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用于診斷或篩選節(jié)肢介體病毒感染的方法、在所述方法和它們的應(yīng)用中使用的試劑

閱讀：343發(fā)布：2024-02-22

專利匯可以提供用于診斷或篩選節(jié)肢介體病毒感染的方法、在所述方法和它們的應(yīng)用中使用的試劑專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且一種用于診斷或篩選節(jié)肢介體 病毒感染 、優(yōu)選黃病毒科感染、更優(yōu)選黃病毒感染的方法，在所述方法和它們的應(yīng)用中使用的 試劑 。所述方法包括：(i)將來源于受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相 接觸 ，此Ig結(jié)合蛋白抗所研究的受試者或動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子，以及(ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與由雜合蛋白組成的檢測分子一起溫育，此雜合蛋白至少包含節(jié)肢介體病毒的ED3結(jié)構(gòu)域和 堿 性 磷酸 酶(PhoA)，檢測出所述免疫復(fù)合物就是所述樣品中節(jié)肢介體病毒存在的標(biāo)記。，下面是用于診斷或篩選節(jié)肢介體病毒感染的方法、在所述方法和它們的應(yīng)用中使用的試劑專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種用于診斷或篩選在受試者或動(dòng)物寄主中節(jié)肢介體病毒的方法，其特征在于，其包括：
(i)將來源于受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，所述Ig結(jié)合蛋白抗所研究的受試者或動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子；以及
(ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與由雜合蛋白組成的檢測分子一起溫育，所述雜合蛋白至少包含節(jié)肢介體病毒的ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶(PhoA)，檢測出所述免疫復(fù)合物就是在所述樣品中存在節(jié)肢介體病毒的標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ig結(jié)合蛋白選自由抗IgM抗體、抗IgG抗體和抗IgA抗體所組成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述節(jié)肢介體病毒是黃病毒。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述堿性磷酸酯酶選自下組：
大鼠、小鼠、雞、牛、酵母以及細(xì)菌的堿性磷酸酶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述堿性磷酸酶是大腸菌的堿性磷酸酶并且包含序列SEQ ID NO：25。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雜合蛋白進(jìn)一步包含多肽標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽標(biāo)記選自由HIS(六聚組氨酸)、c-MYC、HA、VSV-G、HSV、V5和FLAG所組成的組。
8.如權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雜合蛋白優(yōu)選包含六聚組氨酸、黃病毒ED3結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌的堿性磷酸酶。
9.如權(quán)利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述大腸菌的堿性磷酸酶被修飾過。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述大腸菌堿性磷酸酶包括在其活性位點(diǎn)上的兩個(gè)突變：D153G和D330N，并且包含序列SEQ ID NO：24。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述ED3結(jié)構(gòu)域多肽選自下組：黃熱病病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、西尼羅河病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、登革熱病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、圣路易斯腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、墨萊溪谷腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽以及日本腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽。
12.一種雜合蛋白，其特征在于，它包含多肽標(biāo)記、節(jié)肢介體病毒ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶。
13.如權(quán)利要求12所述的雜合蛋白，其特征在于，它包含六聚組氨酸、選自下組的黃病毒ED3結(jié)構(gòu)域：黃熱病病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、西尼羅河病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、登革熱病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、圣路易斯腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽、墨萊溪谷腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽以及日本腦炎病毒ED3結(jié)構(gòu)域多肽；以及
大腸桿菌堿性磷酸酶。
14.如權(quán)利要求12或13所述的雜合蛋白，其特征在于，所述雜合蛋白優(yōu)選呈多聚體形式，更優(yōu)選呈二聚體形式。
15.如權(quán)利要求12、13或14所述的雜合蛋白，其特征在于，它選自下組：包含序列SEQ ID NO：2的(H6-ED3.DEN1-PhoA)2、包含序列SEQ ID NO：4的(H6-ED3.DEN2-PhoA)2、包含序列SEQ ID NO：6的(H6-ED3.DEN3-PhoA)2、包含序列SEQ ID NO：8的(H6-ED3.DEN4-PhoA)2、包含序列SEQ ID NO：10的(H6-ED3.WN-PhoA)2以及包含序列SEQ ID NO：12的(H6-ED3.YF-PhoA)2。
16.編碼如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述雜合蛋白的核酸。
17.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，其選自下組：編碼H6-ED3.DEN1-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：1、編碼H6-ED3.DEN2-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：3、編碼H6-ED3.DEN3-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：5、編碼H6-ED3.DEN4-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：7、編碼H6-ED3.WN-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：9和編碼H6-ED3.YF-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：11。
18.一種制備如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述雜合蛋白的方法，其特征在于，其包括：
(a)通過將編碼節(jié)肢介體病毒的ED3多肽、優(yōu)選黃病毒ED3多肽的序列插入載體pEBL1(SEQ ID NO：13)中，得到表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述雜合蛋白的序列，
(b)用(a)中獲得的載體轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌菌株、優(yōu)選XL1-Blue菌株，
(c)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述改造過的菌株，以及
(d)從周質(zhì)的提取物中純化標(biāo)記-ED3-PhoA雜合蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的所述表達(dá)載體選自由如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)定義的雜合蛋白的表達(dá)載體所組成的組。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體包含編碼雜合蛋白H6-ED3.DEN1-PhoA的序列(pEBL11，于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3748保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28 rue du Docteur Roux，75015，巴黎))。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體包含編碼雜合蛋白H6-ED3.WN-PhoA的序列(pEBL15，于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3749保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28 rue du Docteur Roux，75015，巴黎))。
22.于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3747保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，75015，巴黎)的表達(dá)載體pEBL1。
23.于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3748保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28 rue du Docteur Roux，75015，巴黎)的表達(dá)載體pEBL11。
24.于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3749保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28 rue du Docteur Roux，75015，巴黎)的表達(dá)載體pEBL15。
25.一種用于篩選受試者或動(dòng)物中節(jié)肢介體病毒抗體、優(yōu)選黃病毒抗體的方法，所述方法包括：
(i)將來源于所述受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，所述Ig結(jié)合蛋白抗所研究的受試者或動(dòng)物種的特定種類的Ig分子，
(ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與檢測分子一起溫育，所述檢測分子由至少含有節(jié)肢介體病毒的ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶的雜合蛋白組成，以及
(iii)檢測所述節(jié)肢介體病毒抗體的存在。
26.一種用于診斷和/或篩選在受試者中的節(jié)肢介體病毒抗體、優(yōu)選黃病毒抗體的試劑盒，其包含：
-被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體，所述Ig結(jié)合蛋白抗所研究的動(dòng)物種的特定種類的Ig分子，
-至少如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的雜合蛋白，所述雜合蛋白至少包含節(jié)肢介體病毒ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶，
-至少一個(gè)陽性對(duì)照，優(yōu)選來自受感染的個(gè)體的對(duì)照血清，以及
-至少一個(gè)陰性對(duì)照，優(yōu)選來自未感染的個(gè)體的對(duì)照血清。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述Ig結(jié)合蛋白優(yōu)選自由抗IgM、抗IgG和抗IgA所組成的組，所述雜合蛋白包含六聚組氨酸、合適的黃病毒的病毒ED3結(jié)構(gòu)域、和大腸桿菌的堿性磷酸酶。
28.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其特征在于，所述堿性磷酸酶是修飾過的堿性磷酸酯酶并且包含序列SEQ ID NO：24，所述堿性磷酸酯酶包括在其活性位點(diǎn)上的兩個(gè)突變：
D153G和D330N。
29.包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶的雜合蛋白的應(yīng)用，用于感染所述病原體的體外診斷或用于所述病原體流行病學(xué)的研究。
30.包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶的雜合蛋白的應(yīng)用，用于抗所述病原體或其免疫原的疫苗接種的體外確證。
31.包含蛋白或其片段和堿性磷酸酶的雜合蛋白的應(yīng)用，用于研究由PhoA融合的所述蛋白或其片段與分子、蛋白或細(xì)胞之間的相互作用。
32.一種用于診斷病原體感染、確證病原體或其免疫原接種、或研究所述病原體流行病學(xué)的方法，其特征在于，其包括：
(i)將來源于受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，所述Ig結(jié)合蛋白抗所研究的動(dòng)物種的特定種類的Ig分子，
(ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與由雜合蛋白組成的檢測分子一起溫育，所述雜合蛋白包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶，所述免疫復(fù)合物的存在就是所述感染的標(biāo)記。
33.一種用于研究在融合于PhoA的蛋白或其片段與分子、蛋白或細(xì)胞之間的相互作用的方法，其特征在于，其包括：
(i)將所述分子、蛋白或細(xì)胞與包含融合于PhoA的蛋白或其片段的雜合蛋白相接觸，以及
(ii)檢測在融合于PhoA的蛋白或其片段與所述分子、所述蛋白或所述細(xì)胞之間最終形成的復(fù)合物。
34.一種用于篩選抗節(jié)肢介體病毒的化合物的方法，所述方法包括：
(i)將最終結(jié)合在固相載體上的抗節(jié)肢介體病毒的抗體或節(jié)肢介體病毒表面分子的受體與包含融合于PhoA的節(jié)肢介體病毒表位的雜合蛋白相接觸，
(ii)通過測定合適的信號(hào)，例如對(duì)硝基苯酚的形成，來檢測在所述抗節(jié)肢介體病毒抗體或所述受體與所述表位之間形成的復(fù)合物，
(iii)加入待檢測的化合物，以及
(iv)通過測定合適的信號(hào)并且將獲得的信號(hào)與(ii)中獲得的信號(hào)相比較，檢測在所述抗節(jié)肢介體病毒抗體或所述受體與所述表位之間形成的復(fù)合物的量與在步驟(ii)中檢測到的復(fù)合物的量相比是否降低。

說明書全文

用于診斷或篩選節(jié)肢介體病毒感染的方法、在所述方法和

它們的應(yīng)用中使用的試劑

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及的是一種用于診斷或篩選節(jié)肢介體病毒(arbovirus)感染、優(yōu)選黃病毒科(flaviviridae)感染、更優(yōu)選黃病毒(flavivirus)感染的方法，在所述方法和它們的應(yīng)用中使用的試劑。

背景技術(shù)

[0002] 節(jié)肢介體病毒(節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒)是在自然界循環(huán)中在吸血的節(jié)肢動(dòng)物載體和易染病的脊椎動(dòng)物寄主上保持的病毒。本發(fā)明包括了所有含有包膜蛋白的節(jié)肢介體病毒，雖然說明書主要集中在黃病毒種類。
[0003] 許多節(jié)肢介體病毒并且特別是許多黃病毒會(huì)引起人類或動(dòng)物的嚴(yán)重的疾病，尤其是黃熱病病毒(YFV)、登革熱病毒(DENV)、西尼羅河病毒(WNV)等等。
[0004] 目前通過一些方法可以檢測黃病毒的感染，包括病毒分離、用RT-PCR檢測病毒RNA、以及靶向病毒蛋白或抗病毒免疫球蛋白分子的免疫化學(xué)試驗(yàn)。許多黃病毒在初次感染或繼發(fā)性感染期間，病毒RNA、病毒蛋白、病毒粒子以及不同種類的抗體(IgM、IgA和IgG)的出現(xiàn)和消失的動(dòng)力學(xué)被很好地記錄下來。
[0005] 檢測對(duì)抗病毒并存在于病人血清中的抗體，是通過免疫吸附試驗(yàn)建立了一個(gè)制定完善的和值得推薦的方法，用于黃病毒感染診斷(Kuno，2003；WHO，1997)。這些診斷的目的至少是雙重的：用實(shí)例確認(rèn)區(qū)分黃病毒的疾病與其他有相似臨床病狀的疾?。缓蛡鞑サ谋O(jiān)控。
[0006] 由于一些因素，使得感染黃病毒的診斷變得復(fù)雜。目前大多數(shù)用來測試抗一種黃病毒的抗體的血清學(xué)試驗(yàn)，會(huì)與這個(gè)家族的其他成員發(fā)生交叉反應(yīng)(Kuno，2003)。這些交叉反應(yīng)在一些黃病毒共傳播的區(qū)域可能是有問題的。例如，許多抗WNY的抗體，會(huì)與JEV(日本腦炎病毒)、SLEV(圣路易斯腦炎病毒)甚至和DENV發(fā)生交叉反應(yīng)(Granwehr et al.，2004)。許多抗DENV的抗體，與YFV和JEV交叉反應(yīng)(Vorndam and Kuno，1997)。
[0007] DENV的四個(gè)血清型存在著一個(gè)特殊的問題。嚴(yán)重形式的登革熱、登革出血熱(DHF)和休克綜合癥(DSS)的發(fā)病機(jī)制，一直是爭論的話題。有兩個(gè)主要的理論被提出來。一般接受的假設(shè)是繼發(fā)性感染或免疫增強(qiáng)理論(Halstead，2003；Mongkolsapaya et al.，
2003)。另一個(gè)假設(shè)強(qiáng)調(diào)了病毒因子的參與(McBrSEQ IDe and Bielefeldt-Ohmann，2000)。
因此初次和繼發(fā)性感染的區(qū)別是理解DHF發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。在初次感染和繼發(fā)感染中都存在著病毒mRNA和抗原(Alcon et al.，2002)。因此，DENV抗體的檢測為區(qū)別感染的不同模式提供了唯一的方法。
[0008] 目前診斷試驗(yàn)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA或快速試紙法(dipstick format)來識(shí)別黃病毒感染。
[0009] 用于檢測病人血清中的病毒抗體的免疫吸附試驗(yàn)(ISA)屬于兩種主要類型：間接ISA和抗體特異性捕獲ISA。
[0010] 在間接ISA中，用病毒抗原(virAg)敏化固相載體。在分析中被固定的抗原與人類或動(dòng)物血清相互反應(yīng)。最終，被結(jié)合的抗體由報(bào)告系統(tǒng)所顯示，此報(bào)告系統(tǒng)通常是由免疫球蛋白結(jié)合蛋白(@Ig)和酶(Enz)之間的聚集體組成，典型的酶是辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(PhoA)。這就是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。也可以使用其他種類的探針，比如熒光團(tuán)或膠態(tài)金。間接ISA的一般圖示如下：
[0011] 支持物-病毒抗原：：血清：：@Ig-報(bào)告分子(1)
[0012] 其中“-”代表共價(jià)鍵或固定化；并且“：：”代表非共價(jià)鍵相互作用。Ig結(jié)合蛋白可能對(duì)特定種類Ig具有特異性(@IgX，其中X＝M，A或G)。在這種情況下，可以稱作IgX特異性間接ISA。已經(jīng)描述過間接ISA的一些變體，尤其是抗原捕獲ISA、表位阻斷ISA以及親合ISA(Blitvich et al.，2003；Johnson et al.，2000；Matheus et al.，2005)。
[0013] 在IgM、IgA或IgG特異性捕獲ISA中，用Ig結(jié)合蛋白(@IgX，X＝M、A或G)敏化固相載體，該Ig結(jié)合蛋白可抗所研究的動(dòng)物種類中的特定種類的Ig分子，并且大多數(shù)通常由異源抗體組成。被固定的Ig結(jié)合蛋白連續(xù)地與所分析的血清、病毒抗原和接著的報(bào)告系統(tǒng)反應(yīng)，此報(bào)告系統(tǒng)一般是抗原結(jié)合分子(@virAg)和酶(Enz)的結(jié)合物。一般的IgX特異性捕獲ISA(XAC-ISA)可以圖示如下：
[0014] 支持物-@IgX：：血清：：病毒抗原：：@virAg-報(bào)告分子(2)
[0015] 視Ig結(jié)合蛋白(@IgX)而定，可以稱作IgM、IgG或IgA抗體捕獲免疫吸附試驗(yàn)(MAC-ELISA、GAC-ELISA或AAC-ELISA)。
[0016] 用于IgM抗體的免疫吸附試驗(yàn)屬于確定近期被黃病毒感染的最有用的血清學(xué)方案，因?yàn)檫@些IgM分子在感染初期出現(xiàn)，在疾病過程中快速增加，并且與IgG抗體相比與其他病毒的交叉反應(yīng)較少(Kuno，2003)。最早在感染后第5天就可以檢測IgM分子，但是通常它們與單體抗原的親合力比其他類型的免疫球蛋白低。
[0017] MAC-ELISA優(yōu)于IgM特異性間接ELISA，因?yàn)閬碜杂谝郧氨幌嚓P(guān)病毒感染的IgG抗體對(duì)后者的試驗(yàn)的靈敏度有抑制作用(Vorndam and Kuno，1997)。WHO推薦它用于一些黃病毒感染、并且尤其是登革熱的血清學(xué)診斷(WHO，1997)。
[0018] MAC-ELISA有下列優(yōu)點(diǎn)：如果得到配對(duì)的血清樣本，IgM上升的、穩(wěn)定的或下降的滴度能顯示出感染的時(shí)間。對(duì)單個(gè)樣本的MAC-和GAC-ELISA平行試驗(yàn)中的IgM與IgG抗體的比值能用來區(qū)分初次感染和繼發(fā)性感染，因?yàn)镮gM/IgG的比值在前面的情況下是高于一，在后面的情況下是低于一(Innis et al.，1989)。它可以檢測腦脊髓液和唾液中的抗黃病毒的IgM(Kao et al.，2005；Teles et al.，2005)。人們已經(jīng)開發(fā)了IgA特異性的ELISA。IgA應(yīng)答發(fā)展在IgM應(yīng)答之后、但在IgG應(yīng)答之前。平行MAC-ELISA和AAC-ELISA試驗(yàn)中的IgA/IgM比值能顯示出DENV和WNV的感染是近期的、還是幾個(gè)月之前的(Prince andLape-Nixon，2005；Talarmin et al.，1998)。
[0019] 免疫吸附試驗(yàn)的特異性主要來自于分析中的血清與抗原的相互作用，因此取決于抗原制品的內(nèi)在性質(zhì)。但是，它也可能來自于報(bào)告分子的內(nèi)在性質(zhì)。
[0020] 直到最近以來，用于ISA的抗原主要是被研究中的病毒感染的乳鼠大腦(SMB)或細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物。這些抗原日益增多地被重組的prM/gpE病毒樣顆粒(VLP)取代，其中prM和gpE是病毒的膜蛋白與包膜蛋白的前體，或具有g(shù)pE的重組胞外結(jié)構(gòu)域(sE)。非結(jié)構(gòu)性蛋白NS1也已經(jīng)被用作IgG特異性間接ELISA和MAC-ELISA的抗原。NS1可以區(qū)分初次感染和繼發(fā)性感染，并且能正確識(shí)別初次感染的病人的血清中的感染性DENV的血清型(Shu et al.，2004；Shu et al.，2003；Shu et al.，2002)。
[0021] 許多MAC-ELISA使用抗病毒的多克隆抗體作為檢測分子。這些多克隆抗體的批次之間在效力上是不同的，并且是病毒交叉反應(yīng)性的，這將限制試驗(yàn)的特異性(Martin et al.，2000)。因此，單克隆抗體(mAb)比多克隆抗體(pAb)有更多優(yōu)勢，并且減少了特異性上的變化。廣泛交叉反應(yīng)性的mAb，例如mAb4G2和mAb6C-1，已被與酶結(jié)合并被廣泛用作檢測分子(Kuno，2003)。在位點(diǎn)S169P和G257R上的中和逃逸突變株已經(jīng)在gpE的結(jié)構(gòu)域1和2之間的界面上繪制了mAb4G2的表位(Serafin and Aaskov，2001)。
[0022] 存在著其他種類的ISA，例如夾心ELISA(R.J.Kerschbaumer et al.，1996)，它的形式如下：
[0023] 支持物-@GST：：GST-(3D6表位)；：scFv3D6-PhoA，
[0024] 其中的@GST代表抗谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的抗體；GST-(3D6表位)是GST和抗體3D6的表位的雜合蛋白；以及scFv3D6-PhoA是抗體3D6單鏈可變片段(scFv)和堿性磷酸酶的雜合蛋白。
[0025] 夾心ELISA試驗(yàn)被用于檢測病人血清中抗原的存在，而不是如同本發(fā)明中的檢測抗感染物的抗體的存在。此外，這種方法需要分離和表征至少兩個(gè)待在試驗(yàn)中使用的非競爭性的抗體。
[0026] 另外一種ISA是反向ELISA(D.Ludolfs et al.，2007)，它的形式如下：
[0027] 支持物-RF：：血清：：rED3-HRP
[0028] 其中Rhumatoid因子(RF)是可識(shí)別IgG免疫球蛋白的Fc片段的自身免疫性抗體；以及rED3-HRP是辣根過氧化物酶(HRP)與西尼羅河病毒包膜蛋白重組結(jié)構(gòu)域3(rED3)的化學(xué)結(jié)合物。辣根過氧化物酶HRP是單體蛋白，而堿性磷酸酶是二聚體，以及rED3-HRP雜合蛋白是通過rED3和HRP兩個(gè)配對(duì)物化學(xué)耦合得到的。
[0029] 這項(xiàng)研究的作者清楚地提到，他們的“反向ELISA”不檢測任何特異性的IgM抗體(472頁，左列，31行以及以下)。他們得出結(jié)論，他們的反向ELISA能提高世界上對(duì)于西尼羅河病毒感染流行的認(rèn)識(shí)。因此這個(gè)方法學(xué)最適合用在病毒感染流行的長期流行病學(xué)研究中。
[0030] 另外一種ISA是間接IgG ELISA(D.W.C.Beasley et al.，2004)，它的形式如下：
[0031] 支持物-rED3：：血清：：@IgG-HRP
[0032] 其中的@IgG-HRP是辣根過氧化物酶和抗人類IgG抗體的化學(xué)結(jié)合物。
[0033] 作者清楚地提到，重組結(jié)構(gòu)域rED3被覆蓋在微量滴定板的孔上的抗體微弱結(jié)合(2764頁，34-39行)，因此不適合用于抗體捕獲ELISA。
[0034] 抗原在捕獲ELISA中的使用
[0035] *由乳鼠大腦(SMB)或細(xì)胞培養(yǎng)物衍生而來的病毒抗原
[0036] 當(dāng)使用由SMB或細(xì)胞培養(yǎng)物衍生而來的病毒抗原時(shí)，GAC-或MAC-ELISA的特異性相差不多(Cardosa et al.，1992)。使用這些抗原制品進(jìn)行的MAC-ELISA對(duì)于病毒的血清復(fù)合物一般是特異性的，但是很難區(qū)分血清復(fù)合物中的感染病毒。例如，它們能區(qū)分DENV與JEV或WNV的感染(Innis et al.，1989；Martin et al.，2002)。但是，它們很難區(qū)分4種DENV血清型的感染，即使在大多數(shù)的例子中感染血清型的信號(hào)是最強(qiáng)的(Nawa et al.，2000)。如果同時(shí)檢測JEV血清復(fù)合物的這些黃病毒并使用精確的特定的診斷算法(Martinet al.，2002；2004)，它們能區(qū)分WNV感染與SLEV或JEV感染。但是，這種特異性的診斷只對(duì)初次感染是可能的，因?yàn)樵谡?jīng)歷繼發(fā)性感染和進(jìn)一步的感染的病人中交叉反應(yīng)性非常重要(Kao et al.，2005；Teles et al.，2005)。
[0037] *將重組體prM/gpE-VLP和sE用作抗原
[0038] 根據(jù)檢測靈敏度、特異性、精確度和其他統(tǒng)計(jì)測試的許多標(biāo)準(zhǔn)，在MAC-ELISA中使用來自于一些黃病毒的prM/gpE-VLP，與SMB衍生的抗原相比，會(huì)進(jìn)行地一樣好或更好(Holmes et al.，2005；Martin et al.，2002；Martin et al.，2000；Muerhoff et al.，2002)。對(duì)于DENV，VLP可以成功地檢測初次感染的感染血清型(Shu et al.，2002；Shu and Huang，2004)。對(duì)于SLEV，VLP不與抗WNV和波瓦生病毒的IgM抗體交叉反應(yīng)，這與由SMB衍生的抗原正相反(Purdy et al.，2004)。對(duì)于TBEV(Tick-Borne Encephalitis Virus，蜱傳播的腦炎病毒)，VLP不與抗JEV的IgM抗體交叉反應(yīng)，與市場上的抗原正相反(Yoshii etal.，2003)。但是對(duì)于WNV，VLP與高比例的被其他黃病毒(JEV、SLEV、DENV、YFV)感染或接種的病人的血清發(fā)生交叉反應(yīng)(Hogrefe et al.，2004)。在果蠅細(xì)胞中作為重組蛋白被表達(dá)的gpE的胞外結(jié)構(gòu)域sE，被用于MAC-和GAC-ELISA的色譜分析中。這種免疫色譜測試，使用來自于DENV的4種血清型的重組sE結(jié)構(gòu)域，其特異性和靈敏度可以與用SMB提取物作為抗原進(jìn)行的傳統(tǒng)的MAC-和GAC-ELISA相媲美(Cuzzubbo et al.，2001)。
[0039] *rED 3作為抗原
[0040] 一些因素與ED3結(jié)構(gòu)域作為免疫試驗(yàn)中的抗原是相關(guān)的：它是高抗原性的和免疫原性的；最強(qiáng)的中和抗體是抗這個(gè)結(jié)構(gòu)域的(Crill and Roehrig，2001；Sanchez et al.，2005)；ED3結(jié)構(gòu)域的序列比gpE的其他結(jié)構(gòu)域的序列遠(yuǎn)得多(Gritsun et al.，1995)；與不同的黃病毒交叉反應(yīng)的對(duì)抗gpE的EDl和ED2結(jié)構(gòu)域的抗體比對(duì)抗ED3結(jié)構(gòu)域的抗體要多(Crill andChang，2004；Kanai et al.，2006；Modis et al.，2005；Roehrig，2003；Sanchez et al.，2005)。對(duì)于DENV，大腸桿菌的TrpE蛋白與四種ED3結(jié)構(gòu)域的血清型形成的雜合蛋白TrpE-ED3，與細(xì)胞培養(yǎng)衍生的病毒抗原進(jìn)行了比較。這兩種抗原在檢測恢復(fù)期血清中的抗DENV的IgM或IgG抗體上是一樣靈敏的。但是，在區(qū)分DENV感染和YFV或JEV接種上，TrpE-ED3抗原比細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的抗原有更高的特異性(Simmons et al.，1998)。對(duì)于DENV，重組分離的ED3結(jié)構(gòu)域(rED3)可以用免疫印跡條帶試驗(yàn)來成功地檢測感染血清型(Ludolfs etal.，2002)。對(duì)于WNV，在猴子、人類和馬的血清試驗(yàn)中，rED3在IgG特異性的間接ELISA中比SMB衍生的抗原有更靈敏和更特異性的應(yīng)答。它可以清楚地區(qū)分抗WNV和抗其他相關(guān)黃病毒的IgG應(yīng)答(JEV、SLEV、MVEV)(Beasley et al.，2004)。對(duì)于TBEV，rED3在IgG特異性的間接ELISA中比SMB衍生的抗原也有更靈敏和更特異性的應(yīng)答。它可以區(qū)分蜱傳播的(TBEV)和蚊傳播的(YFV、DENV)黃病毒，但是不能區(qū)分黃病毒TBEV血清復(fù)合物的成員(Holbrook et al.，2004)。
[0041] 但是，分離的ED3結(jié)構(gòu)域只能用于IgG或IgM特異性間接ISA的理由在下文中解釋。
[0042] 當(dāng)使用具有重組抗原的捕獲ELISA時(shí)，將出現(xiàn)效價(jià)和折疊的問題以及檢測的問題。
[0043] -效價(jià)和折疊
[0044] 實(shí)際上，初步實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，來自于WNV的rED3結(jié)構(gòu)域被覆蓋在微量滴定板孔上的抗體微弱地結(jié)合，或者由于空間位阻的原因只是被捕獲而并沒有被檢測的抗體結(jié)合。因此可以得出結(jié)論，rED3可能并不直接適用于捕獲型試驗(yàn)(Beasley et al.，2004)。但是，其他的解釋也同樣很有道理。黃病毒在它們的表面展示了180個(gè)單體(90個(gè)二聚體)的gpE，因此gpE和它的ED3結(jié)構(gòu)域是以多個(gè)和相連的拷貝存在的(Kuhn et al.，2002；
Mukhopadhyay et al.，2003)。相同分子的IgG、IgA或IgM能同時(shí)結(jié)合二至五個(gè)它的表位拷貝，并且這種結(jié)合的多效價(jià)模式導(dǎo)致了明顯很強(qiáng)的親合力(抗體親抗原性)。抗原的效價(jià)在prM/gpE VLP中也是很高的(Ferlenghi et al.，2001)；其對(duì)于重組的抗原，象二聚體形式的水溶性gpE(sE)，效價(jià)是二(Kanai et al.，2006；Modis et al.，2003；Modis et al.，
2005；Reyet al.，1995)，但是對(duì)于分離的ED3結(jié)構(gòu)域只是一。因此，單體rED3結(jié)構(gòu)域和IgM的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的親合力對(duì)于MAC-ELISA是不夠的。對(duì)于IgG或IgA捕獲ELISA，也能碰到類似的問題，尤其是初次感染。為了克服單體rED3結(jié)構(gòu)域的這種局限，工程化它們的寡聚化是必要的。
[0045] ED3結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)半胱氨酸殘基。它們形成二硫鍵，此二硫鍵對(duì)于結(jié)構(gòu)域正確折疊和結(jié)構(gòu)域的抗原完整性是必要的(Roehrig et al.，2004)。rED3可以以正確折疊的狀態(tài)在埃希氏菌屬大腸桿菌的周質(zhì)間隙中生成，在其中可以形成必不可少的二硫鍵。在周質(zhì)間隙中的產(chǎn)生有個(gè)附加的優(yōu)勢，就是蛋白能通過簡單的滲透休克而以濃縮的并且部分純化的形式被提取出來。
[0046] -檢測
[0047] 為了定量比較針對(duì)一些不同抗原的血清的應(yīng)答(例如針對(duì)不同的病毒血清型)從而推導(dǎo)出它的特異性，測試的檢測系統(tǒng)對(duì)于所有測試的抗原必須是一樣的。當(dāng)使用多克隆抗體時(shí)情況就可能不是這樣了?？共煌《净虿《狙逍偷钠胀ū砦坏膯慰寺】贵w的使用可能會(huì)引起下面的問題：(i)抗原與人類血清的結(jié)合可能掩蓋住示蹤物單克隆抗體的表位。(ii)示蹤抗體和不同的抗原之間的親合力可以取決于表位的具體結(jié)構(gòu)。結(jié)果，測試的輸出信號(hào)與捕獲的抗原量之間的關(guān)系可能因不同的抗原而變化。
[0048] 因此，需要比現(xiàn)有技術(shù)的試劑更好地適合ELISA試驗(yàn)、并且更優(yōu)選適合XAC-ELISA試驗(yàn)的試劑。

發(fā)明內(nèi)容

[0049] 因此，本發(fā)明涉及一種用于診斷或篩選在受試者或動(dòng)物寄主中節(jié)肢介體病毒的方法，其特征在于，其包括：
[0050] (i)將來源于受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，此Ig結(jié)合蛋白抗所研究的受試者或動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子，并且通常由異源抗體(抗IgX抗體)組成；以及
[0051] (ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與由雜合蛋白組成的檢測分子一起溫育，此雜合蛋白至少包含節(jié)肢介體病毒的ED3結(jié)構(gòu)域、優(yōu)選包含黃病毒的ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶(PhoA)，檢測出所述免疫復(fù)合物就是存在所述樣品中節(jié)肢介體病毒的標(biāo)記。
[0052] 根據(jù)進(jìn)行所述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，Ig結(jié)合蛋白選自由抗IgM、抗IgG和抗IgA所組成的組(@IgX，X＝M、A或G)。
[0053] 根據(jù)進(jìn)行所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述節(jié)肢介體病毒優(yōu)選是黃病毒。
[0054] 根據(jù)進(jìn)行所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述堿性磷酸酶選自由大鼠、小鼠、雞、牛、酵母以及細(xì)菌堿性磷酸酶、優(yōu)選大腸桿菌的堿性磷酸酶所組成的組。
[0055] 根據(jù)實(shí)施所述方法的進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方式，所述雜合蛋白進(jìn)一步包括多肽標(biāo)記，該標(biāo)記例如使用于從周質(zhì)的提取物中純化所述雜合蛋白。這種多肽標(biāo)記的例子可以是HIS(hexahistidine，六聚組氨酸)、c-MYC、HA、VSV-G、HSV、V5和FLAG(Sigma產(chǎn)品)。
[0056] 因此，根據(jù)實(shí)施所述方法的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式，所述雜合蛋白優(yōu)選包含六聚組氨酸--一種合適的黃病毒ED3結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌的堿性磷酸酶，并且包含序列SEQ ID NO：25。
[0057] 優(yōu)選堿性磷酸酶由序列SEQ ID NO：25組成。
[0058] 根據(jù)所述實(shí)施方法的實(shí)施方式，所述大腸桿菌的堿性磷酸酶是被修飾過的。更優(yōu)選所述大腸桿菌的堿性磷酸酶在它的活性位點(diǎn)上包括兩個(gè)突變：D153G和D330N，并且包含序列SEQ ID NO：24(Le Du等人，2002的編號(hào))。在歐洲專利申請(qǐng)No.0752475中已經(jīng)描述過這種修飾的PhoA。
[0059] 優(yōu)選堿性磷酸酶由序列SEQ ID NO：2組成。
[0060] 堿性磷酸酶的其他修飾也是可能的，并且包括在本發(fā)明中。
[0061] 出乎意料地，通過使用上述的檢測分子，即，其至少包含黃病毒的結(jié)構(gòu)域ED3和大腸桿菌的堿性磷酸酶，優(yōu)選六聚組氨酸、黃病毒的結(jié)構(gòu)域ED3和大腸桿菌的堿性磷酸酶(優(yōu)選修飾過的堿性磷酸酶)的雜合蛋白，用于檢測黃病毒的IgX抗體捕獲免疫吸附測試可以在一些水平上得到顯著的提高：
[0062] (i)用限定的同源分子種類替換在一些測試中使用的試劑(抗原或檢測系統(tǒng))粗制品；
[0063] (ii)減少測試中必須的試劑數(shù)量和步驟；
[0064] (iii)用能夠在細(xì)菌中生成并容易被純化的重組成分來取代涉及在安全實(shí)驗(yàn)室里對(duì)于制品的感染性的病毒、動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)操作的測試中的所有成分。
[0065] 因此，檢測分子優(yōu)選(H6-ED3-PhoA)2雜合蛋白；所以，(H6-ED3-PhoA)2雜合蛋白的結(jié)合性通過PhoA部分的酶活性顯現(xiàn)出來。許多產(chǎn)生比色的或化學(xué)熒光反應(yīng)的PhoA的底物可以被用來顯示。優(yōu)選使用微量滴定板來固定抗IgG或抗IgM的抗體。固定也可以用其他類型和規(guī)格的載體，尤其是光學(xué)纖維。
[0066] 因此，可以用(H6-ED3-PhoA)2雜合蛋白進(jìn)行測試，用于檢測抗ED3結(jié)構(gòu)域的其他免疫球蛋白型，比如IgA和IgE，從而檢測來源于人和不同動(dòng)物例如小鼠、牛和馬的免疫球蛋白，并且檢測除血清外的其他體液中的免疫球蛋白。同樣也可以用來源于那些沒有被提及的其他節(jié)肢介體病毒或其他黃病毒的ED3結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行測試，因?yàn)閬碓从谶@個(gè)分類群的病毒的E糖蛋白具有高度同源的結(jié)構(gòu)。也可以用其他抗原蛋白或蛋白片段間的雜合體來進(jìn)行測試，無論它們是否來源于病原體，以及無論它們?cè)谶@些試劑中是以單體還是多聚體狀存在。也可以延伸至包括另一種不同于PhoA的示蹤蛋白的雙功能雜合蛋白。最終，也可以延伸至這種情況：通過基因融合或與不同于示蹤蛋白的特異性蛋白組件的化學(xué)耦合，來得到抗原的寡聚化。在ED3結(jié)構(gòu)域的核酸或氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)合成編碼ED3結(jié)構(gòu)域的DNA片段的可能性，極大地推進(jìn)了雜合體的構(gòu)建。
[0067] 象(H6-ED3-PhoA)2或更普遍的(Ag-PhoA)2的雙功能二聚雜合體有很多的應(yīng)用。它們可以被用來(i)檢測抗與PhoA融合的抗原(Ag)的抗體；(ii)檢測抗抗原來自于其或模擬其的病原體的抗體；(iii)診斷病原體感染或驗(yàn)證病原體或免疫原的接種；(iv)研究病原體的流行病學(xué)；(v)研究與PhoA融合的蛋白或蛋白片段與分子、蛋白或細(xì)胞之間的相互作用；(vi)在化學(xué)文庫中篩選和識(shí)別可改變?nèi)诤系鞍谆虻鞍灼闻c靶分子、細(xì)胞的蛋白之間的相互作用的分子。
[0068] 以前沒有描述過使用rED3來成功地檢測被感染的個(gè)體血清中的IgM。
[0069] 通過構(gòu)建其基因序列和堿性磷酸酶基因的雜合體，本發(fā)明依賴于同時(shí)將重組抗原二聚化和將它融合于酶示蹤物的可能性。這樣，得到可以檢測低親合力的抗體的試劑；例如IgM免疫球蛋白，其是五聚體的并且在被節(jié)肢介體病毒感染的初期出現(xiàn)。這個(gè)早期檢測可以用作流行病管理的手段。因此，它清楚地與那些基于IgG的檢測并且只能用追溯研究的測試(這些測試?yán)绺鞣N夾心法、反向和間接ELISA)區(qū)分開來。
[0070] 尤其是，如本發(fā)明所述的優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的方法和試劑的優(yōu)點(diǎn)包括：(i)在低安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室里生產(chǎn)診斷試劑；(ii)在單個(gè)步驟并且不需要任何化學(xué)反應(yīng)步驟中，對(duì)于每個(gè)病毒生產(chǎn)單個(gè)試劑；(iii)使用人工的二聚體抗原能檢測在感染初期出現(xiàn)并且親合力低的IgM；(iv)針對(duì)病毒和感染種類的特異性檢測；(iv)通過將抗原和酶示蹤物融合來簡化并加速診斷測試。
[0071] 因此，優(yōu)選地，所述的雜合體(H6-ED3-PhoA)2是在編碼六聚組氨酸、病毒結(jié)構(gòu)域ED3以及大腸桿菌的堿性磷酸酶的序列之間的基因水平上構(gòu)建的。六聚組氨酸標(biāo)記使得雜合體可以通過鎳離子柱進(jìn)行純化。PhoA是二聚的周質(zhì)蛋白。基因水平上過客蛋白與PhoA的融合導(dǎo)致了雜合蛋白的二聚化、它輸出至周質(zhì)間隙、以及保持折疊和兩部分的功能(Boulain and Ducancel，2004)。而且，過客蛋白在PhoA二聚體的晶體結(jié)構(gòu)上插入的對(duì)稱點(diǎn)位于分子的相同一側(cè)，靠近另一個(gè)分子 并且遠(yuǎn)離催化位點(diǎn) (Le Duetal.，2002)。
[0072] 因此，雜合體(ED3-PhoA-H6)2的構(gòu)建解決了抗原效價(jià)的問題。該雜合體包括它們自己的酶示蹤物，并且雜合體的酶部分并不取決于其抗原部分的本性。利用這個(gè)新的試劑，MAC-或者AAC-或者M(jìn)AC-ELISA只包括三種參與分子，如下圖示：
[0073] 支持物-@IgX：：血清：：(H6-ED3-PhoA)2(3)
[0074] 其中X＝M、A或G。
[0075] 根據(jù)實(shí)施本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方式，包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽選自下組：黃熱病病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽、西尼羅河病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽、登革熱病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽、圣路易斯腦炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽、墨萊溪谷腦炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽以及日本腦炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域3多肽。
[0076] 更優(yōu)選ED3結(jié)構(gòu)域選自WNY(稱為ED3.WN)、黃熱病毒(ED3-YF)或登革熱病毒(血清型1、2、3或4)，并且優(yōu)選選自DENY的血清型1(稱為ED3.DEN1)。
[0077] 例如在國際PCT專利申請(qǐng)WO2004/016586中描述了黃病毒的ED3多肽。
[0078] 這些新的試劑出乎意料地簡化了MAC-、AAC-和GAC-ELISA，有助于使得它們更具重現(xiàn)性和定量性，并且因此更具特異性。它們的制備只需要低等級(jí)的生物安全性和技術(shù)方法。
[0079] 本發(fā)明也涉及一種雜合蛋白，其特征在于，它包括合適的多肽標(biāo)記、節(jié)肢介體病毒ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶。
[0080] 尤其是，本發(fā)明涉及能用于如本發(fā)明所述方法的雜合蛋白。
[0081] 根據(jù)所述雜合蛋白的優(yōu)選的實(shí)施方式，其包含六聚組氨酸、合適的黃病毒ED3結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌的堿性磷酸酶。
[0082] 所述的雜合蛋白優(yōu)選是多聚體形式，更優(yōu)選二聚體形式，例如(H6-ED3-PhoA)2。
[0083] 根據(jù)所述雜合蛋白的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式：
[0084] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自DEN1病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.DEN1-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：2)。
[0085] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自DEN2病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.DEN2-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：4)。
[0086] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自DEN3病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.DEN3-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：6)。
[0087] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自DEN4病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.DEN4-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：8)。
[0088] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自西尼羅河病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.WN-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：10)，以及
[0089] -當(dāng)ED3結(jié)構(gòu)域來自黃熱病病毒時(shí)，所述的雜合蛋白(H6-ED3.YF-PhoA)代表序列(SEQ ID NO：12)。
[0090] 本發(fā)明也涉及編碼如本發(fā)明所述雜合蛋白的核酸。
[0091] 所述的核酸優(yōu)選自下組：編碼H6-ED3.DEN1-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：1、編碼H6-ED3.DEN2-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：3、編碼H6-ED3.DEN3-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：5、編碼H6-ED3.DEN4-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：7、編碼H6-ED3.WN-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：9和編碼H6-ED3.YF-PhoA雜合蛋白的序列SEQ ID NO：11。
[0092] 根據(jù)與EP0407259和EP0752475描述的方法類似的方法可以得到所述的雜合蛋白。
[0093] 優(yōu)選地，它們是通過將正確的ED3插入表達(dá)載體pEBL 1(SEQ ID NO：13)中而得到，此載體包含了含有兩個(gè)突變(D153G和D330N)的修飾過的堿性磷酸酶(SEQ ID NO：24)，編號(hào)參見Le Du等人，2002。
[0094] 所述的表達(dá)載體于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3747保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28rue du Docteur Roux，75015，巴黎)。
[0095] 本發(fā)明同樣涉及了制備如本發(fā)明所述雜合蛋白的方法，所述方法的特征在于，其包括：
[0096] (a)通過將編碼合適的節(jié)肢介體病毒的ED3多肽、優(yōu)選黃病毒ED3多肽的序列插入至載體pEBL1(SEQ ID NO：13)中，得到包含編碼如上限定的雜合蛋白的序列的表達(dá)載體，[0097] (b)用(a)中獲得的載體轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌、優(yōu)選XL1-Blue菌株(Bullock等人，1997描述)，
[0098] (c)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述改造過的菌株，以及
[0099] (d)從周質(zhì)提取物中純化標(biāo)記-ED3-PhoA雜合蛋白。
[0100] 當(dāng)標(biāo)記是六聚組氨酸時(shí)，純化步驟(d)通過在NiNTA樹脂柱上的親和層析來進(jìn)行。
[0101] 如此得到的不同表達(dá)載體包含了表達(dá)合適的雜合蛋白的序列：
[0102]載體 雜合蛋白表達(dá)
PEBL 11 H6-ED3-DEN1-PhoA
PEBL 12 H6-ED3-DEN2-PhoA
PEBL 13 H6-ED3-DEN3-PhoA
PEBL 14 H6-ED3-DEN4-PhoA
PEBL 15 H6-ED3-WN-PhoA
PEBL 17 H6-ED3-YF-PhoA
[0103] 根據(jù)實(shí)施所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，步驟(a)中的表達(dá)載體選自由如上限定的雜合蛋白的表達(dá)載體所組成的組，更優(yōu)選雜合蛋白H6-ED3.DEN1-PhoA的表達(dá)載體(pEBL11，于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3748保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28rue du Docteru Roux，75015，巴黎))和雜合蛋白H6-ED3.WN-PhoA的表達(dá)載體(pEBL15，于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3749保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，
28rue du Docteur Roux，75015，巴黎))。
[0104] 本發(fā)明也涉及用于篩選受試者或動(dòng)物中節(jié)肢介體病毒抗體、優(yōu)選黃病毒抗體的方法，所述方法包括：
[0105] (i)使來源于所述受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，此Ig結(jié)合蛋白抗所研究的受試者或動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子，
[0106] (ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與檢測分子一起溫育，此檢測分子由至少含有節(jié)肢介體病毒ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶的雜合蛋白所組成，以及
[0107] (iii)檢測所述的節(jié)肢介體病毒抗體的存在。
[0108] 所述的檢測優(yōu)選通過加入pNPP并測定對(duì)硝基苯酚的形成來進(jìn)行。
[0109] 在所有提到的方法和試劑盒中，Ig結(jié)合蛋白、ED3結(jié)構(gòu)域、堿性磷酸酶以及多肽標(biāo)記如同上述所描述的。
[0110] 本發(fā)明也涉及用于診斷和/或篩選受試者中節(jié)肢介體病毒抗體、優(yōu)選黃病毒抗體的試劑盒，其包含：
[0111] -用Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體，此Ig結(jié)合蛋白抗所研究的動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子，并且通常由異源抗體(抗IgX抗體)組成，以及
[0112] -至少一種雜合蛋白，其至少包含節(jié)肢介體病毒ED3結(jié)構(gòu)域和堿性磷酸酶，[0113] -至少一個(gè)陽性對(duì)照，優(yōu)選來自感染的個(gè)體的參照血清，以及
[0114] -至少一個(gè)陰性對(duì)照，優(yōu)選來自未感染的個(gè)體的參照血清。
[0115] Ig結(jié)合蛋白優(yōu)選自由抗IgM、抗IgG和抗IgA(@IgX，X＝M、A或G)所組成的組，并且所述的雜合蛋白包括六聚組氨酸、合適的黃病毒的病毒ED3結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌的堿性磷酸酶。
[0116] 根據(jù)所述試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，堿性磷酸酶是修飾過的堿性磷酸酶，包括在它的活性位點(diǎn)上的兩個(gè)突變：D153G和D330N(Le Du等人的編號(hào))。
[0117] 優(yōu)選堿性磷酸酶包含序列SEQ ID NO：24。
[0118] 本發(fā)明也涉及包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶的雜合蛋白用于被所述病原體感染的體外診斷、或用于所述病原體流行病學(xué)研究的應(yīng)用。
[0119] 本發(fā)明也涉及包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶的雜合蛋白用于抗所述病原體或其免疫原的疫苗接種的體外確證的應(yīng)用。
[0120] 本發(fā)明也涉及包含蛋白或其片段和堿性磷酸酶的雜合蛋白用于研究與堿性磷酸酶融合的所述蛋白或其片段與分子、蛋白或細(xì)胞之間相互作用的應(yīng)用。
[0121] 本發(fā)明也涉及診斷被病原體感染、用于確證被病原體或其免疫原接種、或用于研究所述病原體流行病學(xué)的方法，其特征在于，其包括：
[0122] (i)將來源于受試者或動(dòng)物的樣品與被Ig結(jié)合蛋白敏化的固相載體相接觸，此Ig結(jié)合蛋白抗抗研究的動(dòng)物種類的特定種類的Ig分子，
[0123] (ii)將(i)中形成的免疫復(fù)合物與由雜合蛋白組成的檢測分子一起溫育，此雜合蛋白包含病原體的合適抗原和堿性磷酸酶，所述的免疫復(fù)合物的存在就是所述感染的標(biāo)記。
[0124] 本發(fā)明也涉及研究融合于PhoA的蛋白或其片段與分子、蛋白或細(xì)胞之間的相互作用的方法，其特征在于，包括：
[0125] (i)將所述的分子、蛋白或細(xì)胞與包含融合于PhoA的蛋白或其片段的雜合蛋白相接觸，以及
[0126] (ii)檢測在融合于PhoA的蛋白或其片段與所述分子、所述蛋白或所述細(xì)胞之間最終形成的復(fù)合物。
[0127] 本發(fā)明也涉及篩選抗節(jié)肢介體病毒的化合物的方法，所述的方法包括：
[0128] (i)將最終結(jié)合在固相載體上的抗節(jié)肢介體病毒的抗體或節(jié)肢介體病毒表面分子的受體與包含融合于PhoA的節(jié)肢介體病毒表位的雜合蛋白相接觸；
[0129] (ii)通過測定合適的信號(hào)，例如對(duì)硝基苯酚的形成，來檢測在所述抗節(jié)肢介體病毒抗體或所述受體與所述表位形成的復(fù)合物；
[0130] (iii)加入要檢測的化合物；以及
[0131] (iv)通過測定合適的信號(hào)，并且比較獲得的信號(hào)與(ii)中獲得的信號(hào)，來檢測在所述抗節(jié)肢介體病毒抗體或所述受體與所述表位之間形成的復(fù)合物的量相對(duì)于在步驟(ii)中檢測到的復(fù)合物的量是否降低。
[0132] 在所有的方法中，通過加入4-硝基苯基磷酸鹽(pNPP)并測定對(duì)硝基酚的形成來直接測定復(fù)合物的形成。附圖說明
[0133] 除了上述規(guī)定，本發(fā)明也包括其他規(guī)定，可從下面的實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例以及附圖描述中體現(xiàn)出來，其中：
[0134] 圖1.質(zhì)粒pLB11、pVP5、pLIP5GN-H6和pEBL1的結(jié)構(gòu)。bla和aph基因各自編碼氨芐西林和卡那霉素抗性。ss代表信號(hào)序列并且H6代表六聚組氨酸。下面部分是，在pLIP5GN-H6和pEBL1中的phoA信號(hào)序列的5’末端和phoA基因的主要部分之間的詳細(xì)序列。垂直的箭頭標(biāo)明信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。不屬于phoA基因或其產(chǎn)物的殘基是用斜體字排字的。
[0135] 圖2.用H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體進(jìn)行簡化的小鼠血清GAC-ELISA。實(shí)心符號(hào)，來自被DENV1感染的小鼠的血清；空心符號(hào)，未感染小鼠的對(duì)照血清。方形，25℃下2.5小時(shí)顯示的值；圓形，4℃下過夜顯示的值；菱形，空白的平均值。2.5小時(shí)和過夜的對(duì)照血清信號(hào)迭加。
[0136] 圖3.用H6-ED3.WN-PhoA雜合蛋白進(jìn)行簡化的小鼠血清MAC-ELISA。實(shí)心符號(hào)，用gpE.WN免疫的小鼠的血清；空心符號(hào)，未免疫的小鼠的對(duì)照血清。方形，25℃下3小時(shí)顯示的值；圓形，4℃下過夜顯示的值；菱形，空白的平均值。
[0137] 圖4.簡化的針對(duì)抗原的GAC-ELISA的特異性。用H6-ED3.DEN1-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA雜合蛋白平行進(jìn)行的測試。實(shí)心符號(hào)，被DENV1感染的小鼠血清；空心符號(hào)，未感染的小鼠的對(duì)照血清。圓形，同種的H6-ED3.DEN1-PhoA抗原；方形，非同種的H6-ED3.WN-PhoA抗原；菱形，空白的平均值。在4℃下過夜顯示的值。
[0138] 圖5.簡化的針對(duì)抗原的MAC-ELISA的特異性。用H6-ED3.DEN1-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA雜合體平行進(jìn)行的測試。實(shí)心符號(hào)，被WNV感染的小鼠的血清；空心符號(hào)，未感染的小鼠的對(duì)照血清。圓形，同種的H6-ED3.WN-PhoA抗原；方形，非同種的H6-ED3.DEN1-PhoA抗原；菱形，空白的平均值。在4℃下過夜顯示的值。
[0139] 圖6.在用H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體進(jìn)行的人血清的簡化MAC-ELISA中信號(hào)的濃度依賴性。實(shí)心符號(hào)，初次感染DENV1的病人的血清；空心符號(hào)，DENV1的繼發(fā)性感染。在25℃下3小時(shí)顯示的值。
[0140] 圖7.用H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體進(jìn)行的被DENV四種血清型感染的病人的血清的簡化的MAC-和GAC-ELISA。血清被稀釋400倍，并且在25℃下3小時(shí)測試顯示的值。(A)，簡化的MAC-ELISA。(B)，簡化的GAC-ELISA。(C)，MAC-和GAC-ELISA的信號(hào)的比值r。
樣品1.1，被DENV1初次感染的血清；1.2，被DENV1繼發(fā)性感染的血清；2、3和4，被DENV2、DENV3和DENV4感染的血清；C，健康個(gè)體的血清；N和B，分別沒有添加血清或抗人Ig的測試中的信號(hào)。

具體實(shí)施方式

[0141] 下面的例子是用來闡明本發(fā)明，但并非對(duì)其進(jìn)行限制。
[0142] 實(shí)施例1：材料和方法
[0143] -培養(yǎng)基、緩沖液和試劑盒
[0144] 已經(jīng)描述過培養(yǎng)基LB(Sambrook and Russell，2001)和SB(Plückthun，1996)。氨芐西林使用的濃度是200μg/mL，卡那霉素是50μg/mL。含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基被用于所有的基因構(gòu)建體。用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(購自Qiagen)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備，用Gel Extraction試劑盒(購自Qiagen)從瓊脂凝膠中提取DNA，用Quick Ligation試劑盒(Roche)連接DNA，用NuPAGE Novex系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用96孔微量滴定板(Maxisorb，Nunc)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)。PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液)購自Invitrogen或Sigma-Aldrich；牛血清白蛋白購自Roche；低脂奶粉購自Regilait；Tween 20、4-硝基苯基磷酸鹽(pNPP)和5-溴-4-氯-3-碘磷酸鹽(Xp)購自Sigma-Aldrich。緩沖液A含有50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl；緩沖液B，含有PBS中0.05％Tween；緩沖液C，含有PBS中0.1％Tween；緩沖液D，10％乙醇胺，pH 9.8，0.01M MgSO4；緩沖液E，緩沖液D中20μM ZnCl2。
[0145] -細(xì)菌、質(zhì)粒和病毒株
[0146] 已 經(jīng) 描述 過 大 腸 桿 菌XL1-Blue菌 株 (Bullock et al.，1987)和 質(zhì) 粒pET20b+(www.novagen.com)、pUC-4K(基因庫登錄號(hào)No.X06404)(Vieira and Messing，1982)、pCR-Blunt(Bernard et al.，1994)、pQUANTAbody(Boulain and Ducancel，
2004)、pLB11(Lisova et al.，2007) 以 及 pVP5(Lisova et al.，2007)。XL1-Blue超 級(jí) 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 (Stratagene)、pCR-Blunt(Invitrogen)、pET20b+(Novagen)以 及pUC-4K(AmershamBiosciences)購自供應(yīng)商。質(zhì)粒pLIP5GN-H6是pQUANTAbody的衍生物(圖1)。已經(jīng)描述過登革熱病毒的血清型1的FGA/89病毒株(DENV1；基因庫登錄號(hào)AF226687)(Duartedos Santos et al.，2000)、西尼羅河病毒的IS-98-ST1病毒株(WNV；基因庫AF481864；(Malkinson et al.，2002))、麻疹病毒的Schwarz病毒株的重組型MVSchw以及它的衍生型MVSchw-sEWNV(Despres et al.，2005)。pUC-4K攜帶aph基因，以可容易移動(dòng)的DNA盒形式賦予卡那霉素抗性。在啟動(dòng)子ptac的控制下，pQUANTAbody攜帶來自大腸桿菌的phoA基因的突變等位基因。這個(gè)等位基因編碼在其活性部位有兩個(gè)突變D153G和D330N并有提高的催化性能的堿性磷酸酶(PhoA)(Boulain and Ducancel，2004；Le Du et al.，
2002；Muller et al.，2001)。pLIP5GN-H6與pQUANTAbody的不同之處在于六個(gè)組氨酸密碼子(H6)和多克隆位點(diǎn)區(qū)域的存在，兩者都位于phoA的密碼子27和28之間、信號(hào)序列的下游(圖1)。pLB11和pVP5在pET20b+的NcoI和XhoI限制位點(diǎn)之間各自攜帶編碼ED3.DEN1和ED3.WN的基因片段(圖1)。MVSchw-sEWNV表達(dá)來源于WNY的水溶性形式的gpE。
[0147] -抗體和抗血清
[0148] 山羊抗人的IgM和IgG(Sigma-Aldrich)購自供應(yīng)商。人的血清來自于法國圭亞那的巴斯德研究所國家節(jié)肢介體病毒參照中心的保藏庫。它們是從顯示出基本的登革熱臨床癥狀(發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛)并伴隨著/或不伴隨發(fā)疹和少量出血表現(xiàn)的病人那里收集。血清通過標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法來表征，尤其是使用小鼠大腦提取物作為抗原的GAC-和MAC-ELISA。
[0149] 山羊抗小鼠的IgM(Pierce)和IgG(Sigma-Aldrich)購自供應(yīng)商。已經(jīng)描述過小鼠的單克隆抗體mAb4E11(Bedouelle et al.，2006)。已經(jīng)描繪了ED3.DEN1結(jié)構(gòu)域表面的表位；它是不連續(xù)的和構(gòu)象的(Lisova et al.，2007)。通過在J0天用病毒感染BALB/c小鼠，在J28天用相同的病毒攻擊以及在J53天采血，得到抗DENV1的小鼠血清。從相同種類的未感染的小鼠得到對(duì)照血清。陽性血清IgG的滴度如下所述，并且通過抗結(jié)構(gòu)域ED3.DEN1的間接ELISA來測定，等于30,000(Despres et al.，2005)。通過在J0天用重組的病毒MVSchw-sEWNV感染CD46-IFNAR小鼠，在J18天采血，獲得抗來源于WNY的sE的血清。用“空”病毒MVSchw感染小鼠，獲得對(duì)照血清。陽性和對(duì)照血清的IgM的滴度各自等于1000和100。
[0150] 實(shí)施例2：中間載體pEBL1的構(gòu)建，于2007年4月23日以保藏號(hào)I-3747保藏在CNCM(法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心，28rue du Docteur Roux，75015，巴黎)。
[0151] 位于質(zhì)粒pLIP5GN-H6克隆區(qū)域的限制性位點(diǎn)是非常近的，在這個(gè)區(qū)域很難進(jìn)行雙重限制性切割操作。因此將卡那霉素抗性盒插入這個(gè)區(qū)域的SalI位點(diǎn)。用SalI酶消化質(zhì)粒pUC-4，并且含有aph基因的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化。同樣用SalI消化pLIP5GN-H6。純化的片段和線形的載體通過連接進(jìn)行重組。通過將連接的混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，并且在含有氨芐西林和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，來回收重組質(zhì)粒pEBL1(SEQ ID NO：13)。
[0152] 更確切地說：
[0153] *XL1-Blue(pEBL1)
[0154] XL1-Blue(pEBL1)是含有pEBL1質(zhì)粒的大腸埃希氏桿菌菌株。pEBL1被工程化成用來簡化在六聚組氨酸、想要的過客蛋白(黃病毒的ED3)和來自大腸桿菌的具有提高的催化性能的堿性磷酸酶之間的融合蛋白的構(gòu)建。在pEBL1中，將賦予卡那霉素抗性的DNA盒插入過客基因的位置。因此根據(jù)Hermann等人以前在1990年描述的克隆策略，過客基因的插入是容易實(shí)施和監(jiān)控的。
[0155] *用于XL1-Blue(pEBL)構(gòu)建的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
[0156] 見實(shí)施例1。
[0157] *測定活性來確證微生物的存活力
[0158] 生物體是氨芐西林和卡那霉素抗性的：通過將生物體平皿接種在含有LB瓊脂培養(yǎng)基、100μg/ml氨芐西林和50μg/ml卡那霉素的皮式培養(yǎng)皿上，能夠檢驗(yàn)表現(xiàn)型。
[0159] 實(shí)施例3：ED3-PhoA雜合基因的構(gòu)建
[0160] 方法
[0161] 編碼黃病毒ED3結(jié)構(gòu)域和PhoA之間雜合蛋白的ED3-phoA雜合基因，其構(gòu)建如下所述：用限制性內(nèi)切酶SmaI首先消化質(zhì)粒pEBL1(見實(shí)施例2)，用電泳來驗(yàn)證消化的完成，并且通過在MicrospinG25柱(Amersham-Biosciences)上的大小排阻層析將被消化的DNA脫鹽。然后用SalI酶消化線形pEBL，并且用電泳和對(duì)應(yīng)卡那霉素抗性盒的DNA片段(1252bp)的出現(xiàn)來監(jiān)控此限制性切割。通過使用兩個(gè)寡核苷酸引物和高保真聚合酶Pfu-Turbo(Stratagene)的PCR來擴(kuò)增ED3基因。在ED3基因5′末端雜交的引物引入了SalI位點(diǎn)，在3′末端雜交的引物引入了ScaI和SpeI位點(diǎn)。ScaI位點(diǎn)(AGT-ACT)優(yōu)于SmaI位點(diǎn)(CCC-GGG)，是因?yàn)楹笳咭肓艘粋€(gè)罕用密碼子CCC。ScaI、SpeI和SalI位點(diǎn)在ED3.DEN1和ED3.WN基因中是沒有的。用SalI和ScaI消化PCR產(chǎn)物。通過瓊脂糖凝膠和提取來純化消化產(chǎn)物，然后通過連接來重組。重組的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化被引入XL1-Blue菌株，并且重組細(xì)菌通過在Xp指示培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落和對(duì)卡那霉素敏感而被篩選。
[0162] 用于擴(kuò)增來源于質(zhì)粒pLB11的ED3.DEN1的引物，含有下面的序列，其中限制性位點(diǎn)被在其下面劃線：
[0163] 5′-GCCGGCGGTCGACAAAGGGATGTCATATGTGATGTGCAC-3′(SEQ ID NO：14)
[0164] 5′-GTTTAGTACTAGTTTTCCCTATGCTGCT TCCCTTC-3′(SEQ ID NO：15)。
[0165] 同樣地，用于擴(kuò)增ED3.WN的引物含有下面的序列：
[0166] 5′-GCCGGCGGTCGACAAAGGAACAACCTATGGCGTCTG-3′(SEQ ID NO：16)；
[0167] 5′-GGTGAGTACTAGTTTTGCCAATGCTGCT ACCAGAC-3′(SEQ ID NO：17)。
[0168] 重組質(zhì)粒，編碼H6-ED3.DEN1-PhoA的pEBL11和編碼H6-ED3.WN-PhoA的pEBL15的序列，通過與pEBL1克隆區(qū)域之外雜交的寡核苷酸來檢測。
[0169] 5’-GCACTGGCACTCTTACCGTTAC-3’(SEQ ID NO：18)；
[0170] 5’-CAGTCTGATCACCCGTTAAAC-3’(SEQ ID NO：19)。
[0171] 實(shí)施例4：雙功能的ED3-PhoA雜合體的生成和純化
[0172] 生成和純化
[0173] H6-ED3-PhoA雜合體是由XL1-Blue菌株中的質(zhì)粒pEBL11和pEBL15產(chǎn)生的。通過將分離的菌落接種于SB液體培養(yǎng)基(1/10體積)并37℃過夜培養(yǎng)，得到生產(chǎn)菌株的預(yù)培養(yǎng)物。將預(yù)培養(yǎng)物以一定體積的相同的培養(yǎng)基稀釋得到初始的吸光度A600nm＝0.25-0.30，在30℃下培養(yǎng)直到A600nm＝1.5-2.0，用0.2mM IPTG來誘導(dǎo)啟動(dòng)子ptac，進(jìn)一步在相同的溫度下培養(yǎng)2小時(shí)，得到生成物。所有接下來的步驟在4℃下進(jìn)行。培養(yǎng)物以5000rpm離心10分鐘。細(xì)菌沉淀物重懸浮在含5mM咪唑、1mg/ml多粘菌素B硫酸鹽(Sigma-Aldrich)的緩沖液A(1/40體積)中，并且細(xì)菌懸浮液用磁力攪拌儀輕柔攪拌1小時(shí)。通過在13000rpm下離心懸浮液10分鐘來收集周質(zhì)提取物，并且在-20℃下冷凍。通過NiNTA樹脂柱(培養(yǎng)物的
0.6ml/L，Qiagen)的親和層析從周質(zhì)提取物中純化ED3-PhoA雜合體。用周質(zhì)提取物上柱，并且用含20mM咪唑的緩沖液A(10體積的樹脂)洗滌。被結(jié)合的蛋白以40到100mM梯度的咪唑緩沖液A洗脫。用還原條件的SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)分析純化物的組分。收集含有H6-ED3-PhoA并被純化至＞90％的部分，匯集，并且通過P10柱(Amersham biosciences)的大小排阻層析被轉(zhuǎn)移至PBS緩沖溶液中。它們?cè)谵D(zhuǎn)移進(jìn)PBS之前或之后在-80℃下驟冷，功能性質(zhì)方面沒什么不同(見結(jié)果)。純化的H6-ED3-PhoA雜合體的濃度通過使用A280nm和-1 -1
單體的消光系數(shù)ε280nm＝40680M cm 來確定，此消光系數(shù)用subroutine Pepstats of the software suite EMBOSS(Rice et al.，2000)由它們的氨基酸序列計(jì)算而來。
[0174] 間接ELISA
[0175] 間接ELISA在200μL/孔體積的微量滴定板上進(jìn)行?？贵wmAb4E11用PBS稀釋10000倍?？装宓目?到11用抗體溶液加樣，孔12用PBS單獨(dú)加樣，孔板在4℃下過夜溫育用于吸附反應(yīng)。用緩沖液B(3次)洗滌小孔，在25℃下用3％BSA的緩沖液B封閉3小時(shí)，并且用緩沖液B(4次)再次洗滌。H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體(0.2μM初始濃度)用1％BSA的緩沖液B依次以2倍梯度稀釋?？?-10用雜合體的前10次的稀釋來加樣，孔11用稀釋緩沖液單獨(dú)加樣，并且孔12用雜合體的最低的稀釋溶液來加樣?？装逶?5℃下溫育1小時(shí)，用于捕獲反應(yīng)。小孔象上述那樣被洗滌，捕獲的雜合體通過加入含5mM(2mg/ml)pNPP的緩沖液D來顯示。4℃下過夜于A405nm處檢測對(duì)硝基苯酚的形成。
[0176] 酶活性
[0177] 在25℃下于緩沖液D或E中，于A405nm處檢測從pNPP形成的對(duì)硝基苯酚鹽(pNP)。pNPP(5mM)的起始濃度是飽和的(Le Du et al.，2002)，并且因此動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat可以通過公式來計(jì)算：
[0178] dA405nm/dt＝kcatE0ε405nm(pNP)(4)
[0179] 其中dA405nm/dt是pNP形成的初始速度；E0是(H6-ED3-PhoA)2二聚體的總濃度；以4 -1 -1
及ε405nm(pNP)＝1.78×10M cm (Muller et al.，2001)。kcat值通過E0的幾個(gè)值來測定，并且求平均值。
[0180] H6-ED3-PhoA雜合體的功能性
[0181] 為了評(píng)估H6-ED3-PhoA雜合體的功能性，測定它們的磷酸酶活性，并且分析它們被單克隆抗體mAb4E11的識(shí)別。H6-ED3.DEN1-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA雜合體對(duì)于pNPP脫磷酸化變成pNP是有活性的，在緩沖液D中在25℃下對(duì)于一個(gè)二聚體分子kcat值分別等-1 -1于190±18s 和154±6s 。在間接ELISA中被結(jié)合的H6-ED3.DEN1-PhoA特異性地固定
mAb4E11，被它內(nèi)在的磷酸酶活性顯示。這些結(jié)果表明，雜合體的PhoA部分是正確折疊的并且是二聚體的，因?yàn)镻hoA的二聚體形式的活性是它的單體形式的100倍(Boulanger and Kantrowitz，2003)。它們表明，雜合體的ED3.DEN1部分作為抗原是正確折疊的和有功能的，因?yàn)閙Ab4E11的表位是不連續(xù)的、構(gòu)象的和包含在結(jié)構(gòu)域里的(Lisovaet al.，2007)。
因?yàn)槊總€(gè)雜合體分子的抗原性質(zhì)通過其內(nèi)在的磷酸酶活性顯示出來，結(jié)果表明絕大部分的H6-ED3.DEN1-PhoA分子同時(shí)具有所有必需的性質(zhì)，即它們的PhoA部分是二聚體的和有活性的，并且它們的ED3.DEN1部分是抗原性的和處于二價(jià)的狀態(tài)。在PhoA多肽鏈位點(diǎn)7中的兩個(gè)殘基都位于PhoA二聚體結(jié)構(gòu)的同一側(cè)(Le Du et al.，2002)。因此，H6-ED3-PhoA二聚體中ED3部分的兩個(gè)拷貝也應(yīng)當(dāng)在分子的同一側(cè)并且根據(jù)抗體親抗原模式與免疫球蛋白相互作用。上面的結(jié)果足以顯示，H6-ED3-PhoA雜合體能夠在GAC-和MAC-ELISA中使用。
[0182] 通過間接ELISA來顯示H6-ED3.DEN1-PhoA和抗體mAb4E11之間的識(shí)別的存在，其表位是不連續(xù)的和構(gòu)象的，其中mAb4E11被固定在微量滴定板的小孔中并且通過雜合體的堿性磷酸酶活性來顯示與雜合體的結(jié)合。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，每個(gè)雜合體分子的兩個(gè)部分ED3.DEN1和PhoA是同時(shí)有功能性的。因此，這兩個(gè)部分是正確折疊的，它們必需的二硫鍵在周質(zhì)的氧化介質(zhì)中形成，并且它們的組合是二聚體的，因?yàn)镻hoA只有在寡聚狀態(tài)才是有顯著活性的。每個(gè)雜合體分子都是二聚的和雙功能的。
[0183] 間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明，有可能通過(H6-ED3.DEN1-PhoA)2來檢測ED3.DEN1結(jié)構(gòu)域和抗體mAb4E11之間的識(shí)別。該雜合體可以用來檢測ED3和其他分子，象抑制劑、其他抗體、受體或甚至整個(gè)細(xì)胞之間的相互作用。
[0184] H6-ED3.DEN1-PhoA和H6-ED3.WN-PhoA的催化常數(shù)kcat的值確證了雜合體分子PhoA部分的高活性和它們的二聚體的狀態(tài)。重組ED3通過PhoA的人工二聚化部分地模仿了它們?cè)谡麄€(gè)病毒表面的多聚性的呈現(xiàn)和它們與抗體或其他受體相互作用的多價(jià)位的模式。
[0185] 實(shí)施例5：GAC-ELISA和MAC-ELISA
[0186] 方法
[0187] 捕獲ELISA在100μL/孔體積的微量滴定板上進(jìn)行?？笽gG和抗IgM的抗體用PBS稀釋(終濃度是1mg/mL)。孔板上的孔1至11用抗體溶液加樣，并且孔12只用PBS加樣?？装逶?℃下過夜溫育，用于吸附反應(yīng)。第二天早晨，用緩沖液C(3次)洗滌小孔，在37℃下用3％(w/v)奶粉的緩沖液C封閉1小時(shí)，然后用緩沖液C(3次)再次洗滌。分析中的血清和對(duì)照血清用1％奶粉的緩沖液C稀釋100倍，然后依次稀釋；H6-ED3-PhoA雜合體用相同的緩沖液稀釋(單體的最終濃度是0.5μM)?？?-10用血清的前10次的稀釋液來加樣，孔11用稀釋緩沖液單獨(dú)加樣，并且孔12用血清的最低的稀釋溶液來加樣。孔板在37℃下溫育1小時(shí)，用于抗體捕獲反應(yīng)。小孔用緩沖液C洗滌(3次)然后用H6-ED3-PhoA溶液加樣。孔板在37℃下溫育1小時(shí)，用于結(jié)合反應(yīng)。按上述步驟洗滌小孔，并且通過添加5mM pNPP的緩沖液E來顯示被結(jié)合的H6-ED3-PhoA分子。在25℃下幾小時(shí)或4℃下過夜后測定A405nm。如果血清的信號(hào)值至少是空白對(duì)照的兩倍時(shí)，認(rèn)為血清的信號(hào)是有效的。血清的滴度等于仍然有效的最大稀釋倍數(shù)。用于小鼠血清進(jìn)行的捕獲ELISA試驗(yàn)與用于人血清的試驗(yàn)一樣，除了延長洗滌之外，抗IgM抗體使用的最終濃度是2.4mg/mL，H6-ED3.DEN1-PhoA單體的最終濃度是0.2μM，以及pNPP在緩沖液D中。
[0188] 結(jié)果
[0189] 用于抗黃病毒的IgG的定量的簡化的GAC-ELISA
[0190] 它用來檢驗(yàn)H6-ED3-PhoA雜合體是否能夠在免疫的小鼠的血清中檢測出抗同種的黃病毒的IgG，因此可以簡化常用于血清學(xué)的GAC-ELISA方案。因此，抗小鼠IgG的抗體通過在塑料上的被動(dòng)吸附而被固定在微量滴定板上。用該被固定的抗體來捕獲存在于小鼠血清中的IgG?？笶D3結(jié)構(gòu)域的IgG，通過H6-ED3-PhoA雜合體經(jīng)其抗原部分的結(jié)合性和它的PhoA部分的催化活性來顯示(見公式3)。
[0191] 用被DENV1免疫的小鼠的血清來進(jìn)行測試。未免疫的小鼠的血清、沒有添加抗IgG抗體的空白試樣以及沒有添加血清的空白試樣被用作對(duì)照(見材料和方法部分)。被H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體催化并在A405nm處監(jiān)控的由pNPP生成的pNP，被用作信號(hào)來顯示結(jié)合反應(yīng)(圖2)。低飽和度的A405nm信號(hào)形成與免疫血清濃度的函數(shù)關(guān)系。這些試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，過夜后顯現(xiàn)的免疫血清的滴度＞50000(2.5小時(shí)后＞12500)。未免疫的血清的信號(hào)與空白信號(hào)相比沒什么不同，反之過夜后免疫血清的信號(hào)顯示視濃度而定比空白信號(hào)高2至18倍(2.5小時(shí)后2至6倍)。這些結(jié)果確證了H6-ED3.DEN1-PhoA的兩部分在同一個(gè)分子雜合體中是同時(shí)有功能的。它們表明，此雜合體能靈敏地、定量地并且特異性地檢測血清中抗ED3.DEN1結(jié)構(gòu)域的IgG的存在，因此能檢測出登革熱病毒的感染。
[0192] 用于抗黃病毒的IgM的定量的簡化的MAC-ELISA
[0193] 同樣地，它用來檢驗(yàn)H6-ED3-PhoA雜合體是否能夠在免疫的小鼠的血清中檢測出抗黃病毒的IgM，因此可以簡化常用的MAC-ELISA方案?？剐∈驣gM的抗體被固定化。用該固定化的抗體來捕獲存在于小鼠血清中的IgM?？笶D3結(jié)構(gòu)域的IgM用二價(jià)的H6-ED3-PhoA雜合體來顯示(見公式3)。
[0194] 用被嵌合體病毒MVSchw-sEWNV免疫的小鼠的血清來進(jìn)行測試，MVSchw-sEWNV表達(dá)WNY的gpE的分泌型。用空載體MVSchw免疫的小鼠血清、沒有添加抗IgM抗體的空白試樣以及沒有添加血清的空白試樣被用作對(duì)照(見材料和方法部分)。H6-ED3.WN-PhoA雜合體用來顯示結(jié)合反應(yīng)(圖3)。低飽和度的信號(hào)形成與免疫血清濃度的函數(shù)關(guān)系。過夜后顯現(xiàn)的免疫血清的滴度＞800(3小時(shí)后＞400)。過夜溫育后未免疫的血清的A405nm信號(hào)比空白信號(hào)最多高1.7倍，反之免疫血清的信號(hào)視濃度而定比空白信號(hào)高2至6.4倍。溫育3小時(shí)后顯示對(duì)于未免疫血清這些數(shù)字是1.2倍，對(duì)于免疫血清是2至2.6倍。注意，對(duì)于血清的相對(duì)濃度≤2.5‰，未免疫血清的信號(hào)沒有顯著地與空白信號(hào)區(qū)分開來。這些結(jié)果確證了H6-ED3.WN-PhoA的兩部分在同一個(gè)分子雜合體中是同時(shí)有功能的。它們表明，雜合體可以靈敏地、定量地和特異性地檢測抗ED3.WN結(jié)構(gòu)域的IgM的存在。它們表明，雜合體可以使人們?cè)缙跈z測出與WNY的接觸(在第8天)。
[0195] 實(shí)施例6：通過ED3-PhoA雜合體來辨別黃病毒
[0196] 根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施交叉反應(yīng)來測定簡化的GAC-和MAC-ELISA的特異性。將被DENV1病毒免疫的小鼠的血清提交給兩個(gè)被H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體或H6-ED3.WN-PhoA顯示的平行GAC-ELISA試驗(yàn)(圖4)。相應(yīng)地，將被MVSchw-sEWNV嵌合病毒免疫的小鼠的血清提交給兩個(gè)被H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體或H6-ED3.WN-PhoA顯示的平行MAC-ELISA試驗(yàn)(圖5)。過夜顯示后，GAC-ELISA中同種的信號(hào)比非同種的信號(hào)最多高達(dá)5.4倍，并且MAC-ELISA中最多高達(dá)3.9倍。當(dāng)然，當(dāng)考慮到特異的信號(hào)(血清的信號(hào)減去空白的信號(hào))時(shí)，這些數(shù)值會(huì)大得多。這些結(jié)果表明，如同這里所描述的，GAC-和MAC-ELISA是特異性的，并且它們可以允許人們確定涉及的感染或免疫接種的黃病毒的種類。
[0197] 實(shí)施例7：用簡化的GAC-和MAC-ELISA來測試人的血清
[0198] 用H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體來檢測來自曾感染過登革熱病毒DENV1至DENV4四種血清型之一的病人的血清。對(duì)于DENV1，三個(gè)血清樣品是在癥狀開始之后的第9天與第28天之間采集，對(duì)應(yīng)于登革熱病毒的初次感染；兩個(gè)血清樣品在第13天和第18天采集，對(duì)應(yīng)于繼發(fā)性感染。對(duì)于DENV2、DENV3和DENV4，在第8天和第32天之間采集樣品，不知道是初次感染還是繼發(fā)性感染狀態(tài)。這些血清以前以乳鼠大腦作為抗原，用GAC-和MAC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法測試過。使用下面的對(duì)照：一個(gè)試驗(yàn)中沒有添加抗人IgG或IgM的固定抗體；一個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒有添加血清；兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的是沒有被登革熱病毒感染的病人的血清。
[0199] 對(duì)于在MAC-ELISA(圖6)中初次感染DENV1病人的血清和對(duì)于在GAC-ELISA(未圖示)中繼發(fā)性感染DENV1病人的血清，飽和度的A405nm信號(hào)形成與血清中濃度的函數(shù)關(guān)系。它直線型上升直至血清的相對(duì)濃度＞2.5‰。因此，使用相對(duì)濃度用于以下分析。25℃下3個(gè)小時(shí)的試驗(yàn)的顯現(xiàn)是足夠的。
[0200] 在20個(gè)檢測的血清中，只有對(duì)應(yīng)于初次感染的三個(gè)血清在MAC-ELISA中給出陽性信號(hào)，即，超過對(duì)照信號(hào)的兩倍；所有其他的血清給的信號(hào)與對(duì)照是相同的(圖7A)。因此，根據(jù)本發(fā)明簡化的MAC-ELISA可以檢測出DENV1的初次感染，并且將DENV1感染和其他三種血清型區(qū)分開來。在GAC-ELISA中四種血清樣品給出陽性信號(hào)：兩個(gè)樣品來自于DENV1繼發(fā)性感染的病人；來自于DENV2感染的病人的六個(gè)樣品中的一個(gè)樣品(2d)；來自于DENV4感染的病人的兩個(gè)樣品中的一個(gè)樣品(4a)(圖7B)。因此，根據(jù)本發(fā)明簡化的GAC-ELISA可以在癥狀開始后第13天檢測出DENV1的繼發(fā)性感染。病人的血清2d和4a在簡化的GAC-ELISA中得分為陽性，可能以前被DENV1未注意地感染過。采集樣品的當(dāng)天和在簡化的MAC--ELISA和GAC-ELISA中的信號(hào)值之間沒有看到相關(guān)性。
[0201] 用平行的MAC--ELISA和GAC-ELISA中的信號(hào)比值r來測定登革病毒的感染是否是初次感染還是繼發(fā)性感染類型。根據(jù)本發(fā)明計(jì)算簡化的捕獲ELISA中的信號(hào)比值(圖7C)。對(duì)應(yīng)于DENV1初次感染的三個(gè)血清的r＞1.90。對(duì)應(yīng)DENV2、DENV3和DENV4感染的血清r＜1.4，除了血清2d和4a之外。對(duì)應(yīng)于DENV1繼發(fā)性感染的血清，血清2d和4a的r＜0.4。因此，比值r可以區(qū)分初次感染和繼發(fā)性感染，以及也區(qū)分DENV1的初次感染和其他DENV血清型的感染。
[0202] (H6-ED3.DEN1-PhoA)2雜合體被成功地應(yīng)用于簡化的GAC-ELISA中，來顯示在抗病毒被高免疫的小鼠的血清中、或在經(jīng)受了病毒繼發(fā)性感染的病人的血清中抗DENV1的IgG的存在。相同的雜合體被成功地應(yīng)用于簡化的MAC-ELISA中，來顯示在經(jīng)受了病毒的初次感染的病人的血清中抗DENV1的IgM的存在。簡化的GAC-ELISA使得我們能區(qū)分小鼠的DENV1感染和WNY感染。簡化的GAC-ELISA和MAC-ELISA組合使得我們能區(qū)分人的DENV1感染和其他三種DENV血清型感染，以及區(qū)分DENV1的初次感染和繼發(fā)性感染。
[0203] 同樣，(H6-ED3.WN-PhoA)2雜合體被成功地應(yīng)用于簡化的MAC-ELISA中，來顯示小鼠的血清中抗WNV的IgM的存在。簡化的MAC-ELISA使得我們能區(qū)分WNY感染和DENV1感染。簡化的GAC-ELISA和MAC-ELISA的高特異性和靈敏度可能來自于兩個(gè)因素：ED3結(jié)構(gòu)域作為抗原的使用和檢測系統(tǒng)的獨(dú)立性，包括針對(duì)抗原的本性和它與血清的免疫球蛋白的相互作用的與PhoA的融合。(H6-ED3-PhoA)2的雙功能的二聚體的特異性應(yīng)當(dāng)比直到目前還在使用的抗原和檢測系統(tǒng)的特異性要高。
[0204] 實(shí)施例8：用簡化的MAC-ELISA來檢測人的血清
[0205] 在進(jìn)一步的試驗(yàn)系列中，收集被登革熱病毒四種血清型DEN1至DEN4之一感染或被黃熱病病毒(YFV)感染的病人的血清，并用MAC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法(Talarmin et al.，1998)和PCR(Lanciotti et al.，1992)來表征。標(biāo)準(zhǔn)MAC-ELISA使用感染的乳鼠大腦的提取物作為抗原，并且PCR使用對(duì)于每個(gè)病毒血清型(表I)特異的引物。引物的序列和擴(kuò)增的條件如(Lanciotti et al.，1992)所述。尤其是引物的序列如下所示：
[0206] 引物D1：5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’(SEQ ID NO：26)。
[0207] 引物D2：5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’(SEQ ID NO：27)。
[0208] 引物TS1：5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’(SEQ ID NO：28)。
[0209] 引物TS2：5’-CGCCACAAGGGGCATGAACAG-3’(SEQ ID NO：29)。
[0210] 引物TS3：5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’(SEQ ID NO：30)。
[0211] 引物TS4：5’-CTC TGT TGT CTTAAA CAA GAGA-3’(SEQ ID NO：31)。
[0212] 擴(kuò)增發(fā)生在含有下列成分的100μl體積中：50mM KCl、10mM Tris(pH 8.5)、1.5mMMgCl2、0.01％gelatin、200μM四種脫氧核苷酸三磷酸鹽的每種、5mM二硫蘇糖醇、
50pmol每個(gè)引物、2.5個(gè)單位的rav-2重組RT(Amersham，Arlington Heights，Ill.)和
2.5個(gè)單位的Amplitaq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，康涅狄格州)。這個(gè)反應(yīng)允許在熱循環(huán)程序中進(jìn)行，42℃下孵育1小時(shí)，然后進(jìn)行35次循環(huán)的變性(94℃，30秒)，引物退火(55℃，1分鐘)和引物延伸(72℃，2分鐘)。
[0213] 表I.用于簡化MAC-ELISA和GAC-ELISA分析的人血清的數(shù)量。
[0214]血清 ELISA DEN雜合體 YF雜合體
DEN1 MAC 30 18
DEN2 MAC 44 24
DEN3 MAC 38 18
DEN4 MAC 13 13
YF MAC 19 19
DEN1 GAC 18 0
血清 ELISA DEN雜合體 YF雜合體
DEN2 GAC 24 0
DEN3 GAC 18 0
[0215] 在上述的表I中，第1列：用標(biāo)準(zhǔn)診斷方法在病人血清中檢測出的黃病毒(見本文)。第3列：用對(duì)應(yīng)于DENV四種血清型的H6-ED3-PhoA雜合體平行檢測的血清的數(shù)量。第4列：用四種H6-ED3.DEN-PhoA雜合體和H6-ED3.YF-PhoA雜合體平行檢測的血清的數(shù)量。第4列的血清組成了第3列血清的一個(gè)亞組。
[0216] 19個(gè)感染YFV病人的血清中有四個(gè)來自于卡宴市(法國圭亞那)的巴斯德研究所并且對(duì)應(yīng)于近期剛接種抗YFV的病人，剩余的15個(gè)血清來自于達(dá)喀爾(塞內(nèi)加爾)的巴斯德研究所。
[0217] 根據(jù)本發(fā)明通過簡化的MAC-ELISA，使用五個(gè)對(duì)應(yīng)的H6-ED3-PhoA雜合體并且按以前所描述的方法(見實(shí)施例5)，對(duì)采集的血清進(jìn)行試驗(yàn)。簡化的MAC-ELISA的一般形式如下所示：
[0218] 支持物-@huIgX：：血清：：(H6-ED3-PhoA)2
[0219] 其中@huIgM是抗人IgM的抗體。發(fā)明者認(rèn)為血清試驗(yàn)的信號(hào)A是陽性的，只要它比對(duì)照的信號(hào)Ac高兩倍以上，即A＞2Ac。后者存在于實(shí)施的n次重復(fù)試驗(yàn)(n≥3)、并且不添加抗人IgM的抗體的試驗(yàn)。
[0220] 表II給出了對(duì)于每種血清和雜合體的陽性信號(hào)的比例。對(duì)于每種血清，同種的雜合體的陽性信號(hào)的比例是最大的，除了DENV4感染的病人的血清之外。在最近的例子中，ED3.DEN1-PhoA和ED3.DEN2-PhoA雜合體的陽性信號(hào)的比例是最高的。DEN2和YF血清很少與非同種的雜合體反應(yīng)。相反，DEN1血清經(jīng)常與DEN2和DEN3雜合體反應(yīng)，并且DEN4血清與每種DEN雜合體反應(yīng)。相反，對(duì)于每種雜合體，同種的血清的陽性信號(hào)的比例是最大的，除了ED3.DEN4-PhoA與每種血清都很微弱的反應(yīng)之外。尤其是，DEN1和YF雜合體很少與非同種的血清反應(yīng)。
[0221] 表II.通過簡化的MAC-ELISA使用H6-ED3-PhoA雜合體來檢測人的血清。
[0222]
[0223] 在上述的表II中，第1列給出了用于測試的H6-ED3-PhoA雜合體類型，即，其ED3部分的病毒來源。2-6列給出了每種血清和雜合體的陽性血清的比例。如果血清的信號(hào)A高于對(duì)照信號(hào)Ac的兩倍(A≥2Ac)，血清的信號(hào)被認(rèn)為是陽性的；如果低于對(duì)照信號(hào)的兩倍(A＜2Ac)，則是陰性的。表I中給出了人血清的數(shù)量和性質(zhì)。
[0224] 表III給出了每種血清和每種雜合體的比例(血清信號(hào))/(對(duì)照信號(hào))的平均值，即。對(duì)于每種血清，同種的雜合體的平均值是最大的，除了DEN4的血清之外。然而，對(duì)于每種雜合體，同種的血清的平均值一般來說不是最大的。
[0225] 表III.簡化的MAC-ELISA中的人血清的相對(duì)信號(hào)。
[0226]
[0227] 在上述的表III中，第1列給出了在試驗(yàn)中使用的H6-ED3-PhoA雜合體。2-6列給出了每種血清和雜合體的A/Ac平均值。詳情見表II說明。
[0228] 實(shí)施例9：使用臨界信號(hào)的簡化的MAC-ELISA的靈敏度和特異性
[0229] 表IV的第1行給出了每種血清和同種的雜合體的簡化的MAC-ELISA的靈敏度。這個(gè)靈敏度對(duì)于DEN1和DEN2血清是高的，對(duì)于DEN3和YF血清是中等的，對(duì)于DEN4血清是低的。如果只限于來自于卡宴市的巴斯德研究所和對(duì)應(yīng)于接種病人的四個(gè)YF血清，靈敏度會(huì)高得多(四個(gè)陽性信號(hào))。ED3.YF-PhoA雜合體，其序列對(duì)應(yīng)于YFN的疫苗菌株17D，與檢測出抗野生型菌株的IgM相比，可能更好地檢測出抗疫苗病毒的IgM。
[0230] 表IV.用于人血清的簡化的MAC-ELISA的靈敏度和特異性。
[0231]
[0232] 在表IV中，第1行的靈敏度被定義為當(dāng)用同種的H6-ED3-PhoA雜合體一起測定時(shí)給出陽性信號(hào)的血清的比例(見表II的對(duì)角線)。在第2行中的DEN血清型特異性被定義為在用同種的DEN雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)的血清中，當(dāng)用三個(gè)非同種的DEN雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)的血清的比例。在第3行中的DEN血清型特異性被定義為在用同種的雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)的血清中，當(dāng)用同種DEN雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)高于用三個(gè)非同種的DEN雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)的血清的比例。測定第2行和第3行的DEN血清型特異性使用的是表I、第3列的血清。在第4行中的種群特異性被定義為用同種DEN雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)并且用YF雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)的DEN血清的比例；以及用同種的YF雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)并且用所有的四個(gè)DEN雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)的YF血清的比例。在第5行中的病毒特異性被定義為在用同種的雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)的血清中，用同種的雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)高于用非同種的雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)的血清的比例。第4行和第5行的種群特異性和病毒特異性的測定使用的是表I、第4列的血清。其他詳情見表II。
[0233] 在簡化的MAC-ELISA中DEN血清型的ED3-PhoA特異性是計(jì)算為：在用同種的雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)(A＞2Ac)的血清中，用三個(gè)非同種的雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)(A＜2Ac)的血清的比例。該血清型特異性對(duì)于ED3.DEN2-PhoA是高的，對(duì)于DEN3雜合體是中等的，對(duì)于DEN4雜合體是低的(表IV，第2行)。
[0234] 在簡化的MAC-ELISA中病毒種群的ED3-PhoA雜合體的特異性一方面計(jì)算為用同種ED3.DEN-PhoA雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)并且用ED3.YF-PhoA雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)的DEN血清的比例；另一方面計(jì)算為用同種的ED3.YF-Ph雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)并且用所有的ED3.DEN-PhoA雜合體測定時(shí)給出陰性信號(hào)的YF血清的比例。病毒種群的特異性每個(gè)都≥89％，對(duì)于ED3.DEN1-PhoA和ED3.DEN4-PhoA雜合體，高達(dá)100％(表IV，第4行)。
[0235] 實(shí)施例10：使用最大信號(hào)的簡化的MAC-ELISA的特異性
[0236] ED3-PhoA雜合體的這樣的模結(jié)構(gòu)使得在簡化的MAC-ELISA中的信號(hào)強(qiáng)度僅僅取決于在它的ED3部分用血清的抗體之間的識(shí)別特性。這種特性使得人們能定量地比較用攜帶不同ED3結(jié)構(gòu)域的ED3-PhoA雜合體測定時(shí)由特定的血清得到的信號(hào)。因此，發(fā)明者計(jì)算出用同種ED3-PhoA雜合體測定時(shí)給出陽性信號(hào)、以及用同種雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)高于用非同種雜合體測定時(shí)給出的信號(hào)的血清的比例。發(fā)明者計(jì)算了四種ED3.DEN雜合體的這些比例，然后計(jì)算了五種ED3-PhoA雜合體的這些比例。用這種方式計(jì)算的四種DEN雜合體的血清型特異性，對(duì)于DEN1、DEN2和DEN3雜合體是≥89％，對(duì)于DEN4雜合體是零(表IV、第3行)。計(jì)算五種雜合體的病毒特異性是≥89％，除了DEN4雜合體之外(表IV、第5行)。
[0237] 實(shí)施例11：用簡化的GAC-ELISA來檢測人的血清
[0238] 收集被登革熱病毒的三種血清型DEN1、DEN2和DEN3中的一種感染的病人的血清，并且用IgG特異性的間接ELISA和PCR標(biāo)準(zhǔn)方法來表征。間接ELISA使用感染的乳鼠大腦的提取物作為抗原，并且PCR使用對(duì)每個(gè)病毒血清型特異的引物(表I)。根據(jù)本發(fā)明通過簡化的GAC-ELISA，使用三個(gè)對(duì)應(yīng)的H6-ED3-PhoA雜合體按照以前所描述的方法(見實(shí)施例5)，對(duì)收集的血清進(jìn)行試驗(yàn)。簡化的GAC-ELISA的一般形式如下所示：
[0239] 支持物-@huIgG：：血清：：(H6-ED3-PhoA)2
[0240] 其中@huIgG是抗人IgG的抗體。當(dāng)血清試驗(yàn)的信號(hào)高于對(duì)照的信號(hào)兩倍時(shí)，發(fā)明者認(rèn)為它是陽性的。后者存在于實(shí)施的n次重復(fù)試驗(yàn)(n≥3)并且不添加抗人IgG的抗體的試驗(yàn)中。在簡化的GAC-ELISA中用同種雜合體測定時(shí)的陽性血清的比例是低的，并且最大不超過29％(表V)。
[0241] 表V.用于人血清的簡化的GAC-ELISA的靈敏度和特異性。
[0242]
[0243] 在表V中，靈敏度和血清型特異性的定義如同表IV。表I中給出了人血清的數(shù)量和性質(zhì)。
[0244] 在實(shí)施例8-11中表征的H6-ED3-PhoA使得發(fā)明者通過簡化的MAC-ELISA能早期識(shí)別出登革熱病毒或黃熱病病毒最近的感染。除了DEN4病毒外，靈敏度以如下順序從高到非常高：DEN1＞DEN2＞DEN3＝Y(jié)F＞＞DEN4。
[0245] 這些靈敏度的差異可能歸因于依照于病毒的ED3結(jié)構(gòu)域的不同免疫原性水平。在這種假設(shè)下，ED3.DEN4結(jié)構(gòu)域的免疫原性可能比其他三個(gè)血清型DEN1-DEN3或YFV結(jié)構(gòu)域的免疫原性小。作為另一種選擇，靈敏度的差異可能歸因于特定的菌株、以及因此發(fā)明者用于構(gòu)建重組雜合體的病毒的序列。例如，用于YFV感染的簡化的MAC-ELISA可以通過任意使用兩個(gè)雜合體來得到改進(jìn)，一個(gè)對(duì)應(yīng)于17D疫苗菌株并且另一個(gè)對(duì)應(yīng)于野生型菌株。
[0246] 五個(gè)被檢測的雜合體都有很好的病毒種群特異性，即登革熱種群對(duì)比黃熱病種群都高于89％。當(dāng)用不同的雜合體進(jìn)行定量比較相同的血清試驗(yàn)時(shí)，它們也都有很好的血清型特異性，除了DEN4雜合體之外都高于89％。這個(gè)結(jié)果表明，抗ED3.DEN4的抗體識(shí)別黃病毒之間共有的表位。
[0247] 用H6-ED3-PhoA雜合體的血清型DEN1-DEN3對(duì)人血清進(jìn)行的簡化的GAC-ELISA，其靈敏度低。這個(gè)結(jié)論是否是普遍的并且應(yīng)當(dāng)延伸至其他病毒或生物體，尚需確定。圖2和4顯示了用H6-ED3.DEN1-PhoA雜合體對(duì)被DENV1免疫的小鼠的血清進(jìn)行簡化的GAC-ELISA的靈敏度。發(fā)明者也顯示了對(duì)人血清進(jìn)行的簡化的MAC-和GAC-ELISA的信號(hào)的定量比較，并且它能區(qū)分DENV1的初次感染和繼發(fā)性感染，見實(shí)施例7和圖7。
[0248] 因此，可以在低等級(jí)的安全性實(shí)驗(yàn)室中制備重組的H6-ED3-PhoA雜合體。它們能早期檢測黃病毒的感染，并且允許臨床醫(yī)生區(qū)分病毒的種群或甚至登革熱病毒的血清型。
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