白丝美女被狂躁免费视频网站,500av导航大全精品,yw.193.cnc爆乳尤物未满,97se亚洲综合色区,аⅴ天堂中文在线网官网

????????????????????????發(fā)明領域

本發(fā)明涉及硝基氧化合物(nitroxide)的治療和診斷應用，包括膜通透性 硝基氧化合物與膜不通透性硝基氧化合物的組合應用，后者包括硝基氧化 合物標記的大分子，包括多肽，如血紅蛋白、白蛋白、免疫球蛋白；多糖， 如葡聚糖、羥乙基淀粉；人工膜，如脂質(zhì)雙分子層，血紅蛋白和白蛋白微 泡。本發(fā)明公開了含硝基氧化合物的制劑，它可減輕活的生物體中與氧有 關的物類的毒性作用，并提供診斷和治療多種病理性生理病癥的能力。本 發(fā)明還涉及硝基氧化合物，合成的硝基氧化合物聚合物及共聚物，以及與 低分子量膜通透性硝基氧化合物組合應用，以維持硝基氧化合物在體內(nèi)的 作用的硝基氧化合物標記的大分子。本發(fā)明還公開了一些新的化合物和方 法，其特點是硝基氧化合物與生理相容性無細胞有包裹的血紅蛋白溶液組 合應用作為紅細胞代用品。本發(fā)明還描述一些方法和新的化合物，它們用 于使細胞膜不通透性硝基氧化合物以其膜通透性形式進行局部輸送，從而 導致治療濃度的硝基氧化合物在細胞內(nèi)積累，以治療皮膚的光老化，并作 為抗皮膚皺縮的藥劑。此外，本發(fā)明描述了上述硝基氧化合物與其他生理 活性化合物，包括其他硝基氧化合物的組合，用于預防病理性損傷和自由 基引起的氧化應力(oxidative?stress)并描述了它們在疾病診斷和治療中的應 用。

????????????????????????發(fā)明背景

雖然氧代謝的生理機制早為人們所知，氧化應力在生理及藥物中的作 用還不完全清楚。由氧引起的自由基對生理和疾病的影響在醫(yī)藥和生物學 課題中越來越重要。已知疾病和創(chuàng)傷可導致自由基水平超過身體自身的抗 氧化能力，結(jié)果產(chǎn)生氧化應力。氧化應力是自由基毒性失控的生理現(xiàn)象。 最明顯的是它由與氧有關的毒性物質(zhì)產(chǎn)生。毒性自由基是許多病理性病癥 的致病因子。其中包括心臟病發(fā)作或中風發(fā)作引起的局部缺血性-重灌注 損傷，休克，脫發(fā)，膿毒癥，細胞凋亡，某些藥物中毒，治療肺病時的氧 療中毒，臨床或意外事故中受到的電離輻射，外傷，封閉性腦傷，燒傷， 牛皮癬，衰老過程以及許多其他疾病。

因此需要有一些排除毒性自由基和類似毒素的藥物和方法，它們在體 內(nèi)有足夠的活性和持久性以便當體內(nèi)自由基濃度增加時，這些抗毒成分不 會迅速消耗掉。

而且，進一步的證據(jù)表明自由基可加重許多疾病，其中包括癌癥，潰 瘍和其他胃腸道疾病，白內(nèi)障，封閉性腦損傷，腎衰，神經(jīng)系統(tǒng)的損害， 以及一些心血管疾病。由于其高度反應性自由基可氧化核酸，生物膜和其 它細胞成分，從而導致嚴重或致死的細胞損傷，細胞變異或癌變?？?a href='/zhuanli/list-21096-1.html' target='_blank'>腫瘤 輻射和許多抗腫瘤藥物通過產(chǎn)生自由基來殺腫瘤細胞，但是同時也使分裂 中的正常細胞受到毒害，從而引起癌癥治療中的不良副作用。實際上，人 們認為許多病理過程作為其共同的最終途徑是產(chǎn)生自由基，后者是所觀察 到的病理現(xiàn)象的直接或潛在的原因。此外，可以觀察到自由基濃度的急劇 增長是阻斷供氧血流而引發(fā)的級聯(lián)反應的一部分，如心臟病發(fā)作或中風發(fā) 作，常常緊跟著是供氧血重灌注到受累區(qū)域。由于在生命系統(tǒng)中這種氧化 應力的重要作用，就需要有抗氧化劑功能的藥物和方法，并且它們可設計 成與氧相關性自由基反應以減輕后者在生物體內(nèi)，特別是對人的毒性。在 其他應用中，毒性自由基可適合于有益的治療，如作為癌癥輻射治療的一 部分的放射療法。例如，由于電離輻射引起被照射有機體的生理損害至少 有部分自由基與細胞起反應，細胞所具有的化合物或與自由基起反應的化 合物對接受輻射治療的組織起局部作用，由此控制治療中引起的損傷。此 外，除了臨床上的重要功能，由于自由基中未配對的電子可由波譜學方法 檢測到，可在體內(nèi)監(jiān)視自由基反應并且通過波譜學技術可觀察到與自由基 相互作用的化合物。

建議采用幾種治療方法來降低自由基的病理水平。理想情況下，安全 有效的抗氧化劑能增加病人的抗氧化能力并消除自由基生成階段的病理性 自由基毒性。然而，抵抗氧化應力或氧相關物質(zhì)毒性的方法和藥物的進展 情況不容樂觀。許多抗氧化劑的用途因在體內(nèi)作用時間短、有效劑量時的 毒性、許多化合物透膜時失活、遇到高濃度自由基時失活而受到限制，例 如，在服用超氧化物歧化酶(SOD)或過氧化氫酶時能促進有毒的自由基 相關物轉(zhuǎn)化為無毒的形式。然而，這些酶不能在細胞內(nèi)有效發(fā)揮作用。作 為GSH前體的原半胱氨酸，還有維生素類和其他抗氧化劑能促進體內(nèi)天然 抗氧化劑的能力，但不能作用于高濃度的自由基，后者發(fā)生在創(chuàng)傷，疾病 和迅速體力消耗的情況。

自由基的活性和其作用時間短是眾所周知的。這類活性特別對生物系 統(tǒng)危害嚴重，因為在自由基產(chǎn)生的部位會發(fā)生自由基與身體組織間的有害 化學反應。因此，本身具有內(nèi)在降低自由基濃度功能的化合物是有益的， 雖然這種有益的功效只有當治療作用能夠被集中并作用于身體的特定部位 時才體現(xiàn)出來，如作用于大腦，表皮，內(nèi)臟，心血管系統(tǒng)或非具體的組織 如輻射照射的部位。

在制造適合于大量靜脈注射給藥的血液代用品遇到的困難是在急救時 防止或減輕由血管內(nèi)氧相關物質(zhì)產(chǎn)生的全身毒性。數(shù)十年來，科學家和醫(yī) 師一直建議生產(chǎn)能安全輸給人的血液代用品。長期的供血不足，血型不兼 容問題，交叉配血，以及疾病的傳染性問題已引起私營企業(yè)，大學和政府 機構(gòu)的廣泛關注并致力于發(fā)現(xiàn)一種藥物使得大量的血液替代物能安全的使 用而不產(chǎn)生明顯的生理副作用。目前正有幾家公司進行有關血液替代物的 臨床實驗。然而，在規(guī)定嚴格的批準程序中，有害的生理反應和化合物本 身內(nèi)在的復雜性以及開發(fā)方法阻礙了開發(fā)進程并阻礙了開發(fā)出臨床適用的 血液替代物。

美國海軍研究顧問委員會在1992年8月發(fā)表了一份報告概括了幾個研 究小組制造血液替代物的工作，評價了這方面工作的狀況并一般性地介紹 了遇到的毒性的問題。海軍研究顧問委員會的報告反映了科學界的目前意 見：雖然現(xiàn)有的血液替代物，即通常稱為“基于血紅蛋白的氧載體” (HBOC)已證明在氧輸送上是有效的，某些毒性問題仍沒解決。在對所 謂“基于血紅蛋白的氧載體”(HBOC)的臨床研究中發(fā)現(xiàn)其有害的輸血 反應包括全身性高血壓和血管收縮作用。這些有害反應迫使一些公司放棄 他們的臨床實驗或以低劑量進行這類實驗。

解決存在于基于血紅蛋白的替代物的毒性問題已由美國政府賦予很高 的優(yōu)先權。海軍研究委員會的介紹已得到國立衛(wèi)生研究院以提議(PA- 93-23)的形式在題為“基于血紅蛋白的氧載體：毒性機理?！币晃闹凶髁?補充。因此，醫(yī)學和科學界面臨著急需解決的血液替代物問題，即需要一 種輸血時沒有基于血紅蛋白的氧載體中觀察到的副作用的血液替代物。

紅細胞是血液中的主要成分并且含有身體的氧氣輸送系統(tǒng)。長期以來 人們一直認為血液替代物的最重要的特征是送氧能力。紅細胞能送氧是因 為紅細胞的主要成分是血紅蛋白，后者可作為氧載體。臨床實驗中的大多 數(shù)血液替代物含有從紅細胞膜分離到的血紅蛋白并保留有紅細胞的組成要 素，而且還要除去全部污染物。然而，當血紅蛋白從紅細胞中分離并以其 天然形式置于溶液中時，它是不穩(wěn)定的并很快解離成亞單位的形式。為此， 對基于血紅蛋白的氧載體(HBOC)中的血紅蛋白必須進行穩(wěn)定化以防止 在溶液中解離。科學實驗的大部分費用和資金投入對開發(fā)在溶液中穩(wěn)定并 且這種穩(wěn)定性要保證其送氧功能不受損害的基于血紅蛋白的產(chǎn)品是必須 的?，F(xiàn)有基于血紅蛋白的氧載體的送氧能力已得到很好的確認(見美國專 利3,925,344；4,001,200；4,001,401；4,053,590；4,061,736； 4,136,093；4,301,144；4,336,248；4,376,095；4,377,512；4,401,652； 4,473,494；4,473,496；4,600,531；4,584,130；4,857,636；4,826,811； 4,911,929和5,061,688)。

在體內(nèi)，當血液流經(jīng)肺部時紅細胞的血紅蛋白與氧分子結(jié)合并在流經(jīng) 身體各部時釋放出氧供身體正常代謝的需要。然而，大多數(shù)活的生物體呼 吸的大氣氧是科學和醫(yī)學上的矛盾。一方面，幾乎所有活的生物體都需要 氧來生活。另一方面，各種有毒的氧相關性化學物質(zhì)在正常氧代謝過程中 產(chǎn)生出來。

關于血紅蛋白在傳送氧的過程中產(chǎn)生的氧化應力，大家知道在送氧過 程中血紅蛋白(Hb)分子能被自身攜帶的氧分子(O2)所氧化。這種自 氧化反應產(chǎn)生兩個不良產(chǎn)物：高鐵血紅蛋白(met-Hb)和超氧化物陰離子 (O-2)。化學反應表示如下： Hb+4O2----→met-Hb+4?O-2----[1]

超氧化物陰離子(O-2)是氧分子，它帶有額外的電子和負電荷， 超氧化物陰離子具有高反應性和毒性。

如本文詳述的，自由基物質(zhì)如超氧化物陰離子在廣泛的病理過程中認 為是細胞損傷的因素。在血紅蛋白送氧時，有潛在破壞作用的氧化應力在 血管中生成，而它正是由超氧化物陰離子引起的，后者通過血紅蛋白的自 氧化作用產(chǎn)生并在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下形成過氧化氫，其反 應式如下： 2?O-2+2H+ SOD2O2+H2O2---[2]

反應中自由基產(chǎn)生體內(nèi)有毒的物質(zhì)或引起細胞損傷，此反應在病理條 件下反復發(fā)生。其中氧化應力是誘因，特別是在局部缺血性重灌注損害如 心臟病發(fā)作或中風。紅細胞中存在的超氧化物陰離子和過氧化氫被認為是 紅細胞氧化應力的主要根源。

除上述血紅蛋白送氧功能外紅細胞鮮為人知的特點是它們含有特定一 組酶，這些酶能使氧代謝中的副產(chǎn)物(氧相關化合物)去氧化。沒有這些 特定酶系統(tǒng)的保護，血紅蛋白的自氧化作用會使紅細胞毀壞。然而在體內(nèi)， 紅細胞中這套酶系統(tǒng)具有的能力是通過將正常代謝中產(chǎn)生的超氧化物陰離 子轉(zhuǎn)化成為無毒物質(zhì)來控制氧化應力的水平從而保護身體不受氧的毒害。 如果這套酶系統(tǒng)受到破壞，則紅細胞的完整性即受到破壞。在這套紅細胞 的防御體系中編碼其中任何一種酶的基因受損時，將引起可見的病理癥 狀。例如，葡萄糖六磷酸脫氫酶缺陷癥是一種紅細胞失調(diào)癥，即與過氧化 氫引起的溶血性局部缺血有關。這種失調(diào)癥是由于受累細胞不能保持足夠 的NAD(P)H水平來還原氧化型谷胱甘肽，使谷胱甘肽過氧化物酶對過氧化 氫的解毒作用不充分(PHochstein，F(xiàn)ree?Radical?Biology&Medicine， 5：387(1988))。

紅細胞的這種保護酶體系分兩步化學反應將有毒的超氧化物陰離子分 子轉(zhuǎn)化成無毒形式。第一步是將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化成過氧化氫，此反應 在超氧化物歧化酶催化下進行(見Equation[2])。由于過氧化氫對細胞也是 有毒的，紅細胞還有另一種酶，即過氧化氫酶在第二步反應中過氧化氫轉(zhuǎn) 化成水(見Equation[3])。 [3]2H2O2 過氧化氫酶2H2O+O2

紅細胞還能利用谷胱甘肽過氧化物酶使過氧化氫和其他有毒有機過氧 化物脫氧，此酶與谷胱甘肽反應將過氧化氫和其他有機過氧化物轉(zhuǎn)化成 水。紅細胞中還有一種酶能防止血紅蛋白自氧化作用產(chǎn)生的高鐵血紅蛋白 的積累。此酶即高鐵血紅蛋白還原酶將高鐵血紅蛋白還原成血紅蛋白天然 形式。因此，在體內(nèi)，血紅蛋白自氧化作用的毒性通過一些專一的酶反應 途徑解毒，這些反應途徑消除了氧代謝中的有毒副產(chǎn)物。

超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶保護紅細胞免受 正常氧傳遞中產(chǎn)生的氧的毒性作用，這種酶催化脫氧功能在迄今所開發(fā)的 基于血紅蛋白的氧載體(HBOC)中是不存在的。沒有對氧的解毒功能， 現(xiàn)有的HBOC溶液的安全性將受到有毒的氧相關物存在的威脅。

現(xiàn)有HBOC溶液的主要生產(chǎn)方法是將血紅蛋白從紅細胞中分離，接著 對其進行純化以去掉全部非血紅蛋白蛋白質(zhì)和其他在送氧過程中可能引起 不良反應的不純成分(見美國專利4,780,210；4,831,012和4,925,574)。 氧解毒酶系統(tǒng)的大量破壞和丟失是目前制備HBOC用血紅蛋白的分離方法 和純化方法不可避免的結(jié)果。另一種方法可避開從紅細胞分離和純化血紅 蛋白步驟，通過重組技術得到純血紅蛋白。然而重組人血紅蛋白太純以至 不含紅細胞中的氧解毒系統(tǒng)。因此，開發(fā)復雜的取得極純凈的血紅蛋白溶 液的技術很難說是一種幸事，因為純化過程會除去有害的雜物同時也除去 正常情況下存在于紅細胞膜上的有益的氧解毒酶系，最終受到氧相關毒性 之害。

現(xiàn)有HBOC類靜脈內(nèi)給藥導致的毒副作用之一是血管收縮作用或高血 壓。眾所周知超氧化物歧化酶(SOD)在體內(nèi)迅速清除超氧化物陰離子并 延長硝基氧化合物(NO)的血管舒張作用。最近發(fā)現(xiàn)硝基氧化合物是先 前被認為是“從內(nèi)皮系統(tǒng)得到的血管舒張因子”(EDRF)的一種分子物 質(zhì)。SOD這種使硝基氧化合物的血管舒張作用延長的功效是由于SOD能 防止超氧化物陰離子與硝基氧化合物發(fā)生反應(M.E.Murphy?et?al.， Proc.Natl.Acad?Sci.USA?88：10860(1991)；Ignarro?et?al.，J.Pharmacol?Exp Ther?244：81(1988)；Rubanyi?Am.J.Physiol.250：H822(1986)；Gryglewski?et al，Nature?320：454(1986))。

然而在體內(nèi)并沒觀察到EDRF受超氧化物陰離子作用而失活的現(xiàn)象， 因此通常是不這樣認為的。不過有些損害SOD的活性的病理生理狀況能引 起超氧化物陰離子的毒性作用(Ignarro?L.J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol 30：535(1990)。臨床實驗前用現(xiàn)有HBOC溶液做動物實驗所觀察到的高血 壓現(xiàn)象表明在大量輸入現(xiàn)有HBOC時，超氧化物陰離子濃集是破壞EDRF 以及所觀察到的血管收縮和全身高血壓現(xiàn)象的原因。

因此，重要的是要解釋硝基氧化合物與超氧化物陰離子反應產(chǎn)生高血 壓效應。而這個反應是由硝基氧化合物與血紅蛋白反應并外滲引起的。在 輸入HBOC時，血紅蛋白還能通過與硝基氧化合物反應產(chǎn)生相應的亞硝酰 基血紅素(NO-heme)加合物抑制硝基氧化合物的血管舒張作用。特別 是，已知去氧血紅蛋白與硝基氧化合物的親和性比與一氧化碳的親和性高 數(shù)倍。

這種血紅蛋白與硝基氧化合物的相互作用已用于檢測硝基氧化合物和 研究硝基氧化合物的生物學活性。例如，血紅蛋白對硝基氧化合物血管舒 張作用的拮抗性似乎不依賴于血紅蛋白的細胞膜通透性。在完整的血小板 中血紅蛋白逆轉(zhuǎn)作為硝基氧化合物前體的L-精氨酸的作用。相反，在裂解 的血小板胞液中，血紅蛋白是環(huán)-GMP誘導的L-精氨酸最強的抑制劑，而 環(huán)-GMP是受硝基氧化合物調(diào)節(jié)的。這些實驗證明血紅蛋白不能有效透過 血小板膜(Radomski?et?al.Br.J.Pharmacol.101：325(1990))。因此，HBOC的 理想特點之一是消除硝基氧化合物與血紅蛋白的相互作用。

人們還知道血紅蛋白對內(nèi)皮系統(tǒng)非依賴性血管舒張(Martin?W.et?al J.Pharmacol.Exp.Ther.232：708(1985))以及硝基氧化合物誘導的血管平滑 肌松弛都有拮抗作用(Grueter?C.A.et?al.，J.Cyclic.Nucleotide?Res.5：211 (1979))。人們試圖通過HBOC中的血紅蛋白化學穩(wěn)定化、聚合化、包膜化 或結(jié)合來延長其循環(huán)時間以限制血紅蛋白的外滲和高血壓效應。因此，雖 然目前的HBOC是相對膜不通透性的并且能傳遞氧，HBOC溶液卻不能防 止超氧化物陰離子與硝基氧化合物發(fā)生反應。上述實例表明盡管試圖改進 血紅蛋白生產(chǎn)和設計方法的研究已經(jīng)進行了數(shù)十年，對解決氧毒性/氧化應 力方面的問題即使在氧傳送反應機制理論上完全清楚的情況下仍是個難 題。

對現(xiàn)有血液替代物的毒性問題的理想解決辦法是以血紅蛋白為基礎的 制劑，這種制劑將現(xiàn)有HBOC的送氧功能與紅細胞的氧解毒功能結(jié)合起 來。然而，簡單的加入超氧化物歧化酶(SOD)到現(xiàn)有HBOC溶液中是 不理想的，因為通過降低超氧化物陰離子的濃度血紅蛋白被轉(zhuǎn)化成高鐵血 紅蛋白的反應將得到增強，從而導致不理想的高鐵血紅蛋白積累(見反應 式[1])。而且，不希望增強超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫的反應，因為 過氧化氫是有毒的并且很活躍，它在儲藏時還可降解成有毒的羥基或其他 有毒有機過氧化物的形式。

由于人工血液替代物要適合大量輸入，與自由基反應的化合物在體內(nèi) 必須能保持其功能并必須穩(wěn)定和無毒性。依照本發(fā)明，可用硝基氧化合物 和硝基氧化合物標記的大分子，包括血紅蛋白，白蛋白和其他大分子減輕 生命機體中自由基物質(zhì)的毒性作用。

由血管腔中發(fā)起的自由基級聯(lián)反應造成生理損害的另外實例是腦水 腫，腦壞死和細胞凋亡，其中伴隨著許多病理現(xiàn)象，包括腦血管閉合和局 部缺血現(xiàn)象通常稱為“中風”。源于中風的大部分腦損傷還產(chǎn)生于腦血管 閉合后的重灌注作用。

中風導致的腦損傷消耗大量的人力和保健費用?？茖W家和醫(yī)生一直尋 求一種能預防中風性腦損傷的治療方法。中風中伴隨局部缺血/重灌注損害 的腦損傷主要是由于在血管部位形成自由基并導致引起細胞損害的級聯(lián)反 應。氧自由基毒性與中風導致的腦水腫可與神經(jīng)損害相關連，如轉(zhuǎn)基因 (Tg)SOD-1小鼠所表現(xiàn)的那樣。Chan，P.H.，C.J.Epstein，H.Kinouchi， H.Kamii，S.Imaizumi，G.Yang，S.F.Chen，J.Gafhi，and?E.Carlson(1994)。 SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠是一種研究中風和腦外傷的神經(jīng)防護動物模型。Ann.N Y.Acad.Sci.738：93-103；Chan，P.H.，C.J.Epstein，H.Kinouchi，S lmaizumi，E.Carlson，and?S.F.Chen(1993)。超氧化物歧化酶在局部缺血性 腦傷中的作用是：還原轉(zhuǎn)基因小鼠局部腦局部缺血后的腦水腫和腦梗塞。 Molecular?Mechanisms?of?Ischemic?Brain?Damage，K.Kogure?and?B.K. Siesjo，eds.Amsterdam：Elsevier.pp.96-104.?Kinouchi，H.，C.J.Epstein，T Mizui，E.Carlson，S.F.Chen，and?P.H.Chan(1991)。超表達銅鋅超氧化物 歧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠中局部腦局部缺血的減輕。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11158-11162

在SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠中，人SOD轉(zhuǎn)基因在小鼠腦中的表達達到正常 水平的三倍于并且正如在血管梗塞大小、腦水腫和伴隨繼發(fā)腦局部缺血的 神經(jīng)病學缺陷中檢測到的那樣，對中風起到30％的預防作用。中風中的自 由基損害發(fā)生在細胞內(nèi)和血管內(nèi)，其表現(xiàn)為(a)損害組織中的細胞膜和 細胞器，(b)特別損害血管內(nèi)皮系統(tǒng)。Imaizumi，S.，V.Woolworth，and R.A.Fishman(1990)。脂質(zhì)體包裹的超氧化物歧化酶能降低大鼠腦局部缺血 時的腦梗塞。Stroke?21：1312-1317.Liu，T.H.，J.S.Beckman，B.A. Freeman，E.L.Hogan，and?C.Y.Hsu(1989)。聚乙二醇結(jié)合超氧化物歧化酶 和過氧化氫酶能減小腦損傷。Am.J.Physiol?256：H586-H593.Chan，P.H.，S. Longar，and?R.A.Fishman(1987)。脂質(zhì)體包裹的超氧化物歧化酶對外傷后腦 水腫的預防作用。Ann.Neurol.21：540-547。

在防止腦局部缺血引起的腦損傷方面還沒證明有完全有效的治療藥 物。已對大量的神經(jīng)保護藥，融血栓藥和抗凝藥進行了測試，但許多這類 藥物都伴有有害副作用不利于它們的應用。而且腦局部缺血/重灌注損害可 在手術時發(fā)生，例如發(fā)生在氣泡栓塞之后，由內(nèi)源或外源顆粒引起的栓塞 或低血壓病情發(fā)展中的栓塞。這些問題不可能通過抗凝藥治療解決。就本 發(fā)明中基于硝基氧化合物的藥物的抗凝防護機制來說，本發(fā)明能夠通過防 止細胞在重灌注期間受到損害，從實質(zhì)上減輕重灌注損傷。而且，由于能 夠用分光光度法檢測此類化合物，本發(fā)明可用作中風治療和診斷藥物以及 用作周圍組織性中風，周圍組織性心臟損害和腎臟損害的預防藥物并可結(jié) 合其他抗中風藥如抗凝藥，谷氨酸釋放抑制因子，鈣匯集阻斷劑和NMDA 受體拮抗劑一起使用。

防止血管系統(tǒng)中的氧化應力還減輕或減少氧化脂質(zhì)形成，后者可導致 動脈斑和心血管系統(tǒng)管壁的粥樣硬化，特別是心臟周圍的動脈粥樣硬化。 自由基反應機制還表現(xiàn)為血漿低密度脂蛋白的氧化，而且這種氧化的脂類 還被認為在大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)重灌注損傷中起作用，在嚴重疾病和心血 管系統(tǒng)疾病中起作用。

正如將在本發(fā)明幾個具體實施方案中評價的那樣，按照本發(fā)明將硝基 氧化合物與生物大分子結(jié)合使用以控制體內(nèi)自由基引起的損傷，使得能夠 設計出含硝基氧化合物的治療和診斷藥物和廣泛應用這類藥物的方法。大 量有氧致自由基存在下的生理狀態(tài)可通過使用這類藥物進行診斷或治療。 膜通透性，低分子量硝基氧化合物與生物相容性大分子如血紅蛋白，白蛋 白和其他這類分子結(jié)合使用還使研究人員能設計出適合特殊使用情況的含 硝基氧化合物的制劑。

多組分硝基氧化合物系統(tǒng)還具有癌輻射治療和接受輻射治療時使用的 防輻射藥物功能。在臨床應用中，輻射治療功效將通過允許安全使用高劑 量輻射而得到加強。

長期以來一直需要能防護醫(yī)用放射治療或環(huán)境輻射中遇到的有害電離 輻射的藥物。此類藥物也用于研究輻射的細胞毒性機理。半胱胺是一種含 硫化合物，它是最早使用的防輻射藥物之一。它的發(fā)現(xiàn)促使美國國防部資 助合成并系統(tǒng)搜集40,000多種化合物以找到更有效的藥物。這項繁重的工 作使得發(fā)現(xiàn)了一些防輻射藥如稱為WR-2721的氨基硫醇類化合物。最近已 知超氧化物歧化酶，白介素I和集落細胞刺激因子都具有防輻射活性。與 這些藥物相比，WR-1721具有對正常組織的十分重要的選擇性防護作 用。然而，當用于癌癥放射治療的病人時，由于其內(nèi)在毒性和腫瘤的非選 擇性保護方面的問題使人們失去對WR-1721的熱情。保護組織免受“電 離”輻射的防護能力還能預防和治療紫外線對皮膚的傷害。因此，按本發(fā) 明所配制的藥物可配合以藥用載體如洗液或藥膏應用于皮膚。

已發(fā)現(xiàn)某些穩(wěn)定的硝基氧化合物有抗毒作用和防輻射作用。然而，這 些膜通透性硝基氧化合物在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)變成無活性的形式并可能變得有 毒。按照本發(fā)明可顯著改進膜通透性硝基氧化合物的施用功效。

????????????????????????發(fā)明概述

本發(fā)明公開了與生物相容性大分子結(jié)合使用的穩(wěn)定的硝基氧化合 物，包括其他用于生物系統(tǒng)治療和診斷的硝基氧化合物。具體地說，本發(fā) 明描述了低分子量膜通透性硝基氧化合物，這類硝基氧化合物與以高摩爾 比與生物相容性大分子如白蛋白和血紅蛋白結(jié)合的硝基氧化合物結(jié)合使 用。在某些應用中，一種形式的硝基氧化合物和另一種形式的有不同自由 基穩(wěn)定性的硝基氧化合物的相互作用促進了它們之間的電子或自旋的傳 遞。不同的穩(wěn)定性可能是由于物質(zhì)的電化學環(huán)境或化合物的內(nèi)在性質(zhì)造成 的。本發(fā)明還試圖應用穩(wěn)定的硝基氧化合物自由基，其前體和衍生物(下 文中將統(tǒng)稱為“硝基氧化合物”)，以提供對基于血紅蛋白的血液替代物 的紅細胞氧解毒功能并減輕氧化應力和避免與自由基毒性有關的生物損 傷，包括炎癥，輻射，頭部損傷，休克，局部缺血后重灌注損傷，中風， 腎衰竭，內(nèi)皮系統(tǒng)損傷，脂質(zhì)過氧化作用，鐮狀細胞性貧血，白細胞活化 和聚集，細胞凋亡，電離輻射，脫發(fā)，白內(nèi)障，膿毒癥，牛皮癬潰瘍，老 化過程等。

在某些實施方案中，穩(wěn)定的硝基氧化合物或其衍生物被用于建立幾種 具有紅細胞氧解毒功能的用于血液替代物的制劑。這些制劑在本文中被描 述為基于血紅蛋白的紅細胞替代物(HRCS)，因為通過提供機體紅細胞 的氧解毒功能，這些基于血紅蛋白的氧載體(HBOC)的氧輸送能力被增 強了。由此可設計出對血管無作用的基于血紅蛋白的氧載體，它可避免在 許多HBOC中觀察到的高血壓現(xiàn)象。

為克服單獨使用硝基氧化合物的缺點，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中， 多硝基氧化合物標記的大分子如Tempo-標記的人血清白蛋白被單獨輸注 或與游離的膜通透性硝基氧化合物一起輸注，以增加體內(nèi)硝基氧化合物的 活性。這種制劑的一個好處是一種改進了的輻射防護藥劑，這種藥劑可用 于醫(yī)用診斷和治療，以及用于防護各種來源的輻射傷害。在醫(yī)用治療中， 可增大輻射劑量，從而增加輻射治療成功的可能性。這種能力特別對某些 腫瘤(如腦腫瘤)有明顯作用，并且在結(jié)合本文描述的成像和輸氧時將是 很有用的，特別是對含有缺氧區(qū)域的腫瘤效果明顯。

硝基氧化合物還可通過電子順磁共振波譜法和核磁共振波譜法檢測。 隨著先進成像儀器的開發(fā)，可通過測量和檢測硝基氧化合物的穩(wěn)定自由基 得到完整的生物組織和器官的圖像。按照本發(fā)明，體內(nèi)活性硝基氧化合物 的水平可維持一段較長的時間，使得與單獨使用低分子量膜通透性硝基氧 化合物相比，能夠改進圖像對比度和延長信號存在的時間。而且，與某些 現(xiàn)有的成像改進劑不同，本發(fā)明公開的組合物能透過血腦屏障。

此外，由于它們的抗氧化劑活性，本文公開的組合物具有治療價值， 與它們的診斷價值相結(jié)合，使本發(fā)明的新的組合物和方法可很好地用于廣 泛的應用領域。

還描述了制備和施用各種形式的穩(wěn)定硝基氧化合物的材料和方法。具 體地說，描述了無活性的，相對無毒的膜通透性硝基氧化合物的前體或衍 生物，它們在體內(nèi)由本文描述的其他化合物轉(zhuǎn)化成生物活性硝基氧化合物 或抗氧化劑酶模擬物。在這兩種情況下，在對有害的自由基解毒的過程中 被還原后，化學還原型(無活性的)硝基氧化合物可由其他不同穩(wěn)定性的 硝基氧化合物或硝基氧化合物標記的大分子物質(zhì)重新活化。經(jīng)此再生過 程，本發(fā)明的硝基氧化合物與單獨使用的低分子量膜通透性硝基氧化合物 相比，在體內(nèi)有較長的半衰期。因此，本發(fā)明提供了增強應用的有效性的 組合物和方法，在所述應用中，硝基氧化合物是有效的。

使用本發(fā)明的多組分系統(tǒng)，在低分子量膜通透性硝基氧化合物和有不 同穩(wěn)定性的含硝基氧化合物的膜通透性物質(zhì)之間建立了動力學平衡。具體 地說，以硝?；鶠樘卣鞯幕谙趸趸衔锏幕衔锬芙邮軄碜云渌趸?氧化合物的電子，所述其他硝基氧化合物例如能接受來自羥胺衍生物的電 子的，膜不通透性大分子結(jié)合的硝基氧化合物，它們可作為一種酶模擬物 產(chǎn)生膜通透性硝基氧化合物的活性功能，或相反，作為一種電子受體將硝 基氧化合物的羥胺形式成轉(zhuǎn)化為自由基形式。

按照本發(fā)明，這種維持體內(nèi)活性硝基氧化合物濃度的能力為任何得益 于使用硝基氧化合物但卻受到體內(nèi)的迅速還原作用或理想療效劑量的膜通 透性硝基氧化合物的毒性限制的實際應用提供了便利。例如，按照本發(fā)明， 體內(nèi)硝基氧化合物活性半衰期的延長提供了輻射防護作用，改進了臨床和 其他應用中的成像，在所述應用中，低分子量膜通透性硝基氧化合物的有 效劑量是有毒性的或被迅速消耗。

硝基氧化合物由于其穩(wěn)定的不配對電子而具有順磁性，可作為核磁共 振成像方法(NMR/MRI)和電子順磁共振成像方法(EPR/ERI)中的造 影劑。然而，由于硝基氧化合物迅速還原成波譜法不可見物質(zhì)，最典型的 是羥胺形式，這種藥劑的用途受到了限制。因為自由基物質(zhì)與重灌注損傷 有關，并已知伴隨著氧代謝過程，可用本發(fā)明的組合物作為造影劑觀察局 部缺血組織的損傷和低氧癥。此外，本發(fā)明的組合物的抗氧化劑，酶模擬 物作用為防護氧化損傷提供了額外益處。

多組分的基于硝基氧化合物的系統(tǒng)的獨特優(yōu)點是能傳遞抗氧化劑、防 輻射、抗局部缺血、改進成像，酶模擬物等功能到身體的數(shù)個區(qū)域如血管 腔、組織間隙、細胞內(nèi)區(qū)域或生物結(jié)構(gòu)中基于特定通透性的具體區(qū)域，或 應用已知的具有靶作用和局部藥效的用制劑法。研究人員和醫(yī)生可根據(jù)應 用情況選用上面描述的多組分系統(tǒng)。例如，本文描述的不同制劑有不同水 平的血管舒張作用。由于能夠選擇本發(fā)明的多組分系統(tǒng)的含硝基氧化合 物，使得能夠選擇性地治療或診斷具體的疾病狀態(tài)或病癥，或增加或減少 硝基氧化合物的自由基形式。例如，正象本領域技術人員會認識到的，本 發(fā)明可通過靜脈注射本文描述的多組分系統(tǒng)的一種或多種組分，特別地應 用于心血管系統(tǒng)。同樣，根據(jù)本發(fā)明的具體應用情況，可在通過局部、口 服、或靜脈注射施用其他物類的同時，通過局部施用一種硝基氧化合物來 選擇皮膚的特定區(qū)域。

從根本上說，在某些實施方案中提供了硝基氧化合物(包括前體和代 謝底物)，它可選擇性執(zhí)行所需要的功能，即防輻射，成像，模擬酶等， 并且另一種基于硝基氧化合物的物質(zhì)被用作活性儲存器。就電子自旋傳遞 體來說，一種物質(zhì)可被當作“受體”硝基氧化合物而另一種為“供體硝基 氧化合物”。在某些實施方案中，“供體”和“受體”可在體內(nèi)基本上保 持物理分離并在它們的自由基部分應具有不同的穩(wěn)定性。在優(yōu)選實施方案 中，受體硝基氧化合物是多硝基氧化合物白蛋白，它主要存在于血管部位 并起著活性倉庫的作用。典型的供體物質(zhì)是低分子量膜通透性物質(zhì)如TPL 或TPH。另外，供體物質(zhì)可以是膜不通透性的，而受體物質(zhì)是膜通透性的， 并且這些物質(zhì)被如此選擇使得硝基氧化合物活性被抑制。

普通技術人員會認識到被選作供體或受體的各個物質(zhì)只要基本上維持 物理上的分離并具有不同的穩(wěn)定性，就可以是不同的。例如，相同硝基氧 化合物既可作為受體又可作為供體。在這樣的實例中，標記在大分子如白 蛋白的幾個氨基上的TPL，提供了基本上是膜不通透性的受體硝基氧化合 物。通過在氨基基團上進行標記而提供大分子結(jié)合的TPL的不同的穩(wěn)定 性，這樣剩下的羧基基團產(chǎn)生酸性微環(huán)境，在白蛋白標記的TPL中得到不 穩(wěn)定的自由基狀態(tài)。另外，通過其內(nèi)在的化學和電子結(jié)構(gòu)，可提供不同的 未結(jié)合的硝基氧化合物，以提供必需的分離和不同的穩(wěn)定性。

本發(fā)明化合物產(chǎn)生的動力學平衡發(fā)生在還原型硝基氧化合物和氧化型 硝基氧化合物之間，使得一種在體內(nèi)有活性，而另一種無活性?；緳C制 是第二硝基氧化合物的硝?；鶑牡谝幌趸趸衔锝邮茈娮?，特別是從其 還原型羥胺衍生物接受電子。第二硝基氧化合物在與第一硝基氧化合物接 觸時由于游離硝?；鶊F的穩(wěn)定性的不同而能夠接受一個電子。例如，自由 基或“氧化”形式，如TPL，被迅速還原成TPH，直到由多硝基氧化合物 白蛋白(PNA)再生成TPL。

應用與生物相容性大分子結(jié)合的硝基氧化合物的優(yōu)選組合物可以是不 同的；例如，對于生理相容性輸注液如基于血紅蛋白的氧載體，該組合物 包括：1)加入到儲存容器中或包含于濾器中的含硝基氧化合物的化合 物；硝基氧化合物可化學連接到濾器中不溶性基質(zhì)上或以方便儲存和施用 的不同形式包含于其中，2)共價連接到用化學或重組交聯(lián)法穩(wěn)定的血紅 蛋白上的硝基氧化合物，3)共價連接到聚合血紅蛋白上的硝基氧化合 物，特別是2、4和8摩爾當量的硝基氧化合物，4)與血紅蛋白一起包 裹在脂質(zhì)體中或嵌入到脂質(zhì)體膜中的硝基氧化合物，(5)共價結(jié)合到結(jié) 合血紅蛋白上的硝基氧化合物，(6)共價結(jié)合到高摩爾比(即6-95) 的白蛋白的數(shù)種形式的硝基氧化合物，(7)共價結(jié)合到免疫球蛋白上的 硝基氧化合物，以及上述多組分系統(tǒng)中的任意組合物。

如上所述，上述組合物可根據(jù)應用情況獨立使用或與低分子量膜通透 性硝基氧化合物結(jié)合使用。而且，上述組合物可以是與其他化合物特別配 制的，以改變它們的體內(nèi)活性或穩(wěn)定性。具體地說，環(huán)葡聚糖 (cyclodextran)和其他已知穩(wěn)定劑可用于增進基于血紅蛋白的溶液的穩(wěn) 定性。而且，已知必需的營養(yǎng)成分硒能產(chǎn)生超氧化物并可與多硝基氧化合 物大分子一起使用以促進其氧化作用。這些制劑還可與其他防氧化應力， 促進成像，增加或降低對輻射的敏感性的已知化合物，以及與其他已知的 臨床或診斷用化合物一起使用。

下面給出實驗結(jié)果以表明低分子量硝基氧化合物可通過與本發(fā)明的硝 基氧化合物標記的大分子相互作用從還原型無活性形式再生成有活性形 式。下面的實驗結(jié)果和方法顯示硝基氧化合物可連接于生物相容性大分 子，包括白蛋白和穩(wěn)定化的、聚合的、結(jié)合的和包裹的血紅蛋白，供診斷 治療和與氧化應力相關的生理病癥的測定之用。硝基氧化合物標記的血紅 蛋白和硝基氧化合物標記的白蛋白無論是單獨還是與帶有自由基的低分子 量硝基氧化合物結(jié)合使用，它們的相互作用顯示具有一定血漿半衰期的其 他生物相容性大分子可被硝基氧化合物標記，并按本發(fā)明應用，以有利于 抵抗或預防由自由基化學物類引起的氧化應力或毒性。

給出的實驗結(jié)果還表明本發(fā)明的組合物和方法當與HBOC輸注時具有 抗高血壓作用，因此HBOC溶液的輸注是對血管無作用的。防輻射作用在 細胞培養(yǎng)物中以及暴露于致死劑量輻射的小鼠中都得到證明。顯示了大鼠 心臟的EPR圖像，它能監(jiān)視局部缺血和重灌注損傷的過程，并且表明除圖 像增強作用外，本文公開的組合物還保護局部缺血的心臟不受重灌注損 害。預防局部缺血/重灌注損傷的作用在心血管和腦血管系統(tǒng)中都表現(xiàn)出 來，實驗結(jié)果還顯示了本發(fā)明在抑制脂類氧化和白細胞激活，以及治療以 及保護皮膚方面的防護作用。

????????????????????????附圖簡述

圖1A和1B表示4-氨基-TEMPO標記的o-棉子糖聚合血紅蛋白在第一 天(A)和第三十天(B)記錄的電子自旋共振波譜。圖1C是圖1A樣 品用等體積無標記血紅蛋白稀釋后在第一天記錄的波譜。圖1D是圖1C樣 品在第三十天記錄的波譜。

圖2A和2B分別是證明4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO共價相連到ω- 氨己基-瓊脂糖和4-氨基-TEMPO共價連接到1，4-雙(2：3-環(huán)氧丙酰 基)丁烷活化瓊脂糖的電子自旋共振波譜。

圖3A和3B分別是證明4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO和3-馬來酰亞氨 基-PROXYL成功共價連接到交聯(lián)型3，5-雙-溴甲硅烷基-二富馬酸 (DBBF)或交聯(lián)型雙阿司匹林人血紅蛋白(HBOC)的電子自旋共振波 譜。

圖4A是4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO的ESR波譜。圖4B是4-(2- 溴乙酰氨基)-TEMPO-標記HBOC的ESR波譜。圖4C是15ND17?TEMPOL 在乳酸化Ringer′s液中的ESR波譜。

圖5是4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-標記的HBOC在硝基氧化合物對 Hb的不同分子比時的ESR波譜；圖5A2：1，圖5B4：1和圖5C8： 1。儀器從圖5A到圖5B到圖5C所記錄的波譜敏感性遞減，以至使中間 峰值(Mo)顯示類似的峰高度。

圖6是4-(2-溴乙酰氨基)TEMPO標記的HBO-C和15ND17-TEMPOL 混合物的ESR波譜，其中前者峰值(見向下箭頭)和后者高區(qū)峰值(見向 上箭頭)調(diào)整到類似的強度。這是圖4B和圖4C的ESR波譜疊加峰。

圖7顯示小鼠的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-標記的HBOC血漿半衰 期。圖7A是小鼠尾部靜脈注射0.5毫升圖6樣品后10分鐘記錄的硝基氧 化合物信號的ESR波譜。圖7B是在10倍儀器敏感度時記錄的圖7中間峰 值(Mo)單強度的時間依賴性降低(掃描時間30分鐘)。圖7C是圖7B 在掃描結(jié)束時的延續(xù)部分。

圖8表示用注射硝基氧化合物直接記錄套管法從小鼠尾部記錄的4- (2-溴乙酰氨基)-REMPO-標記的HBOC(每dl?8克血紅蛋白和TEMPO 對血紅蛋白比例是8∶1)與15ND17?TEMPOL(每32克體重小鼠內(nèi)0.5 毫升)混合物的血漿半衰期。注射前樣品的ESR波譜如圖6所示。圖8A 是0.5分鐘間隔記錄的5個ESR波譜每次波譜掃描磁場強度增加2高斯以 展示隨時間函數(shù)單個強度的降低。圖8B是在同樣時間間隔內(nèi)重復記錄一 系列6個ESR波譜的圖8A的延續(xù)部分，不同的是每次掃描磁場強度降低 2高斯。

圖9A和9B，分別是證明4-氨基-TEMPO標記并o-棉子糖交聯(lián)的聚合 人血紅蛋白和3-馬來酰亞氨基-PROXYL標記的DBBF-血紅蛋白用戊二醛 聚合的電子自旋共振波譜。

圖10A和圖10B分別是含(A)3-DOXYL-膽甾烷(B)16-DOXYL- 硬脂酸并脂質(zhì)體包裹的人血紅蛋白電子自旋共振波譜。圖10C是3-DOXYL- 膽甾烷和16-DOXYL-硬脂酸的電子自旋共振波譜。

圖11是硝基氧化合物標記的血紅蛋白用4-氨基-TEMPO標記并與葡聚 糖交聯(lián)的電子自旋共振波譜。

圖12是含結(jié)合有硝基氧化合物的固體基質(zhì)的濾盒，含血紅蛋白的溶液 可通過此基質(zhì)。

圖13表示向清醒大鼠體內(nèi)靜脈注射乳酸化Ringer′s溶液(虛線)和 7.89/dl?10％v/v?DBBF-Hb+多硝基氧化合物白蛋白(PNA)5g/dl+TPL?100 毫摩爾10％v/v(實線)后大鼠的平均動脈壓反應。允許讓大鼠手術后恢 復并在研究實驗前麻醉7天。

圖14是表示靜脈注射后大鼠TPL血漿濃度的時間依賴性圖示。血漿 樣品取自圖13的大鼠。TPL血漿濃度由EPR電子自旋密度測試決定。

圖15A，15B和15C分別是相應的順磁共振波譜，它們是：15A， TPL(2毫摩爾)在50毫摩爾的磷酸鈉緩沖液中，pH7.6：15B，TPH (2毫摩爾)在同樣緩沖液中；15C，多硝基氧化合物白蛋白(PNA)。 波譜儀設定如下。微波電源：8毫瓦；感受器增益：1.00e+03；調(diào)制放大： 0.5G；調(diào)制頻率：100千赫；微波頻率：9.43兆赫；搜索寬度：200G。

圖16是直方圖表示12Gray輻射下中國倉鼠V79細胞存活比例。V79 細胞在x光照射前預處理10分鐘。用TPH或單獨用PN沒觀察到防輻射反 應(顯示2％存活的直方圖與不加處理的對照組相同)。在含有TPH和PNA 結(jié)合使用的樣品中顯示出增加的防輻射反應(8％存活)。

圖17表示通過將固定濃度為25毫摩爾的PNA?TPH與溶于50毫摩爾 磷酸鈉，pH7.6緩沖液但濃度增加的PNA混合，使TPH轉(zhuǎn)化成TPL。 TPL/TPH比例對25毫摩爾PNA濃度繪圖。這個比例表現(xiàn)了轉(zhuǎn)換效率。通 過將25毫摩爾TPH和7種不同濃度的PNA在室溫下溫浴30分鐘后在 5000xg下用10KD膜CENTROCON分離1小時來決定TPL濃度。在濾出 液中TPL的高磁場EPR峰強度通過所繪制的的TPL標準曲線圖計算。

圖18A是小鼠尾部的連續(xù)15個(15)EPR波譜記錄，每次掃描間隔 中用人工方法增加約1G的場強。掃描次數(shù)標記在15N?TPL的高磁場峰值處 (M-1/2)。事先給小鼠注射0.5毫升40毫摩爾15N?TPL，后者還原成半 衰期為2分鐘(結(jié)果未顯示)的EPH。將PNA和15N?TPL混合物第二次 注射到小鼠尾靜脈表現(xiàn)了類似的15N-TPL消失速率(見半衰期為2分鐘的 30秒間隔的1-5峰值記錄)繼之以峰強度的等速恢復(見峰值5-7)。TPL 蛻變峰強度半衰期是13分鐘(見峰值7-15，記錄間隔為1分鐘)。多硝 基氧化合物白蛋白(PNA)的中間(Mo)寬共振峰(A)顯示在15N-TPL 峰(TPL)的兩個線束(M+1/2和M-1/2)之間，也出現(xiàn)半衰期為13分鐘 的蛻變。因此，15N-TPL清楚證明在體內(nèi)自旋電子從TPH傳遞給PNA的 14N硝基氧化合物。圖18B，18C和18D是ESR波譜，通過三種不同的硝 基氧化合物標記的人蛋白質(zhì)顯示TOPS活性。圖18B和圖18D通過不同硝 基氧化合物標記的白蛋白顯示TOPS活性。圖18C是硝基氧化合物標記的 基于血紅蛋白的氧載體。圖18B顯示(1)只有50毫摩爾TOPS；(2) 43毫摩爾PNA；(3)PNA(43毫摩爾)與TOPS(50毫摩爾)的PH7.8 的磷酸鈉溶液混合2小時。圖18C表示(1)只有50毫摩爾的TOPS；(2) 15毫摩爾的PN-HBOC；(3)PN-HBOC(15毫摩爾)與TOPS(50 毫摩爾)的pH7.8磷酸鈉緩沖液混合2分鐘。圖18D表示(1)只有50- 毫摩爾TOPS；(2)10毫摩爾B3T-標記的白蛋白；(3)B3T標記的 白蛋白(10毫摩爾)與TOPS(50毫摩爾)的pH7.8磷酸鈉緩沖液混合2 分鐘。

圖19顯示在C57小鼠中有或無PNA時TPL和TPH的藥物動力學。 任意單位的TPL血漿水平如檢測EPR高磁場峰值強度所繪制的那樣是時間 場的函數(shù)(分鐘)，(□)TPL(2毫摩爾)靜脈注射給藥，(◇)TPL275毫克 /公斤腹膜內(nèi)給藥，(○)PNA靜脈注射給藥繼之以TPH100毫克/公斤腹 膜內(nèi)給藥。

圖20顯示經(jīng)10Gray輻射的C57小鼠(每組10只小鼠(N＝10)存活 力實驗，照射前用PNA?0.5毫升/小鼠經(jīng)靜脈注射給藥，10分鐘后靜脈注 射PBS緩沖液(■)，10分鐘后腹膜內(nèi)給藥(ip)0.5毫升PBS繼之以 200毫克/公斤TPL(●)，10分鐘后靜脈注射給予多硝基氧化合物白蛋 白0.5毫升/小鼠繼之以200毫克/公斤TPL(◆)。

圖21顯示經(jīng)10Gray輻射的C57小鼠存活力實驗，照射前用PNA?0.5毫 升/小鼠經(jīng)靜脈注射給藥，10分鐘后靜脈注射PBS緩沖液(■)，10分鐘 后腹膜內(nèi)給藥0.5毫升PBS繼之以200毫克/公斤TPL(●)，10分鐘后 靜脈注射給予多硝基氧化合物白蛋白0.5毫升/小鼠繼之以50毫克/公斤 TPL(◇)。

圖22A是承載TPL和多硝基氧化合物白蛋白的大鼠心臟三維立體 (25X25X25立方毫米)圖像(全視野)。此圖像是用局部缺血后2.5小 時得到的144個投影建立的。圖22B是同一圖像的截面圖。有用數(shù)據(jù)參數(shù) 有波譜促發(fā)脈沖：7.0G；立體促發(fā)脈沖：2.5毫米；最大梯度：49.3G/厘 米。

圖23是承載TPL和PNA的大鼠心臟的EPR圖像(25×25mm2)， 指示的時間是局部缺血的持續(xù)時間(156分鐘)，得自一個三維圖像。數(shù) 據(jù)獲取參數(shù)為：采樣時間：10分鐘；波譜窗口：7.0G；空間窗口：25毫 米；最大梯度：43.9G/厘米。

圖24顯示局部缺血心臟在不同時間內(nèi)15N-TEMPOL?EPR的信號強 度。上邊的直線表示經(jīng)2毫摩爾TPL+PNA處理后的心臟(●)，下面的 直線表示單獨用2毫摩爾TPL處理后的心臟(■)。實線是對觀察的強度 數(shù)據(jù)的雙指數(shù)擬合。半衰期分別是0.4分，2.9分(■)，3.3分，30.1分 (●)。

圖25是承載TPL+PNA的大鼠心臟在局部缺血期間EPR二維斷面圖 像，在連續(xù)圖像中有時間數(shù)字顯示(分∶秒)。此圖像來源于三維立體圖 像。有用的數(shù)據(jù)參數(shù)同圖23。

圖26顯示對未處理的對照組(○)，用2毫摩爾TPL處理(●)， PNA(4g/dl)+2毫摩爾TPL處理(的心臟冠狀動脈血流的恢復測定。心 臟經(jīng)受30分鐘的局部缺血繼之以45分鐘的血流恢復。

圖27顯示對未處理的對照組心臟(○)，用2毫摩爾TPL處理(●)， PNA(4g/dl)+2毫摩爾TPL(▲)處理的大鼠血壓生成恢復的測定。心 臟經(jīng)受30分鐘的局部缺血繼之以45分鐘的血流恢復。

圖28是用15N-TPL+PNA處理的大鼠心臟局部缺血期間TEMPOL的 EPR信號強度圖解，此圖解由圖25顯示的圖像繪制的。強度值從相應三維 立體圖像的下列特定部位得到的：LAD(●)，動脈(■)，LV-反射點 (_)和組織(▲)。

圖29顯示給清醒大鼠靜脈注射7.8g/dl10％v/vDBBF- Hb+7.5g/dlPNA+100毫摩爾10％v/v?TPL(n＝4)時反映的平均動脈壓 (MAP)。允許大鼠手術后恢復并在實驗前麻醉約7天。

圖30顯示用PNA處理小鼠的神經(jīng)學缺陷的功能復原。通過MCA/CCA 栓塞法造成動物局部腦局部缺血病灶繼之以重灌注。動物在局部缺血現(xiàn)象 出現(xiàn)前用PNA(PNA前)或人血清白蛋白(HAS)處理或在重灌注后立 即做上述處理，重灌注24小時后評價神經(jīng)學病癥。所用PNA或人血清白 蛋白是體重的0.5％，v/w。

圖31顯示用PNA處理的小鼠血管梗塞的恢復情況。通過MCA/CCA 栓塞法造成動物局部腦局部缺血病灶繼之以重灌注。動物在局部缺血現(xiàn)象 出現(xiàn)前用PNA(PNA前)或人血清白蛋白(HAS前)處理或于重灌注后 立即做上述處理(PNA后，HAS后)，重灌注24小時后處死小鼠做組織 學分析。所用PNA或人血清白蛋白劑量是體重的0.5％，v/w。從腦前端 每隔05毫米做一系列冠狀橫切，從血管梗塞的累加面積計算血管梗塞體 積。結(jié)果用均值±SEM表示，n＝7。

圖32顯示用PNA處理的小鼠血管梗塞的恢復百分數(shù)情況。通過 MCA/CCA栓塞法造成動物局部腦局部缺血病灶1小時繼之以重灌注。動 物在局部缺血現(xiàn)象出現(xiàn)前用PNA(PNA前)或人血清白蛋白(HAS前) 處理或于重灌注后立即做上述處理(PNA后，HAS后)，重灌注24小時 后處死小鼠做組織學分析。所用PNA或人血清白蛋白劑量是體重的0.5％， v/2。按照(血管梗塞體積/同側(cè)大腦半球體積)x100計算血管梗塞百分數(shù)。 結(jié)果用均值SEM表示，n＝7。

圖32A顯示對照組與PNA-處理組小鼠的大腦一系列切面的中風損傷 量的比較。取大腦前端每隔500微米的一系列20微米厚度的冠狀組織切 片，大腦局部缺血量化為每個切片的血管梗塞面積(平方毫米，均值 S.D.)。在PNA-處理小鼠的血管梗塞面積(●)與對照組(■)相比的差異是 兩條線之間的面積(p＜0.05，Student′st測驗)。

圖33顯示PNA處理的小鼠大腦半球腫大的恢復情況。通過MCA/CCA 栓塞法造成動物局部腦局部缺血病灶1小時，繼之以重灌注。動物在局部 缺血現(xiàn)象出現(xiàn)前用PNA(PNA前)或人血清白蛋白(HAS前)處理或于 重灌注后立即做上述處理(PNA后，HAS后)，重灌注24小時后處死小 鼠做組織學分析。所用PNA或人血清白蛋白劑量是體重的0.5％，v/w。 大腦半球腫大百分比計算為(同側(cè)大腦半球體積-對側(cè)大腦半球體積對側(cè)大 腦半球體積)x100。結(jié)果用均值士SEM表示，n＝7。

圖34A和圖34B顯示具代表性的冠狀切面，它表現(xiàn)PNA-處理小鼠和 相對于對照組在經(jīng)過局部大腦局部缺血(1小時)和重灌注(24小時)后， 大腦血管梗塞的復原情況。用甲苯紫對20微米厚的腦切片染色，這種染料 很難被局部缺血組織吸收。圖34A是未經(jīng)處理的動物腦切片，顯示了幾乎 占整個腦半球的大片的局部缺血性損傷(未染色區(qū)域)。與同一大腦對側(cè) 腦半球相比，水腫看上去像是增大了的血管梗塞的大腦半球。圖43B是 PNA-處理的動物大腦的一個切片，呈現(xiàn)了正常組織學和無腦水腫情況。這 表明PNA提供了防止中風損傷的作用。圖34C代表PNA-處理組和相應對 照組比較呈現(xiàn)了中風損傷的復原的組織切片。動物經(jīng)受腦局部缺血(1小 時)和重灌注(24小時)。在局部缺血和重灌注出現(xiàn)前給處理小鼠靜脈注 射PNA。每副劑量等于體重的1％(v/w)。為證明解剖學意義的局部缺 血程度，取大腦前端間隔500微米的20微米厚冠狀切片，并用甲苯紫染色。 局部缺血組織未染上顏色。未處理動物(左手部分)呈現(xiàn)幾乎整個大腦半 球的局部缺血性損傷。作為明顯對照，PNA-處理的動物(右手部分)全大 腦呈現(xiàn)正常的組織學特征。

圖35是輸注PNA的動物大腦的一系列染色冠狀切片，染色是在MCA 血管縫合術2小時后進行的。

圖36是輸注生理鹽水的對照組動物大腦的一系列染色冠狀切片，染色 是在MCA縫合術2小時后進行的。

圖37A和37B是在臨時性MCA閉合術和給予生理鹽水、人血清白蛋 白和PNA后，大鼠的血管梗塞體積和百分數(shù)的組織學分析。

圖38是在2小時間隔內(nèi)注射3次PNA后，大鼠血液自旋電子密度相 對于時間函數(shù)的測定。

圖39是閉合術和MCA重灌注時，大鼠腦的加重擴散性核磁共振圖 像。

圖40A，40B和40C是麻醉小鼠背部皮膚中的PNA和15N-TPL的EPR 波譜。在小鼠背部做PNA皮內(nèi)注射100微升并記錄(A)中顯示的波譜。 然后做15NTPL(1％v/w，20毫克/毫升)靜脈注射，并記錄1分鐘后顯示 為(B)的波譜。30分鐘后記錄顯示為(C)的波譜。

圖41顯示靜脈內(nèi)15N-TPL(1％v/w)的藥物動力學，在注射PNA部 位的小鼠背部皮膚片上測定。取低場15N-TPL峰值強度對時間做圖。15N- TPL峰值對時間做圖。15N-TPL信號在注射后上升，5分鐘后急劇下降。 反映了生物復原現(xiàn)象。正如本文的TPL表現(xiàn)那樣，15N-TPL信號在5分鐘 后得到穩(wěn)定。并保持穩(wěn)定至少30分鐘，反映了被PNA氧化。

圖42A和42B顯示在小鼠腹部皮膚片測定的靜脈內(nèi)15N-TPL (1％v/w)藥物動力學。(A)低場峰強度上升和下降以及注射15N-TPL 后5分鐘內(nèi)下降情況。(B)作為時間的函數(shù)，靜脈注射100微升PNA后 15N-TPL信號強度增加持續(xù)至少30分鐘。

圖43顯示注射甘油到肌肉中進行橫紋肌動物模型分析時，10天后的 存活率以及隨后腎衰情況，用多硝基氧化合物白蛋白合并使用TEMPL和 白蛋白作為對照。

????????????????????????發(fā)明詳述

硝基氧化合物是穩(wěn)定的自由基，它表現(xiàn)出抗氧化劑催化活性，類似于 超氧化物歧化酶(SOD)所具有的作用并且當存在于體內(nèi)時，能與其他物 質(zhì)反應執(zhí)行過氧化氫酶類似的功能。硝基氧化合物在過去被用于電子自旋 共振波譜作為“自旋標記”以研究生物大分子的構(gòu)像特征和運動特征。硝 基氧化合物還用于檢測反應性自由基的中間產(chǎn)物，因為它們的化學結(jié)構(gòu)提 供了具有界定良好的超精細相互作用的穩(wěn)定未配對電子。此外，還觀察到 硝基氧化合物起酶模擬物作用。某些低分子量硝基氧化合物已鑒定具有 超氧化物歧化酶(SOD)模擬物的活性。(A.Samuni?et?al.J.Biol.Chem. 263：17921(1988))和過氧化氫酶的活性(R.J.Mehlhorn?et?al.，F(xiàn)ree?Rad Res.Comm.，17：157(1992))。大量研究還表明硝基氧化合物可通透過細胞 膜，能短期保護哺乳動物細胞免受來自次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶造成的超氧 化物陰離子和來自過氧化氫的毒害。

本文所用術語“硝基氧化合物”是指穩(wěn)定的硝基氧化合物自由基，包 括含有硝?；幕衔铮绾铣傻木酆象w，它們的前體(如N-H形式)， 和相應的衍生物，包括其羥胺衍生物(N-OH)，其中的氧原子被羥基置 換并以鹵化氫形式存在。從本發(fā)明目的上說，羥胺衍生物的氯鹽形式一般 是較理想的。

本文的硝基氧化合物中，未配對電子是部分穩(wěn)定的，因為氮原子核與 兩個被強電子供體取代的碳原子相連。兩個碳原子帶有N-O鍵中的氧的部 分負電荷，使氮原子核上的未配對電子有了固定的位置。

硝基氧化合物一般可有雜環(huán)和鏈式兩種結(jié)構(gòu)?；九袆e標準是穩(wěn)定的 自由基。從結(jié)構(gòu)上說，下述分子式的硝基氧化合物是優(yōu)選的，其中R1-R4 是電子供體并且A是雜環(huán)中的保留成員。

在這些雜環(huán)結(jié)構(gòu)中，“A”代表五元雜環(huán)結(jié)構(gòu)(即，吡咯烷基或帶雙 鍵的PROXYL即吡咯烷)或六元雜環(huán)結(jié)構(gòu)(即，哌啶基或TEMPO)中保 留的碳原子并且其中的一個碳原子可被氧原子(噁唑啉基或DOXYL)取 代并且某些氫原子可被多至兩個溴原子取代。在這類雜環(huán)結(jié)構(gòu)中，可使用 穩(wěn)定的同位素(如15N，氘)。在α碳原子上的取代應當使未成對電子基 本上維持在πp軌道構(gòu)型。R1到R4是鏈烷基(直鏈或支鏈)或芳香基但最 好是甲基或乙基。任何硝基氧化合物α碳上的取代基應是強電子供體以加 強穩(wěn)定性，因此甲基(CH3)或乙基(C2H5)是優(yōu)選的，即使其他較長碳 鏈的種類也可使用。見美國專利5,462946。保留自由基活性的其他替代物 是業(yè)內(nèi)人士所熟知的。并且一直在不斷合成出來。見Bolton等人的″一些 四甲基異吲哚基-2-氧?；杂苫腅PR?and?NMR研究”J.Chem.Soc. Perkin?Trans.(1993)和Gillies等人的“一些5-(正烷基)-1，1，3，3-四 (三氘代甲基)-異二氫氮茚-2-基氧基的EPR超精細偶合常數(shù)的NMR 確定”，J.Chem.Soc.Faraday?Trans.，90(16)，2345-2349(1994)；

按照本發(fā)明，當與生物相容性大分相連時，硝基氧化合物的活性由于 微環(huán)境而改變。這種活性可根據(jù)所使用的標記方案和其他化合物如已知能 改變自由基穩(wěn)定性或活性的硒而不同。在實踐中硬脂酸可能會限制既經(jīng)濟 又實用的硝基氧化合物的使用范圍。本發(fā)明優(yōu)選使用的硝基氧化合物具有 下列結(jié)構(gòu)：

DOXYL ??(4，4-二甲基-3- ??噁唑啉基氧.) (4，4-二甲基噁唑烷-

N-氧基)

PROXYL ??(2，2，5，5-四甲基-1 ??-吡咯烷基氧) (2，2，5，5-四甲基吡咯烷-

N-氧基)

TEMPO (2，2，6，6-四甲基-1 -哌啶烷基氧.) (2，2，6，6-四甲基哌啶-

N-氧基) 從上顯而易見，最適合的硝基氧化合物基本上可用下述結(jié)構(gòu)式表示

假設R基選自保持自由基穩(wěn)定的構(gòu)像。

如上所示，硝基氧化合物的結(jié)構(gòu)形式可經(jīng)過改變而不影響其基本功 能。硝基氧化合物的功能基也可結(jié)合成二聚體如下面介紹的B3T，寡聚體， 或多硝基氧化合物人工合成聚合體，后者含有各種重復亞單位，每一種亞 單位含至少一個硝基氧化合物。優(yōu)選的合成聚合體在其各取代單位(n)上有 硝基氧化合物和羧基基團。例如，下面的化合物可由已知技術合成，如美 國專利5,407,657介紹的從二胺化合物和二酐化合物生成聚合體。

為符合本發(fā)明之目的，美國專利5,407,657中的聚合體的硝基氧化合物 最好用溴代TEMPO取代。這類合成的聚合體可用于標記血紅蛋白，特別 是天然血紅蛋白。其方法是用略微過量的二聚體合成這類化合物以在聚合 體的末端產(chǎn)生游離的氨基。末端氨基與嗜中性基團反應如溴乙?；寤?反應產(chǎn)生溴代TEMPO的硝基氧化合物聚合體衍生物，使得能給類似于 PNA和PNH的蛋白質(zhì)上的氨基做標記。

已有各種技術可將硝基氧化合物共價連接到生物大分子上，包括血紅 蛋白，白蛋白，免疫球蛋白和脂質(zhì)體。見McConnell?et?al.，Quart.Rev.Biophys 3：p.91(1970)；Hamilton?et?al，″結(jié)構(gòu)化學和分子生物學″A?Rich?et?al.，eds.， W.H。freeman，San?Francisco，P.115(1968)；Griffith?et?al.，Acc.Chem.Res 2：p.17(1969)；Smith?I.C.P.″電子自旋共振波譜的生物學應用″Swartz，H.M. et?al.，eds.，Wiley/Interscience，New?York?p.483(1972)。選擇的硝基氧化合物 共價結(jié)合到血紅蛋白分子以用于研究血紅蛋白的攜氧結(jié)合機制。

關于本文介紹的大分子，至少有兩種技術即通常稱謂的“標記策略” 使硝基氧化合物結(jié)合到大分子上成為可能。特定標記的重要意義在于結(jié)合 到大分子上的硝基氧化合物微環(huán)境和由此產(chǎn)生的硝基氧化合物的催化活 性。在特定配位體結(jié)合部位或生成血紅蛋白的部位做特殊標記會使結(jié)合部 位有更加恒定的微環(huán)境，由此產(chǎn)生對硝基氧化合物的催化活性和專一性來 說更可靠的化合物。

本文使用術語“血紅蛋白”是指氧合血紅蛋白、碳氧血紅蛋白、一氧 化碳血紅蛋白和脫氧血紅蛋白，文中另有注釋者除外。本發(fā)明所用血紅蛋 白可源于人，重組或動物血紅蛋白。并使用已知技術分離和純化。血紅蛋 白可通過與醛基反應共價連接到吡哆醛-5’-磷酸的吡哆醛基或開環(huán)式腺嘌 呤三磷酸(o-ATP)并與血紅蛋白的衍生物交聯(lián)。交聯(lián)衍生物包括多功能， 異種雙功能和同種雙功能交聯(lián)劑如二醛，聚合醛，雙環(huán)氧化物，多環(huán)氧化 物，活化多羧基和二羧基，例如3，5-雙-溴硅?；?二延胡索酸和TEMPO 琥珀酸或TOPS見(美國專利4,240,797)環(huán)葡聚糖和其他陰離子交聯(lián)血紅 蛋白(如硫酸鹽)以及聚合血紅蛋白。穩(wěn)定化血紅蛋白可形成具有交聯(lián)外 層的微球體，交聯(lián)外層由蛋白質(zhì)內(nèi)的交聯(lián)半胱氨酸殘基產(chǎn)生(VivoRx Pharmaceuticals，Inc.，Santa?Monica，CA)。本文介紹的全部血紅蛋白溶液和 其他以硝基氧化合物為基礎的溶液，比如本文介紹的本發(fā)明其他化合物中 的血紅蛋白以生理學相容形式如生理學可接受的靜脈注射形式或懸浮在可 接受的載體，溶劑或基質(zhì)中的形式給藥。血紅蛋白溶液是無細胞的，以除 去熱源，內(nèi)毒素和其他污染物。

所使用的與白蛋白相連的硝基氧化合物優(yōu)選組合物包括：

1)用硝基氧化合物(即，4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO以高硝基氧 化合物對白蛋白比例非專一性標記的白蛋白；

2)特定配位體部位的專一性標記白蛋白；

3)通過二硫鍵的烷基化反應和還原反應增強標記的白蛋白。

本文使用的術語白蛋白包括人血清白蛋白，動物白蛋白，重組型白蛋 白，和片段。白蛋白可用溫度或化學方法處理增加可以利用的標記部位。 此外，白蛋白可以單體，二聚體，聚合體存在或包裹在微球體中。本文公 開的白蛋白還可用聚乙二醇(PEG)通過熟知的技術處理，以提高其免疫 相容性。

通過擴大體內(nèi)抗毒能力來減輕氧化應力的優(yōu)選技術是使用多組分以硝 基氧化合物為基礎的系統(tǒng)。第一成分是膜通透性硝基氧化合物，如 TEMPOL。由于其電荷特性和小分子特性，低分子量，非結(jié)合性硝基氧化 合物透過細胞膜并進入細胞內(nèi)空間。第二成分是含硝基氧化合物物質(zhì)如生 物相容性大分子標記的有高摩爾比例硝基氧化合物的物質(zhì)(多硝基氧化合 物)，例如用30∶1摩爾比TEBPOL標記人的血清白蛋白。本發(fā)明的多 組分硝基氧化合物體系的應用有助于減輕由大量，濃集的或反復用藥的低 分子量膜通透性硝基氯化合物產(chǎn)生的毒性。由于硝基氧化合物的羥胺形式 不如抗氧化劑活躍并且由于硝基氧化合物高劑量時的毒性被認為主要是由 細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的紊亂引起的抗氧化劑活力造成的，羥胺的狀態(tài)表現(xiàn) 出的毒性比相應未還原的硝基氧化合物的毒性要低。因此，本發(fā)明的一個 實施方案介紹了使用無毒劑量的膜通透性硝基氧化合物，并與大分子多硝 基氧化合物結(jié)合使用以活化體內(nèi)已被還原成無活性形式的硝基氧化合物。 類似的，羥胺可作為無毒性硝基氧化合物前體施用，此前體在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成 有活性的抗氧化劑。其結(jié)果是在體內(nèi)存在一個安全持久的治療水平的強力 抗氧化劑。

關于體內(nèi)安全性，按本發(fā)明施用的硝基氧化合物水平在動物中有良好 的耐受性，并預計在人體也有良好的耐受性，因為已知硝基氧化合物是相 對安全的：例如，小鼠的TEMPO最大耐受皮內(nèi)注射劑量是275毫克/公斤 并且半致死量是341毫克/公斤。而且，結(jié)合大分子的硝基氧化合物要比以 其活性形式存在的游離硝基氧化合物更安全。與游離硝基氧化合物一起使 用的本發(fā)明的標記硝基氧化合物的大分子會降低硝基氧化合物的總量，另 一方面不得不使用這類硝基氧化合物以達到抗氧化劑的效力。以抗氧化劑 形式使用的標記硝基氧化合物的大分子的另一優(yōu)點在于在其活性抗氧化劑 狀態(tài)下硝基氧化合物能力在達到高活性水平的同時還增加了安全性。

大多數(shù)迄今在生物體研究的硝基氧化合物有較低的分子量。它們能很 容易的透過細胞膜進入體內(nèi)組織。本發(fā)明的結(jié)合大分子的硝基氧化合物可 靜脈注射并且由于大分子物質(zhì)的膜不通透性他們可保持在血管腔內(nèi)。在此 實施方案中，共價結(jié)合到大分子上的硝基氧化合物將減輕自由基毒性同時 將硝基氧化合物限定在局部即血管腔中，在那里使其作用最佳化。

當注射TEMPOL時，它迅速進入血管，在那里通過解毒(氧化)自由 基被還原成羥胺。在清除來自有毒自由基的未配對電子時，硝基氧化合物 被還原成氧代氨中間物。后者再進入兩反應途徑之一。它可通過自發(fā)提供 從自由基獲得的電子給一些天然化合物；這個途徑可描述為模擬酶反應， 因為凈反應結(jié)果是硝基氧化合物沒有發(fā)生變化。另一途徑是，氧代氨中間 物可進一步被還原成羥胺。羥胺不是順磁性的(即它在EPR波譜中是靜默 的)并且缺乏硝基氧化合物的抗氧化劑催化活性。由于其高度膜通透性和 惰性化學骨架，羥胺可在細胞內(nèi)外自由分布并且在體內(nèi)存在時間較長。然 而，一旦硝基氧化合物被還原成羥胺，抗氧化劑活性隨即消失。

TEMPOL4-羥基-2，2.6，6-四甲基-哌啶-N-氧基在自由基解毒過程中迅 速消耗；它還原成氧代氨中間物，后者可被氧化成硝基氧化合物或進一步 還原成羥胺。因此，硝基氧化合物的生物轉(zhuǎn)化(在自由基解毒過程中)產(chǎn) 生羥胺。羥胺不是順磁性的(它在ESR波譜中是無活性的)并且缺乏硝基 氧化合物的抗氧化劑催化活性。TEBPOL單獨使用不適合治療用，因為它 會迅速轉(zhuǎn)化成羥胺并可能在達到有抗氧化作用的劑量時是有毒的。

然而，羥胺是化學上穩(wěn)定的并且在體內(nèi)相對持久(硝基氧化合物分子 的骨架是相對惰性的)而且按照本發(fā)明，它可化學上轉(zhuǎn)化成硝基氧化合物 活性形式。這種體內(nèi)轉(zhuǎn)化作用能使硝基氧化合物在臨床上安全使用以提供 持久的抗氧化劑活性。如上所述，未配對硝酰基電子給與硝基氧化合物抗 氧化劑活性以外的其他有用的屬性。特別是，以自由基形式存在的硝基氧 化合物是順磁性探針，其EPR信號能反映生物系統(tǒng)內(nèi)代謝方面的信息，即 氧壓力和組織氧化還原狀態(tài)的信息。由于天然存在的未配對電子在體內(nèi)是 基本不存在的，EPR成像的另一優(yōu)點是基本上沒有本底干擾。硝基氧化合 物還減少氫原子核的馳豫時間并用作質(zhì)子或核磁共振成像的造影劑。硝基 氧化合物還可用作造影劑為MRI獲得的形態(tài)資料補充代謝方面的信息。例 如，通過取代硝基氧化合物上的各種功能基就能操縱包括馳豫性，可溶性， 生物分布作用，體內(nèi)穩(wěn)定性和耐受性在內(nèi)的各種屬性。從硝基氧化合物獲 得的反差增強能通過區(qū)分強度相等但組織學上不同的組織和改進受傷部位 如血腦屏障的損害，膿腫和腫瘤的定位和特征識別來改進MRI的效果。

由于大分子多硝基氧化合物的高分子量和低膜通透性，它易于在細胞 外分布，并且不易被生物化學環(huán)境所還原。然而，已發(fā)現(xiàn)大分子多硝基氧 化合物能接受來自羥胺的電子。能在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)生成具有有活性抗氧化劑功 能的硝基氧化合物。這個過程有效的將細胞外抗氧化劑性能的高容量大分 子儲藏庫中的抗氧化劑生成能力傳遞給高流動性可透膜的硝基氧化合物， 后者可穿過細胞膜提供細胞內(nèi)抗氧化劑活力。一旦進入細胞，這種硝基氧 化合物即通過氧化毒性自由基的過程而被還原成羥胺，并循環(huán)出細胞外。 在細胞外再被大分子多硝基氧化合物活化。此外，可通過加入其他化合物 如硒使大分子多硝基氧化合物活化。

因此，用高分子比的硝基氧化合物結(jié)合到大分子(多硝基氧化合物) 上就能制備出含硝基氧化合物的特別優(yōu)越的藥物組合物，并使其結(jié)合到細 胞內(nèi)有治療藥效劑量的小分子量硝基氧化合物上，從而提供了具有催化活 性的多硝基氧化合物大分子。有治療活性的硝基氧化合物與有催化活性的 硝基氧化合物相互作用在周圍組織中提供了持久的抗氧化劑，輻射防護劑 和造影劑等。實際上大分子物質(zhì)是抗氧化劑活性倉庫，它能為膜通透性低 分子量物質(zhì)的活性起補充作用。本文公開的這種共生方式為用-藥提供了很 好的方法，如大分子硝基氧化合物與口服低分子量硝基氧化合物結(jié)合用藥 從而提供局部化的，持久的抗氧化劑活力。

基于本文描述的實驗結(jié)果和組合物數(shù)據(jù)，已在體外觀察到本發(fā)明的含 硝基氧化合物物質(zhì)的抗氧化劑，輻射防護劑，抗高血壓和波譜活性和體內(nèi) 使用的各種藥物組合物。基于這些結(jié)果，多硝基氧化合物標記的大分子和 參與自由基氧化還原反應的游離硝基氧化合物的反應機制足以證明將新的 HBOC和其他含硝基氧化合物大分子用于自由基解毒的設計能力，這些藥 物設計將很好的用于診斷和治療各種各樣的生理狀況。

此外，本發(fā)明介紹了與藥物儲存或使用容器相聯(lián)系的含硝基氧化合物 化合物。含硝基氧化合物化合物可以固體或液體形式加入容器內(nèi)部或共價 結(jié)合到容器的內(nèi)表面。一種先進的給藥技術是將含硝基氧化合物化合物， 在有或無硝基氧化合物情況下，添加到液體給藥用的在管線中的濾器中。 例如，多硝基氧化合物白蛋白可與游離硝基氧化合物一起結(jié)合進入濾器中 或連到濾器中的不溶性充填基質(zhì)上，與靜脈液用藥如現(xiàn)在使用的HBOC一 起使用，以便在給病人注射前清除有毒的氧相關性化合物。

HRCS制劑和下面介紹的硝基氧化合物標記大分子通過使硝基氧化合 物在功能上起“超氧化物氧化酶”的作用來防止有毒的氧相關物質(zhì)的形成， 這是紅細胞內(nèi)發(fā)生的一種酶樣反應。在這些HRCS藥物中，硝基氧化合物 防止由血紅蛋白的自氧化作用產(chǎn)生的不利的超氧化物陰離子的積累(見反 應式[1])。標記硝基氧化合物的大分子如白蛋白和免疫球蛋白，在功能上 類似于抗氧化劑酶模擬物，其功能定位在血管和消化道腔，并且可與膜通 透性硝基氧化合物反應以提供細胞內(nèi)的防護作用。

與免疫球蛋白一起使用的硝基氧化合物優(yōu)選組合物包括硝基氧化合物 標記的與免疫球蛋白專一結(jié)合的半抗原或抗原。

而且，按照本發(fā)明，對有益的硝基氧化合物化合物的治療作用是可控 制和可維持的。例如，硝基氧化合物2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-亞哌啶基琥 珀酸(TOPS)可結(jié)合到人血清白蛋白的原膽紅素上。在體內(nèi)，這種結(jié)合 延長了血漿半衰期并減慢硝基氧化合物向細胞內(nèi)的擴散，減少了必需的藥 量(因此減少了潛在的毒性)和延長了生物反應性。因此，雖然硝基氧化 合物如TOPS本身，沒有大分子多硝基氧化合物，作為抗氧化劑仍有應用 價值。根據(jù)本發(fā)明，有可能篩選或設計出一些能將硝基氧化合物傳遞到體 內(nèi)特定部位的載體，它們是使治療用抗氧化劑的作用局部化的手段。

考慮到硝基氧化合物穩(wěn)定的化學性質(zhì)，本文公開的組合物可通過各種 途徑使用。膜通透性硝基氧化合物能經(jīng)非胃腸道或口服使用。以還原形式 存在的羥胺可位于GI系統(tǒng)或吸收進入血液。因此，能夠為全身提供持久的 抗氧化活性。大分子多硝基氧化合物能經(jīng)胃腸道給藥，在那里它將保持在 細胞外使還原型硝基氧化合物活化，也可口服或局部/經(jīng)皮膚給藥，在那里 它使循環(huán)的還原型硝基氧化合物活化從而提供局部抗氧化作用。

蛋白質(zhì)類大分子多硝基氧化合物和膜通透性硝基氧化合物的特殊反應 性似乎能通過加熱大分子和標記多肽鏈的原氨基酸基團得到加強。已知加 熱能改變大分子的構(gòu)型拉直氨基和羧基之間的氫鍵并引起大分子的四級結(jié) 構(gòu)上的改變。加熱后，用硝基氧化合物所做的共價標記可以發(fā)生在加熱后 蛋白質(zhì)的相對較深的部位。結(jié)果在硝基氧化合物標記的大分子中，硝基氧 化合物那一半被保護起來不太容易與溶劑起反應。而且，在蛋白質(zhì)上許多 硝基氧化合物可連接的氨基部位，剩余羧基的優(yōu)勢創(chuàng)造了結(jié)合有硝基氧化 合物的周圍環(huán)境的酸性條件。酸性條件通過吸引N-O鍵的未配對電子到氧 原子上增加硝基氧化合物的反應性。

在本發(fā)明針對紅細胞替代物的實施方案中，硝基氧化合物的必不可少 的屬性是它們通過模仿超氧化物氧化酶，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的 活性影響HRCS中發(fā)生的超氧化物陰離子的級聯(lián)反應過程，而在這個過程 中不發(fā)生損耗。

在“超氧化物氧化酶”反應中，超氧化物陰離子被氧化成分子氧而不 事先形成過氧化氫。完成此反應的一部分原因是由于創(chuàng)建了一種儲存條件 的，在此條件下硝基氧化合物濃度大大的超過了氧的濃度。按本文公開的 方式，硝基氧化合物防止了不需要的氧化級聯(lián)反應，后者是以生成超氧化 物陰離子開始的。而且，本文的生理相容性HRCS溶液提供的優(yōu)越性將超 過HBOC，因為在將本文介紹的組合物輸注給病人后這種硝基氧化合物將 模仿超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的酶反應起作用。

雖然本發(fā)明可使用各種各樣的硝基氧化合物，這些硝基氧化合物應是 以生理可接受的最低濃度來滿足減輕氧毒性的需要。在評估所使用的藥物 時，值得指出的是相對較低毒性的硝基氧化合物已經(jīng)促使將它們開發(fā)成 NMR成像中使用的造影劑(見美國專利4,834,964；4,863,717； 5,104,41)。

許多用于分離和純化血紅蛋白溶液使其具有生理相容性的方法為專業(yè) 技術人員所知。典型的有，純化的血紅蛋白成分至少含總蛋白重量99％的 血紅蛋白，磷脂含量至少有3微克/毫升，至少有1微克/毫升的磷脂酰絲氨 酸或磷脂酰乙醇胺和至少6％的無活性血紅素。本發(fā)明使用的純化血紅蛋白 溶液可用各種常規(guī)方法制備，包括但不限于下述公開的方法Cheung?et?al. Anal?Biochem?137：481-484(1984)，De?Venuto?et.al.，J?Lab?Clin?Fled?89：509- 516(1977)，and?Lee，et?al.，Vith?International?Symposium?on?Blood Substitutes，San?Diego，CA?Mar?17-20?Abstract?H51(1993)。

本發(fā)明中使用的純化的血紅蛋白溶液應是基本上無氧的?？捎门c引起 血紅蛋白釋放出氧的化學還原劑混合的辦法使溶液中的血紅蛋白脫氧并保 持一種基本上脫氧的狀態(tài)。使血紅蛋白溶液脫氧的一個優(yōu)選方法是通過將 血紅蛋白溶液暴露在惰性的基本上無氧的氣體中如氮氣或一氧化碳以除去 血紅蛋白結(jié)合的氧并轉(zhuǎn)化溶液中的血紅蛋白成為諸如脫氧血紅蛋白或缺氧 的一氧化碳血紅蛋白形式。另一方法是可將血紅蛋白暴露在真空中或讓氣 體透過一種能讓氧通過卻不能讓血紅蛋白通過的膜。例如可讓血紅蛋白溶 液流過有膜墻的擴散室，在血紅蛋白流動中氧氣可透過膜但血紅蛋白不能 透過膜。惰性氣體沿相對于血紅蛋白的膜墻循環(huán)，從而除去氧氣并轉(zhuǎn)化溶 液中的血紅蛋白成為脫氧狀態(tài)。最好是，脫氧血紅蛋白在硝基氧化合物標 記，交聯(lián)，聚合化或結(jié)合期間保持在一個基本上無氧的環(huán)境中。

除去任何結(jié)合的氧之后，硝基氧化合物被共價連接到血紅蛋白上。正 常情況下，至少有一個，最好是一個以上，硝基氧化合物共價連接到一個 血紅蛋白分子上。硝基氧化合物可共價連接到血紅蛋白分子的幾個部位的 任何一個部位，包括：

(a)在一個或多個游離巰基(-SH)，例如在B-93位；

(b)在任何活性氨基(-NH2)部位，例如β鏈的Val-1的DPG部位和 /或β鏈的第82位賴氨酸和/或α鏈的第99位賴氨酸；

(c)在任何非專一性表面氨基上(-NH2)或羧基上(-COOH)；

硝基氧化合物還可結(jié)合到任何醛基，環(huán)氧基或涉及交聯(lián)和聚合化血紅 蛋白的二價或多價交聯(lián)物的活化羧基上，或結(jié)合到一種藥劑的任何活化基 團上如用于結(jié)合血紅蛋白的葡聚糖(Dx)或羥乙基淀粉(HES)或聚氧 乙烯(POE)。

如上述反應式[1]所描述的，在存儲期間，HBOC溶液中的血紅蛋白自 動被氧所氧化形成高鐵血紅蛋白和超氧化物陰離子。然而，在作為本發(fā)明 主題的HRCS存儲期間如此形成的超氧化物陰離子將還原硝基氧化合物成 為羥胺衍生物，并且超氧化物陰離子將通過下述反應被氧化形成分子氧。

反應式[4]中描述的超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化成分子氧防止了超氧化物陰 離子的積累和隨后過氧化氫的形成。此活性，即本文描述為“超氧化物氧 化酶”的活性，將在組合物中初始氧含量保持最小的情況下效力最高，此 藥存放在基本無氧環(huán)境中并且硝基氧化合物濃度足以防止形成超氧化物陰 離子和過氧化氫。因此HRCS最好存放在基本無氧的容器中。

使溶液保存在無氧環(huán)境的容器系統(tǒng)是眾所周知的，因為許多非基于血 紅蛋白的靜脈注射溶液對氧都敏感。例如，在封裝過程中清除氧的玻璃容 器是可以使用的。還有，現(xiàn)在使用的柔性塑料容器可以嚴密包裝防止氧氣 的進入。基本上說，任何防止氧氣與溶液中血紅蛋白反應的容器都可以使 用。

為證明硝基氧化合物的“超氧化物氧化酶”活性，將溶液中的硝基氧 化合物標記血紅蛋白樣品保持在加速的氧化儲存狀態(tài)，并且對硝基氧化合 物的氧化還原狀態(tài)用電子自旋共振波譜進行超時研究。例如，將已標記有 4-氨基-TEMPO的o-棉子糖聚合血紅蛋白溶液以氧化態(tài)保存在封閉玻璃容 器中(圖1A)。在這種狀態(tài)下，溶液中的超氧化物陰離子和高鐵血紅蛋 白生成速率足以將硝基氧化合物轉(zhuǎn)化成其羥胺衍生物。這個過程可方便的 觀察到(見反應式[4]并參照圖1A和1B)。反應式4表示硝基氧化合物轉(zhuǎn) 化為其反磁性羥基衍生物的轉(zhuǎn)化過程與超氧化物陰離子逆轉(zhuǎn)成分子氧的過 程相偶聯(lián)。支持這一轉(zhuǎn)化的”實驗證據(jù)“如圖1A和1B所示。共價連接到 血紅蛋白上的TEMPO的電子自旋共振波譜(圖1A)轉(zhuǎn)化成其反磁性衍生 物的波譜，樣品在4℃下保持30天后共振波譜峰完全消失(圖1B)。硝 基氧化合物被認為是在血紅蛋白存在下，當它被轉(zhuǎn)化成其羥胺衍生物時已 經(jīng)執(zhí)行了“超氧化物氧化酶”樣的功能。

在HBOC溶液中的硝基氧化合物的“超氧化物歧化酶”活性通過顯示 羥胺衍生物逆轉(zhuǎn)化成硝基氧化合物(見反應式[5]和反應式[4])得到證明。 已知在圖1A和1B的實驗條件下，硝基氧化合物完全轉(zhuǎn)化成羥胺(見反應 式[4]，硝基氧化合物可通過僅提供更多的超氧化物陰離子，如圖5所示， 得到再生。為證明此反應機制，通過用等體積未標記血紅蛋白稀釋圖1A 中的樣品增加血紅蛋白(和超氧化物陰離子)對硝基氧化合物的相對濃度。 圖1A與1C比較顯示由于稀釋效應，硝基氧化合物信號強度減少約50％。 另一方面，在4℃下冷東保存30天后，如反應式[5]所示，硝基氧化合物 得到部分再生(見圖1D)。這個現(xiàn)象與羥胺衍生物逆轉(zhuǎn)化成硝基氧化合 物同時偶聯(lián)從超氧化物陰離子生成過氧化氫的反應相一致。 綜合反應式[4]和[5]得到： 2?O-2+2H-------＞O2+H2O2

上述反應證明硝基氧化合物在“HBOC”溶液中起低分子量，無金屬， SOD模擬物作用。硝基氧化合物的電子自旋共振波譜檢測(圖1D)與超 氧化物陰離子和羥胺(RN-OH)反應致使形成硝基氧化合物 和過氧化氫(H2O2)的結(jié)果相一致。最近，有人提出氧代銨陽離子作為一 種中間產(chǎn)物參與超氧化物的硝基氧化合物催化的歧化作用。(Krishna et.a1.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA?89?5537-5541(1992))。

本文介紹的HRCS制劑將減輕現(xiàn)有HBOC溶液的超氧化物陰離子發(fā)生 過程中產(chǎn)生的氧化應力，并且在輸入時減少一氧化氮的破壞作用，后者是 由內(nèi)皮系統(tǒng)得到的松弛因子(EDRF)。如果防止了EDRF破壞作用，在 給病人注入現(xiàn)有的HBOC溶液時所觀察到的血管收縮和系統(tǒng)高血壓問題就 會得到大大的緩解。

每個血紅蛋白分子的硝基氧化合物的數(shù)目范圍約在1到40之間或任何 整數(shù)值或取其間的數(shù)值，并且，若為專一性標記最好是2。當用作多組分 系統(tǒng)的一個成分時，硝基氧化合物對血紅蛋白的摩爾比可以大約是3到60 或任何整數(shù)值或取其間的數(shù)值。例如，硝基氧化合物，3-馬來酰亞胺- PROXYL通過首先制備硝基氧化合物的100mM乙醇溶液作為載體溶液， 共價結(jié)合到溶液中的血紅蛋白上。兩個(2)摩爾當量的硝基氧化合物直 接加入到血紅蛋白中并與乳酸化Ringer’s中的DCL-Hb(8g/dl)混合。使 反應混合物在22℃下攪拌反應直到90％以上的硝基氧化合物共價結(jié)合到 DCL-Hb上，時間通常在一個小時以內(nèi)。然后用叉向流動膜過濾系統(tǒng)除去 未反應的硝基氧化合物，以分子量30,000道爾頓為截點用10體積的乳酸 化Ringer’s液洗三(3)次。RETANTATE血紅蛋白濃度調(diào)整到7-14g/dl 之間，滅菌，過濾，并儲存在4℃。在輸注后，當HRCS被完全氧化時， 硝基氧化合物的功能將起SOD模擬物的作用，其次起著過氧化氫酶模擬物 的作用。作為SOD模擬物，它歧化超氧化物陰離子成過氧化氫(見反應式 [2])，結(jié)果是防止內(nèi)皮系統(tǒng)中的硝基氧化合物的破壞，從而防止血管變窄。 作為過氧化氫酶模擬物，它防止通過轉(zhuǎn)化過氧化氫成為無害的水來防止過 氧化氫的毒害作用(見反應式[3])。

如上所述，硝基氧化合物被共價結(jié)合到血紅蛋白上以研究血紅蛋白本 身所具有的氧結(jié)合屬性。然而，硝基氧化合物還沒有與穩(wěn)定化的血紅蛋白 溶液一起使用，即與生理相容的交聯(lián)，或聚合，包裹，或結(jié)合式血紅蛋白 溶液一起使用。還沒有含硝基氧化合物聚合物被用于標記天然血紅蛋白。 血紅蛋白和硝基氧化合物的已知化學特點表明，化學交聯(lián)或重組交聯(lián)技術 建立的硝基氧化合物標記血紅蛋白的類似功能是可以實現(xiàn)的，而這些交聯(lián) 技術是通過選擇血紅蛋白分子上一些可用部位，即那些沒有被用作穩(wěn)定 化，聚合化，或結(jié)合血紅蛋白分子的特殊化合物所封閉的部位進行的。因 為某些下面要講到的血紅蛋白穩(wěn)定化和聚合化形式通常涉及到臨床實驗， 下面介紹一下將硝基氧化合物連接到這些穩(wěn)定化和聚合化基于血紅蛋白的 氧載體上的方法以便證明本發(fā)明的氧解毒功能可應用到現(xiàn)有的血紅蛋白溶 液中。

在硝基氧化合物-HBOC的實例中證實的硝基氧化合物標記技術易于 應用到依靠有用的抗氧化劑和酶模擬物活性生產(chǎn)其他硝基氧化合物標記的 大分子中，例如硝基氧化合物標記的血清白蛋白和硝基氧化合物標記的免 疫球蛋白。易于用此技術做硝基氧化合物標記的血清白蛋白的形式是單體 血清白蛋白(正常的情況)，和白蛋白同源二聚體以及寡聚體以及各種情 況下的集結(jié)物和多肽片段。本文所謂的蛋白質(zhì)或大分子包括片段，即蛋白 質(zhì)的多肽片段。

由于應用上的不同，本文介紹的組合物可以一起使用或分開使用。例 如，在治療和診斷心臟重灌注損害時或血管系統(tǒng)的局部缺血損害時，理想 的是取本發(fā)明的數(shù)個方面的長處，如氧傳遞，保護系統(tǒng)免受氧化應力，免 受重灌注損害的局部化保護作用和改進成像功能。在這種情況下，可結(jié)合 使用本文介紹的組合物如現(xiàn)有的HBOC，硝基氧化合物標記的白蛋白和可 同時給藥或順序給藥的低分子量硝基氧化合物，后者給藥情況依治療目的 或診斷目的而定。

關于選擇按本發(fā)明給藥的具體制劑和施用方法，取決于具體的應用。 選用能接受低分子量膜通透性物質(zhì)的電子的基于硝基氧化合物的化合物， 可根據(jù)具體應用進行補充。可根據(jù)具體應用中所期望的位點專一性保護， 選擇使用幾種可用的施用方法和優(yōu)選制劑。避免輸注上文介紹的基于血紅 蛋白的氧載體時產(chǎn)生的氧化應力是按本發(fā)明選用制劑和施用方法以便提供 免受自由基毒性的特殊保護，避免HBOC輸注時的毒副作用的一個主要實 例。位點專一性保護或活性的理想部位是皮膚和內(nèi)皮層，優(yōu)選化合物是 TOPS，因為它相對較小并且是膜通透性的。專一性保護作用或活性的理 想部位是胃腸道。優(yōu)選化合物是多硝基氧化合物葡聚糖，因為它在胃腸道 中不易于被酶解消化。在這種應用中，推薦使用口服或直腸給藥。靜脈注 射或血管內(nèi)區(qū)域被認為是給藥的專一性保護或活性適合部位，如腦血管或 心血管系統(tǒng)，多硝基氧化合物白蛋白是優(yōu)選的化合物因為白蛋白是主要的 血漿蛋白質(zhì)，耐受性強，易于給藥，并表現(xiàn)出較長的血漿半衰期。這類應 用還包括基于血紅蛋白的氧載體或多硝基氧化合物衍生物。應用于腹膜內(nèi) 或皮內(nèi)的道理是相同的。

正如幾個實施例所顯示的，本發(fā)明化合物的給藥可施用于身體或直接 用于一個細胞群或一個組織。特別是，用作移植的組織可通過在移出身體 前后輸注多硝基氧化合物白蛋白來達到保存目的。例如，心臟移植中，PNA 被用于選擇性灌注到心臟，即通過濃縮的靜脈注射給藥，繼之以將器官移 出身體。器官也可用PNA方法移植和儲存以防被諸如脂肪的過氧化作用和 氧化應力等作用而腐敗。而且在移植手術后當器官受到氧化血的重灌注 時，器官將得到與本文證明的心臟和腦的局部缺血性重灌注損傷同樣的保 護方式。如果對肺的專一性保護是理想的，可選用多硝基氧化合物白蛋白 的氣溶膠形式從而可以鋪滿肺氣管。這種形式對于這方面的專家是顯而易 見的，因此選用的制劑可根據(jù)具體應用而定。

如上所述，上述制劑是接受電子化合物的優(yōu)選制劑。關于膜通透性電 子供體化合物，優(yōu)選化合物的選用也取決于應用和施用方法。制劑和施用 方法應該按相應受自由基物質(zhì)所累的具體系統(tǒng)或組織來分類，而這些自由 基是由相關的生理條件或受損傷或受治療的區(qū)域產(chǎn)生的。例如，在膿毒癥 中，觀察到循環(huán)系統(tǒng)的大規(guī)模萎陷伴隨系統(tǒng)的自由基生成現(xiàn)象增加。類似 的，全身性輻射會導致在全身產(chǎn)生自由基。在這種情況下，可口服或靜脈 注射給予小分子量膜通透性電子供體硝基氧化合物如TEMPOL以保證全 身分布的劑量用藥。相應這種施用方法應伴隨同樣可以做全身分布的電 子受體藥物的使用，如多硝基氧化合物白蛋白。在自由基產(chǎn)生的區(qū)域更加 局部化，最好通過選用接受電子的物質(zhì)使用局部化的保護和活性方法因為 膜通透性物質(zhì)易于在給藥時呈全身性分布，即使對皮膚進行膜通透性物質(zhì) 給藥可以產(chǎn)生更加局部化的效果。

基于本文公開的內(nèi)容，專業(yè)人員能夠選擇最有效的制劑和施用方法以 滿足使用本發(fā)明的具體應用的需要。例如，為達到胃腸道系統(tǒng)成像的改進， 可選擇多硝基氧化合物葡聚糖的口服藥作為電子受體并使用TEMPOL口 服和/或靜脈注射給藥。進一步舉例，為治療牛皮癬即一種產(chǎn)生自由基的皮 膚局部化特征所表現(xiàn)疾病，可選擇局部使用的TOS作為電子受體合并局部 使用膜通透性TEBPOL。按類似道理，使用本發(fā)明的其他有自由基存在的 疾病，診斷或治療的制劑可提供位點專一性保護或活性。因此，下面的實 施例將公開幾種制劑的詳細說明，這些制劑可以依本發(fā)明的應用，以任意 組合形式使用。

????????實施例一--含有硝基氧化合物和硝基氧化合物標記

????????????????????的化合物的容器和濾器

已有可能將本發(fā)明的氧解毒功能提供給現(xiàn)有的靜脈注射溶液，如 HBOC溶液，而無須對現(xiàn)有制劑做化學修飾。通過將可與游離硝基氧化合 物合并使用的多硝基氧化合物大分子包括在內(nèi)，或通過共價結(jié)合硝基氧化 合物到存放有HBOC的管的內(nèi)表面，將減輕用現(xiàn)有制劑觀察到的氧毒性產(chǎn) 生的不良生理效應。

容器與含血紅蛋白的本發(fā)明主題溶液一起使用應該是生理相容的，具 有任何用于靜脈注射液體容器相類似的特點。典型的說，玻璃或生物相容 性塑料容器是適合的。對本發(fā)明的內(nèi)容來說，靜脈注射溶液放置在容器中 達任意長的時間，容器應是無氧的，并且應能密封以將氧隔絕在外。使用 玻璃，傳統(tǒng)的塞子和封閉器具就足夠了。然而，目前使用的一些柔性塑料 容器是氧通透性的。這種情況下，可用錫箔密封或用其他密封辦法以防止 氧接觸到溶液。

為將硝基氧化合物加到容器內(nèi)表面，將硝基氧化合物聚合體的非過濾 層或涂有硝基氧化合物的共聚體直接罩在內(nèi)表面。含硝基氧化合物聚合體 可通過許多已知聚合原理的技術制造出來只要在制造過程中一直保持自由 基的穩(wěn)定性。

HBOC容器內(nèi)表面還可修飾成含有一層能結(jié)合硝基氧化合物的物質(zhì)， 如親水性肼化物基團，它能與丙酮或硝基氧化合物上的醛基反應形成穩(wěn)定 的腙衍生物。這個罩化反應是直向前進行的。例如，硝基氧化合物 (100Mm)的醋酸緩沖液pH5.0加入到活化的肼化物塑料容器中加速腙鍵 的形成。

一旦容器制備好，就加入生理相容性溶液。這種溶液可以是本文介紹 的穩(wěn)定的和純化的HBOC或HRCS，也可包括任何靜脈注射膠體或類晶體 溶液，它們與血紅蛋白一起注入是理想的。然后將此溶液保存在無氧環(huán)境。

除處理容器的內(nèi)表面外，要用到一種帶有路厄鎖出入口的濾器模式 盒，它含有固定化硝基氧化合物的膠體或固體基質(zhì)，以便在血紅蛋白溶液 流經(jīng)此盒時除去氧相關性物質(zhì)。對這種給藥技術，可將多硝基氧化合物大 分子加入到濾器室中，溶液通過此濾器室直接注入病人體內(nèi)與先前注入的 溶液反應。低分子量硝基氧化合物也可包括在內(nèi)。在這些應用中，硝基氧 化合物也可結(jié)合到軟或硬凝膠基質(zhì)上，其功能上作為一種無菌的在管線中 的濾器，在注入前使用。在親和層析技術中已知有各種方法將小的配位體 連接到固體基質(zhì)上，如硝基氧化合物，以便在化學上修飾玻璃或塑料的表 面。已知有幾種類型的基質(zhì)與無菌溶液是相容的，包括瓊脂糖凝膠，聚砜 類材料，膠乳和其他物質(zhì)。

在濾器盒方法中，固體基質(zhì)與硝基氧化合物共價結(jié)合并包含在濾器室 中或其他此類裝置中，以至溶液如血紅蛋白能夠流過裝置并在注入病人體 內(nèi)時與硝基氧化合物接觸。一種實踐的方法是用通常使用的活化瓊脂糖凝 膠作為基質(zhì)并將此凝膠裝入無菌的路厄鎖盒。在輸注含血紅蛋白的溶液 時，此盒再簡單的插入到液體給藥管線中。實踐中，含有硝基氧化合物并 且血紅蛋白可以由此通過的濾器室組成的結(jié)構(gòu)可用各種已知技術建成。見 美國專利5,149,425?，F(xiàn)在參考圖12，室1含有硝基氧化合物標記的 瓊脂糖凝膠。例如，4-溴乙酰氨基-TEMPO標記的ω-氨己基-瓊脂糖(見圖 2A)1，4-雙(2，3-環(huán)氧丙基)丁烷瓊脂糖偶聯(lián)4-氨基-TEMPO(見圖 2B)。其他化合物(未給出)可包含在濾器室中。

輸注時，含有此溶液的靜脈輸注管線將連接到路厄入口2，使其進入 室1，在那里血紅蛋白溶液與含有結(jié)合在基質(zhì)4上或位于室內(nèi)的化合物的 硝基氧化合物相遇。在此過程中，含硝基氧化合物的組分將被注入并可反 應以便從溶液中除去有毒的氧相關物。然后，血紅蛋白溶液流出盒，經(jīng)過 路厄出口3，并直接輸給病人。4-氨基-TEMPO標記的環(huán)氧瓊脂糖的電子 共振波譜在圖2A給出。另一種方法是，ω-氨己基-瓊脂糖可與4-(2-溴乙 酰氨基)-TEMPO反應形成TEMPO標記的瓊脂糖。其電子自旋共振波譜 如圖2B所示。一種替換物通過碳氨鍵將4-羧基-TEMPO偶聯(lián)到有碳化二 亞胺的氨基瓊脂糖上。相反，用碳化二亞胺容易將4-氨基-TEMPO偶聯(lián)到 瓊脂糖凝膠上。例如，1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳化二亞胺。

用4-氨基-TEMPO標記的盒的制備方法是在室溫下將100mM4-氨基 TEMPO(西格瑪化學公司)在乳酸化Ringers溶液中循環(huán)通過一種醛即 AvidChrom?Cartridge(Unisyn?Tech.Inc.)1小時，然后用氫硼化氰還原6小 時。盒室內(nèi)部用乳酸化Ringers藥劑徹底清洗。

用3-氨基-PROXYL標記的盒可用類似方法制備，即按照上述方法將4- 氨基-TEMPO用3-氨基-PROXYL替換。

????????實施例二--硝基氧化合物標記的穩(wěn)定化血紅蛋白

為防止血紅蛋白解離成亞單位，通過其亞單位的化學或重組子交聯(lián)技 術使血紅蛋白分子內(nèi)部穩(wěn)定化。血紅蛋白“穩(wěn)定化”在本文是指對由化學 或重組子交聯(lián)法穩(wěn)定的血紅蛋白單體的描述也是指對二聚體，三聚體和更 大的聚合體的描述，它們組成的血紅蛋白分子經(jīng)過環(huán)葡聚糖及其硫酸鹽衍 生物的作用交聯(lián)。

將硝基氧化合物連接到穩(wěn)定的血紅蛋白上的優(yōu)選技術是通過共價結(jié)合 將硝基氧化合物連接到穩(wěn)定的血紅蛋白兩個β-鏈的β-93位的巰基上。雖然 在這個位置上專一性標記已在天然人血紅蛋白構(gòu)像研究中得到證明(見 MeConnell等人的綜述，Quart.Rev.Biophys.3：91(1970))，交聯(lián)血紅蛋白的 這種專一性標記還一直沒有報道。如上所述，幾種血紅蛋白交聯(lián)的氧載體 已經(jīng)開發(fā)出來，它們通過化學交聯(lián)法穩(wěn)定化，例如，DBBF交聯(lián)血紅蛋白 和用o-棉子糖穩(wěn)定化和寡聚化的血紅蛋白。

在我的美國專利4,857,636中描述的開環(huán)式蔗糖生產(chǎn)出從雙糖，寡糖或 更好一些的是從三糖如棉子糖得到的多價醛。這些化合物的功能是即提供 分子內(nèi)的穩(wěn)定性(發(fā)生交聯(lián))又提供分子內(nèi)的聚合化。通過控制在我早期 專利所公開的反應，多價醛可用于生產(chǎn)“穩(wěn)定化”血紅蛋白而不發(fā)生聚合 化反應。在另一種情況下，硝基氧化合物可以共價結(jié)合到穩(wěn)定化血紅蛋白 或聚合化血紅蛋白上。因此，在此實施方案中多價醛穩(wěn)定的基于血紅蛋白 的溶液被當作“穩(wěn)定化”血紅蛋白，而在隨后的實施方案中被當作聚合化 血紅蛋白。

為了證明經(jīng)過化學修飾的血紅蛋白不會變得空間上硝基氧化合物接觸 不到，將結(jié)果表示出來以肯定硝基氧化合物是可以共價結(jié)合到DBBF-HbDE β-93位上的。

在此實施方案中，DBBF-Hb與兩種類型的硝基氧化合物(TEMPO和 PROXYL)反應，它們含有兩種巰基專一性基團并且具有下列結(jié)構(gòu)分子式：

4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO?3-馬來酰亞氨基-PROXYL

通過已知技術用雙(3，5-二溴水楊基)富馬酸從溶液中交聯(lián)純化的 脫氧血紅蛋白制備DBBF-Hb，得到的產(chǎn)物用柱層析純化。3-馬來酰亞胺 (2，2，5，5-四甲基吡咯烷-N-氧基)[3-馬來酰亞胺-PROXYL]的共價 連接通過將2摩爾當量的此硝基氧化合物加入到1毫升濃度為約100mM的 DBBF-Hb乳酸化Ringer’s溶液中來完成，反應中用甲醇作為載體溶劑在3- 馬來酰亞胺-PROXYL濃度為100mM的條件下進行。在22-23℃下混合使 DBBF-Hb反應30分鐘。交聯(lián)程度從沒反應的硝基氧化合物的電子自旋共 振信號強度判斷。為除去沒反應的硝基氧化合物，反應混合物用10體積強 的乳酸化Ringers洗三次，條件是Filtron攪拌池，截止分子量為30道爾頓 正常分子量限度(NMWL)，聚乙烯砜(PES)膜(Filtron?Technology?Co.)。

硝基氧化合物標記的血紅蛋白的電子自旋共振檢測用Bruker

ESR波譜儀測定。圖3A顯示4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO標記的 DBBF-Hb的電子自旋共振波譜。DBBF-Hb的電子自旋共振波譜與3-馬來 酰亞胺-PROXYL在圖3B中顯示的相同。

在此實施方案中，硝基氧化合物共價連接到血紅蛋白的兩個β球蛋白 鏈的單巰基上。因此，此在99.00％脫氧血紅蛋白的情況下硝基氧化合物對 血紅蛋白結(jié)合氧的比例是大約200比1，因為有兩個硝基氧化合物連到血 紅蛋白的兩個β-球蛋白鏈上。然而在輸注后，脫氧血紅蛋白HRCS在肺部 與氧結(jié)合而且在100％氧化情況下，硝基氧化合物與血紅蛋白結(jié)合氧的比例 成為1比2，因為有四個氧分子結(jié)合到血紅蛋白的四個球蛋白鏈上，留下 兩個硝基氧化合物在β-球蛋白鏈上。

若使用比例為1比2的血紅蛋白對硝基氧化合物，90％以上的硝基氧 化合物共價連接到DBBF-Hb上。DBBF-Hb還可以共價連接到共振波譜類 似于圖3B的馬來酰亞胺和PROXYL之間的間隔基上(即剩余的甲基)。 值得注意的是，硝基氧化合物可共價連接到DPG結(jié)合部位的專一性氨基上 (即β-Val-1β-Lys-82和α-Lys-99)或可連接到血紅蛋白的其于40-正表面賴 氨酸ε-氨基上。TEMPO異硫氰酸鹽衍生物和PROXYL硝基氧化合物也可 與氨基反應。例如，4-異硫氰酸鹽-TEMPO可以約為10∶1的摩爾比加入 到血紅蛋白中。在其他部位標記硝基氧化合物的血紅蛋白共振波譜(未顯 示)類似于圖3A顯示的共振波譜。

在DBBF-Hb的幾個部位連接硝基氧化合物的能力表明用α-球蛋白二 聚體穩(wěn)定的重組血紅蛋白(D.Looker?et.al.NATURE?356：258(1992))可類 似的用硝基氧化合物標記。也可制備硝基氧化合物標記的交聯(lián)劑如TEMPO 標記的琥珀酸鹽(見美國專利4,240,797)。

圖4是(A)2-(溴乙酰氨基)-TEMPO，(B)2-(溴乙酰氨基) -TEMPO-標記的HBOC和(C)15ND17TEMPOL(TEMPOL：4-羥基- 2，2，6，6-四甲基吡咯烷-1-氧基)在室溫下乳酸化Ringer′s溶液中的 ESR波譜。圖4A和4B的差別表現(xiàn)小分子量硝基氧化合物的運動性與共價 連接到大分子如血紅蛋白上的硝基氧化合物的運動性的差別。圖4C顯示 具有1/2核自旋的穩(wěn)定同位素氮產(chǎn)生兩個共振峰，并顯示具有1個核自旋天 然同位素氮產(chǎn)生三個共振峰(與(4A到4C相比)。在本文描述的這套實 驗中，共振峰的分離用于證明酶模擬物和體內(nèi)、體外大分子量硝基氧化合 物的氧化還原反應。

用不同硝基氧化合物對血紅蛋白摩爾比的硝基氧化合物標記的HBOC 可制備如下。2、4和8摩爾當量的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO，以固 體粉末的形式直接加入到清潔通風廚的中的三個分開的15毫升真空容器 中。在換掉橡膠隔膜后，將4-(2-溴乙酰氨基)TEMPO溶解在200微升 的氯仿中。然后將真空容器通過一個27號口徑穿過橡膠隔膜的針連接到高 真空中(5毫米Hg)并排除氯仿，在真空容器的下半部表面留下一薄層 4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO。用無菌轉(zhuǎn)移器穿過橡膠隔膜引入適量的 HBOC，此溶液在室溫下用間歇渦流法間隔5分鐘混合1/2小時(在硝基 氧化合物對血紅蛋白摩爾比為4和8中的固體物沒有完全溶解)，然后將 真空容器放在4℃冰箱內(nèi)過夜。次日晨，恢復到室溫再渦流混合1/2小時 直到在真空容器表面完全看不到固體4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO。

然后將反應混合物和對照轉(zhuǎn)移到無菌透析管中并用乳酸化Riners液進 行透析直到檢測不到未標記的游離4(2-溴乙酰氨基)-TEMPO電子自旋 共振(ESR)信號。4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO對Hb的摩爾當量為2、 4和8的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-標記的HBOC的ESR波譜分別在圖 5A-5C給出。在2摩爾當量的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO對血紅蛋白時， 無論有無透析，ESR波譜基本上是相同的，說明共價標記是定量的。在β 球蛋白鏈是的兩個SH-在HBOC的情況似乎位于共價結(jié)合處(這可通過選 擇性封閉N-乙基-馬來酰亞胺標記的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO或用反 相高效液相層析做球蛋白鏈分析得到證實)。值得注意的是，ESR信號強 度(峰Mo)比例是2、4、8的情況幾乎與按比例降低儀器敏感度所記 錄的波譜比例相同。

而且，期望4-(2-溴乙酰氨基)-TEMP在體內(nèi)甚至會以更高的摩爾比 例連接到Hb上，例如作為體內(nèi)輻射防護劑。

在血液替代制劑中，優(yōu)選的硝基氧化合物對血紅蛋白的摩爾比是8∶ 1，特別優(yōu)選的摩爾比是18，按如下制備方法以產(chǎn)生多硝基氧化合物血紅 蛋白(PNH)。PNH的優(yōu)選組合物是碳化一氧基，CO-PNH，CO結(jié)合 到穩(wěn)定PNH血紅素基團的PNH上，已經(jīng)表明CO-PNH在60℃是穩(wěn)定的。 因此，CO-PNH不需要冷凍并可存放在室溫下較長時間。而且當注入體內(nèi) 時，CO的存在提高了PNH的血管舒張的活性，已知CO在體內(nèi)起舒張血 管因子的作用。當CO從PNH上卸載時，PNH通過傳遞氧到組織中和通 過起硝基氧化合物調(diào)節(jié)的血管舒張作用繼續(xù)發(fā)揮治療藥物的功能，

參照圖6，4-(2-溴乙酰氨基)-TENPO-標記的HBOC和15ND17- TEMPOL混合物的ESR波譜的4-(2-溴乙酰氨基)TEMPO(向下箭頭所 示)中間峰和15ND17-TEMPOL(向上箭頭指示的)的高磁場強峰被調(diào)節(jié)到 相似的強度。

共振峰的分開使得可以同時檢測體內(nèi)(MURINE)和體外反應中涉及 小分子量硝基氧化合物(TEMPOL)和大分子共聚物的自由基或酶模擬物 活性。例如，兩種硝基氧化合物的體內(nèi)血漿半衰期通過參考不同硝基氧化 合物的特有波譜特征進行比較。特別是體內(nèi)基于血紅蛋白的溶液的ESR研 究在用小鼠作實驗時用硝基氧化合物對血紅蛋白比例為8∶1(見圖5C) 以便取其高ESR信號強度的優(yōu)點。首先，通過制備小分子量硝基氧化合物 (15N17-TEMPOL見4C)和大分子量4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPOL-標記 的HBOC(見圖4B)混合物并調(diào)整ESR信號強度到大致相同的水平來確 定它們大致的血漿半衰期(見圖6)。在麻醉狀態(tài)下，將0.4毫升的此混 合物注入熱燈下小鼠擴張的血管中。小鼠尾插入ESR腔中記錄注射后十分 鐘內(nèi)的波譜(見圖7A)。

然而，參照圖7A，7B，7C，檢測不到15ND17-TEMPOL信號，4- (2-溴乙酰氨基)-TEMPO標記的HBOC明顯被分解(見圖7B，和7C， 血漿半衰期的研究，其中7C是7B的延續(xù))。由于據(jù)報道在給大鼠大量注 射HBOC的第一個5到15分鐘內(nèi)HBOC的血管收縮作用得到充分發(fā)揮， 在小鼠體內(nèi)檢測到硝基氧化合物標記的HBOC在注入后立刻參與自由基氧 化還原反應。在麻醉狀態(tài)下，給雌性CH3小鼠尾靜脈插管輸入80％的硝基 氧化合物，20％的氧和3％的異螢烷。在熱燈下可見到小鼠尾靜脈擴張， 由30號口徑的皮針套管連接到一英尺長的聚乙烯管上，插入尾靜脈并用氰 基丙烯酸膠固定。在體內(nèi)ESR檢測時將插管小鼠在麻醉狀態(tài)下轉(zhuǎn)移到50 毫升椎形離心管中使其尾部從離心管端伸出讓管的開口端的麻醉氣體繼續(xù) 流動。小鼠尾插入塑料離心管，然后將管固定在TE102腔中以保證其開放。 插管靠近鼠尾的根部并保持在ESR腔外以便在大量注射后立刻能檢測到來 自尾部的純信號。通過插管注入0.5毫升樣品(見圖8)調(diào)整波譜儀重復 掃描模式在1/2分鐘間隔處(見圖8A和8B)。在圖8A中，磁場強度增 加兩高斯，在圖8B中，磁場強度降低兩高斯，兩者都加在共振波譜上。 注射后2.5分鐘內(nèi)，15ND17-TEMPOL信號消失。在此期間，4-(2-溴乙酰 氨基)-TEMPOL-標記的HBOC也以同樣速率降低。

然而，硝基氧化合物-HBOC信號在血漿中顯示是穩(wěn)定的(圖8B)。因 此，圖8B與圖7的結(jié)果共同顯示硝基氧化合物標記到大分子上如HBOC， 與小分子量硝基氧化合物(即15N17-TEMOL)相比顯著延長了半衰期。

自由基反應觀察到的性質(zhì)涉及兩個途徑：

1.快速狀態(tài)似乎涉及硝基氧化合物的自由基(即超氧化物)氧化反應成 為其氧代氨陽離子中間產(chǎn)物，繼之以氧代氨陽離子還原成為硝基氧化合物 穩(wěn)定的羥胺衍生物。此還原反應涉及血管腔內(nèi)的一個或兩個還原當量(即 NADH)。在8∶1摩爾比的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-標記的HBOC 代表HBOC上的大約25％的4-(2-溴乙酰氨基)TEMPO的情況下，氧化 物還原成羥胺形式將導致ESR信號強度的迅速降低。這個狀態(tài)涉及小分子 和大分子硝基氧化合物。

2.慢速狀態(tài)(見圖8B)似乎表現(xiàn)為HBOC上其余75％的4-(2-溴乙酰 氨基)TEMPO的抗氧化劑酶模擬物活性與硝基氧化合物參與的游離循環(huán) 自由基反應，例如SOD模擬物反應機制相關。其中硝基氧化合物自由基作 為SOD模擬物基本上不消耗，降低ESR信號強度的慢速率主要歸因于上 述反應機制其次歸因于HBOC濃度降低，這是由其血漿半衰期的性質(zhì)從血 管腔中逐漸消失造成的。

這個結(jié)果證明了多硝基氧化合物大分子，在此例中為TEMPO標記的 HBOC，在體內(nèi)使自由基解毒的應用性。此應用性定義為通過硝基氧化合 物在體內(nèi)起酶模擬物的作用提供短期的(以分鐘計)清除自由基并不斷防 止氧化劑反應的能力。通過此實施例以及與含血紅蛋白溶液的有關的每個 實施例中，能夠理解未結(jié)合的低分子量硝基氧化合物可以加入到制劑中以 增加透過血管膜，進入腸道和細胞周圍的環(huán)境的活性硝基氧化合物的濃 度。本文表示的結(jié)果因而能鑒別低分子量硝基氧化合物簡單加入到本發(fā)明 的多硝基氧化合物大分子藥物成分中的效果。本發(fā)明用多硝基氧化合物大 分子與分子量硝基氧化合物一起使用的多成分系統(tǒng)的特殊優(yōu)點強調(diào)如下。

基于圖8的波譜分析，氧化/還原(氧化還原)循環(huán)反應涉及大約73％ 保持其自由基狀態(tài)的4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-標記的HBOC。這表明 TEMPOL參與限于血管內(nèi)的體內(nèi)氧化還原反應。

為研究基于血紅蛋白的溶液的血管收縮效應，檢測被修飾的人血紅蛋 白溶液在整個大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的效應。應用于人的方法總是可以用于任何實 驗動物中。

在實驗前7天，用酮胺(40毫克/公斤i.m.)和乙酰噻吩嗪(0.75mg)， 或巴比妥鈉(20毫克/公斤i.p.)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。將醫(yī)用級 聚乙烯微孔(0.05ID，.03OD)插入股動脈和靜脈。將插管從腹內(nèi)取出并裝入 肝素處理的葡萄糖，用不銹鋼針封好。經(jīng)2-3天的恢復，有知覺的動物放 入塑料動物籠中。手術后需要恢復七(7)天以保證換輸液前創(chuàng)口的恢復。 因為手術可能引起少量流血，恢復是很重要的以便手術引起的少量流血不 會與換血的副作用攪在一起。用輸液泵進行50％換液以便分別從兩個來源 同時輸入和抽出實驗液和血液。除去的血液體積(12-15毫升，根據(jù)總體 積而定)用實驗溶液替換，時間大約在20分鐘到30分鐘以上。終點是血 球容量計降低到初始一半時的數(shù)值。換輸液后用連接到圖表記錄儀上的壓 力傳感器測量并記錄動脈血壓5小時。計算平均動脈壓為1/3脈搏壓。根 據(jù)血壓掃描圖據(jù)確定心跳速率。

??????實施例三--硝基氧化合物標記的穩(wěn)定的血紅蛋白聚合體

從交聯(lián)單體產(chǎn)生穩(wěn)定血紅蛋白二聚體的同時，還可從穩(wěn)定的或天然血 紅蛋白產(chǎn)生血紅蛋白聚合體。血紅蛋白聚合體溶液含有單體，二聚體，三 聚體，四聚體和其他寡聚體。一般用作HBOC的含有聚合血紅蛋白的溶液 具有較長的血漿循環(huán)時間并且與穩(wěn)定單體血紅蛋白相比有較高的氧承載能 力。這種聚合化的血紅蛋白可由幾種不同的聚合化藥劑通過幾個不同途徑 制備。(見美國專利4,001,200，4,857,636和4,826,811)。將硝基氧化合 物引入聚合血紅蛋白溶液的優(yōu)選方法還是通過共價結(jié)合硝基氧化合物到血 紅蛋白的兩個β-93巰基上。這些巰基尚不知與穩(wěn)定化和聚合化過程有牽 連。結(jié)果，最好在血紅蛋白單體穩(wěn)定化和聚合化之前將硝基氧化合物共價 結(jié)合到血紅蛋白上。

例如，按照本發(fā)明在上面第二個實施例中介紹的方法將硝基氧化合物 共價結(jié)合到DBBF-Hb上，繼之以按Sehgal等人在美國專利4,826,811中介 紹的方法用戊二醛進行聚合化。圖4B是用3-馬來酰亞胺-PROXYL標記并 用戊二醛聚合化的DBBF-Hb的電子自旋共振波譜。同樣的，用戊二醛聚合 的DBBF-Hb可以用4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO經(jīng)同樣方法進行標記。

用類似方法，聚合血紅蛋白中間物，如戊二醛聚合的，o-棉子糖聚合 的，或o-環(huán)葡聚糖聚合的血紅蛋白中間物，后者含有無活性的醛基，可用 于將4-氨基-TEMPO或3-氨基-PROXYL通過還原性氨化反應進行共價結(jié)合 以生成硝基氧化合物標記的血紅蛋白聚合體。對還原性氨化反應來說，反 應順序和時間是重要的。在完成聚合化反應后但在導致硝基氧化合物共價 結(jié)合到聚合血紅蛋白的還原反應前將4-氨基-TEBPO加入到戊二醛-聚合的 血紅蛋白上。同樣，對o-棉子糖聚合血紅蛋白進行硝基氧化合物標記可通 過在還原性氨化反應前加入4-氨基-TEMPO或3-氨基-PROXYL來完成。例 如，按照我的美國專利4,857,636介紹的方法制備4-氨基-TEMPO標記的o- 棉子糖聚合血紅蛋白，方法不同之處是在聚合反應后和在用20摩爾強的甲 硼烷二甲胺混合物進行還原反應前加入6摩爾當量的4-氨基-TEMPO。如 本文所介紹的，血紅蛋白可用從雙糖得到的多價醛或開環(huán)蔗糖包括寡糖或 最好是三糖如o-棉子糖進行交聯(lián)和聚合。同樣，單糖可用于穩(wěn)定化和聚合 血紅蛋白雖然最好用高分子量的蔗糖。透析和清洗o-棉子糖聚合的4-氨基 -TEMPO標記的血紅蛋白共振波譜如圖9A所示。

為增加聚合血紅蛋白的血紅蛋白寡聚物(Hbn，其中n＝2-4)的產(chǎn)量， 最好用α-環(huán)葡聚糖，β-環(huán)葡聚糖和γ-環(huán)葡聚糖以及它們的衍生物增加交聯(lián)劑 的聚合醛價鍵，這些衍生物是6-，7-和9-環(huán)葡萄糖分子，開環(huán)α-環(huán)葡聚糖， β-環(huán)葡聚糖和γ-環(huán)葡聚糖，它們分別有12，14和16活性醛基。這些開環(huán) 交聯(lián)劑可用于交聯(lián)和聚合血紅蛋白以生成富集寡聚體的聚合血紅蛋白。無 活性的醛，如上面提到的，可用于共價連接到氨基-硝基氧化合物上，例如 4-氨基-TEMPO或3-氨基-PROXYL。

還有，開環(huán)硫酸鹽衍生物，例如α-環(huán)葡聚糖硫酸鹽，將因為兩個原因 成為一種有效的交聯(lián)劑：(1)硫酸鹽基團在降低交聯(lián)血紅蛋白的氧親和 力方面將模擬DPG的活性，因此改進氧的傳輸屬性，并且(2)硫酸鹽基 團將作為親和標記，它將多級(即n＝2-4)血紅蛋白復合化而開始形成一 種“簇”。一旦“簇”復合物形成，環(huán)葡聚糖上的醛基將向DPG結(jié)合部位 的鄰近NH2基靠近，由此促進血紅蛋白的亞單位內(nèi)部共價鍵形成和分子內(nèi) 部的交聯(lián)從而增加血紅蛋白寡聚體的產(chǎn)量。除抗氧化劑酶模擬物活性外， 環(huán)葡聚糖聚合并硝基氧化合物標記的血紅蛋白與o-棉子糖和戊二醛聚合的 血紅蛋白相比還促進產(chǎn)量和改進制劑。

????????實施例四--硝基氧化合物標記的脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白

脂質(zhì)體是由疏水性分子集結(jié)成雙層結(jié)構(gòu)而形成的顆粒，雙層結(jié)構(gòu)構(gòu)成 空心球狀，極性部位面向空心球內(nèi)的水區(qū)和球外的水區(qū)。本領域上有幾種 形成脂質(zhì)體的可行方法。典型的說，分子如二棕櫚酰卵磷脂形成水溶液中 的脂質(zhì)體。形成脂質(zhì)體時可以用膽固醇增加穩(wěn)定性還可包括其他物質(zhì)如中 性脂質(zhì)，表面調(diào)節(jié)劑如正電荷或負電荷化合物。優(yōu)選的脂質(zhì)體是小雙層單 位膜球形殼。

在脂質(zhì)體中包裹血紅蛋白的方法也是已知的(見Farmer等人的美國專 利4,911,921)。為本發(fā)明之目的，許多方法可將基于硝基氧化合物的氧解 毒功能引入脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白溶液中。例如可用硝基氧化合物標記的 天然血紅蛋白或上面介紹的硝基氧化合物標記的穩(wěn)定化血紅蛋白作為起始 物，然后通過已知技術進行硝基氧化合物標記血紅蛋白的脂質(zhì)體包裹加 工。在此實施方案中，純化的血紅蛋白還可與膜不通透性硝基氧化合物包 襄在一起，如Hsia等人的美國專利4,235,792發(fā)表的用于電子自旋共振免 疫檢測的氯化TEMPO-膽堿。

而且，任何純化的血紅蛋白可用脂質(zhì)體包裹，這種脂質(zhì)體含有硝基氧 化合物標記的脂肪酸(即7-DOXYL-硬脂酸鹽，12-DOXYL-硬脂酸，和 16-DOXYL-硬脂酸鹽)，膽甾烷，膽固醇類似物(即，3-DOXYL-膽甾烷)， 或磷脂(即，12-DOXYL-硬脂酸鹽-標記的卵磷脂)。將血紅蛋白包裹在 含有標記的3-DOXYL-膽甾烷的脂質(zhì)體中的制備方法類似于在Tabushi?et al.，(J.Am.Chem.Soc.106：219(1984))中介紹的方法。首先將5毫升含脂肪 成分的氯仿溶液，其中包括DOXYL標記的硬脂酸和/或膽甾烷像下面具體 介紹的那樣在氮氣中干燥以除去溶劑。然后殘余物在真空中干燥并將得到 的膜懸浮在2毫升的血紅蛋白(24g/dl)的乳酸化Ringers溶液上。這種 分散開的濃脂肪有100mM。然后旋轉(zhuǎn)這種脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白并最好 在37℃溫浴直到全部脂質(zhì)擴散形成多層囊。然后按照Cook等人的方法讓 這種含多層囊脂質(zhì)體包裹血紅蛋白的溶液和游離未包裹的血紅蛋白加壓通 過微量流化器以形成0.2微米的脂質(zhì)體(見美國專利4,533,254)。脂質(zhì)體 中，二棕櫚酰卵磷脂∶膽固醇∶二棕櫚酰磷脂酸∶3-DOXYL-膽甾烷的摩 爾比是0.5∶0.4∶0.02∶0.07。產(chǎn)生的3-DOXYL-膽甾烷標記的脂質(zhì)體包裹的血 紅蛋白共振波譜如圖10A所示。在這種構(gòu)像中，硝基氧化合物插入到脂質(zhì) 體膜中并且在脂質(zhì)雙層水交界的內(nèi)外表面都能見到。用16-DOXYL-硬脂酸 代替脂質(zhì)成分中的3-DOXYL-膽甾烷，如圖10A所示產(chǎn)生的電子共振波譜 在圖10B給出。如共振波譜所反映的硝基氧化合物的運動性與主要存在于 脂質(zhì)雙層的疏水內(nèi)層的硬脂酸的DOXYL的表現(xiàn)相一致。以等摩爾比加入 3-DOXYL-膽甾烷和16-DOXYL-硬脂酸到脂質(zhì)成分中，這種雙硝基氧化合 物標記的脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白共振波譜如圖10C所示。圖10C的共振波 譜是由圖10A和10B構(gòu)成，因為在這個實施方案中硝基氧化合物位于膜水 界面和疏水脂質(zhì)雙層內(nèi)部。通過將硝基氧化合物放置在這兩個部位，此方 案在脂質(zhì)雙層疏水內(nèi)部和膜水交界面都提供了氧解毒功能，因而為包裹的 血紅蛋白提供了額外儲存氧解毒功能的好處。

????????實施例五--硝基氧化合物標記的結(jié)合血紅蛋白

結(jié)合血紅蛋白的生理相容性溶液是通過形成血紅蛋白與用作血漿膨脹 劑的生物相容性大分子的結(jié)合物而產(chǎn)生的。血漿膨脹劑如葡聚糖(Dx)， 聚氧乙烯(POE)，羥乙基淀粉(HES)用于增加血紅蛋白在體內(nèi)循環(huán) 的半衰期。在這種情況下，血紅蛋白分子與生物相容性大分子都被認為是 血紅蛋白結(jié)合物。有許多方法將硝基氧化合物結(jié)合到血紅蛋白結(jié)合物中。 例如，可以簡單的將想要結(jié)合的血紅蛋白用硝基氧化合物標記的血紅蛋白 如TEMPO標記的DBBF-Hb替換。這可通過用3-馬來酰亞氨基-PROXYL- DBBF-Hb或4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO-DBBF-Hb在制備結(jié)合血紅蛋白 時替換血紅蛋白或吡哆酰血紅蛋白來完成。

4-氨基-TEMPO標記的葡聚糖結(jié)合血紅蛋白按照Tam?et.al.，(Proc.Natl. Acad.Sci，73：2128(1976))中介紹的方法制備。一開始，將pH7.4含8％血紅 蛋白的0.15M?NaCl和5mM的磷酸鹽緩沖溶液與高碘酸氧化葡聚糖結(jié)合形 成Schiff-堿中間物。向血紅蛋白中加入20摩爾當量的4-氨基-TEMPO在硝 基氧化合物和葡聚糖的剩余反應醛基之間形成Sciff-堿。4℃下保持30分 鐘后加入50摩爾當量的二甲胺硼酸鹽水溶液。此溶液在4℃下再保持兩小 時。此后，對此溶液做透析并用乳酸化Ringers緩沖液再生，然后用Filtron 膜過濾單元(Filtron?Technology?Co.)無菌過濾。4-氨基-TEMPO標記的葡 聚糖結(jié)合血紅蛋白的電子自旋共振波譜是尖銳的不對稱三重線，反映了高 度的運動自由性(見圖11)。當和緊密折疊的血紅蛋白分子相比時，與葡 聚糖共價結(jié)合的TEMPO增加的運動性與硝基氧化合物連接到柔性多糖葡 聚糖鏈上是一致的(見圖3A和3B)。因此圖11的共振波譜證明已制備 出新的硝基氧化合物標記的葡聚糖結(jié)合的血紅蛋白。

????????????實施例六--硝基氧化合物標記的白蛋白

本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是用硝基氧化合物標記的生物相容性大分子與 低分子量膜通透性硝基氧化合物結(jié)合以提供持久的抗氧化劑體內(nèi)活性。最 好是，硝基氧化合物標記到生物相容性大分子上就像本文使用的那樣，術 語“蛋白質(zhì)”包括片段和相關衍生物。硝基氧化合物標記的蛋白質(zhì)最好使 用大部分氨基酸基團被標記的蛋白質(zhì)。例如，這種理想的生物相容性大分 子是人血清白蛋白(HAS)。此外，標記二硫鍵能增加硝基氧化合物對蛋 白質(zhì)的摩爾比例。如此標記的蛋白質(zhì)，創(chuàng)造了酸性微環(huán)境，它能促進游離 硝基氧化合物和與大分子結(jié)合的硝基氧化合物之間的相互作用，由于不同 物質(zhì)的穩(wěn)定性差異促進了電子自旋的傳遞。這類共價標記的硝基氧化合物 連接成二硝基氧化合物，三硝基氧化合物，或多硝基氧化合物羧基共聚物， 其分子量在5000到7000。因此硝基氧化合物對白蛋白的摩爾比可增加到 大約400并且可通過本文公開的標記策略進行變更以達到一個必要的的值 或值的范圍達到400。在白蛋白的情況，還有可能將硝基氧化合物共價結(jié) 合到原膽紅素的白蛋白結(jié)合部位，可使用諸如帶有此部位專一性結(jié)合親和 力的硝基氧化合物活化衍生物，即TOPS。通過選用大分子上的結(jié)合部位， 修飾硝基氧化合物的反應性并且這種修飾可用于改變這類化合物的反應 性。

血清白蛋白是帶有多配位體結(jié)合部位的血漿蛋白質(zhì)并且是血液中許多 配位體的運輸?shù)鞍踪|(zhì)。硝基氧化合物可專一性結(jié)合到人血清白蛋白的許多 配位體結(jié)合部位或與之非專一性結(jié)合。這類結(jié)合可能是非共價的，或者是 通過活化硝基氧化合物共價結(jié)合。硝基氧化合物-白蛋白即可單獨使用也可 與低分子量硝基氧化合物化合物結(jié)合使用如TEMPOL，TOPS，以及TOPS 的單或二酯，用于口服，胃腸外給藥和局部治療用藥。硝基氧化合物標記 的白蛋白還用作白蛋白的一種“改進”形式(即具有抗氧化劑活性的改進 形式)，可用于目前常規(guī)使用血紅蛋白用途的任何方面，包括紅細胞保存 劑，胃腸外膠體溶液，生物材料中，生物相容性表面膜等以及抗氧化劑應 用如保存細胞用化合物，即器官移植時保存器官用和輸血時保存血細胞 用。

白蛋白可從血漿中得到或可通過遺傳重組方法生產(chǎn)。HAS有各種使 用形式，包括單體(正常的血漿形式)，同源二聚體，寡聚體，和集合物 (中心球和白蛋白微泡)。此外，白蛋白可用聚乙二醇處理產(chǎn)生免疫原性。 通過使用對蛋白質(zhì)的相關部位有結(jié)合專一性的活性硝基氧化合物衍生物， 硝基氧化合物專一性標記的白蛋白可到達幾種結(jié)合部位，包括血紅素， FFA，吲哚，或Cu++結(jié)合部位，一個優(yōu)選實施例是共價結(jié)合到HAS的原血 紅素結(jié)合部位的2，2，6，6-四甲基-1-氧-4-亞哌啶琥珀酸(TOPS)硝基氧化合 物。白蛋白的非專一性標記可達大約50個能接觸到的氨基。溫度和化學處 理白蛋白能增加硝基氧化合物對白蛋白的摩爾比。用天然白蛋白摩爾比在 7以上并可達到60。用硝基氧化合物標記的白蛋白達60摩爾，通過用硝 基氧化合物標記白蛋白的35個潛在的巰基硝基氧化合物對白蛋白的摩爾 比可達到95。這種共價標記的硝基氧化合物以二硝基氧化合物，三硝基氧 化合物或具有分子量5000到7000的硝基氧化合物羧基共聚物的形式結(jié) 合。因此，硝基氧化合物對白蛋白的摩爾比可增加到400并且可通過本文 公開的標記策略給以改變以達到一個必要的數(shù)值或數(shù)值范圍達到400。

為證明活性硝基氧化合物在體內(nèi)再生，將4-羥基-2，2，6，6-四甲 基-哌啶-N-氧基(N-TPL)的磷酸緩沖鹽水注入麻醉的小鼠(體重40克) 尾靜脈作為對照。尾端插入電子共振波譜(ESR)儀的樣品管中。在注射 前小鼠尾不顯示電子共振波譜信號。在注射0.5毫升6mM?TEMPOL后檢測 到電子共振波譜信號并很快消退，在30秒間隔內(nèi)能見到三個連續(xù)的掃描波 譜(見圖18A)。這個結(jié)果表明TEMPOL減少到無法用電子共振波譜檢測 到并且成為沒有催化活性的N-羥胺(R-NOH)衍生物(TEMPOL-H或 TPH)。為檢測小鼠尾的TEMPOL血漿半衰期，連續(xù)檢測高磁場強峰強度 8分鐘(圖19)。8分鐘后，重復注射TEMPOL。在大約10秒鐘內(nèi)在小 鼠尾部得到與TEMPOL(TPL)濃度相對應的最大峰強度，接著衰減到 基線，結(jié)果TPL在體內(nèi)半衰期是大約50秒(圖19)。通過兩種方法確定 TPL的半衰期：即，掃描間隔時段的整個波譜和連續(xù)記錄高磁場強峰強度。

為制備多硝基氧化合物白蛋白(PNA)，讓人血清白蛋白(HAS， 5％溶液，Baxter?Healthcare?Corp)與60摩爾當量的Br-TEMPO(Sigma) 在60℃下混合反應10小時。得到的反應混合物，即在Vacutainer管中含 15毫升的HAS和165毫克的Br-TEMPO用0.22微量濾器除菌過濾并轉(zhuǎn)移 到150毫升的配備有10kda-截止超濾膜的攪拌池中(Stirred?Cell?Device)。 用Ringer′s液(McGaw?Inc.)清洗直到濾物中用電子共振波譜檢測到的游 離Br-TEMPO含量小于1微摩爾。得到的亮橙黃色物濃縮到含HSA?25％， 再用0.22微量濾器除菌過濾進入10毫升無菌試管(Abbott?Laboratories) 并在4℃下儲存直到使用。大分子多硝基氧化合物的電子共振波譜如圖 15C所示。

為增加硝基氧化合物在多硝基氧化合物白蛋白中的摩爾比，在脲的存 在下將二硫基團還原成巰基乙酸鈉并加入過量的Br-TEMPO以便標記打開 的二硫鍵。用這種方法平均增加大約10個摩爾比，這個結(jié)果類似于Chen 等人在“硝基氧化合物標記白蛋白作為磁共振成像和波譜造影劑的可能 性”中介紹的方法的結(jié)果，Biconjugate?Chemistry，1990，Vol.1，32-36頁。

在燒瓶中將多硝基氧化合物白蛋白溶液濃度調(diào)到17.5毫克/毫升。此溶 液用脲稀釋到8M并攪拌直到完全溶解。加入2％碳酸鈉調(diào)pH到8.2。調(diào) pH后的溶液徹底脫氣15分鐘。然后充滿氬氣。在另一個燒瓶中制備3M 的巰基乙酸鹽溶液，脫氣并充滿氬氣。此巰基乙酸鈉加入到多硝基氧化合 物白蛋白中使終濃度為0.3M。

得到的溶液進行脫氣和充滿氬氣并在室溫，黑暗和氬氣條件下混合并 放置20小時。然后用3升脫氣的pH8.4的磷酸緩沖溶液(2％碳酸鈉調(diào) pH)室溫，氬氣條件下透析5小時。加入過量的Br-TEMPO并在氬氣下再 混合攪拌24小時。

最終的溶液在PBS，pH7.4條件下透析5小時以除去未反應的硝基氧 化合物?？捎肊PR波譜測定自旋電子強度和用Biuret方法測定蛋白質(zhì)濃 度。

典型結(jié)果陳述如下，這是三次實驗的平均結(jié)果： 1蛋白質(zhì)濃度：

氨基標記的多硝基氧化合物白蛋白

53.0mg/ml＝0.78mM

氨基加二硫化物

13.9mg/ml＝0.20mM 2.自旋密度：

氨基標記的多硝基氧化合物白蛋白(PNA)

33mM

氨基加二硫化物

10.5mM 3.結(jié)合到蛋白質(zhì)上的硝基氧化合物摩爾比計算

氨基標記的多硝基氧化合物白蛋白

33mM/0.78mM＝42硝基氧化合物/白蛋白

氨基加二硫化物

10.5mM/0.20mM＝52硝基氧化合物/白蛋白

二硫化物基團的還原使此實施例中的硝基氧化合物對白蛋白摩爾比增 加了10個。

用于產(chǎn)生本文介紹的實例PNA使用的方法和用于證明本發(fā)明多硝酰 化生物相容性分子的治療，診斷和功能性用途所使用的方法易于應用到生 產(chǎn)其他化合物中如多硝酰化HBOC(或PNH)，多硝?；暇厶?PND) 和許多其他的PNA制劑中如在下面圖表中給出的硝基氧化合物種類，結(jié) 構(gòu)，蛋白質(zhì)濃度自旋電子強度和白蛋白上可用基團的結(jié)合百分數(shù)。

為證明上述多硝基氧化合物標記的白蛋白功能上促進低分子量膜通透 性硝基氧化合物的體內(nèi)活性，將人血清白蛋白用4-(2-溴乙酰氨基)- TEMPO(BR-TEMPO)做共價標記并在TEMPOL給藥后進行輸注，觀察 到它已被轉(zhuǎn)換成還原態(tài)。

在上述實施例中注射TEMPOL兩小時后，小鼠尾部顯示無esr信號。 在向尾部靜脈注射0.2毫升多硝基氧化合物白蛋白時，4分鐘內(nèi)TEMPOL 信號再次出現(xiàn)。TEMPOL信號強度持續(xù)2小時以上。半衰期大約是40分 鐘(見圖18)。從它們特有的圖譜看，TEMPOL信號可與多硝基氧化合 物白蛋白信號區(qū)分開。TEMPOL信號以其特殊的高磁場強峰強度被檢測 到。硝基氧化合物對白蛋白摩爾比為27表現(xiàn)了同樣的反應活性。

注射多硝基氧化合物白蛋白后檢測到esr信號僅是由于在大分子上的 硝基氧化合物與大分子解離的可能性由下述實驗排除。實驗的進行與上相 同只是使用[15N]-TEMPOL和白蛋白-[14N]-TEMPOL。不同的氮提供了鑒別 游離的esr信號和大分子硝基氧化合物的信號的方法。結(jié)果(圖18A)證 實來自再生硝基氧化合物的信號是從同位素15N得到的，因此低分子量膜 通透性[15N]-TEMPOL的抗氧化劑活性在加入大分子多硝基氧化合物后得 到再生。

如此所述，兩種含硝基氧化合物物質(zhì)之間的供體/受體關系提供了在體 內(nèi)維持硝基氧化合物保護作用的能力。在幾個實施方案中描述的PNA和 TPL的相互作用僅是本發(fā)明提供的附加結(jié)合制劑的一個實施例。參考圖 18B(1)，(2)和(3)，多硝基氧化合物白蛋白表現(xiàn)出TOPS活性。 50mM的TOPS本身(圖18B(1))和43mM的PNA本身(圖18B(2)) 反映出相對低的峰強度，而兩者結(jié)合，在磷酸鈉緩沖液中(pH7.8)表現(xiàn)明 顯提高的峰強度(圖18B(3))。同樣，在圖18C，多硝酰化HBOC表 現(xiàn)為活性TOPS，在圖18D，B3T標記白蛋白表現(xiàn)為活性TOPS。因此， 如本文其他地方提到的，多組分方案可用不同的硝基氧化合物或具有不同 自由電子穩(wěn)定性的基于硝基氧化合物的化合物來組方。

????????????實施例七--硝基氧化合物標記的免疫球蛋白

如上述實施例中所述某些硝基氧化合物靜脈注射時表現(xiàn)出很短的血漿 半衰期。由于期望得到具有長血漿半衰期的抗氧化劑酶模擬物，硝基氧化 合物可連接到免疫球蛋白上以便提供長效抗氧化劑酶模擬物活性。

免疫球蛋白是一類在免疫系統(tǒng)的B細胞中產(chǎn)生的血漿蛋白質(zhì)，它們的 特點是具有兩個專一性配位體結(jié)合位點(抗原結(jié)合部位)。過去硝基氧化 合物已經(jīng)在研究初級免疫和次級免疫應答時免疫球蛋白的半抗原結(jié)合專一 性和親和力中用作探針。

正如上述實施方案中描述的硝基氧化合物標記的白蛋白那樣，在以上 硝基氧化合物-HBOC實例中介紹的硝基氧化合物標記技術容易應用于生 產(chǎn)硝基氧化合物標記免疫球蛋白。由于免疫球蛋白具有專一結(jié)合及循環(huán)半 衰期長的優(yōu)點，本發(fā)明的這種化合物的酶模擬物活性可以作用于特定的組 織并具有延長的活性。

硝基氧化合物標記的免疫球蛋白可在體內(nèi)使用，通過與活動的氧物質(zhì) 反應提供保護細胞免受損傷的作用。硝基氧化合物標記的免疫球蛋白可單 獨使用或與低分子量硝基氧化合物結(jié)合使用提供延長的抗氧化劑活力和延 長的血漿半衰期。

硝基氧化合物標記的免疫球蛋白可用專一性標記免疫球蛋白自身或共 價標記在半抗原結(jié)合部位來制備。為避免將硝基氧化合物標記的免疫球蛋 白作為身體的天然免疫應答部分被清除，一種方法是使用免疫球蛋白片 段，例如按已知非專一性標記技術切開免疫球蛋白所產(chǎn)生的(Fab)2，優(yōu)選的 硝基氧化合物：免疫球蛋白摩爾比可高達60∶1。

硝基氧化合物標記的免疫球蛋白是用于將模擬酶作用指向特定目標的 向?qū)У膬?yōu)選物質(zhì)。例如通過篩選對炎癥抗原的專一性抗體或其他這類病理 學專一性抗體。本發(fā)明的成像促進和治療優(yōu)越性可被導向特定部位。

????????實施例八--生物結(jié)構(gòu)和自由基反應的EPR成像

在大多數(shù)情況下，自由基反應發(fā)生的太快以至于EPR-成像(ERI)是 很困難的。然而由于穩(wěn)定自由基的存在，硝基氧化合物可用電子頁磁共振 波譜檢測到。隨著先進成像儀器的開發(fā)，完整生物組織和器官的成像可基 于檢測自由基濃度而得到。生物相容性硝基氧化合物是成像促進劑的侯選 化合物。

因為硝基氧化合物在給藥后數(shù)分鐘內(nèi)在體內(nèi)被還原成無活性的衍生 物，它們的用途受到限制。按照本發(fā)明，體內(nèi)的活性硝基氧化合物水平可 以維持一段較長的時間使得與低分子量膜通透性硝基氧化合物本身相比改 進了成像對比度和較長的信號持續(xù)時間。

電子順磁共振波譜(EPR)是一種通過檢測磁場存在下的未配對電子 的能量狀態(tài)改變觀察自由基的行為。這種技術對自由基是專一的因為只有 未配對電子才被檢測到。用現(xiàn)有的測量電子順磁共振裝置，可得到宏觀物 體的實時圖像，包括活組織。EPR成像(ERI)提供了多維圖像(包括波 譜-空間圖像)為診斷和研究之用。

電子順磁共振成像(ERI)用硝基氧化合物作為造影劑主要對醫(yī)學成 像是有價值的方法，特別是對局部缺血組織。然而，這個技術的發(fā)展因硝 基氧化合物在體內(nèi)迅速還原成無順磁性的物質(zhì)而受到限制。

表面上引用硝基氧化合物的應用方面已證明在體內(nèi)作為EPR造影劑 有較低的分辨率。(L.J.Berliner，″EPR體內(nèi)應用″pp.292-304，EPR IMAGING?AND?IN?VIVO?EPR，G.R.Eaton，S.S.Eaton，K.Ohno，editors； CRC?Press(1991)。重要的是，Subramanian和他的合作者分析了檢測自由 基物質(zhì)和體內(nèi)成像的無線電頻率傅立葉變換EPR波譜(J.Bourg?et?al，J Mag.Res.B102，112-115(1993)。

按本發(fā)明制備的多硝基氧化合物白蛋白(PNA)已證明分布于血管和 其他細胞外間隙。雖然本發(fā)明的化合物的濃度范圍可以改變，優(yōu)選的范圍 是每dl?5-25克標記的PNA和0.1到200mM?TEMPOL。電子順磁共振 (EPR)波譜測定的抗氧化劑活性和可檢測性是唯一目的。此外，當與溫 和劑量的小分子量膜通透性硝基氧化合物同時給藥時，硝基氧化合物在體 內(nèi)較長時間內(nèi)維持活性自由基狀態(tài)。

用于ERI成像的優(yōu)選組合物是人血清白蛋白(1.0到25.0g/dl)用高摩 爾比硝基氧化合物(7比95，硝基氧化合物比白蛋白)。如本文其他地方 所述，多硝基氧化合物白蛋白(PNA)能接受來自硝基氧化合物羥胺形式 的未配對電子(即TPH)再生活動硝基氧化合物成自由基狀態(tài)(即TPL)。 這種多組分基本優(yōu)點是當大分子或物質(zhì)在細胞外時，小的膜通透性硝基氧 化合物和其還原型(羥胺)衍生物自由分布于細胞外和細胞內(nèi)空間。這造 成一種循環(huán)，在此循環(huán)中硝基氧化合物自由基能在還原前在細胞內(nèi)被檢測 到，然后通過大分子物質(zhì)(細胞外)再生。因此，在體內(nèi)較長時間內(nèi)保持 理想濃度的波譜可檢測到的硝基氧化合物。

延長體內(nèi)較短的硝基氧化合物半衰期幫助克服了硝基氧化合物為基礎 的成像方法和醫(yī)學治療的發(fā)展障礙。就成像而言，Johns?Hopkins?University 的EPR實驗室已開發(fā)出連續(xù)波EPI儀器，用硝基氧化合物作為造影劑研究 心臟局部缺血和重灌注的過程。然而，硝基氧化合物本身有限的半衰期意 味著無法研究重灌注狀態(tài)。在這些研究中，硝基氧化合物在大鼠心臟的三 維波譜空間EPR成像由于硝基氧化合物的還原作用遇到了自由基信號迅速 衰減的麻煩。雖然大鼠心臟的橫截面二維空間EPR圖像已經(jīng)從三維波譜空 間數(shù)據(jù)中建立起來，這是以12分鐘的探測期間內(nèi)EPR信號不斷衰減的基 礎上建立的。硝基氧化合物在心外膜，中層心肌和心內(nèi)膜有不同的還原速 率，由于持續(xù)局部缺血的作用進一步減小了心臟截面圖像的清晰度。按照 本發(fā)明，這種ERI圖像是可以改進的。延長體內(nèi)硝基氧化合物的活性半衰 期使得能對重灌注狀態(tài)成像并且提供了有關局部缺血性損傷在組織和器官 的發(fā)展過程的額外信息。本發(fā)明的制劑提供了穩(wěn)定的硝基氧化合物信號， 適合給藥后10分鐘內(nèi)的成像并可至少持續(xù)約2小時。(見圖25)。作為 比較，僅來自游離硝基氧化合物的信號在給藥后20分鐘內(nèi)功效消失。(圖 24)。關于治療用途，安全的保持活性硝基氧化合物水平的能力代表著提 供延長抗氧化劑效力的能力，這有助于防止局部缺血/重灌注損傷，和防止 來自有毒氧的自由基成為細胞損傷物質(zhì)的病理學過程(見圖26和圖27)。

用基本上相同于Kuppusamy等人介紹的方法，Proc.Natl.Act.Sci.，USA Vol.91，pgs.3388-3392(1994)，用多硝基氧化合物白蛋白(PNA)在濃度 為4克白蛋白/dl和2mM?15N-TEMPOL時檢測大鼠心臟圖像。

參考圖24，15N-TEMPOL在多硝基氧化合物白蛋白存在時的信號強 度可在分離的大鼠心臟見到。EPR信號是雙相位穩(wěn)定并且強度逐漸下降。 當單獨使用小分子量膜通透性硝基氧化合物時，信號強度雙相位迅速下降 (圖24)。

在EPR成像研究中，大鼠心臟用含有硝基氧化合物的溶液灌注同時可 伴有多硝基氧化合物白蛋白或沒有多硝基氧化合物白蛋白，隨后終止灌注 流造成局部缺血。圖24顯示在局部缺血期間，有或無多硝基氧化合物白蛋 白存在下，分離的大鼠心臟中的[15N]-TEMPOL的總信號強度。可見到信號 強度經(jīng)歷了雙相衰減并且多硝基氧化合物白蛋白顯著減慢信號強度的衰 減。通過如此的TEMPOL信號穩(wěn)定化過程，多硝基氧化合物白蛋白使得在 一個較長的時間內(nèi)得到高質(zhì)量的EPR圖像。參考圖22-23，局部缺血性心 臟的三維EPR圖像經(jīng)過156分鐘的普遍局部缺血后仍能得到。圖22A顯示 心臟的斷面觀。如圖23中所示，三維圖像還可從橫切面觀察。這顯示了 TEMPOL信號在局部缺血性心臟的差別分布作用；這在圖28作了量化。 圖25顯示一系列圖像如在圖23中125分鐘內(nèi)的普遍局部缺血期間一系列 連續(xù)時間點所得到的圖像。這說明PNA的存在使得成像在分辨率和信號持 久性方面要比TEMPOL單獨存在時所可能有的結(jié)果要好的多。

本發(fā)明的一個特殊的優(yōu)點是能夠通過選擇組合物找出圖像改進的辦 法，被選擇的制劑選擇性分布于要觀察物的結(jié)構(gòu)中和/或通過選擇施用方法 達到上述目的，所選擇的施用方法促進特定結(jié)構(gòu)或系統(tǒng)的圖像的改進。例 如，心血管系統(tǒng)的圖像改進能夠通過靜脈輸注有較長血漿半衰期的多硝基 氧化合物大分子得到，并且最好是靜脈注射低分子量膜通透性硝基氧化合 物。另一種方法，即可通過口服給予這些化合物的一種來改進胃腸道的圖 像。同樣，通過局部施用懸浮在穩(wěn)定載體中的多硝基氧化合物大分子并結(jié) 合口服或靜脈注射額外的硝基氧化合物獲得皮膚不連續(xù)區(qū)域的圖像的改 進。另外，按照本發(fā)明多基于硝基氧化合物的組合物根據(jù)應用情況，能用 作皮膚給藥。

????????????????????實施例九--輻射防護

活的有機體暴露在電離輻射下受到的有害作用能在高劑量輻射下致 死，最近的證據(jù)表明輻射通過破壞DNA引起細胞損傷。在DNA總的破壞 中，輻射誘導的水源自由基和其次的碳類自由基造成的傷害高達80％。國 防部已篩選了40,000氨基硫醇化合物尋找體內(nèi)輻射防護因子。雖然藥劑 (WR-2721)顯示了選擇性輻射防護效果，WR-2721在人的臨床實驗中 卻不能展示出輻射防護作用。硝基氧化合物(即TPL)是非-硫醇輻射防護 劑，但正如本文所述，(?PTL)在體內(nèi)的半衰期很短。其他化合物是天然 來源的大分子化合物(超氧化物歧化酶，白細胞介素-1，和GM-CSF)。 然而，由于它們的分子-大小，其中每一種提供細胞內(nèi)自由基清除能力都是 有限的。

國立癌癥研究院試圖用硝基氧化合物的化合物Tempol作為輻射防護 劑以便使癌癥病人能接受高劑量水平的輻射治療。研究人員們很快發(fā)現(xiàn)小 分子量硝基氧化合物很快還原成無活性的形式并且沒有安全的給藥劑量。

基于本文公開的發(fā)明，結(jié)合到大分子化合物起酶模擬物作用的硝基氧 化合物能夠與低分子量硝基氧化合物一起使用通過與在細胞內(nèi)為自由基解 毒的膜通透性硝基氧化合物化合物相互作用使血管腔中的氧自由基解毒。 按照本發(fā)明延長輻射防護作用的期限，使得可以用硝基氧化合物化合物防 止醫(yī)學應用如癌癥治療和偶然性受到有害輻射源照射中的受控輻射的有害 作用。

根據(jù)國立癌癥研究院開發(fā)的輻射劑量表，將中國倉鼠細胞培養(yǎng)在防輻 射化學藥劑存在下暴露在電離輻射下。圖16顯示中國倉鼠細胞V79在 12Gray照射下的存活率。實驗對照是結(jié)合硝基氧化合物大分子(PNA)， 和還原型硝基氧化合物(TPHHH)表現(xiàn)類似的存活率。然而，TPH預先 與PNA混合導致轉(zhuǎn)化成輻射防護劑TPL(見圖17)后者促進V79細胞的 存活(見圖16)。

低分子量膜通透性硝基氧化合物，即TPL已證明在C3H小鼠中能提供 體內(nèi)的輻射防護作用。在這些研究中，發(fā)現(xiàn)最大TPL腹膜內(nèi)給藥耐受劑量 是275毫克/公斤。從而導致注射后全血5-10分鐘內(nèi)，TPL最高水平是 (～150微克/毫升)。小鼠在無或有TPL(275毫克/公斤)存在下給藥后 接受全身輻射5-10分鐘。30天內(nèi)使50％的TPL處理的小鼠死亡的輻射劑 量是9.97Gray，而對照小鼠相應的劑量是7.84Gray。

因為TPL的防輻射作用來自未配對電子，當TPL由于失去未配對電子 而被還原成羥胺時，便成為無活性的。按照本發(fā)明，有效的防輻射劑在體 內(nèi)以其活性狀態(tài)保持TPL的治療濃度，同時又能克服當單獨使用時，需要 較高來維持治療水平卻具有毒性。

圖19顯示腹膜內(nèi)注射給藥275毫克/公斤的TPL后(◇)，2mM?TPL單 獨靜脈內(nèi)給藥后(□)和100毫克/公斤TPH+1毫升PNA(○)后，TPL 的最大血漿水平。結(jié)果顯示TPL最大血漿水平大約是PNA存在下(0.5毫 升/小鼠在白蛋白濃度為20g/dl并且每摩爾白蛋白有42摩爾TPL時)腹膜 內(nèi)注射約100毫克/公斤TEMPOL后所觀察到的1/4。因此，TPL血漿水 平在PNA存在下增加了10倍以上。TPL血漿水平的增加影響細胞內(nèi)的 TPL水平對細胞和細胞核水平的輻射防護是有作用的。

這種增強防護作用由基于小鼠的30天存活實驗的全身輻射得到證 明。圖20顯示通過在TPL濃度(200毫克/公斤)存在下加入PNA對輻射 防護作用的促進。

結(jié)果顯示PNA存在時的TPL有較強的輻射防護效果。十個小鼠中的 八個(80％)在10Gray致死劑量照射下存活，而相比之下TPL單獨使用 時十個小鼠存活一個(10％)。在對照實驗中，沒有TPL或只有PNA， 全部小鼠在15天或前后死亡。因此，膜不通透性PNA表現(xiàn)為無輻射防護 作用并且不能防止細胞內(nèi)水平上的輻射損傷。

參考圖21，實驗數(shù)據(jù)顯示PNA能在TPL中還原達到類似的輻射防護 效果。在這個實驗中，當單獨使用PNA(0.5毫升/小鼠)時，全部小鼠在 15天時死亡。圖20中使用了四分之一的TPL，TPL濃度從200毫克/公斤 降低到50毫克/公斤，PNA的存在保護了十分之二的小鼠免于致死性輻射 (10Gray)。這些結(jié)果證明PNA可用于減少TPL劑量四分之一達到同樣 良好的輻射防護作用。

由于能夠提供系統(tǒng)的或生理的局部防輻射效果，使用本發(fā)明制劑對保 護接受輻射治療的病人有特殊的好處。例如，膜通透性硝基氧化合物的全 身或局部給藥?？膳c多硝基氧化合物白蛋白在輻射流進入身體的部位局部 給藥結(jié)合使用。

在一項具體應用中，含多硝基氧化合物白蛋白的局部用藥膏用于接受 頭蓋腫瘤治療的病人頭皮。此外，膜通透性硝基氧化合物目前通過適當?shù)?方法給藥，包括諸如局部藥膏懸浮法。當輻射劑量被應用時，皮膚和發(fā)囊 將受到保護免受氧載體代謝相關的十分有害的減輕氧化應力過程。這種來 自于含硝基氧化合物化合物的生物學作用，包括當按本發(fā)明體內(nèi)給藥時防 止活性氧化物的細胞毒性的功能在內(nèi)，起到額外的復合抗氧化劑酶模擬物 活生。

如上所述，當靜脈注射時，TEMPOL已經(jīng)顯示出具有很短的半衰期。 由于其分子大小和電荷特點，它容易離開血管腔。在許多醫(yī)學應用中，在 血管腔中保持酶模擬物作用是理想的。按照本發(fā)明這可通過將硝基氧化合 物結(jié)合到大分子上如血紅蛋白和白蛋白來實現(xiàn)結(jié)合物在生物學上是安全的 并有理想的半衰期，

膜通透性硝基氧化合物如TPL在游離自由基狀態(tài)時在體內(nèi)和體外表現(xiàn) 出具有酶模擬物活性。然而，在體內(nèi)，主要在細胞內(nèi)，它通過生物還原藥 劑如NADH迅速還原成無活性的羥胺衍生物(TPH)。先前，這種活性 TPL還原成無活性的TPH反應基本上是化學計量學上不可逆的。因此它的 作為治療和診斷工具的作用受到限制。

按照本發(fā)明，多組分含硝基氧化合物制劑作為第一成分都有膜通透性 硝基氧化合物，后者存在于TPL(活性)和TPH(無活性)動力學平衡之 間。

在體內(nèi)，無活性TPH占主導(＞90％)。兩種物質(zhì)(TPL和TPH)都 易于穿過細胞膜并分布于細胞內(nèi)外空間。

第二成分是可透膜的，分布于細胞外空間的大分子多硝基氧化合物主 要分布于血管腔。第一和第二成分表現(xiàn)出另一種先前未知的體內(nèi)酶模擬物 功能，即合成還原型硝基氧化合物氧化酶功能。例如，本文描述的多硝基 氧化合物白蛋白作為多組分系統(tǒng)的一部分通過自旋電子傳遞反應氧化TPH 和TPL，起還原型硝基氧化合物氧化酶的作用。因此，大分子多硝基氧化 合物白蛋白起酶模擬物的作用，轉(zhuǎn)變TPL/TPH平衡使細胞內(nèi)外空間的TPL 達到約90％。這種酶模擬物功能對在必要的水平上防輻射，局部缺血等所 必須的高劑量TPL是特別有用的，這些輻射和局部缺血通過占絕對優(yōu)勢的 氧化還原反應對細胞產(chǎn)生毒性。

例如，在一定劑量的γ射線照射下，當照射劑量升高時，提供有射線 防護效應的小分子量膜通透性硝基氧化合物所必要的量可能變的很大以至 于細胞的氧化還原狀態(tài)處于崩潰而導致毒性。

為克服毒性障礙，本發(fā)明多組分系統(tǒng)再生還原型TPH成TPL。這個系 統(tǒng)可用于在體內(nèi)需要活性硝基氧化合物的任何應用。

TPL，TPH和多硝基氧化合物白蛋白的EPR波譜在圖15A，15B和15C 中分別給出。還原型硝基氧化合物氧化酶活性的證明是通過TPH(不活動 EPR圖15B)再氧化成大分子多硝基氧化合物(圖15C)并將其轉(zhuǎn)換成 TPL(活動EPR)(圖15A)，反應進行如下：(1)等摩爾比的TPH 對大分子多硝基氧化合物在室溫下溫浴30分鐘；(2)反應混合物離心通 過10kd截止的濾膜；(3)記錄濾物的EPR波譜如圖15B。TPH到TPL 的轉(zhuǎn)化量在圖17中給出。

合成的還原型氧化酶(多硝基氧化合物白蛋白)的制備方法是讓人血 清白蛋白(HAS，25％Baxter?Healthcare)與40摩爾當量的4-(2-溴乙酰 氨基)-TEMPO或Br-TEMPO在60℃下混合反應10小時。得到的混合物 含15毫升HAS和165毫克或Br-TEMPO在真空容器管中，將此化合物用 0.22微量濾器除菌并轉(zhuǎn)移到150毫升配有10kd截止濾膜的攪拌池中 (Filtron?Technology?Corp.)。濾得的反應混合物用Ringers液洗直到ESR 波譜檢測到的濾得物中游離TEMPO含量小于1微摩爾。得到的亮橙黃色 物濃縮到含HSA25％，再用0.22微量濾器除菌過濾進入10毫升試管并在 4℃下儲存直到使用。為證明體內(nèi)TPH向TPL的酶樣轉(zhuǎn)換，將TPL的15N 穩(wěn)定同位素類似物注射進入插管小鼠的尾靜脈并直接檢測尾部的EPR信 號。直接給麻醉的小鼠靜脈注射0.5毫升TPL(40mM)溶液證明TPL的 血漿半衰期大約是2分鐘。參考圖18，用含有大分子多硝基氧化合物和穩(wěn) 定同位素15N?TPL的混合物繼續(xù)注射(～30分鐘后)，出現(xiàn)15N?TPL的峰強 度的雙相變化。一開始，15N?TPL信號強度的降低是由于TPL擴散到血管 外。接著進行其細胞內(nèi)的還原反應。擴散速率最初比TPH再氧化成TPL 的反應速率快，由于圖18中的15N?TPL信號強度再現(xiàn)較慢。雖然TPH再 氧化成TPL的反應比初始擴散/還原速率慢，它比TPL的穩(wěn)定狀態(tài)細胞內(nèi) 還原反應速率要快。因此，圖18顯示的TPL信號的再現(xiàn)測定了TPH再氧 化成TPL，由此證明了合成產(chǎn)生的還原型硝基氧化合物氧化酶在小鼠體內(nèi) 的活性。見圖18B-18D。

??實施例十一--局部缺血與重灌注損傷一中風中的腦血管局部缺血

如上所述，含硝基氧化合物化合物可應用于醫(yī)學成像。一種特別應用 是獲得心臟或其他地方的局部缺血組織的圖像等，因為有關氧代謝的有價 值的信息和在通透損傷的有價值的信息都可獲得。然而，游離硝基氧化合 物在體內(nèi)的迅速還原限制了游離硝基氧化合物在這方面的應用。然而按照 本發(fā)明，有可能改進專門解決對心臟局部缺血組織的成像能力，檢測心肌 局部缺血的發(fā)展情況，研究心肌重灌注相的發(fā)展情況，和觀察組織或器官 的實時乏氧狀態(tài)。參考圖22，23和25，表現(xiàn)了分離大鼠心臟灌注15N TEMPOL和多硝基氧化合物白蛋白后的ERI圖像

在圖24中，EPR信號的強度表現(xiàn)為局部缺血期間的一個函數(shù)。在下 側(cè)的曲線中，2mM?TEMPOL灌注到局部缺血心臟中。上部曲線描繪出 2mM?TEMPOL與多硝基氧化合物白蛋白(4g/dl白蛋白，每摩爾白蛋白對 42摩爾TEMPOL)一起使用時的初始強度。此數(shù)據(jù)證明當使用本發(fā)明制 劑時此信號強度明顯增大并能夠保持住。圖25顯示局部缺血組織的三維空 間圖像的成像變化。圖像連續(xù)描繪大約125分鐘期間內(nèi)的局部缺血情況。

除了證明診斷用途外，多硝基氧化合物白蛋白和TEMPOL結(jié)合使用保 護心臟免受局部缺血性重灌注損傷。圖26顯示硝基氧化合物本身與PNA 結(jié)合使用時不影響冠狀血流的恢復。然而，圖27顯示在30分鐘的局部缺 血繼之以45分鐘的血液流動之后RPP(調(diào)血壓藥物)的明顯改善恢復情 況的作用只有在兩者都存在時才能觀察到。而且，由局部缺血/重灌注損傷 造成的心臟水腫得以預防。

參考圖28，局部缺血心臟的各種解剖區(qū)域中的15N-TPL濃度在100 分鐘的局部缺血期間上升。TPL組織濃度的上升可歸因于PNA對心臟功 能的保護(圖27)。

為證明PNA保護大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受局部缺血/重灌注損傷(如 上所述)，將3月齡的CD-1小鼠，體重35-40克，用1.5％異熒烷在連續(xù) 30％氧/70％硝基氧化合物流下進行麻醉。此動物經(jīng)中度腦動脈閉合術并用 Yang等人的方法重灌注(Stroke?25：165-170，1994)伴隨IPSI側(cè)頸總動脈閉 合術(CCA)。在臨MCA閉合術一小時前(局部缺血前)或局部缺血后 重灌注剛結(jié)束后(重灌注后)靜脈注射PNA或人血清白蛋白對照溶液。靜 脈注射劑量是體重，v/w)的0.5％。手術期間體溫保持在36.5-37.5℃。 檢測四個動物的平均動脈壓和血氣以保證對照組的可靠性。

重灌注24小時后，將動物解剖做神經(jīng)學缺陷評估，方法如Bederson 等人所介紹(Stroke?17：472-476，1986)。神經(jīng)學缺陷按下述等級評分：0+ 無可見缺陷，1+不能伸展右前足，2+向右轉(zhuǎn)圈，3+向右傾斜，4+不能自 主行走。神經(jīng)學評估后，為評估血管梗塞，在腦前端每隔0.5毫米作冠狀 切面并用甲酚紫染色。梗塞體積按梗塞大小的加和計算(在連續(xù)切面中以 平方毫米計算計量)。

參考圖30，或在局部缺血發(fā)病前或在剛剛重灌注后用PNA-處理明顯 降低了重灌注后24小時檢測到的神經(jīng)學缺陷(n＝7)?，F(xiàn)在參考圖31， 在大腦局部缺血前或剛剛重灌注后用PNA處理明顯降低重灌注后24小時 檢測到的梗塞體積。在局部缺血發(fā)病前處理動物，PNA處理的動物梗塞體 積是6.956立方毫米±4.910，而對照組動物是62.636立方毫米±12.372。

圖32和32A分別顯示梗塞值的百分數(shù)和梗塞面積的百分數(shù)，它們是 從梗塞體積和IPSI側(cè)半球體積計算得到。在局部缺血前PNA處理的動物 中，梗塞值百分數(shù)是5.148％±3.237，其對照組則是42.462％±5.001。重灌注 后立刻處理的動物中，用PNA處理的動物的這些數(shù)值是9.210％±4.080， 其對照組數(shù)值是37.782％±8.030(均值±SEM，N+7)。圖33顯示在局部缺 血前或剛剛重灌注后用PNA處理明顯降低重灌注后24小時測量的腦半球 腫大。局部缺血前處理的動物顯示基本沒有腫大現(xiàn)象(0.094％±0.094)，而 其對照組顯示13.916％±3.491腫大現(xiàn)象。在重灌注開始時PNA處理的動物 顯示3.056％±2.053腫大，而其對照組數(shù)值是22.994％±8.562。

圖30-33顯示局部腦局部缺血前或剛剛重灌注后用PNA處理從統(tǒng)計學 意義上得到防止神經(jīng)學缺陷所檢測到的中風損傷，梗塞體積，梗塞百分數(shù)， 和腦半球腫大。正如所能看到的，神經(jīng)學缺陷評分與大腦水腫和血管梗塞 的組織學測量有密切關系。

為確定與其他化合物相比PNA所提供的保護作用相對水平，即功能上 減輕血管腔中的自由基級聯(lián)反應，進行一項研究來比較PNA在正常小鼠中 產(chǎn)生的保護作用和超表達SOD在SOD-1Tg小鼠中嚴生的高水平保護作 用。Chan，P.H.，C.J.Epstein，H.Kinouchi，H.Kamii，G.Yang，S.F.Chen，J Gafni?and?E.Carlson(1994)。SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究中風和腦損傷的 神經(jīng)保護模型。Ann.N.Y.Acad.Sci..738：93-103。Chan，P.H.，C.J.Epstein. H.Kinouchi，S.Imaizumi，E.Carlson，and?S.F.Chen(1993)。在局部缺血性腦 損害中超氧化物歧化酶的作用：減小轉(zhuǎn)基因小鼠繼局部腦局部缺血后的腦 水腫和血管梗塞。在Molecular?Mechanisms?of?Ischemic?Brain?Damage，K. Kogure?and?B.K.Siesjo，eds.Amsterdam：Elsevier.pp.97-104.Konouchi，H.， C.J.Epstein，T.Mizui，E.Carlson，S.F.Chen?and?P.H.Chan(1991)。超表達 CuZn超氧化物歧化酶弱化轉(zhuǎn)基因小鼠中的局部腦局部缺血損傷。Proc. Natl.Acad.Sci.USA?88：11158-11162.Imaizumi，S，V.Woolworth，and?R.A Fishman(1990)。脂質(zhì)體包裹的超氧化物歧化酶減少大鼠大腦局部缺血中的 腦梗塞。Stroke?211312-1317.Liu，T.H.，J.S.Beckman，B?A.Freeman，E.L. Hogan，and?C.Y?Hsu(1989)。聚乙二醇調(diào)節(jié)的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶 減少局部缺血性腦損傷。Am.J.Physiol.256：H586-H593.Chan，P.H.，S Longar，and?R.A.Fishman(1987)。脂質(zhì)體包裹的超氧化物歧化酶對損傷后大 腦水腫的預防作用。Ann.Neurol.21：540-547.1％體重v/w(20克小鼠200 微升)的PNA靜脈注射給麻醉小鼠。十分鐘后，用尼龍線縫合中冠狀動脈 (MCA)。局部缺血一小時后重灌注，重灌注24小時后評價動物的神經(jīng)功 能并解剖和進行血管梗塞和腦水腫的組織學測定。參考圖34A和34B，取 對照組和處理組小鼠的代表性腦冠狀切片用甲苯紫染色這種染料染正常組 織，局部缺血損害的區(qū)域不吸收染料。對照組大腦顯示受累腦半球的大量 局部缺血損傷，并且與同腦對側(cè)腦半球比較顯示出大量腦水腫。相反處理 過的小鼠受累大腦半球是正常的并與對側(cè)腦半球大小，形狀和染色密度均 一致。圖34C顯示的連續(xù)切片表明局部缺血損傷邊布于代表對照組動物大 腦，而代表性對照組動物的大腦顯示正常。在對照組動物與PNA處理組動 物的梗塞區(qū)在圖32A給出定量表示，表明PNA處理為防止動物模型的血 管梗塞提供了基本完整的保護。下表總結(jié)了處理小鼠的神經(jīng)缺陷，梗塞百 分比(由連續(xù)切片的梗塞面積計算出)和腦半球腫大的減少。因此灌注PNA 提供的保護作用要比轉(zhuǎn)基因SOD超表達的三倍劑量效果還強。 ??????????????????抗小鼠中風損傷的保護作用 ??????對照 ?????????PNA ????神經(jīng)學缺陷評分1 ???????5.5 ?????????2.0 ????????梗塞％2 ???58.0±9.4 ??????1.9±1.9 ??????腦半球腫大％2 ???24.1±6.2 ??????1.7±0.9 ????在一小時的腦局部缺血發(fā)病前和在重灌注發(fā)病前10分鐘給PNA(1 ％體重v/w，200微升/20克小鼠)。評估動物的神經(jīng)學功能并重灌注 24小時后解剖動物供組織學觀察。 ????1神經(jīng)學缺陷用缺陷等級表示分成四組：PNA組表現(xiàn)為缺陷明顯減 少(p＜0.005，Mann-Whitney測驗)。 ????2存活24小時的動物的梗塞百分比和腦半球腫大百分比用均值 ±S.E.M.表示；PNA組表現(xiàn)為明顯減小 ????p＜0.05，Student’st-測驗。

在經(jīng)過肺心旁路手術和其他由栓塞和/或高血壓引起的手術中局部缺 血性損傷伴隨緊接其后的重灌注損傷的重大發(fā)病率的例證也在不斷增加。 主要侵犯的器官是腦，心臟和腎。

作為近乎有效的中風調(diào)整方面的預防性治療模型，PNA施用于MCA 閉合術前和重灌注后的小鼠。因為單獨使用白蛋白可為腦局部缺血提供一 定的防護作用。取HAS和生理鹽水作為PNA實驗的對照。參考圖35和36， 圖35顯示用生理鹽水處理的大鼠有大量損傷，而圖36的PNA處理的大鼠 大致上看不出梗塞現(xiàn)象。組織學分析顯示(圖37A和37B)生理鹽水處理 的大鼠梗塞體積的平均值是192±17立方毫米。用白蛋白處理得到小得多的 梗塞平均值，81±26立方毫米。而用PNA處理得到得數(shù)值比單獨使用白蛋 白減小兩倍，其平均值是18±223(p＜0.05vs白蛋白，p＜0.01vs.生理鹽水)。

在大鼠MCAO模型中與組織學分析相對應的，磁共振成像研究表明當 MCA閉合開始的時候，PNA減慢大腦局部缺血期間的影響擴散成像的高 強度顯影過程(圖39)。此外，PNA提供的對再擴散性損傷的防護表現(xiàn) 為DWI高強度于重灌注后迅速消失。

除了本文證明的小鼠大腦局部缺血的防護作用外，本發(fā)明化合物已經(jīng) 顯示出在大鼠中風模型中的功效。

參考圖35a和35b，用通常的生理鹽水處理的大鼠大腦代表性冠狀切 面(圖35)和用PNA處理的大鼠(圖36)大腦的冠狀切面顯示在生理鹽 水實驗組有明顯的組織壞死，而PNA處理的實驗組幾乎沒有組織壞死。給 大鼠實施2小時的MCA縫合閉塞術然后，進行22小時的重灌注。按總劑 量為體重的1％(v/w)給VI組用藥或用生理鹽水，分為1/2總劑量在MCA 閉合術前5分鐘給藥：1/4總劑量在除掉縫線允許MCA重灌注前5分鐘給 藥；和最后1/4總劑量于重灌注后2小時給藥。腦切片用TTC染色。

參考圖37A和37B，經(jīng)受短暫MCA閉合和生理鹽水、人血清白蛋白 (按25g/dl溶液，總劑量為體重的1％)、或PNA處理的大鼠其梗塞百分 比和梗塞體積的組織學分析顯示了對大腦組織的抗局部缺血/重灌注損傷 的防護作用。用PNA處理的動物顯示大約2±3％的梗塞；用白蛋白處理的 動物顯示11±4％的梗塞；用生理鹽水處理的動物顯示22±4％的梗塞。單獨 使用白蛋白產(chǎn)生的保護效應大約是使用PNA得到的效應的50％，這個事實 說明了中風治療中血漿膨脹的潛在作用。因此，高滲生理鹽水中的PNA可 進一步促進其對中風的治療作用。白蛋白在本實驗中給予基本的防護作 用，這個事實說明血漿膨脹對中風治療有潛在的益處。PNA的保護作用大 約是白蛋白的兩倍說明多硝基氧化合物化合物可增加高滲或 HYPERONCOTIC治療中風的效果。

參考圖38，由于在體內(nèi)缺少大量的天然產(chǎn)生的順磁性物質(zhì)，結(jié)合PNA 的活性硝基氧化合物濃度可通過體內(nèi)EPR波譜檢測。在這個實驗中，用 PE50聚乙烯管法給大鼠實行股動靜脈分流術。管的一部分放置于EPR波 譜儀腔中，使得可以測量流經(jīng)分流處的血液自旋電子密度。通過對側(cè)股靜 脈導液管注入PNA，取隨PNA注入后時間為函數(shù)測量血液自旋電子密度。 與標準曲線(未顯示)作對照表明每間隔2小時注入3次PNA的EPR信 號的血液中水平保持在1-6mM硝基氧化合物范圍達5小時。

參考圖39，擴散影響的磁共振成像(DWI)已給出表示水的表觀擴 散系數(shù)(ADC)。中風時，DWI超強度被認為是局部缺血期間大腦損傷 過程的實際時間標志。擴散影響的成像(PWI)在本實驗用于確定MCA 的閉合和重灌注(圖像未給出)。此圖顯示在大鼠的MCA閉合1.5小時時 期前，中和后的DWI圖像，每一行表現(xiàn)同一大腦的三個階段的圖像。A 行表示MCA閉合前沒有DWI超強度。B行表示MCA閉合后30分鐘， DWI超強度開始出現(xiàn)并在MCA閉合后1小時被清楚的確定(C行)。作 為比較，在對照圖像中(未給出)明顯的DWI圖像典型的表現(xiàn)在5-10分 鐘MCA閉合期間。因此，在在局部缺血出現(xiàn)前，PNA能夠顯著減慢大腦 局部缺血損傷的進程。D行顯示重灌注后8分鐘產(chǎn)生的圖像；DWI圖像 已經(jīng)基本消失，表明發(fā)生在局部缺血期間的ADC變化在PNA存在下重灌 注時迅速消失。作為比較，典型的對照圖像顯示重灌注后DWI圖像的過 程，反映了重灌注損傷。E行和F行分別表現(xiàn)重灌注后1小時和2小時產(chǎn) 生的圖像，確定了沒有DWI圖像存在。此實驗動物在MCA閉合后24小 時進行解剖，從組織學上發(fā)現(xiàn)在基神經(jīng)節(jié)處有小的梗塞，在皮質(zhì)層沒有梗 塞現(xiàn)象。

????實施例十二--基于血紅蛋白的紅細胞替代物(HRCS)

????????????的血管舒張和對血管無作用制劑

圖13顯示本發(fā)明的基于血紅蛋白的氧載體(HBOC)，特別是 DBBF-Hb的血管收縮作用。這種血管收縮作用在清醒大鼠中經(jīng)過測量灌注 10％v/v的最高承載此溶液的平均動脈壓(MAP)的增加而得到證明。參 考圖13，虛線表明HBOC灌注后作為時間函數(shù)的平均動脈壓。按照本發(fā) 明，同樣的PNA和TPL溶液用作輻射防護，ERI和局部缺血/重灌注損傷 防護表現(xiàn)在具有廣泛的酶模擬物作用和輻射解毒功能。PNA或TPL當亙 獨與HBOC一起注射時發(fā)現(xiàn)沒有抗高血壓作用。而且，PNA(5g/dl)或 TPL(100mM)單獨使用，10％v/v最高承載時清醒大鼠中不產(chǎn)生明顯的 血管舒張作用。然而，PNA(5％/dl)/TPL(100mM)10％最高承載時， 觀察到了產(chǎn)生的明顯和持久的血管舒張作用(圖29)。這個血管舒張作用 與這些大鼠的持久的TPL水平相吻合(圖14)。在沒有PNA時，這些大 鼠的TPL血漿半衰期小于60秒。因此，通過混合等體積的PNA(5g/dl) /100mMTPL與DBBF-Hb7.8g/dl并且這些大鼠中的最高負載為20％v/v，得 到對血管無作用HRCS組合物(圖13)。在圖29中觀察到的低血壓作用 與血管平滑肌的TPL持續(xù)上升相吻合，后者防止硝基氧化合物的分解(即 由超氧化物產(chǎn)生的內(nèi)皮系統(tǒng)來源的舒張因子(EDRF))，由此促進血管舒張 和降低大鼠中的MAP(圖29)。在對血管無作用HRCS組合物中(圖13)， HBOC和PNA/TPL的血管收縮活性與血管舒張活性在體內(nèi)的硝基氧化合物 上發(fā)生的作用相互抵消。因此，HRCS的這個組合物是目前臨床HBOC開 發(fā)方面的一個明顯的促進，它基于對自由基和氧化應力的全面防護。

????????????????實施例十三--脂類氧化作用的抑制

脂類氧化作用牽涉到重灌注損傷和動脈粥樣硬化以及大腦和中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的組織損傷。本發(fā)明的硝基氧化合物標記的大分子證明能減輕脂質(zhì)氧 化。

從健康，不吸煙男性采集大約60毫升肝素化血液。EDTA(1毫克/ 毫升)-抗凝靜脈血經(jīng)4℃2000g離心20分鐘后制備血漿LDL。在柔和燈 光下的冰上做血液，血漿和LDL實驗以抑制LDL抗氧化劑的光氧化作用。 從血漿中通過速度區(qū)帶密度梯度超離心的方法分離LDL。加入5克KBr到10毫升的血漿中使血漿密度上升到1.3克/毫升。在TIPPER上輕輕混合 10到15分鐘使KBr溶于血漿。每份KBr血漿樣品在23毫升冰凍0.9％NaCl覆蓋下在EasySeal同質(zhì)異晶聚合物超離心管中分層。密封離心管在 50,000rpm(302,000g)4℃下離心3小時。離心后，用針穿透管底將密 度梯度分段，將Fluorinert以5毫升/分鐘的速率泵入管中。從管的頂部收 集各組分分流到組分收集器中。棄去第一個12毫升的成分含有極低密度脂 蛋白。收集隨后1.2毫升的六個組分的每個組分。暗黃色的LDL峰值一般 是在第四個組分。收集LDL峰值組分和其后的一個組分以及其前的兩個組 分到一起。瓊脂糖凝膠電泳得到一條β-遷移帶即LDL，這表明LDL沒有受 到其他脂蛋白的污染。用前LDL樣品在6升HBSS緩沖液中透析三次。分 離到的脂蛋白樣品存放在暗處冰上。LDL含量由Peterson-Lowry法測定， 以牛血清白蛋白為標準。

脂質(zhì)氧化用氯高鐵血紅素和過氧化氫氧化LDL進行測定。將200微克 /毫升LDL加入到含有5微摩爾氯高鐵血紅素和50微摩爾過氧化氫的小杯 中。最終檢測體積是2到3毫升在HBSS緩沖液中，pH7.4。檢測從加入 過氧化氫開始。在一些實驗中，PNA加TPL用HBSS以1∶100，1∶ 1000和1∶10,000稀釋。在每個時間點，除去樣品并檢測丙二酰硫脲還原 物(TBARS)的測量值。這通過加入樣品到500微升的丙二酰硫脲藥劑 中后者包括丙二酰硫脲，三氯乙酸和蒸餾水，加入終濃度為0.1毫克/毫升 的丁基羥甲苯的DSMO溶液以抑制在隨后的加熱步驟中TBARS的自發(fā)形 成。在100℃加熱15分鐘，使樣品在室溫冷卻并以10,000g離心10分鐘。 透明上清液用分光光度法在532nm消光系數(shù)1.56x105摩爾/升-1厘米-1進行 分析，結(jié)果表示為每毫克LDL蛋白微微摩爾TBARS。圖35a-35b表示與 高鐵血紅素過氧化氫有關的LDL脂蛋白氧化的時間過程。在這四個分開的 實驗中，PNA存在下并以1∶100，1∶1,000，1∶10,000的比例加入 TPL的情況下LDL的氧化時間受到有力的制約。在一兩個實驗中光密度的 增加反映了TBARS的形成由于以1∶100和1∶10,000的比例在PNA中 加入TPL而被阻斷。

????????????????實施例十四--白細胞激活的抑制

白細胞與內(nèi)皮細胞和血小板的相互作用是反映一些不良生理學病癥的 微循環(huán)指標，范圍包括從局部和全身局部缺血/重灌注損傷，器官移植的排 異反應和對有機體的應答反應到各種發(fā)生氧化反應的新物質(zhì)。見Lehr?et?aI.， PNAS，791：7688(1984年6月)。反應性氧物質(zhì)的調(diào)節(jié)因子作用已在許多體 內(nèi)和體外模型中被引用，結(jié)果抗氧化劑和自由基清除劑被用于抗白細胞活 化、聚集和向內(nèi)皮細胞附著以及隨后發(fā)生的微循環(huán)功能障礙。用Syrian Golden倉鼠背側(cè)皮皺室模型研究兩種不同的硝基氧化合物載體對吸煙誘 導的白細胞轉(zhuǎn)動和附著到小動脈和小靜脈的內(nèi)皮細胞上的抑制作用，以及 對白細胞/血小板在血流中聚集形成的抑制作用(Lehr?et?al.，PNAS?91：7688， 1994)證明了HBOC(DBBF-交聯(lián)血紅蛋白)與生理鹽水處理的對照相比 對白細胞活化沒有作用。然而，多硝?；疕BOC基本上完全抑制白細胞活 化，已知白蛋白提共一定的保護作用，如下表所見到的那樣，在劑量達到 一定水平它抑制白細胞活化。然而，這個表顯示PNA也有抑制活化作用， 并且此表顯示的HBOC和多硝?；?HBOC的實驗結(jié)果預示PNA的防護作 用比低蛋白質(zhì)濃度的白蛋白要好。如上所述，多硝?；椎鞍缀投嘞貂；?， 穩(wěn)定化基于血紅蛋白的氧載體有效的防止了有害的白細胞與內(nèi)皮細胞和血 小板的相互作用，正如下表中表示的那樣。 時間點 基線 15分鐘 60分鐘 A人血清白蛋白，2g/dl 小動脈轉(zhuǎn)動(/毫米) 0.0 0.1±0.2 0.1±0.2 小動脈粘連(/平方毫米) 0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 小靜脈轉(zhuǎn)動(％) 4.9±0.2 5.5±0.9 6.9±2.1 小靜脈粘連(/平方毫米) 0.0±+0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 聚集形成(/30秒) 0.6±O.7 0.7±0.7 1.3±1.1 B多硝酰化白蛋白 小動脈轉(zhuǎn)動(/毫米) 0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 小動脈粘連(/平方毫米) 0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 小靜脈轉(zhuǎn)動(％) 5.2±0.8 5.8±0.8 6.3±1.8 小靜脈粘連(/平方毫米) 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0+0.0 聚集形成(/30秒) 0.4±0.5 0.9±0.7 1.2±0.8 C基于血紅蛋白的氧載體 (HBOC)，HBBF-Hb 小動脈轉(zhuǎn)動(/毫米) 0.3 1.9±2.0 3.8±2.9 小動脈粘連(/平方毫米) 0.0 31.9±26.4 42.0±32.1 小靜脈轉(zhuǎn)動(％) 5.8±1.2 7.9±2.8 9.2±3.8 小靜脈粘連(/平方毫米) 0.0+0.0 66.0±43.2 101.5±76.9 聚集形成(/30秒) 0.3±0.5 3.0±1.7 4.5±2.6 D多硝酰化基于血紅蛋白的氧 載體 小動脈轉(zhuǎn)動(/毫米) 0.0 0.2±0.3 0.1±0.3 小動脈粘連(/平方毫米) 0.0 0.0±0.0 1.3±2.5 小靜脈轉(zhuǎn)動(％) 5.0±O.2 6.7±1.0 6.3±1.2 小靜脈粘連(/平方毫米) 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 聚集形成(/30秒) 0.2±0.2 1.9±0.2 1.4±0.3 E等容常規(guī)生理鹽水(對照) 小動脈轉(zhuǎn)動(/毫米) 0.3±0.2 2.5±2.9 3.3±2.0 小動脈粘連(/平方毫米) 0.0±0.0 36.0±27.6 40.0±32.7 小靜脈轉(zhuǎn)動(％) 4.5±1.3 9.3±1.7 10.3±2.5 小靜脈粘連(/平方毫米) 0.0±0.0 68.O±43.8 90±56.7 聚集形成(/30秒) 0.3±0.3 3.5±0.6 5.1±1.1

????????實施例十五--對皮膚病，特別是牛皮癬的局部應用

大多數(shù)研究針對一些皮膚病的潛在病因，自由基水平上升或有自由基 級聯(lián)反應發(fā)生的部位是在真皮。牛皮癬的情況是多原因的，然而，炎癥過 程的最終起作用因素似乎是超氧化物和其他有毒氧基。具報道皮膚細胞和 白細胞都是引起牛皮癬病理自由基水平的原因。已有報道說牛皮癬病人的 受損和未受累皮膚成纖維細胞都比正常對照組高(分別高150％和100％)。 Er-Raki?A，Charveron?M，and?Bonafe?JL?1993。牛皮癬病人的皮膚成纖維細 胞中超氧化物陰離子生成的增加。Skin?Pharmacol?6：253-258。已有報道說 多形核白細胞(PMNs)能增加牛皮癬區(qū)域的超氧化物生成。Miyachi?Y and?Nima?Y1983。多形核白細胞在牛皮癬區(qū)域氧調(diào)節(jié)生成方面的作用。 Arch.Dermatol.Res.275：23-26。據(jù)報道，牛皮癬病人的PMNs中的SOD 水平顯著低于正常人。Dogan?P，Doyuer?U，and?Tanrikulu?G?1989。牛皮癬 病人的多形核白細胞中超氧化物歧化酶和髓過氧化物酶活性銅水平。Br. J.Dernatol.120：239-244。已有報道，牛皮癬皮膚的超氧化物歧化酶mRNA 和免疫活性酶增高，可能反映補償自由基水平上升的的一種傾向。 Kobayashi?T，Matsumoto?M，Iizuka?H，Suzuki?K，and?Taniguchi?N?1991。牛皮 癬中的超氧化物歧化酶，鱗狀細胞瘤和基底細胞皮膚瘤：免疫組化研究。 Br.J.Dermatol.124：555-559。由于已有報道說自由基清除劑對牛皮癬的實 驗研究提供便利，可遵循自由基解毒藥劑通過防止自由基在牛皮癬損傷部 位的細胞毒性，可阻斷炎癥反應。Haseloff?RF，Boasio?IE，Neffert?H，and Ebert?B.1990。苯甲酸及其衍生物的羥基清除作用和抗牛皮癬活性。Free Radical?Biol.Med.9：111-115。

將體內(nèi)EPR波譜應用于小鼠，可從皮內(nèi)注射PNA和靜脈注射15N-TPL 的藥物動力學分析確定本發(fā)明化合物的作用。

定做的橋式環(huán)形-間隙表面共振儀，即吸收微波橋以1.25GHz(L-波 段)用于小鼠體內(nèi)EPR波譜測定。這個儀器用于測量小鼠身體特定部位的 局部TPL和PNA濃度。麻醉小鼠放在夾板中間使其被固定在環(huán)形-間隙表 面共振儀上，吸收微波橋按仰臥姿勢放置以測量腦后的波譜或按伏臥姿勢 放置以測量腹部波譜。尾靜脈插管用于靜脈輸注15N-TEMPOL；此注射部 位要遠離共振儀。

圖40A顯示皮內(nèi)注射PNA的EPR波譜(100微升10g/dlPNA溶液)， 測定動物背部注射部位。

圖40B顯示PNA皮內(nèi)注射和15N-TPL靜脈注射的混合物波譜，測量動 物背部的皮內(nèi)PNA注射部位。寬闊，不對稱中間峰只反映PNA濃度，而 左側(cè)的尖銳低場強峰只反映15N-TPL濃度。經(jīng)尾靜脈注射15N-TPL后1分 鐘，得到此波譜。15N-TPL劑量是15N-TPL儲液重量的1％(20毫克/毫升 或～115mM，在Ringer’s液中)，使血液濃度達到約1.15mM。為調(diào)整15N-TPL 信號，圖40B以大約為圖40B使用的儀器增益的1/5做記錄。圖40C顯示 在尾靜脈注射15N-TPL后30分鐘時產(chǎn)生的EPR波譜。這個特殊的15N-TPL 和PNA峰保持清楚可辯。

PNA皮內(nèi)注射部位的15N-TPL藥物動力學在圖41中給出，以15N-專一 性峰強度對時間作圖。在尾靜脈注射后，15N-TPL信號立刻增強，注射后 不到2分鐘達到最大，然后衰減到穩(wěn)定狀態(tài)水平。假設在整個體內(nèi)水分中 的擴散是完全的，殘留物的穩(wěn)定狀態(tài)水平則相當于15N-TPL初始濃度的 17％。開始衰減反映眾所周知的TPL還原成順磁性的(EPL-無活性形式) TPH。殘留物的15N-TPL信號的持續(xù)是由于15N-TPH被皮內(nèi)注射的PNA再 氧化成15N-TPL。

參照圖42A和42B，為確認皮內(nèi)的PNA再氧化作用，檢測了15N-TPH 的局部藥物動力學，顯示出半衰期為30秒。沒有皮內(nèi)PNA時，15N-TPL 完全轉(zhuǎn)變成15N-TPH。

皮膚內(nèi)存在的15N-TPH通過在腹部皮內(nèi)注射PNA得到證明。皮內(nèi)注射 PNA(100微升，10g/dl)在注射部位再生并保持15N-TPL在局部。15N- TPH的體內(nèi)再還原藥物動力學通過圖42A和圖42B表示出來。皮內(nèi)注射 PNA后A+5分鐘時，15N-TPH再氧化反應基本完成。

????????????????實施例十六--自由基毒性--腎損傷

在橫紋肌溶解動物模型中，注射大劑量甘油進入主要肌肉中引起血紅 素誘導的腎損傷。在以白蛋白為對照的存活實驗中，多硝基氧化合物白蛋 白表現(xiàn)為減少甘油誘導的腎損傷。體重約為275克的雄性Sprague-Dawley 大鼠在經(jīng)過基本肌酸酐測定后脫水過夜(16小時)。次日晨，通過尾靜脈 注射1.25毫升多硝基氧化合物白蛋白和TEMPOL(10g/dl)或白蛋白 (10g/dl)。注射后立刻肌內(nèi)注射甘油(50％水v/v，10毫升/公斤)， 1/2劑量進入前股肌。第-次注射兩小時后，通過尾靜脈再做一次等劑量注 射。參考圖43，在10天內(nèi)檢測存活率和血清肌酸酐。到第十天全部被檢 測大鼠或死亡或顯示復康跡象(血漿肌酸酐下降)。

本文給出的具體實施例是指導性的，不應該解釋為對應用的限制，所 述應用是本領域技術人員能夠用本發(fā)明實現(xiàn)的。本領域技術人員可以進行 改進和其他應用，這些改進和其他應用包括在本發(fā)明的實質(zhì)之中，所述實 質(zhì)是由下面的權利要求的范圍限定的。所有上述引用的參考文獻和出版物 在本文中引入作為參考。