一株高效降解佛波酯菌株及其在麻瘋樹(shù)餅粕發(fā)酵脫毒中的
應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)
[0002] 麻瘋樹(shù)(Jatropha?curcas)屬大戟科(Euphorbiacea)麻瘋樹(shù)屬(Jatropha)
植物，分為有毒和無(wú)毒兩種基因類(lèi)型，其中無(wú)毒品種僅分布在墨西哥。麻瘋樹(shù)的種籽是麻瘋樹(shù)果，其種仁含油量高達(dá)60％，是制備
生物柴油的理想原料。但由于其餅粕中含有胰蛋白酶
抑制劑、植物凝集素、佛波醇酯等
抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素，使其不能直接被用作動(dòng)物
飼料。目前一般將其作為廢棄物丟棄，不僅造成了大量的資源的浪費(fèi)，還污染了環(huán)境。近年來(lái)，由于世界范圍內(nèi)以麻瘋樹(shù)為原料生產(chǎn)生物柴油的研究已成為熱
門(mén)課題，而且其成果逐步得到推廣應(yīng)用，致使麻瘋樹(shù)制備生物柴油的副產(chǎn)品-麻瘋樹(shù)餅粕的應(yīng)用受到極大的關(guān)注。與其他植物源蛋白飼料類(lèi)似，麻瘋樹(shù)餅粕通過(guò)物理化學(xué)方法(
熱處理、
溶劑浸出、
堿處理等)也可以降低或去除其抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒物。物理脫毒效率低，且對(duì)餅柏中的營(yíng)養(yǎng)成分造成一定的破壞；化學(xué)脫毒操作復(fù)雜過(guò)程繁瑣、易導(dǎo)致化學(xué)物殘留，而且脫毒范圍小、成本高。
[0003] 利用
微生物發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)行麻瘋樹(shù)餅粕的全方位脫毒，不僅可降低麻瘋樹(shù)餅粕的毒性，增加產(chǎn)品的適口性，而且還可進(jìn)一步提高
蛋白質(zhì)含量。目前，麻瘋樹(shù)籽餅粕發(fā)酵主要是由
棉籽粕和大
豆粕發(fā)酵方法演變而來(lái)，多采用單菌或混菌固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵菌株多是
酵母和霉菌。
發(fā)明內(nèi)容
[0004] 本發(fā)明提供一株高效降解佛波酯菌株，該菌種從麻瘋樹(shù)種根系
土壤中分離獲得，可進(jìn)行麻瘋樹(shù)餅粕的發(fā)酵脫毒。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 一株高效降解佛波酯菌株，該菌是陰溝腸桿菌(Enterobacter?cloacae)的菌株Z11，該菌株于2017年9月21日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，編號(hào)為CGMCC?No.14655。
[0007] 所述的高效降解佛波酯菌株是從四川攀枝花麻瘋樹(shù)種植園麻瘋樹(shù)根系土壤中分離篩選、純化得到，該菌株的生物學(xué)性質(zhì)如下：
[0008] 形態(tài)學(xué)特征：在LB培養(yǎng)基平板上形成明顯菌落，乳白色，圓形或稍顯圓形，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，呈扁平狀，中間略微凸起，不透明。革蘭氏
染色為陰性。
顯微鏡下觀(guān)察，菌株細(xì)胞形態(tài)為桿狀。
[0009] 培養(yǎng)特征：最適生長(zhǎng)
溫度32℃(圖5)，最適生長(zhǎng)初始pH為8(圖4)，兼性厭
氧。生長(zhǎng)于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分：NaCl?0.5g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母膏5.0g/L。
[0010] 一種所述的高效降解佛波酯菌株在麻瘋樹(shù)餅粕的發(fā)酵脫毒方面的應(yīng)用。作為優(yōu)選，采用所述的高效降解佛波酯菌株進(jìn)行麻瘋樹(shù)餅粕的發(fā)酵脫毒方法是：采用固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵的方式，含麻瘋樹(shù)餅粕的底物接種菌株Z11的菌液，菌液接種量為15％-30％，在30℃條件下發(fā)酵5-7天。
[0011] 一種所述的采用高效降解佛波酯菌株進(jìn)行麻瘋樹(shù)餅粕的發(fā)酵脫毒方法，包括如下步驟：
[0012] ①活化菌株：取-80℃保存的菌液加入滅菌活化培養(yǎng)基中，30±2℃120rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)，得到菌株Z11的菌液，活化培養(yǎng)基含有NaCl?0.5g/L，蛋白胨5.0g/L和酵母膏5.0g/L；
[0013] ②餅粕制作：麻瘋樹(shù)
種子干燥后
壓榨脫油，取脫油麻瘋樹(shù)餅粕，干燥后
粉碎過(guò)40目篩，121℃滅菌20min；
[0014] ③固態(tài)發(fā)酵條件：干燥后的脫油麻瘋樹(shù)餅粕與
水混合，接種菌株Z11的菌液，底物初始水分含量30％-50％，菌液接種量為15％-30％，在30℃條件下發(fā)酵5-7天。發(fā)酵后麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯含量可下降38.6％～50.7％。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：具有高效降解佛波酯的腸桿菌菌株Z11，是為研究麻瘋樹(shù)餅粕脫毒機(jī)制提供有效的降解菌株，可以提高麻瘋樹(shù)餅粕的飼用價(jià)值。麻瘋樹(shù)餅粕在發(fā)酵后，其
粗蛋白的含量較發(fā)酵前約有30％的提高。發(fā)酵后麻瘋樹(shù)餅粕中的賴(lài)
氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸等含量都較發(fā)酵前有了一定程度的提高，發(fā)酵后餅粕中總氨基酸含量較發(fā)酵前提高18％左右，其中總必需氨基酸總量提高約16％左右，氨基酸含量平衡，齊全。發(fā)酵后麻瘋樹(shù)餅粕中的各類(lèi)抗?fàn)I養(yǎng)因子都有不同程度的減少。其中植酸、胰蛋白酶抑制劑和植物凝集素的含量均下降70％以上。
附圖說(shuō)明
[0016] 圖1是腸桿菌Z11在LB培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)結(jié)果圖；
[0017] 圖2是腸桿菌Z11的掃描電鏡圖；
[0018] 圖3是腸桿菌Z11的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖；
[0019] 圖4是不同pH條件下腸桿菌Z11的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
[0020] 圖5是不同溫度條件下腸桿菌Z11的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
[0021] 圖6是添加不同
碳源條件下菌株Z11的生長(zhǎng)圖；
[0022] 圖7是添加不同氮源條件下菌株Z11的生長(zhǎng)圖。
具體實(shí)施方式
[0023] 為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳
實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具有高效降解麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯的腸桿菌Z11對(duì)麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯與抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解功效進(jìn)行說(shuō)明，詳細(xì)說(shuō)明如后。
[0024] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0025] 佛波酯含量的測(cè)定方法：使用Agilent?Extend-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈：水＝80:20(V:V)，加入0.3％
甲酸，檢測(cè)
波長(zhǎng)280nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。使用PMA(Phorbol?12-myristate?13-acetate)為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0026] 實(shí)施例1：
[0027] 從四川省攀枝花市麻瘋樹(shù)種植園區(qū)麻瘋樹(shù)根系土壤表層下5-10cm處取得土壤樣品，經(jīng)富集、篩選、純化培養(yǎng)，獲得28株可耐受麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯的菌株。將獲得的菌株接種到麻瘋樹(shù)餅粕中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵后餅粕中佛波酯含量的測(cè)定，篩選出對(duì)佛波酯降解效果最好的菌株，記為腸桿菌Z11，該菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)結(jié)果如圖1所示。腸桿菌Z11的掃描電鏡圖見(jiàn)圖2。
[0028] 對(duì)編號(hào)為Z11的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化鑒定，根據(jù)顯色反應(yīng)判定Z11為陰溝腸桿菌。腸桿菌Z11的生理生化鑒定部分結(jié)果見(jiàn)表1。
[0029] 表1?Z11菌株生理生化特性鑒定
[0030]
[0031] 注：“+”號(hào)表示陽(yáng)性，“-”號(hào)表示陰性。
[0032] 結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株Z11為Enterobacter?cloacae，中文名稱(chēng)陰溝腸桿菌。
[0033] 采用搖瓶培養(yǎng)基，固定搖瓶培養(yǎng)的其他條件后，測(cè)定腸桿菌Z11的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖3，并通過(guò)測(cè)量菌液于600nm的吸光度(OD600)對(duì)溫度、初始pH、最佳碳源及氮源等進(jìn)行逐一優(yōu)化。結(jié)果表明腸桿菌Z11最適pH值為8(圖4)，最適溫度為32℃(圖5)，最適碳源為
蔗糖(圖6)，最適氮源為蛋白胨(圖7)。
[0034] 取一環(huán)斜面保存的腸桿菌，接入菌株活化培養(yǎng)基(g/L
牛肉膏3g/L，蛋白胨1g/L，NaCl5g/L，pH7.0)中，32℃，150r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。
[0035] 將活化的腸桿菌Z11接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(麻瘋樹(shù)餅粕5g，去離子水50mL，pH自然，121℃滅菌20min)，30℃，150rpm培養(yǎng)5d，離心，棄上清液，保留餅粕，65℃烘干，測(cè)得麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯含量從發(fā)酵前1.22mg/g降低至發(fā)酵后的0.37mg/g，降低69.77％。
[0036] 實(shí)施例2：
[0037] 選擇接種量、初始加水量和發(fā)酵時(shí)間這三個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平如表2。
[0038] 表2試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平
[0039]
[0040]
[0041] 試驗(yàn)以佛波酯的降解率為研究目標(biāo)，記為變量Y，接種量、初始
含水量和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因子為考察對(duì)象，分別記為變量X1、X2、X3。設(shè)計(jì)了3因素3水平(接種量15％，20％，30％；初始含水量30％，50％，80％；發(fā)酵時(shí)間4d，5d，6d)發(fā)酵試驗(yàn)。17組試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
[0042] 表3響應(yīng)面設(shè)計(jì)與佛波酯降解率實(shí)測(cè)值
[0043]
[0044]
[0045] 實(shí)施例3：
[0046] 將活化的腸桿菌Z11接種在麻瘋樹(shù)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中(麻瘋樹(shù)餅粕干燥后，過(guò)40目，取5g，加入去離子水5mL，pH自然，121℃滅菌20min)，菌株接種量為20％，濕度50％條件下，發(fā)酵5d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)麻瘋樹(shù)餅粕發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)結(jié)果可知，麻瘋樹(shù)餅粕中佛波酯含量下降51.6％，植酸含量下降82.56％，
單寧含量下降37.80％，胰蛋白酶抑制劑含量下降90.45％，凝集素含量下降88.90％。
[0047] 表4麻瘋樹(shù)餅粕發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量
[0048]
[0049] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到結(jié)論：使用腸桿菌Z11發(fā)酵麻瘋樹(shù)餅粕后，在降解佛波酯
基礎(chǔ)上同時(shí)減少麻瘋樹(shù)餅粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并保留其主要營(yíng)養(yǎng)成分。綜合來(lái)看，該工藝具有較高的脫毒效率，經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保指標(biāo)均可滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)需求。
[0050] 以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出
權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
