技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本
發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù),具體的說是一種用于多環(huán)芳
烴污染
土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法,是以蛭石為載體的
吸附固定化混合菌工藝。
背景技術(shù)
[0002] 蛭石化學(xué)式為Mgx(H2O){Mg3~x〔AlSiO3O10〕(OH)2},是一種層狀結(jié)構(gòu)的含鎂的
水鋁硅酸鹽次生變質(zhì)礦物,外形似
云母,通常由黑(金)云母經(jīng)熱液蝕變作用或
風(fēng)化而成。因其受熱失水膨脹時呈撓曲狀,形態(tài)酷似水蛭,故稱蛭石。蛭石具有
隔熱、耐凍、吸水等優(yōu)異性能,是一種優(yōu)良的載體材料。
[0003] 多環(huán)芳烴(PAHs)是指2個或2個以上的苯環(huán)稠合在一起的一類化合物,它們在環(huán)境中普遍存在。人類活動特別是化石
燃料的燃燒是環(huán)境中PAHs的主要來源。由于該類化合物的辛醇-水分配系數(shù)高,
水溶性差,常被吸附于土壤顆粒上。因此,土壤就成為PAHs的主要載體。PAHs在土壤中比較穩(wěn)定而且難于分解,即便采用處理土壤中易揮發(fā)、易降解有機(jī)污染物較成功的方法也很難去除土壤中的PAHs。多環(huán)芳烴在自然界中的積累會對人類以及整個自然界造成極大的危害,一些多環(huán)芳烴進(jìn)入人體和動物體內(nèi)后,會產(chǎn)生致癌、致畸、致突變的后果。因此,有關(guān)PAHs污染土壤的修復(fù)技術(shù)倍受關(guān)注。盡快開發(fā)出安全、高效、實(shí)用性強(qiáng)的多環(huán)芳烴污染
土壤修復(fù)技術(shù),是科研工作者面臨的艱巨而緊迫的任務(wù)。
[0004] 近年來,發(fā)展起來的微
生物修復(fù)技術(shù)為PAHs的降解提供了較好的途徑,但也存在一些
缺陷,如單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、反應(yīng)啟動慢、與土著菌競爭處于劣勢、抗毒性侵害能
力差、對環(huán)境條件敏感,加入到修復(fù)現(xiàn)場環(huán)境中的
微生物可能由于競爭或難以適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致作用結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大出入,使得不能很好的應(yīng)用于原位污染土壤修復(fù)。因此,亟需開發(fā)更高效更適合于原位多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的新型生物技術(shù),而微生物固定化技術(shù)可以克服這些弊端。
[0005] 所謂固定化技術(shù),是利用化學(xué)或物理的手段,將游離的細(xì)胞(微生物)或酶
定位于限定的空間區(qū)域使其保持活性并能反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是可以大幅度提高參加反應(yīng)的微生物濃度,固定化后的微生物耐環(huán)境沖擊性增強(qiáng),根據(jù)需要可選擇適宜的微生物,可降低二次污染等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛用于修復(fù)受污染的
流體介質(zhì)(如
廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)環(huán)境中。但將固定化微生物用于降解非流體介質(zhì)(土壤)中有機(jī)污染物的研究,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
[0006] 微生物固定化技術(shù)的關(guān)鍵是篩選適宜的載體材料和確定優(yōu)化的固定化工藝條件。
發(fā)明內(nèi)容
[0007] 為了解決上述問題,本發(fā)明的目的在于提供一種用于修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的固定化混合菌(細(xì)菌與真菌)顆粒的制備方法。本發(fā)明以蛭石為載體材料,采用吸附固定化方法,對高效降解多環(huán)芳烴的菌株進(jìn)行固定化,將制得的固定化微生物應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù),結(jié)果表明:按照該配方制得的固定化生物產(chǎn)品對高分子量多環(huán)芳烴污染土壤具有良好的修復(fù)效果,是一種可信賴的新型環(huán)保生物產(chǎn)品。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案(固定化混合菌的制備方法)為:
[0009] 一種以蛭石為載體的真菌和細(xì)菌聯(lián)合固定化方法,以經(jīng)過改性與浸潤處理的蛭石為載體材料,高溫高壓
蒸汽滅菌后,接種真菌與細(xì)菌的混合菌,然后增殖培養(yǎng),便制得所需固定化混合菌顆粒。
[0010] 所述蛭石在作為載體以前需經(jīng)過改性處理,包括3種改性方法,具體為:
[0011] 1.將蛭石過2mm篩后,加0.5~1.5mol/L HCl,固液比1∶15~25,室溫靜泡24~36h,用水沖洗,然后60~83℃烘干,放干燥器中備用,便制得室溫酸改性蛭石;
[0012] 2.將蛭石過2mm篩后,加0.5~1.5mol/L HCl,固液比1∶15~25,80~83℃恒溫水浴攪動2~2.5h,蒸餾水沖洗,烘干后,便制得加熱酸改性蛭石;
[0013] 3.加熱酸改性后蛭石再于400~500℃
焙燒4~8h,得到酸處理并焙燒的蛭石。
[0014] 所述蛭石浸潤處理為,改性處理后的蛭石按0.5~1.5ml/g的固液比用無菌水或增殖培養(yǎng)基浸潤培養(yǎng)12~24h。
[0015] 所述真菌為毛霉(Mucor sp.),細(xì)菌為(Bacillus sp.),其對多環(huán)芳烴,尤其是高分子量多環(huán)芳烴具有一定的降解能力,培養(yǎng)
溫度為20~28℃;
種子斜面培養(yǎng)基為
葡萄糖1.25%,
牛肉膏0.25%,NH4NO3 0.1%,MgSO4·7H2O0.02%,KCl 0.02%,pH6.5,較佳的種子培養(yǎng)基為
馬鈴薯0.3%,
蔗糖2%,牛肉膏0.2%,瓊脂2%,NaCl 0.5%,pH自然;增殖培養(yǎng)基可為蔗糖4.0%,
酵母膏0.3%,尿素0.12%,KH2PO4 0.05%,MgSO4·H2O0.025%,pH5.0~7.0,也可為蔗糖4.0%,尿素0.12%,蛋白胨0.3%,KH2PO4 0.05%,MgSO4·H2O0.025%,NaCl 0.2%pH5.0~7.0,較佳的為蔗糖4.0%,酵母膏0.3%,KH2PO40.05%,(NH4)HPO4 0.2%,MgSO4·H2O 0.025%,pH6.0~6.5。
[0016] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017] 1.本發(fā)明對載體材料進(jìn)行三種不同的改性處理,使蛭石呈現(xiàn)多孔的特征,晶片破裂,并出現(xiàn)0.01~0.4μm大小不等微孔,
比表面積提高,吸附性增強(qiáng),為真菌和細(xì)菌提供了更多的吸附位點(diǎn),提高了固定化效率;以改性后的蛭石為載體材料,制備的固定化混合菌顆粒為微生物提供了更適合的微環(huán)境,與土著菌的競爭力增強(qiáng),對環(huán)境中毒物的抗性增加,可以在不良環(huán)境中仍然發(fā)揮高效降解菌對多環(huán)芳烴的降解作用;該固定化方法簡單易行,適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。
[0018] 2.本發(fā)明所采用微生物為真菌和細(xì)菌的混合菌,很好的解決了單一菌株降解不徹底問題,真菌能夠分泌胞外酶,使多環(huán)芳烴羥基化,對高分子量多環(huán)芳烴起開環(huán)作用,但生成的中間代謝產(chǎn)物毒性往往比原污染物的毒性更大,真菌不能降解這些中間產(chǎn)物,而細(xì)菌可以將這些毒性更大的中間產(chǎn)物降解成CO2和水,真菌和細(xì)菌的聯(lián)合使得高分子量的多環(huán)芳烴降解更徹底;固定化混合菌(真菌和細(xì)菌)顆粒對受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)中具有明顯的修復(fù)效果,在投粒比2%、修復(fù)時間60d的條件下,土壤中PYR去除率為81~96%,對BaP的去除率為52~65%,較游離菌提高20%以上。
[0019] 3.本發(fā)明所制得的固定化混合菌顆粒很好的解決了非流體介質(zhì)傳質(zhì)困難的問題?!膀问?細(xì)菌-真菌”三者間關(guān)系相互關(guān)聯(lián),不可分割,經(jīng)SEM(掃描
電子顯微鏡)觀察到:細(xì)菌附著在真菌菌絲體表面,菌絲隨著生長而移動,使得附著在其表面的細(xì)菌也跟著遷移,更易于與污染物
接觸,從而使固定化顆粒降解多環(huán)芳烴的有效范圍更廣,修復(fù)效果更明顯,修復(fù)更徹底(見圖7、8);有的細(xì)菌附著在真菌孢子表面,有的細(xì)菌直接吸附在蛭石表面,或者蛭石的凹陷部位(見圖4、5、6);真菌繁茂的菌絲交錯于蛭石空隙間,有的菌絲附著在蛭石表面(見圖1、2、3、4),“蛭石-細(xì)菌-真菌”這種固定化混合菌顆粒就如一個“源”向周圍非流體介質(zhì)輸送能高效降解多環(huán)芳烴的微生物,發(fā)揮真菌與細(xì)菌協(xié)同降解作用,使受污染介質(zhì)得到
凈化。
[0020] 4.本發(fā)明所用載體材料價格便宜,成本低,來源廣泛,通氣性良好,無毒,不會造成土壤的二次污染。
附圖說明
[0021] 圖1為蛭石改性后固定化顆?!?50掃描電子顯微鏡照片;
[0022] 圖2為蛭石改性后固定化顆?!?000掃描電子顯微鏡照片;真菌較細(xì)菌大的多,很難在一個
視野里即看到真菌有看見細(xì)菌,所以圖1與圖2的固定化混合菌,主要看見的是真菌菌絲體與載體蛭石的關(guān)系;
[0023] 圖3為蛭石載體固定化顆粒×500掃描電子顯微鏡照片;
[0024] 圖4為蛭石載體固定化顆粒×200掃描電子顯微鏡照片;圖3與圖4是表示傳質(zhì)過程圖。真菌孢子囊里面的孢子散落到鄰近蛭石載體上,使得真菌在載體間傳遞,延伸,便于在非流體介質(zhì)中傳質(zhì);
[0025] 圖5為蛭石載體固定化混合菌×1500掃描電子顯微鏡照片;圖5表示真菌孢子與細(xì)菌關(guān)系,細(xì)菌吸附在孢子表面(右上
角);
[0026] 圖6為蛭石載體固定化混合菌×10000掃描電子顯微鏡照片;圖6表示真菌孢子吸附在蛭石表面,同時細(xì)菌也有吸附在蛭石表面;
[0027] 圖7為蛭石改性后固定化顆?!?000掃描電子顯微鏡照片;
[0028] 圖8為蛭石改性后固定化顆?!?0000掃描電子顯微鏡照片;圖8是圖7的局部放大圖。真菌菌絲體上面也吸附了細(xì)菌!細(xì)菌可以隨著真菌菌絲體的生長而不斷的移動,進(jìn)一步解決了非流體介質(zhì)中傳質(zhì)性的問題!
具體實(shí)施方式
[0029] 下面通過實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0031] (1)固定化混合菌斜面培養(yǎng)
[0032] 在裝有培養(yǎng)基(葡萄糖1.25%,牛肉膏0.25%,NH4NO3 0.1%,MgSO4·7H2O0.02%,KCl 0.02%,pH6.5)的試管中先后接種細(xì)菌和真菌,置于28~30℃
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
2~3d。
[0033] (2)固定化載體改性處理
[0034] 所述蛭石在作為載體以前需經(jīng)過改性處理,具體操作步驟為:將蛭石過2mm篩后,加1mol/L HCl,固液比1∶20,室溫靜泡24h,
自來水洗至pH值為自來水的pH值(約為6.8),然后60℃烘干,放干燥器中備用,便制得室溫酸改性蛭石。
[0035] (3)固定化載體浸潤培養(yǎng)
[0036] 將改性后的蛭石按1ml/g比例,用無菌水浸潤培養(yǎng)12~24h。
[0037] (4)固定化顆粒制備
[0038] 將處理后的載體中間打孔,高溫高壓蒸汽滅菌90min,待溫度降到20℃,從混合菌斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)混合菌,接入無菌載體有孔的中心部位,密封后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),每天按0.2ml/g載體的量補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基(蔗糖4.0%,酵母膏0.3%,KH2PO40.05%,(NH4)HPO4 0.2%,MgSO4·H2O 0.025%,pH6.0~6.5),3d后菌絲體穿透蛭石載體,布滿培養(yǎng)瓶,便制得以蛭石為載體的混合菌固定化顆粒。
[0039] 經(jīng)上述步驟制得的固定化混合菌顆粒周期短,單位體積細(xì)胞
密度大,細(xì)菌7 5
3.07×10 個/g,真菌9.25×10 個孢子/g。
[0040] (5)固定化混合菌對受多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)效果
[0041] 將制備好的固定化顆粒按2%投粒比,投入受多環(huán)芳烴污染的土壤中,60d后,土壤中PYR的去除率為87%;土壤中BaP的去除率為52%。在整個降解過程中,固定化顆粒的降解速度快,60d后固定化顆粒仍然具有90%以上的活性。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 與實(shí)施例1不同處在于:載體改性處理步驟為將2mm粒徑的蛭石,加0.5mol/L HCl,固液比1∶15,80℃恒溫水浴攪動2~2.5h,蒸餾水沖洗至pH為6.8,烘干后,制得加熱酸改性蛭石。
[0044] 經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度,7.21×108個/g,真菌孢6
子數(shù)為5.38×10 個/g。
[0045] 固定化顆粒按照2%投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤,修復(fù)60d,PYR的去除率為81%,BaP的去除率為59%。
[0046] 實(shí)施例3
[0047] 不同處在于:載體改性處理步驟為將2mm粒徑的蛭石,加1mol/L HCl,固液比1∶20,83℃恒溫水浴攪動2~2.5h,蒸餾水沖洗至pH為6.8,烘干后,制得加熱酸改性蛭石。
[0048] 經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度較大,1.59×109個/g,真7
菌孢子數(shù)為2.42×10 個/g。
[0049] 固定化顆粒按照2%投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤,修復(fù)60d,PYR的去除率為85%,BaP的去除率為59%。
[0050] 實(shí)施例4
[0051] 與實(shí)施例1不同處之一在于:混合菌培養(yǎng)基制備為在裝有培養(yǎng)基(馬鈴薯0.3%,蔗糖2%,牛肉膏0.2%,瓊脂2%,NaCl 0.5%,pH自然)的試管中先后接種細(xì)菌和真菌,置于28~30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d。
[0052] 與實(shí)施例1不同處之二在于:載體改性處理步驟為將2mm粒徑的蛭石,加1mol/L HCl,固液比1∶20,83℃恒溫水浴攪動2~2.5h,蒸餾水沖洗至pH為6.8,烘干后,便制得加熱酸改性蛭石(ST83),然后再焙燒至400℃(升溫速度為90℃/h),得到酸處理并焙燒至400℃的蛭石。
[0053] 經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度很大,6.17×1010個/g,8
真菌孢子數(shù)為4.38×10。
[0054] 固定化顆粒按照2%投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤,修復(fù)60d,PYR的去除率為89%,BaP的去除率為64%。
[0055] 實(shí)施例5
[0056] 與實(shí)施例4不同處在于:載體改性處理步驟為將2mm粒徑的蛭石,加1.5mol/L HCl,固液比1∶25,83℃恒溫水浴攪動2~2.5h,蒸餾水沖洗至pH為6.8,烘干后,便制得加熱酸改性蛭石(ST83),然后再焙燒至500℃(升溫速度為90℃/h),得到酸處理并焙燒至500℃的蛭石。
[0057] 經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度,1.48×1010個/g,真菌8
孢子數(shù)為2.52×10。
[0058] 固定化顆粒按照2%投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤,修復(fù)60d,PYR的去除率為86%,BaP的去除率為60%。
[0059] 實(shí)施例6
[0060] 與實(shí)施例4不同處之一在于:載體經(jīng)改性處理后無浸潤處理過程,而是直接將干燥后的
泥炭土滅菌,然后接種。
[0061] 不同處之二在于:接種后的固定化顆粒,在增殖培養(yǎng)過程中不補(bǔ)加增殖
營養(yǎng)液或無菌水。
[0062] 結(jié)果表明:固定化混合菌中真菌的孢子數(shù)無明顯變化,而單位載體細(xì)菌數(shù)受到很7
大影響,僅為10,較實(shí)施例3下降了3個數(shù)量級。
[0063] 實(shí)施例7
[0064] 與實(shí)施例4不同處之一在于:載體浸潤處理步驟為改性處理后的泥炭土(ST400)按1ml/g比例加增殖培養(yǎng)液(蔗糖4.0%,酵母膏0.3%,KH2PO40.05%,(NH4)HPO4 0.2%,MgSO4·H2O 0.025%,pH6.0~6.5)后,再高溫濕熱滅菌90min。
[0065] 與實(shí)施例4不同處之二在于:接種后,每天按0.2ml/g載體的量補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基(蔗糖4.0%,酵母膏0.3%,KH2PO4 0.05%,(NH4)HPO4 0.2%,MgSO4·H2O 0.025%,pH6.0~6.5),3d后菌絲體穿透蛭石載體,布滿培養(yǎng)瓶,便制得以蛭石為載體的混合菌固定化顆粒。
[0066] 結(jié)果表明:經(jīng)培養(yǎng)液浸潤的載體較經(jīng)無菌水或無浸潤的載體對細(xì)菌吸附能力更強(qiáng),細(xì)菌活力更持久,主要提高了固定化混合菌中細(xì)菌的數(shù)量,制得的固定化顆粒細(xì)菌密度11
可達(dá)3.24×10 個/g;固定化顆粒按照2%投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤,修復(fù)60d,PYR的去除率為96%,BaP的去除率為65%。