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一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑盒及應(yīng)用

閱讀：1080發(fā)布：2020-05-23

專利匯可以提供一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑盒及應(yīng)用專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、 試劑 盒 及應(yīng)用，該試劑盒包括特異性引物對及探針、側(cè)流層析 試紙 條；所述探針5’末端的修飾方式為：用FITC進行標記，3’末端的修飾方式為：引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)；所述探針在AP位點前至少要保留30bp的 堿 基，在AP位點之后至少有15bp的堿基；所述下游引物的5’末端的修飾方式為：標記 生物 素。本發(fā)明優(yōu)點在于：不依賴實驗室設(shè)備，能夠很好的應(yīng)用到現(xiàn)場檢測中，可實現(xiàn)在25℃-45℃，20min內(nèi)快速檢測副溶血弧菌。，下面是一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑盒及應(yīng)用專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對，包括特異性引物對以及探針，其特征在于，所述特異性引物及探針的序列為：
上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
探針：
5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG?ATCA-SpC3
2.一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的特異性引物對及探針、側(cè)流層析試紙條；
所述探針的長度至少為46bp；
所述探針5’末端的修飾方式為：用FITC進行標記，3’末端的修飾方式為：引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)；
所述探針在AP位點前至少要保留30bp的堿基，在AP位點之后至少有15bp的堿基；
所述下游引物的5’末端的修飾方式為：標記生物素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括水解緩沖液、雙蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸鎂。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述側(cè)流層析試紙條通過與水解緩沖液和樣品的混合物進行接觸顯色。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，采用所述試劑盒檢測在35℃-45℃，20min內(nèi)可以得到檢測結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，采用所述試劑盒進行檢測的檢測下限為1CFU/反應(yīng)。
7.權(quán)利要求1所述的引物對，以及權(quán)利要求2～6任一項所述的試劑盒在區(qū)分副溶血弧菌與其他弧菌以及其他細菌的樣本中的應(yīng)用，其特征在于，所述其他弧菌包括：創(chuàng)傷弧菌，溶藻弧菌，哈維是弧菌，霍亂弧菌，地中?；【_弧菌，沙門氏菌，丹增李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用檢測，其特征在于，所述樣本包含水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，水產(chǎn)品加工食品，養(yǎng)殖環(huán)境等。

說明書全文

一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑

盒及應(yīng)用

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

[0002] 目前，檢測副溶血弧菌的常用方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，免疫診斷，核酸診斷，其中，核酸診斷主要有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和(LAMP)?兩種方法，傳統(tǒng)培養(yǎng)法是在我國頒布的國家標準GB/T4789.7—2008?《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血弧菌檢驗》中，將送檢的樣品增菌后進行分離培養(yǎng)，隨后對分離培養(yǎng)的可疑菌株進行形態(tài)學(xué)和生化鑒定，對鑒定結(jié)果進行綜合評價，確定可疑菌株是否是副溶血弧菌。該方法檢測周期長，工作量大，對工作人員實驗技能要求高，該實驗操作只能在實驗室進行，無法進行現(xiàn)場檢測。
[0003] 免疫診斷是結(jié)合抗原抗體免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)的一種可視化檢測。通過酶降解底物呈現(xiàn)的顏色深淺來判斷檢測抗原的多少。該方法特異性強，但對試劑的選擇性高，靈敏度低，并且容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
[0004] 核酸診斷技術(shù)因其特異性強，靈敏度高而受到人們的高度關(guān)注，常用的核酸診斷技術(shù)主要包括常規(guī)PCR擴增和LAMP兩大類。據(jù)報道?PCR技術(shù)用于檢測病原體的種類已超過100多種，但是由于要經(jīng)過三個溫度階段，實驗設(shè)備要求高且耗時長。因此，PCR技術(shù)被局限于實驗室研究，不宜做野外實地檢測(POCT檢測)。與PCR相比，等溫擴增技術(shù)更簡單，快速，其特異性和靈敏度與PCR相當，該技術(shù)既克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)高溫變性獲得單鏈模板的缺陷，也避免了升降溫的過程，無需溫控設(shè)備，很大程度上降低了檢測成本。
[0005] 傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測副溶血弧菌的檢測周期長，工作量大，對工作人員實驗技能要求高，該實驗操作只能在實驗室進行，無法進行現(xiàn)場檢測。PCR要經(jīng)過三個溫度階段，實驗設(shè)備要求高且耗時長，因此，?PCR技術(shù)被局限于實驗室研究，不宜做野外實地檢測(POCT檢測)。?LAMP在很大程度上避免了PCR的缺陷，但其自身也存在一定的問題：?1、LAMP引物設(shè)計比較復(fù)雜，需要2-3對引物；2、LAMP很容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，降低結(jié)果的精確度；4、LAMP擴增時間一般在?40min-60min，在一定程度上增加了時間成本。
[0006] 傳統(tǒng)的副溶血弧菌檢測方法由于檢測時間長，設(shè)備依賴性強，對檢測人員實驗操作技能要求高，因此被局限于實驗室檢測，不適合進行現(xiàn)場檢測。此外，再樣本送檢過程中會影響樣本的質(zhì)量，對后期檢測造成不同程度的影響。因此需要建立一個不依賴于設(shè)備的現(xiàn)場快速檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的檢測副溶血弧菌的技術(shù)無法很好的應(yīng)用到現(xiàn)場快速檢測中的缺點，而提出的一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對、試劑盒及應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對，包括特異性引物對以及探針，所述特異性引物及探針的序列為：
[0009] 上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
[0010] 下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
[0011] 探針：
[0012] 5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG?ATCA-SpC3[0013] 本發(fā)明還涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的試劑盒，所述試劑盒包括：特異性引物對及探針、側(cè)流層析試紙條；所述探針的長度至少為46bp；所述探針5’末端的修飾方式為：用FITC進行標記，3’末端的修飾方式為：引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)；所述探針在AP位點前至少要保留30bp的堿基，在AP位點之后至少有15bp的堿基；所述下游引物的5’末端的修飾方式為：標記生物素。
[0014] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括水解緩沖液、雙蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸鎂。
[0015] 優(yōu)選地，所述側(cè)流層析試紙條通過與水解緩沖液和樣品的混合物進行接觸顯色。
[0016] 優(yōu)選地，采用所述試劑盒檢測在35℃-45℃，20min內(nèi)可以得到檢測結(jié)果[0017] 優(yōu)選地，采用所述試劑盒進行檢測的檢測下限為1CFU/反應(yīng)。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種上述特異性引物對和試劑盒在區(qū)分副溶血弧菌與其他弧菌以及其他細菌的樣本中的應(yīng)用；
[0019] 所述其他弧菌包括：創(chuàng)傷弧菌，溶藻弧菌，哈維是弧菌，霍亂弧菌，地中?；【?，席羅弧菌，沙門氏菌，丹增李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌。
[0020] 優(yōu)選地，所述樣本包含水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，水產(chǎn)品加工食品，養(yǎng)殖環(huán)境等。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 1、在海產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，對病原菌的早期檢測在疾病的預(yù)防和治療中極其重要，本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)Ω比苎【M行現(xiàn)場快速檢測，并且對操作人員要求低，很適合養(yǎng)殖戶自身使用，而且能夠快速得到檢測結(jié)果。
[0023] 2、保證海產(chǎn)品食品安全及其重要，副溶血弧菌主要分布在沿海及海產(chǎn)品中，誤食攜帶副溶血弧菌的海產(chǎn)品嚴重威脅人們的身體健康，本發(fā)可以快速的對海產(chǎn)品市場中的海產(chǎn)品進行現(xiàn)場檢測，避免被副溶血弧菌感染的海產(chǎn)品流入到餐桌，威脅讓人們的身體健康。
[0024] 3、快速、便攜、現(xiàn)場檢測，本發(fā)明創(chuàng)造的一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的方法及應(yīng)用在不依賴實驗室設(shè)備，能夠很好的應(yīng)用到現(xiàn)場檢測中；本發(fā)明創(chuàng)造的檢測方法在20min內(nèi)可以得到檢測結(jié)果。
[0025] 4、可視化檢測，本發(fā)明創(chuàng)造的檢測副溶血弧菌的方法是將RPA?技術(shù)和LFS技術(shù)有機結(jié)合，是檢測的擴增產(chǎn)物不需要瓊脂糖凝膠電泳檢測額，可以短時間內(nèi)檢測出可視化結(jié)果。
[0026] 5、事實監(jiān)控：本發(fā)明創(chuàng)造的檢測副溶血弧菌的方法具有快速便攜等特點，且不依賴與實驗室設(shè)備和高素質(zhì)技術(shù)人員，養(yǎng)殖戶可以進行現(xiàn)場快速檢測，在養(yǎng)殖過程中可以實時監(jiān)控副溶血弧菌的情況。附圖說明
[0027] 圖1為試紙條原理圖；
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例中特異性檢測的結(jié)果示意圖；
[0029] 圖3為本發(fā)明實施例中體系優(yōu)化檢測的結(jié)果示意圖；
[0030] 圖4為本發(fā)明實施例中最低檢出限定測定的結(jié)果示意圖。

具體實施方式

[0031] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。
[0032] 本發(fā)明涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的特異性引物對，包括特異性引物對以及探針，特異性引物及探針的序列為：
[0033] 上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
[0034] 下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
[0035] 探針：
[0036] 5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG?ATCA-SpC3[0037] 本發(fā)明還涉及一種基于RPA-LFS快速檢測副溶血弧菌的試劑盒，試劑盒包括：特異性引物對及探針、側(cè)流層析試紙條；探針的長度至少為46bp；探針5’末端的修飾方式為：用FITC進行標記，3’末端的修飾方式為：引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)；探針在AP位點前至少要保留30bp?的堿基，在AP位點之后至少有15bp的堿基；下游引物的5’末端的修飾方式為：標記生物素。
[0038] 檢測試劑盒還包括水解緩沖液、雙蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸鎂。
[0039] 側(cè)流層析試紙條通過與水解緩沖液和樣品的混合物進行接觸顯色。
[0040] 采用試劑盒檢測在35℃-45℃，20min內(nèi)可以得到檢測結(jié)果
[0041] 采用試劑盒進行檢測的檢測下限為1CFU/反應(yīng)。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種上述特異性引物對和試劑盒在區(qū)分副溶血弧菌與其他弧菌以及其他細菌的樣本中的應(yīng)用；
[0043] 其他弧菌包括：創(chuàng)傷弧菌，溶藻弧菌，哈維是弧菌，霍亂弧菌，地中?；【?，席羅弧菌，沙門氏菌，丹增李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌。
[0044] 樣本包含水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，水產(chǎn)品加工食品，養(yǎng)殖環(huán)境等。
[0045] 試紙條原理：DNA擴增產(chǎn)物的可視化檢測基于：1)RPA擴增產(chǎn)物的化學(xué)修飾；2)用AuNPs功能化的抗體。在本發(fā)明中，擴增產(chǎn)物分別在兩端被FITC和生物素修飾，該抗體是來自小鼠的抗FITC，并被?AuNPs功能化。將擴增產(chǎn)物加載到樣品墊上后，它們會遷移穿過膠體金墊并與抗FITC?AuNPs結(jié)合。當這些擴增產(chǎn)物到達用鏈霉親和素包被的檢測線時，由于生物素修飾而被捕獲，并導(dǎo)致AuNP聚集，在檢測線上顯示紅色。未與擴增產(chǎn)物結(jié)合的抗FITC抗體分子繼續(xù)遷移至涂有抗小鼠抗體的對照線，并在此處聚集以驗證試紙條的可用性。通過LFS測試，可以直觀地讀取RPA擴增產(chǎn)物，其中正信號為測試線的紅色帶，而驗證信號為控制線的第二紅色帶。如圖1所示。
[0046] 引物設(shè)計：根據(jù)副溶血弧菌不耐熱溶血毒素(TLH)，耐熱直接溶血毒素(TDH)，相對耐熱直接溶血毒素(TRH)的基因為靶序列，在NCBI?primer?blast中設(shè)計五對引物，并將設(shè)計好的引物送至合成公司合成。引物設(shè)計原則為：1、引物長度為30-36bp；2、引物GC含量為20％-80％；3、引物Tm值為50-100。
[0047] 引物篩選：以副溶血弧菌為模板，用RPA試劑盒進行擴增，檢測?5對引物的擴增效果。首先取10裝有重組酶和聚合酶等組分的干粉管，想里面加入41.5μL的A?buffer，加入2.4μL的上游引物和下游引物(10μM)，充分渦旋混勻并離心后，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL的模板DNA(即副溶血弧菌基因組)和2.5μL的280mM?醋酸鎂加到蓋子上，NTC用1μL?H20補足體積，瞬時離心時模板和鎂離子同時加入反應(yīng)體系中，最后充分渦旋混勻并瞬時離心后，將樣品放在恒溫金屬浴中37℃反應(yīng)30min。并將擴增產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒進行純化，清潔后的樣品可用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
[0048] 擴增效果最好的引物對序列為：
[0049] 上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
[0050] 下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
[0051] 引物種間特異性檢測：分別以副溶血弧菌，創(chuàng)傷弧菌，溶藻弧菌，霍亂弧菌，沙門氏菌，單增李斯特菌，金黃色葡萄求菌的基因組為模板，檢測篩選出擴增效果最佳引物的種間特異性。取8管裝有重組酶和聚合酶等組分的干粉管，向里面加入41.5μL的A?buffer，加入?2.4μL的上游引物和下游引物(10μM)，充分渦旋混勻并離心后，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將2.5μL的280mM醋酸鎂加到蓋子上，按順序依次將不同基因組的模板加入相應(yīng)的管子中，NTC用1μL?H20補足體積，最后充分渦旋混勻并瞬時離心后，將樣品放在恒溫金屬浴中
37℃反應(yīng)30min。并將擴增產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒進行純化，清潔后的樣品可用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
[0052] 探針設(shè)計：根據(jù)篩選出的最佳引物設(shè)計探針，在primer5.0軟件中設(shè)計探針，探針位置在上游引物和下游引物之間。探針設(shè)計原則為：?1、引物探針篩選探針長度至少46bp；2、探針5’末端用FITC進行標記，3’末端引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)；3、AP位點前至少要保留30bp的堿基，AP位點之后至少有
15bp的堿基。下游引物的5’末端標記生物素。如此一來，探針和下游引物擴增產(chǎn)物的一端帶有FITC，另一端帶有生物素，因此可以用LFS檢測。
[0053] 探針篩選：采用Twixt?Amp?nfo試劑盒篩選引物探針。擴增反應(yīng)總體積為50μL，以副溶血弧菌基因組為模板，在裝有各種酶組分的干粉管中加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1?μL模板DNA(副溶血弧菌基因組DNA)和2.5μL的280mM醋酸鎂加到管蓋上，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，最后將反應(yīng)體系放入37℃反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后取2mL的EP管并編號向EP管中加入95μL的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入EP管，2min后可以判定結(jié)果。
[0054] 篩選出的最佳探針序列為：
[0055] 5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG?ATCA-SpC3[0056] RPA-LFS種間特異性檢測：采用Twixt?Amp?nfo試劑盒檢測篩選出來的探針、引物。擴增反應(yīng)總體積為50μL，分別以以副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌，霍亂弧菌，沙門氏菌，單增李斯特菌，金黃色葡萄球菌基因組為模板，在裝有各種酶組分的干粉管中加入29.5μL?的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，2.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL模板DNA(副溶血弧菌基因組DNA)和2.5μL的280mM醋酸鎂加到管蓋上，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，最后將反應(yīng)體系放入37℃反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后取2mL的EP管并編號向EP管中加入95μL的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入EP管，2min后可以判定結(jié)果。結(jié)果如圖2所示。
[0057] RPA-LFS反應(yīng)溫度優(yōu)化：以副溶血弧菌基因組為模板，選用篩選出來的一組引物探針進行反應(yīng)溫度優(yōu)化，反應(yīng)溫度梯度設(shè)置為?15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,37℃,40℃,45℃,50℃。取10個裝有重組酶、聚合酶等組分的干粉管，向管內(nèi)加入29.5μL的再水化buffer，?2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL模板DNA(副溶血弧菌基因組DNA)和?2.5μL的280mM醋酸鎂加到管蓋上，NTC加入1μLddH2O補足體積，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，最后將反應(yīng)體系分別方人員對應(yīng)的溫度中反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后取2mL的EP管并編號向EP管中加入95μL的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入EP管，2min后可以判定結(jié)果。結(jié)果如圖3所示。
[0058] RPA-LFS反應(yīng)時間優(yōu)化：以副溶血弧菌基因組為模板，選用篩選出來的一組引物探針進行反應(yīng)時間優(yōu)化。取9個裝有重組酶、聚合酶等組分的干粉管，向管內(nèi)加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL模板DNA(副溶血弧菌基因組DNA)和2.5μL的?280mM醋酸鎂加到管蓋上，NTC加入1μLddH2O補足體積，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，最后將反應(yīng)體系分再37℃分別反應(yīng)?5min，10min，15min，20min，25mmin，30min，35min，40min后進行LFS檢測。反應(yīng)結(jié)束后取2mL的EP管并編號向EP管中加入95μL?的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入EP管，2min后可以判定結(jié)果。結(jié)果如圖3所示。
[0059] RPA-LFS檢出限測定：分別以107，106，105，104，103，102，?101CFU的副溶血弧菌基因組作為模板，進行RPA-LFS檢出限測定。取8個裝有重組酶、聚合酶等組分的干粉管，向管內(nèi)加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL模板DNA(副溶血弧菌基因組DNA)和2.5μL的280mM醋酸鎂加到管蓋上，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，NTC加入1μLddH2O補足體積，最后將反應(yīng)體系分在37℃分別反應(yīng)30min后進行LFS檢測。反應(yīng)結(jié)束后取2mL?的EP管并編號向EP管中加入95μL的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入?EP管，2min后可以判定結(jié)果。結(jié)構(gòu)如圖4所示。
[0060] qPCR檢出限測定：分別以107，106，105，104，103，102，101CFU?的副溶血弧菌基因組作為模板，進行qPCR檢出限測定。反應(yīng)體系為：?10μL?MonAmpTM?SYBR?Green?qPCR?Mix，0.4μL上游引物(10μM)，?0.4μL下游引物(10μM)，1μL基因組模板，8.2μLddH2O補足體積至20μL。將加樣完成的體系渦旋混勻并瞬時離心后用羅氏定量?PCR儀檢測，檢測程序為：95℃
30s,95℃10s,60℃10s,72℃30s。?(每個梯度做三個平行)。
[0061] RPA-LFS初步應(yīng)用：用建立完整的RPA-LFS檢測方法檢測從環(huán)境中分離出來的菌株是否是副溶血弧菌。將分離出來的50個菌株過夜培養(yǎng)后取1mL菌液離心后加入100μL?ddH2O重懸，沸水煮10min使基因組DNA充分釋放出來作為模板進行RPA-LFS檢測。取51個裝有重組酶、聚合酶等組分的干粉管，向管內(nèi)加入29.5μL的再水化?buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，為保證所有反應(yīng)體系的同步進行，將1μL模板DNA(副溶血弧菌基因組?DNA)和2.5μL的280mM醋酸鎂加到管蓋上，瞬時離心并充分渦旋混勻后再瞬時離心，NTC加入1μLddH2O補足體積，最后將反應(yīng)體系分在37℃分別反應(yīng)30min后進行LFS檢測。反應(yīng)結(jié)束后取2mL的EP管并編號向EP管中加入95μL的稀釋buffer，再去5μL的擴增產(chǎn)物加入EP管中，充分混勻、離心后將試紙條按正確的方向插入EP管，?2min后可以判定結(jié)果。
[0062] qPCR樣本檢測：以從環(huán)境中分離出來的菌株基因組為模板用?qPCR進行檢測。反應(yīng)體系為：10μL?MonAmpTM?SYBR?Green?qPCR?Mix，?0.4μL上游引物(10μM)，0.4μL下游引物(10μM)，1μL基因組模板，8.2μLddH2O補足體積至20μL。將加樣完成的體系渦旋混勻并瞬時離心后用羅氏定量PCR儀檢測，檢測程序為：95℃30s,95℃?10s,60℃10s,72℃30s。(每個梯度做三個平行)。
[0063] 利用該技術(shù)進行應(yīng)用檢測，對48個對蝦樣本進行檢測。
[0064] 結(jié)果如表所示：
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
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