產(chǎn)生和篩選新代謝途徑的方法
專利匯可以提供產(chǎn)生和篩選新代謝途徑的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及用于產(chǎn)生和篩選分子多樣性的新的藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)提供了混合和克隆來(lái)自組合基因表達(dá)文庫(kù)中的多種 生物 的遺傳物質(zhì),產(chǎn)生新的代謝途徑或新類型的化合物的方法。該系統(tǒng)還包括預(yù)篩選或鑒定包含能產(chǎn)生新途徑和化合物的文庫(kù)的宿主生物的方法。該宿主生物可用于對(duì)特定 疾病 的藥物篩選,以及感興趣化合物的商業(yè)生產(chǎn)中。本發(fā)明的方法還可用于保存已知或?yàn)橛邢Ｍ乃幬镔Y源的生物的基因組。，下面是產(chǎn)生和篩選新代謝途徑的方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種組合基因表達(dá)文庫(kù)，包括表達(dá)構(gòu)建物庫(kù)，每個(gè)表達(dá)構(gòu)建物包 含來(lái)自多種供體生物的cDNA或基因組DNA片段，其中cDNA或基因組 DNA片段可操作性地與一個(gè)或多個(gè)引起由適宜宿主生物中的cDNA或基 因組DNA片段編碼的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
2.一種組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)，包括表達(dá)構(gòu)建物庫(kù)，每個(gè)表達(dá) 構(gòu)建物包含來(lái)自一種或多種供體生物的隨機(jī)多聯(lián)體化的cDNA或基因組 DNA片段，其中多聯(lián)體cDNA或基因組DNA片段可操作性地與一個(gè)或 多個(gè)引起由適宜宿主生物中的多聯(lián)體cDNA或基因組DNA片段編碼的基 因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
3.一種偏倚性的組合基因表達(dá)文庫(kù)，包括表達(dá)構(gòu)建物庫(kù)，每個(gè)表達(dá) 構(gòu)建物包含cDNA或基因組DNA片段，它們的一些由于特定性質(zhì)被從多 種供體生物中預(yù)選擇，其中cDNA或基因組DNA可操作性地與一個(gè)或多 個(gè)引起由適宜宿主生物中的cDNA或基因組DNA片段編碼的基因表達(dá)的 調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
4.權(quán)利要求1，2或3的基因表達(dá)文庫(kù)，其中表達(dá)構(gòu)建物包括質(zhì)粒 載體，噬菌體，病毒載體，粘粒載體或人工染色體。
5.權(quán)利要求4的基因表達(dá)文庫(kù)，其中載體為能在不同宿主細(xì)胞種類 或菌株中復(fù)制的穿梭載體
6.權(quán)利要求1，2或3的基因表達(dá)文庫(kù)，其中cDNA或基因組DNA 片段來(lái)自細(xì)菌，真菌，藻類，地衣，植物，原生動(dòng)物，后生動(dòng)物，腔腸 動(dòng)物，昆蟲(chóng)，軟體動(dòng)物，海綿，蠕蟲(chóng)，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，被囊動(dòng)物， 鳥(niǎo)或哺乳動(dòng)物。
7.權(quán)利要求1，2或3的基因表達(dá)文庫(kù)，其中供體生物包括陸生微 生物或海洋微生物的混合物，或陸生微生物和海洋微生物的混合物。
8.權(quán)利要求1，2或3的基因表達(dá)文庫(kù)，其中cDNA或基因組DNA 片段來(lái)自環(huán)境樣品。
9.權(quán)利要求7的基因表達(dá)文庫(kù)，其中cDNA或基因組DNA片段包 括一個(gè)或多個(gè)供體生物的操縱子或其一部分。
10.權(quán)利要求9的基因表達(dá)文庫(kù)，其中操縱子或其一部分編碼完整 或部分代謝途徑。
11.權(quán)利要求1，2或3的基因表達(dá)文庫(kù)，其中各表達(dá)構(gòu)建物包含 在宿主細(xì)胞中。
12.權(quán)利要求11的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞通過(guò)導(dǎo)入，誘導(dǎo)或 過(guò)量產(chǎn)生活性外排系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行修飾。
13.權(quán)利要求11的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞被通過(guò)導(dǎo)入，誘導(dǎo) 或過(guò)量產(chǎn)生感興趣的已知的代謝途徑或其一部分來(lái)進(jìn)行修飾。
14.權(quán)利要求11的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞為細(xì)菌，真菌，植 物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞為大腸桿菌，枯草 芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌，啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵 母，Spodoptera?frugiperda，構(gòu)巢曲霉，Arabidopsis?thaliana，煙草， COS細(xì)胞，293細(xì)胞，VERO細(xì)胞，NIH/3T3細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含被剪接 的(tailored)適合于鑒定文庫(kù)中表達(dá)所需代謝途徑或化合物的克隆的報(bào) 道體系(regimen)。
17.權(quán)利要求16的基因表達(dá)文庫(kù)，其中報(bào)道體系包括編碼可操作性 與可被宿主細(xì)胞表達(dá)的所需代謝途徑或化合物誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián) 的報(bào)道基因的DNA。
18.權(quán)利要求11的基因表達(dá)文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞位于含有適合于鑒 定文庫(kù)中的表達(dá)所需代謝途徑或化合物的克隆的剪接的報(bào)道體系的基質(zhì) 中。
19.一種制備組合基因表達(dá)文庫(kù)的方法，包括將DNA載體與從多種 供體生物獲得的cDNA或基因組DNA片段連接，產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)， 其中cDNA或基因組DNA片段中包含的基因可操作性與引起基因在適宜 宿主細(xì)胞中表達(dá)的它們的天然或異源調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
20.一種制備嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)的方法，包括將從一種或多種 供體生物獲得的cDNA或基因組DNA片段隨機(jī)地多聯(lián)體化，并且將多聯(lián) 體化的DNA片段與DNA載體連接以產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)，其中包含在 cDNA或基因組DNA片段中的基因可操作性地與引起基因在適宜宿主細(xì) 胞中表達(dá)的它們天然或異源調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
21.一種制備偏倚性組合基因表達(dá)文庫(kù)的方法，包括將DNA載體與 從一種或多種供體生物獲得的cDNA或基因組DNA片段連接，其中一些 由于特定性質(zhì)被選擇產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)，其中包含在cDNA或基因組 DNA片段中的基因可操作性地與引起基因在適宜宿主細(xì)胞中表達(dá)的它們 的天然或異源調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)。
22.權(quán)利要求19，20或21的方法，其中DNA載體為質(zhì)粒載體， 噬菌體，病毒載體，粘粒載體或人工染色體。
23.權(quán)利要求22的方法，其中載體為能在不同宿主細(xì)胞種類或菌株 中復(fù)制的穿梭載體。
24.權(quán)利要求19，20或21的方法，其中cDNA或基因組DNA片 段來(lái)自細(xì)菌，真菌，藻類，地衣，植物，原生動(dòng)物，后生動(dòng)物，腔腸動(dòng) 物，昆蟲(chóng)，軟體動(dòng)物，海綿，蠕蟲(chóng)，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，被囊動(dòng)物， 鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物。
25.權(quán)利要求19，20或21的方法，其中供體生物包括陸生微生物 或海洋微生物混合物，或陸生微生物和海洋微生物的混合物。
26.權(quán)利要求19，20或21的方法，其中cDNA或基因組DNA片 段來(lái)自環(huán)境樣品。
27.權(quán)利要求25的方法，其中cDNA或基因組DNA片段至少包括 供體微生物的操縱子或其一部分。
28.權(quán)利要求27的方法，其中操縱子編碼完整或部分代謝途徑。
29.權(quán)利要求19，20或21的方法，進(jìn)一步包括將表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù) 導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的方法，其中宿主細(xì)胞為細(xì)菌，真菌，植物細(xì)胞， 昆蟲(chóng)細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中宿主細(xì)胞為大腸桿菌，枯草芽孢桿菌， 淺青紫鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌，啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵母，Spodoptera frugiperda，構(gòu)巢曲霉，Arabidopsis?thaliana，煙草，COS細(xì)胞，293 細(xì)胞，VERO細(xì)胞，NIH/3T3細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
32.權(quán)利要求29的方法，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含剪接的適合于鑒 定文庫(kù)中的表達(dá)所需代謝途徑或化合物的克隆的報(bào)道體系。
33.權(quán)利要求32的方法，其中報(bào)道體系包括編碼可操作性地與可通 過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)的所需代謝途徑或化合物誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)的報(bào) 道基因的DNA。
34.權(quán)利要求29的方法，其中宿主細(xì)胞被通過(guò)導(dǎo)入、誘導(dǎo)或過(guò)度產(chǎn) 生活性排出系統(tǒng)來(lái)修飾。
35.權(quán)利要求29的方法，其中宿主細(xì)胞被通過(guò)導(dǎo)入，誘導(dǎo)或過(guò)量產(chǎn) 生感興趣的已知代謝途徑或其一部分來(lái)進(jìn)行修飾。
36.一種鑒定基因表達(dá)文庫(kù)中的感興趣化合物的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求11的基因表達(dá)文庫(kù)；和
(b)篩選產(chǎn)生化合物的克隆的基因表達(dá)文庫(kù)。
37.一種篩選感興趣化合物的基因表達(dá)文庫(kù)的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求16的基因表達(dá)文庫(kù)；和
(b)檢測(cè)報(bào)道體系產(chǎn)生的信號(hào)；
從而鑒定產(chǎn)生化合物的克隆。
38.一種篩選感興趣化合物的基因表達(dá)文庫(kù)的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求18的基因表達(dá)文庫(kù)；和
(b)檢測(cè)報(bào)道體系產(chǎn)生的信號(hào)；
從而鑒定產(chǎn)生化合物的克隆。
39.一種制備感興趣化合物的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求36鑒定的克?。灰约?br/>(b)從鑒定的克隆的培養(yǎng)物中回收化合物。
40.一種制備感興趣化合物的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求37鑒定的克?。灰约?br/>(b)從鑒定的克隆的培養(yǎng)物中回收化合物。
41.一種制備感興趣化合物的方法，包括：
(a)培養(yǎng)權(quán)利要求38鑒定的克??；以及
(b)從鑒定的克隆的培養(yǎng)物中回收化合物。
1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種新的發(fā)現(xiàn)藥物的方法，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種 保存為藥物的良好或有希望的來(lái)源的生物基因組的系統(tǒng)；一種任意混合 來(lái)自一種或多種生物的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生新的代謝途徑的系統(tǒng)；以及一種 預(yù)篩選或篩選這些遺傳工程細(xì)胞以產(chǎn)生新的生化途徑和制備新的種類的 化合物的系統(tǒng)。該新的或重新構(gòu)成的代謝途徑可用于商業(yè)生產(chǎn)這些化合 物。
2.發(fā)明背景
2.1.藥物前驅(qū)的來(lái)源
藥物發(fā)現(xiàn)中的基本任選是確定具有所需活性的前驅(qū)化合物，并優(yōu)選 前驅(qū)化合物以滿足進(jìn)行進(jìn)一步藥物開(kāi)發(fā)所需的要求。一個(gè)藥物發(fā)現(xiàn)的通 常的方法包括產(chǎn)生在生物分析中與產(chǎn)生疾病(疾病目標(biāo))有關(guān)的大分子， 其中測(cè)試可能的候選藥物的治療活性，這些分子可為受體，酶或轉(zhuǎn)錄因 子。
另一種方法包括提供為疾病的病原體的代表的整個(gè)細(xì)胞或生物。這 些病原體包括細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞系。
一般地，存在兩種可能的藥物候選來(lái)源，一批天然產(chǎn)物和合成化合 物。通過(guò)任意篩選包含盡可能寬范圍的結(jié)構(gòu)類型的這一批已實(shí)現(xiàn)了前驅(qū) 化合物的鑒別。合成的組合化合物庫(kù)的最近進(jìn)展將進(jìn)一步增加可用于篩 選的化合物的數(shù)目和種類，然而，任何合成的化合物庫(kù)的合成法受人的 想象和合成技術(shù)的限制。
任意篩選來(lái)自例如陸生細(xì)菌，真菌，無(wú)脊椎動(dòng)物和植物來(lái)源的天然 產(chǎn)物已導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了許多重要的藥物(Franco等，1991，Critical?Rev Biotechnol?11：193-276；Goodfellow等，1989，在“微生物產(chǎn)物： 新方法”，Cambridge?University?Press，pp.343-383；Berdy?1974， 高級(jí)應(yīng)用微生物學(xué)18：309-406；Suffness等，1988，在海洋生物 的生物藥物的重要性，D.G.Fautin，California?Academy?of?Sciences，p. 151-157)。多于10,000種的這些天然產(chǎn)物具有生物活性，這些中的 至少100種目前被用作抗生素，農(nóng)業(yè)化肥和抗腫瘤劑。這種發(fā)現(xiàn)藥物的 方法的成功極大地取決于進(jìn)入篩選程序中的化合物的多少。通常，藥物 公司篩選含有數(shù)萬(wàn)種天然和合成化合物的化合物群。然而，新的化合物 與以前發(fā)現(xiàn)的化合物的比例隨著時(shí)間而降低。在篩選抗癌藥劑中，例如， 大多數(shù)具有生物活性的微生物種類可產(chǎn)生已被鑒定的化合物。一部分是 由于始終如一并足夠地發(fā)現(xiàn)，重新產(chǎn)生以及提供新的天然產(chǎn)物樣品的困 難。因?yàn)?a href='/zhuanli/list-17467-1.html' target='_blank'>生物多樣性很大程度是由于潛在的分子多樣性，在目前被選擇 用于任意篩選的生物中沒(méi)有足夠的生物多樣性，這就降低了分離新化合 物的可能性。
新的生物活性已始終如一地在各種天然來(lái)源中發(fā)現(xiàn)。參見(jiàn)例如， Cragg等，1994.(在“Enthnobotany及新藥找尋”Wiley，Chichester.p 178-196)。少數(shù)來(lái)源已被系統(tǒng)和全面地試驗(yàn)用于新藥物前驅(qū)。例如， 估計(jì)僅5000種植物種類被詳盡地研究用于可能的醫(yī)藥用途。這是估計(jì)的 250,000-3,000,000種類全部的一小部分，它們大多數(shù)生長(zhǎng)在熱帶 (Abelson?1990，科學(xué)247：513)。而且，在估計(jì)的數(shù)百萬(wàn)種海洋微 生物中，僅少數(shù)已被表征。確實(shí)，具有仍未被挖掘?yàn)榍膀?qū)化合物來(lái)源的 巨大的生物多樣性。
陸生微生物，真菌，無(wú)脊椎動(dòng)物和植物歷來(lái)被用作天然產(chǎn)物的來(lái)源。 然而，除開(kāi)一些被細(xì)致研究的生物群外，例如放線菌屬，它已被開(kāi)發(fā)用 于藥物篩選和商業(yè)生產(chǎn)外，可重復(fù)生產(chǎn)和生產(chǎn)問(wèn)題仍然存在。例如，抗 腫瘤劑，紫杉酚，為成熟太平洋水松樹(shù)的樹(shù)皮的一部分，并且它作為臨 床制劑已導(dǎo)致了關(guān)于對(duì)當(dāng)?shù)?a href='/zhuanli/list-17469-1.html' target='_blank'>生態(tài)系統(tǒng)的破壞的關(guān)注。紫杉酚含有11個(gè)手 性中心，具有2048個(gè)可能非對(duì)映異構(gòu)體形式，這樣它的在商業(yè)規(guī)模上的 從頭合成看來(lái)是不可能的(Phillipson，1994，皇家熱帶醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生學(xué) 匯刊88?Supp?1：17-19)。
海洋無(wú)脊椎動(dòng)物是一個(gè)有希望的新的化合物的來(lái)源，但存在大多數(shù) 在用于進(jìn)行藥物篩選和大規(guī)模重新提供的技術(shù)中的不足。例如，海洋無(wú) 脊椎動(dòng)物難于重新收集，并且在天然產(chǎn)物的含量方面，許多具有季節(jié)的 可變性。
海洋微生物是一種有希望的新化合物的來(lái)源，但也存在大多數(shù)在用 于進(jìn)行藥物篩選和用海洋微生物進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵的技術(shù)中的不足。例如， 海洋微生物難于收集，建立以及在培養(yǎng)物中保持，并許多具有特殊的營(yíng) 養(yǎng)需求。可靠來(lái)源的未被污染的海水通常對(duì)于發(fā)酵是必需的。估計(jì)至少 99％的海洋細(xì)菌種類在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中不能存活。而且，購(gòu)置的商業(yè)發(fā) 酵裝置不適宜用于鹽水環(huán)境，或高壓下。
而且，一些化合物僅當(dāng)特定的生物相互作用和與環(huán)境作用時(shí)才在自 然界中出現(xiàn)。病原體可能改變植物基因表達(dá)并誘發(fā)化合物的合成，例如 植物抗毒素，促使植物抗侵蝕。例如，野生煙草植物(Nicotiana sylvestris)當(dāng)受來(lái)自煙草天蛾(Manduca?sexta)幼蟲(chóng)的侵蝕時(shí)，則增 加其生物堿的合成。同樣真菌可通過(guò)解毒作用或防止它們的積累對(duì)植物 抗毒素產(chǎn)生反應(yīng)。通過(guò)傳統(tǒng)的高通過(guò)量(throughput)篩選，這些代謝 物被遺失，該方法不一起評(píng)價(jià)真菌和它的植物宿主。自然環(huán)境對(duì)生物的 影響的一個(gè)明顯的例子通過(guò)有毒導(dǎo)彈蛙可以看出。雖然可通過(guò)將吹風(fēng)導(dǎo) 彈的頂部沿田間種類的腺的背部擦刮來(lái)收集致死劑量的鈉通道拮抗劑生 物堿，蛙毒素，但在第二代陸地飼養(yǎng)的蛙中不能檢測(cè)到蛙毒素(Daly， 1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊92：9-13)。只要運(yùn)用傳統(tǒng)的藥物篩選 技術(shù)，象這些的可能有價(jià)值的分子可能永遠(yuǎn)不會(huì)被發(fā)現(xiàn)。
而且，通過(guò)隨意篩選的前驅(qū)化合物極少成為藥物，因?yàn)樗男?a href='/zhuanli/list-23072-1.html' target='_blank'>力， 選擇性，生物利用度或穩(wěn)定性可能不夠。通常，需要一定量的前驅(qū)化合 物，這樣它可被結(jié)構(gòu)修飾以改善它的初始活性。然而，目前從天然來(lái)源 尤其是植物合成和開(kāi)發(fā)前驅(qū)化合物的方法相對(duì)效率低。存在與藥物開(kāi)發(fā) 各階段有關(guān)的明顯的障礙，例如重新收集，產(chǎn)生藥物的生物的生長(zhǎng)，去 復(fù)制(dereplication)，菌株改進(jìn)，培養(yǎng)基改進(jìn)和擴(kuò)大生產(chǎn)。這些問(wèn)題 延遲了新化合物的臨床試驗(yàn)，并影響使用這些新來(lái)源的藥物前驅(qū)的經(jīng)濟(jì) 性。
目前，對(duì)天然產(chǎn)物的上述海洋，植物和動(dòng)物來(lái)源利用不足。對(duì)于這 些開(kāi)發(fā)不足的來(lái)源，目前現(xiàn)有的制備和篩選前驅(qū)化合物的方法不能被有 效地運(yùn)用。不象一些陸生細(xì)菌和真菌，這些產(chǎn)生藥物的生物不容易適應(yīng) 于工業(yè)發(fā)酵技術(shù)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物新來(lái)源的壓力被新的高效和高通過(guò)量 的篩選技術(shù)加劇。因此，普遍需要利用作為仍未開(kāi)發(fā)的化合物來(lái)源的遺 傳資源和化合物多樣性的方法以用于發(fā)現(xiàn)藥物的目的。 2.2.表達(dá)庫(kù)
最近藥物發(fā)現(xiàn)計(jì)劃已轉(zhuǎn)移到以機(jī)理為基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)篩選。一旦確定一 個(gè)分子靶(例如參與調(diào)節(jié)疾病的激素受體)，則將分析設(shè)計(jì)為識(shí)別和/或 合成在分子水平與靶相互作用的治療劑。
基因表達(dá)庫(kù)被用來(lái)識(shí)別，試驗(yàn)和制備靶分子。在不知道蛋白質(zhì)物理 性質(zhì)時(shí)，表達(dá)克隆已成為獲得編碼單一蛋白質(zhì)的靶基因的常規(guī)方法。
通過(guò)篩選基因表達(dá)庫(kù)識(shí)別，從人和哺乳動(dòng)物組織制備的許多蛋白質(zhì) 為可能的疾病靶，例如，受體(Simonsen等，1994，藥物科學(xué)動(dòng)態(tài)15： 437-441；Nakayama等，1992，當(dāng)今生物技術(shù)評(píng)論3：497-505； Aruffo，1991，當(dāng)今生物技術(shù)評(píng)論2：735-74l)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 (Margolis等，US5,434,064)。參見(jiàn)Seed等，1987，美國(guó)國(guó)家科學(xué) 院院刊84：3365-3369；Yamasaki等，1988，科學(xué)241：825-828； 和Lin等，1992，細(xì)胞68：775-785，(類型III?TGF-β受體) 為通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性表達(dá)克隆識(shí)別的蛋白質(zhì)的例子。
一旦靶疾病被確定，靶蛋白或表達(dá)靶蛋白的被遺傳設(shè)計(jì)的宿主細(xì)胞 被用于生物分析以篩選前驅(qū)化合物(Luyten等，1993，生物技術(shù)動(dòng)態(tài) 11：247-54)。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)的方案中，基因表達(dá)文庫(kù)的使用極 大地受限制于可能的蛋白質(zhì)疾病靶的識(shí)別和產(chǎn)生。僅在藥物為蛋白質(zhì)或 小肽，例如，抗體的那些情況下，表達(dá)文庫(kù)才被制備以產(chǎn)生和篩選具有 所需生物活性的分子(Huse等，1991，Ciba?Foundation?Symp 159：91-102)。
然而，與藥物發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因表達(dá)文庫(kù)具有其它的用途。為了識(shí)別 參與產(chǎn)生具有藥物活性的代謝物和特殊化學(xué)物質(zhì)的生物合成途徑的基因 的目的，已制備出了微生物的基因文庫(kù)。這些途徑需要多種蛋白質(zhì)(具 體地說(shuō)，酶)，必然伴有比用作藥物靶的單一蛋白質(zhì)更大的復(fù)雜性。例 如，通過(guò)篩選該生物的基因文庫(kù)確定了編碼細(xì)菌聚酮化合物合成酶 (PKSs)途徑的基因(Malpartida等，1984，自然，309：462； Donadio等，1991，科學(xué)252：675-679)。PKSs催化為重要一類 治療化合物的聚酮化合物類的生物合成的多個(gè)步驟，并控制產(chǎn)生的聚酮 化合物的結(jié)構(gòu)多樣性。已開(kāi)發(fā)出允許克隆的PKS基因定向突變和表達(dá)的 在鏈霉菌屬中的宿主??載體系統(tǒng)(McDaniel等，1993，科學(xué)262： 1546-1550；Kao等，1994，科學(xué)265：509-512)。該特定的宿 主載體系統(tǒng)已被用來(lái)開(kāi)發(fā)更為有效的產(chǎn)生聚酮化合物類的途徑，并被用 來(lái)合理地開(kāi)發(fā)新的聚酮化合物類(Khosla等，WO95/08548)。
另一個(gè)例子是通過(guò)在大腸桿菌宿主中發(fā)酵來(lái)制備織物染料，靛藍(lán)。 含有編碼多酶生物合成途徑的基因的兩個(gè)操縱子已被遺傳操縱以提高外 源大腸桿菌宿主的靛藍(lán)的產(chǎn)生(Ensley等，1983，科學(xué)222：167- 169；Murdock等，1993，生物/技術(shù)11：381-386)?？傊幋a 代謝途徑的基因的異種表達(dá)的常規(guī)研究包括定向克隆，序列分析，設(shè)計(jì) 突變和編碼已知參與以前表征的代謝途徑的蛋白質(zhì)的特定基因的重排。
鑒于對(duì)疾病機(jī)理和藥物靶確定的認(rèn)識(shí)的巨大進(jìn)步，日益需要改進(jìn)迅 速識(shí)別前驅(qū)化合物并將它們引入臨床試驗(yàn)的策略和方法。
3.發(fā)明概述
本發(fā)明提供一種產(chǎn)生和篩選用于藥物發(fā)現(xiàn)目的的分子多樣性的藥物 發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。本發(fā)明的方法將已知為/或有希望為藥物前驅(qū)來(lái)源的生物的遺 傳物質(zhì)捕捉并保存在混合的基因表達(dá)文庫(kù)中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括從一種或多種供體生物構(gòu)建混合天 然途徑的基因表達(dá)文庫(kù)，其中供體生物包括微生物，植物和動(dòng)物，尤其 是在自然界不能大量回收，或不能在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的那些。根據(jù)它們已 知的生物特性，可選擇庫(kù)中的供體生物，或它們可為已知和/或從自然界 收集的未知種類的生物的混合物。在宿主生物中克隆和表達(dá)供體生物基 因組的任意片段，它們中的一些含有全部和部分生化途徑。
根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)移的DNA的基因產(chǎn)物的亞組(subset)能在宿主生 物中起作用。在宿主生物中，供體生物自然發(fā)生的途徑可由此被重新構(gòu) 成。供體基因在異種宿主的不相類似的生理和調(diào)節(jié)環(huán)境中的表達(dá)可暴露 其它沉默的代謝途徑。供體生物的代謝途徑也可與存在于宿主生物中的 代謝途徑相互作用以產(chǎn)生新的化合物或宿主生物一般不產(chǎn)生的化合物。
而且，由于在任一時(shí)間，在宿主生物中僅僅表達(dá)確定的亞組的供體 生物的基因，該系統(tǒng)可使得在宿主生物的已表征的生化/細(xì)胞背景下更易 于檢測(cè)代謝途徑和化合物。從本質(zhì)上講是，這些供體生物的遺傳資源被 捕捉和保存在基因表達(dá)文庫(kù)中，該基因表達(dá)文庫(kù)在不同的藥物發(fā)現(xiàn)步驟 中可被復(fù)制和反復(fù)使用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括結(jié)合的嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建， 其中來(lái)自一種或多種供體生物的遺傳物質(zhì)在宿主生物中被任意組合，克 隆和表達(dá)。這些文庫(kù)從多個(gè)途徑和生物產(chǎn)生基因的任意組合，這樣產(chǎn)生 了以前在自然界不存在的代謝途徑和獨(dú)立的基因組。術(shù)語(yǔ)“獨(dú)立的基因 組”指從來(lái)自組合基因表達(dá)文庫(kù)中的一個(gè)或多個(gè)途徑或生物的基因的連 接而獲得的兩個(gè)或多個(gè)基因的任何結(jié)合。多種基因產(chǎn)物能在宿主生物中 起作用，其中它們相互作用以形成產(chǎn)生新類別的化合物的新的嵌合代謝 途徑。因此，通過(guò)混合組合嵌合基因表達(dá)文庫(kù)中的現(xiàn)存的途徑和生物的 遺傳物質(zhì)增加了可用于藥物篩選的分子結(jié)構(gòu)的多樣性。
雖然可使用篩選基因表達(dá)文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該文庫(kù)可被進(jìn)一步修 飾以摻入一個(gè)報(bào)道體系來(lái)滿足識(shí)別正在表達(dá)所需途徑和代謝產(chǎn)物的克隆 的需要。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，宿主生物被遺傳改造包括編碼可操 縱性地與化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子相關(guān)的報(bào)告蛋白質(zhì)的基因，該化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子 與在表達(dá)文庫(kù)中要檢測(cè)的所需種類的代謝物產(chǎn)生應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物可暴露于為報(bào)道分子前體的生理探 針中，該前體通過(guò)在所找到的途徑中產(chǎn)生的化合物直接或間接轉(zhuǎn)化為報(bào) 道分子。報(bào)道分子表征的活化或報(bào)道前體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了允許識(shí)別和分離 所需克隆的信號(hào)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)中的宿主生物可與報(bào)道體系或 含有試樣或本身為所需化合物的靶的其它指示細(xì)胞類型，例如抗感染劑 針對(duì)的病原體或抗腫瘤劑針對(duì)的腫瘤細(xì)胞一起內(nèi)嵌在半固體基質(zhì)中?？?使用高流通量的篩選方法，例如，大滴流分選，熒光激活細(xì)胞分選或磁 激活細(xì)胞分選以在組合基因表達(dá)文庫(kù)中識(shí)別和分離所需生物。
可進(jìn)一步分析陽(yáng)性克隆產(chǎn)生的新化合物。通過(guò)表征導(dǎo)入分離克隆中 的遺傳物質(zhì)可說(shuō)明導(dǎo)致產(chǎn)生新化合物的代謝途徑的遺傳學(xué)和生物化學(xué)。
本發(fā)明還涉及用于構(gòu)建組合基因表達(dá)文庫(kù)的DNA載體，特定的組合 基因表達(dá)文庫(kù)，含有特定類型的報(bào)道體系的宿主生物，被修飾以便于產(chǎn) 生其它毒性化合物的宿主生物，和包含宿主生物，指示細(xì)胞和/或報(bào)道體 系的組合物。 3.1.定義
如本文所采用，下面術(shù)語(yǔ)具有所指明的含義。
“組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)”是表達(dá)從來(lái)自多種供體生物的遺傳物質(zhì) 制備的構(gòu)建物的文庫(kù)，其中存在于遺傳物質(zhì)中的基因可操作性地在適宜 宿主生物中引起基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)系。組合表達(dá)文庫(kù)使用能產(chǎn)生供 體生物的功能性基因產(chǎn)物的宿主生物。在各個(gè)宿主生物中的遺傳物質(zhì)編 碼來(lái)自一個(gè)供體生物的自然發(fā)生的生化途徑或它的一部分。
“組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)”是表達(dá)從來(lái)自一種或多種供體生物的任 意多聯(lián)體化的遺傳物質(zhì)制備的構(gòu)建物的文庫(kù)，其中存在于遺傳物質(zhì)中的 基因可操作性地與在適宜宿主生物中引起基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)系。使 用的宿主生物能產(chǎn)生供體生物的功能性基因產(chǎn)物。
“偏倚的組合基因表達(dá)文庫(kù)”是表達(dá)從來(lái)自一種或多種供體生物的 遺傳物質(zhì)制備的構(gòu)建物的文庫(kù)，它已被對(duì)特定的性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)先選擇。 預(yù)先選擇的遺傳物質(zhì)可被用來(lái)制備組合天然途徑或嵌合文庫(kù)。
如本文所采用，術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”指表達(dá)構(gòu)建物或含表達(dá)構(gòu)建物的宿主 生物。
術(shù)語(yǔ)“生化途徑”，“天然途徑”和“代謝途徑”包含所有系列的 由生物進(jìn)行的相關(guān)的生化反應(yīng)。該途徑可包括，但不局限于生物合成或 生物降解途徑，或能量產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化途徑。
“化合物”是為生化途徑的結(jié)果或副產(chǎn)物的任何分子，并且通常是 多種基因產(chǎn)物相互作用的產(chǎn)物。
“活性”是宿主生物進(jìn)行生化反應(yīng)或一系列導(dǎo)致產(chǎn)生感興趣化合物 的生化反應(yīng)的能力。
如本發(fā)明中所采用的，下面縮寫(xiě)表示：eq(當(dāng)量)；M(摩爾濃 度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；N(正常)；mol (摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)：nmol(納摩爾)： kg(千克)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)； L(升)；mL(毫升)；μl(微升)；vol(體積)；s(秒)；和℃ (攝氏溫度)。
此外，采用下面縮寫(xiě)：Cfu：克隆形成單位；LB：Luria發(fā)酵液； ddH2O：雙蒸餾，反滲透純化水；海水：過(guò)濾的太平洋海水；SSW：合 成海水；FACS：熒光激活細(xì)胞分選；GFP：維多利亞多管水母 (Aequorea?victoria)綠色熒光蛋白；kbp：千堿基對(duì)；g：重力； rpm：每分鐘旋轉(zhuǎn)；CIAP：小牛腸堿性磷酸酶；EDTA：乙二酸四乙胺； TE：10mM?Tris/1.5mM?EDTA?pH?7.4；PEG：聚乙二醇；E. coli：大腸桿菌；CHO：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢；S.cerevisiae：啤酒糖酵母； A.nidulans：構(gòu)巢曲霉；S.pombe：粟酒裂殖酵母；S.lividans：變青 鏈霉菌；S.aureus：金黃色葡萄球菌；S.coelicolor：天藍(lán)色鏈霉菌； B.subtilis：枯草芽孢桿菌；BAC：細(xì)菌人工染色體；YAC：酵母人工 染色體；PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；CaMV：花椰菜花葉病毒；AcNPV： 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；EBV：Epstein-Barr病毒；SDS：十 二烷基磺酸鈉；CsCl：氯化銫。
4.附圖說(shuō)明
圖1：組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)的表達(dá)構(gòu)建物。該表達(dá)構(gòu)建物含有載 體DNA以及包括編碼代謝途徑和天然相聯(lián)系的調(diào)節(jié)區(qū)的供體DNA片 段。
圖2：組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的表達(dá)構(gòu)建物。該表達(dá)構(gòu)建物含有載 體DNA和各包括供體DNA和調(diào)節(jié)區(qū)的五個(gè)多聯(lián)體化的基因盒。
圖3：組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)的克隆方法。將從供體生物(A)提 取的可克隆DNA(B)用限制性酶部分消化以產(chǎn)物編碼天然發(fā)生的生化 途徑或其一部分的基因組DNA(C)的片段。將被用限制性酶消化以產(chǎn) 生具有相容末端(E)的載體的DNA載體(D)連接至基因組DNA的 片段上以形成表達(dá)構(gòu)建物(F)。
圖4A-4C：基因盒的裝配。圖4A描述了含有粘性BamHI位點(diǎn)和 相對(duì)于SamI位點(diǎn)的一部分為平端的退火的，磷酸化的lac啟動(dòng)子片段。 圖4B描述了含有在于側(cè)翼位于lac啟動(dòng)子旁側(cè)的BamHI位點(diǎn)的啟動(dòng)子二 聚體。圖4C描述了多聯(lián)體化的啟動(dòng)子片段
圖5A-5F：組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的克隆方法。圖5A表明制備 用于cDNA和基因組DNA插入片段的定向克隆的啟動(dòng)子和終止子片段的 步驟。圖5B表明制備用于與基因組DNA插入片段相連的啟動(dòng)子和終止 子片段的步驟。圖5C表明制備用于定向克隆，基因盒的裝配，以及與固 體支持物的連接的cDNA插入片段的步驟。圖5D表明制備用于克隆，基 因盒的裝配以及與固體支持物的連接的基因組DNA插入片段的步驟。圖 5E和5F表明基因盒的系列連接以及去保護(hù)以形成多聯(lián)體，多聯(lián)體與裂 殖酵母/大腸桿菌穿梭載體(pDblet)的連接；表達(dá)構(gòu)建物從固體載體上 的釋放以及表達(dá)構(gòu)建物的環(huán)化。
圖6A-6B：用于制備組合基因表達(dá)文庫(kù)的載體。圖6A表明 Streptocos圖譜。粘粒載體Streptocos在多個(gè)克隆位點(diǎn)中含有位于T3和 T7啟動(dòng)子旁側(cè)的唯一個(gè)BamHI位點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)和來(lái)自pIJ?699的硫鏈絲 菌肽抗性基因，ColE1起點(diǎn)(ori)，氨芐青霉素基因(Amp)和兩個(gè) cos位點(diǎn)。圖6B表明修飾的pDblet圖譜。質(zhì)粒pDblet在多個(gè)克隆位點(diǎn) (MCS)被修飾，并且含有復(fù)制的ColE1起點(diǎn)，氨芐青霉素基因(ApR)， 兩個(gè)拷貝的自主復(fù)制序列(ARS)，一個(gè)ura4標(biāo)記，以及β-半乳糖苷 酶基因(LacZ)。A：AatII；B：BamHI；N：NdeI。圖6C表明 含有改變的BstXI序列和NcoI位點(diǎn)的寡聚體，它被過(guò)量地與SacI/NotI 切割的pDblet連接的形成修飾的pDblet。
圖7表明化學(xué)應(yīng)答構(gòu)建物pERD-20-GFP，其包括一個(gè)編碼綠色 熒光蛋白(GFP)的受體基因，化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子(Pm)和其相關(guān)的調(diào) 節(jié)子(Xyls)。
圖8表明包含可通透基質(zhì)和含有受體區(qū)的指示細(xì)胞的大粗流，在基 質(zhì)中來(lái)自組合基因表達(dá)文庫(kù)的克隆被包裹。
圖9A和9B提供了在存在和不存在包含海洋細(xì)菌基因的表達(dá)構(gòu)建物 的情況下，對(duì)大腸桿菌細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行FACS分選的實(shí)例。用海洋細(xì)菌基因 的粘粒文庫(kù)感染稱為XLl-GFP的含有化學(xué)應(yīng)答構(gòu)建物pERD-20- GFP的大腸桿菌菌株XLl?MR。在30℃下，將具有或不具有海洋細(xì) 菌基因的XLl-GFP細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)，并進(jìn)行兩輪的FACS分選。圖 9A：具有海洋細(xì)菌基因的XLl-GFP；圖9B：對(duì)照XLl-GFP細(xì)胞。
圖10表明天藍(lán)色鏈霉菌的放線紫素脫水酶的氨基酸序列的排列，以 及來(lái)自CXC-AMN?20的預(yù)測(cè)的部分氨基酸序列。空白的部分說(shuō)明序列 相同，有陰影的部分說(shuō)明保守序列同源性。
圖11：海洋細(xì)菌的基因組DNA庫(kù)中的克隆CXC-AMN?20序列的 PCR檢測(cè)。該圖表明含有來(lái)自海洋細(xì)菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增子的染 色的瓊脂糖凝膠。M：分子量標(biāo)記，大小為bp。-：陰性對(duì)照。+： 擴(kuò)增子和核糖體RNA的陽(yáng)性對(duì)照。泳道含有來(lái)自T的擴(kuò)增子：來(lái)自所有 37種海洋細(xì)菌的基因DNA；1，2，3，4：海洋細(xì)菌的基因組DNA庫(kù)。
圖12A-C：海洋細(xì)菌種類的基因組DNA中的克隆CXC-AMN?20 序列的PCR檢測(cè)。該圖表明含有來(lái)自海洋細(xì)菌各種類的基因組DNA的 PCR擴(kuò)增子的染色的瓊脂糖凝膠。M：分子量標(biāo)記，大小為bp。-： 陰性對(duì)照。+：擴(kuò)增子和核糖體RNA的陽(yáng)性對(duì)照。泳道含有來(lái)自海洋細(xì) 菌基因組DNA的擴(kuò)增子：分別是庫(kù)1，2，3中的種類#1-10，#12 -20和#21-35。
5.發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供用于捕獲和保存自然界 多樣性的遺傳資源，并且用于將捕獲和資源翻譯和擴(kuò)展為多樣性的化學(xué) 結(jié)構(gòu)的方法和組合物。本發(fā)明還便于篩選所需活性和化合物。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供用于構(gòu)建和篩選組合基因表達(dá)文庫(kù)的方 法。這些文庫(kù)包括任意種類的多種種類的基因產(chǎn)物，在一些情況下，它 能在表達(dá)宿主中相互作用，并在某些情況下導(dǎo)致形成新的生化途徑和/或 產(chǎn)生新類型的化合物。而且，本發(fā)明的文庫(kù)提供有效的得到其它不可得 到的分子多樣性來(lái)源的途徑。
新的生化途徑可進(jìn)行，包括但不局限于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾，將化學(xué)基 團(tuán)加入物質(zhì)中或分解物質(zhì)的過(guò)程。
新種類的化合物可包括，但不局限于代謝物，二級(jí)代謝物，酶，或 生物體的結(jié)構(gòu)組成。感興趣的化合物可具有一種或多種潛在的治療特 性，包括但不局限于抗生素，抗病毒，抗腫瘤，藥理學(xué)或免疫調(diào)節(jié)特性 或其它具有商業(yè)價(jià)值的化合物，如色素?；衔锟勺鳛橐活愂荏w或一個(gè) 特定受體的興奮劑或拮抗劑。
如本發(fā)明所采用的，術(shù)語(yǔ)“組合基因表達(dá)文庫(kù)”包括組合天然途徑 表達(dá)文庫(kù)，組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)以及含有表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)的宿主生 物。
“組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)”是從來(lái)自一種或多種供體生物的遺傳物 質(zhì)制得的表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)，其中存在于遺傳物質(zhì)中的基因可操作性地與 引起基因在適宜宿主生物中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)系。組合表達(dá)文庫(kù)使用能 產(chǎn)生供體生物功能性基因產(chǎn)物的宿主生物。各宿主生物中的遺傳物質(zhì)編 碼來(lái)自供體生物的自然發(fā)生的生化途徑或其一部分。
“組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)”是從來(lái)自多種供體生物的任意嵌合的遺 傳物質(zhì)制備的表達(dá)構(gòu)建物文庫(kù)，其中存在于遺傳物質(zhì)中的基因可操作性 地與引起基因在適宜宿主生物中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)相聯(lián)系。所采用的宿主生 物能產(chǎn)生供體生物的功能性基因產(chǎn)物。在宿主生物中表達(dá)時(shí)，供體生物 的基因產(chǎn)物可相互作用形成新的嵌合生化途徑。
通常，本發(fā)明的方法包括提供來(lái)自一或多個(gè)供體生物的遺傳物質(zhì)。 操作所述遺傳物質(zhì)，和將所述遺傳物質(zhì)借助于克隆或表達(dá)載體導(dǎo)入宿主 生物中，這樣供體生物的一個(gè)或多個(gè)基因被轉(zhuǎn)移至并在宿主生物中表 達(dá)。這些含有供體遺傳物質(zhì)的宿主生物被匯集形成文庫(kù)。
轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)通常包含任意種類的基因，它們表達(dá)由一個(gè)或多個(gè) 功能性調(diào)節(jié)區(qū)引起和控制。表達(dá)構(gòu)建物或載體可提供一些這樣的調(diào)節(jié) 區(qū)。在宿主生物中供體生物的基因被轉(zhuǎn)錄，翻譯并加工以產(chǎn)生其本身又 產(chǎn)生感興趣的代謝物的功能性蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，包括完全天然發(fā)生的生化途徑或其本質(zhì)一部分的基因 表達(dá)文庫(kù)，可大大便于尋找負(fù)責(zé)產(chǎn)生化合物或提供感興趣活性的供體多 酶體系。參與特定生化途徑的基因可按常規(guī)分離并以單個(gè)表達(dá)構(gòu)建物或 克隆來(lái)表征。該表達(dá)構(gòu)建物的一個(gè)典型的排列示于圖1中。
一旦確定了所需活性化合物，這個(gè)合適的特征可大大地便于下面的 藥物開(kāi)發(fā)工作，例如菌株的改進(jìn)和方法的改進(jìn)?？稍跇?biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)陽(yáng) 性克隆以產(chǎn)生足夠量的用于進(jìn)一步研究或使用的所需化合物。該生化途 徑的基因可立即用于測(cè)序，突變，表達(dá)和更多輪的篩選?？寺〉纳?徑容易適合于用于過(guò)量產(chǎn)生所需化合物的傳統(tǒng)的和/或遺傳操作。
而且，在供體生物中另外情況下為沉默或不可檢測(cè)的生化途徑可較 容易地根據(jù)它們?cè)谒拗魃镏械墓δ苄灾亟▉?lái)發(fā)現(xiàn)。因?yàn)樗拗魃锏纳?化特征是熟知的，作為供體遺傳物質(zhì)表達(dá)的結(jié)果的許多偏離可被容易地 識(shí)別。可通過(guò)將含有供體遺傳物質(zhì)的宿主生物的提取物與在一系列給定 的環(huán)境條件下已知由對(duì)照宿主生物產(chǎn)生的化合物分布圖進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè) 新化合物。當(dāng)宿主生物的宿主生化和細(xì)胞背景被很好地表征時(shí)，甚至可 檢測(cè)非常低水平的所需活性或化合物。如后面章節(jié)所描述的，本發(fā)明提 供了用于檢測(cè)和分離產(chǎn)生所需活性或化合物類型的克隆的方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些方法可適用于在自然界不能大量回 收或不能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的供體生物。通過(guò)將來(lái)自這些生物的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn) 移至宿主生物中，生物的代謝途徑可重新產(chǎn)生，并且它們的產(chǎn)物可被有 效地檢測(cè)其任何所需性質(zhì)。因此，捕獲并保存了這些生物的遺傳多樣性。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，可構(gòu)建組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)， 其中在導(dǎo)入宿主生物之前，來(lái)自一種或多種供體生物的遺傳物質(zhì)被任意 地多聯(lián)體化。因此，文庫(kù)中的每一宿主生物可各自含有來(lái)自各供體途徑 或生物的唯一，任意的基因組合。圖2表達(dá)組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù) 的表達(dá)構(gòu)建物中的基因和調(diào)節(jié)區(qū)的排列。大多數(shù)情況下，文庫(kù)中的基因 的這些組合在自然界并不發(fā)生。在表達(dá)時(shí)，在各宿主生物中，各種供體 途徑或生物的功能性基因產(chǎn)物相互作用，產(chǎn)生導(dǎo)致新的嵌合代謝途徑和/ 或產(chǎn)生新化合物的生化反應(yīng)的組合?？偟膩?lái)說(shuō)，文庫(kù)中的供體生物的遺 傳資源被翻譯成在各供體生物中不可能發(fā)現(xiàn)的多種化合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可根據(jù)它們的生物特性，或進(jìn)行互補(bǔ)于宿 主生物的所需組不特殊的生化反應(yīng)的能力來(lái)選擇供體生物的種類。這些 所需特性可包括，但不局限于使用某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在極端條件下存活， 衍生化學(xué)結(jié)構(gòu)的能力，以及分解或催化某些類型化學(xué)鍵形成的能力。當(dāng) 供體生物的基因在宿主生物中表達(dá)時(shí)，供體基因產(chǎn)物可修飾和/或取代組 成宿主代謝途徑的宿主基因產(chǎn)物的功能，從而產(chǎn)生新的雜交途徑。新的 活性和/或化合物可通過(guò)包含供體和來(lái)自宿主的成分的雜交途徑而產(chǎn) 生。被供體基因產(chǎn)物修飾的靶代謝途徑對(duì)于宿主生物可能為原先有的。 另一方面，靶代謝途徑可由異種基因產(chǎn)物來(lái)提供，該異種基因?yàn)閮?nèi)源性 的或在構(gòu)建基因表達(dá)文庫(kù)之前或同時(shí)已被遺傳操作至各宿主生物中。因 此，本發(fā)明還包括構(gòu)建和篩選基因表達(dá)文庫(kù)，其中編碼供體生物代謝途 徑的DNA片段在含有靶代謝途徑的宿主生物中克隆和共表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物可具有將感興趣化合物分 泌至培養(yǎng)基的活性藥物外排系統(tǒng)的增強(qiáng)補(bǔ)體，從而降低化合物對(duì)宿主生 物的毒性?？稍谂囵B(yǎng)宿主生物期間使用吸水性物質(zhì)，如中性樹(shù)脂，從而 可分離由宿主生物產(chǎn)生和分泌的代謝物，因此而便于回收代謝物。
為了使篩選組合基因表達(dá)文庫(kù)的方法更為有效，本發(fā)明進(jìn)一步提供 了檢測(cè)文庫(kù)中具有感興趣活性或化合物的那些宿主生物的方法。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物含有報(bào)道體系，該報(bào)道體系將通過(guò)活化 報(bào)道分子的從頭合成來(lái)對(duì)引入的變化和出現(xiàn)產(chǎn)生反應(yīng)，例如出現(xiàn)所需化 合物或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物含有報(bào)道分子的前體，或生 理性探針，由于所需化合物或活性的出現(xiàn)，它則轉(zhuǎn)化為報(bào)道分子。陽(yáng)性 克隆中的報(bào)道分子產(chǎn)生可檢測(cè)表達(dá)文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆，以及從不產(chǎn)生它 的其它克隆中分離的信號(hào)。
在許多方面，該藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)的各個(gè)步驟直至臨床試 驗(yàn)提供了明顯的便利和時(shí)間優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的文庫(kù)與已建立的多孔足跡形 式和高流通量篩選的機(jī)器人技術(shù)相容。本發(fā)明的宿主生物為通常用于遺 傳操作和/或方法開(kāi)發(fā)的生物。本發(fā)明利用了這些宿主生物或生產(chǎn)宿主在 它們的生物學(xué)特性和供養(yǎng)需求方面已清楚地被表征這一事實(shí)。通過(guò)將來(lái) 自供體生物的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至其它更為熟悉的表達(dá)系統(tǒng)，降低了對(duì)供體 生物的困難的培養(yǎng)條件的需求。因此，可研究和更有效地優(yōu)化在本發(fā)明 系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的任何前驅(qū)化合物的生物活性，藥物動(dòng)力學(xué)和毒性性質(zhì)。
陽(yáng)性克隆中產(chǎn)生的新的代謝途徑可通過(guò)分子生物學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái) 說(shuō)明?？稍跇?biāo)準(zhǔn)或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)產(chǎn)生藥物的宿主生物 的克隆來(lái)合成前驅(qū)化合物，這樣可分離足夠量的前驅(qū)化合物用于進(jìn)一步 的分析和開(kāi)發(fā)。已有高純度的生產(chǎn)方法，例如對(duì)于一些這樣的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè) 宿主生物建立的良好的制造加工(Good?Manufacturing?Practice) (GMP)。不象篩選天然產(chǎn)物來(lái)源的常規(guī)方法，需要較少的努力來(lái)使篩 選和生產(chǎn)方法適應(yīng)于各可能的產(chǎn)生藥物的生物的特殊的需求。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法從特定組的供體生物和/或細(xì)胞 類型制備的特定的組合基因表達(dá)文庫(kù)。并非一組中所有的生物或細(xì)胞類 型，尤其是混合樣品均需要一一確定或表征以使得制備組合基因表達(dá)文 庫(kù)成為可能。
本發(fā)明的任何組合基因表達(dá)文庫(kù)可擴(kuò)增，復(fù)制和貯存。擴(kuò)增指培養(yǎng) 含有供體DNA的初始宿主生物，這樣可產(chǎn)生宿主生物的多個(gè)克隆。復(fù)制 指挑選和培養(yǎng)文庫(kù)中的各個(gè)克隆?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的適宜于宿主生物 的任何方法貯存和復(fù)蘇本發(fā)明的組合基因表達(dá)文庫(kù)，因此，本發(fā)明的文 庫(kù)是一個(gè)有效的捕獲和保存供體生物遺傳資源的方法，該遺傳資源在藥 物發(fā)現(xiàn)方案中可重復(fù)獲得。 5.1.組合基因表達(dá)文庫(kù)的制備 5.1.1.供體生物
任何生物可作為用于制備本發(fā)明組合基因表達(dá)文庫(kù)目的的供體生 物。供體生物可從私人或公共實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物，或培養(yǎng)物保藏單位，例如 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，國(guó)際真菌學(xué)院，或從培養(yǎng)的或未培養(yǎng)的環(huán)境 樣品中獲得。
供體生物可能已是藥物前驅(qū)的傳統(tǒng)來(lái)源，例如陸生細(xì)菌，真菌和植 物。供體生物可為已用于產(chǎn)生和/或制備藥物的轉(zhuǎn)基因，被遺傳操作或遺 傳選擇的菌株。
供體生物可以或不可用目前現(xiàn)有技術(shù)提到的微生物學(xué)方法來(lái)進(jìn)行培 養(yǎng)，例如用于制備文庫(kù)的遺傳物質(zhì)可直接從環(huán)境樣品中獲得。因?yàn)閮H少 量(≤1％)自然界發(fā)現(xiàn)的微生物可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，所以本發(fā)明的主要優(yōu) 點(diǎn)是本文所使用的供體生物不必是可培養(yǎng)(Torsvik等，1990，應(yīng)用環(huán) 境微生物學(xué)，156：782-787)。
本發(fā)明不局限于使用微生物作為供體。植物產(chǎn)生大量的化合物，一 些對(duì)動(dòng)物和微生物具有強(qiáng)的活性，例如植物抗毒素(Abelson?1990，科 學(xué)247：513)。這些化合物中的一些可通過(guò)創(chuàng)傷或來(lái)自植物病原體的 細(xì)胞壁的提取物來(lái)誘導(dǎo)(Cramer等，1985，歐洲分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)雜 志，4：285-289；Cramer等，1985，科學(xué)227：1240-1243； Dron等，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊85：6738-6742)。生物活性 化合物，如紫杉酚，喜樹(shù)堿，青蒿素，為來(lái)自植物的天然產(chǎn)物的實(shí)例， 它們分別作為抗腫瘤和抗瘧疾劑正進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)。任何植物，尤其是具 有可能的藥物性質(zhì)的那些，可能為所需的供體生物(Phillipson，1994， 皇家熱帶醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生學(xué)匯刊，88補(bǔ)編1：S17-9；Chadwick等編， 1994，在“人種植物學(xué)和新藥研究”，Wiley，Chichester，Ciba Foundation?Symp?185)。
具有可能有用的抗微生物或藥物學(xué)性質(zhì)的天然產(chǎn)物的另一個(gè)來(lái)源是 無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。這些化合物的一些起抗競(jìng)爭(zhēng)者，病原體和捕食 者的化學(xué)防護(hù)的作用。這些化合物也可用來(lái)殺傷捕獲物或用作聯(lián)系的各 種形式(Caporale?1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊92：75?82)。在多 數(shù)情況下，二級(jí)代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是由相關(guān)的可能為共生的微生物所產(chǎn)生 (Faulkner等，1993，Gazzetta?Chimica?Italiana，123：301- 307；Bewley等，1995，在Antonio?Gonzalez教授在“海洋天然產(chǎn)物 化學(xué)討論會(huì)上的共生的綜述”，La?Laguna大學(xué)，Canary?Islands， 9，16，1995，p26(摘要))。
在自然界被已知操縱其它生物的生化途徑的生物是尤其感興趣的來(lái) 源，例如一些植物，如蘇鐵屬，可產(chǎn)生干擾某些昆蟲(chóng)發(fā)育的蛻皮素模擬 物。這些生物可生存于相同的生態(tài)位中，其中它們作為競(jìng)爭(zhēng)者，共生體， 捕食者和捕獲物，或作為宿主和寄生物而存在。因此，使用來(lái)自在自然 界相互發(fā)生化學(xué)相互作用的生物的遺傳物質(zhì)可能是有利的。
天然產(chǎn)物的另外其它的豐富來(lái)源是海洋生物。例如，海洋微生物產(chǎn) 生新的分子結(jié)構(gòu)，其中許多具有生物活性，例如辛內(nèi)酰亞胺A(octalactin ?A)，它為具有以前在陸生細(xì)菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的分子結(jié)構(gòu)的可能的抗腫瘤 劑(Tapiolas等，1991，美國(guó)化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志，113：4682-83)； 和Salinamides(Trischman等，1994，美國(guó)化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志，116： 755-758)，它具有可能的抗炎性質(zhì)。來(lái)自海洋生物的一些化合物含有 來(lái)自海水的溴，由于摻入的鹵素的化學(xué)活性，使得化合物具有高活性， 例如marinone(Pathirana等，1992，Tetrahedron?Lett?33：7663- 7666)，混合聚酮化合物和甲瓦龍酸生物合成途徑的產(chǎn)物，它具有選擇 性的抗革蘭氏陽(yáng)性菌的抗生素活性。在具有不同的鹽濃度，溫度和壓力， 從極地到熱帶區(qū)的大范圍的棲息地中生活著巨大量的海洋生物種類。這 些棲息地的獨(dú)一無(wú)二的特性反映在這些生物的獨(dú)特的遺傳學(xué)和生物化學(xué) 中，并且可能提供許多有用的藥物前驅(qū)。參見(jiàn)，例如Fenical等，1992， “海洋微生物，新的生物資源”。海洋生物技術(shù)進(jìn)展，Vol.I，Plenum Press，New?York。
環(huán)境樣品可從天然或人工環(huán)境中獲得，可包含原核和真核生物的混 合物，和病毒，其中一些可能是未鑒別的，樣品可任意收集或從為生態(tài) 學(xué)重點(diǎn)的地區(qū)收集，例如靠近工業(yè)廢物的地區(qū)，土壤，淡水或海水過(guò)濾 物，熱泉或熱火出口周圍的沉積物，和海洋或港灣沉積物可用作供體生 物的來(lái)源。樣品可從海底，海面和潮間的海洋來(lái)源收集。樣品可從熱帶， 亞熱帶，溫帶和其它區(qū)域收集。供體生物可為嗜熱，嗜鹽，嗜酸，嗜壓 或甲烷微生物。
還優(yōu)選使用面臨滅絕可能性的生物，例如在熱帶雨林中發(fā)現(xiàn)的那些 植物和微生物。在這些棲息地正遭到破壞的情況下，可能產(chǎn)生有用藥物 的種類正在消失。
也可根據(jù)它們?cè)趥鹘y(tǒng)或合乎規(guī)格的藥物實(shí)踐中的用途來(lái)收集具有可 能藥物性質(zhì)的生物，包括藻類，地衣，真菌，植物和動(dòng)物。
在許多方面，希望用來(lái)自通常不適宜于傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)或開(kāi)發(fā)技術(shù)的 供體生物的遺傳物質(zhì)來(lái)構(gòu)建文庫(kù)。這些供體生物可具有一種或多種下面 特點(diǎn)：(i)該生物不能在實(shí)驗(yàn)室繁殖或培養(yǎng)；(ii)從自然界不能回 收足夠量的該生物來(lái)用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)；和/或(iii)該生物需要特殊條 件來(lái)產(chǎn)生未知或者適于工業(yè)化的所需化合物。后面的特點(diǎn)也描述了現(xiàn)存 培養(yǎng)物收集物中的生物，其中由于不適宜的培養(yǎng)條件，在常規(guī)篩選方法 中可能檢測(cè)不到藥物前驅(qū)。
為了構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)的目的，供體生物不需被分類鑒定或生化表征。 根據(jù)樣品的復(fù)雜性和藥物發(fā)現(xiàn)程序的需要，例如，需要供體種類的去復(fù) 制(dereplication)，可進(jìn)行可培養(yǎng)種類或來(lái)自環(huán)境樣品的代表組的鑒 定或遺傳足跡法。
在提取它們核酸之前，可將供體生物多聯(lián)體化或在實(shí)驗(yàn)室或田間培 養(yǎng)，為了制備cDNA，可能要求特殊的生長(zhǎng)條件或在培養(yǎng)基中存在一定 的化學(xué)物質(zhì)以誘導(dǎo)或增加編碼供體生物中的感興趣活性的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn) 錄。如果僅需要基因組DNA，可使用標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件來(lái)培養(yǎng)生物。
因?yàn)樵诃h(huán)境樣品中的所有供體生物不可能以相同速率繁殖，如果完 全在實(shí)驗(yàn)室條件下，一些供體生物可能過(guò)度生長(zhǎng)并導(dǎo)致?lián)p失或緩慢生長(zhǎng) 的微生物的稀釋。因此，可優(yōu)選不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的在先培養(yǎng)而直接從環(huán)境 樣品中的供體生物制備核酸。這在當(dāng)試圖得到無(wú)脊椎動(dòng)物，例如海綿的 次級(jí)代謝物時(shí)可能尤為有用，其中代謝物通常被認(rèn)為是由相關(guān)的共生和 不可培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生。從環(huán)境樣品中的供體生物制備高質(zhì)量的核酸的 方法提供在下面5.1.2節(jié)中。
本發(fā)明設(shè)想的供體生物可包括，但不局限于病毒；細(xì)菌；單細(xì)胞真 核生物，如酵母和原生動(dòng)物；藻類；真菌；植物；被囊動(dòng)物；苔蘚動(dòng)物； 蠕蟲(chóng)；棘皮動(dòng)物；昆蟲(chóng)；軟體動(dòng)物；魚(yú)類；兩棲動(dòng)物；爬行動(dòng)物；鳥(niǎo)類； 和哺乳動(dòng)物。供體生物的非限制性實(shí)例列于表I和II。
表I
細(xì)菌和真菌供體生物的實(shí)例表(Berdy?1974，實(shí)用微生物進(jìn)展， 18：309-406；Goodfellow等，1989，“微生物產(chǎn)品：新方法”， Cambridge?University?Press?343-383) 分類???????????????????屬 細(xì)菌 ??放線菌目?????????????鏈霉菌屬，單孢絲菌屬，Norcodia，馬杜拉放
???????????????????線菌屬，游動(dòng)放線菌屬，孢囊鏈霉菌屬，小雙
???????????????????孢菌屬，北里孢菌屬 ??真細(xì)菌目?????????????固氯菌屬，根瘤菌屬，無(wú)色細(xì)菌屬，腸桿菌屬，
???????????????????布魯氏菌屬，細(xì)球菌屬，乳酸桿菌屬，芽孢桿
???????????????????菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，短桿菌屬 ??假單孢菌目???????????假單孢菌屬，氣桿菌屬，弧菌屬，鹽桿菌屬 ??枝原體目?????????????枝原體屬 ??粘細(xì)菌目?????????????噬細(xì)胞菌，粘液球菌屬 真菌 ??Myxothallophytes?????絨泡菌屬，煤絨菌屬 ??藻形菌綱?????????????毛霉屬，疫霉屬，根霉屬 ??子囊菌綱?????????????曲霉屬，青霉屬 ??擔(dān)子菌綱?????????????鬼傘屬，Phanerochaete ??半知菌綱?????????????枝頂孢屬(頭孢子菌屬)，Trochoderma，長(zhǎng)
???????????????????孺孢屬，鐮孢霉屬，交鏈孢霉屬，漆斑菌屬 ??酵母?????????????????糖酵母屬
表II
?????高等形式的供體生物的實(shí)例 分類?????????????????????實(shí)例屬，化合物和特性 植物 ??藻類???????????????????海人草(紅藻氨酸，治蠕蟲(chóng)劑)
?????????????????????狹葉海帶(昆布氨酸，治低血壓) ??地衣???????????????????松羅(關(guān)耳酸，抗菌；地衣酸，抗腫瘤) ??高等植物???????????????長(zhǎng)春花屬(長(zhǎng)春花)，毛地黃屬(強(qiáng)心苷)，
?????????????????????鬼臼屬(鬼臼毒素)，紅豆杉屬(紫杉酚)，
?????????????????????粗榧屬(高三尖杉酯堿)，旱蓮木屬(喜樹(shù)
?????????????????????堿)，蒿屬(蒿素)，錦紫蘇屬(毛喉素)，
?????????????????????角絲鼓藻屬(鉀通道拮抗劑) 原生動(dòng)物門 ??甲藻???????????????????ptychodiscus?brevis(brevitoxin心血管性) ??昆蟲(chóng)???????????????????狡蛛屬(“盜蛛”毒液)，植瓢蟲(chóng)屬(墨西
?????????????????????哥豆瓢蟲(chóng)堿) ??苔蘚蟲(chóng)?????????????????苔蘚蟲(chóng)(bryostatins，抗腫瘤) ??軟體動(dòng)物???????????????芋螺 ??海綿???????????????????細(xì)芽海綿(ectyonin，抗菌)Cryptotethya
?????????????????????cryta(D?阿拉伯呋喃糖苷) ??珊瑚???????????????????Pseudoterogonia(pseudoteracins，抗炎癥)，
?????????????????????Erythropodium(erythrolides，抗炎癥) 蠕蟲(chóng) ??環(huán)節(jié)動(dòng)物門?????????????索沙蠶(沙蠶毒素，殺蟲(chóng)) ??Spinunculida???????????裂螠(裂螠素，神經(jīng)活性) 被囊動(dòng)物?????????????????Trididemnum?solidum(didemnin，抗腫瘤
?????????????????????和抗病毒)
?????????????????????Ecteinascidia?turbinata(ecteinascidins，抗
?????????????????????腫瘤) 魚(yú)類?????????????????????粘盲鰻(粘盲鰻毒素，刺激心臟)，龍?chǎng)?蛋
?????????????????????白質(zhì)毒素，降低血壓，呼吸以及減少心率) 兩棲動(dòng)物??????????樹(shù)棘蛙(蛙毒素，pumiliotoxins，
??????????????histrionicotoxins和其它聚胺) 爬行動(dòng)物??????????蛇毒液毒素 鳥(niǎo)類??????????????histrionicotoxins，修飾的類胡蘿卜素，類視色
??????????????素和甾族化合物(Goodwin?1984“類胡蘿卜
??????????????素的生物化學(xué)”Vol?II，Chapman和Hall，
??????????????New?York，pp?160-168) 哺乳動(dòng)物??????????鴨嘴獸(鴨嘴獸毒液)，修飾的類胡蘿卜素，
??????????????類視色素和甾族化合物(Goodwin?1984，
??????????????Supra?pp.173-185；Devlin?1982“生物化
??????????????學(xué)教科書(shū)”Wiley，New?York，p.750) 5.1.2.從供體生物制備高質(zhì)量的核酸
取決于生物的類型和樣品的來(lái)源，可通過(guò)各種方法從供體生物分離 核酸。為了構(gòu)建充分代表供體生物的遺傳信息的基因表達(dá)文庫(kù)，獲得沒(méi) 有缺刻，單鏈缺口和部分變性的高質(zhì)量核酸是非常重要的。為了制備高 質(zhì)量的核酸，本發(fā)明的方法提供樣品中的供體生物的溫和，快速和完全 溶胞，以及來(lái)自該生物的核酸酶和其它降解性蛋白質(zhì)的快速，完全失活。 初始的提取可在田間進(jìn)行以穩(wěn)定樣品中的核酸直至進(jìn)一步的分離步驟可 在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
任何核酸分離方法均要求供體生物充分地?cái)嗔选？刹捎迷S多標(biāo)準(zhǔn)方 法，包括在液氮下凝固，在存在玻璃或其它破裂劑時(shí)研磨，以及簡(jiǎn)單機(jī) 械剪切或酶消化。
對(duì)于混合物質(zhì)，例如土壤，或?qū)τ诤懈吆康膱?jiān)韌的物質(zhì)，例如 纖維素或幾丁質(zhì)(如在絲狀真菌和植物中)，可采用冷凍干燥使樣品脆 弱，從而使它更適合于破裂。該被冷凍干燥的物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間只保存具酶活 性以及高分子量物質(zhì)(例如核酸)(Gurney?1984，分子生物學(xué)方法， Vol.2，p?35-42，John?M.Malker編)。樣品可在液氮中被瞬間冷 凍。疏松的樣品，如土壤，可在細(xì)網(wǎng)或尼龍篩中冷凍。在真空下，可對(duì) 冷凍樣品進(jìn)行24-72小時(shí)的冷凍干燥?？蓪⒗鋬龈稍飿悠犯稍镔A存在 真空-70℃下。可能需要另外的步驟來(lái)制備環(huán)境樣品，例如濃縮微生物 種群(Jacobson等1982，實(shí)用環(huán)境微生物，58：2458-2462；Zhou 等1996，實(shí)用環(huán)境微生物，62：316-322；Somerville等1989， 實(shí)用環(huán)境微生物，55：548-554)。
本發(fā)明的一個(gè)基本方法，雖然當(dāng)然不是唯一所采用的，是對(duì)Chirgwin 等(1979，生物化學(xué)，24：5294)，Sadler等(1992，現(xiàn)代遺傳學(xué)， 21：409-416)和Foster(1991，博士論文，University?of?California， Santa?Barbara)的改進(jìn)。該方法使用強(qiáng)促溶劑，異硫氰酸胍和2-巰基 乙醇來(lái)使蛋白變性并使核酸酶失活，接著用氯化銫梯度離心來(lái)純化核酸 物質(zhì)。本文提供的方法與Chirgwin的方法所不同之處在于提取了DNA 和RNA。本發(fā)明的方法還包括了高速離心步驟，和選擇性地加入二苯酰 亞胺染料。取決于所采用的供體生物，另外的步驟可包括，但不局限于 用氯化十六烷基吡啶鎓氯化物或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)以選 擇性地去除多糖，用聚乙烯吡咯烷酮處理以去除苯酚，以及進(jìn)行纖維素 層析以去除淀粉和其它碳水化合物(Murray和Thompson，1980，核酸 研究8：4321-25)。
使用反轉(zhuǎn)錄酶可將從供體生物分離的RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA。
受損的核酸可能難于克隆，從而導(dǎo)致供體生物DNA的損失以及文庫(kù) 中低數(shù)目的克隆。如果宿主生物允許重組并且缺乏有效的內(nèi)源DNA修復(fù) 機(jī)制，那么問(wèn)題可被嚴(yán)重化。本發(fā)明還提供了使用在互補(bǔ)DNA第二條鏈 合成期間常用的酶促反應(yīng)可以在克隆前在體外修復(fù)受損的DNA (Sambrook等1989，“分子克隆”2版，章節(jié)8)。例如，可通過(guò) DNA聚合酶的Klenow片段和大腸桿菌DNA連接酶來(lái)修復(fù)DNA裂隙和 缺刻。這些酶促反應(yīng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
當(dāng)從由環(huán)境樣品提取的DNA制備重組表達(dá)文庫(kù)時(shí)，可獲得的DNA 量常常受到限制，并且在連接方法的選擇上是一個(gè)要考慮的問(wèn)題。如第 5.1.3.中所描述的，如果在提取或多聯(lián)體化之后它的量少(＜100μg)， DNA可被連接到高效克隆系統(tǒng)中，例如SuperCos。擴(kuò)增克隆中的插入片 段，并通過(guò)限制性酶消化從載體中釋放。由于環(huán)境DNA樣品的性質(zhì)，它 可能包含原核和真核供體生物，可能需要使用多個(gè)宿主生物。如果可獲 得足夠量的初始環(huán)境DNA樣品，或如果DNA已擴(kuò)增，DNA可被連接 到適宜于所需批表達(dá)宿主細(xì)胞的一批載體中的每一個(gè)中。優(yōu)選地，載體 具有在兩個(gè)或多個(gè)表達(dá)宿主之間穿梭的能力。 5.1.3.宿主生物和載體
本文所采用的術(shù)語(yǔ)“宿主生物”廣泛地包括單細(xì)胞生物，例如細(xì)菌， 和多細(xì)胞生物，如植物和動(dòng)物?？墒褂萌魏渭?xì)胞類型，包括在體外培養(yǎng) 或被遺傳改造的那些?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的任何宿主-載體系統(tǒng)可用于本 發(fā)明。使用可被復(fù)制并在多于一個(gè)的宿主生物中生存的穿梭載體是有利 的。
宿主生物或宿主細(xì)胞可從私人實(shí)驗(yàn)室保藏物，公共培養(yǎng)物中心，例 如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心或從商業(yè)供應(yīng)商處獲得。這些宿主生物或細(xì) 胞可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)被進(jìn)一步修飾而用于特定的用途。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選宿主生物或宿主細(xì)胞已被用于異源基因的表達(dá)， 并且被合理地很好地進(jìn)行了生物化學(xué)，生理和/或遺傳表征。這些宿主生 物可能已被通過(guò)常規(guī)的遺傳菌株改進(jìn)方法，培養(yǎng)方法，發(fā)酵方法和/或重 組DNA技術(shù)而使用。需使用已開(kāi)發(fā)用于大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程的供體生物，并 已知用于生長(zhǎng)和產(chǎn)生次級(jí)代謝物的條件。
可在標(biāo)準(zhǔn)的溫度，保溫時(shí)間，光強(qiáng)以及適應(yīng)于表達(dá)宿主的營(yíng)養(yǎng)和生 理需要的培養(yǎng)基組合物的條件下培養(yǎng)宿主生物。然而，用于維持和產(chǎn)生 文庫(kù)的條件可能與用于表達(dá)和篩選文庫(kù)的那些不同。改進(jìn)的培養(yǎng)條件和 培養(yǎng)基也可被用來(lái)模仿供體生物的一些營(yíng)養(yǎng)和生理特點(diǎn)，并且以便于產(chǎn) 生感興趣的代謝物。例如可在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中提供感興趣的化合物的化學(xué) 前體以便于修飾那些前體。本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)可被用來(lái)建立最佳的 條件。
宿主生物應(yīng)優(yōu)選缺乏進(jìn)行同源重組以及限制外源DNA的能力。宿主 生物應(yīng)優(yōu)選具有類似于供體生物的密碼子選擇。如果采用真核供體生 物，優(yōu)選宿主生物具有適當(dāng)加工供體信使RNA的能力，例如剪掉內(nèi)含 子。
優(yōu)選的原核宿主生物可包括，但不局限于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌， 變青鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌。也可使用酵母種類，例如啤酒糖酵母(發(fā) 面酵母)，粟酒裂殖糖酵母(裂殖酵母)，巴斯德畢赤氏酵母和多形漢 遜氏酵母(甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母)。還可采用絲狀子囊菌，例如粗糙鏈孢霉 和構(gòu)巢曲霉。優(yōu)選植物細(xì)胞，例如來(lái)自煙草屬和擬南芥屬的那些。優(yōu)選 的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不局限于來(lái)自人類，猴和嚙齒動(dòng)物，例如 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，NIH/3T3，COS，293，VERO等(見(jiàn) Kriegler?M.“基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”New?York，F(xiàn)reeman 和Co.1990)。
可選擇如所需的以特定方式修飾和加工表達(dá)的基因產(chǎn)物的宿主生 物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)對(duì)于蛋 白質(zhì)在生化途徑中的作用可能是非常重要的，可選擇適宜的細(xì)胞系或宿 主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的正確的修飾和加工。最后，如果供體 生物為真核生物，具有用于初級(jí)轉(zhuǎn)錄物正確和精確加工，糖基化和基因 產(chǎn)物的磷酸化的細(xì)胞器的真核宿主細(xì)胞可能是優(yōu)選的。
例如，已表明真核真菌具有許多相同的核心分子生物學(xué)，在最為常 見(jiàn)的真菌種類的許多種之間發(fā)生基因交換是有可能的(Gurr等1987， 真核微生物的基因結(jié)構(gòu)，Kinghorn編，p.93；Bennet和Lasure?1992， 真菌中的基因操作，Academic?Press，NY)。真核宿主生物的優(yōu)選實(shí) 例為裂體生殖的酵母，粟酒裂殖糖酵母。首先粟酒裂殖糖酵母的分子生 物學(xué)已被充分研究，許多主要的培養(yǎng)和純化方法和操作已被按常規(guī)進(jìn) 行。第二，它為單細(xì)胞，因此在實(shí)驗(yàn)室條件下能容易地被培養(yǎng)，貯存和 操作。第三，在用于表達(dá)混合的真核DNA中尤為重要，它能正確地剪接 和表達(dá)其它種類的真菌，植物和哺乳動(dòng)物的基因。對(duì)于異源核RNA(含 有內(nèi)含子的RNA)的剪接和加工的研究已說(shuō)明粟酒裂殖糖酵母與其它真 菌和高等直翅目具有顯著的用于剪接所需要的核內(nèi)小RNA(snRNA) 成分的類型和結(jié)構(gòu)的相似性。最后，許多非粟酒裂殖糖酵母啟動(dòng)子，其 中一些來(lái)自哺乳動(dòng)物和植物病毒，能適度地引起高水平的基因表達(dá) (Forsburg，1993，核酸研究，21：2955)。這一特征可允許真菌 DNA/cDNA文庫(kù)穿梭到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)宿主中，例如NIH3T3(成纖 維細(xì)胞)，GT1?7(神經(jīng)元)，或其它細(xì)胞類型。
克隆載體或表達(dá)載體可被用于將供體DNA導(dǎo)入用于表達(dá)的宿主生 物中。表達(dá)構(gòu)建物是含有可操作性地與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)相關(guān)的供體 DNA序列的表達(dá)載體。調(diào)節(jié)區(qū)可由供體DNA或載體來(lái)提供?？墒褂枚?種載體，它包括，但不局限于質(zhì)粒；粘粒；噬菌體質(zhì)粒嵌合體；人工染 色體，例如酵母人工染色體(YACs)，和細(xì)菌人工染色體(BACs， Shizuya等1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊89：8794-8797)或修飾的 病毒，但是載體一定要與宿主生物相容?？捎幂d體的非限制性實(shí)例為 λgt11，pWE15，SuperCosl(Stratagene)，pDblet(Brun等1995， 基因，164：173?177)，pBluescript(Stratagene)，CDM8，pJB8， pYAC3，pYAC4(參見(jiàn)分子生物學(xué)中的同前方法的附錄，1988，編者 Ausubel等，Greene?Publish.Assoc.和Wiley?Interscience，它在本文 被引作參考)。
當(dāng)宿主和供體生物的調(diào)節(jié)區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子相容時(shí)，供體的轉(zhuǎn)錄區(qū)將能 結(jié)合宿主因子，例如RNA聚合酶，以影響宿主生物中的轉(zhuǎn)錄。如果供體 和宿主生物不相容，與宿主生物相容的調(diào)節(jié)區(qū)可與供體DNA片段相連， 以保證被轉(zhuǎn)移的基因的表達(dá)。
在全部操縱子，包括它本身的翻譯起始密碼子，核糖體結(jié)合區(qū)和鄰 近的序列被插入到適宜的克隆或表達(dá)載體中的情況下，可不需要另外的 控制信號(hào)。然而，在僅有一部分基因的編碼序列被插入時(shí)，必然提供外 源的控制信號(hào)，包括翻譯起始密碼子(通常為ATG)和鄰近的序列。這 些外源的調(diào)節(jié)區(qū)和起始密碼子可為各種來(lái)源，天然的和合成的。組成型 和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)可被用于供體DNA的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物可能有毒 時(shí)，需要使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)適宜的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件的內(nèi)含物來(lái)提 高表達(dá)的效率(參見(jiàn)Bittner等1987，酶學(xué)方法153：516-544)。
“可操作性相聯(lián)”指一種聯(lián)系，其中調(diào)節(jié)區(qū)和將要表達(dá)的DNA序列 以允許轉(zhuǎn)錄和最終翻譯的方式連接和定位。基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)的精 確性質(zhì)可隨生物與生物而變化。通常，需要能結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)可 操作性相聯(lián)的核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些調(diào)節(jié)區(qū)可包括5′-非密碼序 列參與轉(zhuǎn)錄和翻譯開(kāi)始的那些，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列 等。非編碼區(qū)3′至編碼序列也可被保留或復(fù)制它的轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列， 例如終止子和多聚腺苷?；稽c(diǎn)。當(dāng)它們以允許兩個(gè)序列轉(zhuǎn)錄至相同的 RNA轉(zhuǎn)錄物上或允許在一個(gè)序列中已開(kāi)始的RNA轉(zhuǎn)錄物擴(kuò)展到第二個(gè) 序列中的方式相互發(fā)生聯(lián)系時(shí)一個(gè)核酸分子的兩個(gè)序列被說(shuō)成“可操作 性地相聯(lián)”。由此可產(chǎn)生多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄物。如果在啟動(dòng)子處開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄 將產(chǎn)生可操作性相聯(lián)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，那么兩個(gè)或多個(gè)序列，例如啟 動(dòng)子和任何其它的核酸序列為可操作性相聯(lián)。為了成為“可操作性相 聯(lián)”，兩個(gè)序列必需是不相互緊鄰。
此外，表達(dá)載體可含有用于初始分離，鑒定或追蹤包含供體DNA的 宿主生物的可選擇或可篩選的標(biāo)記基因。表達(dá)載體也可提供唯一的或方 便被定位的限制性位點(diǎn)以允許保存和/或重排部分表達(dá)構(gòu)建物中的DNA 插入片段。
表達(dá)載體可含有允許載體在一個(gè)或多個(gè)宿主生物中存在和/或復(fù) 制，或載體整合到宿主染色體上的序列。這些序列可包括，但不局限于， 復(fù)制區(qū)，自動(dòng)復(fù)制序列(ARS)，著絲粒DNA和端粒DNA。結(jié)果，在 宿主生物中可產(chǎn)生和保存一個(gè)或多個(gè)拷貝表達(dá)文庫(kù)。表達(dá)構(gòu)建物可整合 在宿主基因組中或宿主生物中保持游離。
通常，使用穿梭載體可能是有利的，該穿梭載體可在至少兩種宿主 生物中復(fù)制和生存，例如，如細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)菌和酵母，細(xì)菌 和植物細(xì)胞或革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。穿梭載體可含有寬的宿主 范圍復(fù)制起點(diǎn)，例如來(lái)自IncP，IncQ質(zhì)粒的那些，或至少兩個(gè)或多個(gè) 復(fù)制區(qū)。穿梭載體還可包含來(lái)自天然產(chǎn)生的質(zhì)粒的序列，它可被用來(lái)借 助于接合轉(zhuǎn)移將文庫(kù)遷移到各種相容的宿主生物中(Hayman等， 1993，質(zhì)粒30：251-257)。通過(guò)使用穿梭載體來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，供體 生物的DNA序列可容易地被復(fù)制并從一個(gè)宿主生物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主 生物中。
例如，一個(gè)優(yōu)選的典型的表達(dá)載體-宿主生物的結(jié)合為粘粒， SuperCos?1和大腸桿菌菌株，XLl-Blue?MR，它們均可購(gòu)自Stratagene (La?Jolla，CA)。載體通過(guò)BamHI克隆位點(diǎn)接受大小變化范圍為30 -42?kbp的DNA插入片段，并帶有新霉素抗性標(biāo)記(neoR)和用于在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的SV40啟動(dòng)子。載體還含有在原核細(xì)胞中用于選擇 的氨芐青霉素抗性基因。大腸桿菌宿主生物缺乏某些限制系統(tǒng)(hsdR， mcrA，mcrCB和mrr)，內(nèi)切核酸酶(endA1)缺陷，并為重組缺陷 (recA)。宿主生物不能酶切帶有半胱氨酸和/或腺嘌呤甲基化的插入片 段，該插入片段通常存在于真核DNA和使用甲基dNTP類似物合成的 cDNA中。
該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括在體外將高效λ包裝系統(tǒng)用于初始在限性負(fù)，recA 負(fù)大腸桿菌宿主中產(chǎn)生文庫(kù)。由于來(lái)源的性質(zhì)，基因組DNA可能少于裸 露DNA轉(zhuǎn)化所需的量，包裝的基因組DNA插入片段可被保護(hù)免于降解。 一旦在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)，受損的插入片段可被宿主細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī) 制所修復(fù)。該系統(tǒng)僅需要少量起始基因組DNA(5-10μg)，并且由 于包裝系統(tǒng)僅接受某一大小范圍的插入片段，所以可能不需要大小選 擇。大腸桿菌中的初始文庫(kù)可被擴(kuò)增以產(chǎn)生超螺旋粘粒DNA，該粘粒 DNA可用于導(dǎo)入其它表達(dá)宿主生物中的高效轉(zhuǎn)化方法中。
通過(guò)置換用鏈霉菌的復(fù)制起點(diǎn)(例如來(lái)自質(zhì)粒pIJ?101或pIJ?922) 和硫鏈絲菌肽抗性基因置換復(fù)制的SV40起點(diǎn)和neoR基因可對(duì)SuperCos 1載體進(jìn)行進(jìn)一步修飾以用于在鏈霉菌宿主中的克隆。該穿梭載體稱為 Streptocos(見(jiàn)圖6A)，它通過(guò)用KpnI和HindIII消化，從含有pIJ?101 起點(diǎn)和硫鏈絲菌肽抗性基因的pIJ?699(Hopwood等，1985，鏈霉菌的 遺傳操作，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，The?John?Innes?Foundation)分離4.0?kb 片段而構(gòu)建。該片段在KpnI位點(diǎn)被末端平齊化，并在SamI-HindIII限 制性位點(diǎn)被克隆在SuperCos中(參見(jiàn)Bierman?1992，相關(guān)實(shí)例見(jiàn)Denis 1992)。此外，可借助于接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入序列成分用于穿梭粘粒的遷移 (Bierman等1992，基因416：43-49)。含有鏈霉菌特異性啟動(dòng) 子的不同的Streptocos形式可被在鄰近BamHI克隆位點(diǎn)處導(dǎo)入載體中。 通過(guò)使用PCR，可產(chǎn)生能被直接克隆至SuperCOS?1的NotI/EcoRI位點(diǎn) 的鏈霉菌啟動(dòng)子片段?？墒褂枚喾N已知的鏈霉菌啟動(dòng)子，包括ermE， Pptr(1995，分子生物學(xué)，17：989)和hrdB(Buttner，M.J.1989， 分子生物學(xué)，Vol.3，pp.1653-1659)。這個(gè)方法通常可用于大范圍 的宿主-載體系統(tǒng)。因此，如果需要，可通過(guò)導(dǎo)入宿主復(fù)制起點(diǎn)，可選 擇的標(biāo)記基因和同源啟動(dòng)子對(duì)SuperCos?1進(jìn)行修飾。
對(duì)于使用植物細(xì)胞作為宿主的組合基因表達(dá)文庫(kù)，供體編碼序列的 表達(dá)可由多種啟動(dòng)子的任一種來(lái)引發(fā)。例如，優(yōu)選的菌株描述在基因操 作原理1985，R.W.OLD和S.B.Primrose?3rd編者Blackwell?Scientific Pub；載體：分子克隆載體和它們的用途的研究1988，R.L. Rodriquez，D.T.Denhardt，Butterworths?Pub.；分子克隆實(shí)用指南 1988，B.Perbal，John?Wiley和Sons，病毒啟動(dòng)子，例如CaMV的 35S?RNA和19S?RNA啟動(dòng)子(Brisson等1984，自然310：511- 514)，或可采用TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子；另一方面，可使用植物啟動(dòng) 子，例如RuBISCo的小亞基(Coruzzi等，1984，EMBO?J.3：1671 -1680；Broglie等1984，科學(xué)224：838-843)；或熱休克啟動(dòng) 子，例如大豆hsp?17.5-E?hsp?17.3-B(Gurley等1986，分子細(xì)胞 生物學(xué)6：559-565)。
植物細(xì)胞和原生質(zhì)體均可用作宿主細(xì)胞。植物宿主可包括，但不局 限于，玉米，小麥，稻，大豆，番茄，煙草，胡蘿卜，花生，土豆，甜 菜，向日葵，薯芋，擬南芥，油菜和矮牽牛的細(xì)胞。由于沒(méi)有細(xì)胞壁并 且它們可能隨著細(xì)胞培養(yǎng)物而增生，并再生為植物，所以優(yōu)選植物原生 質(zhì)體。
此外，重組構(gòu)建物可包括植物可表達(dá)的可選擇或可篩選的標(biāo)記基 因，它包括，但不局限于使其具有抗生素抗性(例如卡那霉素或潮霉素 抗性)或除草劑抗性(例如抗磺酰脲，phosphinothricin，或草甘膦)的 基因。可篩選的標(biāo)記包括，但不局限于編碼β-葡糖醛酸酶(Jefferson， 1987，植物分子生物學(xué)，Rep5：387-405)，熒光素酶(Ow等1986， 科學(xué)234：856-859)，和調(diào)節(jié)花色素苷顏料產(chǎn)生的B蛋白(Goff 等1990，EMBOJ9：2517?2522)的基因。
為了將供體生物DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，可采用用于轉(zhuǎn)化植物的根癌土 壤桿菌系統(tǒng)。這種以T-DNA為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)化載體的恰當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)和構(gòu)建對(duì) 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講是熟知的。這些轉(zhuǎn)化選擇使用二元土壤桿菌T -DNA載體(Bevan，1984，核酸研究12：8711-8721)，和共 培養(yǎng)方法(Horsch等1985，科學(xué)227：1229-1231)。通常，土壤 桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被用于遺傳改造雙子葉植物(Bevan等，1982，Ann.Rev. Genet?16：357-384，Rogers等1986，酶學(xué)方法118：627-641)， 但它也可被用于轉(zhuǎn)化以及將DNA轉(zhuǎn)移至單子葉植物和植物細(xì)胞中(參見(jiàn) Hernalsteen等1984，EMBOJ3：3039-3041；Hooykassvan?Slogteren 等1984，自然311：763-764；Grimsley等1987，自然325：1677 -1679；Boulton等1989，植物分子生物學(xué)12：31-40；Gould等 1991，植物生理學(xué)95：426-434)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可使用各種用于將重組核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植 物細(xì)胞的其它方法。在目標(biāo)為單子葉植物細(xì)胞時(shí)，這些其它方法尤為有 用。其它基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化方法包括，但不局限于，通過(guò)鈣-，聚乙二醇 (PEG)-或電穿孔介導(dǎo)的裸露DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn) Paszkowski等1984，EMBOJ3：2717-2722，Potrykus等1985， 分子和普通遺傳學(xué)199：169-177；Fromm等1985，美國(guó)國(guó)家科學(xué) 院院刊82：5824-5828；Shimamoto，1989，自然338：274- 276)和植物組織的電穿孔(D′Halluin等，1992，植物細(xì)胞4：1495 -1505)。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的另外的方法包括顯微注射，碳化硅介導(dǎo)的 DNA攝入(Kaeppler等，1990，植物細(xì)胞報(bào)道9：415-418)，和 微彈轟擊法(參見(jiàn)Klein等1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊85：4305- 4309；Gordon-Kamm等，1990，植物細(xì)胞2：603-618)。
對(duì)于植物分子生物學(xué)技術(shù)的綜述參見(jiàn)，例如Weissbach和Weissbach， 1988，植物分子生物學(xué)方法，Academic?Press，NY，節(jié)VIII，pp.421 -463；和Grierson和Corey，1988，植物分子生物學(xué)，2d?Ed.， Blackie，London，Ch.7-9。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜核蛾多角體病毒(AcNPV)，一種桿狀 病毒被用作載體來(lái)在草地夜蛾細(xì)胞中表達(dá)供體基因。供體DNA序列可被 克隆至病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)并置于AcNPV啟動(dòng)子的 控制下(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)。接著這些重組病毒被用來(lái)感染其中 插入基因被表達(dá)的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)Smith等1983，病毒學(xué)雜志46： 584；Smith美國(guó)專利號(hào)4,215,051)。
在酵母中，多種含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體可與啤酒糖酵母 (Saccharomyces?cerevisiae)(發(fā)面酵母)，粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomyces?pombe)(裂殖酵母)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和多形漢遜氏酵母(Hansenula?polymorpha)(漢遜酵母) 一起使用。對(duì)于綜述，參見(jiàn)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法Vol.2，1988，Ed. Ausubel等，Greene?Publish.Assoc和Wiley?Interscience，Ch.13； Grant等1987，酵母的表達(dá)和分泌載體，在酵學(xué)方法中，Eds?Wu和 Grossman，1987，Acad?Press，N.Y，Vol.153，pp.516-544； Glover，1986，DNA克隆，Vol.II，IRL?Press，Wash，D.C.，Ch. 3；和Bitter，1987，酵母中的異種基因表達(dá)，酶學(xué)方法，Eds.Berger和 Kimmel，Acad.Press.N.Y.，Vol.152，pp.673-684；和糖酵母 的分子生物學(xué)，1982，Eds.Strathern等，Cold?Spring?Harbor?Press， Vols.I和II。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，多種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可商業(yè)購(gòu)得。此外， 可利用大量以病毒為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒被用作表達(dá)載體的情況 下，可將供體DNA序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)復(fù)合物上，如后期 啟動(dòng)子和三分裂的前導(dǎo)序列。接著可通過(guò)體外或體內(nèi)重組將嵌合基因插 入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)(例如區(qū)E1或E3)的插 入片段將產(chǎn)生能在被感染的宿主中存活并能表達(dá)異源產(chǎn)物的重組病毒 (例如，參見(jiàn)Logan和Shenk，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊81：3655 -3659)。Epstein-Barr病毒(EBV)的復(fù)制起點(diǎn)(Orip)和作為 反式作用復(fù)制因子的EBNA-1被用于產(chǎn)生穿梭游離基因克隆載體，例 如EBO-pCD(Spickofsky等1990，DNA?Prot?Eng?Tech?2：14 -18)。以反轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)的病毒載體也可被采用(Morgenstern等 1989，核酸科學(xué)年評(píng)，12：47-65)。另一方面，可采用痘苗7.5K 啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如Mackett等，1982，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊79：7415 -7419；Mackett等1984，病毒學(xué)雜志49：857-864；Panicali等 1982，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊79：4927?4931)。
可采用多種選擇系統(tǒng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括，但不局限于單純皰 疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細(xì)胞11：223)，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌 呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 院刊48：2026)，和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等1980，細(xì)胞 22：817)基因可分別用于tk，hgprt或aprt細(xì)胞中。而且，抗代謝 物抗性可用作選擇二氫葉酸還原酶(dhfr)的基礎(chǔ)，它可使具有氨甲蝶 呤抗性(Wigler等，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊77：3567；O′Hare 等1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊78：1527)；gpt，它可使具有霉酚醛 抗性(Mulligan和Berg，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊78：2072)； 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)，可使具有氨基糖苷G-418抗性(Colberre -Garapin等1981，分子生物學(xué)雜志150：1)；和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (hyg)，它可使具有潮霉素抗性(Santerre等1984，基因30：147)。
本發(fā)明還提供了改進(jìn)組合基因表達(dá)文庫(kù)性能的對(duì)宿主生物的特定修 飾。當(dāng)文庫(kù)被用于產(chǎn)生次級(jí)代謝物的目的時(shí)，化合物的毒性可導(dǎo)致未能 充分代表文庫(kù)中的這些具有生產(chǎn)力的宿主生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案中可將宿主生物修飾，這樣宿主生物的生長(zhǎng)和存活受到感興趣化合物 的產(chǎn)生的不利影響少。提高的耐受量可減少在篩選階段以及生產(chǎn)階段正 在產(chǎn)生可能的藥物的宿主生物的損失。
宿主生物的一個(gè)優(yōu)選的修飾是在宿主生物中引入和/或過(guò)量產(chǎn)生活 性藥物外排系統(tǒng)。膜相關(guān)的能量驅(qū)動(dòng)外排在大多數(shù)生物中的藥物抗性中 起著主要作用，這些生物包括細(xì)菌，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Nikaido 1994，科學(xué)264：382-388；Balzi等1994，生物化學(xué)生物物理進(jìn) 展1187：152-162；Gottesman等1993，生物化學(xué)年評(píng)62：385)。 具有增強(qiáng)補(bǔ)充的外排系統(tǒng)的被修飾的宿主生物可活躍地分泌較大范圍的 可能的毒性化合物，因此降低了它在宿主生物中的積累?？杀苊?a href='/zhuanli/list-20096-1.html' target='_blank'>負(fù)反饋 機(jī)制，例如產(chǎn)生化合物的代謝途徑的終產(chǎn)物抑制。而且因?yàn)楦信d趣的化 合物沒(méi)有在宿主生物內(nèi)部積累，所以對(duì)化合物的分離可能變得更為有 效。
在細(xì)菌中，已研究了大量外排(efflux)系統(tǒng)，這些外排系統(tǒng)可排 出大范圍的結(jié)構(gòu)不相關(guān)的分子，從例如聚酮化合物抗生素(大腸桿菌的 AcrAE基團(tuán)，Ma等1993，細(xì)菌學(xué)雜志175：6299-6313)，熒光 喹啉和溴化乙錠(枯草芽孢桿菌的bmr和金黃色葡萄球菌的norA， Neyfakh等1993，抗微生物劑化學(xué)37：128-129)，阿霉素(戊霉 素輪絲鏈霉菌的drr)，至叔胺(產(chǎn)氣克雷白氏桿菌的qacE和大腸桿菌 的mvrC)。外排系統(tǒng)的非限制性實(shí)施方案表見(jiàn)表III。任一這種外排系 統(tǒng)可用于原核宿主生物。
在酵母中，許多使具有多效性藥物抗性的基因編碼外排系統(tǒng)，并且 可用于本發(fā)明。例如bfrl+基因?qū)⒉祭追堑戮谹抗性傳給粟酒裂殖糖 酵母，并且白色假絲酵母的CDR1基因傳遞環(huán)己酰胺和氯霉素抗性 (Prasad等1995，Curr?Genet27：320-329)。
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可使用屬于ATP-結(jié)合泵蛋白類的多藥抗性蛋 白質(zhì)(Juranka等1989，F(xiàn)ASEBJ，3：2583-2592；Paulusma等1996， 科學(xué)271：1126-1128；Zaman等1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，91： 8822-8826；Breuninger等1995，癌癥研究55：5342-5347， Koepsell?EP?0699753)。人mdr1多種藥物抗性基因已在發(fā)面酵母中功 能表達(dá)(Kuchler等1992，美國(guó)科學(xué)院院刊89：2302-2306)。任 何其它的外排系統(tǒng)也可用于真核細(xì)胞。
表III
由活性藥物流出系統(tǒng)分泌的化合物表 化合物類型?????????具體名稱??????????外排系統(tǒng) 陽(yáng)離子染料?????????若丹明-6G?????????bmr
???????????????溴化乙錠
???????????????吖啶黃素??????????acrAE 堿性抗生素?????????嘌呤霉素??????????bmr
???????????????阿霉素????????????drr，mdr 親水抗生素?????????新生霉素??????????acrAE
???????????????大環(huán)內(nèi)酯 疏水抗生素????????β內(nèi)酰胺類 有機(jī)陽(yáng)離子????????四裝基鏻???????????bmr 不帶電荷??????????紫杉醇?????????????mdr
??????????????氯霉素?????????????bmr 弱酸性????????????萘啶酮酸???????????emr
??????????????絲紫霉素???????????mdr 兩性離子??????????氟喹啉類???????????bmr 洗滌劑????????????SDS????????????????acrAE
可將一種或多種外排系統(tǒng)引入，誘導(dǎo)或過(guò)度產(chǎn)生到宿主生物中?？?將編碼外排系統(tǒng)組成的基因?qū)胨拗魃镏胁⑹褂蒙鲜霰磉_(dá)載體和方法 使其表達(dá)。在一些情況下，使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)外排系統(tǒng)基因是有 利的。 5.1.4.組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)
本發(fā)明涉及組合基因表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和用途，其中宿主生物含有編 碼天然生化途徑或其一部分的來(lái)自多種供體生物的遺傳物質(zhì)，并且能產(chǎn) 生供體生物的功能性基因產(chǎn)物。由此，供體生物的生化途徑或其一部分 在各個(gè)宿主生物的文庫(kù)中被功能性地重新構(gòu)建。新活性和這些生化途徑 的化合物可更易于通過(guò)藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)或本文提供的方法來(lái)篩選。
DNA或RNA可被用作起始遺傳物質(zhì)用來(lái)制備這些文庫(kù)，其中這些 文庫(kù)可包括cDNA文庫(kù)，基因組DNA文庫(kù)以及混合的cDNA/基因組DNA 文庫(kù)。來(lái)自例如在5.1.1中描述的多種供體生物的DNA片段被導(dǎo)入宿主 生物庫(kù)中，這樣庫(kù)中的各個(gè)宿主生物均含有來(lái)自一個(gè)供體生物的DNA片 段。
如果宿主生物和供體生物具有某些遺傳特征，則可能是有利的，例 如DNA類似的GC含量和共同的RNA剪接機(jī)理，或生理特征，如最適 生長(zhǎng)溫度。因此可能需要使用與供體生物發(fā)育遺傳學(xué)緊密相關(guān)的宿主生 物。例如，可能更需要原核宿主生物來(lái)克隆和表達(dá)其它原核操縱子。
不適于傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)或藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)的供體生物可能是優(yōu)選的。例 如，大多數(shù)海洋細(xì)菌未被很好地表征，并且不適于常規(guī)陸生微生物學(xué)方 法。本發(fā)明可簡(jiǎn)化生產(chǎn)和純化過(guò)程的開(kāi)發(fā)。
轉(zhuǎn)移的供體DNA片段可包含編碼完整生化途徑的功能性蛋白質(zhì)或 其一部分的編碼區(qū)以及自然相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)，例如啟動(dòng)子和終止子。通過(guò) 使用具有較大的編碼全部生化途徑可能性的大的原核基因組DNA片段 可獲得最佳結(jié)果。如果轉(zhuǎn)移的DNA片段的自然功能和結(jié)構(gòu)在宿主生物中 保存，那么供體生物的基因可被相應(yīng)地表達(dá)。還提供了外源調(diào)節(jié)區(qū)，該 調(diào)節(jié)區(qū)可與DNA片段相連以確保宿主生物中的被轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，從而 代替或補(bǔ)充了從天然啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄。
令人感興趣的是，已發(fā)現(xiàn)許多來(lái)自海洋細(xì)菌的基因在大腸桿菌中使 用天然啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)功能性蛋白。因此，海洋微生物的基因甚至可在不 需要使用外源調(diào)節(jié)區(qū)時(shí)表達(dá)。在大腸桿菌中使用其天然啟動(dòng)子的海洋細(xì) 菌的基因的實(shí)施方案表提供在表IV中。
表IV
在大腸桿菌中使用其天然啟動(dòng)子的海洋細(xì)菌基因表 基因??????????????屬和種????????????????參考文獻(xiàn) κ-角叉菜膠酶?????食鹿角菜交替單孢菌????Barbeyron等1994，基因 (cgkA)????????????革蘭氏(-)需氧?????????139：105-109 Na+/H+反向運(yùn)輸????解藻朊酸弧菌??????????Nakamura等，1994，生 (NhaA)??????????????????????????????????物化學(xué)和生物物理進(jìn)展
????????????????????????????????????1190：465-468 磷酸二酯酶???????費(fèi)氏弧菌，兩棲?????????Dunlap等，1993，細(xì)菌 (cpdP)??????????????????????????????????學(xué)雜志175(15)：
????????????????????????????????????4615-4624 幾丁質(zhì)???????????交替單孢菌類，?????????Tsujibo等，1993，細(xì)菌
?????????????菌株0-7????????????????學(xué)雜志175(1)：
?????????????176-181 氯化三丁基???????交替單孢菌類，M-1，????Fukagawa等，1993，生 錫抗性???????????革蘭氏(-)Rod???????????物化學(xué)和生物物理研究
????????????????????????????????????194(2)：733-740 dagA-互補(bǔ)????????河豚毒素交替單孢菌?????Macleod等，1992，分子
?????????????革蘭氏(-)??????????????微生物學(xué)6(18)：
?????????????2673-2681 弧菌溶胞素???????解蛋白弧菌David等，1992，基因， (nprV)???????????革蘭氏(-)??????????????112：107-112 四環(huán)素抗性???????殺鮭弧菌???????????????Sorum等，1992，化學(xué)
?????????????需氧???????????????????分子學(xué)36(3)：
?????????????611-615 黑素合成?????????考氏殺瓦氏菌???????????Fuqua等，1991，基因， (melA)???????????革蘭氏(-)附生??????????109：131-136 DNA修飾多酶系統(tǒng)??生絲單孢菌?????????????Danaher等，1990，
?????????????喜溫???????????????????基因，89：129-133
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法利用了將原核生物，如細(xì) 菌的基因組織進(jìn)入基因組中的各個(gè)獨(dú)立的功能性相關(guān)的基因簇，稱為操 縱子中的方式。在這些簇中，編碼生化途徑的組成的基因一起與共同的 調(diào)節(jié)區(qū)相連。絲狀真菌(放線菌)中的功能性相關(guān)的基因也被已知聚簇 化。許多細(xì)菌和放線菌的基因簇，以及少量真核真菌生物合成途徑已被 分離和表征。例如，用于在草生歐文氏桿菌中從頭合成產(chǎn)生類胡蘿卜素 玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的十二種蛋白質(zhì)可在細(xì)菌大腸桿菌中活化和同步 產(chǎn)生(Perry等，1986，細(xì)菌學(xué)雜志168：607-612；Hundle等1991， 光化學(xué)和光生物學(xué)54：1：89-93)。此外，在獨(dú)立的簇中還含有原 核生物氨基酸生物合成途徑，例如亮氨酸和異亮氨酸的生物合成以及葡 萄糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，因此，原核生物被用作供體生物時(shí)，在生物合成途徑中 功能性相關(guān)的基因可能在一個(gè)克隆中被分離。
優(yōu)選具有含有相對(duì)少量非編碼區(qū)的緊密基因組的供體生物。在許多 方面，供體生物為具有相對(duì)小的基因組的細(xì)菌，例如對(duì)于大腸桿菌為4400 kbp長(zhǎng)度，以及對(duì)于古細(xì)菌為2500-3500kbp。從下面公式計(jì)算在文庫(kù) 中要求達(dá)到99％的可能含有供體基因組的全部序列的獨(dú)立克隆的數(shù)目 (Clarke等，1976，細(xì)胞9：91-99)： 其中
N＝文庫(kù)中必需的重組克隆的數(shù)目
p＝序列重新出現(xiàn)的可能性
f＝在單個(gè)重組克隆中基因組的百分比
例如大腸桿菌具有約4400kbp的DNA；粘粒載體可包裝約40kbp 的DNA。根據(jù)這些計(jì)算，大腸桿菌的全部基因組可望在粘粒文庫(kù)中的少 達(dá)504個(gè)克隆中被全部表示。因?yàn)橥ǔ５腄NA文庫(kù)可包含500,000獨(dú)立 的重組克隆，所以每一個(gè)這樣的文庫(kù)可有效地代表高達(dá)1,000個(gè)不同的 具有類似于大腸桿菌基因組的細(xì)菌種類的基因組。因此，通過(guò)篩選包括 1,000或更多種細(xì)菌的不同的遺傳物質(zhì)的基因表達(dá)文庫(kù)，可有效地產(chǎn)生 和估價(jià)相當(dāng)多的化學(xué)多樣性。
在普通文獻(xiàn)中描述的方法之后，例如Maniatis等1989，分子克隆， 第2版，Cold?Spring?harbor?Press，New?York；和Ausubel等， 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，Greene?Publishing?Associates?and?Wiley Interscience，New?York，可接著進(jìn)行用于構(gòu)建重組基因表達(dá)文庫(kù)的常 規(guī)分子生物學(xué)反應(yīng)。
重組天然途徑基因表達(dá)文庫(kù)的克隆步驟示于圖3中。來(lái)自供體生物 的任何細(xì)胞均可作為用于構(gòu)建基因表達(dá)文庫(kù)的核酸來(lái)源?？墒褂没蚪M DNA，它包括染色體DNA以及染色體外遺傳物質(zhì)，例如天然產(chǎn)生的質(zhì) 粒。另一方面，可使用供體生物的RNA。優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方 法提取純化信使RNA(mRNA)并轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA(cDNA)。寡聚 (dT)引物和任意序列引物可用于引發(fā)cDNA的首鏈合成?？蛇x擇性地 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA插入片段。
可通過(guò)5.1.2部分提供的方法或通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法提取和純 化基因組DNA和RNA。對(duì)于絲狀真菌和細(xì)菌，這些方法可包含包括下 面方法a)，b)或c)的多種方法中的任一種，其中a)快速SDS/原 生質(zhì)體的高鹽溶胞作用和立即用平衡的苯酚萃取，其中原生質(zhì)體從生長(zhǎng) 在液體培養(yǎng)基中的幼小的菌絲體制備；b)在并硫氰酸胍中進(jìn)行原生質(zhì) 體的快速溶胞作用，接著在Cscl梯度中超離心；或c)從在瓊脂糖填料 中制備的原生質(zhì)體分離高分子量DNA，并進(jìn)行脈沖電場(chǎng)凝膠電泳。對(duì)于 細(xì)菌，通過(guò)溶菌酶/去污劑的另一種溶胞方法，與非特異性蛋白酶一起保 溫，接著用一系列苯酚/氯仿/異戊醇萃取可能是有用的。
對(duì)于最佳結(jié)果，優(yōu)選大的任意原核生物基因組DNA片段來(lái)更大可能 性地含有全部操縱子或其本質(zhì)的部分?？墒褂酶鞣N限制性酶在特定位點(diǎn) 酶切基因組DNA。通過(guò)將基因組DNA用常見(jiàn)的切割限制酶部分消化來(lái) 產(chǎn)生任意大的DNA片段(大于20kbp)。所需的基因組DNA的量根據(jù) 使用的基因組的復(fù)雜性而變化。另一方面，DNA可被物理性地剪切，例 如通過(guò)細(xì)孔針或超聲處理。
在插入空的表達(dá)載體之前，可根據(jù)大小通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法分離這些DNA 插入片段，這些方法包括但不局限于，瓊脂糖凝膠電泳，動(dòng)態(tài)密度梯度 離心和柱層析。優(yōu)選10-40％線性蔗糖梯度。通過(guò)將DNA片段連接 到具有互補(bǔ)粘性末端的表達(dá)載體中可完成插入。用于連接反應(yīng)的載體 DNA和DNA插入片段的量取決于它們的相對(duì)大小，并且可通過(guò)現(xiàn)有技 術(shù)中已知的方法來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。然而，如果用于斷裂DNA的互補(bǔ)限制 位點(diǎn)不存在于表達(dá)載體中，可酶促修飾DNA分子的末端，例如產(chǎn)生平末 端。另外，可通過(guò)將核苷酸序列，即接頭或銜接物連接到DNA末端上來(lái) 產(chǎn)生所需的任何位點(diǎn)；這些被連接的接頭或銜接物可包含編碼限制性內(nèi) 切酶識(shí)別序列的特異性化學(xué)合成的寡核苷酸。在另一種方法中，可通過(guò) 同聚物加尾來(lái)修飾酶切的表達(dá)載體和DNA插入片段。
在將載體DNA連接到DNA插入片段中后，將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入宿主 生物，可采用多種方法，包括，但不局限于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，感染，接合， 原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，電穿孔，顯微注射和微彈轟擊法。 在具體的實(shí)施方案中，通過(guò)在體外將DNA包裝到噬菌體顆粒中，接著讓 這些顆粒感染大腸桿菌細(xì)胞來(lái)將噬菌體或粘粒DNA導(dǎo)入大腸桿菌宿 主。還可利用其它天然發(fā)生的微生物之間的DNA轉(zhuǎn)移機(jī)理，例如細(xì)菌接 合。
在收集含有表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞形成文庫(kù)后，可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已 知的方法擴(kuò)增和/或復(fù)制它們。擴(kuò)增的目的是提供可被使用多次的文庫(kù)。 通過(guò)挑取文庫(kù)，使細(xì)菌生長(zhǎng)，并收集噬菌體或細(xì)菌用于貯存可完成擴(kuò)增。
另外，可以規(guī)定的順序貯存文庫(kù)。大塊的文庫(kù)可在低密度時(shí)挑出平 板培養(yǎng)以使其形成單個(gè)，獨(dú)立的噬菌斑或菌落，接著將各噬菌斑或菌落 轉(zhuǎn)移到編碼的多孔主板的各孔中，例如96-孔平板或384-孔平板。在 適宜條件下讓各菌群在孔中生長(zhǎng)。編碼的主板可被用作將各克隆分別復(fù) 制到一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)平板中的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源。因此，可對(duì)文庫(kù)中的各個(gè)克 隆分別進(jìn)行處理和分析?？蓪⒕幋a的數(shù)據(jù)庫(kù)平板包被并貯藏以用于將來(lái) 的用途?？捎枚噌槒?fù)制基因或用于流體處理的多通道裝置。優(yōu)選地通過(guò) 實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)操作儀進(jìn)行全部或大多數(shù)的轉(zhuǎn)移和操作(Bentley等1992， 基因組12：534-541)。
可通過(guò)冷凍干燥，或在冷藏箱中深低溫保藏(-10℃～-100℃)或在 液氮(-176℃～-196℃)下保存本發(fā)明的文庫(kù)。
根據(jù)采用的宿主-載體系統(tǒng)，可通過(guò)多種方法鑒定和選擇在文庫(kù)中 含有供體DNA的宿主生物。在一種方法中，根據(jù)存在或不存在標(biāo)記基因 的功能來(lái)鑒定和選擇這些宿主生物，例如胸苷激酶活性，抗生素抗性， 例如卡那霉素，氨芐青霉素，博萊霉素或硫鏈絲菌肽抗性，產(chǎn)生色素， 例如黑素，以及氨甲蝶呤抗性。另一方面，可采用通過(guò)代謝試驗(yàn)，組織 培養(yǎng)物中的聚集點(diǎn)的形成或桿狀病毒中包函體的形成所指明的宿主生物 表型或代謝的變化。一旦對(duì)存在供體DNA的情況進(jìn)行了選擇，可用克隆 進(jìn)行一系列酶促分析或代謝試驗(yàn)以進(jìn)一步表征。
為了表征含有供體DNA或其一部分的克隆文庫(kù)中的供體DNA插入 片段，可用代表組的克隆進(jìn)行DNA的微量制備和限制性分析。結(jié)果將提 供供體DNA大小的指紋圖譜和可被認(rèn)為是文庫(kù)期望的插入片段DNA的 范圍和大小的限制性圖譜。 5.1.5.組合嵌合途徑表征文庫(kù)
本發(fā)明還涉及組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和用途，其中宿主生物 含有來(lái)自一種或多種供體生物的任意多聯(lián)體化的遺傳物質(zhì)，并且能產(chǎn)生 供體生物的功能性基因產(chǎn)物。文庫(kù)大量的宿主生物可含有來(lái)自一種或多 種供體生物的任意和唯一的基因組合。被轉(zhuǎn)移基因的共表達(dá)可受它們各 自天然的調(diào)節(jié)區(qū)或外源提供的調(diào)節(jié)區(qū)的作用。在宿主生物中，來(lái)自不同 供體生物的多種基因產(chǎn)物相互作用產(chǎn)生新的嵌合代謝途徑和新化合物。 這些嵌合途徑的新的活性及化合物通過(guò)常規(guī)藥物發(fā)現(xiàn)方法或本文提供的 方法可變得更適合于篩選。
不受在組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)中如何產(chǎn)生新途徑或化合物的任 何理論所束縛，來(lái)自一種或多種供體生物的功能性異種基因的共表達(dá)促 使體內(nèi)基因產(chǎn)物互相作用，以及與宿主生物的組成成分相互作用。通過(guò) 這些相互作用，產(chǎn)生新種類的生化反應(yīng)，其中一些可一齊作用形成嵌合 生化途徑。異源基因產(chǎn)物可遇到不存在于它們各自供體生物中的底物， 輔因子，和產(chǎn)生信號(hào)的分子。這些底物，輔因子和產(chǎn)生信號(hào)的分子可由 宿主生物提供，由在相同宿主生物中共表達(dá)的其它異源基因產(chǎn)物提供， 或來(lái)自培養(yǎng)基。
而且，一些異源基因產(chǎn)物可被結(jié)構(gòu)修飾，和在宿主生物的生物合成 期間被不同地區(qū)室化和局部化。一些異源基因產(chǎn)物可被暴露于不同于它 們各自供體的宿主細(xì)胞環(huán)境。
可以預(yù)測(cè)一些異源基因產(chǎn)物還可對(duì)宿主生物產(chǎn)生作用并改變宿主細(xì) 胞環(huán)境?？捎绊?，或受異源基因產(chǎn)物的作用影響的宿主細(xì)胞環(huán)境的因素 包括，但不局限于鹽濃度，微量元素，營(yíng)養(yǎng)物，氧，代謝物，能量來(lái)源， 氧化還原狀態(tài)和pH。一些異源基因產(chǎn)物還可與宿主基因產(chǎn)物相互作用， 從而可導(dǎo)致宿主代謝途徑的改變。
取決于異源基因的組合，不存在于自然界的新的嵌合生化途徑和新 種類的化合物可在宿主生物文庫(kù)中形成。在組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)中， 供體生物的遺傳資源被增殖并被擴(kuò)增，從而提供不可能在各生物中發(fā)現(xiàn) 的多種化學(xué)結(jié)構(gòu)。如此制備的文庫(kù)可使用常規(guī)方法或本發(fā)明提供的方法 來(lái)篩選。因此，新的途徑和化合物被變得更適合于藥物篩選。
描述在5.1.1.中的任何供體生物可被用于制備組合嵌合途徑表達(dá)文 庫(kù)。可根據(jù)它們已知的生物學(xué)特性來(lái)篩選供體生物，或它們可為已知和/ 或未鑒定的生物的混合物。
本發(fā)明的組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)可根據(jù)節(jié)5.1.3中描述的原理來(lái)進(jìn) 行裝配。為了使來(lái)自多種供體生物的DNA片段任意地多聯(lián)體化，可通過(guò) 包括下面步驟對(duì)文庫(kù)裝配方法進(jìn)行改選：產(chǎn)生較小基因組DNA片段，與 調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子和終止子連接以形成基因盒，并且多聯(lián)體化基因 盒。
插入片段DNA可為來(lái)自mRNA的cDNA，和/或基因組DNA片段。 可同時(shí)純化不同種類的供體生物的DNA或RNA，或分別分離它們并接 著以特定比例混合。可在插入到克隆或表達(dá)載體之前的任何階段進(jìn)行插 入DNA的任意混合。
可在cDNA合成中使用甲基化的核苷酸，例如5-甲基-dCTP以 提供抗酶促酶切的保護(hù)，并且允許在相對(duì)于啟動(dòng)子和終止子片段為有義 方向的cDNA插入片段的定向克隆。
可通過(guò)用具有相對(duì)高頻率的切割位點(diǎn)，如Sau3AI的限制酶部分消化 來(lái)產(chǎn)生為2-7kbp范圍的基因組DNA的任意片段。通過(guò)將樣品的等分 試樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)監(jiān)測(cè)和證實(shí)部分消化。
可提供外源調(diào)節(jié)區(qū)，例如組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和終止子來(lái)引起被 轉(zhuǎn)移的基因的表達(dá)。當(dāng)宿主和供體表達(dá)系統(tǒng)不相容時(shí)，必需提供這些調(diào) 節(jié)系列。PCR可用來(lái)產(chǎn)生對(duì)于特定表達(dá)宿主為特異性的，并且在它們的 末端已定義了限制位點(diǎn)的各種啟動(dòng)子和終止子片段。可采用將調(diào)節(jié)區(qū)與 DNA插入片段相連接的任何方法?？刹捎糜肒lenow片段和部分組的核 苷酸處理，即填補(bǔ)反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生僅特異性連接到具有相容末端的啟動(dòng)子和 終止子上的插入DNA片段。
本發(fā)明提供一種涉及包含反向定位在唯一的限制位點(diǎn)各側(cè)的兩個(gè)拷 貝的啟動(dòng)子的基因盒的應(yīng)用方法，插入到這個(gè)限制位點(diǎn)的任何DNA將分 別通過(guò)來(lái)自兩側(cè)的兩個(gè)啟動(dòng)子在兩條鏈上轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還提供另一種涉及包含位于DNA插入片段各側(cè)的啟動(dòng)子和 終止子的基因盒的應(yīng)用方法。如果進(jìn)行cDNA定向克隆的方法，cDNA 插入片段的5′末端和3′末端將分別具有唯一匹配的帶有啟動(dòng)子片段的3′ 末端和終止子片段的5′末端的限制位點(diǎn)。
在兩個(gè)末端具有相容的限制位點(diǎn)的基因組DNA片段或cDNA被連接 到啟動(dòng)子上，并且在一些情況下，連接到終止子片段上，從而形成具有 平均大小均為1-10kbp的基因盒。
通過(guò)類似于在肽合成中所采用的方法裝配包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的多聯(lián) 體。在一個(gè)末端將基因盒庫(kù)的一個(gè)亞組結(jié)合到固相，例如磁珠上。將其 它流離末端進(jìn)行幾次連續(xù)的“去保護(hù)”循環(huán)和一系列轉(zhuǎn)錄單元剩余庫(kù)的 連接。每次加入循環(huán)后，固體使得多聯(lián)體從未被連接的DNA片段中分 離。當(dāng)完成多聯(lián)體化后，通過(guò)用限制酶保溫釋放多聯(lián)體，例如內(nèi)含子核 酸酶，它酶切固相附近的唯一的非常稀少的位點(diǎn)以降低酶切多聯(lián)體化的 DNA的可能性。接著可將多聯(lián)體化的DNA插入克隆載體中以形成被導(dǎo) 入適宜宿主生物中的表達(dá)構(gòu)建物；另一方面，在導(dǎo)入宿主生物之前，可 將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到用于擴(kuò)增的大腸桿菌recA負(fù)鏈菌株中。
有關(guān)啟動(dòng)子和終止子片段的合成，基因盒的制備，DNA插入片段的 裝配以及插入片段和載體的連接的詳細(xì)情況提供在第5.4和5.5中。
一旦裝配了組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)，則它可基本上以節(jié)5.1.3中描 述的相同方式貯存，擴(kuò)增，復(fù)制，預(yù)篩選和篩選。 5.1.6.偏倚性組合表達(dá)文庫(kù)
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，可一起從一種或多種供體生 物中收集的預(yù)選擇的DNA片段制備偏倚性組合天然或嵌合途徑表達(dá)文 庫(kù)。替代僅使用供體生物全部收集的基因DNA或cDNA，該方法將減少 需要被篩選的克隆數(shù)目并增加將產(chǎn)生感興趣化合物的克隆的百分?jǐn)?shù)。預(yù) 選擇的DNA片段包含編碼部分或全部生物合成途徑的基因，并且可通過(guò) 將從可能與產(chǎn)生感興趣化合物相關(guān)或參與其中的已知基因制備的多個(gè)探 針與初始DNA文庫(kù)雜交來(lái)預(yù)選擇。初始DNA文庫(kù)，優(yōu)選粘粒文庫(kù)并且 不一定必需為表達(dá)文庫(kù)，可包含來(lái)自一種或多種供體生物的DNA。為了 進(jìn)一步的預(yù)篩選，如果初始文庫(kù)為表達(dá)文庫(kù)，那么可將陽(yáng)性克隆中的DNA 轉(zhuǎn)移至用于制備的宿主中并在其中表達(dá)，例如大腸桿菌或淺青紫鏈霉 菌。可預(yù)篩選多于一個(gè)的初始文庫(kù)，而且可收集來(lái)自所有陽(yáng)性克隆的 DNA，并用于制備偏倚性組合基因表達(dá)文庫(kù)。
可擴(kuò)增初始文庫(kù)，這樣可在多種宿主生物中預(yù)篩選供體生物的 DNA。例如，一旦產(chǎn)生了鏈霉菌中的基因表達(dá)文庫(kù)，可將它導(dǎo)入用于表 達(dá)和篩選的特定的宿主生物，例如產(chǎn)生氧四環(huán)素的S.rimosis，或產(chǎn)生放 線菌素的S.parlus。如果表達(dá)載體包含天然發(fā)生的質(zhì)粒中的用于基因轉(zhuǎn) 移的適宜的序列，這些序列可被用來(lái)借助于接合轉(zhuǎn)移將文庫(kù)遷移到各種 相容宿主中。
用于預(yù)篩選的探針可來(lái)自任何克隆的生物合成途徑，例如聚酮化合 物生物合成位點(diǎn)，因?yàn)檫@些是最好識(shí)別的生物合成位點(diǎn)，并且在已知的 簇中之間具有相當(dāng)多的序列保守，例如actI(放線紅素的生物合成- Malpartida等，1987自然325：818-820)，WhiE(孢子色素的生 物合成-Blanco等，1993基因130：107-16)和eryAl(Donadio 等，1991科學(xué)252，675-679)。類似的原理可用于其它抗生素或 次級(jí)代謝生物合成位點(diǎn)。例如低GC革蘭氏陽(yáng)性菌中克隆的肽合成酶基 因，例如枯草芽孢桿菌(Stachelhaus等，1995科學(xué)269：69-72) 以及高GC革蘭氏陽(yáng)性菌，例如產(chǎn)生硫鏈絲菌肽，維吉尼亞霉素，纈氨 霉素和放線菌素的放線菌種類可具有類似于用作探針以識(shí)別兩組細(xì)菌中 的新的生物合成位點(diǎn)的足夠的序列。其它克隆的生物合成途徑，例如肽 合成酶和氨基糖苷合成酶，也可提供用于預(yù)篩選初始文庫(kù)的探針。
另一方面，可通過(guò)來(lái)自編碼參與次級(jí)代謝的蛋白質(zhì)的DNA的探針篩 選初始DNA文庫(kù)?？赏ㄟ^(guò)從全部DNA中除去非編碼DNA和編碼與初 級(jí)代謝生物合成途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的DNA來(lái)制備這些探針。剩余的DNA 由此偏向于編碼參與次級(jí)代謝的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。除去步驟的詳細(xì)情況 提供在節(jié)5.3.5中。 5.2.篩選組合表達(dá)文庫(kù)
本發(fā)明的藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進(jìn)一步包括篩選組合表達(dá)文庫(kù)的新方法。在 篩選表達(dá)文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如抗體結(jié)合和配體結(jié)合也可與本發(fā)明的表 達(dá)文庫(kù)一起使用的同時(shí)，可將文庫(kù)適應(yīng)于被加尾以識(shí)別正在表達(dá)所需途 徑和代謝產(chǎn)物的宿主生物的報(bào)道方式。
本文要求保護(hù)的方法能在進(jìn)行最少量的處理以允許文庫(kù)中具有生產(chǎn) 力的克隆的有效和高流通量的檢測(cè)和分離時(shí)進(jìn)行大量樣品的管理。可預(yù) 篩選文庫(kù)的廣范圍的活性，產(chǎn)生的一類化合物或相關(guān)DNA序列的存在。 在體內(nèi)和體外分析中，文庫(kù)也可與靶一起直接使用。已識(shí)別或分離的細(xì) 胞群可容易地培養(yǎng)，進(jìn)行數(shù)量擴(kuò)增，并進(jìn)行對(duì)產(chǎn)生新化合物的進(jìn)一步分 析。編碼導(dǎo)致產(chǎn)生新活性或化合物的代謝途徑的基因可通過(guò)表征被導(dǎo)入 被分離克隆中的遺傳物質(zhì)來(lái)描述。有關(guān)基因和途徑的信息以及克隆將大 大便于藥物最優(yōu)化和生產(chǎn)
如本文所采用，術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)克隆”或“文庫(kù)細(xì)胞”指含有至少一個(gè) 可能編碼供體代謝途徑或其一部分的供體DNA片段的組合基因表達(dá)文 庫(kù)中的宿主細(xì)胞或生物。術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性克隆”或“陽(yáng)性細(xì)胞”指根據(jù)報(bào)道 范圍產(chǎn)生信號(hào)的文庫(kù)克隆或細(xì)胞，術(shù)語(yǔ)“有生產(chǎn)力的細(xì)胞”或“有生產(chǎn) 力的克隆”指不同于文庫(kù)中其余的“沒(méi)有生產(chǎn)力的細(xì)胞”，文庫(kù)中產(chǎn)生 感興趣活性或化合物的宿主細(xì)胞或生物。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)篩選”指表明感興趣的活性或化合物或基因的存在的一般 的生物或生化分析。術(shù)語(yǔ)“篩選”指針對(duì)特定的疾病或臨床病癥并且采 用靶的特定的以治療為目的的生物或生化分析。術(shù)語(yǔ)“靶”通常指整個(gè) 細(xì)胞以及大分子，例如酶，在篩選中試驗(yàn)化合物暴露于其中。預(yù)篩選和 篩選的應(yīng)用通常包括顏色指和器的肉眼檢測(cè)或自動(dòng)相分析，通過(guò)熒光活 化細(xì)胞分選的熒光檢測(cè)(FACS)或使用在存在報(bào)道范圍時(shí)在文庫(kù)細(xì)胞 群中進(jìn)行的磁細(xì)胞分選系統(tǒng)(MACS)。
本發(fā)明方法提供另一種但不相互排斥的產(chǎn)生用于檢測(cè)和分離這些感 興趣細(xì)胞目的的與有生產(chǎn)力的細(xì)胞相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)的方法。報(bào)道物可 為促使直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的分子。例如，報(bào)道物可為光發(fā)射分 子，或可被報(bào)道范圍的其它成分特異性識(shí)別的細(xì)胞表面分子。報(bào)道范圍 包括報(bào)道物和促使和支持報(bào)道物產(chǎn)生信號(hào)的復(fù)合物，報(bào)道范圍可包括活 的指示細(xì)胞或其一部分。可將報(bào)道范圍的成分摻入到文庫(kù)的宿主生物 中，或它們可在通透性的半固體培養(yǎng)基中與單個(gè)或文庫(kù)細(xì)胞庫(kù)一起被共 包被，形成用于篩選的獨(dú)立的單元。
為了易于在下文中描述的感興趣的化合物的檢測(cè)，可將吸收性物 質(zhì)，例如天然樹(shù)脂，如Diaion?HP?20或Amberlite?XAD-8樹(shù)脂加入 到文庫(kù)細(xì)胞的培養(yǎng)物中(Lam等，1995，工業(yè)微生物雜志15：453 456)。因?yàn)樵S多次級(jí)代謝物為疏水性分子，這些代謝物的釋放或分泌可 能導(dǎo)致在細(xì)胞外部產(chǎn)生沉淀。培養(yǎng)基中的這些樹(shù)脂的內(nèi)含物導(dǎo)致在樹(shù)脂 中發(fā)生多價(jià)螯合作用，該樹(shù)脂可被從培養(yǎng)基中除去以用于洗脫和篩選。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物被操作包含化學(xué)應(yīng)答構(gòu)建 物，該化學(xué)應(yīng)答構(gòu)建物包含編碼可操作性地與對(duì)在表達(dá)文庫(kù)中將要篩選 的所需類型的化合物或代謝物產(chǎn)生應(yīng)答的化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子相關(guān)的報(bào)道分 子的基因。在存在所需活性或化合物時(shí)，陽(yáng)性克隆中的化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子 被誘導(dǎo)啟動(dòng)可操作性相聯(lián)的報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)由于報(bào)道基 因的表達(dá)產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)來(lái)識(shí)別。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用在各個(gè)細(xì)胞中，由于存在所需活性或 化合物，作為對(duì)生理性變化產(chǎn)生應(yīng)答而產(chǎn)生信號(hào)的生理性探針。該探針 可為報(bào)道分子的前體，該前體通過(guò)被尋找的生化途徑中的活性或化合物 被直接或間接轉(zhuǎn)化為報(bào)道分子。在與有生產(chǎn)力的細(xì)胞接觸時(shí)，生理性探 針或報(bào)道前體產(chǎn)生促使有生產(chǎn)力細(xì)胞的識(shí)別和/或分離的可檢測(cè)信號(hào)。接 觸可通過(guò)直接將探針或前體加入到文庫(kù)細(xì)胞中來(lái)完成。另一方面，接觸 可通過(guò)包被作用和在篩選期間將探針或前體擴(kuò)散到文庫(kù)細(xì)胞中來(lái)完成。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，指示細(xì)胞可被用于報(bào)告所需活性或 化合物的產(chǎn)生，從而能夠識(shí)別和/或分離文庫(kù)中的有生產(chǎn)力的細(xì)胞?？蓪?全部活的或固定的指示細(xì)胞，或其細(xì)胞的某些部分與各文庫(kù)細(xì)胞或文庫(kù) 細(xì)胞庫(kù)混合或共包被。根據(jù)它們對(duì)所需活性或化合物的存在產(chǎn)生應(yīng)答的 生物學(xué)特征來(lái)選擇指示細(xì)胞。指示細(xì)胞可為所需化合物的靶細(xì)胞。另一 方面，可將指示細(xì)胞與報(bào)道物一起使用以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
在全面表征宿主生物，如有可能全面表征供體生物之后，選擇各文 庫(kù)的預(yù)篩選和篩選。其中宿主生物為陽(yáng)性的分析是不合格的，而其中供 體生物為陽(yáng)性的分析被認(rèn)為是可接受的文庫(kù)預(yù)篩選或篩選。優(yōu)選為與所 需生物合成能力有關(guān)的酶的靶的底物可被用作表明在特定克隆中存在 DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯活性的另一個(gè)不相關(guān)的靶(例如淀粉酶，β-半乳糖苷 酶)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素抗性可被用作產(chǎn)生或可能產(chǎn) 生感興趣次級(jí)代謝物的指示物。當(dāng)文庫(kù)克隆被置于一組抗生素中時(shí)，抗 生素抗性可表明存在自我保護(hù)機(jī)制，例如外排泵，它通常作為對(duì)自體毒 性的保護(hù)在次級(jí)代謝物生物合成途徑附近被發(fā)現(xiàn)。這些克隆在檢測(cè)時(shí)可 能不表現(xiàn)出產(chǎn)生次級(jí)代謝物，但具有增加的含有可如所需地被進(jìn)一步操 作或檢測(cè)的相鄰的生物合成途徑的可能性。
本發(fā)明還提供取代在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)菌而在有限的空間培養(yǎng)細(xì)胞的 包被的有效的高流通量的方法。平板形式的活細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)室和實(shí)體密集 形式的，而包被的細(xì)胞可容易地在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是各種分 開(kāi)的細(xì)胞被放在一起，并由此而易于檢測(cè)感興趣的次級(jí)代謝物。包被的 另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能用文庫(kù)細(xì)胞包被報(bào)道范圍的成分和/或其它指示細(xì)胞，這 樣可在獨(dú)立的單元中進(jìn)行預(yù)篩選或篩選。細(xì)胞的包被作用可容易地通過(guò) 使用物質(zhì)，如瓊脂糖，藻酸或角叉菜膠的熱或離子凝膠化作用來(lái)進(jìn)行。
FACS是一種熟知的根據(jù)顆粒的熒光特性分離顆粒(1-130μm大 小)的方法(Kamarch，1987，酶學(xué)方法，151：150-165)。FACS 的工作原理是各顆粒中的熒光部分的激光激發(fā)。陽(yáng)性熒光導(dǎo)致將少量電 荷傳給顆粒。這種變化使得能從混合物中將陽(yáng)性和陰性顆粒進(jìn)行電磁分 離。被分離的顆粒可被直接積累到96孔或384孔平板中的各孔中。
MACS是一種熟知的根據(jù)它們與磁微球體(0.5-100μm直徑)的 結(jié)合能力分離顆粒劑的方法(Dynal，1995)。對(duì)磁微球體可以進(jìn)行多 種有用的改變，包括共價(jià)加上特異性識(shí)別細(xì)胞表面抗原或半抗原的抗 體。另一方面，對(duì)于被包被細(xì)胞的磁化，可將報(bào)道范圍摻入產(chǎn)生磁報(bào)道 蛋白質(zhì)如鐵蛋白的宿主細(xì)胞中。在這種情況下，產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的包被細(xì) 胞起磁微球體的作用?？蓪⑦x擇的微球體暴露磁場(chǎng)中而進(jìn)行物理性處 理。例如，可通過(guò)將磁鐵放在反應(yīng)容器的外面來(lái)將選擇的微球體進(jìn)行多 價(jià)螯合。 5.2.1.報(bào)道構(gòu)建物
根據(jù)本發(fā)明，文庫(kù)中的宿主生物可被改造包含含有可操作性地與報(bào) 道基因相關(guān)的化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子的化學(xué)應(yīng)答報(bào)道構(gòu)建物。宿主生物和/或構(gòu) 建物可包含其它編碼參與調(diào)節(jié)來(lái)自化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄或信號(hào)產(chǎn)生的 輔佐蛋白質(zhì)的基因。
化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子為任何雙鏈DNA序列，它能結(jié)合RNA聚合酶，并 僅在存在某些種類的活性或某些種類的化合物時(shí)啟動(dòng)或調(diào)節(jié)可操作性相 聯(lián)的報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，在不存在誘導(dǎo)活性或化合物時(shí)，在宿主 生物中化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子沒(méi)有或僅具有低水平的組成型背景轉(zhuǎn)錄活性。還 可使用通過(guò)降低或減小轉(zhuǎn)錄活性對(duì)活性或化合物的存在產(chǎn)生消極應(yīng)答的 化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng)子。
用于本發(fā)明的啟動(dòng)子可包括，但不局限于，用于代謝途徑，生物降 解途徑，細(xì)胞色素和應(yīng)激反應(yīng)的啟動(dòng)子(Orser等，1995，體外毒物學(xué) 8：71-85)，例如熱激蛋白。例如，可采用假單孢菌TOL質(zhì)粒間位 裂解途徑的Pm啟動(dòng)子和它的通過(guò)一系列苯甲酸鹽和鹵素或烷基芳基化 合物誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)的陽(yáng)性調(diào)節(jié)子X(jué)ylS蛋白(Ramos等，1988，F(xiàn)EBS?Letters 226：241-246；de?Lorenzo等，1993基因130：41-46；Ramos 等，1986，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊83：8467?8471；Mermod等， 1986，細(xì)菌學(xué)雜志167：447-454)。其它非限制性的化學(xué)應(yīng)答啟動(dòng) 子的實(shí)例為與磷酸鹽的利用有關(guān)的啟動(dòng)子(Metcalf等，1993，細(xì)菌學(xué) 雜志175：3430?3442)，對(duì)順-順粘康酸敏感的啟動(dòng)子(Rothmel， 1990)；對(duì)抗生素和水楊酸敏感的啟動(dòng)子(Cohen等，1993，細(xì)菌學(xué) 雜志，175：7856-7862；Cohen等，1993，細(xì)菌學(xué)雜志，175： 1484-1492)，來(lái)自砷酸鹽的啟動(dòng)子和來(lái)自金黃色葡萄球菌的鎘操縱子 (Corbisier等，1993，F(xiàn)EBS?Letters?110：231-238)；SfiA (Quillardet等，1982，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊79：5971-5975)， zwf(Orser等，1995，上文)。
報(bào)道基因編碼能直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子。這包括產(chǎn) 生顏色或產(chǎn)生磁性的報(bào)道分子以及任何發(fā)光的報(bào)道物，例如生物發(fā)光 物，可使用化學(xué)發(fā)光或熒光蛋白質(zhì)，它包括，但不局限于Victoria aequona的綠色熒光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994，科學(xué)263：802 -805)，具有增強(qiáng)熒光的改進(jìn)的GFP(Heim等，1995，自然373： 663-4)，哈氏弧菌的熒光素酶(LuxAB基因產(chǎn)物)(Karp，1989， 生物化學(xué)生物物理進(jìn)展1007：84?90；Stewart等，1992，普通生 物學(xué)雜志，138：1289-1300)，和來(lái)自熒火蟲(chóng)，photinus?pyralis 的熒光素酶(De?wet等，1987，分子細(xì)胞生物學(xué)7：725-737)。 可使用任何產(chǎn)生熒光或產(chǎn)生顏色的酶，它包括但不局限于β-半乳糖苷 酶(LacZ，Nolan等，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊85：2603-2607)； 和堿性磷酸酶。可使用任何細(xì)胞表面抗原，例如，大腸桿菌硫氧還蛋白 -鞭毛蛋白融合蛋白，即大腸桿菌的以與大腸桿菌鞭毛表面的鞭毛蛋白 (fliC基因)形成的融合蛋白形式表達(dá)的硫氧還蛋白(trxA基因)(Lu 等，1995，生物/技術(shù)13：366-372)。
本文提供的化學(xué)應(yīng)答報(bào)道構(gòu)建物的實(shí)例為pERD-20-GFP，它包 含假單孢菌的Pm啟動(dòng)子和XylS基因(Ramos等，1988，F(xiàn)EBS?Letter 226：241-2476)，它們對(duì)某些類型的苯甲酸鹽產(chǎn)生應(yīng)答，從而導(dǎo)致 報(bào)道物GFP的轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達(dá))(見(jiàn)圖6)。
不同的啟動(dòng)子序列可通過(guò)PCR產(chǎn)生并與GFP或鞭毛蛋白-硫氧還蛋 白報(bào)道物的編碼區(qū)相連?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的DNA純化方法從有關(guān)種類純化包 含感興趣的啟動(dòng)子的基因組和質(zhì)粒DNA，并再懸浮于TE中。可對(duì)應(yīng)于 具有限制位點(diǎn)的另外序列的啟動(dòng)子區(qū)的5′和3′邊界合成引物以易化亞克 隆。在已確定為對(duì)于選擇的模板和引物為可接受的條件下，在熱循環(huán)器 中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，并使用TA克隆 盒(Invitrogen，La?Jolla)進(jìn)行亞克隆??擴(kuò)增的啟動(dòng)子系列可被再克 隆到本文中的通常目的的克隆載體的GFP或鞭毛蛋白-硫氧還蛋白的5′ 端。 5.2.2.生理性探針和報(bào)道前體
本文所采用的生理性探針為熒光或產(chǎn)生顏色的試劑，它們?cè)诮佑|或 進(jìn)入時(shí)，產(chǎn)生對(duì)文庫(kù)細(xì)胞或指示細(xì)胞的生理性和/或代謝參數(shù)的變化發(fā)生 應(yīng)答的信號(hào)。
探針可以為與熒光試劑相連的酶底物。例如，可以將熒光烷基醚與 這些細(xì)胞一起保溫。如果細(xì)胞產(chǎn)生多芳香烴，該烴類可誘導(dǎo)微粒體脫烴 酶，該酶本身酶切熒光烷基醚，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
熒光探針可被選擇用來(lái)檢測(cè)下列生理和代謝參數(shù)的變化，例如，但 不局限于Shechter等(1982，F(xiàn)EBS?Letters?139：121-124)，和 Bronstein等(生物化學(xué)年評(píng)219：169-81)中描述的那些。
??????????????原因???????????????????菌株/底物 代謝活性??????????具體實(shí)例???????????????(化合物類型) 膜電位降低????????壓力，損傷??????????????BacLight菌株
??????????????(異丙醇)????????????????(半滲透核酸染色) 細(xì)胞內(nèi)pH??????????生理性變化??????????????BCECF-AM(親脂性的
??????????????????????????????????????氟苯酚的乙酸基甲酯) 細(xì)胞色素介導(dǎo)的????通過(guò)多芳香烴(萘)對(duì)??????7-乙氧基-十七烷基 氧化作用的增加????微粒體的脫烴酶的誘導(dǎo)????香豆素(熒光烷基醚) 5.2.3.文庫(kù)的預(yù)篩選和篩選
本發(fā)明的組合基因表達(dá)文庫(kù)可通過(guò)多種方法來(lái)預(yù)篩選或篩選，這些 方法包括，但不局限于，肉眼觀察，自動(dòng)成像分析，與分子標(biāo)記DNA探 針雜交(Tyaei等1996，自然生物技術(shù)，14：303-308)熒光激活細(xì) 胞分選(FACS)和磁細(xì)胞分選(MACS)。篩選可在未擴(kuò)增或擴(kuò)增文 庫(kù)的大體積培養(yǎng)物中進(jìn)行。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，在預(yù)篩選或篩選期間，將各個(gè)文庫(kù)細(xì) 胞或細(xì)胞庫(kù)以小滴形式包被在惰性，穩(wěn)定和多孔的半固體基質(zhì)中。半固 體基質(zhì)對(duì)氣體，液體以及大分子是可滲透的，并且允許包被的細(xì)胞生長(zhǎng) 和分裂。適宜基質(zhì)的實(shí)施方案可包括，但不局限于瓊脂糖，藻酸和角叉 菜膠?？梢孕〉涡问脚囵B(yǎng)和檢測(cè)包被的文庫(kù)細(xì)胞，并保持可肉眼觀察， 這樣可從小滴中回收細(xì)胞用來(lái)進(jìn)一步操作?；|(zhì)可任選暴露于例如抗生 素的物質(zhì)中，該物質(zhì)可選擇包含可選擇性標(biāo)記的文庫(kù)細(xì)胞。還可將小滴 置于營(yíng)養(yǎng)物中以支持文庫(kù)細(xì)胞的生長(zhǎng)。下面實(shí)施方案用來(lái)說(shuō)明并且不以 任何方式限制本發(fā)明。
可用許多方法進(jìn)行包被作用，根據(jù)在后來(lái)的預(yù)篩選或篩選期間采用 的檢測(cè)方法，制備粗滴(0.5-2.5mm的滴)或微滴(10-250μm的 滴)。在形成滴的過(guò)程中，可以控制滴的大小和組成。優(yōu)選地，各粗滴 或微滴包含1至5個(gè)文庫(kù)細(xì)胞。
例如，可按如下使用藻酸鈉制備粗滴：使用壓力混合器以2000rpm 將藻酸鈉以1％的濃度溶解在100ml無(wú)菌水中。將1體積的大腸桿菌或 酵母的文庫(kù)細(xì)胞，例如粟酒裂殖糖酵母和糖酵母類；或鏈霉菌類的孢子， 枯草芽孢桿菌和絲狀真菌，例如曲霉和鏈孢霉類加入到藻酸鈉溶液中， 這樣每滴中包被了1-5個(gè)細(xì)胞。讓混合物靜置至少30分鐘放氣，接著 通過(guò)導(dǎo)致形成獨(dú)立的液滴的任何裝置擠出。其中一種裝置為具有25個(gè)計(jì) 量針頭的注射器。通過(guò)將藻酸鈉溶液滴加到裝有135mM氯化鈣溶液的輕 輕攪拌的燒杯中形成液滴。讓小滴固化10分鐘，接著轉(zhuǎn)移到除去了氯化 鈣溶液而以適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基取代的滅菌燒瓶中。包被的文庫(kù)細(xì)胞可在標(biāo) 準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)。
可通過(guò)產(chǎn)生小滴的任何方法或設(shè)備來(lái)制備微滴。例如，但不局限于 兩相環(huán)形噴霧器，靜電液滴發(fā)生器，震蕩孔流系統(tǒng)和乳化作用?，F(xiàn)有技 術(shù)熟知其它制備半固體滴的方法；參見(jiàn)例Weaver，美國(guó)專利號(hào)4,399, 219。
下面的實(shí)施方案是使用乳化技術(shù)制備微滴的例子(Monshipouri等 1995，微包被雜志12：255-262)。使用為2000rpm的壓力混合器， 將0.6g多磷酸鈉和2％藻酸鈉溶解于100ml無(wú)菌水中，讓藻酸鈉溶液放 氣60分鐘。通過(guò)將300ml油，例如鹽酸組胺酸或橄欖油與1.0g純化的 大豆卵磷脂混合至少30分鐘制備油相。通過(guò)超聲處理至少15分鐘來(lái)制 備在10ml?50％乙二醇中包含1.9g硫酸鈣的漿。在導(dǎo)入油相之前立即 將該漿和1體積的將產(chǎn)生每滴1-5個(gè)細(xì)胞的文庫(kù)細(xì)胞摻合到藻酸溶液 中。乳化過(guò)程通過(guò)將藻酸混合物緩慢轉(zhuǎn)移到油相中并以580rpm混合10 分鐘來(lái)啟動(dòng)。接著加入500ml無(wú)菌水并讓混合持續(xù)5分鐘。通過(guò)離心從 油中分離微滴。洗滌微滴并將其重新懸浮在適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，如果需 要即可用于標(biāo)準(zhǔn)條件下的培養(yǎng)。可通過(guò)相顯微鏡來(lái)測(cè)定微滴的大小。對(duì) 于通過(guò)FACS或MACS的分選目的，如果滴在分選所必需的所需大小范 圍之外，可使用所需大小限制的濾膜對(duì)滴進(jìn)行大小選擇。
根據(jù)本發(fā)明，報(bào)道范圍的成分或藥物篩選的靶也可被包被在帶有文 庫(kù)細(xì)胞的滴中。在形成前面所述的粗滴或微滴之前，可將整個(gè)報(bào)道細(xì)胞 或包含生物檢定，酶，或報(bào)道分子的細(xì)胞部分與懸浮在培養(yǎng)基中的文庫(kù) 細(xì)胞混合。文庫(kù)細(xì)胞產(chǎn)生的感興趣的化合物可在滴中聚積和擴(kuò)散以達(dá)到 共包被的指示細(xì)胞或報(bào)道物，并產(chǎn)生信號(hào)。共包被的指示細(xì)胞可為所需 化合物的活靶，例如抗感染針對(duì)的病原體，或抗腫瘤劑針對(duì)的腫瘤細(xì)胞。 指示細(xì)胞的代謝狀況中的任何變化，例如死亡，或生長(zhǎng)抑制，組成了信 號(hào)并可在滴內(nèi)通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種方法來(lái)檢測(cè)。該方法可包括， 但不局限于使用生理性探針，例如活體染色，或滴的光學(xué)特性的測(cè)定。
當(dāng)?shù)伪┞队趫?bào)道范圍的成分中時(shí)，由包被的文庫(kù)細(xì)胞和報(bào)道成分產(chǎn) 生的代謝物和化合物可擴(kuò)散通過(guò)半固體培養(yǎng)基產(chǎn)生信號(hào)，例如，可將生 理性探針加入到接著進(jìn)行適宜的分選方法的一批滴中。如果文庫(kù)細(xì)胞被 允許在滴中分開(kāi)，初始陽(yáng)性細(xì)胞的后代在小菌落中被保持在一起，從而 產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的信號(hào)。優(yōu)選半固體培養(yǎng)基與由報(bào)道物產(chǎn)生的信號(hào)是光學(xué) 相容的，例如對(duì)一定范圍的波長(zhǎng)的光是透明的，這樣信號(hào)可被有效地檢 測(cè)。
粗滴可通過(guò)眼睛或使用允許滴通過(guò)篩選點(diǎn)，并具有分離陽(yáng)性物能力 的任何設(shè)備，使用生色報(bào)道物來(lái)進(jìn)行分選。可使用FACS或MACS來(lái)分 選微滴。FACS操作可通過(guò)合格的操作者在任何適宜的機(jī)器(例如Becton -Dickinson?TACStar?Plus)上進(jìn)行。顆粒懸浮密度(細(xì)胞或滴)調(diào) 節(jié)為1×106粒/ml。在所有情況下，陽(yáng)性物可以1個(gè)克隆/孔直接分選到 多孔平板中。按照制造商的說(shuō)明使用MPC-M磁試管架進(jìn)行MACS (Dynal，5?Delaware?Drive，Lake?Success，New?York?11042)。
在預(yù)篩選或篩選中被發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性的包被細(xì)胞可通過(guò)將滴放在適宜的 瓊脂或液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)或?qū)⒌稳茉?a href='/zhuanli/list-13853-1.html' target='_blank'>檸檬酸鈉中來(lái)進(jìn)行回 收。培養(yǎng)一段時(shí)間后，陽(yáng)性細(xì)胞可從滴中生長(zhǎng)出來(lái)。為了滴處理和貯存 的方便，后面的培養(yǎng)可在多孔平板中進(jìn)行。
被減少到較小群體的預(yù)篩選的陽(yáng)性物可接著在存在乙二醇的情況下 冷凍和貯存或在多孔平板中生長(zhǎng)。這些可被用于使用多針復(fù)制基因?qū)⒒?因組轉(zhuǎn)移到各種類型的分析平板中(例如分化培養(yǎng)基，選擇性培養(yǎng)基， 抗微生物或改造的分析菌苔)。在這些微量滴定平板中也可進(jìn)行特定的 分析，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的平板讀出器或目前高流通量篩選技術(shù)中所采用的任 何其它方法進(jìn)行閱讀。
為了討論的清楚性，下面的子章節(jié)詳細(xì)地描述了涉及原核生物和真 核生物，供體和宿主生物的本發(fā)明的不同的實(shí)例。下面的實(shí)例為舉例并 不局限本發(fā)明。 5.3.從供體生物制備高質(zhì)量核酸的方法
作為起始物質(zhì)的高質(zhì)量的DNA或RNA的可獲得性在DNA文庫(kù)的構(gòu) 建中是非常重要的，該DNA代表了供體生物的遺傳信息。本節(jié)提供了從 供體生物的培養(yǎng)物或從環(huán)境樣品中提取，選擇和制備高質(zhì)量核酸的方 法。還描述了為了濃縮與次級(jí)代謝物相關(guān)的DNA而用于預(yù)篩選DNA文 庫(kù)的被除去的DNA探針的制備方法。 5.3.1.異硫氰酸胍核酸分離
可通過(guò)機(jī)械研磨器，或另外通過(guò)研缽和研杵在存在磨得很細(xì)的玻璃 或浮石用手將冷凍干燥或未冷凍干燥的材料破碎。研磨后立即以每1-2 克研磨的冷凍干燥的材料對(duì)應(yīng)于10ml溶胞緩沖液的量進(jìn)行混合。溶胞緩 沖液為5M異硫氰酸胍，50mM?Hepes?pH?7.6，10mM?EDTA，和 5％β-巰基乙醇(或250mM?DTT)。混合并在50℃下保溫5分鐘后， 在以8000g離心之前，將溶液倒入4％肌氨酸中，混合，并在50℃保溫 多于5分鐘。如果上清可見(jiàn)為混濁，可使用轉(zhuǎn)速為27,000g的90分鐘離 心步驟以沉降不需要碳水化合物。另外，可采用15,000g的旋轉(zhuǎn)以清除 不需要污染物的溶胞產(chǎn)物。離心后，將上清倒入1.42M?CsCl(0.15g CsCl/ml)中并在超速離心管中的預(yù)先制備的5.7M?CsCl/TE(10mM Tris-HCl/1mM?EDTA)溶液上分層。20℃，可以160,000g進(jìn)行超 速離心18小時(shí)。超速離心后，在1.42M/5.7M?CsCl界面上的清亮象膠 體一樣的層為DNA，同時(shí)全部的細(xì)胞RNA以清亮的片狀沉淀物形式存 在于管的底部?？蓪?lái)自超速離心步驟的DNA對(duì)TE緩沖液進(jìn)行透析， 換成0.1M?NaCl進(jìn)行透析，用2.5體積乙醇沉淀，干燥并重新溶液于適 宜體積的TE中。如果DNA層為白色，可將它移出并在CsCl/二聯(lián)苯酰 亞胺梯度中再離心8小時(shí)以除去殘留的碳水化合物?？赏ㄟ^(guò)用85％異丙 醇洗滌2-5次去除染料，并如上面一樣進(jìn)行透析和處理。
可將RNA重新溶解在重新懸浮的緩沖液中(5M，異硫氰酸胍， 50mM?Hepes，pH?7.6，10mM?EDTA)，用50mM?Hepes?pH?7.6， 10mM?EDTA溶液稀釋至1.33M異硫氰酸胍。如果需要全部RNA，則 加入2體積乙醇或1體積異丙醇沉淀稀釋的RNA樣品。將沉淀的RNA 用乙醇漂洗，干燥并重新懸浮在水中或甲酰胺中，-70℃貯存直至使用。 5.3.2.含多聚腺苷酸RNA的分離
因?yàn)榻^大多數(shù)真核生物mRNA分子在3′末端含有一片聚(腺苷)酸， 長(zhǎng)度多達(dá)250個(gè)堿基，它可通過(guò)使用寡聚-dT纖維素基質(zhì)的親和層析來(lái) 進(jìn)行純化。可使用大量商業(yè)可購(gòu)得的寡聚-dT基質(zhì)，包括但不局限于簡(jiǎn) 單重力柱，順磁顆粒，自旋和推進(jìn)柱。分離的mRNA可以溶解在水或甲 酰胺中或在-70℃下干燥的形式貯存。 5.3.3.來(lái)自總RNA的非核糖體序列的富集
非核糖體序列的富集可能是在從困難或不可培養(yǎng)的供體生物獲得有 用RNA數(shù)量中重要的一個(gè)步驟。中性蔗糖梯度上RNA的分級(jí)分離可用 于純化從其它RNA種類中純化出顯著核糖體RNA(R.McGookin 1984，分子生物學(xué)方法Vol.2核酸Humana?Press，pp.109-112)。 離心后，放棄包含最大量核糖體RNA的樣品，透析和沉淀剩下的部分。
利用帶有或不帶有任意加尾的寡-dT引物的任意引物的其它方 法和PCR可被用來(lái)擴(kuò)增原料中的少量的RNA。 5.3.4.使用Klenow片段的補(bǔ)平反應(yīng)
使用大腸桿菌DNA聚合酶，或其它缺乏3′→5′外切核酸酶活性的 DNA聚合酶的Klenow片段，將核苷酸加至5′粘端是通常用來(lái)在消化后 產(chǎn)生平端DNA分子的標(biāo)準(zhǔn)方法，當(dāng)沒(méi)有完全核苷酸組時(shí)被使用時(shí)，該活 性可被用于產(chǎn)生與它們本身不相容但互相相容的連接末端中。
這一技術(shù)已被用于制備高效價(jià)的基因文庫(kù)和構(gòu)建物(Hyug等， 1984，核酸研究12：1863-1874；Zaborovsky等1986，基因42： 119；Foster，1991，博士論文，加利福尼亞大學(xué)，Santa?Barbara，Loftus 等1992，生物技術(shù)12：172-175)。
可用Klenow緩沖液(50mM?Tris-HCl?pH?7.5，10mM?MgCl2， 50mg/ml?BSA，1mM?dNTP)，酶，以及在37℃保溫3-4小時(shí)來(lái) 進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)。反應(yīng)后，可通過(guò)多種方法純化DNA，包括但不局限于， 親和層析，乙醇沉淀，和旋轉(zhuǎn)柱沉淀。 5.3.5.用于預(yù)篩選的被除去的DNA探針的制備方法
可從具有復(fù)雜生活周期的未沒(méi)有分化的年幼，中間對(duì)數(shù)期的生物培 養(yǎng)物分離RNA。這個(gè)RNA庫(kù)與參與未分化生長(zhǎng)和初級(jí)代謝的基因互補(bǔ)。 RNA在體外被進(jìn)行生物素標(biāo)記并過(guò)量地與來(lái)自同源或密切相關(guān)的異源種 類的基因組DNA的被任意剪切，并按基因大小排列的片段進(jìn)行雜交，用 苯酚萃取該混合物導(dǎo)致去除了在界面與初級(jí)代謝RNA互補(bǔ)的基因組序 列，這一過(guò)程可被重復(fù)一次。得到的單鏈DNA片段由初級(jí)代謝基因的 (+)鏈和包括與次級(jí)代謝相關(guān)的其它基因的(+)和(-)鏈組成。 使該DNA混合物變性，并且在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下重新雜交5-10個(gè)半 CotS，這樣僅僅相關(guān)的序列可重新雜交以形成雙鏈DNA?？赏ㄟ^(guò)與羥 基磷灰石結(jié)合或通過(guò)用綠豆核酸酶消化除去剩余的單鏈DNA?？山又?用任意引發(fā)標(biāo)記代表非初級(jí)代謝相關(guān)基因的分離的雙鏈DNA，并將其用 作探針來(lái)預(yù)篩選文庫(kù)。 5.3.6.從土壤或其它混合的環(huán)境樣品中純化核酸
將土壤樣品在液氮中快速冷凍并貯存于-70℃下直至使用。另外， 土壤樣品被冷凍貯存于-20℃下。使用前立即將樣品在冰上融化，或在 操作前被冷凍干燥。
取決于材料的物理性質(zhì)和來(lái)源，通過(guò)具有少量改進(jìn)的多種方法提取 全部核酸。直接冷凍干燥和處理被干燥成半干燥的樣品；非常濕的樣品 被進(jìn)行快速冷凍和冷凍干燥；在操作前將油狀樣品用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行 稀釋?？刹捎孟旅嫒我环N方法：Ogram等1987，微生物學(xué)方法雜志7： 57-66；Steffan等1988，實(shí)用環(huán)境微生物學(xué)，54：137-161； Werner等1992，細(xì)菌學(xué)雜志174(15)：5072-5078；Zhou等 1996，實(shí)用環(huán)境微生物學(xué)62(2)：316-322。
簡(jiǎn)而言之，通過(guò)滴加至熱的異硫氰酸胍溶胞緩沖液(見(jiàn)節(jié)5.3.1) 直接將5g樣品溶胞，并進(jìn)行氯化銻純化。另外，在50ml離心管中將樣 品與13.5ml?DNA提取緩沖液(100mM?Tris-HCl?pH?8.0，100mM EDTA，100mM磷酸鈉，1.5mM?NaCl，1％CTAB(溴化十六烷基 甲銨)和100μl?20mg/ml蛋白酶K混合，37℃下，以225rpm的速度水 平振蕩30分鐘。振蕩后，加入15ml?20％SDS，65℃下每15-20 分鐘進(jìn)行一次尾-尾振蕩將樣品保溫2小時(shí)。20℃下，通過(guò)以6000×g 離心10分鐘來(lái)收集上清。通過(guò)加入4.5ml提取緩沖液和0.5ml?20％ SDS，旋渦振蕩1分鐘，接著在65℃下保溫10分鐘并且再離心來(lái)將片 狀沉淀物重新提取3次。將從3次提取過(guò)程匯集的上清用氯仿-異戊醇 (48∶1)提取兩次。通過(guò)加入0.6體積的異丙醇，接著保溫1小時(shí)，并 在室溫下以16,000×g離心20分鐘來(lái)沉淀核酸。接著將粗提的核酸片 狀沉淀物重新懸浮于10nM?Tris-HCl?pH?8.0，2mM?EDTA中。如 果需要通過(guò)EDAE層析對(duì)DNA進(jìn)行進(jìn)一步純化。通過(guò)用4M乙酸鋰或酸 性苯酚提取對(duì)RNA進(jìn)行選擇性沉淀來(lái)從粗提的片狀沉淀物中獲得全部 RNA(Ausubel等1990，Greene?Publishing?Associates?and?Wiley Interscieuce，New?York；Hoben等1988，實(shí)用環(huán)境微生物學(xué)，54： 703-71)。 5.3.7.DNA的修復(fù)
通過(guò)首先用T4?DNA聚合酶使任何被切斷的末端平端化來(lái)修復(fù)帶 缺刻或被降解的DNA(New?England?Biolabs)。37℃下，將DNA 在平端緩沖液(50mM?Tris-HCl?pH?7.8，10mM?MgCl2，40μM dNTPs，5U/10μg?T4?DNA聚合酶)中處理1-2小時(shí)。通過(guò)加入1/10 體積的3M乙酸鈉和2.5體積的100％乙醇對(duì)DNA進(jìn)行乙醇沉淀。
沉淀并重新懸浮于水中后，16℃下，將DNA樣品在大腸桿菌連接 酶緩沖液(50mM?Tris-HCl?pH?7.8，10mM?MgCl2，10mM DTT，26μM?NAD+和25μM?BSA，10U大腸桿菌)中用大腸桿菌 DNA連接酶處理1-2小時(shí)。處理后，將DNA樣品用20mM?Tris－HCl?pH?8.0，0.3M乙酸鈉溶液稀釋5倍，并分別用苯酚和氯仿提取一 次。向水相中加入2.5體積乙醇沉淀DNA。用70％乙醇將樣品漂洗兩 次，重新懸浮于無(wú)菌水或10mM?Tris-HCl，pH?8.0，1mM?EDTA 中，并在-70℃下貯存自至使用。 5.4.用于原核表達(dá)文庫(kù)的方法
本節(jié)提供了使用原核宿主和供體生物制備天然途徑表達(dá)文庫(kù)和嵌合 途徑表達(dá)文庫(kù)的方去。通過(guò)節(jié)5.3.1-5.3.4描述的方法獲得的純化的 高質(zhì)量的DNA可用于下面的方法中。 5.4.1.細(xì)菌種類，菌株和培養(yǎng)條件
特別好的表達(dá)宿主生物是限制性-負(fù)型，核酸內(nèi)切酶缺陷和重組缺 陷型。對(duì)于大腸桿菌，優(yōu)選的菌株為XLl-MR(基因型：McrA-， McrCB-，McrF，Mrr，hsdr，cndal-，recA-)。對(duì)于鏈 霉菌，優(yōu)選的菌株為淺青紫鏈霉菌TK64。對(duì)于枯草芽孢桿菌，優(yōu)選的 菌株為枯草芽孢桿菌PB?168?trpC2；枯草芽孢桿菌PB5002?sacA， degUhy；枯草芽孢桿菌PB?168?delta?trpC2，pksdelta?75.8；枯草芽孢桿 菌ATCC?39320和39374。
供體生物為細(xì)菌種類。一些被用于選擇它們產(chǎn)生可通過(guò)目前分析來(lái) 檢測(cè)的獨(dú)特化合物的能力。其它則由于它們存在于可能感興趣的環(huán)境樣 品中而被選擇。在一些實(shí)例中，海洋細(xì)菌從Harbor?Branch?Oceanographic Institute?and?Scripps?Institute?of?Oceanography獲得。它們通常從 公海近海處大于200英里處收集。將代謝試驗(yàn)以及革蘭氏試驗(yàn)以及菌落 形態(tài)學(xué)進(jìn)行到必需確保樣品具有分類差異的程度。
當(dāng)制備文庫(kù)貯備物時(shí)，讓大腸桿菌在37℃下生長(zhǎng)并在30℃下表達(dá)。 讓海洋放線菌屬和鏈霉菌屬的種類僅在30℃下生長(zhǎng)。 5.4.2.供體基因組DNA的制備
培養(yǎng)來(lái)自每一種類的細(xì)菌的10ml培養(yǎng)物。通過(guò)離心沉淀細(xì)菌并重新 懸浮于10mM?Tris，5mm?EDTA(TE)。可通過(guò)節(jié)5.1.2中描述的 方法可純化DNA，或者可將細(xì)菌沉淀物溶解在SDS/蛋白酶K中，用苯 酚-氯仿提取，并用異丙醇沉淀。將得到的純化DNA在TE中懸浮過(guò)夜。
將各純化的DNA的等分試樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以證實(shí)完整性并 確定DNA濃度。
為了制備用于天然途徑表達(dá)文庫(kù)的任意大的DNA片段，通過(guò)在37 ℃下，在1X酶緩沖液和每微克DNA?0.01-0.5單位酶中保溫1小時(shí)， 將20μg各種類的DNA用頻繁切割酶(frequent-cutting?enzyme)例 如Sau3A部分消化?？赏ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)確定所用酶量以產(chǎn)生所需的大小范圍。 收集被消化的DNA，苯酚∶氯仿提取，并用乙醇沉淀。100ug該混合 物用于需要大量天然基因組DNA片段的各文庫(kù)。該混合物可選擇性地通 過(guò)蔗糖梯度來(lái)按大小分級(jí)分離。可同時(shí)通過(guò)按大小分級(jí)分離來(lái)選擇用于 嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的較小的DNA片段。
通過(guò)將樣品的等分試樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)證實(shí)消化和按大小的 分級(jí)分離。 5.4.3.原核啟動(dòng)子片段的制備
在一個(gè)實(shí)施方案中，合成的寡核苷酸被用于構(gòu)建含兩個(gè)拷貝的β- 半乳糖苷糖啟動(dòng)子(lac)的片段，一個(gè)位于唯一的BamHI位點(diǎn)的一端， 被定位于直接轉(zhuǎn)錄的lac的各個(gè)拷貝朝向中心的BamHI位點(diǎn)(圖4A)。 合成的寡核苷酸通過(guò)合成儀被磷酸化。在室溫用T4?DNA連接酶連接 30分鐘之前，通過(guò)煮沸5分鐘并緩慢冷卻30分鐘至25℃使400ng各種 寡核苷酸復(fù)性。將連接混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切除2-7kbp片段 并用Gene?Clean純化。通過(guò)在15℃在1×連接酶/PEG緩沖液中用T4 DNA連接酶保溫16小時(shí)將連接配對(duì)并且正確定位的盒插入pBSK質(zhì)粒載 體的Smal位點(diǎn)。將連接混合物導(dǎo)入XLl-MR細(xì)胞中。通過(guò)限制酶分 析法來(lái)分析各個(gè)克隆并可選擇性地測(cè)序以證實(shí)定位和準(zhǔn)確度。
將pBSK-(lac/lac)n克隆(其中n為2-10的整數(shù))以0.3l的量培 養(yǎng)，并使用質(zhì)粒制備盒(Qiagen)純化質(zhì)粒。在1×緩沖液中用Saml 完全消化40μg被選擇和純化的pBSK-(lac-lac)n。將消化的DNA進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，切下lac/lac啟動(dòng)子二聚體，并用Gene?Clean純化， 在1×緩沖液中用BamHI完全消化。參見(jiàn)圖4B和4C。將消化的啟動(dòng)子 單體用苯酚∶氯仿提取。乙醇沉淀，在1×CIAP緩沖液中用CIAP處理 來(lái)脫磷酸化。如前所述提取和沉淀脫磷酸化的被消化的啟動(dòng)子，并在貯 存-20℃下或進(jìn)一步使用之前以20ng/μl的濃度重新懸浮于TE中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將制備的啟動(dòng)子片段與類似制備的不包含啟 動(dòng)子序列的接頭混合，平接著用于與供體基因組DNA的連接中。在反義 轉(zhuǎn)錄是一個(gè)需要考慮的問(wèn)題的情況下，這使得產(chǎn)生僅具有一個(gè)啟動(dòng)子的 盒。 5.4.4.用于組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的基因盒的制備
在一個(gè)實(shí)例中，將基因組DNA(平均大小為3.5kbp)BamHI- BamHI片段與過(guò)量的脫磷酸啟動(dòng)子片段混合，接著連接。啟動(dòng)子與基因 組DNA片段的摩爾比為20∶1。產(chǎn)生的單元(lac/基因組DNA片段/lac) 將具有約為4kbp的平均大小?？墒褂玫钠渌藛?dòng)子包括其它大腸桿 菌啟動(dòng)子(Harley等，1987，核酸研究15：2343-2361)以及用于 鏈霉菌種類的表達(dá)宿主的鏈霉菌啟動(dòng)子(Strohl，1992，核酸研究 V20：961-974)。在宿主具有未確定或顯著的重組能力時(shí)，需要使 用一系列不同的啟動(dòng)子，這樣包含一些盒的任何克隆將含有一些不同的 啟動(dòng)子。 5.4.5.固體支持物的制備
超連接固定的鏈霉親和素顆粒購(gòu)自Pierce(目錄號(hào)53113)。3M Emphaze?Biosupport?Medium?ABl“空白玻珠”購(gòu)自Pierce(目錄號(hào) 53112)。來(lái)自其它賣主的相似的固體支持物可代替它們用于此目的。
寡核苷酸購(gòu)自Life?Technologies?(Gibco-BRL)。寡核苷酸“玻 珠-連接-5”是5′生物素-GCC?GAC?CAT?TTA?AAT?CGG?TTA?AT 3′?！安Ｖ?連接-3”是5′磷酸-TAA?CCG?ATT?TAA?ATG?GTC?GGC 3′。當(dāng)退火時(shí)，這些寡核苷酸包含一個(gè)SwaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(示于下 面劃線部分)。復(fù)性的玻珠-連接寡核苷酸還在3′末端留下一個(gè)AT突 出端。該突出端在寡核苷酸玻珠-連接-5中的用黑體表示。
生物素-GCC?GAC?CAT?TTA?AAT?CGG?TTA?AT
CGG?CTG?GTA?AAT?TTA?GCC?AAT
在eppendorf管中將等摩爾量的各種顆粒連接寡核苷酸混合在一 起。將管中加入5M?NaCl至最終濃度為300mM。在60℃將反應(yīng)保溫 1.5小時(shí)。使用未退火的寡核苷酸作為對(duì)照，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)證實(shí) 退火。
為了制備空白玻珠，將100mg干的玻珠重新懸浮在1ml磷酸緩沖生 理鹽水(PBS)中。加入牛血清蛋白(BSA)至最終濃度為1mg/ml。 室溫下將玻珠旋轉(zhuǎn)4小時(shí)。離心沉淀玻珠，室溫下用1M?Tris-HCl?pH 8.0在2小時(shí)內(nèi)將其洗滌3次以封閉未反應(yīng)的氮雜內(nèi)酯位點(diǎn)。短暫離心沉 淀玻珠并用PBS充分洗滌。在4℃下，將空白玻珠貯存在PBS中直至使 用。
為讓玻珠連接的寡核苷酸與抗生蛋白鏈菌素玻珠結(jié)合，在1×結(jié)合 緩沖液中(PBS，500mM?NaCl)，將10μg預(yù)先退火的寡核苷酸與 20μl超連接的固定的鏈霉親和素玻珠混合。與保持玻珠懸浮相反，室溫 下將玻珠保溫3小時(shí)。沉淀玻珠并用1ml結(jié)合緩沖液洗滌3次。接著將 玻珠用1×連接緩沖液(50mM?Tris-HCl?pH?7.8，10mM?MgCl2， 10mM二硫蘇糖醇，1mM?ATP，25μg/ml?BSA)洗滌并平衡。4℃ 貯存玻珠直至使用。 5.4.6.組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)的裝配
將基因盒連接到磁珠上：在1×激酶緩沖液中使用T4多核苷酸激酶 磷酸化基因盒。乙醇沉淀磷酸化片段并重新懸浮于TE中。將其1/10連 接到兩個(gè)短的未磷酸化的合成接頭的混合物上。剩余的9/10用于后面步 驟。每個(gè)接頭將具有兩個(gè)稀有切割酶中的一個(gè)，Not1或Srf1。此外，含 有Not1的接頭在合成寡核苷酸時(shí)被用生物素標(biāo)記。將Not1和Srf1接頭 與磷酸化的轉(zhuǎn)錄單元分別以100∶100∶1的比例混合，并在15℃在1× 連接酶/PEG緩沖液中用T4?DNA連接酶連接16小時(shí)。讓該混合物與親 和素結(jié)合的MPG磁珠結(jié)合，并用制造商提供的方法從連接混合物中除去 玻珠-結(jié)合轉(zhuǎn)錄單元。
在連接的DNA的混合物中，大約1/2將在一個(gè)末端具有生物素標(biāo)記 的Not1接頭并在另一末端具有生物素標(biāo)記的Srf1接頭。Not1末端將通 過(guò)親和素-生物素連接與顆粒結(jié)合。在兩個(gè)末端具有Not1接頭的片段不 參與進(jìn)一步的連接步驟。在兩個(gè)末端具有Srf1接頭的片段不被保留在磁 分離步驟。
用于與玻珠結(jié)合的DNA連接的DNA庫(kù)的制備：如上將剩余的9/10 磷酸化的轉(zhuǎn)錄單元僅與Srf1接頭連接，接著用Srfl完全消化，脫磷酸化， 純化并用乙醇沉淀。
玻珠結(jié)合的DNA的脫保護(hù)：在1×Srf1緩沖液中用Srf1酶完全消 化與玻珠結(jié)合的轉(zhuǎn)錄單元。加熱滅活該反應(yīng)并且通磁分離除去玻珠。
多聯(lián)體化：接著將玻珠加入到含有脫磷酸Srf1-Srf1消化的轉(zhuǎn)錄單 元的連接混合物的1×連接緩沖液中。在加熱滅活連接酶和磁分離玻珠 之前通過(guò)加入T4?DNA連接酶啟動(dòng)連接并在25℃進(jìn)行60分鐘。連接主 要磷酸化的玻珠結(jié)合的DNA與非磷酸化的轉(zhuǎn)錄單元之間發(fā)生。通過(guò)T4 多核苷酸激酶磷酸化顆粒上的轉(zhuǎn)錄單元，加熱滅活，磁分離，并且通過(guò) 加入更多的T4?DNA連接酶回到連接混合物中。
在通過(guò)用Not1消化從玻珠酶切多聚體之前，將該循環(huán)重復(fù)10次。 乙醇沉淀酶切的DNA，重新懸浮于TE中，并且在插入到SuperCos?1或 其它載體中之前，根據(jù)表達(dá)宿主，在瓊脂糖凝膠上觀察以估計(jì)它的性質(zhì) 和大小范圍。如節(jié)5.4.5中描述的，多聯(lián)體被用于在相關(guān)的表達(dá)宿主中 產(chǎn)生原核文庫(kù)。 5.4.7.組合天然途徑表達(dá)文庫(kù)的裝配
用于大腸桿菌文庫(kù)的表達(dá)載體被希望是能保留大小為30～42kpb 的插入片段的粘粒SuperCos?1。按照制造商的說(shuō)明(Stratagene)來(lái)進(jìn) 行將DNA片段插入到SuperCos?1中并用Gigapack提取物包裝。
簡(jiǎn)而言之，用包含DNA文庫(kù)的SuperCos?1噬菌體感染XL1-MR 宿主細(xì)胞。它按照如下來(lái)進(jìn)行：37℃在5ml補(bǔ)充有1％麥芽糖，10mM MgSO4的LB培養(yǎng)基中以300rpm將XL1-MR細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。以1∶10 稀釋過(guò)夜的培養(yǎng)物，并在37℃下，以300rpm在LB/10mM?MgSO4中培 養(yǎng)3小時(shí)。以800×g離心沉淀培養(yǎng)物，并重新懸浮于5ml?LB中。室 溫下，將600μl懸浮液與500cfu包裝在噬菌體顆粒中的文庫(kù)一起保溫30 分鐘，接著在37℃下，與8體積的LB以300rpm保溫60分鐘。
為了擴(kuò)增表達(dá)文庫(kù)，將被感染的宿主細(xì)胞鋪在含有50ml?LB，50μg /ml氨芐青霉素的150mm培養(yǎng)皿中。室溫下這些平板被預(yù)先干燥48小 時(shí)。涂布后，37℃下讓平板保溫過(guò)夜。刮取平板，用每平板含有3ml?15％ 乙二醇，85％LB重新懸浮菌落。該細(xì)菌懸浮液貯存于-70℃以備進(jìn)一 步的使用。
為了制備用于篩選各個(gè)克隆的文庫(kù)，將被感染的宿主細(xì)胞鋪在含有 50ml?LB，50mg/ml氨芐青霉素的150mm培養(yǎng)皿中。室溫下將平板預(yù) 先干燥48小時(shí)。涂布后，37℃下讓平板保溫過(guò)夜。用滅菌的牙簽挑取 產(chǎn)生的菌落并一孔一個(gè)地轉(zhuǎn)移到多孔平板中。384孔工作平板的每個(gè)孔 含有75/μ1?LB，50μg/ml氨芐青霉素，7％乙二醇。外面的行(總共 80孔)不被接種，但類似地裝上培養(yǎng)基以提供在后來(lái)保溫和冷凍期間的 蒸發(fā)屏障。37℃下，將這些接種的主皿不振蕩放置16小時(shí)。過(guò)夜的主 384孔平皿被用作源平皿復(fù)制引一個(gè)或多個(gè)工作384孔平皿或Omni- Trays中。接著將該主384孔平皿分別包被并在-80℃下冷凍。用384 針頭復(fù)制儀進(jìn)行復(fù)制。在每次使用之前和之后，將384針頭復(fù)制儀順序 地浸入漂白液中20秒，水中30秒，接著在燃燒之前浸入乙醇中5秒。 文庫(kù)裝配的方法取決于載體和表達(dá)宿主的選擇。 5.4.8.表達(dá)文庫(kù)的預(yù)篩選
有三種類型的預(yù)篩選，胞內(nèi)，差示和選擇。
簡(jiǎn)而言之，第一種類型，胞內(nèi)預(yù)篩選需要將文庫(kù)導(dǎo)入被遺傳改造包 含化學(xué)應(yīng)答性的報(bào)道構(gòu)建物的宿主中。報(bào)道物為GFP(綠色熒光蛋白) 或β-半乳糖苷酶，選擇通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或粗滴分選來(lái) 進(jìn)行。
第二種類型，差示預(yù)篩選，需要用熒光或色素原的生理性示蹤物保 溫宿主中的文庫(kù)，接著通過(guò)FACS或粗滴分選。
第三種類型，選擇預(yù)篩選，需要用選擇性試劑，例如抗生素來(lái)保溫 宿主中的文庫(kù)，接著通過(guò)FACS或粗滴分選來(lái)識(shí)別存活或增殖的細(xì)胞。
對(duì)于所有方法，在檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)物之前，在大量擴(kuò)增文庫(kù)的培養(yǎng)物 中進(jìn)行細(xì)胞分選。
可通過(guò)FACS或粗滴分選來(lái)預(yù)篩選文庫(kù)。以一種或多種提高高或低 密度微環(huán)境的方式培養(yǎng)含有DNA文庫(kù)的宿主細(xì)胞的庫(kù)。
在第一種方法中，按單個(gè)細(xì)胞來(lái)鑒定擴(kuò)增文庫(kù)的細(xì)胞。在沉淀之前， 30℃，以300rpm將大腸桿菌文庫(kù)等分試樣在20體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 小時(shí)，重新懸浮于1體積的滅菌ddH2O，與熒光探針一起保溫(如果需 要)，并且放置在冰上以轉(zhuǎn)移到FACS設(shè)備上。
在第二種方法中，在轉(zhuǎn)移到FACS或粗滴分選設(shè)備之前，如節(jié)5.2.3 所描述的，在存在底物或選擇劑時(shí)包裝和培養(yǎng)擴(kuò)增文庫(kù)的等分試樣。
對(duì)于與熒光示蹤物或底物檢測(cè)的培養(yǎng)物，在FACS之前按照制造商 的方法將重新懸浮在ddH2O中的培養(yǎng)物染色，通常如下進(jìn)行：室溫下在 黑暗中保溫15分鐘，接著在1.5ml?microfuge管中沉淀5分鐘并重新懸 浮于1體積的冷的ddH2O中。
分選后，將來(lái)自表達(dá)文庫(kù)的選擇的1-1000克隆庫(kù)或粗滴培養(yǎng)在 0.5L營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。通過(guò)用0.5L乙酸乙酯提取對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌和培養(yǎng)基進(jìn) 行處理以用于化學(xué)分析旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生約20mg-1g提取物/升培養(yǎng)物的 粗的有機(jī)提取物。純化同種克隆的DNA并重新轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中以證實(shí) 與粘粒相關(guān)的序列的定位。由文庫(kù)克隆的表達(dá)產(chǎn)生的化學(xué)樣品可通過(guò)使 用一系列柱(陽(yáng)離子，陰離子，反相)的HPLC和隨后通過(guò)使用NMR的定 量化學(xué)分析來(lái)測(cè)定。 5.4.9.通過(guò)平板復(fù)制對(duì)海洋革蘭氏(-)菌/大腸桿菌文庫(kù)的代謝 測(cè)定
在制備DNA文庫(kù)之前，先檢測(cè)各種野生型海洋種類以防止重復(fù)和有 利于確定在完成的文庫(kù)中進(jìn)行的代謝測(cè)定的順序。
為了制備用于篩選各克隆的文庫(kù)，將被感染的宿主細(xì)胞，例如大腸 桿菌XLl-MR鋪在含有50ml?LB，50mg/ml氨芐青霉素的150mm培 養(yǎng)皿上。室溫下預(yù)先將平板干燥48小時(shí)。鋪開(kāi)后，在37℃下，讓平板 保溫過(guò)夜。用滅菌的牙簽挑取產(chǎn)生的菌落并一孔一個(gè)地轉(zhuǎn)移到384孔平 板中。各孔含有75μl?LB，50μg/ml氨芐青霉素，7％乙二醇。外面的 行(總共80孔)不接種但類似地裝上培養(yǎng)基以提供在后面的保溫和冷卻 期間的蒸發(fā)屏障。37℃下，將這種接種的主皿不振蕩放置16小時(shí)。過(guò) 夜的主384-孔平皿被用作源皿復(fù)制到一個(gè)或多個(gè)工作多孔平皿或Omni -Trays中。接著分別包被主384孔平皿，-80℃貯存。用384針頭復(fù) 制儀進(jìn)行復(fù)制。在每次使用之前和之后，順序地將384針頭復(fù)制儀浸入 漂白液中20秒，水中30秒，接著在燃燒之前浸入乙醇中5秒。
工作多孔平板或Omni-Trays被用作源平皿將DNA文庫(kù)復(fù)制至一 系列差示和/或選擇培養(yǎng)基上(例如鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基或抗菌培養(yǎng)基)。 匯編結(jié)果并與用于構(gòu)建DNA文庫(kù)的野生型海洋細(xì)菌的圖譜進(jìn)行比較。 5.4.10.通過(guò)粗滴包被對(duì)海洋革蘭氏(-)菌/大腸桿菌文庫(kù)進(jìn)行代 射測(cè)定
通過(guò)稱取藻酸鈉并通過(guò)壓力混合器以2000rpm以1％的濃度溶解在 100ml無(wú)菌水中來(lái)包被克隆。加入1體積的文庫(kù)懸浮物以致每滴包被1 -5個(gè)克隆。讓混合物靜置至少30分鐘以放氣。接著擠壓通過(guò)允許它形 成單個(gè)滴的任何設(shè)備。其中一個(gè)例子是具有25號(hào)針頭的注射器。這些被 滴入裝有135mM氯化鈣的輕輕攪拌的燒杯中。讓滴變硬10分鐘并接著 轉(zhuǎn)移至滅菌的燒瓶中，除去氯化鈣，用LB/Amp培養(yǎng)基和底物(例如x -葡糖胺)代替。接著在30℃下將含有滴的燒瓶振蕩過(guò)夜，第二天早上 檢測(cè)由存在蘭色菌落表示的陽(yáng)性克隆。
將滴以單層放置在一大的干凈的盤中并用眼睛觀察。取出陽(yáng)性菌落 并放置于包含LB/Amp和50mM檸檬酸鈉pH?7.4的96孔主皿中以溶解 滴，并在37℃讓其生長(zhǎng)過(guò)夜。這些過(guò)夜的主96孔平皿被用作源平皿復(fù) 制到一個(gè)或多個(gè)工作多孔平皿或Omni-Trays中。分別包被主96-孔 平皿，并在-80℃下冷凍。陽(yáng)性克隆可被送去用于特定的產(chǎn)物檢測(cè)或送 去進(jìn)行另一輪預(yù)篩選或篩選?？赏ㄟ^(guò)用多針頭復(fù)制儀進(jìn)行的復(fù)制來(lái)進(jìn)行 進(jìn)一步篩選。在每次使用之前和之后，順序地將多針頭復(fù)制儀浸入漂白 液中20秒，水中30秒，接著在燃燒前在乙醇中浸入5秒。 5.4.11.通過(guò)微滴包被對(duì)海洋革蘭氏(-)菌/大腸桿菌文庫(kù)進(jìn)行的 代謝測(cè)定
通過(guò)下面方法可產(chǎn)生微滴。以2000rpm使用壓力混合器將0.6g多磷 酸鈉和2％藻酸鈉溶解在100ml無(wú)菌水中。讓該混合物放氣60分鐘。接 著將1.9g硫酸鈣在10ml?50％乙二醇中超聲處理至少15分鐘。在導(dǎo)入 已加入1.0g純化的大豆卵磷脂預(yù)混合至少30分鐘的油相(橄欖油)之前 立即將該漿和將產(chǎn)生1-5個(gè)細(xì)胞/滴的1體積的文庫(kù)懸浮液摻合到藻酸 溶液中。該乳化過(guò)程通過(guò)將藻酸混合物緩慢地轉(zhuǎn)移到油相并以580rpm 混合10分鐘而啟動(dòng)。接著加入500ml無(wú)菌水并讓混合持續(xù)5分鐘?？赏?過(guò)離心將微滴從油中移出并洗滌，重新懸浮在LB/Amp中。對(duì)于通過(guò)FACS 的分選，如果滴在分選必需的所需的大小范圍之外，可使用具有所需大 小限制的濾膜對(duì)滴進(jìn)行大小選擇?？稍?0℃，在含有熒光底物的LB/Amp 培養(yǎng)基中將克隆搖蕩培養(yǎng)2小時(shí)。
保溫后，通過(guò)離心，洗滌和以1×106滴/ml的密度重新懸浮于無(wú)菌 水中來(lái)制備用于通過(guò)FACS分選的樣品?？赏ㄟ^(guò)相差顯微鏡來(lái)測(cè)定滴的 大小。由合格的操作者在Becton-Dickinson?FACStar?Plus上進(jìn)行 FACS操作，并將陽(yáng)性克隆直接分選到含有LB/Amp的多孔平板中，將陽(yáng) 性克隆分為1個(gè)克隆/孔。讓平板在37℃下生長(zhǎng)直至克隆從玻珠中長(zhǎng)出 (1-2天)。這些過(guò)夜平板被用作源平板復(fù)制到一個(gè)或多個(gè)工作多孔 平板或Omni?Trays中。分別包被主多孔平板并在-80℃冷凍?？山?著將陽(yáng)性克隆送去用于特定的產(chǎn)物的檢測(cè)或送去進(jìn)行另一輪的預(yù)篩選或 篩選?？赏ㄟ^(guò)用96或384針頭復(fù)制儀進(jìn)行復(fù)制來(lái)完成進(jìn)一步的篩選。在 每次使用之前和之后，順序地將復(fù)制儀浸入漂白液中20秒，水中30秒， 接著在燃燒之前浸入乙醇中5秒。 5.4.12.通過(guò)平板復(fù)制對(duì)放線菌/淺青紫鏈霉菌文庫(kù)進(jìn)行的代謝測(cè)定
在制備DNA文庫(kù)之前，先測(cè)定各種可培養(yǎng)的野生型放線菌種類以防 止分類學(xué)重復(fù)，并有利用確定在完成的文庫(kù)中進(jìn)行的代謝測(cè)定的順序。 為了制備用于篩選各克隆的文庫(kù)，將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，淺青紫鏈霉菌 TK66，涂布含有F10A的150mm平皿中。室溫下將平皿預(yù)先干燥48小 時(shí)。涂布后，30℃下，讓平皿保溫過(guò)夜。通過(guò)涂上硫鏈絲菌肽來(lái)啟動(dòng)選 擇。用牙簽挑取產(chǎn)生的菌落并一孔一個(gè)地轉(zhuǎn)移到96孔平皿中。每孔包含 F10A培養(yǎng)基。30℃下。將這些接種的主皿放置1-4天。過(guò)夜主96孔 平皿被用作源平皿復(fù)制到一個(gè)或多個(gè)多孔平皿或Omni-Trays中。接著 分別包被主96孔平皿并在-80℃冷凍。用多針頭復(fù)制儀進(jìn)行復(fù)制。在 每次使用之前和之后，順序地將多針頭復(fù)制儀浸入漂白液中20秒，水中 30秒，接著在燃燒之前浸入乙醇中5秒。
工作多孔平皿或Omni-Trays被用作源平皿將DNA文庫(kù)復(fù)制到一 系列分化和/或選擇培養(yǎng)基中(例如抗生素平皿或抗菌培養(yǎng)基)。匯集結(jié) 果并與用于構(gòu)建DNA文庫(kù)的野生型細(xì)菌的圖譜進(jìn)行比較。 5.4.13.通過(guò)粗滴包被對(duì)放線菌/淺青紫鏈霉菌文庫(kù)進(jìn)行代謝測(cè)定
通過(guò)如節(jié)5.4.10中描述的用于大腸桿菌文庫(kù)的方法來(lái)包被克隆。讓 滴變硬40分鐘并接著轉(zhuǎn)移至滅菌燒瓶中，除去氯化鈣并用F10A培養(yǎng)基 和底物(例如x-gal)代替。30℃下，將含有滴的燒瓶振蕩1-5天， 并測(cè)定由存在蘭色菌落表示的陽(yáng)性克隆。
將滴以一單層放在一個(gè)大的干凈的盤中并用眼睛觀察。提取陽(yáng)性菌 落并放在包含F(xiàn)10A?50mM檸檬酸鈉pH?7.4的96孔主皿中以溶解滴， 隨后在30℃下生長(zhǎng)2天。這些過(guò)夜的主96孔平皿被用作源平皿復(fù)制到 一個(gè)或多個(gè)工作多孔平皿或Omni-Trays中。分別包被主96孔平皿并 在-80℃下冷凍。隨著可將陽(yáng)性克隆送去用于特定的產(chǎn)物檢測(cè)或送去用 于另一輪預(yù)篩選或篩選。可通過(guò)如上面節(jié)5.4.9中描述的復(fù)制來(lái)進(jìn)行進(jìn) 一步的篩選。 5.4.14.通過(guò)與指示細(xì)胞的共包被進(jìn)行的文庫(kù)的預(yù)篩選
通過(guò)平板接種適宜的稀釋物并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)來(lái)滴定文庫(kù)克隆。將足 量的文庫(kù)細(xì)胞混合在1％藻酸中以產(chǎn)生約1個(gè)細(xì)胞/粗滴。此外，加入足 量的指示細(xì)胞以產(chǎn)生約50個(gè)靶細(xì)胞/滴。如節(jié)5.4.10描述地制備粗滴， 并在適合于文庫(kù)和指示細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
通常，在30℃，在R5或F10A中培養(yǎng)淺青紫鏈霉菌文庫(kù)粗滴，在 30-37℃，在LB或B3中培養(yǎng)大腸桿菌粗滴?？烧{(diào)節(jié)培養(yǎng)基和溫度以 適應(yīng)指示細(xì)胞的生理需要。為了肉眼觀察文庫(kù)細(xì)胞對(duì)指示細(xì)胞的作用， 使下面的報(bào)道范圍：為了檢測(cè)細(xì)胞死亡，加入中性紅或剛果紅；為了檢 測(cè)細(xì)胞存在，加入與指示細(xì)胞相關(guān)的底物(例如對(duì)于E.faecalis?X-吡 喃葡萄糖苷)；為了檢測(cè)對(duì)啟動(dòng)子活化產(chǎn)生應(yīng)答的β-半乳糖苷?qǐng)?bào)道活 性，在培養(yǎng)基中加入80mg/ml?X-gal。在如節(jié)5.4.10中描述分離陽(yáng) 性粗滴之后，通過(guò)加入對(duì)文庫(kù)細(xì)胞，但不對(duì)指示細(xì)胞具有選擇性的抗生 素來(lái)消除指示細(xì)胞。接著貯存文庫(kù)細(xì)胞和/或按需要進(jìn)一步測(cè)定。 5.5.用于真核表達(dá)文庫(kù)的方法
本節(jié)描述了可通常用于制備真核供體生物的組合基因表達(dá)文庫(kù)的方 法。真核生物中組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)的制備所涉及的步驟示于圖 5A-5F中。
特別好的表達(dá)真核宿主生物為穩(wěn)定的，非絲狀的，并且被足夠地表 征以致能被遺傳操作用于基因表達(dá)的目的。對(duì)酵母和真菌，優(yōu)選的種類 為生長(zhǎng)在30℃下粟酒裂殖糖酵母(C.Guthrie和G.R.Funk，酵母遺傳 學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法，Vol.194，Academic?Press)。擬南 芥(A.thaliana?)和煙草(N.tabacum)細(xì)胞為優(yōu)選的宿主(C.P. Lichtenstein和J.Draper，植物遺傳工程，DNA克隆Vol.II，pp.67 119)。 5.5.1.密度梯度離心除去衛(wèi)星基因組DNA
真核生物基因組通常具有大量主要由核糖體編碼區(qū)或無(wú)明顯功能的 序列組成的重復(fù)DNA。因此，在從真核供體生物制備基因組DNA時(shí)， 可望從文庫(kù)將這些非編碼DNA序列除去。在克隆之前，存在DNA結(jié)合 染料，Hoechst?33258的標(biāo)準(zhǔn)CsCl基因組DNA純化方法可用于分離各種 類型的基因組DNA。 5.5.2.真核生物啟動(dòng)子和終止子片段的制備
通過(guò)使用從已知的啟動(dòng)子和終止子的公開(kāi)序列改變而來(lái)的序列特異 性引物的PCR可制備啟動(dòng)子和終止子基因片段。啟動(dòng)子和終止子序列的 選擇可由采用的宿主生物來(lái)決定。例如如果采用粟酒裂殖糖酵母作為表 達(dá)宿主，可采用天然啟動(dòng)子，例如nmt?1或ura?4和非天然啟動(dòng)子，例如 來(lái)自病毒的那些，如CMV，SV40(Forsburg，1993核酸研究8：4321 -4325)?；騺?lái)自人的，例如絨毛膜促性腺素或促生長(zhǎng)素抑制素(R. Toyama，H.Okayma?1990，F(xiàn)EBS?Letters?268(1)pp.217-221)。 也可采用類似于在可誘導(dǎo)四環(huán)素系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的遺傳改造的啟動(dòng)子 (Faryar等1992，Curr?Genet21：345-349)。
可在商業(yè)可購(gòu)得的PCR儀上使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件和高可靠性 和生產(chǎn)率的DNA聚合酶，例如，但局限于Pfu聚合酶(Stratagene)或 Vent聚合酶(New?England?Biolabs)來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。因?yàn)椴⒎菦](méi) 有引物組都使用相同的反應(yīng)條件，所以可用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法用實(shí) 驗(yàn)來(lái)確定準(zhǔn)確的條件。PCR寡核苷酸引物可商業(yè)購(gòu)得或通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中 熟知的方法來(lái)合成。
PCR產(chǎn)生的啟動(dòng)子和終止子片段可能在5′末端包含限制位點(diǎn)。本文 采用Bgl?II，Xho?I和BamHI以說(shuō)明本發(fā)明的原理。只要該位點(diǎn)不在啟 動(dòng)子或啟動(dòng)子基因序列中出現(xiàn)，可使用任何限制位點(diǎn)。
為了產(chǎn)生與cDNA或基因組DNA插入片段相容的克隆位點(diǎn)，用Bgl II和Xho?I酶切啟動(dòng)子基因片段將產(chǎn)生在它們的5′末端具有Bgl?II位點(diǎn)， 在它們的3′末端具有Xho?I位點(diǎn)的啟動(dòng)子基因片段。僅用Xho?I切割的終 止子將僅在它們的5′末端具有Xho?I位點(diǎn)。5′和3′方向以沿啟動(dòng)子或終 止子基因片段的期望的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)榛A(chǔ)。參見(jiàn)圖5B。
利用大腸桿菌DNA聚合酶1大亞基(Klenow片段)和脫氧核苷酸 亞組(在這里為dCTP和dTTP)的部分補(bǔ)平反應(yīng)可被用來(lái)產(chǎn)生不能通過(guò) 它們的Xho?I末端進(jìn)行自身連接的啟動(dòng)子和終止子片段。由于缺乏堿基 互補(bǔ)性，啟動(dòng)子片段的Bgl?II末端不受影響，并且終止子片段的BamHI 末端沒(méi)有暴露的5′末端為Klehow片段所利用。
用磷酸酶，例如小牛腸堿性磷酸酶處理將防止Bal?II自身連接，并 且在啟動(dòng)子和終止子片段中提供用于連接的相似的末端。通過(guò)在首鏈合 成中摻入5′-甲基dCTP保護(hù)cDNA片段免于NotI的消化(Short，J.M 1988，核酸研究16：7583-7600)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)DNA插入片段來(lái)自mRNA時(shí)，定 向克隆可用來(lái)提高克隆的效率。可以對(duì)啟動(dòng)子和終止子片段為有義的方 向?qū)DNA插入片段單向連接。這可通過(guò)在啟動(dòng)子和終止子片段上產(chǎn)生 不同，不可連接的末端而實(shí)現(xiàn)。Bgl?II，Xho?I，Xma?I和BamHI被用 來(lái)說(shuō)明本發(fā)明?？墒褂卯a(chǎn)生相容末端并可通過(guò)甲基化被保護(hù)的任何酶 對(duì)。
在終止子片段的5′末端Xma?I位點(diǎn)代替了Xho?I位點(diǎn)，而啟動(dòng)子片 段的制備沒(méi)有變化。采用Xma?I是由于通過(guò)插入Klenow片段和dCTP， 它與Not?I相容。這產(chǎn)生了具有兩個(gè)堿基dCTP-dCTP?5′伸出物的終止 子片段，它與適當(dāng)制備的Not?I消化的cDNA基因片段相容。參見(jiàn)圖5A。 5.5.3.DNA插入片段的制備
用于真核文庫(kù)的編碼基因片段將來(lái)自兩個(gè)主要的DNA資源，即基因 組DNA(gDNA)或酶促來(lái)自信使RNA(?mRNA)的互補(bǔ)DNA。制 備gDNA或cDNA的方法非常相似，但不相同。
使用文獻(xiàn)中可獲得的標(biāo)準(zhǔn)方法，或尤其是制造商的說(shuō)明從信使RNA 和/或總RNA制備互補(bǔ)DNA。通過(guò)節(jié)5.3.1描述的異硫氰酸胍方法可同 時(shí)完成總RNA和基因組DNA的分離，并且mRNA可通過(guò)寡-dT纖維 素上的順序親和層析來(lái)分離。
首鏈cDNA的合成可使用在5′末端包含克隆位點(diǎn)，例如Not?I位點(diǎn)的 寡-dT?DNA引物。在靠近5′末端包含內(nèi)在Not?I位點(diǎn)的隨機(jī)序列的寡 核苷酸也可用于隨機(jī)引物的首鏈的合成。使用這一可供選擇的引物避免 了對(duì)于大mRNA的3′偏差。甲基化的脫氧核苷酸，例如5-甲基-dCTP 可與聚合酶，例如Pfu一起使用以提供免于限制性消化的保護(hù)(Short 等，Supra；G.L.Costa，1994，Strategies?7：8)。僅存在于初始引 物中的未甲基化位點(diǎn)可加以酶切，因此確保了cDNA的定義的3′末端。 甲基化的cDNA也可通過(guò)用甲基化作用處理來(lái)制備，但由于所有可獲得 的位點(diǎn)都將被甲基化并且從而對(duì)酶切產(chǎn)生抗性而將喪失克隆的方向性。
通過(guò)連接序列特定性連接物，例如修飾的具有5′磷酸的BamHI連接 物來(lái)制備cDNA的定義的5′末端。當(dāng)對(duì)它的互補(bǔ)的寡核苷酸退火時(shí)，連 接物僅包含兩個(gè)堿基的dGTP-dATP?5′突出端和平整5′磷酸末端?？蓪?修飾的連接物連接到如標(biāo)準(zhǔn)方法中的用Pfu或T4?DNA聚合酶處理的 cDNA上。在連接了修飾的BamHl連接物和用Not?I消化cDNA后，可 將連結(jié)的cDNA用Klenow片段和dGTP處理，產(chǎn)生用于連接到適宜制備 的啟動(dòng)子和終止子片段的被定義的定向的cDNA基因插入片段。片段的 方向是這樣的，即cDNA的5′末端朝向啟動(dòng)子的3′末端，cDNA的3′末 端朝向終止子的5′末端。參見(jiàn)圖5C。
通過(guò)將全部基因DNA用通常切割的限制酶，例如Sau?3AI部分消化 獲得基因組DNA片段。該酶被廣泛用于此目的，并且部分消化之后進(jìn)行 分級(jí)分離，雖然蔗糖梯度是一個(gè)非常標(biāo)準(zhǔn)的方法?？墒褂脕?lái)自起始酶濃 度變化的三種不同消化的片段庫(kù)以使得基因組中的酶的敏感性不同。
在大小分級(jí)分離和純化之后，可將片段用BamHI甲基化酶處理以保 護(hù)任何內(nèi)在的BamHl位點(diǎn)，接著用Klenow片段和dATP和dGTP處理。 這產(chǎn)生在BamHI位點(diǎn)被內(nèi)在甲基化的基因片段，并且僅具有dATP dGTP突出端。參見(jiàn)圖5D。這些片段不能自身連接，并且僅能連接到適 宜制備的啟動(dòng)子和終止子基因片段。 5.5.4.插入片段DNA與啟動(dòng)子和終止子的連接
16℃下，將適宜制備的cDNA，啟動(dòng)子和終止子片段連接過(guò)夜。在 連接反應(yīng)中可采用10啟動(dòng)子(P)：1?cDNA∶10終止子(T)的比例。 最佳比例可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法由實(shí)驗(yàn)確定。定向克隆方法僅提 供一種連接產(chǎn)物，即正確定向的啟動(dòng)子-有義插入片段-終止子基因 盒。
可在16℃下，用不同比例進(jìn)行制備的基因組DNA，啟動(dòng)子和終止 子基因片段的連接。由于沒(méi)有一種連接成分可以自身連接，可通過(guò)實(shí)驗(yàn) 確定最佳比例。估評(píng)形成的連接產(chǎn)物的一半直接可用，形成的1/4的產(chǎn) 物不能進(jìn)行連接循環(huán)，1/4的產(chǎn)物在生長(zhǎng)鏈終止之前僅可被連接一次。
下面組合(P＝啟動(dòng)子，frag＝5′→?3′基因組DNA片段，T＝終 止子garf＝3′→?5′基因組DNA片段)：
1.P-frag-T????5.P-gaff-T
2.T-frag-P????6.T-garf-P
3.P-frag-P????7.P-gaff-P
4.T-frag-T????8.T-garf-T
1，6和2，5組合代表所需的構(gòu)建物，但由于插入片段的方向是隨機(jī) 的，可望50％的構(gòu)建物對(duì)于任何給定的基因是正確的方向(1和6)。
可形成終止子/終止子基因盒，但不能參與任何后續(xù)的克隆步驟，因 為由于在它們3′末端的被平端化未被切割的BamHI末端而缺乏暴露的5′ 末端。
由于Bgl?II末端缺乏5′磷酸(第一輪)，啟動(dòng)子/啟動(dòng)子構(gòu)建物將在 后面僅與其它暴露的BamHI末端的連接中克隆。由于缺乏5′磷酸，后面 與暴露的Bgl?II末端的連接在新的基因盒中是稀少的。暴露的BamHI末 端僅可在固有的組成鏈上而不可能在新引入的基因盒中產(chǎn)生。因此可望 通過(guò)用另一條鏈上的附近的BamHI位點(diǎn)環(huán)化該啟動(dòng)子/啟動(dòng)子基因盒將 終止鏈，這些環(huán)化作用是不可恢復(fù)的。如果該啟動(dòng)子/啟動(dòng)子片段成為連 接效率的一個(gè)明顯問(wèn)題，那么在加入新基因盒之前固定生長(zhǎng)鏈的中間激 酶處理將允許啟動(dòng)子/啟動(dòng)子片段通過(guò)形成Bgl?II/Bgl?II連接產(chǎn)物延伸生 長(zhǎng)鏈。激酶處理促進(jìn)固相中Bgl?II/Bgl?II和Bgl?II/BamHI連接，它將環(huán) 化參與的生長(zhǎng)鏈。 5.5.5.基因盒的系列連接形成多聯(lián)體
用與前面對(duì)原核DNA描述的類似方法進(jìn)行均由啟動(dòng)子/終止子組合 位于其旁側(cè)的基因DNA或cDNA插入片段組成的基因盒的連接。這里主 要的不同是該方法使用核酸內(nèi)切酶BamHI產(chǎn)生用于后面克隆的暴露的3′ 限制位點(diǎn)。使用BamHI甲基化酶或5-甲基-dCTP確保插入DNA中 的BamHI位點(diǎn)被保護(hù)。參見(jiàn)圖5E。
5-10輪鏈連接之后，用BamHI將多聯(lián)體生長(zhǎng)鏈脫保護(hù)，并且被用 Klenow片段和dATP和dGTP處理來(lái)制備用于與表達(dá)載體的連接。這使 得生長(zhǎng)鏈的所有末端不能互相連接，從而消除了任何環(huán)化作用和多聯(lián)體 鏈的損失。
可以5∶1摩爾比將載體DNA連接到多聯(lián)體鏈上。也可采用其它比 例。可將它們?cè)?6℃下進(jìn)行8-12小時(shí)，或者在22℃下進(jìn)行4小時(shí)。 連接后，可洗滌顆粒并將其重新懸浮在內(nèi)含子核酸酶限制緩沖液。按照 生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)描述的進(jìn)行消化?？墒褂萌魏蝺?nèi)含子核酸酶。優(yōu)選酶CeuI， 因?yàn)樗a(chǎn)生非回文3′突出端，該突出端可用于防止自身連接。參見(jiàn)圖5F。 5.5.6.環(huán)化和包含多聯(lián)體構(gòu)建物的載體的轉(zhuǎn)化
通過(guò)用1×連接酶緩沖液將CeuI消化混合物稀釋100倍可促使從固 相釋放的多聯(lián)體-載體分子進(jìn)行分子內(nèi)連接。可加入T4連接酶，并可在 22℃將反應(yīng)進(jìn)行4-6小時(shí)，或16℃過(guò)夜。參見(jiàn)圖5F?？赏ㄟ^(guò)微過(guò)濾 或冷凍干燥來(lái)濃縮產(chǎn)生的構(gòu)建物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入粟酒裂殖糖酵母 菌株或大腸桿菌或淺青紫鏈霉菌菌株中?？墒褂萌魏畏椒ǎ?，但不 局限于電穿孔和改進(jìn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)化方法。 5.5.7.在酵母中表達(dá)的制備載體的制備和連接
本節(jié)描述可通常用于制備使用酵母作為宿主生物的組合基因表達(dá)文 庫(kù)的方法。
為了在粟酒裂殖糖酵母制備文庫(kù)，一個(gè)可能的，但當(dāng)然不是唯一的 載體為大腸桿菌/粟酒裂殖糖酵母穿梭載體pDblet(Brun等1995，基 因，164：173-177)。該載體具有擁有多個(gè)克隆位點(diǎn)和f1噬菌體復(fù) 制起點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，它以適當(dāng)?shù)母呖截悢?shù)表達(dá)，并在大腸桿菌和粟酒裂殖糖 酵母中非常穩(wěn)定。
對(duì)于本發(fā)明，可修飾pDblet的多克隆位點(diǎn)(MCS)以適合已知序 列的BstXI位點(diǎn)。參見(jiàn)圖6B。這是由于用于從固相釋放多聯(lián)體鏈的內(nèi)含 子核酸酶產(chǎn)生定義序列的3′核苷酸突出端(3′GATT…)。在酶切后， 具有序列CCACCTAACTGG的改造的BstXI位點(diǎn)產(chǎn)生適宜的CTAA-3′ 突出端。
為了修飾pDblet，可首先用SacI和NotI切割以除去沒(méi)有正確序列 的存在的BstXI位點(diǎn)。可將曾通過(guò)旋轉(zhuǎn)層析或其它方法純化的pDblet質(zhì) 粒與預(yù)合成的寡核苷酸混合，該寡核苷酸除含BstXI位點(diǎn)的正確序列外， 還包含新的NcoI位點(diǎn)和SacI-和NotI-相容突出端。參見(jiàn)圖6C。在連 接和轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)用NcoI消化檢測(cè)微量制備的克隆的正確性。通過(guò) BstXI和NcoI位點(diǎn)的存在來(lái)鑒定正確的克隆。用BstXI，接著用XhoI位 點(diǎn)處理該修飾的pDblet產(chǎn)生包含5′XhoI位點(diǎn)和3′CTAA?BstXI突出端 的載體。參見(jiàn)圖5E?？蓪⒃撁盖休d體用Klenow片段和dCTP和dTTP 處理以使得它不能自身連接。該載體可被用來(lái)接受多聯(lián)體鏈。 5.5.8.植物表達(dá)文庫(kù)
本節(jié)描述可通常用于使用植物細(xì)胞作為供體和/或宿主生物制備組 合基因表達(dá)文庫(kù)的方法。
為了從植物制備供體DNA，采用下面一般步驟：(1)在冷乙醚中 預(yù)處理植物組織以促進(jìn)植物破碎；(2)通過(guò)與砂，玻璃?；蜓趸?a href='/zhuanli/list-21273-1.html' target='_blank'>鋁一 起研磨將組織機(jī)械勻漿；(3)用篩過(guò)濾以除去細(xì)胞碎片；和(4)用 5.1.2中描述的方法提取DNA。如第5.5.3描述，修飾所產(chǎn)生的純化的 DNA。通過(guò)如節(jié)5.5.3中描述的PCR制備CaMV?35S或胭脂堿合成酶片 段，和胭脂堿合成酶終止子片段。將啟動(dòng)子和終止子片段與DNA片段相 連，并如節(jié)5.5.5和5.5.6中描述的將其與植物DNA載體連接。
優(yōu)選的植物DNA載體為Bin19或其變異體，它使T-DNA邊緣和 根瘤土壤桿菌中共同存在的Ti質(zhì)粒的病毒區(qū)的反式作用功能來(lái)將供體遺 傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物宿主細(xì)胞的核基因組中(Bevan，1984，supra)。 可使用包含多個(gè)克隆位點(diǎn)，例如可商業(yè)購(gòu)得pBI?121或pBI?221(Clontech， Palo?Alto)的修飾的Bin19載體?？敲顾乜剐院?或β-半乳糖苷酶 活性被用作標(biāo)記來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化和預(yù)篩選。
如Potrykus等1988在“植物分子生物學(xué)方法”?Weissbach和 Weissbach編Acadcmic?Press，p.376-378中描述的從煙草植物葉中 制備植物原生質(zhì)體。通過(guò)Power等1988，在“植物分子生物學(xué)”Weissbach 和Weissbach編Academic?Press，p.388-391中描述的使用聚乙二醇 的轉(zhuǎn)化將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入原生質(zhì)體細(xì)胞中。通過(guò)抗生素抗性，例如抗卡 那霉素選擇轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，并可如節(jié)5.4.10中描述的被包被用于預(yù)篩 選。
6.實(shí)施例：組合基因表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和篩選
下面的小節(jié)描述使用陸生微生物或海洋微生物的混合物作為供體生 物制備和預(yù)篩選組合基因表達(dá)文庫(kù)。文庫(kù)使用淺青紫鏈霉菌，大腸桿菌 和粟酒裂殖糖酵母作為宿主生物。結(jié)果表明一些文庫(kù)細(xì)胞顯示供體生物 的代謝活性，表明可能感興趣的供體代謝途徑在宿主生物中是有作用 的。此外，表明一個(gè)文庫(kù)克隆包含編碼與代謝途徑中已知的酶具有序列 同源性的海洋細(xì)菌蛋白質(zhì)的DNA。 6.1.材料和方法
用于本方法的試劑通常是可商業(yè)購(gòu)得的。例如：
基因Clean，Genome盒(Bio?101，Vista，CA)；限制酶，PCR 試劑和緩沖液(Promega，Madison，WI；New?England?Biolabs； Stratagene，La?Jolla，CA)：TA克隆盒(Invitrogen，La?Jolla， CA)；細(xì)菌培養(yǎng)基(Difco，Inc)；Mira翻譯抑制蛋白(Hawaiian 海洋進(jìn)口公司)；pBSK質(zhì)粒，XLl-MR細(xì)胞，SuperCos?1粘粒， Gigapack包裝提取物(Stratagene，La?Jolla，CA)；Qiagen QIAprep質(zhì)粒純化盒(Qiagen，Inc，Chaworth，CA)；親和素結(jié)合磁 多孔玻璃(MPG)珠(CPG，Inc.，New?Jersey)；平皿，96和384 孔平板，Omni-Trays(Nunc)，96和384針頭復(fù)制儀和模板(V& P?Scientific，San?Diego，CA)；氨芐青霉素(IBI，Inc，CA)； 綠色熒光蛋白和GFP?cDNA(Clontech，Inc)；寡核苷酸(Genset， La?Jolla，CA)；別處沒(méi)有指明的細(xì)菌種類和DNA序列(美國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)；7-乙氧基-十七烷基香豆素， BCECF-AM(分子探針，Oregon)；3-甲基苯甲酸鹽，3-氯甲 苯，間甲苯甲酸鹽，四環(huán)素，氯霉素，乙酰氨基酚，砷，銻，順-順粘 康酸鹽，以及除非另有說(shuō)明的其它化學(xué)試劑(Sigma)；和Dynabeads， MPC-M(Dynal，Inc.，Lake?Success，NY)。 6.1.1.培養(yǎng)基的制備
通常用在培養(yǎng)基和溶液中的純化水(ddH2O)通過(guò)軟化，反滲透和 去離子作用來(lái)純化。太平洋海水(海水)從Scripps?Institute?of Oceanography(La?Jolla，CA)獲得并在使用前過(guò)濾。通過(guò)加入鹽 (45.2mm?NaF，48.8mm?SrCl2，0.324mM?H3BO3，0.563mM KBr，6.25mM?KCl，4.99mM?CaCl2，0.7mM?Na2SO4，16.4mM MgCl2，268mM?NaCl，45.8mM?Na2SiO3，1.10mM?EDTA， 1.58mM?NaHCO3)和海洋微量元素(0.01％Mira?Trip)從ddH2O制備合成海水(SSW)。
用1％胰蛋白酶解胨，0.5％酵母提取液，1％NaCl從ddH2O制備 LB培養(yǎng)基。用0.25％胨，0.15％酵母提取液，0.6％(vol/vol)乙二 醇從75％海水或SSW制備W2-B1。
從含有2.5％可溶性土豆淀粉，0.2％葡萄糖，0.5％酵母提取液， 0.5％胨，0.5％Distiller溶液(Nutrition?Products?Co.Louisville， KY)，0.3％碳酸鈣，pH被調(diào)節(jié)至7的ddH2O制備F10A。 6.2.通過(guò)平板復(fù)制和粗滴包被預(yù)篩選放線菌/淺青紫鏈霉菌組合天然 途徑表達(dá)文庫(kù)
被鑒定為種#501-534的34種放線菌種類，被用作供體生物。分 別將微生物培養(yǎng)在F10A培養(yǎng)基，并如節(jié)5.3.1中描述的提取和純化基因 組DNA。
得到約100μg基因組DNA/種，并如節(jié)5.4.2中描述的將它們混合在 一起用于Sau?3A的部分限制性消化。將基因組DNA片段通過(guò)蔗糖梯度 密心進(jìn)行大小分級(jí)分離，收集含有20-40kb片段的級(jí)分，并用Klenow 片段部分補(bǔ)平以與下面類似制備的載體相容(Korch?1987，核酸研究 15：3199?3220；Loftus等1992，生物技術(shù)12：172-175)。在 多批中將0.5-3.0μg?收集的片段連接到0.5-3.0μg用BamHI或XhoI 制備的pIJ?922和pIJ?903中(Hopwood?1985，supra)。將被連接的表 達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到宿主生物淺青紫鏈霉菌菌株TK64中，該菌株通過(guò)用溶 菌酶去除細(xì)胞壁而變得適合(Hopwood?1985，supra)。產(chǎn)生約11,000 個(gè)單獨(dú)的克隆，擴(kuò)增并以菌絲體形式貯存在20％乙二醇中，以及以孢子 懸浮液形式貯存在-70℃下50％乙二醇中。
為了制備用于篩選各個(gè)克隆的文庫(kù)，將轉(zhuǎn)化的TK64宿主細(xì)胞鋪開(kāi) 裝有F10A瓊脂的150mm平皿中。鋪開(kāi)后，30℃讓平皿保溫21小時(shí)。 用5μg/ml，1ml/平板的硫鏈絲菌肽覆蓋平皿來(lái)進(jìn)行選擇。48-72小時(shí) 后，用滅菌牙簽挑取菌落并一孔一個(gè)地轉(zhuǎn)移到96孔平皿中。各孔含有 F10A培養(yǎng)基。在30℃，讓接種的主皿放置1-4天。將過(guò)夜主96-孔 平皿用作源平皿復(fù)制到一個(gè)或多個(gè)工作96孔平板或Omni-Trays中。 接著分別包被主96孔平皿并在-80℃冷凍。用在每次使用之前用燃燒 滅菌的96-針頭復(fù)制儀進(jìn)行復(fù)制。
將工作96孔平皿用作源平皿將文庫(kù)復(fù)制到一系列分化和/或選擇培 養(yǎng)基和指示平板中。選擇性抗生素包括紅霉素，新生霉素和新霉素。分 化培養(yǎng)基包括含有底物X-吡喃葡糖苷和X-葡糖酸的F10A和R5培養(yǎng) 基。指示平皿包括生長(zhǎng)在F10A上，接著用腸球菌(E.faecalis)，枯草 芽孢桿菌(B.subtilis)或SOS?Chromotest(具有X-gal)的指示菌 苔覆蓋的文庫(kù)克隆。匯編結(jié)果并與鏈霉菌宿主TK64的圖譜進(jìn)行比較。
還通過(guò)粗滴包被預(yù)篩選文庫(kù)克隆。對(duì)于每次預(yù)篩選，用如節(jié)5.4.13 中描述的方法包被文庫(kù)的50,000個(gè)擴(kuò)增的克隆。 6.3.通過(guò)粗滴包被預(yù)篩選放線菌/大腸桿菌組合嵌合途徑表達(dá)文庫(kù)
將如節(jié)6.2描述的從34個(gè)放線菌種(鑒定為種501-534)獲得的 基因DNA用于在淺青紫鏈霉菌中制備組合嵌合途徑基因表達(dá)文庫(kù)。收集 包含Sau?3A消化的基因組DNA的2-7kbp的片段。
如節(jié)5.5.3中描述的將基因組DNA片段的等分試樣連接到不同的啟 動(dòng)子上以分別形成基因盒。通過(guò)使用用于每次循環(huán)的不同庫(kù)的基因盒的8 次循環(huán)的連接和脫保護(hù)形成多聯(lián)體，這樣產(chǎn)生的多聯(lián)體各自具有8個(gè)包 含與基因組DNA片段相連的8個(gè)不同的啟動(dòng)子的基因盒。
將10μg多聯(lián)體環(huán)化并在BamHI位點(diǎn)與0.5μg?SuperCos?1載體連接 以形成表達(dá)構(gòu)建物，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明(Stratagene)在體外包裝該構(gòu)建 物以用于大腸桿菌宿主細(xì)胞的感染。獲得約1,000,000個(gè)單個(gè)克隆，擴(kuò) 增并收集形成擴(kuò)增的文庫(kù)。將文庫(kù)貯存于-70℃。如節(jié)5.4.10中描述 的包被擴(kuò)增的細(xì)胞并如節(jié)5.4.14中描述的進(jìn)行預(yù)篩選。 6.4.通過(guò)粗滴包被預(yù)篩選真菌/粟酒裂殖糖酵母組合嵌合途徑表達(dá)文 庫(kù)
使用從ATCC獲得的下面真菌供體生物制備兩個(gè)組合嵌合途徑表達(dá) 文庫(kù)：木霉(Trichoderma?reesei)，尖孢鐮孢，婁格法爾特氏青霉， 寡孢根霉，粗糙鏈孢霉，布拉氏須霉，煙曲霉，黃曲霉，Emericella heterothallica，毛殼霉(C.gracile)，點(diǎn)青霉，產(chǎn)黃青霉。
以中等轉(zhuǎn)速將各種分別在500ml土豆葡萄糖瓊脂(PDA；Difco) 麥芽提取液瓊脂(MEA；Difco)中培養(yǎng)48-72小時(shí)，將1×104- 1×106孢子/ml的孢子接種物放到1升培養(yǎng)燒瓶中的500ml土豆提取液 或麥芽提取液肉湯中，并在22℃，225轉(zhuǎn)數(shù)/分下生長(zhǎng)48-72小時(shí)。
真空下通過(guò)用Miracloth(Calbiochern)過(guò)濾收集培養(yǎng)物。將收集 到的菌絲體固體用2升ddH2O洗滌，并且在冷凍干燥之前空氣干燥10 分鐘。如節(jié)5.3.1和5.3.2中描述的，從菌絲體提取和純化真菌基因組 DNA和mRNA。將部分收集的菌絲體冷凍干燥并在-70℃下貯存。
如節(jié)5.4.2所描述的制備真菌基因組DNA片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將真 菌mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA(Sambrook等1989，Watson?CJ和Jackson JF(1985)DNA克?。簩?shí)踐方法79-88，IRL?Press)。從各種中 收集重量相等的DNA片段以產(chǎn)生基因組DNA庫(kù)和cDNA庫(kù)。
將包含約5-10μg?DNA的各庫(kù)獨(dú)立地用來(lái)裝配重組嵌合途徑表達(dá) 文庫(kù)。如節(jié)5.5.2中描述的制備下面粟酒裂殖糖酵母相容的啟動(dòng)子和終 止子：CMV速發(fā)/早期，SV40早期，RSV，HSV胸苷激酶，CaMV， nmtI，adh1和uva4啟動(dòng)子。如節(jié)5.5.4中描述的將啟動(dòng)子和終止子片 段與cDNA和基因組DNA庫(kù)混合。如節(jié)5.5.5中描述的將平均大小為 5kb的各基因盒多聯(lián)體化。將各自包含8個(gè)基因盒的最終的多聯(lián)體環(huán)化并 插入載體修飾的pDblet中(Brun等，1995，基因，Vol.164?pp.173- 177)。借助于Gietz和Woody的乙酸鋰法將表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到粟酒裂 殖糖酵母細(xì)胞中(FD?Gietz和RA?Woody，酵母的分子遺傳學(xué)：實(shí)踐 方法，第8章，pp?121-134)。在選擇Ura4標(biāo)記的存在時(shí)，獲得并擴(kuò) 增110,000個(gè)粟酒裂殖糖酵母的克隆。收集克隆形成準(zhǔn)備用預(yù)篩選的被 擴(kuò)增文庫(kù)。進(jìn)行下面的預(yù)篩選：酶底物試驗(yàn)，抗微生物活性，抗生素抗 性。 6.5.通過(guò)平板復(fù)制預(yù)篩選海洋革蘭氏(?)菌/大腸桿菌文庫(kù)
從Bahamas島附近收集的海水中獲得的海洋細(xì)菌由Harbor?Branch Oceanographic?Institute提供。在制備DNA文庫(kù)以確定重復(fù)性并有利用 于確定在完成的文庫(kù)中進(jìn)行預(yù)篩選的順序之前，檢測(cè)每種野生類型的革 蘭氏陰性著色的海洋細(xì)菌種類
在親本種類的海洋革蘭氏陰性菌/大腸桿菌文庫(kù)中進(jìn)行下面分析，結(jié) 果如下： 分析???????????????????????37種中的陽(yáng)性種類 Chromazurol?S(CAS)???????????????27 釀膿鏈球菌???????????????????????0 腸球菌(E.faecalis)???????????????3 奇異變形菌???????????????????????1 橙色八疊球菌?????????????????????10 金黃色葡萄球菌???????????????????6 淀粉消化液???????????????????????17
在這些分析中，下面步驟被選擇在大腸桿菌；CAS；金黃色葡萄球 菌；橙色八疊球菌；淀粉消化液中的組合基因表達(dá)文庫(kù)的細(xì)胞中進(jìn)行。
簡(jiǎn)而言之，將40種親本種類的每一種接種到5ml?B3培養(yǎng)基中并在 30℃，以300轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在Falcon?2059管中培養(yǎng)過(guò)夜。沉淀過(guò)夜的培 養(yǎng)物并用標(biāo)準(zhǔn)方法提取全部基因組DNA。通過(guò)在瓊脂糖凝膠中顯象定量 基因組DNA，將5μg?40種的每一種放到總共為200μg的庫(kù)。如節(jié)5.1. 4中描述的在大腸桿菌中裝配組合天然連徑表達(dá)文庫(kù)。根據(jù)SuperCos?1 生產(chǎn)商的說(shuō)明(Stratagene)將DNA部分消化，連接到SuperCos?1中并 包裝在λ噬菌體，以導(dǎo)入大腸桿菌。產(chǎn)生5×106單個(gè)克隆，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方 法擴(kuò)增到7×108/ml?cfu。-70℃下，將擴(kuò)增的貯液貯存在15％乙二 醇中以備后面使用。
為了制備用于篩選各克隆的文庫(kù)，將擴(kuò)增的文庫(kù)細(xì)胞鋪在含有50ml LB，100mg/ml氨芐青霉素和50mg/ml卡那霉素的150mm平皿中。室溫 下在黑暗中將平皿預(yù)先干燥24小時(shí)，將7×108/ml?cfu貯存用LB稀釋 至500cfu/ml。將1ml涂布各個(gè)150mm平皿中，涂布后，37℃下，讓 平皿保溫過(guò)夜。用滅菌的牙簽挑取產(chǎn)生的菌落并一個(gè)孔一個(gè)地轉(zhuǎn)移到384 孔平皿中。挑選6400個(gè)菌落并堆成堆。各孔含有75μl?LB，50μg/ml 氨芐青霉素，7％乙二醇。不接種外面的行(總共80孔)，但類似地裝 有培養(yǎng)基以在后面保溫和冷凍干燥期間提供一個(gè)蒸發(fā)屏障。37℃，將這 些接種的主皿不振蕩放置16小時(shí)。過(guò)夜的主384孔平皿被用作源平板復(fù) 制到一個(gè)或多個(gè)工作多孔平皿或Omn1-Trays中。接著分別包被主384 -孔平皿并在-80℃下冷凍。用多針頭復(fù)制儀進(jìn)行復(fù)制，在每次使用之 前和之后，在燃燒之前順序地將384針頭復(fù)制儀浸入漂白液中20秒，水 中30秒，接著在乙醇中5秒。
工作多孔平皿或Omni-Trays被用作源平皿以將DNA文庫(kù)復(fù)制到 一系列分化和/或選擇培養(yǎng)基中(例如鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基(CAS)或抗微 生物菌苔)。匯編結(jié)果并與用于構(gòu)建DNA文庫(kù)的野生型海洋細(xì)菌的圖譜 比較。
分離6個(gè)對(duì)淀粉消化活性陽(yáng)性的克隆。檢測(cè)這些克隆抑制金黃色葡 萄球菌或橙色八疊球菌的能力，發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆抑制橙色八疊球菌的生 長(zhǎng)。將該克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析，包括DNA序列分析，并且發(fā)現(xiàn)其包含編 碼與聚酮化合物合成途徑中的那些同源的蛋白質(zhì)的DNA序列。圖10表 現(xiàn)來(lái)自克隆CXC-AMN?20的DNA序列的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與天藍(lán)色 鏈霉菌的放線紫素脫水酶基因的一致性。
通過(guò)用有機(jī)溶劑提取對(duì)來(lái)自該克隆的活性成分進(jìn)行進(jìn)一步分析并根 據(jù)抗微生物測(cè)定進(jìn)行純化。
通過(guò)復(fù)合PCR對(duì)該克隆含有的DNA序列進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定以確定同 種親本種類。根據(jù)克隆的序列選擇和合成PCR引物。高度保守的核糖體 RNA引物序列在PCR中被用作陽(yáng)性對(duì)照物。該陽(yáng)性對(duì)照物產(chǎn)生約2kb 的片段。從該克隆或其同種親本種類產(chǎn)生的擴(kuò)增子小于600bp。起初， 通過(guò)使用親本種類的一組四個(gè)庫(kù)的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行復(fù)合 PCR反應(yīng)。來(lái)自庫(kù)1-3的基因組DNA在擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生擴(kuò)增子。參見(jiàn)圖 11。用各親本種類的基因組DNA重復(fù)復(fù)合PCR反應(yīng)。圖12表明在PCR 反應(yīng)中來(lái)自庫(kù)1種類#6，庫(kù)2種類#18和庫(kù)3種類#31的基因組DNA 為陽(yáng)性。這表明被鑒定的DNA序列可能來(lái)自這三種海洋細(xì)菌的任何種 類。
因此，結(jié)果表明組合基因表達(dá)文庫(kù)包含帶有來(lái)自海洋細(xì)菌，編碼感 興趣代謝途徑的遺傳物質(zhì)的克隆。而且，還表明文庫(kù)中的這些克隆可被 鑒定并通過(guò)預(yù)篩選分離。 6.6.通過(guò)粗滴預(yù)篩選海洋革蘭氏(-)菌/大腸桿菌文庫(kù)
通過(guò)稱量藻酸鈉(Protanol?LF?20/60，Pronova?Biopolymer， Drammer，Norway)并使用壓力混合器以2000轉(zhuǎn)/分以1％的濃度將其 溶解于100ml無(wú)菌水中來(lái)包被30,000個(gè)克隆。加入1ml含有30,000個(gè) 細(xì)胞的文庫(kù)懸浮液以使每滴中埋入1-5個(gè)克隆。讓混合物靜置30分鐘 放氣。接著讓混合物從25號(hào)針中擠出。將這些流體滴至裝有135mM氯 化鈣的0.5L輕輕攪拌的燒杯中。讓滴變硬10分鐘并隨后轉(zhuǎn)移到滅菌的 燒瓶中，并除去氯化鈣，用LB/Amp培養(yǎng)基和80ug/ml底物X-氨基葡 糖苷代替。其它底物為X-乙酸鹽，X-吡喃葡糖苷，X-gal和與聚 酮化合物途徑相關(guān)的特定的常規(guī)底物。30℃下，將含滴的燒瓶振蕩過(guò)夜 并且第二天早上檢測(cè)由蘭色菌落的出現(xiàn)所代表的陽(yáng)性克隆。還如節(jié)5.4 14中描述的將克隆與指示細(xì)胞一起其包被。指示細(xì)胞包括金黃色葡萄球 菌，橙色八疊球菌。
將滴以單層放置在一大的干凈盤并用眼睛觀察?；厥找粋€(gè)X-氨基 葡糖苷陽(yáng)性菌落，重新懸浮于15％乙二醇中并在-70℃貯存?；厥掌?它陽(yáng)性菌落，并放在含有LB/Amp和50mM檸檬酸鈉pH?7.4的96孔主皿 中以溶解基質(zhì)，并在37℃下讓其生長(zhǎng)過(guò)夜。將這些過(guò)夜的主96孔平皿 用作源平皿復(fù)制到一個(gè)或多個(gè)工作多孔平皿或Omni-Trays中。接著分 別包被主96孔平皿并-80℃冷凍，將陽(yáng)性克隆送去對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行特定檢 測(cè)或送去進(jìn)行另一輪預(yù)篩選或篩選。進(jìn)一步篩選通過(guò)使用多針頭復(fù)制儀 進(jìn)行復(fù)制來(lái)完成。
由此公開(kāi)了本發(fā)明的示范性實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到公 開(kāi)的僅是示范性的，可在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行各種其它選擇，改進(jìn)和修改。 因此，本發(fā)明不受本文舉例的具體實(shí)施方案限制，但僅受下面權(quán)利要求 書(shū)的限制。
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