舉 證性的系統(tǒng)。

在許多狀態(tài)下可以得到突變的胞漿區(qū)，其中被轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)可能不 同于野生型，從而產(chǎn)生與野生型相比受限制的或不同的途徑。例如， 對(duì)于EGF和FGF等生長激素，已報(bào)導(dǎo)了其突變情況，其中信號(hào)與細(xì)胞 生長相脫離，但仍由c-fos保留(Peters?et?al.，Nature(1992) 358，678)。

在全身的各種細(xì)胞上，都可以發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體。相反，CD3 ζ家族、Ig家族和淋巴激活素β鏈?zhǔn)荏w家族則主要見于造血細(xì)胞、 特別是T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì) 胞及天然殺傷細(xì)胞上。NF-AT轉(zhuǎn)錄所需要的信號(hào)主要來自抗原受體 的zeta(ζ)鏈，較少來自CD3γ、δ、ε。

?????????????????????????????????????????表1 配體 DNA 元件 結(jié)合因子 基因 參考文獻(xiàn) 胰島素及 其他 cAMP 反應(yīng)性元件 (cre) LRFI jun-B 許多基因 Mol.Cell?Biol.(1992)，12， 4654 PNAS，83，3439 PDGF， FGF，TGF 及其他 SRE SRF/SR EBP c-fos Mol.Cell?Biol.(1992)，12， 4769 EGF VL30 RSRF RVL-3 病毒 c-jun Mol.Cell.Biol.(1992)，12， 2793 do.(1992)，12，4472 IFN-α ISRE ISGF-3 Gene?Dev.(1989)3，1362 IFN-γ GAS GAF GBP Mol.Cell.Biol.(1991)11.182 PMA?and TCR AP-1 許多基因 Cell(1987)49，729-739 TNF NFкB 許多基因 Cell(1990)62，1019-1029 抗原 ARRE-1 OAP/O ct-1 許多基因 Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715 抗原 ARRE-2 NFAT IL-2 增強(qiáng)子 Science(1988)241，202

由于天然存在的或被截短的、修飾的或突變的，胞漿區(qū)域至少約 10個(gè)，一般至少約30個(gè)，更通常至少約50個(gè)氨基酸，并且通常 不超過約400個(gè)氨基酸，更好是不超過約200個(gè)氨基酸(參見Romeo， et?al.，Cell(1992)68，889-892)。雖然任何種均可使用，但較 好使用內(nèi)源于宿主細(xì)胞的種。然而，在許多情況下，可以有效地使用 來自不同種的胞漿區(qū)。上文指出的任何胞漿區(qū)，以及目前已知的或繼 后可能被發(fā)現(xiàn)的其他胞漿均可使用。

對(duì)于大部分與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的其他嵌合蛋白質(zhì)來說，主要不同在 于具有將嵌合蛋白質(zhì)導(dǎo)向核膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞擊靶序列，并具有作為作用 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子或其部分。通常，轉(zhuǎn)錄因子作用區(qū)域可分為“DNA結(jié) 合區(qū)”和“激活區(qū)”?？梢蕴峁┯幸粋€(gè)或多個(gè)配體結(jié)合區(qū)的DNA結(jié)合 區(qū)，以及有一個(gè)或多個(gè)配體結(jié)合區(qū)的激活區(qū)。以這種方式，DNA結(jié)合 區(qū)可以與多個(gè)結(jié)合區(qū)上和/或激活區(qū)偶聯(lián)。另外，對(duì)涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的 與表面膜有關(guān)之嵌合蛋白質(zhì)的討論也適用于指導(dǎo)與基因組DNA結(jié)合的 嵌合蛋白質(zhì)。同樣，與胞吐作用相關(guān)的嵌合蛋白質(zhì)，代替轉(zhuǎn)導(dǎo)性胞漿 蛋白質(zhì)，基本上不同于與泡囊膜同表面膜的融合相關(guān)的蛋白質(zhì)。

B.細(xì)胞擊靶區(qū)域

信號(hào)肽或序列使嵌合蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面膜，此時(shí)相同或其他 的序列可以編碼與細(xì)胞表面膜結(jié)合的嵌合蛋白質(zhì)。雖然有一個(gè)通用的 信號(hào)序列部分，在兩個(gè)或三個(gè)N末端極性氨基酸之后是大約15- 20個(gè)基本上疏水的氨基酸，但個(gè)別氨基酸可能有很在的變化。因此， 實(shí)質(zhì)上任何在宿主中有功能活性的，并且可能或可能不與嵌合蛋白質(zhì) 的其他區(qū)域之一相聯(lián)系的信號(hào)肽均可利用。正常情況下，信號(hào)肽要經(jīng) 過加工并且將不保留在成熟的嵌合蛋白質(zhì)中。編碼信號(hào)肽的序列是在 編碼序列的5′端，并且將包括起始蛋氨酸密碼子。

選擇膜保留區(qū)域?qū)τ诒景l(fā)明來說不是很重要的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)這些膜 保留區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是可替代的，并且結(jié)合或?yàn)榧せ疃Y(jié)合到其他膜區(qū)域 上都不要求有嚴(yán)格的氨基酸。因此，不管是不是宿主內(nèi)源的，從任何 方便的表面膜或胞漿蛋白質(zhì)中都可以分離膜保留區(qū)域。

至少有兩個(gè)不同的膜保留區(qū)：跨膜保留區(qū)，其為橫跨膜延伸的氨 基酸序列；以及脂質(zhì)膜保留區(qū)，其脂質(zhì)與細(xì)胞表面膜的脂質(zhì)相聯(lián)。

為了易于構(gòu)建，大部分都可使用胞漿區(qū)域或受體區(qū)域的跨膜區(qū)， 這樣可趨向于簡化融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建。然而，對(duì)于脂質(zhì)膜保留區(qū)，通 常在與膜結(jié)合的N末端編碼序列的5′端，和接近C末端結(jié)合區(qū)編碼 序列的3′端加上加工信號(hào)。脂質(zhì)膜保留區(qū)具有約12到24的碳原 子，特別是14個(gè)碳原子，更具體是有肉豆蔻酰基，與甘氨酸連接的 脂質(zhì)。脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的信號(hào)序列是一N末端序列并且可有很寬范圍的變 化，通常在2位殘基上是甘氨酸且在7位殘基上是賴氨酸(Kaplan， et?al.，Mol.Cell.Biol.(1988)8，2435)。Carr等人(PNAS， USA(1988)79，6128)、Aitken等人(FEBS?Lett.(1982)150， 314)、Henderson等人(PNAS，USA(1983)80，319)、Schulz等 人(Virology(1984)123，2131)、Dellman等人(Nature(1985) 314，374)都已描述過，并在Ann.Rev.of?Biochem.(1988)57， 69中也已綜述過參予翻譯后加工以提供脂質(zhì)膜結(jié)合的肽序列。有意 義的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。多種DNA 序列均可用于編碼融合之受體蛋白質(zhì)中的所述序列。

一般說來，跨膜區(qū)域有大約18-30個(gè)氨基酸，更常見是約 20-30個(gè)氨基酸，其中心部分主要是中性、非極性氨基酸，并且 該區(qū)域的末端是極性氨基酸，常常是帶電荷的氨基酸，一般約帶1- 2個(gè)電荷，跨膜區(qū)域的末端主要是堿性氨基酸，其后是螺旋斷裂殘基， 如pro-或gly-。

C.配體結(jié)合區(qū)域

本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的配體結(jié)合(二聚合)區(qū)可以是任何允許使用 天然或非天然配體，較好是非天然合成配體進(jìn)行誘導(dǎo)的方便區(qū)域。根 據(jù)構(gòu)建體的性質(zhì)和選擇的配體不同，結(jié)合區(qū)域可以是細(xì)胞膜內(nèi)部的或 外部的。多種包括受體在內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)，包括與上文指出的胞質(zhì)區(qū) 相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)都是已知的。其中特別有用的是已知其配體的(較 好是小的有機(jī)配體)或可以容易產(chǎn)生的結(jié)合蛋白質(zhì)。這些受體或配體 結(jié)合區(qū)域包括FKBP和親環(huán)素受體、類固醇受體、四環(huán)素受體、 上文指出的其他受體等，以及可從抗體，特別是重或輕鏈亞單位、其 突變序列得到的“非天然”受體、以隨機(jī)程序、組合合成等方法得到 的隨機(jī)氨基酸序列。在大多數(shù)情況下，受體區(qū)作為天然區(qū)域或其截短 的活性部分，至少有大約50個(gè)氨基酸、且少于約350個(gè)氨基酸，通 常少于200個(gè)氨基酸作為其天然區(qū)或截短的活化區(qū)。結(jié)合區(qū)較好是小 的(＜25KDa，以允許在病毒載體中轉(zhuǎn)染)、單體的(這就排除了 抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng))、非免疫原性的，并且應(yīng)是易于合成上 的、可透過細(xì)胞的、可二聚成形的無毒性配體。

依據(jù)編碼嵌合蛋白質(zhì)之構(gòu)建體的設(shè)計(jì)和適當(dāng)配體的可利用性，受 體區(qū)可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的。對(duì)于疏水配體，結(jié)合區(qū)可以在膜的任 一側(cè)，但對(duì)于親水配體，特別是蛋白質(zhì)配體，除非有一個(gè)使配體以其 得到結(jié)合的形式實(shí)現(xiàn)內(nèi)在化的運(yùn)輸系統(tǒng)，否則結(jié)合區(qū)通常都是細(xì)胞膜 外的。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)受體，構(gòu)建體可以編碼信號(hào)肽和受體區(qū)序列的跨膜 區(qū)5′或3′端?；蚩赡苡惺荏w區(qū)序列的脂質(zhì)連接信號(hào)序列5′端。 當(dāng)受體區(qū)處于信號(hào)肽和跨膜區(qū)域之間時(shí)，受體區(qū)將是細(xì)胞外的。

構(gòu)建體的編碼受體的部分可因種種原因受到誘變。經(jīng)誘變的蛋白 質(zhì)可提供更高的結(jié)合親和性，允許由配體分辨天然出現(xiàn)的受體和經(jīng)誘 變受體，為設(shè)計(jì)受體-配體對(duì)等提供機(jī)會(huì)。受體改變可包括已知是在 結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸的改變、使用組合技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，其中可經(jīng) 改變特定氨基酸的密碼子(有已知改變或隨機(jī)改變)，在適當(dāng)?shù)脑?宿主中表達(dá)所得到的蛋白質(zhì)，然后篩選所得到的用于結(jié)合的蛋白質(zhì)， 而對(duì)與結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)之氨基酸或與構(gòu)型改變相關(guān)之其他氨基酸的密碼 子進(jìn)行誘變?？膳e例的這種狀態(tài)是將FKBP12的36位Phe改變成 Ala，和/或?qū)⑵?7位Asp改變成Gly或Ala，以便在FK506或FK520 的9或10位上容納氨基酸取代。具體地說，作為在C9和/或C10 上包含修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區(qū)，代替一個(gè)或多個(gè) Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99而含有Val、Ala、 Gly、Met或其他小氨基酸的突變FKBP12部分是特別有意義。

可以使用抗體亞單位，如重鏈或輕鏈，特別是其片段，更具體的 是全部或部分可變區(qū)，或重鏈與輕鏈的融合體以產(chǎn)生高親和性結(jié)合。 可以制備抗生理上可接受之半抗原分子的抗體，并根據(jù)結(jié)合親和性篩 選個(gè)別抗體亞單位。可以分離編碼亞單位的cDNA并經(jīng)缺失恒定區(qū)、 部分可變區(qū)、誘變可變區(qū)等對(duì)其進(jìn)行修飾，以得到對(duì)配體有適當(dāng)親和 性的結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域。以這種方式，幾乎任何生理上可接受的半抗原 化合物均可以用作配體，或提供配體的表位。如結(jié)合區(qū)是已知的并且 有一個(gè)有用的結(jié)合配體時(shí)，可以利用天然受體來代替抗體單位。

基于體外利用誘變或?qū)幋a蛋白質(zhì)之序列的組合修飾，得以能夠 生產(chǎn)可根據(jù)不同配體的結(jié)合親和性進(jìn)行篩選的蛋白質(zhì)文庫。例如，可 在編碼結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上，總體上隨機(jī)設(shè) 定一個(gè)有1至5個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)密碼子的序列，制成表達(dá)構(gòu)建體 并將此表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入單細(xì)胞微生物中，以建立文庫。然后可以根據(jù) 對(duì)一個(gè)或多個(gè)配體的結(jié)合親各性篩選該文庫。然后即可使用與它們將 導(dǎo)入其中的細(xì)胞相匹配的最好的親和性序列作為結(jié)合區(qū)。應(yīng)根據(jù)所使 用的細(xì)胞來篩選配體，以確定配體與內(nèi)源性蛋白質(zhì)結(jié)合的水平?？梢?權(quán)衡對(duì)經(jīng)過誘變的結(jié)合區(qū)的結(jié)合親合性與對(duì)內(nèi)源性蛋白質(zhì)的結(jié)合親和 性之結(jié)合區(qū)的比例，以確定結(jié)合特性。然后可使用有最好結(jié)合特性的 那些配體作為配體。作為非限制性的例子，可在完成前述工作中使用 噬菌體顯示技術(shù)。

D.多聚合

正常情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)是由于配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)分子的低 聚造成的，即由于配體結(jié)合后的低聚合的結(jié)果，盡管亦可利用其他結(jié) 合過程，例如變構(gòu)激活來產(chǎn)生信號(hào)。就各區(qū)域的次序和個(gè)別區(qū)域的重 復(fù)數(shù)目來說，嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體間是有所不同的。對(duì)于在5′-3′ 方向上轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞外受體區(qū)域來說，構(gòu)建體將編碼包含信號(hào)肽、受體 區(qū)、跨膜區(qū)和信號(hào)起始區(qū)的蛋白質(zhì)，其最后一個(gè)區(qū)域?qū)⑹羌?xì)胞內(nèi)的 (胞質(zhì)的)。然而，如受體區(qū)是細(xì)胞內(nèi)的，則可利用不同的次序，此 時(shí)信號(hào)肽之后可跟著受體區(qū)或信號(hào)起始區(qū)，然后是其余區(qū)域，或者有 多個(gè)受體區(qū)，信號(hào)起始區(qū)可夾在受體區(qū)之間。通常，信號(hào)起始區(qū)的活 性位點(diǎn)是在序列內(nèi)的，并且不需要有游離的羧基末端。每個(gè)區(qū)域都可 以被多聚合，特別是受體區(qū)，通常具有不超過大約5次重復(fù)，及常見 是不超過大約3次重復(fù)。

為了使受體多聚合，嵌合表面膜蛋白質(zhì)的受體區(qū)配體通常是在其 至少應(yīng)有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的意義上多聚的，同時(shí)每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均能夠與 受體區(qū)結(jié)合?？赏黝}配體是二聚體或更高級(jí)的低聚體，通常是不大 于四聚的小的合成有機(jī)分子，單個(gè)分子一般至少約150D并且小于約 5KD，通常是小于約3KD?？衫枚喾N合成配體和受體對(duì)。例如，在 涉及天然受體的實(shí)施方案中，可使用二聚FK506與FKBP受體，可使 用二聚合的環(huán)孢菌素A與環(huán)孢菌素受體、二聚合的雌激素與雌激素受 體、二聚合的糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體、二聚合的四環(huán)素與四環(huán) 素受體、二聚合的維生素D與維生素D受體等。另外亦可使用更高級(jí) 聚合如三聚合的配體。對(duì)于涉及非天然受體的實(shí)施方案，例如抗體亞 單位、經(jīng)修飾的抗體亞單位或經(jīng)修飾的受體等，可以使用任何各種不 同的化合物。這些配體單位的重要特征是它們以高親合性(較好Kd≤ 10-8M)與受體結(jié)合，并且能夠化學(xué)二聚合。

配體可以有帶不同表位的不同的受體結(jié)合分子(也稱為“HED” 試劑)，因?yàn)樗鼈兛梢越閷?dǎo)有相同或不同結(jié)合區(qū)域之嵌合蛋白質(zhì)的異 二聚合或異低聚合。配體可包括FK506或FK506型部分，以及CsA或 環(huán)孢菌素型部分。兩部分都共價(jià)連接到共同的接頭部分上。這樣的配 體將適用于介導(dǎo)第一和第二嵌合蛋白質(zhì)的低聚，其中第一嵌合蛋白質(zhì) 含有能夠與FK506型部分結(jié)合的受體區(qū)如FKBP12；第二嵌合蛋白質(zhì) 則含有能夠與環(huán)孢菌素A型部分結(jié)合的受體區(qū)如環(huán)孢菌素。

VI.細(xì)胞

細(xì)胞可以是原核的，但最好是真核的，包括植物、酵母、蠕蟲、 昆蟲以及哺乳動(dòng)物。目前優(yōu)選的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是靈長類 動(dòng)物，更具體是人，但可與涉及其他任何有興趣的動(dòng)物特別是家養(yǎng)動(dòng) 物，如馬、牛、鼠、羊、狗、貓等。這些種動(dòng)物中，可包括各種類型 的細(xì)胞，例如造血、神經(jīng)、間質(zhì)、皮、粘膜、基質(zhì)、肌肉、脾、網(wǎng)狀 內(nèi)皮、表皮、內(nèi)皮、肝、腎、胃腸、肺等組織的細(xì)胞。其中特別有用 的是造血細(xì)胞，其包括任何可能與淋巴樣細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞譜系相 關(guān)的有核細(xì)胞。其中特別有價(jià)值的是T和B細(xì)胞譜系的成員、巨噬細(xì) 胞和單核細(xì)胞、成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。另外特別適用的是干細(xì)胞和 祖細(xì)胞，如造血、神經(jīng)、基質(zhì)、肌肉、肝、肺、胃腸等細(xì)胞。

細(xì)胞可以是自體細(xì)胞、同源細(xì)胞、同種異型細(xì)胞、甚至有些情況 下是異源細(xì)胞?？梢愿淖冎饕M織相容性復(fù)合(“MHC”)特征以修 飾細(xì)胞，包括失活β2巨球蛋白以阻止生成功能性I類MHC分子、失 活I(lǐng)I類分子、為一種或多種MHC分子的表達(dá)準(zhǔn)備條件、經(jīng)提高或抑制 與細(xì)胞毒活性相關(guān)之基因的表達(dá)提高或失活胞毒能力等。

在某些情況下，特定克隆或寡克隆細(xì)胞可能是有意義的，這些細(xì) 胞有特定的特異性，例如T細(xì)胞和B細(xì)胞即具有特定抗原特異性或保 有靶位點(diǎn)特異性。

VII.配體

包括天然發(fā)生的和合成的物質(zhì)在內(nèi)的多種多樣的配體均可用于本 發(fā)明，以影響嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚。選擇配體的適用的和容易觀察 或度量的標(biāo)準(zhǔn)是：(A)配體是生理上可接受的(即對(duì)于它所用于的 細(xì)胞或動(dòng)物沒有過多的毒性)，(B)有合理的治療劑量范圍，(C) 可望(用于整體動(dòng)物，包括基因治療應(yīng)用時(shí))能夠口服攝入(其在胃 腸系統(tǒng)中是穩(wěn)定的，并且可被吸收到血管系統(tǒng)中)，(D)必要時(shí)可 以穿越細(xì)胞和其他膜，并且(E)以適合所期望之應(yīng)用的親和性結(jié)合 到受體區(qū)域上。第一個(gè)合乎需要的標(biāo)準(zhǔn)是除了其激活受體的能力之外， 所用化合物在生理上是相對(duì)惰性的。配體與天然受體結(jié)合越少并且與 天然受體結(jié)合之總配體的比例越低，則反應(yīng)越是正常。特具體地說， 受體對(duì)天然蛋白質(zhì)不應(yīng)該有強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)大多數(shù)情況來說，受 體將是非肽的和非核酸的。

對(duì)大多數(shù)主題化合物要有兩個(gè)或多個(gè)單位，這些單位可以是通過 中心連接基團(tuán)連接在一起的相同或不同的單位?！皢挝弧笔悄軌蚪Y(jié)合 受體的各個(gè)部分(如FK506、FK520、環(huán)孢菌素A、類固醇等)。至少 在二聚體或較高級(jí)同聚物中，各單位通常通過相同的反應(yīng)性部分連接 到連接基團(tuán)上。

如上文指出的，對(duì)于小的非蛋白質(zhì)有機(jī)分子有多種不同的天然受 體，這些小的有機(jī)分子都符合上述標(biāo)準(zhǔn)，并且可在不同的位點(diǎn)上二聚 合以提供本發(fā)明的配體。只要保留有所需特異性的結(jié)合能力，即允許 對(duì)這些化合物進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾。許多化合物是大環(huán)的，例如大環(huán)內(nèi)酯。 適宜的結(jié)合親和性將反映在Kd值低于10-4，較好低于10-6，更 好低于約10-7，但結(jié)合親和性也可能低于10-9或10-10，并且 在某些情況下是最合乎要求的。

普遍優(yōu)選的配體包括低聚物，通常是能夠與FKBP蛋白質(zhì)和/或 親環(huán)素蛋白質(zhì)結(jié)合之化合物的二聚體。這樣的配體包括保留其與 天然或誘變之結(jié)合區(qū)的結(jié)合能力的，環(huán)孢菌素A、FK506、FK520及 雷帕霉素和其衍生物的同和異多聚體(通常是2-4個(gè)，更常見為2 -3個(gè)單位)。這些化合物的許多衍生物都是已經(jīng)知道的，包括可用 于本發(fā)明實(shí)踐中的合成的高親和性FKBP配體(例如參見Holt?et?al， J.Am.Chem.Soc.1993，115，9925-9935)。連接FK506和其類 似物的有意義位點(diǎn)包括卷入從17至24位的環(huán)狀碳原子的位置，以 及與這些環(huán)原子結(jié)合的取代基位置，如21(烯丙基)、22、37、 38、39和40位(環(huán)己基)，而除21位外同一位置對(duì)于FK520 是有意義的。對(duì)于環(huán)孢菌素，有意義的位點(diǎn)包括McBmt，位置3和位 置8。

對(duì)配體修飾中特別有意義的是改變其結(jié)合特性，特別是就配體的 天然存在的受體來說。同時(shí)，應(yīng)改變結(jié)合蛋白質(zhì)以適應(yīng)配體的改變。 例如，可以用具有更大空間需要的基團(tuán)取代羥基，或者用有更大空間 要求的基團(tuán)取代羰基或使羰基功能化，例如形成N取代的西夫堿或亞 胺來修飾10位上的羰基，以加大該位置的空間體積，而對(duì)FK506的 9和10位上基團(tuán)進(jìn)行修飾(參見Van?Duyne?et?al(1991)Science 252，839)，以便增強(qiáng)它們的空間要求。可以在這些位點(diǎn)上方便地引 入的各種功能性基團(tuán)是形成醚的烷基基團(tuán)、酰氨基團(tuán)、N-烷化胺、 2-羥乙基亞胺也可形成1，3-噁唑啉等。一般說來，取代基大約 有1-6個(gè)，通常1-4個(gè)，更多是1-3個(gè)碳原子，且有1-3個(gè)， 通常1-2個(gè)雜原子，這些雜原子一般是氧、硫、氮等?？墒褂没?結(jié)構(gòu)的不同衍生物，產(chǎn)生對(duì)結(jié)合有不同構(gòu)型要求的不同配體。經(jīng)誘變 受體，可以得到實(shí)質(zhì)上有相同序列的不同受體，所述受體對(duì)結(jié)構(gòu)上沒 有明顯不同的經(jīng)修飾的配體有不同親和性。

可以使用的其他配體是類固醇。類固醇可以是低聚的，以致在沒 有丟失其與含有一個(gè)或多個(gè)類固醇受體區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)合能力的 情況下，降低了它們的天然生物學(xué)活性。作為非限制性實(shí)施例，可以 使用糖皮質(zhì)激素和雌激素。也可以使用多種藥物，已知這些藥物能夠 以高親和力結(jié)合特定受體。在受體的結(jié)合區(qū)是已知的時(shí)尤其是這樣， 因此允許在嵌合蛋白質(zhì)中只使用結(jié)合區(qū)，而不是整個(gè)天然受體蛋白質(zhì)。 為此目的，可使用酶和酶抑制劑。

A.接頭

連接中可包括多種不同的官能團(tuán)，例如酰胺基團(tuán)，包括碳酸衍生 物、醚、酯、有機(jī)和無機(jī)酯、氨基等。為了提供連接，可經(jīng)氧化、羥 化、取代、還原等修飾特定單體，以提供偶聯(lián)位點(diǎn)?？梢愿鶕?jù)不同單 體，選擇不同的位點(diǎn)作為偶聯(lián)位點(diǎn)。

可用任何常規(guī)方法合成多聚配體，其中連接基團(tuán)是在并不干擾配 體與受體在結(jié)合位點(diǎn)上的結(jié)合。在生理學(xué)活性的活性位點(diǎn)和配體與受 體區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)不同的情況下，一般可望在活性位點(diǎn)連接以失活配體。 可以利用多種連接基團(tuán)，通常在兩分子之間的鏈中有1-30個(gè)、更 好有大約1-20個(gè)原子(除氫以外)，其中連接基團(tuán)主要由碳、氫、 氮、氧、硫和磷組成。連接基因可以包括各種官能團(tuán)，如酰胺和酯 (有機(jī)和無機(jī)的)、胺、醚、硫醚、二硫化物、季銨鹽、肼等。鏈可 包括脂族、無環(huán)、芳族或雜環(huán)基團(tuán)?？筛鶕?jù)合成容易的和多聚配體的 穩(wěn)定性來選擇鏈。因此，如果希望保留長期活性，可使用相對(duì)惰性的 鏈，以使多聚配體鍵合不被裂解。另外，亦可只希望在血流中有短的 半壽期，那么即可利用易于被裂解的各種基團(tuán)，例如酯和酰胺，特別 是肽，其中循環(huán)的和/或細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶能夠裂解連接基團(tuán)。

可利用各種基團(tuán)作為配體間的連接基團(tuán)，例如通常有2至20個(gè) 碳原子的亞烷基，通常有4至18個(gè)碳原子的氮雜亞烷基(其中氮通 常是在兩個(gè)碳原子之間)、通常有6至24個(gè)碳原子的N-亞烷基氮 雜亞烷基(見上文)、通常有6至18個(gè)碳原子的亞芳基、通常有8 至24個(gè)碳原子的芳二亞烷基(ardialkylene)、通常有8至36 個(gè)碳原子的雙-羧酰氨基亞烷基等。說明性的這類基團(tuán)包括癸烯、 十八烯、3-氮雜戊二烯亞戊基、5-氮雜癸烯、N-丁烯、5-氮 雜壬烯、亞苯基、亞二甲苯基、對(duì)二丙烯基苯、雙-苯甲?；?，8 -二氨基辛烷等。可使用下文實(shí)施例中描述的材料和方法，用攜帶相 應(yīng)受體區(qū)的本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)估計(jì)上述含接頭部分的多價(jià)或其他(詳 見下述)配體分子。

B.配體特征

對(duì)于細(xì)胞內(nèi)結(jié)合區(qū)，應(yīng)選擇能夠以生物活性形式跨膜轉(zhuǎn)移的配體， 即該配體是可透過膜的。多種配體都是疏水的或者是可以經(jīng)用親脂基 團(tuán)進(jìn)行適當(dāng)修飾而制成的。具體地說，可經(jīng)提供約有12至24個(gè)碳 原子脂族側(cè)鏈來利用連接橋提高配體的親脂性。另外，亦可提供一個(gè) 或多個(gè)將提供跨膜運(yùn)輸能力的，而又希望沒有核內(nèi)體形成的基團(tuán)。

在某些例子中，不必使用多聚配體。例如，在兩個(gè)不同的結(jié)合位 點(diǎn)供受體二聚時(shí)，可以使用分子。在其他例子中，配體的結(jié)合可導(dǎo)致 受體區(qū)的構(gòu)型改變，例如使受體二聚合而導(dǎo)致活化。誘導(dǎo)信號(hào)的其他 一些機(jī)制也是可以發(fā)揮效力的，例如結(jié)合具有構(gòu)象改變而導(dǎo)致胞質(zhì)區(qū) 域激活的單一受體。

C.配體拮抗物

可以使用單體配體逆轉(zhuǎn)多聚配體的作用，即抑制或破壞低聚體的 形成或維持。因此，如果迅速終止細(xì)胞激活的效應(yīng)，可以使用單體配 體。可以使用同樣方法，在如多聚體的相同位點(diǎn)方便地修飾母配體部 分，不同的是用單功能化合物取代多功能化合物?？墒褂糜?到20 個(gè)(它們可以更長)，通常有2至12碳原子的單胺，如乙胺、己胺、 芐胺等代替多胺。另外，在母體化合物沒有過多不期望的生理學(xué)活性 (如免疫抑制、有絲分裂、毒性等)的情況下，可以使用單價(jià)母體化 合物。

D.舉例說明性的同可與含補(bǔ)償性突變之突變受體結(jié)合的“隆起 塊”異低聚(HED)和同低聚(HOD)的試劑。

如上文討論的，由于在經(jīng)修飾的HED/HOD試劑上存在與受體之 結(jié)合“袋”中的側(cè)鏈殘基進(jìn)行空間碰撞的取代基(“隆起塊”)，所 以可以制備這種不能與其野生型受體(如FKP12)發(fā)生可估計(jì)的結(jié) 合的經(jīng)修飾的HED/HOD試劑。也可以制得在干擾殘基上包含突變 (“補(bǔ)償性突變”)的相應(yīng)受體，并因此而獲得與帶“隆起塊”之配 體結(jié)合的能力。使用“形成隆起塊的”配體部分和攜帶補(bǔ)償性突變的 受體區(qū)域，會(huì)提高我們的試劑的特異性并進(jìn)而提高其效力。形成隆起 塊的試劑不會(huì)與內(nèi)源性、野生型受體結(jié)合，其另外可以對(duì)基于天然配 體部分的二聚體起到“緩沖劑”作用。另外，新的受體-配體對(duì)的產(chǎn) 生同時(shí)將會(huì)產(chǎn)生將在需要異二聚化時(shí)使用的HED試劑。例如，可以使 HED試劑誘導(dǎo)syntaxin(一種漿膜融合蛋白質(zhì))與synaptobrevin(一 種泡囊膜融合蛋白質(zhì))的異二聚，而實(shí)現(xiàn)受調(diào)節(jié)的泡囊融合。這不僅 提供了一種研究工具，而且也可作為使用經(jīng)適當(dāng)修飾的分泌細(xì)胞對(duì)糖 尿病進(jìn)行基因治療的基礎(chǔ)。

作為“形成隆起塊的FK1012s”的一個(gè)實(shí)例，我們制備了FK506 的C10乙酰胺和甲酰胺衍生物。有關(guān)FK1012s?A-C和FK506M的合 成的詳細(xì)內(nèi)容可參見圖16A和我們的報(bào)導(dǎo)，Spencer?et?al， “Controlling?Signal?Transduction?with?Synthetic?Ligands”， Science?262，5136(1993)：1019-1024。我們選擇到制兩類形成 隆起塊的FK1012；一類在C10上有隆起，一類在C9上有隆起。已 按照?qǐng)D05B中所示的反應(yīng)順序合成了FK506之C10乙酰胺和甲酰 胺的R和S異構(gòu)體。這些帶隆起的衍生物在它們對(duì)FKBP12的結(jié)合親 和性失去了至少3個(gè)數(shù)量級(jí)(圖16B)。檢測(cè)衍生物抑制FKBP12 旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶(rotamase)的活性來確定親和性。

第二類C9帶隆起塊之衍生物的一個(gè)實(shí)例是已按已知方法(參見 Fisher?et?al.J.Org.Chem.56，8(1991)：2900-7和Edmunds et?al.Tet.Lett.32，48(1991)：819-820)制得的螺-環(huán)氧化 物(如圖16C中所示)。令人特別感興趣的C9衍生物系列的特征 在于它們的sp3雜化和在C9上的還原低的氧化狀態(tài)。已按照?qǐng)D 16C中所示的反應(yīng)合成了幾種這樣的化合物。

應(yīng)理解到的是，異二聚體(或其他異低聚體)須按不同于同二聚 體的方法構(gòu)成，否則至少在應(yīng)用中同二聚體污染時(shí)可能會(huì)對(duì)其成功地 應(yīng)用造成不利影響。圖16D中圖解顯示了為克服這一問題而發(fā)展的一 個(gè)說明性的合成戰(zhàn)略。在含過量三乙胺的二氯甲烷中，使單alloc- 保護(hù)的1，6-己二胺(Stahl?et?al，J.Org.Chem.43，11 (1978)：2285-6)與衍生形式的FK506偶聯(lián)，以44％產(chǎn)率得到 alloc-胺-取代的FK506。現(xiàn)在即可將該中間產(chǎn)物用于與任何活化的 FK506(或帶隆起塊的FK506)分子偶聯(lián)。在室溫THF中雙甲酮存在下 用催化性四聯(lián)-三苯基膦鈀去保護(hù)，除去胺保護(hù)基團(tuán)。立即用活化的 FK506衍生物處理，然后脫甲硅基而產(chǎn)生二聚產(chǎn)物。已使用該技術(shù)合 成了說明性的HOD和HED試劑。

E.說明性的環(huán)孢菌素試劑

環(huán)孢菌素A(CsA)是以高親和力(6nM)與其細(xì)胞內(nèi)受體親環(huán) 素-一種18KDa單體蛋白質(zhì)-結(jié)合的環(huán)十一肽。所得到的復(fù)合物 如FKBP12-FK506復(fù)合物，與蛋白質(zhì)磷酸酶calcineurin結(jié)合并使 之失活，進(jìn)而導(dǎo)致藥物的免疫抑制性質(zhì)。作為本發(fā)明的另一個(gè)說明性 實(shí)例，我們以6個(gè)步驟通過其NeBmtl側(cè)鏈二聚合了CsA，并以35％ 的總產(chǎn)率得到(CsA)2(圖17，按Eberle?et?al，J.Org.Chem. 57，9(1992)：2689-91中報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行步驟1-4)。同 FK1012一樣，選擇二聚位點(diǎn)以使所得的二聚體與兩個(gè)親環(huán)素分子結(jié) 合而又不能在結(jié)合親環(huán)素后與calcineurin結(jié)合。我們已證明(CsA) 2以1∶2的化學(xué)計(jì)算量用親環(huán)素A結(jié)合。因此，(CsA)2同F(xiàn)K1012 一樣，并不抑制信號(hào)傳輸途徑并因而沒有免疫抑制作用和毒性。

VIII.靶基因

A.轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域

第二構(gòu)建體或第二系列構(gòu)建體在5′區(qū)域具有反應(yīng)性元件，如上 文所討論的，其可能是通過產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，對(duì)配體介導(dǎo)的 嵌合受體蛋白質(zhì)的低聚作用發(fā)生反應(yīng)。因此，必須知道至少一個(gè)由胞 質(zhì)區(qū)域直接或間接激活的或者可通過兩個(gè)區(qū)域的聯(lián)系而激活的轉(zhuǎn)錄起 始系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)錄起始因子。還必須知道至少一個(gè)對(duì)所得到的轉(zhuǎn)錄起 始系統(tǒng)起反應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域。需要知道啟動(dòng)子區(qū)域或在其轉(zhuǎn)錄控制下 的基因。換句話說，可以基于作用區(qū)域通過給定的啟動(dòng)子或反應(yīng)性元 件在起始轉(zhuǎn)錄中所起的作用，來選擇嵌合蛋白質(zhì)的作用區(qū)(由“第一” 系列構(gòu)建體編碼)(如參見上文V(A)部分“胞質(zhì)區(qū)域”)。

在知道反應(yīng)性元件的情況下，即可使其包括在靶基因構(gòu)建體中， 以便為整合到基因組中(以游離基因形式或經(jīng)染色體摻入)提供表達(dá) 盒。只要知道在天然配體結(jié)合到含有胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)上之后由胞質(zhì)區(qū) 轉(zhuǎn)錄激活的基因，便不必去分離反應(yīng)性元件的特定序列。然后可以使 用同源重組將有用基因插入啟動(dòng)子區(qū)的下游以使之處于內(nèi)源性啟動(dòng)子 區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。如特異的反應(yīng)性元件序列是已知的，可以將其與 不同的、可以在轉(zhuǎn)錄速度上有高或低的活性以及結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子 等其他表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相連接。

因此，表達(dá)構(gòu)建體將在其轉(zhuǎn)錄方向的5′端有允許誘導(dǎo)有用靶基 因，通常是治療性基因轉(zhuǎn)錄起始的反應(yīng)性元件和啟動(dòng)子序列。轉(zhuǎn)錄終 止區(qū)不是那么重要，其可通過插入用于降低mRNA穩(wěn)定性的AU序列， 用以提高短半壽期mRNA的半壽期或制得短半壽期的mRNA，并因此而 限制蛋白質(zhì)作用的時(shí)間?？梢岳萌魏翁峁┍匾霓D(zhuǎn)錄終止，以及在 需要時(shí)提供翻譯終止的任何區(qū)域。

反應(yīng)性元件可以是單一序列或者可以是低聚合的，通常具有不超 過約5次重復(fù)，更多是有大約3次重復(fù)。

也可以使用同源重組除去和/或失活內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄控制序列(包括 對(duì)低聚過程有反應(yīng)的啟動(dòng)子和/或反應(yīng)性元件)，和/或在所需內(nèi)源 性基因上游插入這樣的反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制序列。

B.產(chǎn)物

可以利用多種基因作為靶基因，包括編碼有意義蛋白質(zhì)的基因或 有意義的反義序列或有意義的核酶(ribozyme)。靶基因可以是提供 所需表型的任何有用序列。靶基因可以表達(dá)表面膜蛋白質(zhì)、分泌的蛋 白質(zhì)、胞質(zhì)蛋白質(zhì)，或者是可表達(dá)不同類型產(chǎn)物的多個(gè)靶基因。靶基 因可以是反義序列，該序列可通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)而調(diào)節(jié)特定途 徑，或者通過抑制某途徑中抑制物的翻譯而開通該特定途徑。靶基因 可編碼核酶，該核酶可以通過在RNA水平上干擾相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的表 達(dá)，或干擾特定途徑之抑制物的表達(dá)來調(diào)節(jié)特定途徑。被單一地或聯(lián) 合地表達(dá)的蛋白質(zhì)可以牽涉到尋靶(homing)、細(xì)胞毒性、增殖、免 疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、凝血或血凝塊溶解、體液調(diào)節(jié)等過程。所表達(dá)的 蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì)，天然蛋白質(zhì)的突變體、獨(dú)特序列或 其組合形式。

基因可以是由細(xì)胞分泌的任何產(chǎn)物的基因，從而可隨意制得期望 得到的或宿主必需的產(chǎn)物。多種被分泌的產(chǎn)物包括激素，如胰島素、 人生長激素、胰高血糖素、垂體釋放因子、ACTH、促黑激素、松弛素 等；生長因子，如EGF、IGF-1、TGF-α、-β、PDGF、G-CSF、 M-CSF、GM-CSF、FGF、促紅細(xì)胞生成素、巨核細(xì)胞刺激和生長因子 等；白細(xì)胞介素，如IL-1至-13；TNF-α和-β等；以及酶， 如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)成員、perforins、 超氧化物歧化酶、凝血因子、抗凝血酶III、因子VIIIc、因子VIIIvW、 α-抗胰蛋白酶、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、內(nèi)啡呔、骨形態(tài)形成蛋白 質(zhì)、CFTR等。

基因可以是任何天然的或經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)信號(hào)肽及跨膜序列而制得之 表面膜蛋白質(zhì)的基因。各種各樣的蛋白質(zhì)可以包括尋靶受體，如L- 選擇素(Mel-14)、血液相關(guān)蛋白質(zhì)，特別是有Kringle結(jié)構(gòu)的 蛋白質(zhì)，如因子VIIIc、因子VIIIvW，造血細(xì)胞標(biāo)志物，如CD3、CD4、 CD8、B細(xì)胞受體、TCR亞單位α、β、γ、δ、CD10、CD19、 CD28、CD33、CD38、CD41等；受體，如白細(xì)胞介素受體IL- 2R、IL-4R等；離子如H+、Ca+2、K+、Na+、Cl-等流入或 流出的通道蛋白質(zhì)；CFTR、酪氨酸激活基序、ζ激活蛋白質(zhì)等。

為了向泡囊運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)以便發(fā)生胞吐，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。 加進(jìn)來自某蛋白質(zhì)的被引向泡囊的序列，在這里修飾該序列使之接近 一個(gè)或另一個(gè)末端，或位于與蛋白質(zhì)來源相似的位置，以將被修飾的 蛋白被導(dǎo)向泡囊中高爾基氏器進(jìn)行包裝。這一過程與存在胞吐作用的 嵌合蛋白質(zhì)相結(jié)合，即可將蛋白質(zhì)迅速地輸向細(xì)胞外介質(zhì)，并達(dá)到相 對(duì)高的定位濃度。

另外，具體根據(jù)宿主細(xì)胞的性質(zhì)，一些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可能是有意 義的，例如代謝途徑中的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、類固醇受體、轉(zhuǎn)錄因 子等。上文指出的某些蛋白質(zhì)也可以作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)存在。

下面是不同基因的少數(shù)實(shí)例。在T細(xì)胞中，可能希望導(dǎo)入編碼一 條或兩條T細(xì)胞受體鏈的基因。對(duì)于B細(xì)胞，可以提供用于分泌作用 的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。對(duì)于皮膚細(xì)胞，例如角質(zhì)形成細(xì)胞；特 別是干細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞，可以通過分泌α-、β或γ-干擾素、抗 趨藥性因子、對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)特異的蛋白酶等而提供防止感染保 護(hù)作用。

除了提供有治療價(jià)值之基因的表達(dá)外，有許多情況下可希望將細(xì) 胞導(dǎo)向特定部位。這些部位可包括解剖部位，如淋巴結(jié)、粘膜組織、 皮膚、滑囊、肺或其他內(nèi)部器官等，或者是凝血、損傷部位、外科處 理、炎癥、感染等功能性部位。經(jīng)提供在宿主靶部位對(duì)天然存在之表 位的結(jié)合，以提供可將宿主細(xì)胞引向特定部位之表面膜蛋白質(zhì)的表達(dá)， 從而可使分泌的產(chǎn)物達(dá)到局部化的高濃度。有用蛋白質(zhì)包括尋靶受體， 如L-選擇素(Selectin)，GMP140、CLAM-1等；或addressin， 如ELAM-1、PNAd、LNAd等；血塊結(jié)合蛋白質(zhì)，或?qū)吽幰蜃拥木?部化梯度反應(yīng)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。在許多情況下可希望將細(xì)胞導(dǎo)向特 定部位，并在該部位釋放出治療產(chǎn)物，這將是有很大價(jià)值的。

在許多情況下可能希望能夠殺死經(jīng)修飾的細(xì)胞，在它們呈現(xiàn)后細(xì) 胞的消失具有意義的研究中，或其他過程中希望終止治療，細(xì)胞變成 惡性的。為此目的，可以提供融合到結(jié)合區(qū)上的Fas抗原或TNF受體 的表達(dá)(Watanable-Fwkunaga?et?al.，Nature(1992)356，314- 317)。在原始修飾中，可以提供這些構(gòu)建體的構(gòu)成性表達(dá)條件，從 而使被修飾的細(xì)胞在其表面上有或在其胞質(zhì)中存在這樣的蛋白質(zhì)。此 外，也可以提供受控制的表達(dá)，此時(shí)相同或不同的配體均可發(fā)動(dòng)表達(dá) 和開始自然死亡過程。通過在胞質(zhì)中提供Fas抗原或TNF受體的胞質(zhì) 部分-其中所說的胞質(zhì)部分連接到與靶基因表達(dá)相關(guān)之結(jié)合區(qū)域不同 的結(jié)合區(qū)域上，即可在受控制的條件下殺死被修飾的細(xì)胞。

C.闡述性舉例

作為舉例說明，可按下述方法處理心臟病人或易患中風(fēng)的病人。 將按本文所述方法修飾的細(xì)胞施予病人并保留相當(dāng)長的時(shí)間。舉例的 細(xì)胞包括漿細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞或其他造血細(xì)胞。應(yīng)修飾細(xì)胞使之 表達(dá)與血凝塊結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如有Kringle區(qū)域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，或 粘附性相互作用的蛋白質(zhì)如CD41，并表達(dá)凝塊溶解蛋白質(zhì)，如組織 血纖維蛋白溶酶原激活物、鏈激酶等。以這種方式，在配體介導(dǎo)的低 聚合后，細(xì)胞在血塊部位積聚并提供高定位濃度的血栓溶解蛋白質(zhì)。

另一個(gè)例子是再灌注損傷?？梢岳糜邢薨雺燮诘募?xì)胞，例如巨 噬細(xì)胞或多形核白細(xì)胞(“嗜中性細(xì)胞”)。細(xì)胞具有嗜中性細(xì)胞尋 靶受體以將細(xì)胞引向再灌注損傷的部位。細(xì)胞也可表達(dá)超氧化物歧化 酶，以破壞單氧并抑制自由基對(duì)組織的侵害。

第三個(gè)例子是自體免疫性疾病?？衫瞄L半壽期的細(xì)胞，例如T 細(xì)胞。構(gòu)建體將提供尋找自身免疫損傷部位的尋靶受體、并對(duì)引起損 傷的細(xì)胞進(jìn)行胞毒性攻擊。然后治療即針對(duì)引起損傷的細(xì)胞發(fā)揮作用。 另外，可以提供分泌可溶性受體或其他肽或蛋白質(zhì)的條件，其中分泌 產(chǎn)物將抑制對(duì)引起損傷之細(xì)胞的活化或誘導(dǎo)無反應(yīng)性。另一種可替代 的手段是分泌可用于減小退化作用的抗炎產(chǎn)物。

第四個(gè)例子包括通過包裹用內(nèi)啡肽治療慢性疼痛。用其中以嵌合 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)控制人內(nèi)啡肽轉(zhuǎn)錄的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞的原株。 DNA構(gòu)建體由TATAAA位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的HNF-1*轉(zhuǎn)錄因子 GTTAAGTTAAC的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)拷貝組成。內(nèi)啡肽cDNA將被插入到起 始位點(diǎn)的下游，多腺苷酸在作用和終止序列的上游?？筛鶕?jù)情況，內(nèi) 啡肽cDNA裝備有“FEST”序列以使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，或者在mRNA的3′ 非翻譯區(qū)中有AUUA序列以使其被快速降低。

也用有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，其中之一將編碼 截短的HNF-1cDNA，以正好編碼從氨基酸1到250的DNA結(jié)合序列， 后者偶聯(lián)到處于在成纖維細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)起始和終止區(qū)之轉(zhuǎn)錄和 翻譯控制下的三聚FKBP結(jié)合區(qū)域上。構(gòu)建體應(yīng)包括一個(gè)附加的轉(zhuǎn)錄 單位，后者是由偶聯(lián)到三聚FKBP′結(jié)合區(qū)上的指導(dǎo)衍生于HNF4之轉(zhuǎn) 錄激活區(qū)產(chǎn)生的同一調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)動(dòng)的(該最好部分意欲改變FKBP以 mM濃度結(jié)合到經(jīng)修飾的FK506上。此修飾抑制了與內(nèi)源性FKBP的結(jié) 合)。

可包裹這些總體上修飾的細(xì)胞以抑制免疫識(shí)別，并放在病人的皮 下或其他方便的體內(nèi)部位。當(dāng)病人需要心痛藥物治療時(shí)，給病人使用 二聚配體FK506-FK506′，給予大約1μg至1mg應(yīng)是足夠的。以 這種方式可以在無須注射或沒有成癮危險(xiǎn)的情況下提供止痛效果。

第五個(gè)例子是治療骨質(zhì)疏松?？梢钥寺U(kuò)增淋巴細(xì)胞或培養(yǎng)生長 來自待治療病人的皮膚成纖維細(xì)胞。按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中用骨 形態(tài)形成因子cDNA基因取代內(nèi)啡肽基因。對(duì)于淋巴細(xì)胞，可以使用 抗原特異性克隆，以允許用抗sIg之獨(dú)特型抗體破壞之。另外，給予 sIg的抗原將會(huì)擴(kuò)充細(xì)胞群體，以增加可被釋放之蛋白質(zhì)的量?？勺?入淋巴細(xì)胞克隆并給予產(chǎn)生骨形態(tài)形成因子所需的配體。監(jiān)測(cè)對(duì)配體 的反應(yīng)，并可根據(jù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果調(diào)整所產(chǎn)生的骨形態(tài)形成因子的量，以 便將劑量調(diào)到所需要的水平。

第六種情況在涉及可能需要被破壞之細(xì)胞的相關(guān)基因治療中具有 普遍適用性。例如，一種被修飾的細(xì)胞可能變成腫瘤細(xì)胞或?qū)е铝硪?種病理學(xué)狀態(tài)。應(yīng)將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到被修飾的細(xì)胞中，該細(xì)胞具有必要 的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)并編碼一種在低聚后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如自發(fā)死亡 (apoptosis)的蛋白質(zhì)。例如，fas抗原或Apo-1抗原可誘導(dǎo)大多 數(shù)類型細(xì)胞的自發(fā)死亡(Trauth?et?al.(1989)Science?245，301 -305；Watanaba-Fukunaga?et?al.(1992)Nature?256，314)。 以這種方式將保護(hù)性構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到用于基因治療或其他目的的細(xì)胞 中，為確保部分或全部細(xì)胞死亡，可能須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾以便能夠借 助配體發(fā)揮受控制的胞毒性作用。

另一種情況是修飾抗原特異性T細(xì)胞，此時(shí)可以為激活細(xì)胞而去 激活蛋白質(zhì)的表達(dá)。其中T細(xì)胞受體可能是直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞、病原 體、細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫等的。通過提供細(xì)胞的激活，例如象IL-2 這樣的白介素即可在對(duì)配體反應(yīng)中用于擴(kuò)充被修飾的T細(xì)胞。被修飾 之T細(xì)胞的其他應(yīng)用可包括表達(dá)將T細(xì)胞導(dǎo)向特定部位的尋靶受體， 由此可望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性、靶細(xì)胞例如上皮細(xì)胞表面膜蛋白質(zhì)的向上調(diào) 節(jié)，或其他所需的生物學(xué)過程。

另外可能要求向靶細(xì)胞釋放高劑量的胞毒性因子。例如，在通過 尋靶受體識(shí)別腫瘤抗原后，可以激發(fā)腫瘤侵潤性淋巴細(xì)胞(TIL)釋 放出毒性濃度的TNF或其他相似產(chǎn)物。

另一種可替代的應(yīng)用是輸出被胞吐的激素或因子。在提高了胞吐 作用的情況下，將會(huì)輸出更大量的激素或因子；此外，如果有一個(gè)基 于胞質(zhì)中激素或因子的量的反饋機(jī)制，則將增加激素或因子的產(chǎn)生。 或者，可以提供誘導(dǎo)的激素或因子的表達(dá)，以致能夠相伴隨地誘導(dǎo)表 達(dá)和輸出。

也可以供給在保留的體液如血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、腦脊液等中的 蛋白質(zhì)。經(jīng)修飾可以具有延長了在宿主中之半壽期的細(xì)胞，例如造血 細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、肌細(xì)胞等，特別是干細(xì)胞，蛋白質(zhì)即可更長時(shí) 間地保留在體液中?？梢杂锰峁┓置诨虬伦饔玫臉?gòu)建體來修飾細(xì)胞。 適于實(shí)現(xiàn)分泌的構(gòu)建體應(yīng)具有作為轉(zhuǎn)位區(qū)的信號(hào)肽，并且在使用其他 嵌合蛋白質(zhì)的情況下則具有結(jié)合區(qū)和作用區(qū)。作用區(qū)可得自于相同或 不同的蛋白質(zhì)。例如，就組織血纖維蛋白溶酶原激活物來說，其可以 有凝塊結(jié)合區(qū)為一個(gè)作用區(qū)，并有血纖維蛋白溶酶原活性位點(diǎn)為另一 個(gè)不同的作用區(qū)。另外，也可以利用結(jié)合蛋白質(zhì)，例如LFA-1作為 一個(gè)作用區(qū)并用選擇素作為第二個(gè)作用區(qū)，從而提高了對(duì)自動(dòng)尋標(biāo)的 阻斷。通過修飾蛋白質(zhì)例如integrin、T細(xì)胞受體、sIg等的亞單位， 可以提供能夠聚集并與某分子結(jié)合的可溶形式的表面膜蛋白質(zhì)。其他 機(jī)會(huì)是補(bǔ)體蛋白質(zhì)、參予凝血的血小板膜蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面上的自體 抗原，以及感染劑表面上的病原體分子。

IX.構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)

構(gòu)建體可以作為一個(gè)或多個(gè)DNA分子或其構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中，這 些構(gòu)建體中通常至少有一個(gè)標(biāo)志物并可能有兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物，借以 選擇含有構(gòu)建體的宿主細(xì)胞?？梢杂贸Ｒ?guī)方法制備構(gòu)建體，包括分離 基因和調(diào)節(jié)區(qū)，適當(dāng)情況下經(jīng)連接后克隆到適當(dāng)?shù)目寺∷拗髦?，并?jīng) 限制性酶切和序列測(cè)定分析或其他常規(guī)手段分析之。具體地說，可以 利用PCR，分離包含全部或部分功能性單位的個(gè)別片段，其中可以使 用“引物修補(bǔ)”、并在必要時(shí)利用連接、體外誘變等手段引入一個(gè)或 多個(gè)突變。在完成構(gòu)建并證明所得構(gòu)建體具有適當(dāng)?shù)男蛄泻?，即可?任何常規(guī)方法將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。可以將構(gòu)建體整合并包裝到非復(fù) 制的、有缺陷的病毒如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)或單純性皰疹病 毒(HSV)或其他病毒，包括反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組中，以感染或轉(zhuǎn)導(dǎo) 到細(xì)胞內(nèi)。如果需要的話，構(gòu)建體可以包括轉(zhuǎn)染的病毒序列?；蛘撸?也可以借助融合、電穿孔、biolistics、轉(zhuǎn)染、脂染等技術(shù)導(dǎo)入構(gòu)建 體。在導(dǎo)入構(gòu)建體之前，通常要培養(yǎng)宿主細(xì)胞并在培養(yǎng)物中擴(kuò)充之， 然后經(jīng)適當(dāng)處理以導(dǎo)入構(gòu)建體并整合該構(gòu)建體。擴(kuò)展細(xì)胞并借助存在 于構(gòu)建體中的標(biāo)志物篩選之。可被成功地使用的各種標(biāo)志包括hprt、 新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。

在某些情況下，可以有同源重組的靶位點(diǎn)，其中可望在特定位點(diǎn) 整合構(gòu)建體。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的同源重組的材料和方法， “擊倒”(knock-out)內(nèi)源基因并用構(gòu)建體編碼基取代之(在同一 位點(diǎn)或其他位點(diǎn))。另外，可以修飾對(duì)信號(hào)起始區(qū)起反應(yīng)之內(nèi)源基因 的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，而不是提供基因。在這樣的實(shí)旋方案中，可經(jīng)給予配 體來控制如EPO、tPA、SOD等內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于同源重組，可以 使用Ω或○載體(例如參見Thomas?and?Capecchi，Cell(1987)51， 503-512；Mansour，et?al.，Nature(1988)336，348-352； Joyner，et?al.，Nature(1989)338，153-156)。

構(gòu)建體可以作為編碼所有基因的單一DNA分子，或有一個(gè)或多個(gè) 基因的不同DNA分子被導(dǎo)入?？梢酝瑫r(shí)或相繼地導(dǎo)入各有相同或不同 標(biāo)志物的構(gòu)建體。在一實(shí)例中，一個(gè)構(gòu)建體含有處于特異性反應(yīng)元件 控制下的治療基因(如NFAT)，另一個(gè)則編碼含有融合到配體受體區(qū) (如在MZF3E中的)上之信號(hào)發(fā)生區(qū)的受體融合蛋白質(zhì)。也可以導(dǎo) 入編碼尋靶受體或增加治療產(chǎn)物之釋放效率的其他產(chǎn)物的第三個(gè)DNA 分子。

可用于制備構(gòu)建體DNA貯備物并完成轉(zhuǎn)染的含有細(xì)菌或酵母復(fù)制 原點(diǎn)、可選擇和/或可擴(kuò)增標(biāo)志、在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)所需之啟 動(dòng)子/增強(qiáng)子元件等有用元件的載體是本領(lǐng)域中已知的，并且可以市 場上購得。

X.細(xì)胞和配體的施用

使已用DNA構(gòu)建體修飾的細(xì)胞在選擇條件下在培養(yǎng)基中生長，然 后可擴(kuò)充根據(jù)其含有構(gòu)建體而選擇的細(xì)胞，并使用例如聚合酶鏈反應(yīng) 檢測(cè)宿主細(xì)胞中構(gòu)建體的存在而進(jìn)一步分析之。一旦鑒定了被修飾的 宿主細(xì)胞之后，即可按計(jì)劃使用之，如培養(yǎng)這些細(xì)胞或?qū)胨拗魃?體中。

然后可根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)，以多種不同的方法將細(xì)胞導(dǎo)入宿主生物 體，如哺乳動(dòng)物體中。通常以至少約104個(gè)細(xì)胞，一般不超過約 1010個(gè)，較好不超過約108個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)將造血細(xì)胞注射到血 管系統(tǒng)內(nèi)。所使用的細(xì)胞數(shù)目將取決于多種環(huán)境條件、導(dǎo)入的目的、 細(xì)胞的半壽期、待使用的程序例如給予的次數(shù)、細(xì)胞增殖的能力、治 療劑的穩(wěn)定性、對(duì)治療劑的生理需要等因素。另外，皮膚細(xì)胞可以作 為移植物使用，其細(xì)胞數(shù)目取決于待施用于燒傷或其他損傷上的細(xì)胞 層的大小。一般說來，成肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目至少約104 個(gè)且不超過大約108個(gè)，并且可作為分散體施用，一般是注射到感 興趣的部位或其附近。細(xì)胞一般都是存在于生理上可接受的培養(yǎng)基中。

在許多情況下可希望在體內(nèi)修飾細(xì)胞而不是在體外修飾細(xì)胞。為 此目的，已開發(fā)了多種不同的體內(nèi)修飾靶組織和細(xì)胞的技術(shù)。已開發(fā) 了許多病毒載體，如可以將病毒轉(zhuǎn)染和隨機(jī)整合到宿主中的腺病毒和 反轉(zhuǎn)錄病毒(例如參見Dubensky?et?al.(1984)Pro.Natl.Acad. Sci.USA81，7529-7533；Kaneda?et?al.，(1989)Science?243， 375-378；Hiebert?et?al.，(1898)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，3594-3598；Hatzoglu?et?al.(1990)J.Biol.Chem.265， 17285-17293和Ferry?et?al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA88，8377-8381)。載體可經(jīng)血管內(nèi)或肌肉內(nèi)注射、吸入或其他 胃腸道外方式使用。

按照體內(nèi)遺傳修飾，修飾的方法取決于組織的性質(zhì)、所需的細(xì)胞 修飾的效力、修飾特定細(xì)胞的機(jī)會(huì)、組織對(duì)被導(dǎo)入這DNA組合物的可 接近性等。應(yīng)用攜帶靶轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的被減毒或修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒后， 必要時(shí)可使用本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建體之一來活化病毒，從而可以產(chǎn)生 病毒并轉(zhuǎn)染相鄰的細(xì)胞。

DNA導(dǎo)入不一定在每種情況下都導(dǎo)致整合。在某些情況下短暫保 留被導(dǎo)入的DNA即可滿足需要。以這種方式可使被導(dǎo)入的DNA具有短 期效應(yīng)，這種情況下可將細(xì)胞導(dǎo)入宿主體內(nèi)并經(jīng)過預(yù)定時(shí)間后，例如 當(dāng)細(xì)胞已能夠定位到特定部位后開通其活性機(jī)制。

然后可根據(jù)需要使用激活胞質(zhì)區(qū)的配體?？筛鶕?jù)配體的結(jié)合親和 性、所需的反應(yīng)、施用方式、細(xì)胞半壽期、所存在的細(xì)胞數(shù)目的不同， 使用多種不同的方法。配體可以以胃腸道外或口服途徑使用?？筛鶕?jù) 上述因素確定給藥次數(shù)。配體可以作為藥丸、粉末、或分散體給口服 攝入，或口頰內(nèi)、舌下含服；血管內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下注射；吸入等途 徑使用。可使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和材料來配制適于各種途徑給 藥的配體(及單體化合物)。給藥的精確劑量和特定方法將取決于上 述因素，并可由臨床醫(yī)生或人或動(dòng)物保健提供者來確定。在大多數(shù)情 況下，給藥方式將根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

在欲逆轉(zhuǎn)由配體激活的過程時(shí)，可以給予單體化合物或其它能與 配體競爭的信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)化合物。因此，在有不利反應(yīng)或期望終止治 療效果的情況下，可以以任何方便的方式，特別是經(jīng)血管內(nèi)(如果希 望快速逆轉(zhuǎn)的話)途徑使用單體結(jié)合化合物。此外，也可以在存在失 活區(qū)的情況下提供DNA結(jié)合區(qū)，或者借助作為構(gòu)成上表達(dá)的構(gòu)建體而 存在的Fas或TNF受體使其自然死亡。

可以按照治療劑量監(jiān)測(cè)程序來確定用于各種目的之配體的特定劑 量，其中可望在延長的時(shí)間里，例如大約兩周以上維持特定的表達(dá)水 平；或者在重復(fù)治療的情況下，以長的間隔期例如兩周或更長時(shí)間的 間隔期，在短時(shí)間里給予單個(gè)或重復(fù)劑量的配體。可以在預(yù)定范圍內(nèi) 給出配體的劑量并監(jiān)測(cè)反應(yīng)，以便得出時(shí)間一表達(dá)水平關(guān)系曲線，同 時(shí)觀察治療反應(yīng)?？筛鶕?jù)在此期間觀察到的表達(dá)水平和治療反應(yīng)，按 照反應(yīng)大小在下次提供更大或更小的劑量。可以反復(fù)重復(fù)這一過程直 到得到一個(gè)治療范圍內(nèi)的有效劑量。當(dāng)緩慢投用配體時(shí)，一旦確定了 配體的維持劑量，即可以以延長的間隔期進(jìn)行檢測(cè)，從而確保該細(xì)胞 系統(tǒng)是可以提供適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)和表達(dá)產(chǎn)物水平的。

值得注意的是，該系統(tǒng)受制于許多可變因素，如細(xì)胞對(duì)配體的反 應(yīng)、表達(dá)效率以及分泌水平、表達(dá)產(chǎn)物的活性，病人的隨時(shí)間和環(huán)境 而改變的特殊需要，以及因細(xì)胞丟失而丟失細(xì)胞活性的速度或個(gè)別細(xì) 胞的表達(dá)活性等。因此，既使有可以對(duì)大的群體使用的一般性細(xì)胞， 也期望對(duì)每個(gè)個(gè)別病人監(jiān)測(cè)其適當(dāng)?shù)膫€(gè)體劑量。

本方法學(xué)和組合物可用于治療多種病理狀況或病征。例如可用B 和T細(xì)胞治療腫瘤、感染性疾病、代謝缺陷、心血管病、遺傳性凝血 缺陷、自身免疫性疾病、關(guān)節(jié)退化性疾病，例如關(guān)節(jié)炎、肺部疾病、 腎病、內(nèi)分泌異常等?？墒褂脿窟B結(jié)構(gòu)的各種細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞和 成肌細(xì)胞治療遺傳缺陷，如結(jié)締組織缺陷、關(guān)節(jié)炎、肝病等。在必須 制得大量蛋白質(zhì)以補(bǔ)充缺陷或向肝炎或門脈循環(huán)中釋放治療產(chǎn)物的情 況下，則可以使用肝細(xì)胞。

給出下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和評(píng)估 實(shí)施例1：經(jīng)交聯(lián)T細(xì)胞受體的CD3鏈誘導(dǎo)已分離的IL-2增強(qiáng)子結(jié)

?????合轉(zhuǎn)錄因子

將(1)用SspI和HindIII切割的pPL/SEAP(Berger，et?al.， Gene(1988)61，1)；(2)用NdeI切割，用Klenow修成平頭， 然后用PvuI切割的pSV2/Neo(Southern?and?Berg，J.Mol.Appl. Genet.(1982)1，332)和(3)用PvuI與HindIII切割的各種含啟 動(dòng)子質(zhì)粒(即NFAT-CD8、B-CD8、cx121acZ-Oct-1、AP1- LUCIF3H，或cx15IL2)(如下所述)的三片段連接，制成含有處在 人IL-2啟動(dòng)子(-325至+47；MCB(86)6，3042)控制下之 胎盤分泌的堿性磷酸酶基因的質(zhì)粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)(圖 1)，及相關(guān)質(zhì)粒變異體(即NFAT-SX，NFB-SX、OAP/Oct1-SX 和AP-1-SX)-其中報(bào)導(dǎo)基因處于與含有各種啟動(dòng)子元件(即分別 是NFAT、NKB、OAR/Oct-1和AP1)的合成寡聚體結(jié)合的最小IL- 2啟動(dòng)子(-325至-294和-72至+47)的轉(zhuǎn)錄控制之下。 NFAT-CD8含有NFAT結(jié)合位點(diǎn)(-286至-257；Gene?and?Dev. (1990)4，1823)的3個(gè)拷貝，且cx121acZ-Oct?I含有來自人IL -2增強(qiáng)子的OAP/Oct-1/(ARRE-1)結(jié)合位點(diǎn)(MCB，(1988) 8，1715)的4個(gè)拷貝；B-CD8含有來自小鼠輕鏈之NFB結(jié)合位 點(diǎn)(EMBO，(1990)9，4425)的3個(gè)拷貝，且AP1-LUCIF3H含 有來自金屬硫蛋白啟動(dòng)子之AP-1位點(diǎn)(5′-TGACTCAGCGC-3′) 的5個(gè)拷貝。

在各次轉(zhuǎn)染中，將5μg編碼嵌合受體TAC/TAC/Z(TTZ) (PNAS88，8905-8909)的表達(dá)載體pCD-SR(MCB8，466-72) (Tac-IL2受體鏈)連同各種以分泌堿性磷酸酶為基礎(chǔ)的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒 (見圖1中pSXNeo/IL2的基因圖)共轉(zhuǎn)染到TAg?Jurkat細(xì)胞(用 SV40大T抗原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系的衍生物 [Northrup，et?al.，J.Biol.Chem.，1993])中。各報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒均 含有用于最小IL-2啟動(dòng)子內(nèi)不同IL-2增強(qiáng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子之結(jié)合 位點(diǎn)的多聚合寡核苷酸，或者是報(bào)導(dǎo)基因的完整增強(qiáng)子/啟動(dòng)子上游。 24小時(shí)后，將細(xì)胞的等分樣品(約105個(gè))放在含有對(duì)數(shù)稀釋度 之結(jié)合的抗TAC(CD25)mAb(33B3.1；AMAC，Westbrook，ME) 的微量滴定板小井中。作為陽性對(duì)照并控制轉(zhuǎn)染效率，向各次轉(zhuǎn)染的 等分樣品中加入肌霉素(ionomycin)(1μM)和PMA(25ng/ml)。 繼續(xù)保溫14小時(shí)后，檢測(cè)上清液中的堿性磷酸酶活性，以及相對(duì)于 陽性對(duì)照組樣品所表達(dá)的這些活性。加入1ng/ml?FK506，所有活性 均由于NFAT而降到本底水平，證明失活作用是以用FK506阻斷的同 樣途徑發(fā)生的。所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)都是兩份樣品的平均值，并且?guī)状?實(shí)驗(yàn)均得到相似的結(jié)果(見圖5)。數(shù)據(jù)表明，用已知的細(xì)胞外受體， 得到報(bào)導(dǎo)基因和不同增強(qiáng)子的適當(dāng)反應(yīng)。當(dāng)使用抗TcR復(fù)合物(即 OKT3)MAb時(shí)得到了相似的結(jié)果。 實(shí)施例2：免疫抑制劑藥物FK506和環(huán)孢菌素A(CsA)或二聚衍生化

?????合物FK1012A(8)、FK1012B(5)、CsA二聚體(PB-

?????1-218)的抑制活性

向105個(gè)TAg-Jurkat細(xì)胞中加入肌霉素(1μm)和PMA(25 ng/ml)。另外，加入各種滴定度的不同藥物。5小時(shí)后在溫和去污 劑(即Triton?X-100)溶解細(xì)胞并使提取物與β-半乳糖苷酶底物， MUG(甲基半乳糖苷基繖形酮)一起保溫1小時(shí)。加入甘氨酸/EDTA 停止緩沖液并檢測(cè)提取物的熒光值。所得到的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是兩份樣 品的平均值，并且?guī)状螌?shí)驗(yàn)都得到相似的結(jié)果。令人驚奇的是，F(xiàn)K 1012B在最高濃度(即5μg/ml)似乎可稍微放大分裂素活性；但 對(duì)照實(shí)驗(yàn)則顯示單獨(dú)FK1012B沒有刺激作用(見圖6)。 實(shí)施例3：二聚FK506衍生物FK1012A對(duì)嵌合FKBP12/CD3

?????(1FK3)受體的活性

5μg含有嵌合受體(1FK3)的真核表達(dá)載體pBJ5(基于在 16S拼接位點(diǎn)和polyA位點(diǎn)間插入了多接頭的pCDL-SR)與4μg NFAT可誘導(dǎo)地分泌堿性磷酸酶的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒NFAT-SX進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在 平行的轉(zhuǎn)染中，使用5μg?pBJ5代替1FK3/pBJ5作為對(duì)照。24 小時(shí)后，將含有約105個(gè)細(xì)胞的各轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的等分樣品與如上指出 的對(duì)數(shù)稀釋度的藥物FK1012A一起保溫。作為陽性對(duì)照并為了控制轉(zhuǎn) 染效率，向各轉(zhuǎn)染的等分樣品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng /ml)。繼續(xù)保溫14小時(shí)后，檢測(cè)上清液的堿性磷酸酶活性和相對(duì) 于陽性對(duì)照樣品的被表達(dá)的這些活性。加入2ng/ml?FK506使所有 刺激作用降至本底水平，證明活化是以與用FK506阻斷一樣的途徑進(jìn) 行的。因此，F(xiàn)K506或環(huán)孢菌素將作為使用這些化合物的有效解毒劑。 所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)均為兩份樣品的平均值，并且?guī)状螌?shí)驗(yàn)都得到了相 似的結(jié)果(見圖7)。 實(shí)施例4A：二聚FK506衍生物FK1012B對(duì)肉豆蔻?；逗螩D3/

??????FKBP12(MZF3E)受體的活性

我們成功地證明了許多進(jìn)行配體設(shè)計(jì)與合成的辦法，包括用稱為 “FK1012”的基于FK506的HOD試劑得到的陽性結(jié)果。我們已發(fā)現(xiàn) FK1012達(dá)到2∶1結(jié)合化學(xué)計(jì)算值的高親和性(Kd(1)＝0.1nM； Kd(2)＝0.8nM)，并且不抑制神經(jīng)鈣蛋白(calcineurin)介導(dǎo)的 TCR信號(hào)發(fā)生。此配體既非“免疫抑制性”的也無毒性(在細(xì)胞培養(yǎng) 物中高達(dá)0.1mM)。同樣，我們已制備了基于環(huán)孢菌素A的同二聚試 劑“(CsA)2”，其可以1∶2的化學(xué)計(jì)算量與CsA受體親環(huán)素 結(jié)合，但不與神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合。因此，象FK1012一樣，(CsA)2并 不抑制信號(hào)轉(zhuǎn)輸途徑，并且既不是免疫抑制性的同樣也無毒性。

我們的配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)聯(lián)系的這樣及其他實(shí)例均導(dǎo)致了對(duì)信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的控制。在一個(gè)實(shí)例中，這一目的是通過產(chǎn)生由足以進(jìn)行翻 譯后肉豆蔻酰化的Src的小片段(M)、ζ的胞質(zhì)尾部(Z；也使用 B細(xì)胞受體的成分)、三個(gè)連續(xù)的FKBP12(F3)和flu表位tag (E)組成的細(xì)胞內(nèi)受體而實(shí)現(xiàn)的。在人(Jurkat)T細(xì)胞中表達(dá)構(gòu) 建體MZF3E(圖18)后，我們進(jìn)一步證實(shí)所編碼的嵌合蛋白質(zhì)經(jīng)受 了FK1012介導(dǎo)的低聚合。根據(jù)在對(duì)FK1012反應(yīng)中(EL50＝50nM)堿 性磷酸酶分泌作用(SEAP)所證實(shí)的，伴隨的ζ鏈的聚集導(dǎo)致通過內(nèi) 源性TCR信號(hào)傳輸途徑發(fā)生信號(hào)(圖15)。構(gòu)建SEAP報(bào)導(dǎo)基因的 啟動(dòng)子以由被激活之T細(xì)胞的核因子(NFAT)轉(zhuǎn)錄激活，使其在TCR 信號(hào)發(fā)生后組裝在核中?？赏ㄟ^稱為FK506-M的配體的無毒性單位 譯本誘導(dǎo)的去聚集過程來終止FK1012誘導(dǎo)的信號(hào)傳輸。

具體地說，5μg真核表達(dá)載體，即含有肉豆蔻酰化嵌合受體的 pBJ5與4μg?NFAT-SX共轉(zhuǎn)染。MZE、MZF1E、MZF2E和MZF3E 分別含有處在肉豆蔻酰化CD3胞質(zhì)區(qū)下游的0、1、2、或3個(gè)FKBP 12的拷貝(見圖2)。作為對(duì)照，在平行的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用5μg pBJ5。24小時(shí)后，將約含105個(gè)細(xì)胞的各轉(zhuǎn)染樣品的等分部分 與如所指出的藥物，F(xiàn)K1012B的對(duì)數(shù)稀釋液一起保溫。作為陽性對(duì)照 并為了控制轉(zhuǎn)染效率，向各轉(zhuǎn)染的等分樣品中加入肌霉素(1μm) 和PMA(25ng/ml)。繼續(xù)保溫12小時(shí)后，檢測(cè)上清液的堿性磷 酸酶活性和相對(duì)于陽性對(duì)照樣品被表達(dá)的這些活性。加入1ng/ml FK506使所有刺激作用降到接近本底水平，證明激活是以如用FK506 阻斷同樣的途徑進(jìn)行的。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明細(xì)胞激活作用的 可逆性。所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)均為兩份樣品的平均值并且所進(jìn)行的幾次 實(shí)驗(yàn)都得到了相似的結(jié)果(見圖8)。肉豆蔻?；难苌镆源蠹s放 大一個(gè)數(shù)量級(jí)對(duì)較低濃度的配體起反應(yīng)，并且激活NFAT依賴性轉(zhuǎn)錄 達(dá)到可比較的水平，但應(yīng)注意到的是配體是不同的(比較圖7和8)。

體內(nèi)FK1012誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)二聚合。我們接下來要進(jìn)一步證實(shí) MZF3E受體的細(xì)胞內(nèi)聚集確定是由FK1012誘導(dǎo)的。因此使MZF3E 構(gòu)建體的流感血細(xì)胞凝集素表位-tag(flu)與不同的表位-tag (flag-M2)交換。在Jurkat?T細(xì)胞中共表達(dá)密切相關(guān)的嵌合體 MZF3Eflu有和MZF3Eflag。用FK1012A處理細(xì)胞后使用偶聯(lián)劑瓊脂糖 小球上的抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。在FK1012A(1μM)存 在下，蛋白質(zhì)嵌合體NZF3Eflag與MZF3Eflu相互作用，并與 MZF3Eflag共免疫沉淀。不存在FK1012A時(shí)則觀察不到MZF3Eflu的 共免疫沉淀。用FKBP單體構(gòu)建體MZF1Eflu和NZF1Eflag進(jìn)行的相 關(guān)實(shí)驗(yàn)并沒有出現(xiàn)信號(hào)，表明它們也在FK1012A作用下發(fā)生了二聚合。 這一結(jié)果反映了用內(nèi)源性T細(xì)胞受體和我們的人工受體MZF3E觀察到 的聚集要求。

FK1012誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)-酪氨酸磷酸化作用在抗原刺激后TCR、 CD3和ζ鏈的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域與胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶相互作用。Src家 庭的特殊成員(lck和/或fyn)使這些細(xì)胞內(nèi)區(qū)域內(nèi)活化基序(酪 氨酸活化基序，TAM)的一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化。酪氨酸激酶 ZAP-70被補(bǔ)充(通過其兩個(gè)SH2區(qū)域)到酪氨酸磷酸化的T細(xì)胞 受體上，被活化，并很可能參予磷酸化酶C的進(jìn)一步的下游激活作用。 如在分別免疫沉淀內(nèi)源性T細(xì)胞受體ζ鏈和MZF3E構(gòu)建體后經(jīng)體外 激酶檢測(cè)法所測(cè)得的，向用MZF3E穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞中加入抗 CD3?MAb或EF1012A，導(dǎo)致了對(duì)ζ鏈之激酶活性的恢復(fù)。用抗CD3 NAb或FK1012處理細(xì)胞后，使用單克隆α-磷酸酪氨酸抗體檢測(cè)酪 氨酸磷酸化作用。在刺激后的不同時(shí)間分析整個(gè)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。用抗 CD3?MAb或FK1012刺激后觀察氨酸磷酸化之蛋白質(zhì)的圖形。該圖形 由可能是ZAP-70的70KDa之主帶和120KDa、62KDa、55KDa 及42KDa的小帶組成。 實(shí)施例4(B)：用Immunophilin-Fas抗原嵌合體調(diào)節(jié)程序化的細(xì)

????????胞死亡

Fas抗原是細(xì)胞表面受體中神經(jīng)生長因子(NGF)/腫瘤壞死因 子(TNF)受體超家族的成員。Fas抗原與抗其細(xì)胞外區(qū)的交聯(lián)可激 活一個(gè)知之很少的信號(hào)發(fā)生途徑，由此導(dǎo)致程序化的細(xì)胞死亡或細(xì)胞 自然死亡。Fas抗原和其相關(guān)自然死亡信號(hào)發(fā)生途徑存在于包括可能 所有腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中。該途徑導(dǎo)致迅速而獨(dú)特的細(xì)胞死 亡(2小時(shí))，特征在于胞質(zhì)濃縮、沒有炎性反應(yīng)及核子體斷裂，而 這些特征都是壞死性細(xì)胞死亡中見不到的。

我們還發(fā)展了一個(gè)次等的、導(dǎo)致細(xì)胞自然死亡的可誘導(dǎo)的信號(hào)發(fā) 生系統(tǒng)。同MZF3E途徑一樣，該途徑是通過激活一個(gè)人工受體而產(chǎn) 生的，所說的人工受體則是構(gòu)成上表達(dá)之“應(yīng)答者”基因的產(chǎn)物。但 此新的途徑不同于第一個(gè)途徑之處在于我們的HOD試劑誘導(dǎo)內(nèi)源途徑 的產(chǎn)物而不是被轉(zhuǎn)染的、可誘導(dǎo)的(如報(bào)導(dǎo))基因的產(chǎn)物的合成。

增加對(duì)Fas途徑的控制對(duì)于生物學(xué)研究和未來的醫(yī)學(xué)進(jìn)步可能有 著重要意義。不能用處于細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制下的“死亡”應(yīng)答基 因創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然后可以用HOD處理，以化學(xué)消除成年動(dòng)物體內(nèi) 的靶細(xì)胞。以這種方法，可以評(píng)價(jià)特定腦細(xì)胞在記憶或認(rèn)識(shí)中的作用， 或免疫細(xì)胞在誘發(fā)或維持自體免疫性疾病中的作用?？梢允褂糜蒑. Blaese及其同事建立的人基因治療技術(shù)(Culver，et?al.，Science 256，5063(1992)：1550-2)將死亡應(yīng)答基因?qū)肽[瘤中，然后 經(jīng)用HOD試劑處理病人而相繼激活這些基因(類似于最近報(bào)導(dǎo)的治療 腦腫瘤的“gancyclovir”基因治療臨床試驗(yàn))。最后，我們?cè)O(shè)想未 來的基因治療中可包括合用死亡應(yīng)答基因和治療基因。這將為基因治 療提供一種“失效保護(hù)”組分。如果什么東西要跑掉(一個(gè)共同討論 的問題是導(dǎo)致腫瘤的整合誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因的丟失)，基因治療病 人就可服用將殺死所有被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的“失效保護(hù)”藥片。這一概念引 發(fā)我們?nèi)リP(guān)注對(duì)HOD試劑的正交系統(tǒng)的開發(fā)。因此，我們期望第二套 試劑沒有可能與第一組試劑有交叉反應(yīng)，其可被用于打開或關(guān)閉治療 基因的轉(zhuǎn)錄。

已構(gòu)建了由三個(gè)與Fas抗原的胞質(zhì)信號(hào)傳輸區(qū)相融合之FKBP12 區(qū)組成的嵌合cDNA(圖20)。當(dāng)在人Jurkat和小鼠D10T細(xì)胞中 表達(dá)時(shí)，可由FK1012試劑誘導(dǎo)該構(gòu)建體二聚合，并發(fā)起將導(dǎo)致FK1012 依賴性自然死亡過程的信號(hào)級(jí)聯(lián)。如根據(jù)報(bào)導(dǎo)基因活性丟失所確定的， FK1012A介導(dǎo)的被MFF3E短暫轉(zhuǎn)染之細(xì)胞死亡的LD50值為15nM (見圖20；有關(guān)檢測(cè)法的討論參見圖21)。這些數(shù)據(jù)與在穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞系中進(jìn)行的細(xì)胞死亡檢測(cè)結(jié)果相符。因?yàn)榉€(wěn)定的轉(zhuǎn)染體代表 了一個(gè)細(xì)胞的同源群體，所以它們已被用于確定死亡是由于自然死亡 而不是壞死(膜起泡、核小體斷裂)。然而，短暫轉(zhuǎn)染程序需要少得 多的工作量，并因此被用作如下描述的初始試驗(yàn)系統(tǒng)。 實(shí)施例4(C)：用親環(huán)素-Fas抗原嵌合體調(diào)節(jié)程序化的細(xì)胞死亡

我們還制備了一系列親環(huán)素C-Fas抗原構(gòu)建體并在短暫表達(dá)試 驗(yàn)中檢驗(yàn)了它們的誘導(dǎo)(CsA)2依賴性自然死亡的能力(圖21A)。 此外，已經(jīng)用被該系列中最活躍的構(gòu)建體MC3FE(M＝Src的肉豆蔻 ?；瘏^(qū)域，C＝親環(huán)素區(qū)域，F(xiàn)＝Fas的胞質(zhì)尾部，E＝flu表位 tag)轉(zhuǎn)染的人Jurkat?K細(xì)胞證明了(CsA)2依賴性自然死亡。在 1、2、3或4個(gè)連續(xù)的親環(huán)素區(qū)域之前或之后融合了Fas的胞質(zhì)尾 部。也制備了兩個(gè)缺少Fas區(qū)的對(duì)照構(gòu)建體。在這種情況下，我們觀 察到只有當(dāng)放在二聚區(qū)之后時(shí)信號(hào)發(fā)生區(qū)才有功能活性(當(dāng)放在二聚 區(qū)之前或之后時(shí)ζ鏈構(gòu)成信號(hào))。如由Western印跡分析所證實(shí)的， 8個(gè)信號(hào)發(fā)生構(gòu)建體的表達(dá)水平和其活性有著量上的不同(圖21B)。 已如此明確證明的最佳系統(tǒng)是MC3FE。MC3FE進(jìn)行的(CsA)2介導(dǎo)之 細(xì)胞死亡的LD50約為200nM。這些數(shù)據(jù)證明了親環(huán)素-環(huán)孢菌素相互 作用對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聯(lián)系的實(shí)用性，并舉例說明了不與FKBP12 -FK1012系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)的正交試劑系統(tǒng)。此外，在此情況下， 數(shù)據(jù)還顯示由Fas胞質(zhì)尾部發(fā)起信號(hào)傳送只需要二聚合而不需要聚集。

肉豆蔻酰化作用信號(hào)的N末端甘氨酸突變?yōu)楸彼釋⒆柚谷舛罐??；⒁虼硕柚鼓ざㄎ?。我們也已觀察到突變的構(gòu)建體(△MFF3E) 具有如FK1012依賴性自然死亡的誘導(dǎo)物的等同能力，此表明膜定位 對(duì)于Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡并不是必須的。 實(shí)施例5：鼠信號(hào)傳送嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建

使用圖4中所述的引物制得各個(gè)不同的片段。有關(guān)引物編號(hào)應(yīng)參 見圖4。

使用含鼠II類MHC受體(Cell，32，745)之I-E鏈的約1.2Kb cDNA片段作為信號(hào)肽的來源，用供應(yīng)商(Promega)描述的PCR方法 由P#6048和P#6049制得70bp?SacII-XhoI片段。使用含有連接 到CD3之跨膜和胞質(zhì)區(qū)(PNAS，88，8905)上的Tac(IL2受體鏈) 的質(zhì)粒制得第二個(gè)片段。使用P#6050和P#6051，以PCR方法制得CD 3之跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的320bp?XhoI-EcoRI片段。連接這兩個(gè)片段并 插入SacII-EcoRI消化的pBluescript(Stratagene)中以得到質(zhì)粒 SPZ/KS。

為了得到FK506的結(jié)合區(qū)，使用質(zhì)粒rhFKBP(由S.Schreiber 提供，Neture(1990)346，674)與P#6052和P#6053制得含有人 FKBP?12的340bp?XhoI-SalI片段。將該片段插入用XhoI和SalI 消化的pBluescript中以提供質(zhì)粒FK12/KS，并以其作為FKBP12 結(jié)合區(qū)的來源。用XhoI消化SPZ/KS，磷酸化(細(xì)胞小腸堿性磷酸酶； CIP)以防止自身退火，并與10倍摩爾過量的來自FK12/KS的含 XhoI-SalI?FKBP12)片段結(jié)合。分離在正確方向上含有單體、二 聚和三聚FKBP12的克隆?？寺?FK1/KS、1FK2/?KS和1FK3 /KS在轉(zhuǎn)錄方向上由來自鼠MHCII類基因I-E的信號(hào)肽、分別是 人FKBP12的單體、二聚體或三聚體的部分，以及CD3的跨膜和胞質(zhì) 部分。最后，使用限制性酶從pBluesript切下SacII-EcoRI片段并 連接到已用SacII和EcoRI消化的pBJ5的多接頭中，以分別得到質(zhì)粒 1FK1/pBJ5、1FK2/pBJ5和1FK3/pBJ5(見圖3和4)。 實(shí)施例6：

A.細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生嵌合體的構(gòu)建

從Pellman等人(Nature?314，374)處得到來自c-src的肉豆 蔻?；蛄胁⑦B接到CD3的互補(bǔ)序列上，以提供互補(bǔ)于跨膜區(qū)之序列 3′的引物，即P#8908。該引物具有與肉豆蔻?；蛄械?′末端相 鄰的SacII位點(diǎn)，以及與其3′末端相鄰的XhoI序列。另一引物#8462 具有與CD3之3′末端序列互補(bǔ)的SalI識(shí)別位點(diǎn)3′，終止密碼子 及EcoRI識(shí)別位點(diǎn)。使用PCR制得由肉豆蔻?；蛄泻驮?′-3′ 方向融合的CD3序列組成的450bp?SacII-EcoRI片段。將該片段連 接到SacII/EcoRI消化的pBJ5(XhoI)(SalI)中并克隆之，得到 質(zhì)粒MZ/pBJ5。最后，用SalI消化MZ/pBJ5，磷酸化，并與10 倍摩爾過量的來自FK12/KS的含XhoI-SalI?FKBP12片段合并并 連接之?？寺『?，分離含有在5′-3′方向上由肉豆蔻酰序列、 CD3和FKBP12多聚體組成之所需構(gòu)建體的質(zhì)粒，并驗(yàn)證其具有正確 結(jié)構(gòu)(參見圖2和4)。

B.細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳送嵌合體表達(dá)盒的構(gòu)建

用限制性酶XhoI和SalI消化構(gòu)建體MZ/pBJ5(MZE/pBJ5)， 除去TCRζ片段并將所得載體與10倍過量的FKBP12的單體、二聚 體、三聚體或更高級(jí)聚合體連接，以制得MF1E、MF2E、MF3E或MFnE /pBJ5。然后可將經(jīng)過消化以含有相容性側(cè)翼限制性位點(diǎn)(即XhoI 和SalI)的活性區(qū)克隆到MEnE/pBJ5的唯一XhoI或SalI位點(diǎn)中。 實(shí)施例7：核嵌合體的構(gòu)建

A.CAL4?DNA結(jié)合區(qū)-FKBP區(qū)域-表位tag。使用含有Kozak序 列之SalI位點(diǎn)上游和翻譯起始位點(diǎn)的5′引物(#37)，和含有 SalI位點(diǎn)的3′引物(#38)，以PCR方法擴(kuò)增GAL4?DNA結(jié)合區(qū) (氨基酸1-147)。分離PCR產(chǎn)物，用SacII和SalI消化，在SacII 和SalI位點(diǎn)處連接到pBluescript?IIKS(+)中，得到構(gòu)建體pBS- GAL4?。經(jīng)序列分析證實(shí)該構(gòu)建體。分離pBS-GAL4中的SacII?SalI 片段并在SacII和XhoI位點(diǎn)處連接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構(gòu) 建體(含有肉豆蔻?；蛄校妼?shí)施例6)中，得到構(gòu)建體GF1E、 GF2E和GF3E。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端：

????????SacII??????????----Gal4(1-147)--->>

???????????????????????M??K??L??L??S??S??I 5?′??????CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG

????????????????Kozak PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端：

?????<<----Gal4(1-147----)|?

R??Q??L??T??V??S 5′?GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG 3′?CTGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC

?????????????SalI

B.HNF1二聚合/DNA結(jié)合區(qū)-FKBP區(qū)域-tag。

使用含有Kozak序列之SacII位點(diǎn)上游和翻譯起始位點(diǎn)的5′引 物(#39)，和含有SalI位點(diǎn)的3′引物(#40)，以PCR方法 擴(kuò)增HNFla二聚/DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-282)。分離PCR產(chǎn)物， 用SacII和SalI消化并在SacII和SalI位點(diǎn)處連接到pBluescript?II KS(+)中，產(chǎn)生構(gòu)建體pBS-HNF。經(jīng)序列分析證實(shí)該構(gòu)建體。分離 pBS-HNF中的SacII/SalI片段并在SacII和XhoI位點(diǎn)處連接到 IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構(gòu)建體中，產(chǎn)生構(gòu)建體HF1E、HF2E和 HF3F。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端：

??SacII???????????|--HNF1(1-281)-->>

?????????????????????M??V??S??K??L??S

?5′?CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

???????????Kczak PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端：

????<<----HNF1(1-282)----|

?????A??F??R??H??K??L

?5′?CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG

?3′?GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC

????????????????SalI

C.FKBP區(qū)-VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)-表位tag。以下述三個(gè)步驟制得 這些構(gòu)建體：(i)由IFK3/pBJ5產(chǎn)生其中的肉豆蔻?；蛄斜恢?接接在XhoI位點(diǎn)上游之起始位點(diǎn)所取代的構(gòu)建體，得到構(gòu)建體SF3E； ii)將核定位序列插入XhoI位點(diǎn)，產(chǎn)生構(gòu)建體NF3E；(iii)將 VP16激活區(qū)克隆到NF3E的SalI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF3EVIE。

(i)將編碼Kozak序列和測(cè)接有SacII和XhoI位點(diǎn)之起始位點(diǎn)的 互補(bǔ)寡核苷酸(#45和#46)一起退火，經(jīng)磷酸化處理后連接到 MF3F的SacII和XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體SF3E。

種屬起始位點(diǎn)的插入

??????????????Kozak

??????????????????M??L??E

??5′??????GGCCACCATGC

??3′????CGCCGGTGGTACGAGCT

?????????SacII????????XhoI

?????????突出部分?????突出部分

(ii)將編碼側(cè)接有5′SalI位點(diǎn)和3′XhoI位點(diǎn)之SV40T 抗原核定位序列的互補(bǔ)寡核苷酸(#47和#48)一起退火，經(jīng)磷酸 化處理后連接到SF1E的XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF1E。經(jīng)DNA序列 分析證實(shí)該構(gòu)建體。分離一個(gè)含有突變或缺陷形式之核定位序列的， 其中128位蘇氨酸取代賴氨酸的構(gòu)建體。該構(gòu)建體被定名為NF1E-M。 從pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將 該片段連接到用XhoI切成線形的NF1E中，得到FKBP12區(qū)的多聚體。 如此產(chǎn)生了構(gòu)建體NF2E和NF3E。

將NLS插入種屬起始位點(diǎn)：

????????????????????T(ACN)

?????????????126???????????????132

???????L??D??P??K??K??K??R??K??V??L??E

??5′??TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC

??3?′?????GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT

???????SalI??????????????????????xhoI

因128位上的蘇氨酸而產(chǎn)生有缺陷的NLS。

(iii)使用含有SalI位點(diǎn)的5′引物(#43)和含有XhoI位 點(diǎn)的3′引物(#44)以PCR法擴(kuò)增VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(氨基酸413 -490)。分離PCR產(chǎn)物，用SalI和XhoI消化并在XhoI和SalI位 點(diǎn)上連接到MF3E中，得到構(gòu)建體MV1E。經(jīng)DNA序列測(cè)定證實(shí)該構(gòu)建 體。作為XhoI/SalI片段從MV1E中分離單一VP16序列，并將該片 段連接到用XhoI切成線形的MV1E中而產(chǎn)生多聚的VP16區(qū)。以同樣 方法產(chǎn)生構(gòu)建體MV2E、MV3E和MV4E。從MV1E或MV2E中分離作為 XhoI/SalI片段的編碼一種或多個(gè)多”16區(qū)域的DNA片段并連接 到用SalI切成線形的NF1E中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF1V1E和NF1V3E。從 pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將此 片段連接到用XhoI切成線性的NF1V1E中，得到FKBP12區(qū)的多聚體。 從而導(dǎo)致構(gòu)建體NF2V1E和NF3V1E的產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端：

????????????SalI????--7P16(413-490)--->>

???????????????????A??P??P??T??D??V

?5′???CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端：

???<<--VP16(413-490)----|

???????C??E??Y??G??E

?5′??GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG

?3′??CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC

??????????????????Xhol

寡核苷酸： #3738mer/0.2um/OFF?5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTT CTATCG #3828mer/0.2um/OFF?5′CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC #39 34mer/0.2um/OFF?5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC #4028mer/0.2um/OFF?5′CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG #4329mer/0.2um/OFF?5′CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC #4426mer/0.2um/OFF?5′CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC #4526mer/0.2um/OFF?5′GGCCACCATGC #4618mer/0.2um/OFF?5′TCGAGCATGGTGGCCGC #4727mer/0.2um/OFF?5′TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC #4827mer/0.2um/OFF?5′TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG 實(shí)施例8：轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的證明

使用所指出的構(gòu)建體(各5μg構(gòu)建體)以電穿孔法(960μF， 250v)轉(zhuǎn)染Jurkat?TAg細(xì)胞。24小時(shí)后，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮 培養(yǎng)基中并分成若干等份。取每份轉(zhuǎn)染物的一半與二聚FK506衍生物 (實(shí)施例14)，以1μM的終濃度保溫。12小時(shí)后，洗細(xì)胞并經(jīng) 反復(fù)凍融制備細(xì)胞提取物。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Molecular?Cloning：A Laboratory?Manual，Sambrook?et?al.eds.(1989)CSH?Laboratory， pp.16-59ff.)檢測(cè)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性。所得數(shù)據(jù) (圖22)證明37℃保溫18小時(shí)后在70μl提取物(總提取物 體積為120μl)存在CAT活性。該項(xiàng)檢測(cè)中所使用的樣品是：

1.????G5E4TCAT(GAL4-CAT報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒)

2.????G5E4TCAT，GAL4-VP16

3.????G5E4TCAT，NF3V1E

4.????G5E4TCAT，GF2E

5.????G5E4TCAT，GF2E，NF3V1E

6.????G5E4TCAT，GF3E，NF3V1E 化學(xué)合成實(shí)施例

如本文中所指出的，目前作為低聚劑的特別適用的化合物具有下 列結(jié)構(gòu)：

?????????????接頭-[rbm1，rbm2，…rbmn]

其中“接頭”是如本文所述的與“n”(從2到5的正整數(shù))， 通常是2或3)可以相同或不同的受體結(jié)合部分(“rbm”)共價(jià)連 接的接頭部分。如本文其他段落中所指出的，受體結(jié)合部分是已知受 體的配體(或其類似物)，如在V(C)部中所列舉的配體，并包括能 夠與FKBP結(jié)合的FK506、FK520、rapamycin和其類似物；以及能夠 與各自的受體結(jié)合的環(huán)孢菌素、四環(huán)素、其他抗生素和大環(huán)內(nèi)酯及類 固醇。

接頭是能夠共價(jià)結(jié)合(“-”)到兩個(gè)或多個(gè)受體結(jié)合部分上的 雙或多功能分子。VI(A)部分和各實(shí)施例中公開了一些舉例的接頭 部分，并且其中包括C2-C20亞烷基、C4-C18氮雜亞烷基、 C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基、C6-C18亞芳基、C8-C 24芳基二亞烷基和C8-C36雙-羧酰氨基亞烷基。

可以使用市場上可購得的材料和本領(lǐng)域已知的方法制備這些化合 物?？砂聪挛乃龇椒ㄖ频眠@些化合物的工程化受體。特別有用的化 合物是以小于10-6，較好小于約10-7并且甚至更好小于10-8 的Kd值與受體結(jié)合的化合物。

令人感興趣的低聚劑中的一個(gè)亞類是其中一個(gè)或多受體結(jié)合部為 FK506、FK-506型化合物或其衍生物的低聚劑，其中受體結(jié)合部分 通過C21(使用FK506編號(hào))上的烯丙基基團(tuán)(如圖23A中所示的 化合物5或13)，或通過環(huán)己基環(huán)(C29-C34)，如通過C32 羥基(如圖23B中所示的化合物8、16、17)共價(jià)連接到接頭 部分上。可按本文中(包括下述實(shí)施例中)所述的方法制備該類化合 物。

另一亞類有用的低聚試劑是其中至少一個(gè)受體結(jié)合部分是FK520 或其衍生物的低聚試劑，其中FK520或其衍生物的分子共價(jià)連接到如 圖10所示FK1040A或FK1040B中的接頭部分上。可按圖10所示的 方案1、圖11A和11B所示的方案2或圖12與圖13所示的方 案3制備這類化合物。

再一個(gè)有用低聚試劑的亞類是其中至少一個(gè)受體結(jié)合部分為環(huán)孢 菌素A或其衍生物的低聚試劑。

應(yīng)理解到的是，本發(fā)明的這些或其他低聚試劑可以是同低聚試劑 (其中的rbm都是相同的)或異低聚試劑(其中的rbm是不同的)。 可按本文給出的相似方法，例如圖3所示的方案3及本文中所討論過 的方法割備異低聚試劑。

下列合成實(shí)施例只是舉例說明相應(yīng)制備方法。

A.通用方法。所有反應(yīng)均在正氮或氬氣壓力下在烘箱干燥的玻 璃器皿中進(jìn)行。對(duì)空氣和濕氣敏感的化合物通過注射器或經(jīng)過橡膠隔 片套管導(dǎo)入。

B.物理數(shù)據(jù)。在Bruker?AM-500(500MHz)和AM-400(400 MHz)分光儀上記錄質(zhì)子磁共振譜(1H?NMR)。使用溶劑共振作為 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(氯仿，7.27ppm)報(bào)告來自四甲基硅烷的化學(xué)位移(ppm)。 數(shù)據(jù)報(bào)告如下：化學(xué)位移，多重性(s＝單線，d＝雙重線；t＝三 重線，q＝四重線，br＝加寬峰，m＝多重譜線)，偶聯(lián)常數(shù)(Hz)， 整合。得到低和高分辨率質(zhì)譜。

C.層析。使用Merck硅膠60F玻璃板(0.25mm)經(jīng)薄層層析 (TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。用長波紫外光光照，暴露于碘蒸氣，和/或浸沒 有鉬酸鈰銨水溶液中然后加熱以顯現(xiàn)各組分。層析的溶劑為HPLC級(jí)。 在E.Merck硅凝膠60(230-400目)上使用所指出的溶劑系統(tǒng)的 加壓流(快速層析)進(jìn)行液相層析。

D.溶劑和試劑。所有試劑和溶劑都是分析級(jí)的，并除了下述特 殊要求者外均直接使用。從二苯甲酮羰游基鈉中蒸餾四氫呋喃 (THF)、苯、甲苯和二乙醚。從氫化鈣中蒸餾三乙胺和乙腈。從五 氧化二磷中蒸餾二氯甲烷。在減壓下從氫化鈣中重蒸餾二甲基甲酰胺 (DMF)并過4分子篩儲(chǔ)存。 FK506衍生物的制備 實(shí)施例9：FK506-TBS2(1至2)的硼氫化作用/氧化作用

按照Evans(Evans，et?al.，JACS(1992)114，6679；引文同 上(1992)6679-6685)所述方法完成硼氫化反應(yīng)(編號(hào)參見 Havding，et?al.，Nature(1989)341，758)。10ml燒瓶內(nèi)裝入 24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧代]-FK506(33.8mg， 0.033mmol)和[Rh(nbd)(diphos-4)]BF4(3.1mg，0.004mmol， 13mol％)。將此有機(jī)混合物溶解在甲苯(2.0ml)中，減壓下經(jīng)4 小時(shí)除去溶劑。用氮?dú)庑⌒那逑礋?，將桔黃色油溶于THF(3.0ml， 10mM終濃度)并用冰水浴冷卻到0℃。通過注射器加入兒茶酚 硼烷(98μl，0.098mmol，在THF中的1.0M溶液，3.0當(dāng)量)并將 所得溶液于0℃攪拌45分鐘。反應(yīng)物于0℃與0.2mlTHF/EtOH(1∶1)，然后是0.2ml?pH7.0緩沖液(Fisher；0.05M磷酸鹽)， 再后用0.2ml?30％H2O驟冷。將溶液于室溫下攪拌至少12小時(shí)。 減壓下除去溶劑，將剩余的油溶于甲苯(10ml)中并用飽和碳酸氫 鈉水溶液(10ml)洗，分離各相并用甲苯(2×10ml)反萃取水 相。合并有機(jī)相并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗-次。用 MgSO4干燥甲苯相，濃縮，并經(jīng)快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯) 后得到澄清的無色油狀初級(jí)醇(12.8mg，0.012mmol，37％)。

制備混合的碳酸酯(2至3)。用Ghosh的方法制備混合的碳酸 酯(Ghosh，et?al.，Tetrahedron?Lett.(1992)33，2781-2784)。 在10ml燒瓶內(nèi)裝入初級(jí)醇(29.2mg，0.0278mmol)和苯(4ml)。 在減壓下經(jīng)60分鐘除去溶劑。將油溶解在乙腈(2.0ml，14mM終 濃度)中并于20℃攪拌下加入三乙胺(77μl，0.56mmol)。以一 份加入N，N′-琥珀酰亞氨基碳酸酯(36mg，0.14mmol)并于20℃ 將溶液攪拌46小時(shí)。用二氯甲烷稀釋反應(yīng)混合物并用飽和碳酸氫鈉 水溶液(10ml)洗。分離各相并用二氯乙烷(2×10ml)反萃取 水層。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)之，濃縮并進(jìn)行快速層析(3∶ 1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分離得到澄清無色的油狀所 需的混合碳酸酯(16.8mg，0.014mmol，51％)。

FK506的二聚合(3至4。在一干的1ml錐形玻璃容器 (Kontes?Scientific?Glassware)內(nèi)裝入混合的碳酸酯(7.3mg， 0.0061mmol)和乙腈(250μl，25mM終濃度)。加入三乙胺(10ml， 0.075mmol)，再加入對(duì)位亞二甲苯二胺(8.3μl，0.0027mmol，加 在DMF中的0.32M鈉)。反應(yīng)物于20℃攪拌22小時(shí)并加入二氯甲 烷(10ml)稀釋使之驟冷。用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗該 溶液。分離各相并用二氯乙烷(2×10ml)反萃取水層。合并有機(jī) 相并干燥(MgSO4)之、濃縮并進(jìn)行快速層析(3∶1至2∶1至1 ∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到所需的被保護(hù)的二聚體，其為澄清的無 色油狀物(4.3mg，1.9μmol，70％)。

FK506二聚體的去保護(hù)(4至5)。將被保護(hù)二聚體(3.3mg， 1.4μmol)放在配有旋轉(zhuǎn)葉輪的聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml， 3mM終濃度)并在攪拌下向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液； Fisher)。將此溶液室溫?cái)嚢?8小時(shí)。然后在15ml試管中在二 氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配去保護(hù)的FK506衍生物。旋轉(zhuǎn) 試管去充分混合各相，分離后用吸管除去有機(jī)相。用二氯甲烷(4× 2ml)反萃取水相，并干燥合并的有機(jī)相，濃縮并進(jìn)行快速層析(1 ∶1∶1己烷∶THF∶乙醚至1∶1THF∶乙醚)得到所需的澄清的無 色油狀二聚體產(chǎn)物(1.7mg，0.93μmol，65％)。

依照上述步驟，可以使用其他單胺和二胺，如芐胺(14)、辛 二胺、癸二胺等。 實(shí)施例10：用L-Selectride還原FK506(FK506至6)

Danishefsky及其同事已證明用L-Selectride處理FK506可得 到有硼酸酯接合C24和C22羥基基團(tuán)的22-二氫-FK506(Colman and?Danishefsky，Heterocycles(1989)28，157-161；Fisher， et?al.，J.Org.Chem.(1991)56，2900-2907)。

混合碳酸酯的制備(6至7)。10ml燒瓶裝入22-二氫- FK506-碳酸仲丁酯(125.3mg，0.144mmol)和乙腈(3.0ml，50mM 終濃度)，并在室溫?cái)嚢柘录尤肴野?200μl，1.44mmol，10當(dāng) 量)至澄清溶液。一次加入N，N′-琥珀酰亞氨基碳酸酯(184.0mg， 0.719mmol)，并將此澄清溶液在室溫?cái)嚢?4小時(shí)。用乙酸乙酯 (20ml)稀釋溶液，再用飽和碳酸氫鈉溶液(10ml)洗滌并分離 各相。然后用乙酸乙酯(2×0ml)反萃取水相，合并有機(jī)相，干燥 (MgSO4)，并對(duì)所得到油進(jìn)行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶乙 酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需混合碳酸酯(89.0mg， 0.088mmol，61％)。

FK506混合碳酸酯的二聚合(7至8)。在一干燥的錐形玻璃瓶 (Kowtes?Scientific?Glassware)中裝入混合的碳酸酯(15.0mg， 0.0148mmol)和二氯甲烷(500μl，30mM終濃度)。室溫?cái)嚢枞?液同時(shí)加入三乙胺(9μl，0.067mmol，10當(dāng)量)再加入二甲苯二 胺(0.8mg，0.0059mmol)。反應(yīng)在20℃下攪拌進(jìn)行16小時(shí)并經(jīng) 用二氯甲烷(5ml)稀釋進(jìn)行驟冷。用飽和碳酸氫鈉溶液(5ml)洗 該溶液。分離各相并用二氯甲烷(2×5ml)反萃取水相。合并有機(jī) 相并干燥(MgSO4)，濃縮并進(jìn)行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶ 乙酸乙酯)，得到作為澄清無色油的所需二聚體(7.4mg，3.8μmol， 65％)。

按照上述步驟，可以用其他單胺、二胺或三胺代替亞二甲苯二胺， 例如可使用芐胺(15)、辛二胺、癸二胺(16)、雙-對(duì)位二芐 胺、N-甲基二乙胺、三-氨基乙胺(17)、三-氨基丙胺、l， 3，5-三氨基甲基環(huán)己烷等。 實(shí)施例11：FK506的氧化裂解和還原(1至9)

按照Kelly(VanRheenen，et?al.，Tetrahedron?Lett.(1976) 17，1973-1976)的方法進(jìn)行鋨酸化。按照Danishefsky(Zell，et al.，J.Org.Chem.(1986)51，5032-5036)的方法裂解。按照 Krisnnamurthy(J.Org.Chem.，(1981)46，4628-4691)的方法 進(jìn)行醛還原。10ml燒瓶內(nèi)裝入24，32-雙[(叔丁基二甲硅烷基) 氧代]-FK506(84.4mg，0.082mmol)、4-甲基嗎啡啉N-氧化物 (48mg，0.41mmol，5當(dāng)量)和THF(2.0ml，41mM終濃度)。 通過注射器加入四氧化鋨(45μl，0.008mmol，0.1當(dāng)量)。將澄 清的無色溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。用50％甲醇水溶液(1.0ml)稀釋 反應(yīng)混合物并一次加過碘酸鈉(175mg，0.82mmol，10當(dāng)量)。將 所得混濁混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，用乙醚(10ml)稀釋，并用飽 和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗滌。分離各相并用乙醚(2×5ml)反 萃取水層。干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層并用固體硫酸鈉(50mg) 處理。然后過濾有機(jī)層，濃縮并對(duì)油狀物進(jìn)行快速層析(3∶1至2 ∶1己烷∶乙酸乙酯)處理，得到澄清的無色油，即為不穩(wěn)定的醛中 間體(53.6mg)。將此醛直接溶解在THF(4.0ml)中并在氮環(huán)境下冷 卻到-78℃，并用三[(3-乙基-3-戊基)氧代]氫化鋁鋰 (0.60ml，0.082mmol，0.1?4M鈉在THF中，1.0當(dāng)量)處理之。將 澄清的溶液于-78℃攪拌10分鐘，再用乙醚(4ml)稀釋并加入飽 和氯化銨水溶液(0.3ml)使之驟冷。將混合物加溫至室溫并加入固 體硫酸鈉以干燥之。然后過濾混合物并濃縮。對(duì)所得到的油進(jìn)行快速 層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需要的 醇(0.038mmol，47％)。

混合碳酸酯的制備(9至10)。按Ghosh等人(Tetrahedron Lett.(1992)33，2781-2784)所述方法制備混合的碳酸酯。10ml 燒瓶內(nèi)裝入伯醇(38.2mg，0.0369mmol)和乙腈(2.0ml，10mM終 濃度)，并在室溫?cái)嚢柘录尤?，6-二甲基吡啶(43μl，0.37 mmol，10當(dāng)量)。以一份量加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯 (48mg，0.18mmol)并將所得溶液室溫?cái)嚢?4小時(shí)。用乙醚 (10ml)稀釋反應(yīng)混合物并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。 分離各相并用乙醚(2×10ml)反應(yīng)萃取水層。合并有機(jī)相并干燥 (MgSO4)、濃縮之，對(duì)其進(jìn)行快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)。 分離得到作為澄清的無色油的混合碳酸酯(32.6mg，0.028mmol， 75％)。

氨基甲酸芐酯的制備(10至11)。在一干燥的、1ml錐形 瓶(Kontes?Scientific?Glassware)內(nèi)裝入混合的碳酸酯10(8.7mg， 0.0074mmol)和乙腈(500ml，15mM終濃度)。于室溫下攪拌的同 時(shí)加入三乙胺(10μl，0.074mmol，10當(dāng)量)，然后再加入芐胺 (1.6μl，0.015mmol，2當(dāng)量)。室溫下將反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)。 用干燥氮?dú)饬鞒ト軇┎⒅苯訉?duì)所得到的油進(jìn)行快速層析，(3∶1 至2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到澄清的無色油狀的所需被保護(hù)的單 體(6.2mg，5.3μmol，72％)。

將被保護(hù)的單體(0.2mg，5.3μmol)放在配有旋轉(zhuǎn)葉輪的1.5ml 聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，11mM終濃度)并在室溫?cái)嚢柘录?入HF(55μl，48％水溶液；Fisher；終濃度3.0N)。室溫下將 溶液攪拌18小時(shí)。然后使去保護(hù)的FK506衍生物在15ml試管中 分配于二氯乙烷和飽和碳酸鈉水溶液之間。旋轉(zhuǎn)試管徹底混合各相， 分離后用吸管吸去有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相并干 燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，然后濃縮并進(jìn)行快速層析(己烷∶乙酸 乙酯1∶1至0∶1)，得到所需的澄清的無色油狀去保護(hù)的氨基甲 酸芐酯(3.9mg，41μmol，78％)。

用二胺如亞二甲苯基二胺(12)、六亞甲基二胺、亞辛基二胺、 癸二胺(13)或其他二胺代替芐胺，制備本發(fā)明的二聚化合物。 實(shí)施例12：混合的FK506(12)碳酸酯的制備(12)。在10ml燒 瓶中裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧代]-FK506 (339.5mg，0.329mmol)、4-甲基嗎啉N-氧化物(193mg，1.64 mmol，5當(dāng)量)、水(0.20ml)和THF(8.0ml，終濃度41mM)。通 過注射器加入四氧化鋨(0.183ml，0.033mmol，0.1當(dāng)量，在水中制 成的0.18M溶液)。室溫下將澄清的無色溶液攪拌4.5小時(shí)。用50％ 含水甲醇(4.0ml)稀釋該溶液并一次加入高碘酸鈉(700mg，3.29 mmol，10當(dāng)量)。室溫下將混濁的混合物攪拌25分鐘，用乙醚 (20ml)稀釋，并用飽和碳酸氫鈉(10ml)水溶液洗。分離各相 并用乙醚(2×10ml)反萃取水層。用MgSO4和固體硫酸鈉(50mg) 干燥合并的有機(jī)相。然后過濾和濃縮有機(jī)相，將所得到的醛直接溶解 在THF(8.0ml)中并在氮?dú)猸h(huán)境下冷卻到-78℃，再用三[(3-乙 基-3-3-戊基)氧代]氫化鋁鋰(2.35ml，0.329mmol，在HF中 的0.14M溶液，1.0當(dāng)量)處理。-78℃下將澄清的溶液攪拌60分 鐘(以TLC法密切監(jiān)測(cè))后經(jīng)用乙醚(5ml)稀釋進(jìn)行驟冷至-78℃ 并加入飽和氯化銨水溶液(0.3ml)。使混合物升混至室溫并加入硫 酸鈉以干燥該溶液。將混合物攪拌20分鐘，過濾、濃縮，并將所得 到的油直接溶解于乙腈(10ml)中。向所得到的在CH3CN中的治 醇溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.380ml，3.3mmol，10當(dāng)量) 和N，N′-二琥珀酰胺基碳酸酯(420mg，1.65mmol，5當(dāng)量)。室 溫下將異質(zhì)混合物攪拌19小時(shí)，同時(shí)用乙醚(30ml)稀釋并用飽 和碳酸氫鈉水溶液(20ml)洗。用乙醚(2×10ml)反萃取水相。 合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)、濃縮，并進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸 乙酯3∶1至2∶1至1∶1)。分離得到呈澄清、無色油狀的所需 的混合的碳酸酯12(217mg，0.184mmol，4步驟總產(chǎn)率56％)。 實(shí)施例13：24，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)

氧代]FK1012-A的制備。(對(duì)位亞二甲苯基二胺橋 接)干燥的、1ml錐形玻璃瓶內(nèi)裝入混合的碳酸酯(23.9mg， 0.0203mmol)和乙腈(500μl.41mM終濃度)。加入三乙胺后再 加入對(duì)位亞二甲苯基二胺(46μl，0.0101mmol，在DMF中的0.22M 溶液)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，用干燥氮?dú)獬ト軇?并對(duì)所得的油直接進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯，3∶1至2∶1 至1∶1)，分離后得到呈澄清的、無色油狀的所需被保護(hù)的二聚體 (11.9mg，5.3μmol，52％)。 實(shí)施例14：FK1012-A(對(duì)位亞二甲苯基二胺橋接)(13)的制備

將被保護(hù)的二聚體(11.0mg，4.9μmol)放在1.5ml配有旋轉(zhuǎn)葉 輪的聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，10mM終濃度)，于20℃攪 拌下加入HF(50μl，48％水溶液；Fisher；終濃度3.0N)。于 室溫下將溶液攪拌16小時(shí)。然后在15ml試管內(nèi)使去保護(hù)的FK506 衍生物分配在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。旋轉(zhuǎn)試管使各相 充分混合，并在分離后用吸管吸除有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml) 反萃取水相，干燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，濃縮并對(duì)其進(jìn)行快速層 析(己烷/THF/乙醚1∶1∶1至THF/乙醚1∶1)制得作為澄清 的無色油的FK1012-A(5.5mg，3.0μmol，63％)。 實(shí)施例15：24，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)

??????氧代-FK1012-B(癸二胺橋接)

在一干燥的1ml錐形玻璃瓶中裝入混合的碳酸酯(53.3mg， 0.0453mmol)和乙腈(2.0ml，11mM終濃度)。加入三乙胺(16μl， 0.11mmol，5當(dāng)量)，再加入癸二胺(61μl，0.0226mmol，在DMF 中的0.37M溶液)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌12小時(shí)，用氮?dú)饬?除去溶劑，并對(duì)所得到的油直接進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯3∶ 1至2∶1至1∶1)，分離后得到所需的作為澄清的無色油的被保 護(hù)的二聚體(18.0mg，7.8μmol，35％)。 實(shí)施例16：FK1012-B(癸二胺-1，10橋接)。

將被保護(hù)的二聚體(18.0mg，7.8μmol)放在配有攪拌flea的 1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，16mM終濃度)，并在室 溫下攪拌同時(shí)向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher， 終濃度3.6N)。將溶液于23℃攪拌17小時(shí)。然后使產(chǎn)物FK1012 -B分配于15ml試管中的二氯乙烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。 用吸管吸掉有機(jī)相。用二氯乙烷(4×2ml)反萃取水相，干燥 (MgSO4)合并的有機(jī)相，濃縮并進(jìn)行快速層析(100％乙酸乙酯至 乙酸乙酯/甲烷20∶1)，得到作為澄清的無色油的FK1012-B (5.3mg，2.9μmol，37％)。 實(shí)施例17：24，24′，32，32-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧

??????代]-FK1012-C(his-對(duì)位氨基甲基苯甲?；锒?/p>

??????胺橋接)。

在一干燥的25ml滴形燒瓶內(nèi)裝入二胺連接物(15.1mg，0.0344 mmol)和1.0ml?DMF。在一分立的燒瓶中，將混合的碳酸酯和三乙胺 (0.100ml，0.700mmol，20當(dāng)量)溶解于2.0ml二氯乙烷，然后緩 慢(4×.050ml)加到攪拌的his-對(duì)位氨基甲基苯甲?；锒? 1，10的溶液中。用二氯甲烷(2×0.5ml)洗含有混合的碳酸酯 12的燒瓶內(nèi)，以確?；旌现妓狨?2的完全轉(zhuǎn)移。于23℃將反 應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)，用干燥氮?dú)饬鞒ト軇?duì)余留的油直接 進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯1∶1至1∶2)，以得到作為澄清 的無色油的，所需被保護(hù)的二聚體(29.6mg，11.5μmol，34％)。 實(shí)施例18：FK1012-C(15)的制備

將被保護(hù)的二聚體(29.6mg，11.5μmol)(17)放在配有攪拌 flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，23mM終濃度)， 并于室溫下攪拌溶液同時(shí)加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher， 3.6N終濃度)。于室溫下攪拌溶液。然后在15ml試管中使所需的 對(duì)稱二聚體分配于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。大幅度旋轉(zhuǎn) 試管以混合各相，分離后用吸管吸去有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml) 反萃取水相，并干燥(MgSO4)合并的水相，濃縮并進(jìn)行快速層析 (100％乙酸乙酯至15∶1乙酸乙酯/甲醇)，得到為澄清的無色 油的FK1012-C(11.5mg，5.5μmol，47％)。 CsA衍生物的制備 實(shí)施例19：MeBmt(OAc)--OH1CsA(2)。

將MeBmt(OAc)--OAc1-CsA(1)(161mg，124mmol)(參見 Eberle?and?Nuninger，J.org.Chem.(1992)57，2689)溶解在甲 醇(10ml)中。將KOH(196mg)溶予水(8ml)。將297ml?KOH溶 液(.130mmol，1.05當(dāng)量)加到(1)在甲醇的溶液內(nèi)。在惰性氣 體環(huán)境和室溫下將此新的溶液攪拌4小時(shí)，同時(shí)用乙酸(2ml)使反 應(yīng)驟冷。使用5cm×25cm，12μ，100A，C18柱以反相HPLC 法純化反應(yīng)混合物，其中于70℃用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的 70％乙腈/水洗脫得到112mg(72％)所需的單乙酸酯(2)。

MeBmt(OAc)--OCOIm1CsA(3)。MeBmt(OAc)--OH1CsA (2)(57mg，45.5μmol)和羰基二咪唑(15mg，2當(dāng)量， 91μmol)移入50ml園底燒瓶中，并溶解在無水THF(6ml)。 加入二異丙基乙胺(32μl，4當(dāng)量，182μmol)后于室溫下在旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑。使用乙酸乙酯作為洗脫劑，在硅凝膠上經(jīng)快速 層析純化殘留物，得到45mg(73％)所需的氨基甲酸酯(3)。

三-(2-氨基乙基)胺CsA三聚體三乙酸酯(6)。將MeBmt (OAc)--OCOIm1-CsA(3)(7.5mg，5.54μmol，3.1當(dāng)量)溶 解于THF(100μl)。加入二異丙基乙胺(62μl，5當(dāng)量，8.93 μmol含有100μl胺在4ml?THF中的溶液)，然后再加入三(2- 氨乙基)胺(26μl，1.79μmol，1當(dāng)量含有100μg三胺在10]ml ?THF中的溶液)。在N2環(huán)境下將該溶液攪拌5天。蒸發(fā)反應(yīng)混合物， 然后使用在氯仿中的0-5％甲醇，在硅凝膠上經(jīng)快速層析純化之， 得到4.1mg所需的產(chǎn)物(6)。 實(shí)施例20：癸二胺CsA二聚體(8)。使固體鈉金屬(200mg，過 量)與無水甲醇(10ml)于0℃下反應(yīng)。將癸二胺二聚體二乙酸酯 (5)(4.0mg)溶解在MeOH(5ml)中。向(5)的溶液中加入 2.5ml?NaOMe溶液。于惰性環(huán)境下室溫?cái)嚢?.5小時(shí)后，用乙酸 (2ml)快速冷卻溶液，并使用5mm×25mm，12μ，100A， C18柱以及反相HPLC法純化產(chǎn)物，層析中用含有0.1(v/v)三氟 乙酸的70-95％乙腈/H2O經(jīng)20分鐘洗脫得到2.5mg(60％) 所需的二醇。

用0.45當(dāng)量的1，10-二癸胺代替三(2-氨乙基)胺制備 癸二胺CsA二聚體二乙酸酯(5)。 實(shí)施例21：對(duì)位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。

用0.45當(dāng)量的對(duì)位亞二甲苯基二胺代替三(2-氨乙基)胺制 備對(duì)位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。

按照文獻(xiàn)中描述的下列方法，經(jīng)在1(MeBmt1)位點(diǎn)以外的位 點(diǎn)上連接而制備親環(huán)素的其他衍生物。

使生產(chǎn)菌攝入D-氨基類以物制得在特定位點(diǎn)上摻入的8位D- 二聚體類似物[參見Patchett，et?al.，J.Antibiotics(1992) 45，943(β-MeSO)D-Ala8-CsA)；Traber，et?al.，文獻(xiàn)同上 (1989)42，591]。經(jīng)在Sac3的特定碳上使CsA多聚-鋰氧化/烷 基化，以制備3位類似物，參見Wenger，Transplant?Proceeding (1986)18，213，Supp.5(涉及親環(huán)素橋接和活性特征，特別是 D-MePhe3-CsA)；Seebach，美國專利No.4,703,033,1987 年10月27日公布(涉及衍生物的制備)。

按照上述方法，可使CsA的其他天然存在的變異體多聚化，以代 替多孢菌素用于本發(fā)明。 實(shí)施例22：(A)基于結(jié)構(gòu)所作的設(shè)計(jì)和FK1012“隆起塊”化合物

??????及其有補(bǔ)償性突變的FKBP12的合成

可以是或者已通過合成得到的FK506的C9和C10位上的取代 基，與不同組的FKBP12側(cè)鏈殘基相抵觸。因此，這些配體的一類突 變受體應(yīng)包含不同的修飾，其中一個(gè)造成C10取代基的補(bǔ)償性空穴， 一個(gè)則造成C9取代基的補(bǔ)償性空穴。對(duì)碳10進(jìn)行選擇性修飾使之 具有從碳上突出的N-乙?；騈-甲酰基基團(tuán)(與FK506中的羥基 基團(tuán)相對(duì))。這些衍生物的橋接性質(zhì)清楚地表明，C10隆起塊消除 與固有FKBP12的結(jié)合。圖23圖解顯示了含有附加之C9隆起塊之 FK506型部分的合成。使這樣的配體與本發(fā)明的接合部分相組合即可 構(gòu)成制備嵌合蛋白質(zhì)的HED和HOD(及拮抗劑)試劑，其中所說的嵌 合蛋白質(zhì)含有攜帶補(bǔ)償突變的相應(yīng)橋接區(qū)。圖23中圖解說明了包含 C9和C10′位上的修飾基團(tuán)的HED試劑。

因此本發(fā)明包括一類含有FK-506型部分的FK-506型化合物， 所說的部分在C9和C10之一或兩者上含有選自-OR、-R、 -(CO)OR、-NH(CO)H或NH(CO)R，其中R是被取代或未被取代的， 可以是直鏈、分支鏈或成環(huán)的烷基或芳基烷基的功能性基團(tuán)，包括被 取代或未被取代的過氧化物，以及碳酸酯?！癋K506型部分”包括 FK506、FK520和至少保留FK-506環(huán)結(jié)構(gòu)的(被取代或未被取代的) C2至C15部分，并能夠較好以低于約10-6的Kd值與天然或被 修飾的FKBP結(jié)合的其合成的或天然產(chǎn)生的變異體、類似物及衍生物 (包括rapamysin)。

本發(fā)明進(jìn)一步包括含有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合到本發(fā)明之接頭部分 上的這類FK-506型化合物的同或異二聚體及更高級(jí)寡聚體。這些 FK-506型化合物也是有用的，而不管是否共價(jià)結(jié)合到接頭部分上， 也不管是否經(jīng)過修飾進(jìn)而沒有消除它們對(duì)相應(yīng)FKBP的結(jié)合親和力。 可以使用這些單體化合物作為低聚拮抗劑，即作為基于象FK-506型 化合物之低聚試劑的拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明包含它們的化合物和低聚體 較好以至少0.1％，更好至少以大約1％，最好以至少大約10％的 親和力，如大到FK506對(duì)FKBP12的親和力(參見Holt?et?al.，下 文)，與天然的或突變的FKBP結(jié)合。

可用基于結(jié)構(gòu)的，位點(diǎn)針對(duì)性的或隨機(jī)的誘變方法制得本發(fā)明的 這些和其他配體的受體區(qū)域。我們研究了一個(gè)FKBP12部分的家族， 其含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸代替Tyr26、Phe36、 Asp37、Tyr82和Phe99中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以作為包括C 9和或C10位修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區(qū)域。

可使用大引物誘變法(參見Sakar?and?Dommer，Bio?Technigues 84(1990)：404-407)進(jìn)行位點(diǎn)針對(duì)性誘變。用序列酶(Sequenase) 試劑盒進(jìn)行cDNA序列測(cè)定。可在包含在大腸桿菌菌株XA90中的質(zhì) 粒pHN1+中進(jìn)行突變體FKBP12的表達(dá)，因?yàn)樵S多FKBP12突變體 均已在該系統(tǒng)中獲得了有效地表達(dá)?？砂匆衙枋鲞^的方法(例如參見 Aldape?et?al.，J.Biol.Chem.267，23(1992)：16029-32和 Park?et?al.，J.Biol.Chem.267，5(1992)：3316-3324)， 通過DE52陰離子交換樹脂進(jìn)行分級(jí)分離，然后在Sepharose柱上進(jìn) 行分子篩分離以方便地純化突變體蛋白質(zhì)。可按兩種方法之一很容易 地確定結(jié)合常數(shù)。如果FKBP保留有足夠的異構(gòu)酶(rotamase)活性， 可利用標(biāo)準(zhǔn)異構(gòu)酶檢測(cè)法(如參見Galat?et?al.，Biochemistry?31 (1992)：2427-2434)。否則可使用我們以前用于檢測(cè)FKBP和親 環(huán)素的LH20樹脂和放射標(biāo)記的T2-二氫FK506及T2-二氫CsA， 對(duì)突變的FKBP進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)(Bierer?et?al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，87，4(1993(：555-69)。

(B)使用酵母二雜種系統(tǒng)選擇隆起塊-FK506的FKBP12中的 補(bǔ)償突變

得到包括FKBP12的受體蛋白質(zhì)或區(qū)域之變異體的一種方法是強(qiáng) 有力的酵母“二雜種”或“相互作用陷阱”系統(tǒng)。已使用二雜種系統(tǒng) 確定彼此相互作用的蛋白質(zhì)。由融合到轉(zhuǎn)錄激活區(qū)上靶蛋白質(zhì)組成的 “鉺”融合蛋白質(zhì)與融合到DNA結(jié)合區(qū)上的潛在的“鉤”的cDNA庫 共表達(dá)。根據(jù)受體基因產(chǎn)物(其合成需要連接DNA結(jié)合和激活區(qū))的 出現(xiàn)來確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(鉺-鉤)相互作用。本文提到的酵母二 雜種系統(tǒng)最初是由Elledge和其同事共同建立的(Durfee?et?al.， Genes?&?Development?74(1993)：555-69和Harper?et?al.， Cell?75，4(1993)：805-816)。

因?yàn)槎s種系統(tǒng)不能提供對(duì)涉及小分子有機(jī)配體的受體-配體相 互作用的深入了解，所以我們已發(fā)展了一種新的、FK1012可誘導(dǎo)的 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(見下文所述)。使用該系統(tǒng)可以擴(kuò)展二雜種系統(tǒng)，從 而能夠深入發(fā)解小分子(例如本發(fā)明的FK506或FK1012或FK506型 分子)。首先產(chǎn)生具有區(qū)域定位于FK506的C9和C10周圍位點(diǎn)處 之突變的突變體FKBP(“鉤”)的cDNA庫。對(duì)于“鉺”來說可采取 兩種不同的策略。第一個(gè)是利用FK506與FKBP結(jié)合的能力并造成一 個(gè)與Caleineurin結(jié)合的復(fù)合表面。因此序列特異性轉(zhuǎn)錄激活物由下 列部分組成：DNA結(jié)合區(qū)-突變FKBP12-隆起塊FK506-calcineurin ?A-激活區(qū)(其中“-”是指非共價(jià)結(jié)合相互作用)。第二個(gè)策略利 用FK1012同時(shí)與二種FKBP結(jié)合的能力?？墒褂肍K1012的HED變體 篩選下列集合體：DNA結(jié)合區(qū)-突變FKBP12-隆起塊FK506-正常 FK506-野生型FKBP12-激活區(qū)。

1.作為“鉺”的calcineurin-Gal4激活區(qū)融合體：已構(gòu)建了 含有Gal4激活區(qū)和calcineurin?A亞單位融合構(gòu)建體的pSE1107的 衍生物。已使用二雜種系統(tǒng)制出calcineurin的FKBP-FK506結(jié)合位 點(diǎn)圖譜，研究證實(shí)了其以所提出的方式作為“鉺”的能力。

2.作為“鉺”的hEKBP12-Gal4激活區(qū)融合體。作為包括完 整開放讀碼的EcoRI-HinIII片段，切下hFKBP12cDNA，修成平頭并 與已修成平頭的pSE1107的XhoI位點(diǎn)連接，以產(chǎn)生全長度hFKBP- Cal4激活區(qū)蛋白質(zhì)融合體。

3.突變體hFKBP12cDNA庫。可用EcoRI和HindIII消化hFKBP 12，修成平頭并克隆到已用NcoI切割并修成平頭的pAS1(Durfee ?et?al，文獻(xiàn)同上)中。進(jìn)一步用NdeI消化該質(zhì)粒以除去pAS1之多 聚接頭序列中NdeI位點(diǎn)和hFKBP12之5′末端間的NdeI片段，并 再連接之，從而產(chǎn)生hFKBP12-Gal4DNA結(jié)合區(qū)蛋白質(zhì)融合體。用 引物#11206和#11210再次擴(kuò)增hFKBP。引物表： 11206???????????????????NdeI 5NdFK：???5′-GGAATTC?CAT?ATG?GGC?GTG?CAG?G-3′

???????????????????H???M???G???V???Q 11207??????????????SmoI 35mFK37：?5′-CTGTC?CCG?GGA?NNN?NNN?NNN?TTT?CTT?TCC?ATC?TTC?AAG?C-

?????????????????R???S???X???X???X???K???K???G???D???E???L 11208??????????????SmaI 35mFK27：?5′-CTGTC?CCG?GGA?GGA?ATC?AAA?TTT?CTT?TCC?ATC?TTC?AAG?CA

?????????????????R???S???5???D???F???K???K???G???D???E???L???M

?????????NNN?NNN?NNN?GTG?CAC?CAC?GCA?GG-3′

??????????X???X???X???H???V???V???C 11209????????????BcmHI 38mFK98：?5′-CGC?GGA?TCC?TCA?TTC?CAG?TTT?TAG?AAG?CTC?CAC?ATC?NNN

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??????????NNN?NNN?AGT?GGC?ATG?TGG-3′

???????????X???X???T???A???H???P 11210?????????????BamHI 3BmFK：??5′-CGC?GGA?TCC?TCA?TTC?CAG?TTT?TAG?AAG?C-3′

?????????????????????END??E???L???K???L???L

引物表：用于構(gòu)建區(qū)域定位的hFKBP12cDNA文庫，用以篩選補(bǔ)

償性突變。

然后使用下面列出的在限定的位置上含有hFKBP之隨機(jī)化突變序 列的引物，以聚合酶鏈反應(yīng)法制備突變體hFKBP12cDNA片段，并將 其插入Gal4DNA結(jié)合區(qū)-hFKBP(NdeI/BamHI)構(gòu)建體中。

4.酵母菌株釀酒酵母Y153攜帶兩個(gè)被整合到基因組中并由 Gal4啟動(dòng)子(Durfee，文獻(xiàn)同上)驅(qū)動(dòng)的可選擇標(biāo)志基因(his3/ β-半乳糖苷酶)。

使用Calcineurin-Gal4激活區(qū)域作為“鉺”。FKBP12-FK506 復(fù)合物以高親和力與calcineurin-一種2B型磷酸酶蛋白質(zhì)相結(jié)合。 因?yàn)槲覀兪褂肅9或C10有隆起的配體作為二雜種系統(tǒng)中的橋，所 以只有含補(bǔ)償突變的cDNA庫中的FKBP才產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活劑。為方便起 見，可以制備各含有8,000個(gè)突變FKBP12的三個(gè)不同的文庫(使用 引物表中的引物11207-11209)。經(jīng)檢查FKBP12-FK506結(jié)構(gòu)來選 擇隨機(jī)化的位點(diǎn)，此提示突變的殘基群可允許令人討厭的C9或C10 取代基結(jié)合于有隆起基團(tuán)的FK506上。然后使用C9和C10帶隆起 基團(tuán)的FK506分別篩選各文庫?？筛鶕?jù)宿主酵母在his滴落(drop -ort)培養(yǎng)基上生長的能力及β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)確定帶隆 起基因之FK506與補(bǔ)償性hFKBP12突變體的相互作用。因?yàn)檫@一選 擇取決于帶隆起基因之FK506的存在，可使用添加或未添加帶隆起之 基團(tuán)FK506配體的復(fù)制板，經(jīng)扣除篩選(Substractive?screening) 排除假陽性。

使用hFKBP12-Gal4激活區(qū)作為“鉺”。使用calcineurin?A -Gal4激活區(qū)篩選hFKBP12突變cDNA庫是一種鑒定FKBP12上補(bǔ) 償突變的簡單方法。但是，使帶隆起基團(tuán)的FK506與hFKBP12的突 變可破壞突變FKBP12-帶隆起FK506復(fù)合物與calcineurin間的相 互關(guān)系。如果用calcineurin作為鉺所作的篩選有錯(cuò)誤，則可以使用 野生型hFKBP12-Gal4激活區(qū)代替之?？梢院铣砂ㄒ蛴蠪K506- 帶隆起部分的FK506組成的FK1012?HED試劑并用作“鉤”。FK1012 的FK506部分可以結(jié)合FKBP12-Gal4激活區(qū)。FKBP12的帶隆起 FK506部分與FKBP12補(bǔ)償?shù)难a(bǔ)償突變體間的相互作用，可使宿主酵 母生長在his滴落培養(yǎng)基上生長并表達(dá)β-半乳糖苷酶。以這種方式， 單體基于hFKBP12突變體與帶隆起基團(tuán)的FK506反應(yīng)的能力進(jìn)行選 擇?？墒褂猛瑯拥目鄢Y選策略排除假陽性。

除了較早討論的體外結(jié)合試驗(yàn)外，還可以使用體內(nèi)試驗(yàn)確定帶隆 起之FK506與補(bǔ)償性hFKBP12突變體的結(jié)合親和力。在酵母二雜種 系統(tǒng)中，可根據(jù)“鉺”和“捕獲物”間相互作用的程度來確定β- gal活性。因此，可根據(jù)在不同的HED(天然FK506-帶隆起的FK506) 濃度下由宿主酵母產(chǎn)生的相應(yīng)β-半乳糖苷酶活性來估計(jì)帶隆起之 FK506和補(bǔ)償性FKBP12突變體間的親和力。

使用同樣的策略，可以以低親和力補(bǔ)償性FKBP12突變體作為模 板產(chǎn)生涉及其他隆起塊接觸殘基的附加隨機(jī)化突變體FKBP12cDNA 文庫，并進(jìn)行相似的篩選。

對(duì)高親和力補(bǔ)償性FKBP突變的噬菌體展開篩選法(display screening)。有此隆起塊FK506的高親和力hFKBP12突變體可在蛋 白質(zhì)的不連續(xù)區(qū)域含有幾個(gè)結(jié)合的點(diǎn)突變。含有適當(dāng)結(jié)合之突變的文 庫，對(duì)于酵母二雜種系統(tǒng)的能力來說可能是太大了(例如＞108個(gè) 突變)。使用噬菌體作為顯露整個(gè)功能性蛋白質(zhì)的載體，將會(huì)大大提 高篩選大數(shù)目突變的能力(如參見Bass?et?al，Proteins： Structure，F(xiàn)unction?&?Genetics?8，4(1990)：309-14； McCafferty?et?al.Nature?348，6301(1990)：552-4；和 Hoogenboom，Nucl.Acids?Res.19，15(1991)：4133-7)。 如果不能用酵母二雜種系統(tǒng)鑒定所帶的高親和力補(bǔ)償性突變體，則可 以用噬菌體載體在hFKBP12上造成大數(shù)目的組合突變?？梢杂脦?起之FK506-Sepharose作為親和性基質(zhì)(其可按我們按原來合成基 于FK506的親和基質(zhì)的相似方法合成，參見Fretz?et?al，J.Am. Chem.Soc.113，4(1991))，篩選突變的hFKBP12融合噬菌體。 重復(fù)進(jìn)行結(jié)合和噬菌體擴(kuò)增循環(huán)即可鑒定高親和力補(bǔ)償性突變體。

(C)“帶隆起的(CsA)2s”的合成：MeVal(11)CsA的修飾

如上文詳述的，我們已證明在細(xì)胞死亡信號(hào)發(fā)生途徑相關(guān)的解決 方案中，使用親環(huán)素作為二聚合區(qū)和(CsA)2作為HOD試劑的可行 性。然而，為了使(CsA)2試劑的細(xì)胞活性最佳化，應(yīng)依據(jù)如就FK 1012所描述的相似策略。因此，在應(yīng)用中應(yīng)優(yōu)選經(jīng)過修飾的(產(chǎn)生 隆起基團(tuán)的)基于CsA的低聚試劑，此時(shí)特別希望該試劑將能夠從內(nèi) 源性親環(huán)素中區(qū)別出它的靶，即人工蛋白質(zhì)構(gòu)建體。

本發(fā)明的一類被修飾的CsA衍生物是CsA類似物，其中(a) NMeVal?11被NMePhe(其可以是被取代或未被取代的)或NMeThr(其 可以是未被取代或在蘇氨酸β羥基基團(tuán)上被取代的)取代，或(b) MMeVal11的前S甲基基團(tuán)被至少有2個(gè)碳原子，較好有3個(gè)或更多 個(gè)碳原子的大基團(tuán)取代，所說的取代基可以是直鏈、分支鏈的和/或 含有環(huán)部分的，并可以是烷基(乙基，或更好是丙基、丁基包括叔丁 基等)、芳基或芳基烷基。這些化合物包括在MeVal11的位置上包 含NMeLeU、NMeIle、NMePhe或特別是非天然的NMe[βMePhe]的CsA 類似物?！?b)″CsA化合物是有結(jié)構(gòu)式2的化合物，其中R代表 如上所述的功能性基團(tuán)。

??????????????????1(R＝Me)：CsA

??????????????????2(R≠M(fèi)e)：被修飾的[MeVal11]CsA

?????????????????????????????3

本發(fā)明包括其中含有一個(gè)或多個(gè)這樣的CsA類似物的同或異二聚 體及更高級(jí)低聚體。根據(jù)本發(fā)明的包含它們的化合物和寡聚體以至少 0.1％，較好至少約1％，更好至少約10％的親和力，如大至CsA 對(duì)親環(huán)素的親和力與天然的，或較好是突變的親環(huán)素蛋白質(zhì)的結(jié)合。

可以使用兩步驟策略從CsA開始制備經(jīng)修飾的[MeVal11]CsA 衍生物。第一步中，從大環(huán)上去掉殘基MeVal11。第二步中，在 (在先的)MeVal11位點(diǎn)上引入選擇的氨基酸并使線性肽環(huán)化。與 總體合成相比較，該策略的優(yōu)點(diǎn)是易于通向幾種經(jīng)修飾的[MeVal11] CsA衍生物。合成流程如下：

為了區(qū)分酰胺鍵，已在MeBmt1的氨基和羥基基團(tuán)間實(shí)現(xiàn)了N， O移換，從而得到IsoCsA?Ruegger?et?al，Helv.Chem.Acta?59， 4(1976)：1075-92)(參見上列流程)。反應(yīng)在甲磺酸存在下 于THF中進(jìn)行(Oliyai?et?al，Pharm.Res.9，5(1992)：617 -22)。以一罐法在吡啶和乙酸存在下用乙?；鶊F(tuán)保護(hù)游離胺。N -乙?；Ｗo(hù)的IsoCsA的總產(chǎn)率為90％。然后于N-甲基酰胺鍵 存在下，例如使用DIBAL-H選擇性地還原酯MeBmt1-MeVal11鍵。 將所得到的二醇轉(zhuǎn)化成有另-個(gè)酸誘導(dǎo)的N，O移換的相應(yīng)的二酯。 如此將制得通過用含水堿水解新形成的酯除去的N-乙?；鶊F(tuán)和 MeVal11殘基。

在保護(hù)游離氨基基團(tuán)之后，例如用PyBrop偶聯(lián)劑引入新的氨基 酸殘基。在DMAP存在下用BOP使線性肽去保護(hù)并環(huán)化(Alberg?and Schreiber，Science?262，5131(1993)：248-250)以完成2的合 成。用估測(cè)FK506和FK1012的同樣方法估測(cè)帶隆起的CsA與親環(huán)素 的結(jié)合親和力。一旦鑒定了有補(bǔ)償性突變的親環(huán)素，即可按照以前描 述過的方法合成帶隆起基因的(CsA)2?HED和HOD試劑。其中特別 有用的是可形成二聚體的帶隆起的CsA化合物，其本身可按1∶2化 學(xué)計(jì)算量與親環(huán)素蛋白質(zhì)結(jié)合?？梢栽O(shè)計(jì)至少含有一個(gè)這樣的CsA或 被修飾的CsA部分的同二聚體和更高級(jí)同低聚體、異二聚體和更高級(jí) 異低聚體，并使用如FK1012和(CsA)2而建立的方法估計(jì)之，同時(shí) 按研究FK1012的相似方法使接頭元件最佳化。

現(xiàn)在有可能通過在配體上容納額外的大基團(tuán)結(jié)合我們的11位 CsA變異體(2)突變的親環(huán)素。可以通過在FK1012研究中所述的 基于結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)針對(duì)性和隨機(jī)誘變/篩選方法鑒定帶有這些補(bǔ)償性突 變的親環(huán)素。

上述結(jié)果表明，本方法和組合物在生產(chǎn)野生型變種細(xì)胞中的廣泛 通用性。利用本發(fā)明的構(gòu)建體，可將細(xì)胞用于治療目的，其中細(xì)胞可 在使用前保持無活性狀態(tài)，并在給予一種安全的藥物后使之被激活。 因?yàn)榧?xì)胞在宿主體內(nèi)有野生品種的生活史，所以有機(jī)會(huì)處理慢性和急 性病癥以提供短期或長期保護(hù)作用。另外，可以提供將被導(dǎo)向特定部 位，如解剖部位或功能部位的細(xì)胞，并借以在該部位提供治療效果。

可提供將導(dǎo)致分泌野生品種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，其可用于糾正缺陷或 抑制不希望的后果，如激活溶胞性細(xì)胞、失活有害因子、殺死受限制 的細(xì)胞群體等。由于細(xì)胞在限定的期間內(nèi)存在于宿主中，所以給予足 可導(dǎo)致細(xì)胞在宿主中的迅速反應(yīng)之劑量的藥物即很容易將細(xì)胞激活。 可以提供使其中被表達(dá)的嵌合受體存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞，故可避免由 于細(xì)胞表面上的外來蛋白質(zhì)引起的免疫反應(yīng)。此外，細(xì)胞內(nèi)嵌合受體 蛋白質(zhì)在為配體結(jié)合后的有效信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了條件，這顯然比在細(xì)胞 外受體區(qū)上的受體結(jié)合更為有效。

使用與嵌合膜結(jié)合受體結(jié)合的相對(duì)簡單的分子，導(dǎo)致有用產(chǎn)物的 表達(dá)或抑制該產(chǎn)物的表達(dá)，從而可提供細(xì)胞治療效果。可以以多種途 徑使用可安全給藥的化合物，并可保證出現(xiàn)很特異的反應(yīng)，以致不會(huì) 攪亂體內(nèi)平衡。

本說明書中列出的所有出版物和專利申請(qǐng)都摻入本文參考文獻(xiàn)， 如同個(gè)另出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e地和各自地指出其列為本文參考文獻(xiàn) 一樣。

雖然為了清楚了解本發(fā)明的目的在一定程度上詳細(xì)舉例描述了本 發(fā)明，但對(duì)本發(fā)明技術(shù)教導(dǎo)的某些沒有超出待批權(quán)利要求之精神或范 圍的改變和改動(dòng)，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的。