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用于卵巢癌的生物標記

【相關(guān)申請】本發(fā)明主張2004年12月1日申請的美國臨時申請案第60/632,474號和2004年3月31日申請的美國臨時申請案第60/558,422號的專利權(quán)利，該兩案所揭示的內(nèi)容以引用方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明提供用于測量卵巢癌有重要意義的生物標記。該等生物標記可利用SELDI分析方法將患有卵巢癌病患的血清蛋白指紋圖譜與健康個體的血清蛋白指紋圖譜區(qū)分開來。本發(fā)明是與生物標記有關(guān)的系統(tǒng)及方法，其中所述的生物標記是可用于定性卵巢癌狀態(tài)。本發(fā)明也將所述的生物標記識別為已知的蛋白質(zhì)。

【背景技術(shù)】在發(fā)達國家中，卵巢癌為最致命婦科惡性腫瘤的一者。僅在美國，每年大約有23,000名婦女診斷有該疾病，其中14,000名婦女死于該疾病。(請參閱Jamal，A.，et?al.，CACancer?J.Clin，2002；52：23-47)。盡管癌癥治療技術(shù)有很大進步，卵巢癌死亡率在過去二十年(Id.)實際上保持不變。由于診斷卵巢癌的階段越早、存活的可能性迅速升高，因此早期發(fā)現(xiàn)仍然是提高卵巢癌病人長期存活可能性的最重要因素。

由于晚期診斷出來的卵巢癌的預(yù)診斷性差、與經(jīng)證實的診斷過程有關(guān)的高費用和高風險性、以及于一般民眾人口中相對低的普遍率，因而非常迫切需要一種可于一般民眾中用于篩檢卵巢癌的高靈敏度和高特異性的檢測方法。

適用于癌癥早期發(fā)現(xiàn)和診斷的腫瘤標記的識別對于提高病人的臨床結(jié)果具有很大前景。對于病征模糊或沒有病征的病人或?qū)τ诓豢山邮芪锢頇z測的腫瘤來說尤為重要。雖然在早期發(fā)現(xiàn)上付出大量努力，但是目前還沒有一種花費低且有效的篩檢方法(請參閱Paley?PJ.，Curr?OpinOncol，2001；13(5)：399-402)，而且診斷時患有癌癥婦女體內(nèi)的癌細胞通常都已擴散。(請參閱Ozols?RF，et?al.，Epithelial?ovarian?caner.In：Hoskins?WJ，Perez?CA，YoungRC，editors.Principles?and?Practice?of?GynecologicOncology.3rd?ed.Philadelphia：Lippincott，Williams?andWilkins；2000.p.981-1057)。

CA125是最具特征的腫瘤標記，其在I階段卵巢癌中大約30至40％為陰性的，而且在許多良性腫瘤中它的數(shù)值水平比較高。(請參閱Meyer?T，et?al.，Br?J?Cancer，2000；82(9)：1535-8；Buamah?P.，J?Surg?Oncol，2000；75(4)：264-5；Tuxen?MK，et?al.，Cancer?Treat?Rev，1995；21(3)：215-45)。由于CA125的低靈敏度和特異性使得它用作為大眾基本篩檢工具以早期發(fā)現(xiàn)和診斷卵巢癌受阻。(請參閱MacDonald?ND，et?al.，Eur?J?Obstet?GynecolReprod?Biol，1999；82(2)：155-7；Jacobs?I，et?al.，HumReprod，1989；4(1)：1-12；Shih?I-M，et?al.，Tumor?makers?inovarian?cancer.In：Diamandis?EP，F(xiàn)ritsche，H.，Lilja，H.，Chan，D.W.，and?Schwartz，M.，editor.Tumor?markersphysiology，pathobiology，technology?and?clinicalapplications.Philadelphia：AACC?Press；in?press)。雖然盆骨超音波掃描以及最近的陰道超音波掃描已用于檢測高風險病人，但其兩者技術(shù)都不具足夠的靈敏度和特異性以應(yīng)用于一般民眾。(請參閱MacDonald?ND，et?al.，同上)。最近在癌癥模型的風險度縱向評估中(請參閱SkatesSJ，et?al.，Cancer，1995；76(10Suppl)：2004-10)將CA125與其它腫瘤標記一起使用(請參閱Woolas?RP?XF，et?al.，J?Natl?CancerInst，1993；85(21)：1748-51；Woolas?RP，et?al.，GynecolOncol，1995；59(1)：111-6；Zhang?Z，et?al.，Gynecol?Oncol，1999；73(1)：56-61；Zhang?Z，et?al.，Use?of?Multiple?Markersto?Detect?Stage?I?Epithelial?Ovarian?Cancers：NeuralNetwork?Analysis?Improves?Performance.American?Societyof?Clinical?Oncology?2001；Annual?Meeting，Abstract)并且協(xié)同使用超音波掃描作為第二線試驗(請參閱Jacobs?IDA，et?al.，Br?MedJ，1993；306(6884)：1030-34；Menon?U?TA，etal.，British?Journal?of?Obstetrics?and?Gynecology，2000；107(2)：165-69)表明，在提高整體試驗特異性方面得到很好的結(jié)果，而特異性對于具相對低普遍性的疾病(例如卵巢癌)為關(guān)鍵性指針。

由于晚期卵巢癌令人失望的預(yù)診斷，普遍認為主治醫(yī)師將會接受積極預(yù)測值在至少10％的測試結(jié)果。(請參閱Bast，R.C.，et?al.，Cancer?Treatment?and?Research，2002；107：61-97)。當擴展到更廣泛的范圍時，一般篩檢試驗將需要靈敏度大于70％且特異性達到99.6％。目前，沒有一者現(xiàn)有的血清學(xué)上的標記，例如CA125、CA72-4或M-CSF，單獨地執(zhí)行上述的功效。(請參閱Bast，R.C.，et?al.，Int?JBiol?Markers，1998；13：179-87)。

因此，迫切需要單獨地或與其它標記或診斷型式組合的新穎血清學(xué)上的生物標記，以給予早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌所需要的靈敏度和特異性。(請參閱Bast?RC，et?al.，Earlydetection?of?ovarian?cancer：promise?and?reality.OvarianCancer：ISIS?Medical?Media?Ltd.，Oxford，UK；2001.inpress)。如果沒有可接受的篩檢試驗，早期發(fā)現(xiàn)仍然是提高卵巢癌病人長期存活最關(guān)鍵因素。

因此需要一種可靠且準確測量病人卵巢癌狀態(tài)的方法，然后該測量結(jié)果可用于安排受驗者治療。

【發(fā)明內(nèi)容】本發(fā)明提供敏感且快速的方法以及試劑盒，利用測量卵巢癌的生物標記來判斷卵巢癌狀態(tài)。測量病人這些生物標記是診斷醫(yī)師提供與人類癌癥的可能性診斷或陰性診斷(亦即，正常的或無疾病的診斷)有關(guān)的信息。該等生物標記是以分子量及/或它們已知的蛋白質(zhì)特性為特征。藉由使用各種分離技術(shù)，例如與質(zhì)譜連用的色譜分離法、利用固定化抗體或傳統(tǒng)免疫測定提取蛋白質(zhì)的方法，生物標記可于一樣本的其它蛋白質(zhì)中析出。在優(yōu)選的實施例中，該析出方法包括表面強化激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)(SELDI)，其中質(zhì)譜儀探針的表面由能結(jié)合生物標記的吸收劑組成。

更詳而言之，依據(jù)下面三種物質(zhì)所采取的方法發(fā)現(xiàn)三種生物標記并隨后得到確定：(1)載脂蛋白A1(Apolipoprotein?A1)(本文以”ApoA1”表示)，包括經(jīng)修飾的ApoA1；(2)甲狀腺素運輸?shù)鞍?transthyretin)，包括截斷型甲狀腺素運輸?shù)鞍祝?本文以”甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10”表示)，及經(jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍追N類，以及(3)至少三種含有間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4的切割片段(本文以”IAIH4片段”表示)的其中一者。

本發(fā)明提供一種定性受驗者卵巢癌狀態(tài)的方法，該方法包括：(a)測量取自該受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍住腚?a href='/zhuanli/list-13903-1.html' target='_blank'>氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3、及其組合物組成的組；以及(b)將測量結(jié)果與卵巢癌狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在某些方法中，測量步驟包括檢測樣本中是否存在所述的生物標記。而在其它方法中，測量步驟包括確定樣本中所述的標記的數(shù)量。在其它方法中，測量步驟包括評定樣本中所述的生物標記的類型。

本發(fā)明所述的方法還包括下列測量步驟：提供受驗者血液樣本或血液衍生物樣本；用陰離子交換樹脂區(qū)分所述的樣本中的蛋白質(zhì)，并收集含有ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段的區(qū)分物；在包含有結(jié)合蛋白質(zhì)生物標記的捕獲劑的基質(zhì)表面上，從這些區(qū)分物中獲取ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段。所述的血液衍生物是血清或血漿。在優(yōu)選的實施例中，所述的基質(zhì)是含有IMAC銅表面的SELDI探針，并且其中所述的蛋白質(zhì)生物標記通過SELDI檢測。在其它實施例中，所述的基質(zhì)是含有結(jié)合ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段的生物特性親和試劑的SELDI探針，而且所述的蛋白質(zhì)生物標記通過SELDI檢測。在其它實施例中，所述的基質(zhì)是含有結(jié)合ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段的生物特異性親和試劑的微量滴定盤，而且所述的蛋白質(zhì)生物標記通過免疫測定方法檢測。

在某些實施例中，所述的方法進一步包括依據(jù)本發(fā)明方法確定的癌癥狀態(tài)來安排受驗者治療。例如，如果采用本發(fā)明方法所得到的結(jié)果不確定或者有必要進一步確定癌癥狀態(tài)時，主治醫(yī)師應(yīng)該安排更多的試驗。或者，如果確定的狀態(tài)表明應(yīng)當要動手術(shù)，主治醫(yī)師則可以為病人安排手術(shù)。否則，如果測試結(jié)果是陽性的，例如確定的狀態(tài)是晚期卵巢癌或狀態(tài)是急性卵巢癌，則無須采取更進一步的措施。又，如果結(jié)果顯示治療很成功，則無須進行進一步的安排試驗。

本發(fā)明也提供在安排受驗者治療后，重新測定至少一種生物標記的方法。在這些實施例中，依據(jù)獲得結(jié)果之后需要重復(fù)及/或修改安排受驗者治療的步驟。

術(shù)語“卵巢癌狀態(tài)”是指病人疾病的狀態(tài)。卵巢癌狀態(tài)的類型包括，但不僅限于，受驗者患癌風險、是否存在疾病、疾病階段以及疾病治療效果。其它狀態(tài)及各自狀態(tài)的程度在熟習技藝領(lǐng)域中為已熟知。

用于本發(fā)明方法的生物標記是選自由ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。在某些優(yōu)選的實施例中，所述的方法進一步包括測量取自受驗者樣本中的至少一種已知生物標記(本文以”標記4”表示)，并將所述的至少一種標記4的測量結(jié)果以及ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段的測量結(jié)果與卵巢癌狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在某些實施例中，除測量選自由ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段的生物標記之外只測量一種標記4，而在另外一些實施例中則需測量多種標記4。

標記4包括已知的卵巢癌生物標記，例如，但不僅限于，CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盤堿性磷酸酯酶(PLAP)、抗原Sialyl?TN、半乳糖轉(zhuǎn)化酶、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生長因子受體細胞外區(qū)域110kD部分(p110E?GFR)、組織激肽釋放酶，如激肽釋放酶6和激肽釋放酶10(NES-1)、絲氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽(UGP)、Dianon?NB?70/K、組織多肽抗原(TPA)、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質(zhì)變異體(如裂解形式、異構(gòu)形式)。

在某些實施例中，所述的方法提供測量所有三種生物標記ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍?、及IAIH4片段(其中所述的ApoA1是選自由未經(jīng)修飾的ApoA1以及經(jīng)修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸?shù)鞍资沁x自由甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、及谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍捉M成的組；以及其中所述的IAIH4片段是選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組)。在另外的實施例中，所述的方法提供測量兩種生物標記，ApoA1與甲狀腺素運輸?shù)鞍?其中所述的ApoA1是選自由未經(jīng)修飾的ApoA1以及經(jīng)修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸?shù)鞍资沁x自由甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly經(jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍捉M成的組)。在優(yōu)選的實施例中，所述的兩種生物標記是經(jīng)修飾的ApoA1以及半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?。在其它的實施例中，所述的方法提供測量ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍住腚装滨；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍滓约八腥NIAIH4片段。在一些實施例中，也要測量取自受驗者樣本中至少一種已知標記，即為標記4，并將所述的已知生物標記4的測量結(jié)果以及其它三種生物標記(ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍?、以及IAIH4片段)的測量結(jié)果與卵巢癌狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。如前所述，在某些實施例中，測量的生物標記包括：所有三種生物標記(ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍?、以及IAIH4片段，其中所述的ApoA1是選自由未經(jīng)修飾的ApoA1以及經(jīng)修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸?shù)鞍资沁x自由甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍捉M成的組；以及其中所述的IAIH4片段是選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組，或可能包括兩種或三種IAIH4片段)以及兩種或多種來自由指定為標記4組成的組的生物標記。

本發(fā)明也關(guān)于指定為標記I至XLVIII的生物標記。本發(fā)明的蛋白質(zhì)標記可從幾個方面來表征。尤其，一方面，這些標記是以本文詳列的情況下的分子量來表征，特別是根據(jù)質(zhì)譜分析法來判斷的分子量。另一方面，生物標記可由經(jīng)質(zhì)譜分析法得到的例如尺寸大小(包括面積)及/或標記的譜峰形狀來進行表征，這些表征方式還包括臨近光譜峰的靠近程度、臨近峰大小以及形狀等等。再一方面，生物標記還可以親和結(jié)合特征為表征，尤其能夠在特定環(huán)境下與IMAC銅吸收劑結(jié)合，然而也可使用例如鎳的其它金屬。在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的生物標記均可以分子量、質(zhì)譜圖以及IMAC銅吸收劑結(jié)合來表征。

至于本文所揭露的生物標記的質(zhì)量，質(zhì)譜儀器所測得的質(zhì)量精確度被認為是在所揭露的質(zhì)量數(shù)值的大約±0.15％之間。除此之外，對于儀器這種公認的精確度變動范圍，質(zhì)譜分析方法的質(zhì)量測定的解析范圍在大約400m/dm至1000m/dm內(nèi)變動，其中m表示質(zhì)量，dm表示質(zhì)譜圖中半峰高的譜峰寬度。這些質(zhì)量精確度和解析范圍均與質(zhì)譜儀有關(guān)，而且在每個從標記I至XLVIII質(zhì)量的揭露過程中，由于質(zhì)譜儀的操作誤差，所以反應(yīng)在上述使用“大約”這一術(shù)語上。值得注意的是，這里所揭示的每種生物標記的質(zhì)量精確度、解析范圍以及“大約”的意義也包括生物標記中由于受驗者的性別、基因型態(tài)和/或人種以及受驗者特定癌癥或疾病起因或其所處的階段的不同帶來的變動。

本發(fā)明也提供一種定性受驗者卵巢癌狀態(tài)的方法，該方法包括：(a)測量取自受驗者樣本中至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由標記I至XLVIII以及其結(jié)合物組成的組；以及(b)將測量結(jié)果與卵巢癌狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在某些方法中，測量步驟包括檢測樣本中是否存在生物標記。而在另一些方法中，測量步驟包括確定樣本中生物標記的數(shù)量。還有一些方法中，測量步驟包括評定樣本中生物標記的類型。

診斷測試的精確度用接收器操作特性曲線(ReceiverOperating?Characteristic?curve，ROC曲線)來表征。ROC是繪制診斷試驗中的真陽性部分與假陽性部分之間可能存在的交點。ROC曲線顯示靈敏度與特異性之間的關(guān)系。也就是說，靈敏度的提高伴隨的是特異性的降低。曲線越靠近縱軸表示試驗越精確。相反，曲線越靠近ROC圖的45度對角線表示試驗越不精確。ROC曲線下的面積可用于測量試驗的精確度。試驗的精確度依試驗是否將受驗者很好地分為患有疾病或沒有患有疾病而定。曲線下的面積(這里用”AUC”指代)為1表示的是成功的試驗，而AUC為0.5表示的是幾乎沒有用處的試驗。因此，本發(fā)明優(yōu)選的生物標記和診斷方法的AUC要大于0.5，更好的是大于0.6，甚至大于0.7。

測量生物標記的優(yōu)選方法包括使用生物芯片列陣。用于本發(fā)明中的生物芯片列陣包括蛋白質(zhì)和核酸列陣。將至少一種生物標記固定于生物芯片列陣上，并經(jīng)激光離子化后檢測生物標記的分子量。例如，生物標記的分析方法是通過分析至少一種生物標記的分子量的闕值強度，其中該闕值強度對總離子電流做標準化換算。優(yōu)選地，對數(shù)轉(zhuǎn)換可用于降低峰值強弱范圍以限制被檢測的生物標記的數(shù)量。

本發(fā)明的優(yōu)選方法中，將生物標記的測量方法與卵巢癌狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的步驟可通過軟件分類算法來進行。優(yōu)選地，須在生物芯片列陣上采用固定化的受驗者樣本、且將該生物芯片列陣經(jīng)激光離子化來檢測用于表示質(zhì)荷比的信號強度，從而獲得數(shù)據(jù)；并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成計算器可讀形式；然后對于檢測出的信號、根據(jù)使用者輸入的參數(shù)將數(shù)據(jù)分類來進行分類演算，其中該信號是代表存在于卵巢癌病人而又很少出現(xiàn)在無癌癥受驗者參照物中。

優(yōu)選地，生物芯片表面是由例如固定化的鎳離子組成的陽離子或陰離子，或由陽離子和陰離子的混合物組成，或由至少一種抗體、單股或雙股線形核酸、蛋白質(zhì)、多肽或多肽片段、氨基酸探針或噬菌體展示庫(phage?displaylibraries)組成。

在其它優(yōu)選方法中，采用激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)測量至少一種生物標記，這種技術(shù)包括提供適用于質(zhì)譜儀的探針，該探針上附著一層與受驗者樣本接觸的吸收劑；并且解吸和電離生物標記或探針上的生物標記，從而用質(zhì)譜儀檢測去離/電離生物標記。

優(yōu)選地，激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)包括：提供附著有吸收劑的基材；將受驗者的樣本與吸收劑接觸；將基材置于探針上，該探針是適用于質(zhì)譜儀且附著有吸附劑；并且解吸和電離生物標記或探針上的生物標記，從而用質(zhì)譜儀檢測去離/電離生物標記。

吸附劑可以是例如厭水的、親水的、離子的或金屬螯合物吸收劑，例如鎳或抗體、單股或雙股線形寡核甘酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽或多肽片段。

本發(fā)明的方法可操作于遵從所述方法的任何類型的病人樣本(如血液、血清和血漿)。

在某些實施例中，需測量取自受驗者的樣本中的許多生物標記，其中該生物標記選自由ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3、以及至少一種已知標記標記4組成的組。在其它優(yōu)選實施例中，所述的生物標記包括選自由ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍住AIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。生物標記的測量也包括測量至少一種標記4。優(yōu)選地，所述的蛋白質(zhì)生物標記通過SELDI法或免疫測定方法測定。

本發(fā)明也提供一種方法，其包括測量取自由受治療樣本中的至少一種生物標記，其中該生物標記是選自由ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍住腚装滨；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及其組合物組成的組。在某些實施例中，所述的方法還包括測量ApoA1及/或至少一種已知的卵巢癌標記4，例如CA125、CAl25II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl?TN、半乳糖轉(zhuǎn)移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon?NB?70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質(zhì)變異體(如裂解形式、異構(gòu)形式)。

本發(fā)明也提供一種試劑盒，所述的試劑盒包括(a)結(jié)合生物標記的捕獲試劑，其中所述的生物標記選白ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及其組合物，以及(b)包括至少一種生物標記的容器。在一實施例中，大多數(shù)生物標記包括ApoA1和甲狀腺素運輸?shù)鞍?，在其?yōu)選實施例中，ApoA1是經(jīng)修飾的ApoA1，而甲狀腺素運輸?shù)鞍资前腚装滨；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?。在另一實施例中，大多?shù)生物標記包括ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。而所述的捕獲試劑可以是任何類型的試劑，但是優(yōu)選地試劑是SELDI探針。所述的捕獲試劑也可能結(jié)合其它已知生物標記，如標記4。在某些優(yōu)選實施例中，試驗試劑盒還包括第二捕獲試劑，該第二捕獲試劑是結(jié)合第一捕獲試劑不結(jié)合的至少其中一種生物標記。

本發(fā)明提供的試劑盒還包括(a)結(jié)合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)結(jié)合至少一種所述的第一捕獲試劑不結(jié)合的生物標記的第二捕獲試劑。優(yōu)選地，至少一種捕獲試劑是抗體。某些試劑盒也包括至少一種捕獲試劑黏附于或可黏附于其上的質(zhì)譜探針。

本發(fā)明的某些試劑盒中，所述的捕獲試劑包括一種固定化的金屬螯合物(immobilized?metalch?elate，IMAC)。

本發(fā)明的某些試劑盒進一步包括沖洗溶液，沖洗后可選擇性地允許被結(jié)合的生物標記保留于所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被沖洗下來。

本發(fā)明提供的試劑盒進一步包括(a)結(jié)合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)使用捕獲試劑檢測生物標記的說明書。在某些試劑盒中，該捕獲試劑包括抗體。而且，一些試劑盒進一步包括所述的捕獲試劑粘附于或可粘附于其上的MS探針。

一些試劑盒中，所述的捕獲試劑進一步包括IMAC。所述的試劑盒可能進一步包括沖洗溶液，沖洗后可選擇性地允許被結(jié)合的生物標記保留于所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被沖洗下來。優(yōu)選地，所述的試劑盒包括使用試劑盒檢測卵巢癌狀態(tài)的書面說明書，并且該說明書供以將試驗樣本與捕獲試劑接觸并檢測一種或多種被捕獲試劑捕獲到的生物標記。

試劑盒提供的捕獲試劑是抗體、單股或雙股線形寡核甘酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽或多肽片段。

使用試劑盒獲得的至少一種蛋白質(zhì)生物標記的測量方法是質(zhì)譜分析法或例如酶聯(lián)免疫吸附測試(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)的免疫試驗法。

本發(fā)明進一步提供用于檢測卵巢癌的經(jīng)純化的肽及/或產(chǎn)生用于進一步診斷試驗的抗體。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)包括下列經(jīng)純化的肽：SEQIDNO：1(IAIH4片段No.1)、SEQ?IDNO：2(IAIH4片段No.2)、SEQ?ID?NO：3(IAIH4片段No.3)。本發(fā)明提供的經(jīng)純化的肽進一步包括可檢測的標記。

本發(fā)明進一步提供一種制品，包括結(jié)合至少兩種生物標記的至少一種捕獲試劑，其中所述的生物標記選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍住腚装滨；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。本發(fā)明所述的制品的其它實施例進一步包括結(jié)合其它已知的卵巢癌標記的捕獲試劑，所述的標記也就是標記4，例如，但不僅限于，CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl?TN、半乳糖轉(zhuǎn)移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon?NB?70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質(zhì)變異體(如裂解形式、異構(gòu)形式)。

本發(fā)明進一步包括一種系統(tǒng)，包括：多種捕獲試劑，每種捕獲試劑結(jié)合至不同生物標記，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍住腚装滨；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍住AIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3以及至少一種標記4。

本發(fā)明進一步提供一種篩選試驗，包括：(a)將激肽釋放酶與激肽釋放酶底物以及測試試劑接觸，以及(b)判斷所述的測試試劑是否調(diào)節(jié)所述的激肽釋放酶活性。在這樣一種試驗中，所述的底物是間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4前體。其中，優(yōu)選地是所述的激肽釋放酶將所述的底物切割成IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2或IAIH4片段No.3。

在另外的實施例中，非介入性藥物影像技術(shù)(如經(jīng)陰道超聲波(transvaginal?ultrasound)技術(shù)、正電子發(fā)射斷層成像(positronemisson?tomography，PET)技術(shù)或單電子發(fā)射型計算機斷層掃描(emission?computerizedtomography，SPECT)影像技術(shù))對于發(fā)現(xiàn)癌癥、冠狀動脈疾病以及腦部疾病尤為有用。超聲多普勒血流影像、PET影像以及SPECT影像顯示器官和組織的化學(xué)功能，而其它影像技術(shù)——如X射線(X-ray)、CT和MRI(核磁共振檢查)——主要顯示的是結(jié)構(gòu)。采用超聲波血流影像、PET影像以及SPECT影像逐漸成為檢查和監(jiān)視例如卵巢癌的疾病發(fā)展狀態(tài)的有用方法。

在PET和SPECT影像應(yīng)用的裝置中可采用本文所揭示的縮氨酸生物標記或其片段。用適當?shù)氖聚檮埢鶠镻ET或SPECT成像裝置進行表面經(jīng)修飾后，與腫瘤蛋白質(zhì)相互作用的縮氨酸生物標記可用于卵巢癌病人體內(nèi)生物標記的成像。

以下將描述本發(fā)明的其它方面。

【圖標簡單說明】第1圖，是表示生物標記發(fā)現(xiàn)集合中樣本的假凝膠質(zhì)譜圖，其中顯示位于12828和28043(組分pH4，IMAC-Cu列陣)，以及3272(組分pH9，IMAC-Cu列陣)的m/z的峰值。

第2(A)、(B)、(C)和(D)圖，是表示CA125與三種指定的生物標記之間比較接收器操作特性(ROC)曲線。

第2(E)、(F)、(G)和(H)圖，是表示CA125與兩種多變量預(yù)測模型的接收器操作特性(ROC)曲線。

第3(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)圖，是表示病人體內(nèi)和健康參照物體內(nèi)的三種指定的生物標記和CA125分別在生物標記發(fā)現(xiàn)集合和獨立確認集合中的分布散點圖(泳道a-h)。

第3(i)、(j)、(k)和(l)圖，是表示病人體內(nèi)和健康參照物體內(nèi)的兩種多變量預(yù)測模型分別在生物標記發(fā)現(xiàn)集合和獨立確認集合中的分布散點圖。

第4圖，是表示用于表征生物標記的分類算法圖表。

第5圖，是表示發(fā)現(xiàn)在卵巢癌樣本中不同的IAIH4片段的質(zhì)譜圖。峰3276.7代表IAIH4片段No.1(SEQ?IDNO：1)。峰3031.3代表IAIH4片段No.2(SEQ?ID?NO：2)。峰2884代表IAIH4片段No.3(SEQ?ID?NO：3)。圖中的表格是表示，以不帶有癌癥樣本為參照物，卵巢癌中自天然IAIH4片段(IAIH4片段No.1；即表格中的“Orig”)開始的八段的峰值pvalue。表格中，NS代表忽略不計?！?MN”代表來自IAIH4片段No.1序列的以N為端點的M到N的截斷，同樣也可來自SEQ?ID?NO：2(IAIH4片段No.2)?！?MNF”表示來自IAIH4片段No.1序列的以N為端點的M到N、N到F的截斷，同樣也可來自SEQ?ID?NO：3(IAIH4片段No.3)。表格中其余截斷是帶有從天然IAIH4片段No.1序列移去指定氨基酸殘基。

第6圖，是表示未經(jīng)修飾的(unmodified)、半胱氨?；?cysteinylated)、谷胱甘肽化(glutathionylated)以及截斷形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍追謩e通過免疫法和色譜分析法發(fā)現(xiàn)的質(zhì)譜圖。

第7圖，是表示患有卵巢癌病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)各種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍着c其它癌癥病人和參照病人比較得到的結(jié)果。

第8圖，是表示甲狀腺素運輸?shù)鞍捉?jīng)還原反應(yīng)和烷基化反應(yīng)的后質(zhì)譜圖中峰的變化，表明甲狀腺素運輸?shù)鞍走_成半胱氨酰化。

第9圖，是表示在Q10?ProteinChip?Array上甲狀腺素運輸?shù)鞍阻b定的代表性譜圖。其中五種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍锥家寻ㄔ趦?nèi)：未經(jīng)經(jīng)修飾的(unmodified)、磺化(sulfonated)、半胱氨?；?cysteinylated)、經(jīng)CysGly修飾的、谷胱甘肽化(glutathionylated)。除此之外，還可發(fā)現(xiàn)其截斷形式transthyretin△N10；它以很低的濃度(～2％)的半胱氨酰化(cysteinylated)形式出現(xiàn)。

第10圖，是表示各種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍着c峰強度之間的線性關(guān)系圖。

第11圖，是表示手術(shù)后甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白(ApolipoproteinA1)的變化情況。對每個病人在術(shù)前和術(shù)后使用基于五種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白(Apolipoprotein?A1)設(shè)計的計算器得出指數(shù)數(shù)值。比較術(shù)前和術(shù)后的指數(shù)數(shù)值點圖發(fā)現(xiàn)，對于大部分病人，術(shù)后該數(shù)值升高。而且A.對于早期卵巢癌患者，該數(shù)值提高31/42(73.8％)；B.對于晚期卵巢癌患者，該數(shù)值提高62/79(78.5％)。

第12圖，適用于表示該指數(shù)數(shù)值可用于監(jiān)視病人情況。圖中是表示治療過程中指數(shù)數(shù)值如何變化的一實施例。對于這個病人，該指數(shù)數(shù)值在術(shù)前很低，在術(shù)后有所升高。直到1996年10月該數(shù)值都一直保持高水平。表明病人在那一時期疾病得到好轉(zhuǎn)。

第13圖，是表示在Q10?ProteinChip?Array上各形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白產(chǎn)生的峰強度的散點圖。對于各種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎膬山Mt-試驗值如下所示：未經(jīng)修飾的，0.0076；經(jīng)磺化的(sulfonated)，0.0052；經(jīng)半胱氨?；?cysteinylated)，0.0104；經(jīng)CysGly修飾的，0.0026；經(jīng)谷胱甘肽化的(glutathionylated)，0.0047。對于載脂蛋白(Apolip?oproteinA1)的兩組t-試驗值為0.0009。

第14圖，是表示采用最近鄰居分析方法得到的指數(shù)數(shù)值。該模型包括六種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白(Apolipoprotein?A1)產(chǎn)生的峰強度，無論是包括年齡因素還是不包括年齡因素。使用的最近鄰居分析方法是用于計算每種樣本是為參照物、良性腫瘤或癌癥之后事概率。計算公式為：p(良性腫瘤/生物標記)+2*p(癌癥/生物標記)。0分表示該樣本歸為參照物，2分表示該樣本歸為癌癥，中間分數(shù)中越接近2分，越有可能是癌癥。

第15圖，是表示在IMA?C30?Cu列陣(PBSIIc)上ApoA1峰的質(zhì)譜圖。

第16圖，是表示在IMAC30Cu列陣(PBS4000)上ApoA1峰的質(zhì)譜圖。

【術(shù)語定義】除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語的意義為熟知技藝領(lǐng)域者所習知。下面的參考文獻為熟知技藝者提供一些本發(fā)明所使用的術(shù)語的一般定義：辛格頓(Singleton)等人著，微生物學(xué)與分子生物學(xué)辭典(Dictionary?of?Microbiology?and?Molecular?Biology)(第二版，1994))；沃克(Walker)編著，劍橋科學(xué)與技術(shù)辭典(The?Cambridge?Dictionary?of?Science?and?Technology)(1988年)；里杰(R.Rieger)等人編著，遺傳學(xué)辭典(TheGlossary?of?Genetics)，第5版，Springer?Verlag出版(1991年)；以及哈樂與馬漢(Hale?&?Marhan)著，哈珀科林斯生物學(xué)辭典(The?Harper?Collins?Dictionary?of?Biology)(1991年)。若沒有其它特別說明，本發(fā)明使用的術(shù)語意義闡述如下。

“氣相離子光譜測定儀”是指一種可檢測氣相離子的儀器。氣相離子光譜測定儀包括離子源以提供氣相離子。例如，氣相離子光譜測定儀包括質(zhì)譜儀、離子移動光譜儀以及總離子流檢測器?！皻庀嚯x子光譜測定法”是指利用氣相離子光譜測定儀來檢測氣相離子的方法。

“質(zhì)譜儀”是指可測量代表氣相離子質(zhì)荷比的參數(shù)的氣相離子光譜測定儀。質(zhì)譜儀通常包括離子源和質(zhì)量分析儀。例如，質(zhì)譜儀包括飛行時間質(zhì)譜儀、磁質(zhì)譜儀、四極柱濾質(zhì)器、離子阱分析儀、離子繞行共振質(zhì)譜儀、靜電扇形分析儀以及其混合使用?！百|(zhì)譜分析法”是指利用質(zhì)譜儀來檢測氣相離子方法。

“激光解吸質(zhì)譜儀”是指利用激光能量解吸、揮發(fā)及電離分析物的質(zhì)譜儀。

“多重質(zhì)譜儀”是指任何能夠鑒別或測量兩個連續(xù)階段的基于m/z包括混合離子在內(nèi)的離子的質(zhì)譜儀。該術(shù)語包括帶有兩個質(zhì)量分析儀、能夠鑒別或測量兩個連續(xù)階段的基于m/z的多重空間離子的質(zhì)譜儀。該術(shù)語還包括帶有單個質(zhì)量分析儀、能夠鑒別或測量兩個連續(xù)階段的基于m/z的多重時間離子的質(zhì)譜儀。所述術(shù)語明顯就包括了Qq-TOF質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、離子阱-TOF質(zhì)譜儀、TOF-TOF質(zhì)譜儀、傅立葉變換離子繞行共振質(zhì)譜儀、靜電扇形-磁扇形質(zhì)譜儀，以及它們的混合運用。

“質(zhì)量分析儀”是指包括可測量代表氣相離子質(zhì)荷比的參數(shù)的質(zhì)譜儀的組件部分。在飛行時間質(zhì)譜儀中，質(zhì)量分析儀是包括離子光學(xué)組件、飛行試管以及以離子檢測器。

“離子源”是指可用來提供氣相離子的氣相離子光譜測定儀的組件部分。在一實施例中，離子源經(jīng)過解吸/電離過程來提供離子。這類實施例通常包括探針接口，該接口令探針可檢測到電離能量源(如激光解吸/電離源)，并同時在大氣壓或低于大氣壓情況下與氣相離子光譜測定儀的檢測器進行通訊。

用于解吸/電離固相分析物的電離能量的形式包括例如：(1)激光能量；(2)高速運行的原子(用在高速運行原子的轟擊)；(3)經(jīng)放射性原子核的β衰退產(chǎn)生的高能量粒子(用在血漿解吸)；以及(4)產(chǎn)生二次離子的主離子(用在二次離子質(zhì)譜儀)。用于固相分析物的電離能量的優(yōu)選形式是激光(用在激光解吸/電離中)，尤其是氮激光、Nd-Yag激光及其它脈沖激光源?！澳芰鳌笔侵競鬟f每單位面積被偵測的影像需要的能量。高能流的源頭，例如激光，將傳遞大約1mJ/mm2至50mJ/mm2。具體來說，將樣本置于探針表面上，探針與充滿有電離能量的探針借口電性結(jié)合。該能量將分析物分子自表面解吸到氣相中去并電離這些處于氣相中的離子。

用于分析物的其它形式的電離能量包括，例如：(1)可電離氣相中性物質(zhì)的電子；(2)強電場，以誘導(dǎo)氣相、固相或液相中性物質(zhì)發(fā)生電離；以及(3)對中性化學(xué)物質(zhì)施以電離粒子或電場以誘導(dǎo)氣相、固相或液相中性物質(zhì)發(fā)生化學(xué)電離的源頭。

“固體支撐物”是指可以本身帶有或涂敷有捕獲試劑的固態(tài)物質(zhì)。該固體支撐物的例子包括探針、微量滴定盤和色譜分析樹脂。

本發(fā)明全文提到的“探針”是指適用于經(jīng)氣相離子光譜測定儀(如質(zhì)譜儀)的探針接口結(jié)合作用后令分析物充有電離能量并傳送到氣相離子光譜儀(如質(zhì)譜儀)中去的裝置。該“探針”通常包括由樣本組成的固體基材(可以是柔韌的，也可以是堅硬的)，該樣本呈現(xiàn)給分析物的表面將暴露于電離能量的源頭。

“表面強化激光解吸/電離”或“SELDI”是指在解吸/電離氣相離子光譜測定法(如質(zhì)譜分析法)的其中一種方法，在這種方法中，在SELDI探針的表面捕獲分析物，而SELDI探針是與氣相離子光譜測定儀(如質(zhì)譜儀)的探針接口電性結(jié)合。在“SELDI質(zhì)譜”中，該氣相離子光譜測定儀是質(zhì)譜儀。SELDI技術(shù)在例如美國專利US5719060(由Hutchens和Yip申請)和美國專利US6225047(由Hutchens和Yip申請)都有描述。

“表面強化親和性捕獲”或“SEAC”包括使用表面有吸附作用的探針(“SEAC探針”)的SELDI方法。“吸附表面”是指涂覆有吸附劑(也稱之為“捕獲試劑”或“親和試劑”)的表面。吸附劑是任何可以結(jié)合分析物(如目標靶向物多肽或核酸)的材料?！吧V吸附劑”是指特別用于色譜法的材料。例如，該色譜吸附劑包括離子交換材料、金屬螯合物(如次氨基乙酸、亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯合物、厭水吸附劑、親水吸附劑、染料、單生物分子(如核甘酸、氨基酸、單分子葡萄糖和脂肪酸)以及混合形式吸附劑(如厭水吸引/靜電排斥吸附劑)?！吧锾匦晕絼笔侵赴ɡ绾怂岱肿?如寡核甘酸)、多肽、多糖、脂質(zhì)、類固醇或它們的軛合物(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白質(zhì)軛合物)這些生物分子的吸附劑。在某些實施例中，該生物特性吸附劑可以是大分子結(jié)構(gòu)，例如多蛋白復(fù)合體、生物細胞膜或病毒。生物特性吸附劑的例子還包括抗體、受體蛋白質(zhì)以及核酸。生物特性吸附劑對于一種靶向分析物來說，比色譜吸附劑有更高的特異性。在美國專利US6225047(Hutchens?and?Yip，“Use?ofretentate?chromatography?to?generate?difference?maps，”May?1，2001)還可發(fā)現(xiàn)用于SELDI的吸附劑。

在一些實施例中，SEAC探針提供的表面具有預(yù)活化功能，可經(jīng)修飾后成為可供選擇的吸附劑。例如，某些探針中含有能夠通過共價鍵結(jié)合生物分子的活性部分。環(huán)氧化物和碳化二亞胺這類活性物質(zhì)可共價結(jié)合例如抗體或細胞受體的生物特性吸收劑。

“吸收”是指分析物以非共價結(jié)合方式結(jié)合到吸收劑或捕獲劑的過程，且該過程是可檢測到的。

“表面強化凈解吸(Surface-Enhanced?NeatDesorption)”或“SEND”是使用表面化學(xué)結(jié)合有能量吸附分子的探針(稱為“SEND探針”)的SELDI方法?！澳芰课椒肿?Energy?absorbing?molecules)”(“EAM”)是指能夠從激光解吸/電離源吸收能量并且與其接觸的分析物分子發(fā)生解吸和電離的分子。該術(shù)語包括用于MALDI的分子，有時候指的是“基質(zhì)”，具體來說包括肉桂酸衍生物、芥子酸(“SPA”)、氰基-羥基-肉桂酸(“CHCA”)以及二羥基苯甲酸、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、羥基乙酮衍生物等等。還包括用在SELDI中的能量吸附分子EAM。還可在美國專利號US5719060和于2002年9月4日申請的美國專利申請?zhí)朥S60/408255(Kitagawa，“Monomers?AndPolymers?Having?Energy?Absorbing?Moieties?Of?Use?InDesorption/Ionization?Of?Analytes”)這兩個專利文件中見到有描述SEND。

“表面強化光敏附著和釋放(Surface-EnhancedPhotolabile?Attachment?and?Release)”或“SEPAR”是指使用表面附著有可共價結(jié)合分析物并且經(jīng)光照(如激光光照)后不耐光共價鍵斷裂而釋放出該分析物的探針的SELDI方法。在美國專利US5719060中可見到對SEPAR進一步描述。

“洗脫劑”或“清洗液”是指試劑，尤指溶液，其用于影響或改變分析物吸附到吸收劑表面的吸附能力及/或從該表面移去未參與結(jié)合的材料。洗脫劑的洗脫性能依pH值、離子強度、厭水性、水分子構(gòu)造破壞程度(chaotropism)程度、清洗劑強度和溫度而定。

“分析物”是指希望檢測到的任何樣本組分。既可以是樣本中單一組分也可以是多個組分。

吸收到親和捕獲性探針的吸附表面上樣本的“多樣性”是指吸收到的蛋白質(zhì)種類各種各樣。

“分子結(jié)合對”和“特異性結(jié)合對”是指分子對，尤指具有特異性結(jié)合性質(zhì)的生物分子對。若無其它限制，分子結(jié)合對包括受體和配位體、抗體和抗原、生物素蛋白和抗生物素蛋白、生物素蛋白和鏈球菌抗生物素蛋白。

“檢測”是指記錄連續(xù)變化參數(shù)的變化過程。

“生物芯片”是指平面黏附有吸附劑的固體基材。有時，生物芯片的表面由數(shù)個可尋址位置組成，每個可尋址位置結(jié)合有吸附劑。生物芯片還可適用于與探針接口電性結(jié)合，這樣就具有探針的功能。

“蛋白質(zhì)生物芯片”是指用于捕獲多肽的生物芯片。在本領(lǐng)域內(nèi)已揭示了一些蛋白質(zhì)生物芯片。例如，由Ciphergen?Biosystems公司(Fremont，CA)、PackardBioScience?Company(Meriden?CT)、Zyomyx公司(Harward，CA)和Phylos公司(Lexington，MA)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)生物芯片。這些蛋白質(zhì)生物芯片在下面幾個專利授權(quán)文件或?qū)＠暾埼募杏嘘U述：美國專利US6225047(Hutchens?and?Yip，“Use?of?retentate?chromatography?togenerate?difference?maps，”May?1，2001)；國際專利WO99/51773(Kuimelis?and?Wagner，“Addres?sable?proteinarrays，”O(jiān)ctober?14，1999)；美國專利US6329209(Wagneret?al.，“Arrays?of?protein-capture?agents?and?methods?of?usethereof，”December?11，2001)以及國際專利WO00/56934(Englert?et?al.，“Continuous?porous?matrix?arrays，”September?28，2000)。

由Ciphergen?Biosystems公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)生物芯片包括表面于可尋址位置上附著有色譜或生物特性的吸附劑。該公司的產(chǎn)品品牌Ciphergen?ProteinChip列陣包括NP20、H4、H50、SAX-2、WCX-2、CM-10、IMAC-3、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、IMAC-40、PS-20和PG-20型號。這些蛋白質(zhì)生物芯片是條狀鋁質(zhì)基材。條狀表面涂覆有二氧化硅物質(zhì)。

以NP-20生物芯片為例，二氧化硅是作為捕獲親水性蛋白質(zhì)的親水性吸收劑來使用。

H4、H50、SAX-2、Q-10、WCX-2、CM-10、IMAC-3、IMAC-30、PS-10和PS-20生物芯片還包括以水凝膠形式存在的經(jīng)功能化且經(jīng)交聯(lián)的聚合物，該聚合物以物理方式附著在生物芯片表面上或通過硅烷以共價鍵化學(xué)結(jié)合方式附著在生物芯片表面上。H4生物芯片含有異丙基官能團以供厭水結(jié)合。H50生物芯片含有壬基苯氧基-聚乙二醇異丁烯酸酯以供憎水結(jié)合。SAX-2生物芯片含有季銨鹽官能團以供陰離子交換。WCX-2和CM-10生物芯片含有羧酸鹽官能團以供陽離子交換。IMAC-3和IMAC-30生物芯片含有可通過螯合作用吸收過渡金屬離子(如Cu2+和Ni2+)的次氨基乙酸官能團。這些固定化金屬離子可通過協(xié)同結(jié)合作用吸收縮氨酸和蛋白質(zhì)。PS-10生物芯片含有可與蛋白質(zhì)上的官能團反應(yīng)以供共價鍵結(jié)合的carboimidizole官能團。PS-10生物芯片含有的環(huán)氧功能基團會與蛋白質(zhì)發(fā)生共價鍵結(jié)合反應(yīng)。PS系列生物芯片對于將生物特性吸收劑(如抗體、受體、凝集素、肝素、蛋白質(zhì)A、生物素/鏈球菌抗生物素等等)結(jié)合到芯片表面是很有用處的，在芯片表面上這些吸附劑自樣本特異性地捕獲分析物。PG-20生物芯片是將蛋白質(zhì)G附著在PS-20芯片上的生物芯片。LSAX-30(陰離子交換)、LWCX-30(陽離子交換)以及IMAC-40(金屬鰲合物)生物芯片的表面含有功能性乳膠粒子。這些生物芯片在以下專利中有進一步描述：國際專利WO00/66265(Rich?et?al.，“Probes?for?a?Gas?Phase?IonSpectrometer，”November?9，2000)；國際專利WO00/67293(Beecher?et?al.，“Sample?Holder?with?Hydrophobic?Coatingfor?Gas?Phase?Mass?Spectrometer，”November?9，2000)；美國專利US20030032043A1(Pohl?and?Papanu，“Latex?BasedAdsorbent?Chip，”July?16，2002)以及美國專利US60/350110(Um?et?al.，“Hydrophobic?Surface?Chip，”November?8，2001)。

分析物被捕獲到生物芯片上之后，它們可由許多檢測方法檢測到，這些方法包括氣相離子光譜分析法、光學(xué)方法、電化學(xué)分析法、原子顯微鏡法和無線頻率分析法。這里將采用氣相離子光譜分析法。尤為感興趣的是質(zhì)譜分析方法、尤其SELDI方法的使用。光學(xué)方法包括，例如，檢測熒光、發(fā)光、化學(xué)熒光、吸光率、反射比、透光度、雙折射率或折射率的方法(如表面電漿共振法、橢偏術(shù)、共鳴鏡法、光柵耦合器波導(dǎo)方法或干涉量度分析法)。光學(xué)方法還包括顯微鏡法(共焦或不共焦)、呈像方法和非呈像方法。不同形式的免疫試驗法(如酶聯(lián)免疫吸附測試法ELISA)是檢測被捕獲在固態(tài)物質(zhì)上的分析物的比較流行的方法之一者。電化學(xué)分析法包括伏安法和電流分析法。無線頻率分析法包括多極共振光譜分析法。

“測量”術(shù)語的意思是包括檢測樣本中是否存在生物標記、樣本中生物標記的數(shù)量及/或評定生物標記類型在內(nèi)的方法。測量可以由本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法完成，而且這些方法將會在下面有進一步描述，其包括(但不僅限于)SELDI法和免疫試驗法?？捎糜诎l(fā)現(xiàn)并測量本文所述的至少一種生物標記的任何方法都是適合的方法。這些方法包括，但不僅限于，質(zhì)譜分析法(如激光解吸/電離質(zhì)譜分析法)、熒光分析法(如三明治式免疫分析法)、表面電漿共振法、橢偏術(shù)以及原子顯微鏡分析方法。

“差異呈現(xiàn)”是指取自患有癌癥病人樣本中的生物標記呈現(xiàn)的數(shù)量及/或頻率較參照物的差異。例如，IAIH4片段與參照物樣本相比，呈現(xiàn)于患有卵巢癌病人樣本中的水平提高。相反，所述的ApoA1和甲狀腺素運輸?shù)鞍着c參照物樣本相比，呈現(xiàn)于患有卵巢癌病人樣本中的水平降低。而且，生物標記也可以是，與參照物樣本相比、呈現(xiàn)于患有卵巢癌病人樣本中頻率更高或更低兩種情況都有的多肽。生物標記在數(shù)量、頻率或兩者兼有的方面有差異呈現(xiàn)的現(xiàn)象。

如果兩個樣本中其中一種樣本中的多肽的數(shù)量與另一種樣本中的多肽有明顯差異時，則稱多肽是差異呈現(xiàn)。例如，如果兩個樣本中其中一種樣本的多肽比另一種樣本的多肽呈現(xiàn)數(shù)量多至少大約120％、至少大約130％、至少大約150％、至少大約180％、至少大約200％、至少大約300％、至少大約500％、至少大約700％、至少大約900％或至少大約1000％，或者如果在其中一種樣本中可發(fā)現(xiàn)而在另一種樣本中不可發(fā)現(xiàn)，則稱多肽是差異呈現(xiàn)。

除此之外，如果兩組樣本中其中發(fā)現(xiàn)患有卵巢癌病人的一組樣本中的多肽的頻率與另一組參照樣本中的多肽的頻率明顯更高或更低時，則稱多肽是差異呈現(xiàn)。例如，如果兩組樣本中其中一組樣本的多肽比另一組樣本的多肽發(fā)現(xiàn)頻率高于或低于至少大約120％、至少大約130％、至少大約150％、至少大約180％、至少大約200％、至少大約300％、至少大約500％、至少大約700％、至少大約900％或至少大約1000％，則稱多肽是差異呈現(xiàn)。

“診斷”是指確定是否呈現(xiàn)例如卵巢癌這類病理狀況或確定這類病理狀況的性質(zhì)。各種診斷方法的靈敏度和特異性都有所不同。診斷試驗的“靈敏度”是測試出陽性的疾病個體的百分數(shù)(“真陽性”的百分數(shù))。未被試驗發(fā)現(xiàn)的疾病個體是“假陰性”。未患疾病的受驗者若在試驗中測試出陰性，則稱為“真陰性”。診斷試驗的“特異性”是指假陽性比率的倒數(shù)，其中“假陽性”比率被定義為測試出陽性的未患病的比率。如果特定診斷方法可能沒有提供狀況的確定診斷結(jié)果，但只要能幫助診斷做出有意義的指示，那么這種方法就已很滿意了。

生物標記的“試驗量”是指呈現(xiàn)在被測試的樣本中該生物標記的數(shù)量。試驗量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。

生物標記的“診斷量”是指診斷出卵巢癌的受體樣本中該生物標記的數(shù)量。診斷量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。

生物標記的“參照量”可以是將與生物標記的試驗量作對比的任何數(shù)量或數(shù)量范圍。例如，生物標記的參照量可以是未患有卵巢癌人體內(nèi)生物標記的數(shù)量。參照量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。

“抗體”是指多肽配位體，該配位體實質(zhì)上經(jīng)過一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼，該基因?qū)?a href='/zhuanli/list-13532-1.html' target='_blank'>門結(jié)合和識別抗原物質(zhì)的表位(如抗原)。被識別的免疫球蛋白基因包括kappa(κ)和lambda(λ)輕鏈恒定區(qū)基因，α、γ、μ、δ、ε重鏈恒定區(qū)基因，??以及多種免疫球蛋白可變區(qū)基因?？贵w的存在形式例如包括以完整的免疫球蛋白的形式或以經(jīng)不同肽酶消化而產(chǎn)生的各種特征片段的形式。例如Fab’和F(ab)’2片段。所述的“抗體”還包括整個抗體經(jīng)修飾后產(chǎn)生的抗體片段或那些重新運用重組DNA方法合成的抗體片段。還包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或單株抗體。Fc區(qū)抗體是指包含至少一種重鏈恒定區(qū)(如CH1、CH2、CH3)的那一部分免疫球蛋白重鏈，而不包括重鏈可變區(qū)部分。

“指導(dǎo)受體治療”是指接下去指導(dǎo)臨床醫(yī)師或主治醫(yī)師判斷卵巢癌狀態(tài)的行為。例如，如果采用本發(fā)明的方法得到的結(jié)果是不確定的，或者存在還需要對狀態(tài)進行確認的情況，主治醫(yī)師可能就會要求安排更多的測試。除此之外，如果狀態(tài)表明進行手術(shù)是恰當?shù)模髦吾t(yī)師就會安排病人動手術(shù)。再者，如果狀態(tài)是否定的，如晚期卵巢癌，或如果狀態(tài)表明是急性的，那么就不需要采取進一步的行動。而且，如果結(jié)果表明治療是成功的話，那么這種指導(dǎo)也將不需要了。

【具體實施方式】本發(fā)明提供的生物標記是通過對比來自診斷有卵巢癌病人的蛋白質(zhì)指紋譜圖和來自不患有已知腫瘤疾病病人的蛋白質(zhì)指紋譜圖、采用ProteinChipBiomarker?System(由Ciphergen?Biosystems，Inc.，F(xiàn)remont，CA提供)而得到。并對這些生物標記以及其它已知卵巢癌標記一起單獨或多元可預(yù)測性模式進行評價。尤其，實驗表明這些生物標記(單獨使用或最好結(jié)合這些生物標記中其它生物標記使用或結(jié)合其它診斷試驗方法)提供一種判斷受體中卵巢癌狀態(tài)的新穎方法。

將生物信息工具有效運用到高產(chǎn)量蛋白質(zhì)構(gòu)型判定上提供了一種篩選癌癥標記的有用方法。簡言之，本發(fā)明使用的系統(tǒng)運用SELDI(表面強化激光解吸/電離，SurfaceEnhanced?Laser?Desorption/Ionization)技術(shù)并利用ProteinChipArray色譜儀對樣本進行測試。結(jié)合到該列陣的蛋白質(zhì)在ProteinChipReader(一種飛行時間質(zhì)譜儀)中讀取。

生物標記(或稱為“標記”)是一種有機生物分子，該生物分子區(qū)別呈現(xiàn)在取自一種顯型狀態(tài)(如患有疾病)受體的樣本中和取自另一種顯型狀態(tài)(如不患有疾病)受體的樣本中。如果經(jīng)統(tǒng)計計算顯示不同群組中的生物標記的平均表達水平有明顯差別，則表示生物標記在不同顯型狀態(tài)之間是區(qū)別呈現(xiàn)的。用于統(tǒng)計學(xué)意義的普通測試方法包括t-試驗、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和優(yōu)勢率。單獨使用或結(jié)合使用生物標記提供測量受體是屬于一種顯型狀態(tài)還是其它一種顯型狀態(tài)這種具有相對風險的方法。因此，它們作為標記對于藥物(治療診斷學(xué)上)和藥物毒性在疾病(診斷)、治療有效性的判斷上是很有用的。

本發(fā)明基于蛋白質(zhì)標記在患有卵巢癌病人的樣本中與在參照受體的樣本中是區(qū)別呈現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，并將該發(fā)現(xiàn)運用在用于判斷卵巢癌狀態(tài)的方法和儀器中。這些蛋白質(zhì)標記在取自卵巢癌病人的樣本中被發(fā)現(xiàn)的水平不用于取自人體癌癥不可發(fā)現(xiàn)到的婦女體內(nèi)的樣本中。如此一來，與參照物對照，在測試樣本中發(fā)現(xiàn)到的至少一種標記的數(shù)量，或者在測試樣本中是否存在至少一種標記，對判斷病人卵巢癌狀態(tài)提供非常有用的信息。

I.生物標記的描述A.載脂蛋白APOLIPOPROTEIN?A1用于本發(fā)明所述方法的標記的其中一種實施例是載脂蛋白A1，這里用“ApoA1”指代。ApoA1可通過質(zhì)譜分析法在m/z為28043峰位置處(標記XXIV)識別出來。所述的標記的質(zhì)量在按照SELDI質(zhì)譜技術(shù)所測定的規(guī)定數(shù)值得0.15％范圍內(nèi)都被認為是準確的。相應(yīng)地，還可在28055m/z峰位置處識別出ApoA1。

ApoA1按照所述方法的程序通過分餾血液來發(fā)現(xiàn)，然后施以IMAC芯片、由SELDI方法測定。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶消化后視作載脂蛋白A1。在下面的實施例中將界定分離和確定ApoA1的操作程序。在患有某一階段的卵巢癌病人體內(nèi)ApoA1的數(shù)量會下降。因此，與正常狀態(tài)的參照物相比，缺乏ApoA1或ApoA1的數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)意義上下降都是與卵巢癌狀態(tài)有關(guān)。統(tǒng)計學(xué)意義上下降是在本領(lǐng)域內(nèi)都已知的概念，例如p值低于0.05。

本發(fā)明的優(yōu)選方法包括使用ApoA1的經(jīng)修飾后的形式。經(jīng)修飾的ApoA1可能包括轉(zhuǎn)譯后加成各種不同的化學(xué)基團，例如糖基化、脂化、半胱氨?；约肮入赘孰幕幕鶊F。

經(jīng)修飾的ApoA1尤為優(yōu)選實施例是峰位置處于29977.4處(標記XXV)的ApoA1。經(jīng)修飾的ApoA1峰是上述ApoA1質(zhì)譜峰上的肩峰。其它優(yōu)選的經(jīng)修飾的ApoA1形式是峰位置處于m/z為28262、28472、28692、28844以及29031處。第15圖和第16圖是表示經(jīng)修飾的ApoA1生物標記的封位置的質(zhì)譜圖。

B.甲狀腺素運輸?shù)鞍?transthyretin)可用于本發(fā)明方法的標記的另一實施例包括前白蛋白形式，這里以”甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10”指代。甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10可通過質(zhì)譜分析法在m/z為12870.9峰位置處識別出來。甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10按照所述方法的程序通過分餾血液來發(fā)現(xiàn)，然后施以IMAC芯片、由SELDI方法測定。通過免疫沉淀法和串聯(lián)質(zhì)譜分析法分析后，發(fā)現(xiàn)提純的蛋白質(zhì)截去以N為端點的十個氨基酸之前白蛋白截斷形式(這里以”甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10”指代)。在下面的實施例中將界定分離和確定甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的操作程序。在患有某一階段的卵巢癌病人體內(nèi)甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的數(shù)量會下調(diào)。因此，與正常狀態(tài)的參照物相比，缺乏甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10或甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)意義上下降都是與卵巢癌狀態(tài)有關(guān)。

所述的本發(fā)明中采用甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10。然而，天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?理論質(zhì)量為13761或13767道爾頓)也同樣適用于本發(fā)明中。除此之外，本發(fā)明的優(yōu)選方法包括使用甲狀腺素運輸?shù)鞍椎慕?jīng)修飾的形式。其中包括轉(zhuǎn)譯后加成各種不同的化學(xué)基團，例如糖基化、脂化、半胱氨?；?、磺化、CysGly經(jīng)修飾的以及谷胱甘肽化的基團。

經(jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍子葹閮?yōu)選實施例是半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?峰位置處于m/z為13890.8或13888道爾頓)。第8圖是表示甲狀腺素運輸?shù)鞍捉?jīng)還原反應(yīng)和烷基化反應(yīng)之后質(zhì)譜圖中峰的變化，表明甲狀腺素運輸?shù)鞍走_成半胱氨?；＝?jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎牧硪挥葹閮?yōu)選實施例是谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?峰位置處于m/z為14086.9或14093道爾頓)。經(jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎牧硪粌?yōu)選實施例是磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?峰位置處于m/z為13850道爾頓)。經(jīng)修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎倪€一優(yōu)選實施例是CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?峰位置處于m/z為13944道爾頓)。

第6圖是表示截斷形式(甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10)、未經(jīng)修飾的、半胱氨酰化以及谷胱甘肽化的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎南鄬Ψ宓拇笮?。如?圖所示，與其它癌癥及不患癌癥的參照物相比，患有卵巢癌病人體內(nèi)截斷形式(甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10)、未經(jīng)修飾的、半胱氨酰化以及谷胱甘肽化的甲狀腺素運輸?shù)鞍拙档?p＜0.001)。

C.IAIH4片段可用于本發(fā)明方法的標記的另一實施例世間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4的裂解片段，這里用”IAIH4片段”、“ITIH4片段”及/或PK120片段指代。在一優(yōu)選實施例中，IAIH4片段是選自IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。在一更佳實施例中，“IAIH4片段”這一類術(shù)語包括IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的任意一者。

IAIH4片段No.1可通過質(zhì)譜分析法在m/z為12870.9峰位置處識別出來。IAIH4片段No.1按照所述方法的程序通過分餾血液來發(fā)現(xiàn)，然后施以IMAC芯片、由SELDI方法測定。該譜峰是自卵巢癌病人血清、經(jīng)一系列色層分析分離技術(shù)純化得到的。其序列確定為MNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ???????????????IDNO：1)，是人類間-α-胰蛋白酶抑制因子片段具660-689個氨基酸長度，即重鏈H4(用IAIH4、ITIH4或PK120指代)。該結(jié)果是以胃蛋白酶消化該標記后分析其產(chǎn)物而確定的。在患有某一階段的卵巢癌病人體內(nèi)，IAIH4片段No.1數(shù)量會上調(diào)。因此，與正常參照物對比，IAIH4片段No.1的出現(xiàn)或IAIH4片段No.1數(shù)量上升都將與卵巢癌狀態(tài)進行關(guān)聯(lián)。

用抗體對IAIH4進行SELDI免疫試驗，其結(jié)果可用于確定某一階段卵巢癌中數(shù)量上升的IAIH4片段。已通過此方法確定了幾個這樣的片段，其中兩個通過統(tǒng)計方法顯示卵巢癌與非卵巢癌之間存在明顯差異(請參閱第5圖)。IAIH4片段No.2的序列確定為FRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ?ID?NO：2)，其包括了IAIH4片段No.1中除前面兩個氨基酸殘基的所有氨基酸殘基。IAIH4片段No.2是通過質(zhì)譜分析法在m/z為3031峰位置處識別出來的。IAIH4片段No.3的序列確定為RPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ?????????????IDNO：3)，其包括了IAIH4片段No.1中除前面三個氨基酸殘基的所有氨基酸殘基。IAIH4片段No.3是通過質(zhì)譜分析法在m/z為2884峰位置處識別出來的。正如IAIH4片段No.1那樣，患有某一階段卵巢癌病人體內(nèi)IAIH4片段No.1及No.2數(shù)量會上調(diào)。因此，與正常參照物對比，IAIH4?No.1或No.2片段的出現(xiàn)或IAIH4?No.1或No.2片段數(shù)量上升都將與卵巢癌狀態(tài)進行關(guān)聯(lián)。

除此之外，本發(fā)明的優(yōu)選方法還包括使用IAIH4片段的經(jīng)修飾的形式。其包括轉(zhuǎn)譯后加成各種不同的化學(xué)基團，例如糖基化、脂化、半胱氨?；约肮入赘孰幕幕鶊F。

D.其它被發(fā)現(xiàn)的卵巢癌標記于pH4與pH9沖提出的區(qū)分物種，亦確認出其它與卵巢癌疾病狀態(tài)有關(guān)的生物標記。于pH4區(qū)分物中，與該些生物標記相對應(yīng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，是以于SELDI蛋白質(zhì)芯片/質(zhì)譜中的譜峰強度代表，該些生物標記中心分子量如下數(shù)值：數(shù)據(jù)組1

數(shù)據(jù)組2

于pH9區(qū)分物中，與該些生物標記相對應(yīng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，是以于SELDI蛋白質(zhì)芯片/質(zhì)譜中的譜峰強度代表，該些生物標記中心分子量如下數(shù)值：

數(shù)據(jù)組3

標記I至XLVIII生物標記的質(zhì)量在由SELDI質(zhì)譜儀測得的規(guī)定數(shù)值的0.15％范圍內(nèi)都被認為是精確的。

如上所述，標記I至XLVIII還可用與吸收劑的親和力為表征，尤其是在下面會講述到的“蛋白質(zhì)芯片分析方法的實施例的一般性評價”指定的條件下與固定化鰲合物(IMAC)-Cu基材表面結(jié)合能力。

E.已知卵巢癌標記本發(fā)明的某些實施例也采用已知卵巢癌生物標記結(jié)合使用至少一種選自由ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的標記的方式。這里“標記4”是用以指代已知卵巢癌標記。用作“標記4”的標記包括(但不僅限于)CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl?TN、半乳糖轉(zhuǎn)移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon?NB?70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質(zhì)變異體(如裂解形式、異構(gòu)形式)。

與正常受驗者對比，血液中這些標記的數(shù)值水平存在差別，基于這一事實，這些標記對于診斷卵巢癌是很有用的。例如，已知CA125在卵巢癌婦女血液中會提高。類似地，已知CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、抑制素(inhibin)、PLAP及其它在卵巢癌婦女血液中亦會提高。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例所采用的方法中，至少一種已知標記(標記4)與至少一種選自ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的標記結(jié)合使用。

F.生物標記的經(jīng)修飾的形式的使用試驗發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)常以各和不同的形式存在于樣本中，而它們的質(zhì)量均不同。這些形式經(jīng)轉(zhuǎn)譯前后的經(jīng)修飾的而得。轉(zhuǎn)譯前經(jīng)修飾的形式包括等位變體、切片變體以及RNA編輯形式。轉(zhuǎn)譯后經(jīng)修飾的形式包括經(jīng)截斷、蛋白水解裂片(如母蛋白質(zhì)的片段)、糖基化、脂化、半胱氨酰化以及谷胱甘肽化、磷酸化、異戊二烯基化、酰胺化、乙酰化、甲基化、硫酸化、磺化、羥基化、十四烷酰化、法尼基化(farnesylation)、氧化、泛素華化(ubiqutination)的形式。包括指定蛋白質(zhì)及其所有經(jīng)修飾的形式在內(nèi)的蛋白質(zhì)集合本文用“蛋白質(zhì)群”來指代。特異性蛋白質(zhì)的所有經(jīng)修飾的形式的集合(不包括指定蛋白質(zhì)本身)本文用“經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)群”來指代。本發(fā)明的任何生物標記的經(jīng)修飾的形式也都可以用作生物標記。在某些情況下，經(jīng)修飾的形式比本文提出的指定形式顯示出更強的診斷能力。

經(jīng)修飾的生物標記最初可經(jīng)任何能夠從生物標記中發(fā)現(xiàn)并識別經(jīng)修飾的生物標記的方法發(fā)現(xiàn)。初步發(fā)現(xiàn)的優(yōu)選方法包括起初采用諸如生物特異性捕獲試劑來捕獲生物標記及經(jīng)修飾的生物標記，然后通過質(zhì)譜儀檢測被捕獲到的蛋白質(zhì)分子。詳而言之，捕獲蛋白質(zhì)所使用到的生物特異性捕獲試劑包括可識別生物標記及經(jīng)修飾的生物標記的抗體、寡核甘酸配基或親和體。而且這種方法還捕獲了蛋白質(zhì)相互作用物，該蛋白質(zhì)相互作用物結(jié)合了蛋白質(zhì)或可經(jīng)抗體識別出來，而且本身可以是生物標記。優(yōu)選地，生物特異性捕獲試劑與固態(tài)物質(zhì)結(jié)合。然后，采用SELDI質(zhì)譜技術(shù)檢測被捕獲到的蛋白質(zhì)，或從捕獲試劑洗提蛋白質(zhì)后，采用傳統(tǒng)的MALDI或SELDI技術(shù)檢測被洗提的蛋白質(zhì)。由于質(zhì)譜分析法可以區(qū)別并量化基于質(zhì)量差異的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，而無須作標簽，這樣使用質(zhì)譜分析法就尤其吸引人。

優(yōu)選地，生物特異性捕獲試劑被結(jié)合到諸如珠粒、平皿、薄膜、或芯片這類固態(tài)物質(zhì)上。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)之人士已熟知如何將諸如抗體這類生物標記結(jié)合到固態(tài)物質(zhì)上的方法。例如，可采用具有雙官能團的結(jié)合試劑，或者該固態(tài)物質(zhì)可經(jīng)諸如環(huán)氧化物或碳化二亞胺這類活性基團衍生而得，當這種固態(tài)物質(zhì)與分子接觸時即可發(fā)生結(jié)合。生物特異性捕獲試劑可在同一位置與各種不同的靶向蛋白質(zhì)混合，或者也可以在不同身體或可尋址的位置結(jié)合到固態(tài)物質(zhì)上去。例如，可用經(jīng)衍生的珠粒填充復(fù)數(shù)個色譜柱中，每個色譜柱只能捕獲單種蛋白質(zhì)群?；蛘撸捎酶鞣N不同的經(jīng)捕獲試劑衍生而來的珠粒填充單個色譜柱，這樣在單個位置處就捕獲了所有分析物。相應(yīng)地，諸如采用Luminex儀器(由Austin，TX提供)的xMAP技術(shù)這類經(jīng)抗體衍生而來的以珠粒為載體的技術(shù)可用于檢測蛋白質(zhì)群。然而，生物特異性捕獲試劑必須是特異性地針對蛋白質(zhì)群中各個成員，以區(qū)分它們。

在另一實施例中，生物芯片表面既可在同一位置處、也可在不同身體可尋址的位置處經(jīng)捕獲試劑捕獲蛋白質(zhì)群衍生而得。在不同的可尋址的位置處捕獲不同蛋白質(zhì)群的一個優(yōu)點是使分析過程變得簡化。

識別經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)并與有相關(guān)聯(lián)的臨床參數(shù)相關(guān)聯(lián)的后，該經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)可在本發(fā)明所述的任一方法中用作生物標記。從這一點講，通過包括親和捕獲后采用質(zhì)譜分析法、或特異性針對經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)免疫試驗法在內(nèi)的任意指定檢測方法即可完成對經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的檢測。免疫試驗法要求諸如抗體的生物特異性捕獲試劑去捕獲分析物。而且，該試驗方法必須要被設(shè)計為特異性區(qū)分蛋白質(zhì)和經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。例如，可通過三明治試驗法來達成這一目的，在該方法中，一種抗體捕獲多于一種形式的蛋白質(zhì)，而且清楚地區(qū)分抗體、特異性地結(jié)合以及提供各種形式蛋白質(zhì)的檢測。還可通過對動物用生物分子免疫來制得抗體。本發(fā)明采用的傳統(tǒng)免疫試驗法包括諸如ELISA或基于熒光的免疫試驗法以及其它酶免疫試驗法在內(nèi)的三明治免疫試驗法。

II.測試樣本A.受驗者類型樣本從想要確定卵巢癌狀態(tài)的婦女受驗者體內(nèi)采集而得。這些受驗者可能是根據(jù)她們的家族史已經(jīng)確診為患有高危卵巢癌的婦女。而其它患有卵巢癌的婦女測試將用于判斷治療效果。而且，還包括接受作為例行檢查一部分的測試的健康婦女，或是建立生物標記的基線數(shù)據(jù)庫。樣本可能是從已經(jīng)確診為患有卵巢癌且接受了消除或緩解癌癥的婦女體內(nèi)采集而得。

B.樣本類型及樣本制備可以用各種不同的生物樣本類型來測試標記。樣本優(yōu)選地是生物液體樣本。例如，可用于本發(fā)明的生物液體樣本包括血液、血清、血漿、陰道分泌物、尿液、淚液、唾液等等。由于所有標記都是在血清中發(fā)現(xiàn)的，所以血清是本發(fā)明實施例中優(yōu)選樣本來源。

若需要，對樣本進行制備以增加標記可檢出率。例如，為了增加標記可檢出率，取自受驗者體內(nèi)的血清樣本最好通過如汽巴克隆(Cibacron)藍色瓊脂糖色層分析與單股DNA親和性色層分析、陰離子交換樹脂、親和性色層分析(如與抗體)以及類似者的方法進行區(qū)分。區(qū)分方法視所用檢測方法而定。任何能增加感興趣蛋白質(zhì)的方法都可以被采用。是否進行樣本制備，如前區(qū)分，是可加以選擇的，根據(jù)所使用的檢測方法的不同，樣本可能不需要制備成有利于增加標記的可檢出率。例如，如果使用專門結(jié)合標記的抗體來檢測樣本中的標記，那么就無需制備樣本了。

典型地，樣本制備過程包括樣本區(qū)分以及收集用于探測是否含有生物標記的區(qū)分物。前區(qū)分方法包括例如，尺寸排斥色層分析法、離子交換色層分析法、甘肅色層分析法、親和性色層分析法、連續(xù)萃取法、凝膠電泳法與液相色層分析法。檢測前分析物亦可能會經(jīng)過經(jīng)修飾的。例如，分析前自血液中除去如白蛋白這類高數(shù)量蛋白質(zhì)是有用的。區(qū)分方法舉例于PCT/US03/00531(已引入此全文以供參考)中有說明。

優(yōu)選地，樣本是以陰離子交換樹脂進行前區(qū)分。陰離子交換色層分析法允許粗略地依照它們電荷特性進行樣本中蛋白質(zhì)前區(qū)分。例如，采用Q陰離子交換樹脂(如Biosepra公司的QHyperDF)，而且樣本能用具不同pH值得洗提液連續(xù)沖提。陰離子交換色層分析法允許樣本中具更多負電荷的生物分子從其它類型生物分子分離出來。以高pH洗提液沖提的蛋白質(zhì)可能是弱負電荷，而以低pH洗提液沖提的區(qū)分物中蛋白質(zhì)可能是強負電荷。因此，除降低樣本多樣性外，陰離子交換色層分析法是依照它們結(jié)合的特性將蛋白質(zhì)分離的。

在優(yōu)選實施例中，血清樣本是以陰離子色層分析法做區(qū)分。高數(shù)量蛋白質(zhì)對較低數(shù)量蛋白質(zhì)訊號的抑制是對SELDI質(zhì)譜法重要的挑戰(zhàn)。樣本區(qū)分降低了每一區(qū)分物組成的多樣性。這種方法也可用于試圖將高數(shù)量蛋白質(zhì)分離至一區(qū)分物中，從而降低對較低數(shù)量蛋白質(zhì)的訊號抑制。陰離子交換區(qū)分通過等電點(pl)分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是由具兩性電荷氨基酸組成，蛋白質(zhì)電荷受其曝露環(huán)境的pH而改變。蛋白質(zhì)等電點是指蛋白質(zhì)無凈電荷處的pH值。當環(huán)境的pH等于蛋白質(zhì)等電點時，則認為蛋白質(zhì)為在中性。當pH高于蛋白質(zhì)等電點時，則認為該蛋白質(zhì)具凈負電荷。當環(huán)境pH低于蛋白質(zhì)等電點時，則認為該蛋白質(zhì)具凈正電荷。血清樣本是依照以下實施例提出的操作步驟做區(qū)分，以獲得本發(fā)明所述的標記。

蛋白質(zhì)為陰離子交換樹脂捕獲后，以一系列于pH9、pH7、pH5、pH4、pH3清洗方式?jīng)_提。通過三個區(qū)分物(pH9、pH4及有機溶劑)的圖形數(shù)據(jù)的單一化最大分離性分析(Unified?Maximum?Separability?Analysis，UMSA)方法發(fā)現(xiàn)一組三種潛在生物標記。pH4區(qū)分物于m/z12828與28043這兩個譜峰，在癌癥組群中皆向下調(diào)整；第三個標記是pH9流洗出的區(qū)分物中，位于m/z3272的譜峰，其譜峰強度于癌癥組群眾向上調(diào)整。所有區(qū)分物皆結(jié)合至固定化金屬親和性色層分析列陣，該列陣具銅離子電荷(IMAC3-Cu)(請參閱第1圖中的光譜圖)。

樣本中生物分子也能經(jīng)高解析電泳分離，如一維或二維凝膠電泳。含有標記的區(qū)分物能通過氣相離子光譜法分離并進一步分析。優(yōu)選地，可采用二維凝膠電泳產(chǎn)生包括至少一種標記的二維生物分子點列陣。請參閱如Jungblut&?Thided，Mass?Spectr.Rev.16：145-162(1997)。

二維凝膠電泳可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)已知方法來實施。例如見德意志(Deutscher)編著，酶學(xué)方法(MethodsIn?Enzymology)第182卷。典型地，樣本中生物分子是以猶如等電聚焦方式分離，此方式中樣本中生物分子以pH梯度分離，直至生物分子達到凈電荷為零(亦即等電點)為止。這第一個分離步驟產(chǎn)生了一維生物分子列陣。該一維列陣中生物分子進一步與第一個分離步驟所用技術(shù)通常有所區(qū)別的技術(shù)進行分離。例如，于第二維中，??以等電聚焦方式分離的生物分子復(fù)采用聚丙烯酰胺膠體進行分離，諸如在十二烷基硫酸鈉(SDS-PAGE)存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳法。SDS-PAGE凝膠允許基于生物分子的分子量進行進一步分離。典型地，二維凝膠電泳能在復(fù)合混合物中化學(xué)性分離分子量范圍1000至200000道爾頓的不同生物分子。該些凝膠的等電點范圍約3-10(屬于寬范圍凝膠)。

二維列陣中的生物分子能以本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)熟知的適合方法進行檢測。例如，將凝膠中生物分子做標記或染色(如考馬斯藍或銀染色)。如果凝膠電泳法產(chǎn)生相等于本發(fā)明的至少一種標記分子量的色點，則該色點可通過氣相離子光譜法做進一步分析?；蛘撸赏ㄟ^施加一電場將含有生物分子的凝膠轉(zhuǎn)移至鈍化膜上。然后膜上約相等于該標記分子量的色點可通過氣相離子光譜法進行分析。在氣相離子光譜法中，色點可通過任何適合技術(shù)，諸如本文所述的MALDI或SELDI(例如使用ProteinChip列陣)進行分析。

進行氣相離子光譜法分析前，還需要將色點中生物分子用諸如蛋白酶(如胰蛋白酶)的切割劑切割成較小片斷。生物分子被切割成這樣小的片段以供色點中該生物分子的質(zhì)量指紋，若需要，該指紋能用于判別標記。

高效液相層析法(HPLC)也可基于生物分子不同的物理性質(zhì)如極性、電荷及大小，將分離樣本中生物分子混合物分離。HPLC儀器通常由流動相儲罐、泵、注射器、分離柱及檢測器組成。樣本中生物分子通過注射等分試樣至分離柱而進行分離。混合物中不同的生物分子，由于在分離柱中移動相與固定相間分布行為的差異，是以不同速度通過分離柱。故能收集相等于至少一種標記的分子量及/或物理性質(zhì)的區(qū)分物。區(qū)分物可通過氣相離子光譜法檢測標記而加以分析。例如，色點可通過如此處所述的MALDI或SELDI(例如使用ProteinChip列陣)進行分析。

或可供選擇地，標記在分析之前先經(jīng)經(jīng)修飾的以提高其解析力或判別力。例如，標記在分析前經(jīng)蛋白質(zhì)分解消化。任何蛋白酶都適用。可能將標記切割成不連續(xù)數(shù)目片斷的蛋白酶，諸如胰蛋白酶，特別有用。消化產(chǎn)生的片段可作為標記指紋，這樣使得間接檢測該標記成為可能。當有類似分子量的標記也許會與還未確認的標記混淆時，標記指紋尤為有用。而且，蛋白質(zhì)分解片斷對高分子量標記也有用處，因為較小標記較易通過質(zhì)譜法解析。在另一實施例中，生物分子可經(jīng)經(jīng)修飾的以提高檢測解析力。例如，可用神經(jīng)胺糖酸酶(neuraminidase)自糖蛋白移除末端唾液酸(sialicacid)殘基，以改善對陰離子吸附劑(如陽離子交換ProteinChip列陣)的結(jié)合作用，以及改善檢測解析力。另一實施例中，標記可通過黏附特異性結(jié)合分子標記，又可識別標記的特定分子量標記進行經(jīng)修飾的?；蚩蛇x擇地，檢測該經(jīng)經(jīng)修飾的的標記后，該標記還可通過匹配蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(如SwissProt)中經(jīng)修飾的標記的物理和化學(xué)特征來進一步得到確定。

III.標記捕獲最好用可被固定至固體支撐物(諸如本文所述的任何生物芯片、多格微滴定盤或樹脂)的捕獲劑來捕獲生物標記。尤其本發(fā)明的生物標記是用SELDI蛋白質(zhì)生物芯片捕獲。捕獲是發(fā)生于色層分析表面或生物特異性表面。任何包括反應(yīng)性表面的SELDI蛋白質(zhì)生物芯片皆可用于捕獲與檢測本發(fā)明的生物標記。然而，本發(fā)明的生物標記是結(jié)合至固定化金屬螯合物上。IMAC-3和IMAC-30生物芯片，其次氨基乙酸官能團可通過螯合作用吸收過渡金屬離子(如Cu2+和Ni2+)，是本發(fā)明用于捕獲生物標記的優(yōu)選SELDI生物芯片。任何包括反應(yīng)性表面的SELDI蛋白質(zhì)生物芯片皆可用于捕獲和檢測本發(fā)明的生物標記。這些生物芯片能以特異性捕獲生物標記的抗體進行衍生，或者以結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G捕獲劑進行衍生。然后生物標記可為適用特異性抗體的溶液捕獲，同時該該已捕獲的標記通過由捕獲劑自生物芯片上分離出來。

通常，含有諸如血清的生物標記樣本是放置于生物芯片的活性表面上，以俾使有充分時間進行結(jié)合。然后，未結(jié)合的分子用適合的沖提劑諸如磷酸鹽緩沖液自該表面沖提出來。通常，該沖提劑離子力越強，則該蛋白質(zhì)必須結(jié)合得越緊，俾使沖提后蛋白質(zhì)仍留在該表面上。此時滯留的蛋白質(zhì)生物標記能以適合的方式進行檢測。

IV.標記檢測與測定一旦諸如生物芯片或抗體的基質(zhì)捕獲到標記，則可用任何適合方法測定樣本中的標記。例如，可能各種方法包括例如氣相離子光譜法、光學(xué)法、電化學(xué)法、原子力顯微鏡法以及射頻法檢測及/或測定標記。使用這些方法可檢測至少一種標記。

A.SELDI一種檢測及/或測定生物標記的優(yōu)選方法是使用質(zhì)譜法，尤其是″表面強化激光解吸/電離″或″SELDI″。SELDI是指在解吸/電離氣相離子光譜測定法(如質(zhì)譜分析法)的其中一種方法，在這種方法中，在SELDI探針的表面捕獲分析物，而SELDI探針是與氣相離子光譜測定儀(如質(zhì)譜儀)的探針接口電性結(jié)合。在“SELDI質(zhì)譜”中，該氣相離子光譜測定儀是質(zhì)譜儀。以上使較詳細地敘述SELDI技術(shù)。ApoA1、六種形式的經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的檢出譜峰分別位于m/z約28043(或28055)；m/z約29977.4，28262，28473，28692，28844，29031；m/z約12870.9，m/z約13761或13767；m/z約13890.8或13888；m/z約13850；m/z約13944；m/z約14086.9或14093；m/z約3272；m/z約3031；以及m/z約2884。

B.免疫試驗法在另一實施例中，可采用免疫試驗法進行檢測和分析樣本中的標記。該方法包括：(a)提供特異性結(jié)合標記的抗體；(b)將樣本與抗體接觸；以及(c)檢測樣本中結(jié)合有標記的抗體復(fù)合體是否存在。

免疫試驗法是一種用抗體特異性結(jié)合抗原(如標記)的測試方法。其特征是使用特定抗體特異性結(jié)合特性，進行抗原的分離、定標及/或定量。當涉及蛋白質(zhì)或肽時，″特異性(或選擇性)結(jié)合″至抗體或″具特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)性″術(shù)語，是指于蛋白質(zhì)與其它生物分子的異種分布中決定該蛋白質(zhì)存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，自指定的免疫試驗法條件下，特定的抗體至少結(jié)合特定蛋白質(zhì)兩次，且對樣本中其它蛋白質(zhì)無顯著量地充分結(jié)合。與抗體在這種條件下特異性結(jié)合需要選擇專門針對特定蛋白質(zhì)的抗體。例如，選擇自特定物種如大白鼠、老鼠或人類的標記培養(yǎng)的多株抗體，以得到那些只對該標記并不對其它蛋白質(zhì)(除該標記的多晶變異體和對偶基因外)具特異性免疫反應(yīng)性的多株抗體。這一選擇可能需要通過排除與其它物種中標記分子進行交互反應(yīng)的抗體而獲得。

通過使用經(jīng)純化當標記或其核酸序列，特異性結(jié)合標記的抗體可采用各種本技術(shù)領(lǐng)域已知的適合方法制備。如，請參閱科立根(Coligan)著，免疫學(xué)現(xiàn)代檔案(CurrentProtocols?in?immunology)(1991)；哈洛與蓮(Harlow?&Lane)著，抗體：實驗室手冊(Antibodies：A?LaboratoryManual)(1988)；高丁(Goding)著，單株抗體：原理與應(yīng)用(Monoclonal?Antibodies：Principles?and?Practice)，第二版(1986)；以及科勒與密爾斯丹(Kohler?&Milstein)，Nature256：495-497(1975)。這樣的技術(shù)包括，但不僅限于此，通過選擇噬菌體或類似媒介物中重組抗體資料中的抗體，以進行抗體的制備，以及通過免疫兔或免疫老鼠的方法制備多株與單株抗體(如，請參閱Huse等人，Science246：1275-1281(1989)；Ward等人，Nature341：544-546(1989))。典型來說，特異性或選擇性反應(yīng)將至少高于背景訊號或噪聲兩倍，而更典型地則為高于背景訊號10至100倍。

通常，自受驗者處得到的樣本可與特異性結(jié)合標記的抗體相接觸?；蚩晒┻x擇地，抗體在與樣本接觸前，能被固定至固體支撐物上，以利于沖提與單離該化合物。固體支撐物包括例如微滴定盤、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。抗體亦能黏附于以上所述的探針基質(zhì)或ProteinChip列陣。樣本以取自受驗者的生物學(xué)液體樣本為宜。生物學(xué)液體樣本舉例包括血液、血清、血漿、乳頭分泌物、尿液、淚液、唾液等。在優(yōu)選實施例中，該生物學(xué)液體是由血清組成。樣本接觸抗體之前，可用適當沖洗劑稀釋樣本。

用抗體培養(yǎng)樣本后，清洗該混合物，這樣就可以檢測形成地抗體-標記化合物。此檢測可通過檢測試劑培養(yǎng)該已被清洗的混合物來完成。此檢測試劑可以是例如以可檢測標記標識的第二抗體?？蓹z測標識舉例包括磁珠(如DYNABEADSTM)、螢光染料、放射性標記、酶(如山葵過氧化酶、堿性磷酸酶及其它ELISA常用酶)，以及諸如膠體金、有色玻璃或塑料珠的比色標記?；蛘撸瑯颖局械臉擞浭且蚤g接方法測定，其中，例如具標記的第二抗體被用作檢測被結(jié)合的標記-特異性抗體，及/或競爭或抑制方法中，例如，結(jié)合至該標記的明顯抗原決定基的單株抗體是與該混合物同時培養(yǎng)的。

測定抗體-標記化合物數(shù)量或存在與否的方法包括，例如，螢光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、吸收率、反射率、透光率、雙折射率或折光指數(shù)的檢測(如表面電漿共振、橢偏術(shù)、共鳴鏡法、光柵耦合器波導(dǎo)方法或干涉量度分析法)。光學(xué)方法還包括顯微鏡法(共焦或不共焦)、呈像方法和非呈像方法。電化學(xué)分析法包括伏安法和電流分析法。無線頻率分析法包括多極共振光譜分析法。施行該些分析方法軾本技術(shù)領(lǐng)域已知者。有用的分析方法包括，例如，諸如酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)、放射免疫分析法(radioimmune?assay，RIA)、西方墨點分析法(Western?blot?assay)或長條墨點分析法(slotblotassay)的酶免疫分析法(enzyme?immune?assay，EIA)。該些方法于下列文獻中亦有說明，例如，細胞生物學(xué)方法：細胞生物學(xué)中抗體(Methodsin?Cell?Biology：Antibodies?in?Cell?Biology)，第37卷(阿塞(Asai)編著，1993)；基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)(Basic?and?ClinicalImmunology)(史提特斯與特爾(Stites?&?Terr)編著，第7版，1991)；以及哈洛與蓮的著作(前面已述)。

整個分析方法中，于每一試劑相結(jié)合后需要進行培養(yǎng)及/或清洗步驟。培養(yǎng)步驟自約5秒至幾個小時變化，最好自約5分種至約24個小時。然而，培養(yǎng)時間將視分析方法類型、標記、溶液體積濃度等而定。雖然分析方法可于一溫度范圍如10℃至40℃下施行，但通常該分析方法將于常溫下進行。

免疫分析法可用于判斷樣本種標記存在與否，以及樣本種標記的量?？贵w-標記化合物的量可通過與標準物對比而定。標準物是如已知化合物或已知存在于樣本種的另一種蛋白質(zhì)。如上所述，標記的試驗量無須以絕對單位測定，只要該測定單位可與參照組對比即可。

檢測樣本中該些標記的方法有很多應(yīng)用。例如，至少一種標記可用于幫助人類癌癥診斷或預(yù)后的測定。另一實施例中，標記檢測的方法可用于監(jiān)測受驗者對癌癥治療的反應(yīng)。在一實施例中，檢測標記的方法可用于分析與確認體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)這些標記表現(xiàn)的化合物。在優(yōu)選實施例中，生物標記適用于區(qū)別腫瘤進程的不同階段，以俾于幫助確定適當?shù)寞煼ㄒ约芭袛嘣撃[瘤轉(zhuǎn)移程度。

V.數(shù)據(jù)分析當例如使用質(zhì)譜法測定樣本時，即產(chǎn)生數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)隨后通過計算器軟件程序分析。通常，該軟件是包括可將質(zhì)譜儀訊號轉(zhuǎn)換成計算器可讀形式的編碼。該軟件還包括能將算法運用于判斷訊號是否代表訊號中對應(yīng)于本發(fā)明標記或其它有用標記的″譜峰″位置的訊號分析的編碼。該軟件還包括執(zhí)行比較來自試驗樣本的訊號與″正?！寮叭祟惏┌Y的典型訊號特征以及確定這兩種訊號間符合程度的算法的編碼。該軟件還包括指示試驗樣本最接近哪個特征的編碼，從而提供可能性診斷。

本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，需要測定多種生物標記。使用多種生物標記可提高試驗預(yù)測值得準確度，以及于診斷、毒物學(xué)、病人狀態(tài)及病人監(jiān)控方面提供較大用處。稱為″圖案識別(pattern?recognition)″的過程大大改善了對預(yù)測性藥物的臨床蛋白體的靈敏度與特異性，其中該過程是檢測由多種生物標記形成的圖案。臨床樣本數(shù)據(jù)(例如以SELDI方法測得的)的細微差異顯示蛋白質(zhì)表現(xiàn)的某些圖案可預(yù)測諸如一些疾病存在與否、癌癥進程特定狀態(tài)、或是藥物治療正向或逆向反應(yīng)之類的表現(xiàn)型。

質(zhì)譜法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是由通過如上所述的離子檢測器檢測離子開始的。離子撞擊檢測器，產(chǎn)生由高速時間列陣記錄器所數(shù)字化的電能，該記錄器是數(shù)字化地捕獲仿真訊號。塞弗吉蛋白質(zhì)芯片(Ciphergen′s?ProteinChip)系統(tǒng)采用摹擬對數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)來完成此動作。ADC將檢測器輸出于固定寬度時間間隔整合成與時間有關(guān)的箱型訊號。該時間間隔典型地為一至四納秒(nanosecond)長。再者，最后分析的飛行時間光譜，典型地并不代表來自對樣本離子化能量的單一脈沖訊號，而是來自許多脈沖訊號的總和。這樣就能降低噪音，增加動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)隨后進行數(shù)據(jù)處理。在塞弗吉蛋白質(zhì)芯片軟件中，典型數(shù)據(jù)處理包括TOF對M/Z轉(zhuǎn)換、基線扣除、高頻噪聲過濾。

TOF對M/Z轉(zhuǎn)換包括將飛行時間轉(zhuǎn)換成質(zhì)荷比(M/Z)的算法運用。在此步驟中，訊號從時間相關(guān)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量相關(guān)。亦即，將每一飛行時間轉(zhuǎn)換成質(zhì)量對電荷比，即M/Z。校正是做內(nèi)或外校正。于內(nèi)校正，被分析的樣本包涵至少一種已知M/Z分析物。位于代表這些質(zhì)量分析物的飛行時間的訊號峰被指定為該已知M/Z?；谶@些指定M/Z比值，計算轉(zhuǎn)換飛行時間為M/Z數(shù)學(xué)函數(shù)的參數(shù)。于外校正，將飛行時間轉(zhuǎn)換為M/Z的函數(shù)，諸如以先前內(nèi)校正造出的函數(shù)，以未使用內(nèi)校正物方式應(yīng)用至飛行時間光譜上。

基線扣除是通過消除會干擾光譜的假的、可重復(fù)顯現(xiàn)的儀器偏移量，來改善數(shù)據(jù)定量。其包括使用導(dǎo)入諸如峰寬的參數(shù)的算法以計算光譜基線，然后自質(zhì)譜中扣除該基線。

高頻噪聲訊號是通過平滑函數(shù)除去的。典型平滑函數(shù)是對每一時間相關(guān)箱型訊號應(yīng)用移動平均函數(shù)。于改善版中，移動平均過濾器是可變寬度數(shù)字過濾器，于該過濾器中，過濾器帶寬是隨著諸如譜峰帶寬的函數(shù)而改變，通常隨飛行時間增加而變寬。例如見2000年11月23日申請的國際專利WO00/70648(Gavin?et?al.，“Variable?WidthDigital?Filter?for?Time-of-flight?Mass?Spectrometry”)。

分析通常包括代表來自分析物訊號的光譜譜峰確認。當然，譜峰的選定可通過肉眼來完成。然而，塞弗吉蛋白質(zhì)芯片軟件中一部分程序亦可用于自動檢測譜峰。通常，該程序的功能是識別具訊號對噪聲比大于選定闕值的訊號，并對該譜峰訊號中央的譜峰質(zhì)量做標記。在一有用的應(yīng)用中，比較許多光譜，以確認出現(xiàn)在某些選定比例的質(zhì)譜中的相同譜峰。該軟件的一個版本是將出現(xiàn)于特定質(zhì)量范圍內(nèi)不同光譜的所有譜峰聚集成群，并對靠近該質(zhì)量(M/Z)群的中點的譜峰指定質(zhì)量(M/Z)。

來自至少一個光譜的譜峰數(shù)據(jù)，通過例如制做電子表格來進行進一步分析，在該電子表格中，電子表格每一行代表一特定質(zhì)譜，每一列代表由質(zhì)量定義光譜中的譜峰，且每一單元格包含特定光譜中該譜峰強度。各種統(tǒng)計或圖案辨認方法都可應(yīng)用于數(shù)據(jù)上。

在一實施例中，塞弗吉生物標記式樣TM軟件(Ciphergen′s?Biomarker?PatternsTMSoftware)用于檢測產(chǎn)生的光譜式樣。采用分類模型的式樣辨認處理對數(shù)據(jù)進行分類。通常，該光譜將代表來自至少兩種不同組群(使用分類算法來尋找)的樣本。例如，該組群是病理學(xué)的對非病理學(xué)的(如癌癥對非癌癥)、藥物反應(yīng)對非藥物反應(yīng)、毒性反應(yīng)對非毒性反應(yīng)、疾病狀態(tài)進步者對疾病狀態(tài)非進步者、有表現(xiàn)型情況對無表現(xiàn)型情況。

本發(fā)明實施態(tài)樣中產(chǎn)生的光譜可用分類模型的式樣辨識處理分類。在一些實施例中，源自使用諸如″已知樣本″的樣本產(chǎn)生的光譜(如飛行時間光譜的質(zhì)量光譜)的數(shù)據(jù)可用于″訓(xùn)練″分類模型?！逡阎獦颖尽迨鞘孪确诸?如癌癥或非癌癥)的樣本。來自該光譜且用于形成分類模型的數(shù)據(jù)被稱未″訓(xùn)練數(shù)據(jù)組″。一經(jīng)訓(xùn)練，該分類模型可識別來自用未知樣本產(chǎn)生的光譜的數(shù)據(jù)類型。然后分類模型可用于將未知樣本分類。例如，造預(yù)測特定生物學(xué)樣本是否與某一生物學(xué)狀況(如疾病對非疾病)相關(guān)時，分類模型是很有用的。

用于形成分類模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組應(yīng)包括天然數(shù)據(jù)或預(yù)處理數(shù)據(jù)。造一些實施例中，天然數(shù)據(jù)可直接從飛行時間光譜或質(zhì)譜得到，然后以任何適當方式進行選擇性″預(yù)處理″。例如，可選擇大于預(yù)定訊號對噪聲比的訊號，以便于選擇光譜中譜峰子集，而不是選擇光譜中所有譜峰。在另一實施例中，在普通數(shù)值(如飛行時間數(shù)值或質(zhì)量對電荷比數(shù)值)的預(yù)定數(shù)目譜峰″群組″可用于選擇譜峰。舉例來說，如果給定質(zhì)量對電荷比的譜峰少于質(zhì)譜群組中該質(zhì)譜的50％，那么該質(zhì)量對電荷比的譜峰可自訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中省略。諸如這些的預(yù)處理步驟可用于減少用于訓(xùn)練分類模型數(shù)據(jù)的數(shù)量。

分類模型可用任何適當且試圖將數(shù)據(jù)主體基于數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)的目標參數(shù)而分隔成組的統(tǒng)計分類(或″學(xué)習″)方法來形成。分類方法可以是監(jiān)督式或非監(jiān)督式。監(jiān)督式與非監(jiān)督式分類處理例子于Jain著作″統(tǒng)計式樣識別：回顧(Statistical?Pattern?Recognitin：A?Review)″，類型分析的IEEE處理與機械智能，第22卷，1期，2000年1月中有說明，此處以其完整資料引用作為參考。

于監(jiān)督式分類中，含有已知種類例子的訓(xùn)練數(shù)據(jù)是呈現(xiàn)于學(xué)習機制中，即學(xué)習多于一組定義每一已知類別的關(guān)系。然后新數(shù)據(jù)被應(yīng)用于該學(xué)習機制中，該學(xué)習機制然后用學(xué)到的關(guān)系分類新數(shù)據(jù)。監(jiān)督式分類處理舉例包括線性回歸處理(如多重線性回歸(multiple?linearre?gression，MLR)、部份最小平方回歸(partial?least?squaresreg?ression，PLS)與主成分回歸(principle?components?regression，PCR))、二元決策樹(binary?decisi?on?trees)(如遞歸分布處理(recursive?portioning?processs)，如分類及回歸樹(CART))、類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial?neural?networks)如倒傳遞網(wǎng)絡(luò)(backpropagation?networks)、辨別分析(如貝斯分類器(Bayesian?classifier)或費舍分析(Fisheranalysis))、邏輯分類器以及支持向量分類器(supportvector?classifier)(支持向量機(support?vector?machine))。

優(yōu)選監(jiān)督式分類方法是遞歸分布處理。遞歸分布處理使用遞歸分布樹分類來自未知樣本的光譜。關(guān)于遞歸分布處理進一步詳細內(nèi)容在美國專利US20020138208A1(Paulse?et?al.，“分析質(zhì)譜方法(Method?for?analyzing?massspectra)，”2002年9月26日)中有提供。

在其它實施例中，制做出的分類模型可用非監(jiān)督式學(xué)習方法形成。非監(jiān)督式分類試圖以訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中的相似性為基礎(chǔ)學(xué)習分類，其中無須預(yù)先分類來自訓(xùn)練數(shù)據(jù)組的光譜。非監(jiān)督式學(xué)習方法包括群集分析。群集分析是試圖將數(shù)據(jù)分成理想上應(yīng)有彼此非常相似而又對其它群集成員非常不相似的″群集″或群組。相似性是用一些測量數(shù)據(jù)組間距離的距離尺度來測定，并且將彼此靠近的數(shù)據(jù)組集合起來。群集技術(shù)包括MacQueen?K-平均值算法與Kohonen自我組織網(wǎng)絡(luò)(SelfOrganizing?Map)算法。

主張學(xué)習算法用于分類生物學(xué)訊息在例如國際專利WO01/31580(Barnhill等人，″確認生物學(xué)系統(tǒng)中式樣的方法與裝置及其使用方法(Methods?and?devices?foridentifying?patterns?in?biological?systems?and?methods?ofuse?thereof)″，2001年5月3日)；美國專利US2002/0193950A1(Gavin等人，″質(zhì)譜方法或分析(Method?or?analyzing?mass?spectra)″，2002年12月19日)；美國專利US2003/0004402A1(Hitt等人，″以自生物學(xué)數(shù)據(jù)隱藏式樣為基礎(chǔ)的生物學(xué)轉(zhuǎn)臺間識別處理(Process?for?discriminating?between?biological?statesbased?on?hidden?patterns?from?biological?data)″，2003年1月2日)；以及美國專利US2003/0055615A1(張與張，″處理生物學(xué)表現(xiàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)與方法(Systems?andmethods?for?processing?biological?expression?data)″，2003年3月20日)。

詳而言之，為得到生物標記ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍滓约癐AIH4片段，將癌癥病人與健康參照物的樣本譜峰強度數(shù)據(jù)當作″發(fā)現(xiàn)組″。將該數(shù)據(jù)合并并隨意分成訓(xùn)練組與試驗組，用單一最大分離分析(Unified?MaximumSeparability?Analysis，USMA)分類器的非線性版建立并試驗多變量預(yù)測模型。USMA分類器詳細內(nèi)容于美國專利US2003/0055615A1中有敘述。

通常，自上面部分IV產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是被放入診斷算法(亦即如上所述的分類算法)中。以學(xué)習算法為基礎(chǔ)，然后產(chǎn)生分類算法。該過程包括發(fā)展能夠產(chǎn)生分類算法的算法。本發(fā)明的方法是基于統(tǒng)計樣本計算，通過增加足夠數(shù)目的一些卵巢癌與正常樣本產(chǎn)生更精確的分類算法。在學(xué)習算法中，該樣本是作為數(shù)據(jù)訓(xùn)練組。

該分類的產(chǎn)生，亦即診斷、演算，是依賴于用于分析樣本亦即產(chǎn)生前述部分IV得到的數(shù)據(jù)的分析操作。用于檢測及/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟務(wù)必與用于獲得發(fā)展該分類演算的數(shù)據(jù)相同。必須在整個訓(xùn)練和分類系統(tǒng)中保持不變的測試分析條件包括芯片類型與質(zhì)譜儀參數(shù)，以及一般樣本制備與試驗操作步驟。如果檢測及標記/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟改變了，則該學(xué)習演算與分類演算也必須改變。類似地，如果學(xué)習演算與分類演算改變，則檢測及標記/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟也必須改變，俾使與用于產(chǎn)生分類演算的操作步驟一致。發(fā)展新的分類演算模型需要引入足夠數(shù)目的卵巢癌與正常樣本，以新的檢測操作步驟為基礎(chǔ)發(fā)展新的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組，用該數(shù)據(jù)產(chǎn)生新的分類演算，最后用多點(multi-site)研究驗證該分類演算。

分類模型可在任何適當?shù)臄?shù)字計算器上建立并使用。適當?shù)臄?shù)字計算器包括使用任何標準或特殊操作系統(tǒng)如Unix、Windows?TM或LinuxTM基本操作系統(tǒng)的微、迷你或大型計算器。所使用的數(shù)字計算器在實體上可能與用于制造有興趣光譜的質(zhì)譜儀分開，也可能與質(zhì)譜儀連用。如果數(shù)字計算器與質(zhì)譜儀是分開的，則數(shù)據(jù)必須通過一些其它方式(不管人工或自動化)輸入計算器中。

依照本發(fā)明實施例的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組與分類模型可通過數(shù)字計算器執(zhí)行的計算器代碼使其具體化。該計算器代碼可存放于任何適當?shù)挠嬎闫骺勺x媒介包括光盤或磁盤、棒、磁帶等，并能以任何適當計算器程序語言包括C、C++、visual?basic等寫成。

VI.優(yōu)選實施例在優(yōu)選實施例中，自病人體內(nèi)收集血清樣本，然后采用上述說明的陰離子交換樹脂區(qū)分。用IMAC銅蛋白質(zhì)芯片列陣捕獲樣本中生物標記。在這一測試中能檢測到ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。然后將結(jié)果輸入計算器系統(tǒng)中，該系統(tǒng)包含有的算法是以與用于學(xué)習演算與分類演算來進行初始判斷生物標記的相同參數(shù)進行設(shè)計。該算法基于接受到的與每個生物標記都相關(guān)的數(shù)據(jù)而產(chǎn)生診斷。

在尤其優(yōu)選實施例中，也要檢測CA125II生物標記的數(shù)量，而且也是通過使用諸如免疫分析法的已知方法或使用SELDI蛋白質(zhì)芯片列陣來進行檢測的。在這些實施例中，CA125II標記結(jié)果亦是輸入至計算器演算中，用于準備診斷?；贏poA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、IAIH4片段No.1以及CA125II這四種生物標記的檢測的診斷試驗，至少有約80％的特異性。

通過用生物標記發(fā)展的分類演算檢查自SELDI試驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)來判定診斷。該分類演算是依賴于用于檢測該生物標記自懷疑試驗操作步驟的特點。這些特點包括例如，樣本制備、芯片類型以及質(zhì)譜儀參數(shù)。如果該試驗參數(shù)有改變，則該演算必須改變。同樣地，如果該演算改變，則該試驗操作步驟亦必須改變。

另一實施例中，自病人體內(nèi)收集血清樣本。采用上述說明的抗體蛋白質(zhì)芯片列陣來捕獲生物標記。用生物特異性SELDI測試系統(tǒng)來檢測該標記。在這一測試中能檢測到ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。然后將結(jié)果輸入計算器系統(tǒng)中，該系統(tǒng)包含有的算法是以與用于學(xué)習演算與分類演算來進行初始判斷生物標記的相同參數(shù)進行設(shè)計。該算法基于接受到的與每個生物標記都相關(guān)的數(shù)據(jù)而產(chǎn)生診斷。

在其它優(yōu)選實施例中，以非SELDI方式捕獲與試驗標記。于一實施例中，自病人體內(nèi)收集血清樣本。采用其它已知方法如抗體對標記在基質(zhì)上捕獲生物標記。用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知方法如光學(xué)法與折射指數(shù)法來檢測該標記。光學(xué)法實例包括例如ELISA的螢光檢測。折射指數(shù)法實例包括表面電漿共振。然后對標記結(jié)果進行演算，該演算可能需要亦可能不需要人工智能。該算法基于接受到的與每個生物標記都相關(guān)的數(shù)據(jù)而產(chǎn)生診斷。

上述任何方法中，自樣本獲得的數(shù)據(jù)可直接自該檢測方法輸入至具診斷演算的計算器中。或者，獲得的數(shù)據(jù)以人工方式，或通過自動化方式，輸入至具診斷演算的個別計算器中。

VII.受驗者診斷及卵巢癌狀態(tài)的確定任何生物標記各自對卵巢癌狀態(tài)的確定都有幫助。首先，在受驗者樣本中使用此處所述的方法，如先在SELDI生物芯片上捕獲然后用質(zhì)譜法檢測，來測定被選擇的生物標記。然后，用該測量結(jié)果與以區(qū)別卵巢癌狀態(tài)與非癌癥狀態(tài)的診斷量或參照組相比較。該診斷量將反應(yīng)這樣的訊息：與非癌癥狀態(tài)比較，癌癥狀態(tài)中個別生物標記是上調(diào)或下調(diào)。如本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)所習知的，該使用的特定診斷量須加以調(diào)節(jié)以提高診斷分析法(是依照診斷醫(yī)師喜好采用)的靈敏度與特異性。這樣，與該診斷量對照的試驗量便顯示出卵巢癌狀態(tài)。

當各自生物標記是為有用的診斷標記時，發(fā)現(xiàn)生物標記組合提供了比單一生物標記更大的預(yù)測價值。尤其，樣本中多個標記的檢測提高了真陽性與真陰性診斷的百分比，并會降低假陽性或假陰性診斷的百分比。如此一來，本發(fā)明的優(yōu)選方法是測定多于一個的生物標記。例如，本發(fā)明方法ROC分析中，其AUC大于0.50，更佳方法的AUC大于0.60，而更優(yōu)方法的AUC大于0.70。特優(yōu)方法AUC大于0.70，而最佳方法AU?C大于0.80。

再者，使用本發(fā)明三個優(yōu)選標記與諸如CA125的標記4組合在一起進行測定的方法大大改善了該CA125的診斷效果，提供AUC大于0.50的試驗，AUC大于0.60的優(yōu)選試驗，AUC大于0.70的更優(yōu)選試驗。

為了使用組合生物標記，邏輯回歸演算是有用的。UMSA演算對于自試驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生診斷演算尤為有用。該演算于下列文獻中有揭露：Z.Zhang等人，將分類分離分析方法應(yīng)用于微列陣數(shù)據(jù)中(Applying?classificationseparability?analysis?to?microarray?data)；Lin?SM，JohnsonKF編著，微列陣數(shù)據(jù)分析方法(Methods?of?Microarray?dataanalysis)：CAMDA’00報告，波士頓Kluwer學(xué)術(shù)出版社，2001：125-136；以及Z.Zhang等人，釣魚探險-從表現(xiàn)圖譜概略萃取式樣的監(jiān)督式方法(Fishing?Expedition-aSupervised?Approach?to?Extract?Patterns?from?aCompendium?of?Expression?Profiles；Lin?SM，Johnson?KF編著，微列陣數(shù)據(jù)分析方法II：CAMDA’01報告，波士頓Kluwer學(xué)術(shù)出版社，2002。

學(xué)習演算將產(chǎn)生多變量分類(診斷)演算，并調(diào)成操作者期望的特定特異性與靈敏度。然后該分類演算可用于確定卵巢癌狀態(tài)。該方法還包括測定受驗者樣本中被選定的生物標記(如ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍住AIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3)。這些測量提供給分類演算。該分類演算產(chǎn)生指示卵巢癌狀態(tài)的指示器分數(shù)。

在一些實施例中，在未對標記定量的情況下，少量出現(xiàn)標記或不出現(xiàn)標記是有用的，而且可以與卵巢癌的可能性診斷相關(guān)聯(lián)。例如，卵巢癌病人中檢測到IAIH4片段的頻率比正常受驗者高。同樣地，例如，卵巢癌病人中檢測到生物標記ApoA1與甲狀腺素運輸?shù)鞍椎念l率比正常受驗者低。因此，分別檢測到受驗者被發(fā)現(xiàn)存在或不存在表明該受驗者有患卵巢癌的較高可能性。

其它實施例中，標記的測量包括定量標記，以關(guān)聯(lián)標記檢測結(jié)果與卵巢癌的可能性診斷。因此，如果受驗者體內(nèi)被檢測到的標記數(shù)量與參照組數(shù)量比較有差異(亦即比參照組高或低，視該標記而定)，則該受驗者有患卵巢癌的較高可能性。

該關(guān)聯(lián)性需要考慮比較樣本中該(些)標記量與該(些)標記參照量(該(些)標記向上或向下調(diào)節(jié))(例如，正常者無法檢測到癌癥)。參照量可以是例如為未檢測到癌癥的正常受驗者的可比樣本中出現(xiàn)標記量的平均或中位數(shù)。該參照量是在該試驗量測定相同或?qū)嵸|(zhì)上類似的實驗條件下測定的。該相關(guān)性須考慮試驗樣本中該標記存在與否，以及參照組中該相同標記檢測頻率。該相關(guān)性須考慮這兩者因素以助于確定卵巢癌狀態(tài)。

在某些評定卵巢癌狀態(tài)的方法實施例中，該方法還包括基于該狀態(tài)的指導(dǎo)受驗者治療。如前所述，這種指導(dǎo)描述的是醫(yī)師或臨床醫(yī)師在對確定卵巢癌狀態(tài)之后采取的行動。例如，如果本發(fā)明方法的結(jié)果無法下結(jié)論或有理由認為確認狀態(tài)是必須的，則醫(yī)師必須安排更多試驗。或者，如果該狀態(tài)表明動手術(shù)是適當?shù)?，則醫(yī)師必須安排病人動手術(shù)。其它舉例，病人必須接受化學(xué)治療或放射性療法，以替代或輔助手術(shù)療法。同樣地，如果該結(jié)果是負面的，例如該狀態(tài)顯示卵巢癌晚期或如果該狀態(tài)為急性，則無須采取進一步動作。再者，如果該結(jié)果顯示已成功治愈，則無須進一步安排了。

本發(fā)明還提供受驗者安排治療方法后再次測定生物標記(或生物標記的特定組合)的方法。在這些例子中，該方法是用于監(jiān)視癌癥狀態(tài)，例如對癌癥治療的反應(yīng)、疾病減緩或疾病進展程度由于這些方法容易操作以及缺乏侵入性，因此病人接受每一治療后，可重復(fù)使用這些方法。這樣就允許醫(yī)師監(jiān)視治療過程的效果。如果結(jié)果顯示治療無效，則處理過程應(yīng)做相應(yīng)變化。這使得醫(yī)師可以彈性選擇治療方法。

另一實施例中，用于檢測標記的方法可被用于分析及識別調(diào)節(jié)體內(nèi)或體外該些標記表現(xiàn)的化合物。

本發(fā)明的方法亦有其它應(yīng)用。例如，該標記可用于篩選調(diào)節(jié)體內(nèi)或體外標記表現(xiàn)的化合物，其中該化合物反過來對治療或避免病人卵巢癌很有用處。另一實施例中，該標記可用于監(jiān)測對卵巢癌治療的反應(yīng)。又一實施例中，該標記可用于遺傳研究以決定是否該受驗者有發(fā)展成卵巢癌的風險。例如，某些標記可能在基因上是相關(guān)聯(lián)的。這可以通過例如分析患有卵巢癌家族病史的卵巢癌病人群樣本而定。該結(jié)果然后可與例如自無卵巢癌家族病史的卵巢癌病人得到的數(shù)據(jù)加以比較。基因上相關(guān)聯(lián)的標記可作為判斷有卵巢癌家族病史的受驗者是否有卵巢癌傾向的工具。

本發(fā)明的另外一些實施例是有關(guān)于將分析結(jié)果或診斷結(jié)果或兩者傳達給技術(shù)專家、醫(yī)師或病人。在某些實施例中，計算器被用作將分析結(jié)果或診斷結(jié)果或兩者傳達給相關(guān)群體如醫(yī)師及其病人的工具。在一些實施例中，做試驗或分析出試驗結(jié)果所在的國家或司法系統(tǒng)與將該試驗結(jié)果或診斷結(jié)果被傳達給的國家或司法系統(tǒng)會不同。

本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，基于在試驗受驗者中是否存在本發(fā)明的任何生物標記的診斷結(jié)果一旦獲得就應(yīng)盡快傳達給該受驗者。該診斷結(jié)果可能是通過受驗者的治療醫(yī)師傳達給該受驗者。或者，該診斷結(jié)果是通過郵件發(fā)送給試驗受驗者或通過電話傳達給受驗者。計算器可用于通過郵件或電話傳達診斷結(jié)果。在某些實施例中，含有診斷測試結(jié)果的訊息被產(chǎn)生并使用計算器硬件與軟件結(jié)合自動傳遞給熟悉通訊技術(shù)的受驗者。一健康導(dǎo)向的通訊系統(tǒng)的例子在美國專利US6283761中有描述；然而，本發(fā)明并不僅限于利用這種特殊通訊系統(tǒng)。在本發(fā)明的方法的某些實施例中，所有或一些方法步驟，包括樣本的分析、疾病的診斷以及測試結(jié)果或診斷結(jié)果的傳達可在不同(如國外)司法系統(tǒng)進行。

VIII.試劑盒在又一實施方面中，本發(fā)明提供用于評定卵巢癌狀態(tài)的試劑盒，其中該試劑盒可用于測定本發(fā)明標記。例如，該試劑盒可用于測定任何至少一種此處所述的標記，該標記在卵巢癌病人者與正常受驗者樣本中出現(xiàn)有差異。本發(fā)明的試劑盒有許多應(yīng)用。例如，該試劑盒可用作區(qū)別受驗者是否有卵巢癌或有陰性診斷，這樣讓醫(yī)師或臨床醫(yī)師診斷是否存在癌癥。在另一實施例中，該試劑盒可用于確認體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)卵巢癌動物模型中至少一種標記表現(xiàn)的化合物。

因此本發(fā)明提供的試劑盒包括(a)結(jié)合選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段NO.3，及其結(jié)合物的生物標記的捕獲試劑；以及(b)包括至少一種生物標記的容器。在優(yōu)選試劑盒中，該捕獲試劑結(jié)合多種生物標記。該捕獲試劑也可能結(jié)合至少一種已知生物標記，標記4，如CA125。在某些優(yōu)選實施例中，試驗試劑盒還包括第二捕獲試劑，所述的第二捕獲試劑是結(jié)合第一捕獲試劑不結(jié)合的至少一種生物標記。

本發(fā)明提供的試劑盒還包括(a)結(jié)合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍住AIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)結(jié)合至少一種所述的第一捕獲試劑不結(jié)合的生物標記的第二捕獲試劑。優(yōu)選地，至少一種所述的捕獲試劑是抗體。某些試劑盒進一步包括至少一種捕獲試劑粘附于或可粘附于其上的MS探針。

所述的捕獲試劑可以為任何類型的試劑，以SELDI探針為宜。本發(fā)明的某些試劑盒中，所述的捕獲試劑包括IMAC。

本發(fā)明提供的試劑盒進一步包括(a)結(jié)合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)使用捕獲試劑檢測生物標記的說明書。在某些試劑盒中，該捕獲試劑包括抗體。而且，一些試劑盒進一步包括所述的捕獲試劑粘附于或可粘附于其上的MS探針。一些試劑盒中，所述的捕獲試劑進一步包括IMAC。該三種經(jīng)確認的標記中每一種，本文是結(jié)合至IMAC?ProteinChip列陣。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施例包括早期監(jiān)測卵巢癌的高產(chǎn)量試驗，該試驗分析IMAC?ProteinChip列陣上病人樣本中該三種分析物，以及傳統(tǒng)CA-125ELISA(或該CA-125ELISA被轉(zhuǎn)移至該ProteinChip列陣平臺)。

在其它實施例中，本文所述的試劑盒包括至少一種結(jié)合至少一種選自標記I至XLVIII的捕獲試劑。

本發(fā)明的某些試劑盒進一步包括沖洗溶液，或洗提液，其中所述的試劑盒進一步包括沖洗溶液，沖洗后可選擇性地允許被結(jié)合的生物標記保留于所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被沖洗下來?；蛘撸撛噭┖泻兄苽湓摏_洗溶液的說明書，其中吸附劑與沖洗溶液的組合允許使用氣相離子光譜法測定該些標記。

優(yōu)選地，該試劑盒包括用于監(jiān)測癌癥的試劑盒的使用方法的書面說明書，并提供測試樣本與捕獲試劑接觸及監(jiān)測至少一種保留在該捕獲試劑中的生物標記的操作說明。例如，試劑盒應(yīng)該具有標準操作說明，以告知消費者在血清樣本接觸捕獲試劑后如何清洗捕獲試劑(如探針)。另一實施例中，試劑盒應(yīng)具用于前區(qū)分樣本的指示，以降低該樣本中蛋白質(zhì)的多樣性。另一例中，試劑盒應(yīng)具自動化該區(qū)分步驟或其它程序的說明書。

該些試劑盒可自上述說明的物質(zhì)制備，而前述討論的這些物質(zhì)(如探針基質(zhì)、捕獲試劑、吸附劑、沖洗溶液等)是完全可應(yīng)用至這部分，故將不再重復(fù)敘述。

在另一實施例中，該試劑盒還包括附著有吸附劑(如有吸附劑功能的顆粒)的第一基質(zhì)，以及該第一基質(zhì)能置其上以形成探針的第二基質(zhì)，其中該探針是可移動可插入至氣相離子光譜儀中。其它實施例中，該試劑盒包括單一基質(zhì)，該基質(zhì)是為可移動可插入于該基質(zhì)上的具吸附劑的探針形式。又另一些實施例中，該試劑盒還包括前區(qū)分自旋柱(如汽巴克隆(Cibacron)藍色瓊脂糖柱、抗HAS瓊脂糖柱、K-30尺寸排除柱、Q-陰離子交換自旋柱、單股DNA柱、lectin柱等)。

在另一實施例中，試劑盒包括(a)特異性結(jié)合標記的抗體；以及(b)檢測劑。該試劑盒可自上述物質(zhì)制備，且前述有關(guān)該物質(zhì)(如抗體、檢測劑、固定化支撐物等)的討論是完全可應(yīng)用于這部分，因此將不再重復(fù)說明?？晒┻x擇地，該試劑盒還包括前區(qū)分自旋柱。在一些實施例中，該試劑盒還包括以卷標或獨立插件形式出現(xiàn)的適當操作參數(shù)的說明書。

可供選擇地，該試劑盒還包括標準或參照訊息，以便測試樣本能與參照訊息對比，以判斷樣本中被檢測的標記的試驗量是否與診斷卵巢癌的診斷量一致。

本發(fā)明進一步提供一種制品，包括結(jié)合至少兩種生物標記的至少一種捕獲試劑，所述的捕獲試劑選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。本發(fā)明所述的制品例子包括，但不僅限于，ProteinChip列陣、探針、微滴定盤、珠、試管、微量試管以及任何其它捕獲試劑可附著其上的固態(tài)物質(zhì)。本發(fā)明制品的其它實施例還包括結(jié)合其它已知卵巢癌標記，即標記4，的捕獲試劑。所述的制品的一實施例中，用于實施例的ProteinChip列陣將具捕獲ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4段No.3以及標記4的吸附劑。在尤佳實施例中，標記4是CA125。在另一實施例中，微滴定盤將具可結(jié)合ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍住⒒腔谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及標記4的抗體。這些是該些制品的一些實施例。具本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)一般技能者將根據(jù)此處所述的方法很容易地就可以制造出其它這類制品。

本發(fā)明進一步提供一種系統(tǒng)，包含多種捕獲試劑，每種捕獲試劑結(jié)合至不同生物標記，其中所述的生物標記選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨酰化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍住ysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及至少一種適于標記4種類的標記。這一系統(tǒng)的實施例包括，但不僅限于，一組ProteinChip列陣，該ProteinChip列陣組包括結(jié)合有至少一種生物標記的吸附劑，所述的生物標記是選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍?、谷胱甘肽化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3。所述的系統(tǒng)類型中，每種所述的生物標記具有一種ProteinChip列陣。或者，可供選擇地，多個標記具有一種ProteinChip列陣，其中所述的標記選自ApoA1、經(jīng)修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10、天然甲狀腺素運輸?shù)鞍?、半胱氨?；谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、磺化甲狀腺素運輸?shù)鞍?、CysGly修飾的甲狀腺素運輸?shù)鞍住⒐入赘孰幕谞钕偎剡\輸?shù)鞍?、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及用作CA125的第ProteinChip列陣。其它系統(tǒng)的實施例包括那些捕獲試劑是各自獨立或成群地含有對每一種生物標記都有一種抗體的試管。具本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)一般技能者將根據(jù)此處所述的方法很容易地就可以制造出其它這類制品。

本發(fā)明進一步提供一種篩檢試驗，包括(a)將激肽釋放酶與激肽釋放酶底物以及測試試劑接觸，以及(b)判判斷所述的測試試劑是否調(diào)節(jié)所述的激肽釋放酶活性。在這樣一種測試中，所述的底物是間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4前體。正如下面將要討論的，業(yè)已發(fā)現(xiàn)數(shù)種激肽釋放酶在卵巢癌中存在調(diào)節(jié)障礙問題(dys-regulated)(在Diamandis2002中有評論)。這樣，判斷了激肽釋放酶的活性就顯示了卵巢癌狀態(tài)。在這種方法中，判斷測試試劑是否起到調(diào)節(jié)激肽釋放酶活性的作用的步驟包括測定是否存在IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3或它們的數(shù)量。上述說明測定IAIH4片段的方法可用于該篩選方法中。

IX.篩選分析中用于識別卵巢癌的生物標記本發(fā)明的方法還有其它應(yīng)用。例如，生物標記可用于篩選可調(diào)節(jié)體內(nèi)或體外生物標記的表達的化合物，這使得化合物反過來對治療或阻止病人體內(nèi)的卵巢癌是有用的。在另一實施例中，生物標記可用于監(jiān)測對卵巢癌治療的反應(yīng)。在又另一實施例中，生物標記可用于遺傳研究以決定是否該受驗者有發(fā)展成卵巢癌的風險。

因此，例如，本發(fā)明的試劑盒可包括含有厭水性能的固體底物，比如蛋白質(zhì)生物芯片(如塞弗吉蛋白質(zhì)芯片列陣)以及用于沖洗該底物的緩沖劑，還包括用于測量芯片上本發(fā)明的生物標記以及利用這些測量結(jié)果來診斷卵巢癌的操作步驟的說明書。

適用于治療試驗的化合物最初可通過確認與至少一種本文所列舉的生物標記相互作用的化合物而被篩選出來。例如，篩選過程包括重組地表達本發(fā)明的生物標記、提純該生物標記以及將該生物標記固定于基質(zhì)上。然后測試用的化合物與基質(zhì)接觸，尤其在水性環(huán)境下，測定該測試用的化合物與該生物標記間的相互作用，例如通過測量以鹽濃度為性能的洗提率。某些蛋白質(zhì)可識別并切割至少一種本發(fā)明的生物標記，其中可通過在標準分析中監(jiān)測至少一種生物標記的切片，例如通過蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析方法，來檢測該蛋白質(zhì)。

在有關(guān)實施例中，還測定了測試用的化合物能夠抑制本發(fā)明的至少一種生物標記的能力。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的其中一個技藝是確認用于測定特定生物標記作用的技術(shù)將依該生物標記的功能與性質(zhì)變化而變化。例如，分析生物標記的酶促作用，以供找到一適合基質(zhì)以及該基質(zhì)和反應(yīng)物的表相可以很容易就被測量出來。潛在有治療作用的測試化合物抑制或促進指定生物標記的作用的能力可通過測量存在或不存在該測試化合物下的催化效率而被確定下來。測試化合物干擾非酶促(如結(jié)構(gòu))機能或本發(fā)明的其中一種生物標記的作用的能力亦可被測量出來。例如，可通過存在或不存在測試化合物下分光鏡檢查來監(jiān)測自組裝多重蛋白質(zhì)，其中該多重蛋白質(zhì)是包含本發(fā)明的一種生物標記。或者，如果該生物標記是轉(zhuǎn)錄非酶增強子，則具干擾該生物標記促進轉(zhuǎn)錄能力的測試化合物可通過測量存在或不存在該測試化合物下體內(nèi)或體外的依賴于生物標記的轉(zhuǎn)錄水平而被確定。

將能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明的任何生物標記的測試化合物投入到患有卵巢癌或其它癌癥病人或有發(fā)展成為卵巢癌或其它癌癥風險的病人體內(nèi)。例如，如果體內(nèi)特定生物標記阻止卵巢癌蛋白質(zhì)的堆積，則投入可提高特定生物標記作用的測試化合物可降低病人體內(nèi)卵巢癌發(fā)病風險。相反，如果具增強作用的生物標記是促發(fā)卵巢癌的至少一部分原因，則投入可降低特定生物標記作用的測試化合物可降低病人體內(nèi)卵巢癌發(fā)病風險。

在其它方面的實施例種，本發(fā)明提供一種用于確定化合物是否對治療與經(jīng)修飾的IAIH4的數(shù)量升高有關(guān)的諸如卵巢癌這樣的紊亂有用的方法。例如，在一實施例中，細胞提取或表達庫可被篩選為促進全長IAIH4切割成截斷形式的IAIH4的化合物。在這種篩選分析的一實施例中，可通過將熒光基團黏附到IAIH4上來檢測IAIH4的切割行為，其中當IAIH4沒在切割時，IAIH4是保持熄滅的，而當該蛋白質(zhì)被切割時，IAIH4則發(fā)出熒光。或者可供選擇地，全長IAIH4經(jīng)修飾的以致于使得氨基酸x和y之間的酰胺鍵不可斷裂，這種經(jīng)修飾的IAIH4可被用于選擇性地結(jié)合或″捕獲″在體內(nèi)分裂全長IAIH4處的細胞蛋白酶。篩選和確定蛋白酶及其靶向物在科學(xué)性文獻中已被完整記錄成冊，如Lopez-Ottin等人編著(Nature?Reviews，3：509-519(2002))。

在另一實施例中，本發(fā)明提供一種用于治療或減緩諸如卵巢癌疾病的進展或發(fā)病可能性的方法，該方法伴隨著截斷IAIH4數(shù)量的升高。例如，在至少一種分裂全長IAIH4的蛋白質(zhì)被確定后，組合庫可被篩選成為具抑制經(jīng)確定的蛋白質(zhì)分裂作用的化合物。用于該些化合物的篩選化學(xué)庫的方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已熟知。請參閱例如Lopez-Ottin等人編著(2002)。或者可供選擇地，可基于IAIH4的結(jié)構(gòu)智能設(shè)計抑制作用的化合物。

全長IAIH4被認為是結(jié)合到并抑制血漿舒血管素。(請參考Pu?XP等人著，Biochim?Biophys?Acta1994；1208：338-43；Nishimura?H等人著，F(xiàn)EBS?Lerr?1995；357：207-11)。以N為端點的IAIH4的截斷產(chǎn)物被認為可減少IAIH4的蛋白酶的抑制作用。請參閱，例如，Abrahamson等人著(Biochem.J.273：621-626(1991))?；衔飳⑷LIAIH4的官能團引入至截斷IAIH4，因此很可能在治療過程如卵巢癌的治療過程中有用處，這與IAIH4的截斷形式有關(guān)。因此，在進一步的實施例中，本發(fā)明提供用于確定可提高截斷IAIH4對于其靶向蛋白酶的親和性的化合物。例如，針對化合物將全長IAIH4的蛋白酶抑制作用引入至截斷IAIH4的能力對化合物進行篩選。然后，能夠調(diào)節(jié)IAIH4的抑制作用或與IAIH4相互作用的分子作用的測試化合物可在體內(nèi)針對化合物在受驗者體內(nèi)緩解或阻止卵巢癌發(fā)展的能力進行試驗。

在臨床水平上講，篩選測試化合物的步驟包括在受驗者被曝露于測試化合物前后，自測試受驗者取得樣本?？蓽y量并分析本發(fā)明的至少一種生物標記的樣本的數(shù)量，以確定生物標記的數(shù)量是否在曝露于測試化合物后有改變。正如此處所述的，該樣本可通過質(zhì)譜分析法進行分析，或者該樣本可通過本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當?shù)姆椒ㄟM行分析。例如，可直接通過使用無線或熒光標識的抗體的西方墨點分析法測量本發(fā)明的至少一種生物標記的數(shù)量，其中該抗體是特異性結(jié)合至該生物標記?？晒┻x擇地，可測量編碼至少一種生物標記的mRNA的數(shù)量變化，并且該變化與指定測試化合物投入至受驗者有關(guān)。在進一步的實施例中，可用體外方法和材料測量至少一種生物標記的表達的數(shù)量變化。已用測試化合物處理的受驗者將被例行檢查由治療方法產(chǎn)生的任何生理效果。尤其，該測試化合物被評定其是否降低受驗者體內(nèi)患疾病的可能性?？晒┻x擇地，如果該測試化合物被投入至先前被診斷患有卵巢癌的受驗者，則該測試化合物被篩選其緩解或阻止疾病發(fā)展的能力。

X.產(chǎn)生分類演算及診斷結(jié)果的方法數(shù)據(jù)組可通過多重分類演算進行分析。一些分類演算提供分散的分類規(guī)則；其它分類演算提供某一結(jié)果(組群)的可能性評估。在后面的例子中，判定(診斷)結(jié)果是基于最高可能性組群做出的。例如，考慮這三組問題：健康組、良性組以及患癌組。假定購建分類演算(如最近鄰居分析方法)，將其應(yīng)用于樣本A中，且該樣本為健康的可能性為0，為良性的可能性為33％，為患癌的可能性為67％。則樣本A被診斷為患有癌癥。然而，這種方法沒有考慮診斷過程中任何″模糊度″問題，即存在該樣本為良性的一定可能性。因此，該診斷結(jié)果與健康或良性的可能性為0而患癌的可能性為1的樣本B相同。

我們提出購建一源自每一組群分配的可能性的指數(shù)。該指數(shù)以任何計算器可執(zhí)行的邏輯方法購建；在這一例子，我們創(chuàng)造該三種可能性的單一線性組合，即I＝0*p(參照)+1*p(良性)+2*p(患癌)成為參照的可能性為1的樣本的數(shù)值為0，成為良性的可能性為1的樣本的數(shù)值為1，以及成為患癌的可能性為1的樣本的數(shù)值為2。因此臨床判定結(jié)果可基于該指數(shù)做出。指數(shù)為0的人不會有患癌癥的風險，而指數(shù)為2的人患有癌癥的風險很高。指數(shù)處于中間的人患癌風險不定，隨著指數(shù)升高風險越高。

我們將這一方法應(yīng)用于一組來自Mayo?Clinic的180個樣本中。我們基于該五種甲狀腺素運輸?shù)鞍?transthyretin)形式以及一種載脂蛋白A1(apolipoproteinA1)形式產(chǎn)生最近鄰居分類演算，在考慮及不考慮年齡的情況下。當年齡不包括在該模型中時，接下來的圖標中指數(shù)數(shù)值作為組群的功能繪于圖中。

數(shù)值為0的個體實際上沒有患基于這些標記的卵巢癌的風險，而數(shù)值為2的個體患卵巢癌的風險最高。

提供以下例子作為舉例說明，但并不僅限于此。當提供特定例子時，以上描述是說明性的，而不是限制性的。先前說明的實施例的任何至少一個特征可與本發(fā)明中任何其它實施例的至少一個特征以任何方式結(jié)合。而且，本發(fā)明的一些變動對具本技術(shù)的技能者于評論該特定性時，將變得很明顯。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該不是根據(jù)上述說明來確定的，而是應(yīng)用根據(jù)附加的專利申請范圍以及與它們同等的全部范圍來確定。

本申請中引用的所有發(fā)表文獻及專利文件是以完整資料方式引用以供參考，對所有目的皆相同，如同每個獨立發(fā)表文獻或?qū)＠募粏为毐硎疽粯印?a href='/zhuanli/list-18290-1.html' target='_blank'>申請人在將各種參考文獻引用于該文件中時，申請人并不承認任何特定參考文獻是他們發(fā)明的″先前技術(shù)″。

實施例材料與方法樣本蛋白質(zhì)體圖形數(shù)據(jù)是自503個在葛洛寧恩大學(xué)醫(yī)院(荷蘭葛洛寧恩)、杜克大學(xué)藥學(xué)中心(北卡羅萊納州杜爾漢)、婦女皇家醫(yī)院(澳大利亞悉尼)以及MD安德生癌癥中心(得克薩斯州休斯頓)收集的血清樣本獲得的。該卵巢癌群組由65位侵入性上皮卵巢癌I/II期病人與88位侵入性上皮卵巢癌III/IV期病人、28位臨界腫瘤病人以及14位復(fù)發(fā)性疾病病人組成。該癌癥案例是由病理學(xué)家以國際婦產(chǎn)科聯(lián)(International?Federation?of?Gynecologists?andObstetricians，F(xiàn)IGO)標準為依據(jù)所做的適當分期。65位侵入性上皮卵巢癌I/II期病人中，20位是漿液性卵巢癌，17位是黏液性卵巢癌，15位是子宮內(nèi)膜狀卵巢癌，8位是透明細胞卵巢癌，1位是癌肉瘤卵巢癌，以及4位是混合上皮卵巢癌。該樣本亦包括166位診斷位良性盆腔囊瘤以及142位健康參照物。研究分布的特性與基本描述性統(tǒng)計，包括年齡與CA125數(shù)量，列于表1。

所有病人樣本是于手術(shù)或治療前收集，且健康志愿者樣本是有機構(gòu)驗證收集而來的。該血液樣本可以凝結(jié)，而血清是即可分離處理。所有樣本存放于-70℃，并于分析前立即解凍。所有病人CA125數(shù)量可從先前研究中使用CA125II放射性免疫分析法試劑盒(Centocor)而得到。

除503個用于蛋白質(zhì)體圖譜樣品外，尚有142個收集自約翰霍普金藥學(xué)研究所、用于常規(guī)臨床實驗室試驗的建檔血清樣品，作為該經(jīng)確認的生物標記(免疫分析試驗可得到)數(shù)量試驗用。該些樣本中，41個是來自卵巢癌晚期病人以及41個是來自健康婦女。剩余的60個樣本由具乳癌、結(jié)腸癌及前列腺癌這三組病人中每組20個組成，且用于試驗該經(jīng)確認的生物標記的腫瘤位置特異性(列于表3)。所有樣本于收集后2至4小時內(nèi)處理，然后存放于2至8℃不超過48小時，接著于-70℃下進行冷凍。CA125II分析亦使用二位置免疫酶分析法(two-siteimmunoenzymometric?assay)于Tosoh?AIA-600II分析儀(Tosoh?Medics公司提供)進行。

實施例1：蛋白質(zhì)表現(xiàn)圖譜血清區(qū)分：血清樣本于冰上解凍，然后以20000g轉(zhuǎn)速離心10分種以除去沉淀。20ul血清與變性緩沖液(U9∶9M尿素、2％CHAPS、50mMTris?pH9.0)混合，并于4℃下振蕩20分種。對每一樣本，180ul?Hyper?Q?DF陰離子交換樹脂于200ul?U1緩沖液(U9于50mM?Tris?pH9.0中稀釋成1∶9)中平衡三次。該變性血清加于樹脂中，并允許進行30分種結(jié)合反應(yīng)。然后收集未經(jīng)結(jié)合的物質(zhì)，接著將含有0.1％OGP的100ul?50mM?Tris?9.0加至樹脂中。收集該洗提液并與該未經(jīng)結(jié)合的物質(zhì)(流體；區(qū)分物1)混合。然后以pH梯度(每一100ul?pH7、5、4、3沖提緩沖水溶液以及有機溶劑使用兩次)沖提以收集各個區(qū)分物。這將得到總共六個區(qū)分物。區(qū)分是以Biomek2000自動液體收集器(Beckman公司提供)與微型混合振蕩器(DPC)進行的。參照混合人類血清的樣本(Intergen公司提供)以相同方式處理以監(jiān)控分析結(jié)果。

A.用于蛋白質(zhì)表達圖譜的材料Beckman?Biomek?2000自動化工作站Q?Hyper?DF陶瓷陰離子交換樹脂(法國Biosepra公司提供)96格v型底微量盤96格LP尼龍羥基(LoProdyne)薄膜過濾盤(SilentScreen，Nalge?Nunc)平衡緩沖液-50mM?Tris-HCl?pH9.0U9-9M尿素，2.0％CHAPS，50mM?Tris-HCl?pH9.0；Ul-1M尿素，0.22％C?HAPS，50mM?Tris-HCl?pH9.0緩沖液-100mM醋酸鈉，0.1％OGP?pH4.0；pH3.0緩沖液-50mM檸檬酸鈉，0.1％OGP?pH3.0；有機緩沖液-33.3％異丙醇/16.67％乙氫/0.5％三氟乙酸(TFA)B.操作程序血清變性以20ul移液管將血清至96格v型底微量盤中.加入30ulU9至每格含有血清中。然后用盤密封膜密封。當樹脂進行時，將此盤中血清于4℃振蕩至少20分種。

樹脂平衡以三倍于50mM?Tris-HCl?pH9.0充填體積量清洗樹脂五次。此操作可在50ml離心管中進行。通過加入等量體積的50mM?Tris-HCl?pH9.0至樹脂中以制成50/50樹脂泥。然后將180ul?50/50樹脂泥加至96格過濾盤每格中。規(guī)律地(每次加二或三格)振蕩含有樹脂泥的試管以確保樹脂對緩沖液的固定組成比例。然后將該緩沖液過濾后加入200ul?U1，接著再過濾一次。以該相同方式再操作兩次以上。

樣本應(yīng)用與培養(yǎng)下一步驟是將血清結(jié)合至樹脂上。該操作中第一步為以50ul移液管將每一樣本移至相對應(yīng)的過濾盤格中。接著加50ul?U1至該樣本盤每格中并混合五次。然后自該樣本盤每格中吸取50ul至相應(yīng)的過濾盤格中。于4℃振蕩30分種。

下一步驟是收集該區(qū)分物。將96格v型底微量盤置于該過濾盤下方。然后收集通過該過濾盤的濾液。接著將100ul清洗緩沖液1加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。區(qū)分物1含有該流通過與pH9洗脫物。下一步將100ul清洗緩沖液2加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。將干凈的v型底微量盤置于該過濾盤下方，然后收集區(qū)分物2。接著將100ul清洗緩沖液2加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區(qū)分物2的殘留物。區(qū)分物2含有pH7的洗脫物。將100ul清洗緩沖液3加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。將干凈的v型底微量盤置于該過濾盤下方，然后收集區(qū)分物3。接著將100ul清洗緩沖液3加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區(qū)分物3的殘余物。區(qū)分物3含有pH5的洗脫物。將干凈的v型底微量盤置于該過濾盤下方，然后收集區(qū)分物4。接著將100ul清洗緩沖液4加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區(qū)分物4的殘余物。區(qū)分物4含有pH4的洗脫物。接著將100ul清洗緩沖液5加至該過濾盤每格中后，于室溫下振蕩10分鐘。在該96格v型底微量盤收集區(qū)分物5的殘留物。區(qū)分物5含有pH3的洗脫物。接著將100ul清洗緩沖液6加至該過濾盤每格中后，于室溫振蕩10分種。將干凈的v型底微量盤置于該過濾盤下方，然后收集區(qū)分物6。將100ul清洗緩沖液6加至該過濾盤每格中后，于室溫下再次振蕩10分鐘。收集區(qū)分物6的殘留物。區(qū)分物6含有該有機溶劑的洗脫物。

冷凍該些區(qū)分物以備芯片結(jié)合操作。

列陣結(jié)合：將10ul每一區(qū)分物與90ul結(jié)合緩沖液混合，并分三份結(jié)合至IMAC、SAX、H50以及W?CX蛋白質(zhì)芯片列陣(塞弗吉公司提供的Biosystem)上。對于IMAC，結(jié)合緩沖液是含有500mM?NaCl的100mM?pH7.0磷酸鈉溶液；對于SAX，結(jié)合緩沖液是100mM?pH7.0磷酸鈉溶液；對于H50，結(jié)合緩沖液是50％乙氰水溶液；對于WCX，結(jié)合緩沖液是100mM?pH4.0醋酸鈉溶液。在室溫下發(fā)生結(jié)合反應(yīng)30分種。然后芯片用結(jié)合緩沖液清洗三次，再用蒸餾水清洗兩次。使用介質(zhì)為芥子酸(sinapinic?acid)。

數(shù)據(jù)采集與分析：對于兩種SELDI分析方法，所有列陣通過Ciphergen?PBS?II?ProteinChip列陣讀取機、時間延滯聚焦、線性、激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀進行讀寫。所有光譜以正離子模式獲得。時間延滯聚焦對于肽的延滯時間為400ns，而對于蛋白質(zhì)是1900ns。用3kV離子萃取脈沖萃取離子，并以20kV加速電壓加速至最終速度。該系統(tǒng)使用重復(fù)速率為每秒2至5脈沖變化的脈沖氮激光。典型激光通量變化范圍為30-150uJ/mm2。自動化分析操作被用于控制大部分樣本分析中數(shù)據(jù)采集過程。每一光譜平均至少100次激光瞄準，并以已知肽或蛋白質(zhì)混合物進行外校正。每周都要用胰島素與免疫球蛋白對儀器進行檢查以確保功能的穩(wěn)定性。每個芯片以兩種激光能量(高能與低能)讀取。光譜的基線用8倍于適合寬度的設(shè)定扣除以得到外校正，然后標準化至總離子流(排除介質(zhì)區(qū))。

實施例2：統(tǒng)計分析生物標記的發(fā)現(xiàn)：從SELDI光譜中選擇M/Z2kD-50kD的質(zhì)量范圍內(nèi)合格的質(zhì)量譜峰(S/N＞5，群集質(zhì)量窗口在0.3％)。為了獲得更多有關(guān)光譜范圍內(nèi)數(shù)據(jù)變化的連續(xù)性，在進一步分析前對譜峰強度進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。采用單一化最大分離性分析(Unified?Maximum?SeparabilityAnalysis，UMSA)算法對來自杜克大學(xué)藥學(xué)中心(Can＝36，HCn＝47)和葛洛寧恩大學(xué)醫(yī)院(Can＝20，HCn＝30)的早期上皮卵巢癌病人和健康參照物進行分析，該UMSA算法是第一次用于微列陣數(shù)據(jù)分析，隨后用于蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)分析(ProPeak，3Z?Informatics)。(請參閱Li?J，Clin?Chem2002；48：1296-304；Rai?AJ，et?al.，Zhang?Z，et?al.，ArchPathol?Lab?Med2002；126：1518-26；Z.Zhang等人，將分類分離分析方法應(yīng)用于微列陣數(shù)據(jù)中(Applyingclassification?separability?analysis?to?microarray?data)；LinSM，Johnson?KF編著，微列陣數(shù)據(jù)分析方法(Methods?ofMicroarray?data?analysis)：CAMDA’00報告，波士頓Kluwer學(xué)術(shù)出版社，2001：125-136；以及Z.Zhang等人，釣魚探險-從表現(xiàn)圖譜概略萃取式樣的監(jiān)督式方法(Fishing?Expedition-a?Supervised?Approach?to?ExtractPatterns?from?a?Compendium?of?Expression?Profiles；LinSM，Johnson?KF編著，微列陣數(shù)據(jù)分析方法II：CAMDA’01報告，波士頓Kluwer學(xué)術(shù)出版社，2002)。

為了降低在選擇譜峰中出現(xiàn)數(shù)據(jù)誤差或人為現(xiàn)象的可能性，自兩處獲得的數(shù)據(jù)采取獨立分析的方法。自舉法重抽樣技術(shù)被用于選擇對區(qū)分早期卵巢癌和健康參照物有顯著且連續(xù)貢獻的譜峰。在每一自舉法運行過程中，隨機選擇固定百分比的癌癥及對照組樣本進行取代分析。各個譜峰依照它們對UMSA分類器線性解釋中的貢獻度進行排序。每一譜峰順序的平均數(shù)及標準偏差是以多次(20至40次)運行來估算。選擇具高平均數(shù)順序及小標準偏差的譜峰，以形成候選譜峰的短小名單。自兩處獲得的結(jié)果然后進行交叉對比，以決定最后一組具一致性表現(xiàn)式樣的譜峰作為一組潛在生物標記。

多變量預(yù)測模型：為了建立多變量預(yù)測模型，將兩處獲得的數(shù)據(jù)進行組合，然后將其隨機分成訓(xùn)練組及試驗組。首先用試驗組對潛在生物標記組的性能及建立的預(yù)測模型進行評估，最后用自剩余兩處未參與生物標記發(fā)現(xiàn)及模型建立過程的獨立數(shù)據(jù)進行驗證。用于評估的統(tǒng)計方法包括靈敏度及特異性的估計，以及接收器操作特性曲線(ROC)分析。

實施例3：生物標記的純化對于所有標記，先采用用于蛋白質(zhì)表現(xiàn)圖譜化的陰離子交換操作步驟區(qū)分血清。對于每一純化步驟，在NP20或IMAC-銅蛋白質(zhì)芯片列陣上檢測區(qū)分物。

28kD標記的純化：將1ml陰離子交換分離的pH4區(qū)分物加至500ul的RPC?PolyBio10-15(BioSepra公司提供)中，并于4℃下培養(yǎng)1小時。收集含有乙氰(acetonitrile，CAN)的數(shù)量逐漸增加的0.1％三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)的區(qū)分物。75％乙氰/0.1％三氟乙酸的區(qū)分物用真空離心干燥機(speed-vac)干燥，然后于100ul不含二硫蘇糖醇(1，4-dithiothreitol，DTT)的SDS-三(羥甲基)甲基甘氨酸(SDS-tricine)上樣緩沖液中復(fù)水。將40ul樣本加至16％三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)凝膠上，并以100mV電壓運行4小時。用膠體藍試劑盒(Pierce公司提供)將凝膠去色，并將該28kD標記刮取下來。

12.8kDa標記的純化：將10ml陰離子交換分離的pH4區(qū)分物用1M?pH11?Tris-HCl溶液調(diào)整pH至7.5，然后加至10ml?MEP微珠(BioSepra公司提供)上，其中MEP微珠使用前先用20ml?pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗三次。于4℃搖晃30分種后得到含有該譜峰的洗提區(qū)分物。因為該區(qū)分物含有大量白蛋白，因此需進行白蛋白免疫消耗試驗(immunodepletion)。蛋白質(zhì)-A微珠先以含有0.1％triton-100接口活性劑的1.5ml?PBS清洗三次，接著以1.5ml?PBS清洗三次.然后將4ml抗人類血清白蛋白(anti-human?serum?albumin，anti-HAS)抗體(ICN公司提供)加至1.5ml蛋白質(zhì)-A微珠中，并耦合過夜。耦合的微珠以1ml含有0.1％triton-100的PBS清洗三次，然后以1mlPBS清洗三次。接著將經(jīng)過MEP管柱的洗提流出物加至微珠中，并于4℃培養(yǎng)1小時。以3000rc?f轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)1分種后得到該洗提流出物。將經(jīng)過蛋白質(zhì)-A-抗HAS抗體管柱的洗提區(qū)分物加至含有1.5ml?RPC?PolyBio10-15樹脂(Bio?Sepra公司提供)的旋轉(zhuǎn)柱中，其中RPC?PolyBio10-15樹脂是先用1.5ml0.1％TFA清洗四次。于4℃下?lián)u晃培養(yǎng)40分種后，以3000rcf轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)移除該洗提區(qū)分物，并以0.8ml0.1％TFA清洗該微珠。收集含有乙氰數(shù)量逐漸增加的0.1％TFA的區(qū)分物。75％乙氰/0.1％TFA的區(qū)分物用真空離心干燥機干燥，然后于100ul不含DTT的SDS-tricine上樣緩沖液中復(fù)水。將40ul樣本加至16％tricine凝膠上，并以100mV電壓運行4小時。用膠體藍試劑盒(Pierce公司提供)將凝膠去色，并將該12.8kDa標記刮取下來。

3272D生物標記的純化：將1ml陰離子交換分離的洗提區(qū)分物加至125ul(250ul?50％泥狀物)與硫酸銅耦合的IMAC纖維素(Biosepra公司提供)中，并于4℃下培養(yǎng)1小時。然后微珠用梯度逐步增加的咪唑(imidazole)(含有500mM?NaCl的100mM?pH7?NaPO4溶液中，溶有250ul的20mM、50mM、100mM、150mM及200mM咪唑)方式清洗。將200ul含有生物標記(50至150mM咪唑)的區(qū)分物加至C18管柱上(ANSYS技術(shù)公司提供，Metachempolaris?C18-A5U)，并以1ml/min流速的0.1％TFA沖洗5分種，接著以1ml/min流速的0％至9％乙氰(ACN)梯度0.1％TFA溶液清洗10分種。然后以1ml/min流速的9％CAN至45％?CAN線性梯度0.1％TFA溶液清洗30分種。收集1ml等分試樣以及于第38個區(qū)分物(該區(qū)分物的CAN濃度為34.2％)中清洗的標記。

實施例4：生物標記的確認已純化的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶切片，然后胰蛋白酶解片段用蛋白質(zhì)芯片讀取機分析。每一光譜范圍是至少250個激光瞄射點的平均，并用已知肽混合物做外校正，或用胰蛋白酶自溶及基質(zhì)譜峰做內(nèi)校正。譜峰質(zhì)量是符合ProFound檢索的肽拼圖位置(在線提供)。蛋白質(zhì)序列是使用美國國立生物技術(shù)信息中心(National?Center?forBiotechnology?Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進行修補。這些數(shù)據(jù)庫匹配度的確認是使用配備蛋白質(zhì)芯片列陣接口(Ciphergen公司提供)的PESciex?QStar(加拿大Concord公司提供)進行的。對于MS/MS實驗，光譜范圍是從配備塞弗吉PCI1000蛋白質(zhì)芯片列陣接口的Sciex?Qstar(加拿大Concord公司提供)串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀獲得。離子是使用脈沖氮激光(Laser?Science?VSL?337NDS，F(xiàn)ranklin，MA，USA)以每秒30個脈沖(傳遞平均130uJ/mm2脈沖通量)產(chǎn)生的。壓力為10mtorr的氮氣用于已形成離子的碰撞冷卻，以及所有低能碰撞引發(fā)解離(collision-induced?dissociation，CID)試驗。通常應(yīng)用的碰撞能遵循50eV/kD規(guī)則。對于MS及MS/MS模式，系統(tǒng)使用已知肽混合物進行外校正.通過加州大學(xué)舊金山分校(University?of?California，San?Francisco，UCSF)ProteinProspector?MS-Tag程序(在線提供；請參閱ClauserK.R.et?al.(1999)Anal.l?Chem.71：2871)來進行蛋白質(zhì)的確認。用下列數(shù)值來執(zhí)行MS-Tag數(shù)據(jù)庫搜索：智人(Homosapiens)、胰蛋白酶切片(允許兩個切割被遺漏)、經(jīng)以胺甲硫胺基甲基化(carbamidomethylation)經(jīng)修飾的的半胱胺酸、母峰及片段離子質(zhì)量容許量50ppm以及NCBI或Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫。

這些確認是通過EIA或使用基于免疫分析發(fā)的蛋白質(zhì)芯片列陣進行的。

雖然這些蛋白質(zhì)通常已被表征為急性期反應(yīng)物，但在用免疫分析法做初步研究時，應(yīng)當注意的是，載脂蛋白A?1(apolipoproteinA1)的數(shù)量于乳癌或結(jié)腸癌中為被發(fā)現(xiàn)有改變，且前白蛋白的數(shù)量于乳癌或前列腺癌病人中亦未被發(fā)現(xiàn)有改變。

甲狀腺素運輸?shù)鞍资顷幮约毙云诘鞍踪|(zhì)，先前已有報導(dǎo)說，在上皮卵巢癌病人中，其數(shù)量會降低。(請參閱Mahlck?CG，et?al.，Gynecol?Obstet?Invest，1994；37：135-40)。甲狀腺素運輸?shù)鞍资茄寮谞钕偎丶叭饧谞钕偎刂饕d體，并通過與視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)間的相互作用來幫助運送視黃醇。缺乏甲狀腺素運輸?shù)鞍妆磉_的轉(zhuǎn)基因鼠，其視黃醇和視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)的數(shù)量非常低(請參閱van?Bennekum?AM，et?al.，J.Biol?Chem2001；276：1107-13)，且數(shù)量降低的視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)以及細胞視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)已顯示與卵巢上皮細胞惡性轉(zhuǎn)形的速率增加有關(guān)(請參閱van?Bennekum?AM，et?al.，J.BiolChem2001；276：1107-13；Roberts?D，et?al.，DNA?Cell?Biol2002；21：11-9)。此外，有報導(dǎo)說，通過寡核甘酸列陣分析，細胞視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)的數(shù)量在卵巢癌中有改變。

產(chǎn)生m/z3272生物標記的IAIH4的羧基部分已顯示是血漿舒血管素的基質(zhì)。(請參閱Pu?XP，et?al.，BiochimBiophys?Acta1994；1208：338-43；Nishimura?H，et?al.，F(xiàn)EBS?Lett1995；357：207-11)。舒血管素蛋白酶包括血漿舒血管素及組織舒血管素，具有重疊基質(zhì)特異性。(請參閱Diamandis?EP，et?al.，Clin?Chem2002；48：1198-205)。組織舒血管素是屬于龐大的復(fù)基因族(multigene?family)，該復(fù)基因族還包括前列腺特異性抗原(PSA；hK3)，其是為前列腺癌的腫瘤標記。在卵巢癌中已發(fā)現(xiàn)數(shù)種組織舒血管素有不正常調(diào)節(jié)現(xiàn)象，其包括hK4、hK5、hK7、hK8及hK9(請參閱Yousef?GM，et?al.，Minerva?Endocrinol?2002；27：157-66)。

甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10及IAIH4片段是成熟蛋白質(zhì)的截斷產(chǎn)物。這些標記是由至少一種蛋白酶切割而成的產(chǎn)物，該蛋白酶包括血漿舒血管素、組織舒血管素、金屬蛋白酶基質(zhì)或prostatin(一種似胰蛋白酶的絲胺酸(serine)蛋白酶，近期有報導(dǎo)說其在卵巢癌病例中會增加)。(請參閱Mok?SC，et?al.，J?Natl?Cancer?Inst?2001；93：1458-64)。產(chǎn)生這些標記的蛋白酶亦可作為可與標記1至4組合以俾于對預(yù)測模型賦予更高靈敏度及特異性的標記使用。

實施例5：個別生物標記的識別能力在發(fā)現(xiàn)組中，早期卵巢癌病人與健康參照物之間，三種生物標記的表達水平經(jīng)統(tǒng)計計算發(fā)現(xiàn)存在顯著差異(對m/z12828及m/z?28043標記，P＜0.000001；對m/z3272標記，P＜0.003，對m/z?303標記，P＜0.04，以及對m/z?2884標記，P＜0.005)(請見表1)。

第2圖(窗格A-D)是通過對來自早期卵巢癌和健康參照物的數(shù)據(jù)，采用接受器操作特性(ROC)曲線分析的三種個別生物標記與CA125的區(qū)分能力進行比較。對于窗格A-D各代表1：CA125，2：m/z?12.8kD，3：m/z?28kD，4：m/z?3272D。CA125與m/z?12828于發(fā)現(xiàn)組及驗證組二者中表現(xiàn)相當，而其它兩種標記于一組或兩組數(shù)據(jù)組中，比CA125有較小曲線下面積(area-under-curve，AUC)。然而，該三種生物標記和CA125中，經(jīng)估算的相關(guān)性低(數(shù)據(jù)未顯示)，表示它們有彼此互補的可能性，并且多變量分析法可能優(yōu)于CA125的單一分析方法。

由于健康參照物中的樣本有27％是來自年齡至少在50歲的婦女，相比之下，早期卵巢癌組群(P＜0.000001)的樣本則有61％是來自年齡至少在50歲的婦女，因此值得關(guān)心的是，這些標記可能反應(yīng)了與年齡有關(guān)的變化。然而，經(jīng)確認的生物標記在兩組年齡組群間無顯著差異，或者，與CA125的數(shù)量相比，這些生物標記的數(shù)量存在差異(請見表1)。先前基于人口的研究已顯示，載脂蛋白A1的數(shù)量實際上隨著年齡增長略微增加(請參閱Jungner，etal.，Clin?Chem?1998；44：1641-9；Bachorik?PS，et?al.，ClinChem1997；43：2364-78)。

實施例6：多變量預(yù)測模型用非線性UMSA分類器建立兩個多變量預(yù)測模型。第一個模型僅用該三個生物標記作為它的輸入，第二個模型用該三個生物標記隨同CA125一起。第2圖中的窗格E-H是采用ROC分析法將該兩個模型的所有診斷結(jié)果與CA125的診斷結(jié)果進行比較。對于窗格E-H各代表○：CA125，□：使用該三種生物標記的多變量模型，△：使用該三種生物標記與CA125的多變量模型。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中，截止值為0.5使得靈敏度與特異性的總和接近最大化。以該截止值，將模型應(yīng)用于試驗組數(shù)據(jù)及獨立驗證組數(shù)據(jù)(請見表2)。對于獨立驗證組中健康參照物和I/II期侵入性卵巢癌之間的區(qū)別，使用該三種生物標記和CA125的多變量模型在靈敏度為82.6％(95％置信區(qū)間(CI)61.2至95.1％)時，其特異性為93.7％(84.5-98.2％)。相比之下，CA125在截止值為11U/mL其靈敏度相同(82.6％)，而其特異性卻只有52.4％(39.4-65.1％)。表2還包括獨立驗證組中，良性狀態(tài)、晚期侵入性癌癥或邊緣腫瘤的病人的結(jié)果。

第3圖繪制了CA125、該三種生物標記的分布圖案，以及該兩種模型對所有診斷組群中的樣本的輸出結(jié)果。Y軸是對所有三種生物標記以線性刻度表示的相對強度；對CA125以對數(shù)比例表示的血清數(shù)量；對兩種模型，0(最低患癌風險)與1(最高患癌風險)間的連續(xù)數(shù)值。樣本組群包括：A)健康參照物，B)良性，C)I/II期侵入性癌，D)HI/IV期侵入性癌，E)復(fù)發(fā)者，F(xiàn))I/II期邊緣腫瘤。生物標記發(fā)現(xiàn)組中兩個IIIc侵入性病例和獨立驗證組中三個III/IV期邊緣腫瘤未繪制出來。

應(yīng)注意的是，除m/z?3272外，其它兩種生物標記和兩種預(yù)測模型具有良性病例中檢測I/II期侵入性癌的適度能力(對m/z12828及28043，P分別為0.004及0.001；對無CA125及有CA125的模型，P分別為0.003及0.0001)。

實施例7：用免疫分析法獨立驗證以微滴定盤格式(美國Wako?Chemical公司提供)使用濁度免疫分析法(turbidimetric?immunoassay)對142個已歸檔的樣品進行載脂蛋白A1分析，對于甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的分析是在Dimension?RxL儀器(Dade-Behring公司提供)上使用顆粒強化濁度免疫分析法進行(請見表3)。

與41位健康參照物比較，在41位晚期卵巢癌病人中，CA125的血清數(shù)量上調(diào)，而載脂蛋白A1與甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的數(shù)量下調(diào)(P分別為0.001895、0.000151、0.000006)。健康參照物的平均血清載脂蛋白A1的數(shù)量，與乳癌或結(jié)腸直腸癌病人的平均血清載脂蛋白A1的數(shù)量相比，無顯著差異(P分別為0.844163、0.330148)，與前列腺癌病人相比只有略微差異(P為0.043676)。結(jié)腸直腸癌病人(P為0.006889)中，平均血清甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的數(shù)量下調(diào)程度比卵巢癌病人小。健康參照物與乳癌或前列腺癌病人中，平均血清甲狀腺素運輸?shù)鞍住鱊10的數(shù)量無顯著差異(P分別為0.928519、0.546918)。

實施例8：分類演算于第4圖中以圖標方式敘述了分類演算，模塊1至3是以UMSA學(xué)習算法訓(xùn)練。然而，最后的分類器模塊具有如一般支持向量機(support?vector?machine，SVM)分類器一樣的數(shù)學(xué)形式。

UMSA分類器模塊1：CA125nm＝log(CA125+0.01)m/z?12.9Knm＝(m/z?12828-61.103)/239.031m/z28Knm＝(m/z28043-61.3043)/238.9799m/z3272nm＝log(m/z3272+0.01)log()：自然對數(shù)核心函數(shù)：多項式＜X(：，i)，X(：，j)＞)^3.0支持向量及系數(shù)：

UMSA分類器模塊2：CA125nm＝log(CA125+0.01)m/z?12.9Knm＝(m/z?12828-0.345)/0.1114m/z28Knm＝(m/z28043-0.4834)/0.2792m/z?3272nm＝log(m/z?3272+0.01)log()：自然對數(shù)核心函數(shù)：exp(-|X(：，i)-X(：，j)|^2/(2*(1.0)^2))支持向量及系數(shù)：

UMSA分類器模塊3：核心函數(shù)：多項式＜X(：，i)，X(：，j)＞)^2.0X1＝exp(模塊1輸出)/(1+exp(模塊1輸出))X2＝模塊2輸出支持向量及系數(shù)：

后處理：

其它模塊輸出＝exp(Y/2)/(1+exp(Y/2))本發(fā)明詳細說明了包括優(yōu)選實施例在內(nèi)的描述。然而，任何熟知此項技藝的人士可運用本發(fā)明的揭示下，對本發(fā)明進行修飾及/或改進，其仍涵蓋于如下列所提申請專利范圍的本發(fā)明范疇及精深內(nèi)。

本申請中所引用的所有出版發(fā)表物及專利文件，對所有目的適用范圍均相同，是以完整參考資料方式引用，如同單獨地代表每一個單獨的出版發(fā)表物及專利文件一樣。引用本文件中各種參考資料時，申請人并不承認任何特定的參考資料是對他們發(fā)明的″先前技術(shù)″。

實施例9：用于早期卵巢癌的標記的確認及與治療方法的關(guān)聯(lián)病人：該研究包括25位忠良性卵巢癌的婦女、53位患早期(I，IIa期)卵巢癌的婦女、116位患晚期卵巢癌的婦女以及73位健康參照物，這些均取自位于葛洛寧恩和魯文的兩家醫(yī)院。該些樣本的組織學(xué)下一級類型包括：95位是漿液性卵巢癌，29位是黏液性卵巢癌，16位是子宮內(nèi)膜狀卵巢癌，11位是透明細胞卵巢癌，17位是癌肉瘤卵巢癌，以及1位是混合上皮卵巢癌。沒有患邊緣腫瘤的病人?；荚缙诎┌Y的婦女平均年齡在51.8歲，晚期癌是58.8，良性癌是47歲，以及健康參照物是58歲。

色譜ProteinChip列陣：用7.5ul9M尿素/2％CHAPS/50mM?TrisHCl混合溶液變性5ul血清。經(jīng)變性的血清在生物芯片結(jié)合緩沖液(對于IMAC30列陣：50mM磷酸鈉溶液，250mM?NaCl溶液，pH6.0；對于Q10列陣：10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0)中稀釋。經(jīng)稀釋的血清在IMAC30列陣或Q10蛋白質(zhì)芯片列陣上培養(yǎng)兩個小時。先用結(jié)合緩沖液、然后用水清洗該些列陣，然后簡單地置于空氣中干燥。加入芥子酸，在4000系列蛋白質(zhì)讀取器中讀取該些列陣。

數(shù)據(jù)分析：對質(zhì)量外校正質(zhì)譜，利用總離子流對強度進行內(nèi)部標準化，基線扣除。手動選擇譜峰并記錄峰強度。用t-試驗以及支持向量機(support?vector?machine)分析數(shù)據(jù)。

第9圖描述了具代表性的于Q10蛋白質(zhì)芯片列陣上甲狀腺素運輸?shù)鞍自囼灥淖V圖。需注意的是，解析出五種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍祝何唇?jīng)經(jīng)修飾的的、經(jīng)磺化的、經(jīng)半胱氨?；?、經(jīng)CysGly經(jīng)修飾的的、經(jīng)谷胱甘肽化的。除此之外，還可發(fā)現(xiàn)截斷形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍?△N10)；以比經(jīng)半胱氨?；募谞钕偎剡\輸?shù)鞍走€要低的水平(～2％)出現(xiàn)。

該試驗可通過使用蛋白質(zhì)標準進行絕對量化以用于校正。第10圖顯示了，對不同形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎乃剑鄳?yīng)的線性譜峰強度。

從表4可以看出，甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1的水平在卵巢癌病人中下降。兩組t-試驗表明，五種形式甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1的水平在患有早期或晚期卵巢癌病人中均會下降。需注意的是，該些甲狀腺素運輸?shù)鞍仔问降乃皆谕砥诓∪酥邢陆蹈用黠@。

從表5可以看出，術(shù)后，甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1的水平上升。盒須圖(box-and-whiskerplots)表明，甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1的水平于術(shù)后均回復(fù)到參照物水平。成對t-試驗結(jié)果表明，該效應(yīng)于統(tǒng)計上是有重要意義的。一些形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍妆憩F(xiàn)出比其它形式更大的響應(yīng)。

正如第11圖中所示，各形式甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1的組合會隨著手術(shù)的進行而改變。支持向量機(support?vector?machine)的運算是基于五種形式甲狀腺素運輸?shù)鞍着c載脂蛋白A1建立的，被用于在術(shù)前和術(shù)后對于每個病人產(chǎn)生出一指數(shù)。術(shù)前水平與術(shù)后水平間比較得到的一組指數(shù)圖揭示了，對于大多數(shù)病人，術(shù)后該指數(shù)會提高。在31/42(73.8％)早期卵巢癌病人中，該指數(shù)提高。正如第12圖所示，該指數(shù)可用于監(jiān)測病人情況，是該指數(shù)在治療過程中如何變化的一舉例。對于這個病人，該指數(shù)在術(shù)前很低，而在術(shù)后升高。直到1996年10月，水平一直保持很高。表明該病人在此時疾病狀況好轉(zhuǎn)。

實施例10：于一案例對照研究中標記的驗證病人：該研究包括45位患有上皮卵巢癌病人的婦女，71位良性卵巢癌病人，122位患有消化疾病的婦女。我們排除了一例兒科良性損害以及多于一次融解和凍結(jié)的樣本。用于參照物的樣本儲存時間比案例以及良性疾病樣本的儲存時間長(即用于參照物的儲存時間為21年，而用于案例及良性的儲存時間為17年)。為使于發(fā)現(xiàn)譜峰中產(chǎn)生的偏差(與儲存時間有關(guān))最小化，我們限制了對于在1983-1989年期間收集的樣本的標記數(shù)據(jù)的主要分析。這里表示的數(shù)據(jù)因此是基于42個卵巢癌病例，65位忠良性疾病的婦女，以及76個參照物。

色譜ProteinChip列陣：用7.5ul?9M尿素/2％CHAPS/50mM?TrisHCl混合溶液變性5ul血清。經(jīng)變性的血清在生物芯片結(jié)合緩沖液(對于IMAC30列陣：50mM磷酸鈉溶液，250mM?NaCl溶液，pH6.0；對于Q10列陣：10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0)中稀釋。經(jīng)稀釋的血清在IMAC30列陣或Q10蛋白質(zhì)芯片列陣上培養(yǎng)兩個小時。先用結(jié)合緩沖液、然后用水清洗該些列陣，然后簡單地置于空氣中干燥。加入芥子酸，在4000系列蛋白質(zhì)讀取器中讀取該些列陣。

數(shù)據(jù)分析：對質(zhì)量外校正質(zhì)譜，利用總離子流對強度進行內(nèi)部標準化，基線扣除。手動選擇譜峰并記錄峰強度。用費舍精確試驗(Fisher?exact?tests)比較人口統(tǒng)計特性。用t-試驗評估兩組間峰高的區(qū)別。用線性和二次判別分析方法以及最近鄰居分析方法建立分類器。用交叉驗證程序評估分類中產(chǎn)生的誤差率。

第13圖，是表示在Q10?ProteinChip?Array上各形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白A1產(chǎn)生的峰強度的散點圖。對于各種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍椎膬山Mt-試驗值如下所示：未經(jīng)經(jīng)修飾的的，0.0076；經(jīng)磺化的，0.0052；經(jīng)半胱氨?；?，0.0104；經(jīng)CysGly經(jīng)修飾的的，0.0026；經(jīng)谷胱甘肽化的，0.0047。對于載脂蛋白A1的兩組t-試驗值為0.0009。

第14圖，是表示采用最近鄰居分析方法得到的指數(shù)數(shù)值。該模型包括六種形式的甲狀腺素運輸?shù)鞍缀洼d脂蛋白A1產(chǎn)生的峰強度，無論是包括年齡因素還是不包括年齡因素。使用的最近鄰居分析方法是用于計算每種樣本是為參照物、良性腫瘤或癌癥的后事概率。計算公式為：p(良性腫瘤/生物標記)+2*p(癌癥/生物標記)。0分表示該樣本歸為參照物，2分表示該樣本歸為癌癥，中間分數(shù)中越接近2分，越有可能是癌癥。

序列表<110>約瀚·霍普金斯大學(xué)賽弗吉生物系統(tǒng)公司<120>用于卵巢癌的生物標記<130>61154-PCT<150>60/632,474<151>2004-12-01<150>60/558,422<151>2004-03-31<160>3<170>PatentIn?version?3.3<210>1<211>30<212>PRT<213>人<400>1Met?Asn?Phe?Arg?Pro?Gly?Val?Leu?Ser?Ser?Arg?Gln?Leu?Gly?Leu?Pro1???????????????5???????????????????10??????????????????15Gly?Pro?Pro?Asp?Val?Pro?Asp?His?Ala?Ala?Tyr?His?Pro?Phe20??????????????????25??????????????????30<210>2<211>28<212>PRT<213>人<400>2Phe?Arg?Pro?Gly?Val?Leu?Ser?Ser?Arg?Gln?Leu?Gly?Leu?Pro?Gly?Pro1???????????????5???????????????????10??????????????????15Pro?Asp?Val?Pro?Asp?His?Ala?Ala?Tyr?His?Pro?Phe20??????????????????25

<210>3<211>27<212>PRT<213>人<400>3Arg?Pro?Gly?Val?Leu?Ser?Ser?Arg?Gln?Leu?Gly?Leu?Pro?Gly?Pro?Pro1???????????????5???????????????????10??????????????????15Asp?Val?Pro?Asp?His?Ala?Ala?Tyr?His?Pro?Phe20??????????????????25