發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及
熒光顆粒在
生物分析上的應(yīng)用，特別是用于光學(xué)分子圖象的熒光探針。
背景技術(shù)
[0002] 已經(jīng)將染料摻入
二氧化
硅顆粒中(Ow，H.；Larson，D.R.；Srivastava，M.；Baird，B.A.；Webb，W.W.；Wiesner，U. ＂ Bright and Stable Core-ShellFluorescent Nanoparticles＂Nano Letters 2005，5，113-117/Verhaegh，N.A.M.；Blaaderen，A.v.＂Dispersions of Rhodamine-Labeled Silica Spheres：Synthesis，Characterization，and Fluorescence Confocal Scanning LaserMicroscopy＂Langmuir 1994，10，1427-1438./Imhof，A.；Megens，M.；Engelberts，J.J.；Lang，D.T.N.d.；Sprik，R.；Vos，W.L. ＂Spectroscopy ofFluorescein(FITC)Dyed Colloidal Silica Spheres＂J.Phys.Chem.B
1999，103，1408-1415.)。
[0003] 用IR染料承載的膠乳已知用于成像和攝影應(yīng)用(US2002/0113854、US6,706,460)。用非IR染料承載的膠乳已知用于生物和診斷應(yīng)用。
[0004] US2005/0244976涉及在具有熒光羰花青染料化合物的樣品中檢測(cè)陰離子蛋白的方法。該發(fā)明用于各種領(lǐng)域，包括免疫、診斷學(xué)、
蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)和熒光
基礎(chǔ)的分析。用熒光羰花青染料化合物檢測(cè)樣品中的陰離子蛋白。該發(fā)明還描述了通過(guò)羰花青染料化合物產(chǎn)生的不連續(xù)熒光
信號(hào)同時(shí)檢測(cè)樣品中的陰離子和非離子蛋白的方法。
[0005] US6,964,844總體上涉及新染料的合成和標(biāo)記以及對(duì)被被分析物進(jìn)行檢測(cè)或顯影的方法，更具體地說(shuō)涉及引入新
熒光染料的熒光膠乳顆粒及其應(yīng)用，在某些方面，熒光
能量轉(zhuǎn)移和分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移用于在免疫分析或在核酸分析中被分析物的檢測(cè)。這些染料是
水溶性混雜酞菁衍生物，用于競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。該發(fā)明公開(kāi)并要求了核酸和分析以下內(nèi)容：具有(1)帶有至少一種所期望激發(fā)峰的供體亞單元；和(2)帶有至少一種所期望發(fā)射峰的受體亞單元，其中所述衍生物能夠從所述供體亞單元向所述受體亞單元傳遞分子內(nèi)能量。這樣的衍生物還可以包含
電子轉(zhuǎn)移亞單元。軸配體可以與包含在
水溶性混雜酞菁衍生物中的金屬共價(jià)連接。配體、配體類似物、多肽、蛋白和核酸能夠連接至染料的軸配體以形成染料綴合物從而用于免疫分析和核酸分析。
[0006] US4,997,772涉及一種僅在核中含有可探測(cè)的示蹤物質(zhì)的核/殼
聚合物顆粒。它還涉及一種免疫反應(yīng)的
試劑以及該試劑在分析元素和方法上的應(yīng)用。水不溶性聚合的顆粒具有分布于第一聚合物的包含可探測(cè)的示蹤物質(zhì)的
內(nèi)核，為此該示蹤物質(zhì)具有高
親和性。此第一聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化
溫度(Tg1)小于約100攝氏度。該顆粒還具有包含第二聚合物的
外殼，為此該示蹤物質(zhì)與所述第一聚合物相比具有實(shí)質(zhì)上很小的親和性。第二聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg2)大于或等于[Tg1-10攝氏度]。其還含有與免疫活性物種的游離
氨基或巰基反應(yīng)或者可被與這些基團(tuán)的反應(yīng)激活的基團(tuán)。這種物種可以共價(jià)連接到該顆粒以形成免疫活性試劑，該試劑可用于分析的元素和不同的分析法，該方法包括免疫學(xué)的方法，例如凝集分析。
[0007] US2004/0038318涉及一種成套試劑和在試驗(yàn)樣品尤其是體液中實(shí)施同時(shí)分析多個(gè)同功酶的方法。該發(fā)明特別用于在顆粒或珠粒、基于多重化分析(based multiplexed assay)系統(tǒng)測(cè)量肌酸激酶同功酶。
[0008] US4,891,324涉及通過(guò)由包括配體和受體(例如具有顆粒的
抗原和
抗體)組成的特異性結(jié)合對(duì)成員的綴合物而確定被分析物來(lái)進(jìn)行測(cè)定的方法。該發(fā)明的方法對(duì)生物學(xué)
流體(例如血清或尿)的異相免疫分析具有特別的應(yīng)用。該方法通過(guò)使用包括具有顆粒的第一種特異性結(jié)合對(duì)成員的綴合物的組合物進(jìn)行實(shí)施。發(fā)光劑被該顆粒的非水相可逆地相關(guān)聯(lián)(associated)。在第一種特異性結(jié)合對(duì)成員不能與被分析物互補(bǔ)時(shí)，采用能結(jié)合至第一種特異性結(jié)合對(duì)成員的第二種特異性結(jié)合對(duì)成員。未結(jié)合的綴合物從結(jié)合至被分析物或結(jié)合至第二種特異性結(jié)合對(duì)成員的綴合物中分離。加入增強(qiáng)發(fā)光劑檢測(cè)能
力的試劑以測(cè)量受到該試劑作用的發(fā)光劑的光發(fā)射。
[0009] WO2006/016166涉及適于藥物材料的聚合材料。該發(fā)明公開(kāi)了一種含有
丙烯酸烷氧基乙基酯
單體、含有伯胺、仲胺、叔胺或季胺基團(tuán)的單體和含有酸基團(tuán)單體的聚合物。該聚合物組合物形成了優(yōu)選0.5至2.0um尺寸的
纖維，其不足以提供小于100nm尺寸的納米顆粒，該納米顆粒是膠態(tài)穩(wěn)定的且能夠承載用于診斷顯象的非水溶性熒光染料。
[0010] US5,326,692涉及將聚合物材料引入多種熒光染料以控制
斯托克斯位移的增強(qiáng)。特別是，該發(fā)明描述了將微粒引入兩種或多種一系列具有重疊激發(fā)和發(fā)射
光譜的熒光化合物，引起熒光微粒具有期望有效的斯托克斯位移。該新熒光微粒用于例如檢測(cè)和分析生物分子，例如DNA和RNA，其需要非常高的靈敏度以及在細(xì)胞計(jì)數(shù)的流量和顯微分析的技術(shù)。
該發(fā)明涉及將微粒引入兩種或多種一系列具有重疊激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料，使得從一系列第一染料的激發(fā)
波長(zhǎng)有效地能量轉(zhuǎn)移，通過(guò)一系列染料和在一系列最后的染料的發(fā)射波長(zhǎng)作為
光信號(hào)的重發(fā)射進(jìn)行轉(zhuǎn)移，引起期望有效的斯托克斯位移，其是經(jīng)過(guò)選擇合適的染料而進(jìn)行控制的。
[0011] 待解決的問(wèn)題
[0012] 用于生理學(xué)成像的IR-發(fā)射的納米顆粒聚集體(assemblies)遇到了很多問(wèn)題。第一，該染料通常高度聚集且因此是不可發(fā)射的。第二，用于染料-納米顆粒的聚集體熒光劑在水環(huán)境中通常無(wú)效。第三，在這種聚集體中使用的染料對(duì)光和氧氣不穩(wěn)定，且容易漂白，這造成了處理和管理困難。第四，這種管理通常是膠態(tài)不穩(wěn)定的且是細(xì)胞毒性的。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明涉及一種承載的膠乳顆粒，其含有由下式表示的混合物制成的膠乳材料：(X)m-(Y)n-(Z)o-(W)p，其中Y為至少一種具有至少兩個(gè)烯鍵式不飽和化學(xué)官能團(tuán)的單體；Z為至少一種具有平均分子量在300和10,000之間的聚乙二醇大分子單體；W為不同于X、Y或Z的烯基單體；且X為至少一種不溶于水的、含有烷氧基乙基的單體，m、n、o和p分別為每種單體的重量百分比。所述顆?？捎脽晒馊玖铣休d。
[0015] 本發(fā)明的有益效果
[0016] 本發(fā)明包括許多優(yōu)點(diǎn)，不是所有的這些優(yōu)點(diǎn)被引入于單一的實(shí)施方案中。
[0017] 本發(fā)明承載的膠乳綜合性質(zhì)提供了優(yōu)點(diǎn)，其使得它們很好地適用于特定的生物學(xué)應(yīng)用。另外，其還提供了增強(qiáng)的熒光效應(yīng)，它們是高度生物相容的，能夠抵抗血清蛋白的粘附，且在寬范圍的條件下仍保持良好的分散。
附圖說(shuō)明
[0018] 附圖1顯示了被兔蛋白斑點(diǎn)化的硝化
纖維素條紋的熒光圖像(白和黑)，所述兔蛋白用在
實(shí)施例38中描述的承載的膠乳-抗兔抗體檢測(cè)。
[0019] 附圖2顯示了尾部靜脈注射之后10分鐘時(shí)小鼠(瑞士裸鼠)的熒光圖像，所述小鼠用100ml在
磷酸鈉緩沖液中的1mg/ml LL1A承載的膠乳靜脈注射，其用720ex/790em
過(guò)濾器在柯達(dá)MM4000影像工作站中曝光1分鐘。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 本發(fā)明涉及非共價(jià)承載至重PEG化納米膠乳顆粒的疏水的紅外染料，當(dāng)優(yōu)選用于IR-活性聚集體時(shí)，其顯示高度有效的熒光、低染料聚集和高光
穩(wěn)定性，即不易受到漂白。這些聚集體還是非細(xì)胞毒性的且膠態(tài)非常穩(wěn)定的，即降低聚集的傾向。本發(fā)明顆粒表現(xiàn)出增加了熒光的量子產(chǎn)率。為了本發(fā)明的目的，納米膠乳是交聯(lián)聚合物，其尺寸小于100nm，含有甲基丙烯酸烷氧基乙基酯或丙烯酸烷氧基乙基酯單體，并且是重PEG化的。
[0022] 用于生理學(xué)成像的IR-發(fā)射的納米顆粒聚集體遇到了很多問(wèn)題。第一，該染料通常高聚集且因此是不可發(fā)射的。第二，用于染料-納米顆粒的聚集體熒光劑在水環(huán)境中通常無(wú)效。第三，在這種聚集體中使用的染料對(duì)光和氧氣不穩(wěn)定，且容易漂白，這造成了處理和管理困難。第四，這種聚集體通常是膠態(tài)不穩(wěn)定的且是細(xì)胞毒性的。
[0023] 為了本發(fā)明的目的：
[0024] “PEG化的”指的是含有至少5重量％共價(jià)連接的聚(乙二醇)的納米膠乳組合物?！癙EG化”通常指的是從活化的PEG和相應(yīng)的PEG-蛋白/肽開(kāi)始獲得PEG-蛋白/肽綴合物的反應(yīng)。該反應(yīng)還可以應(yīng)用于PEG-
治療劑、PEG-染料、PEG-生物配位體、PEG-(核
磁共振成像造影劑)、PEG-(X-射線造影劑)、PEG-抗體、PEG-(酶
抑制劑)、PEG-(
放射性同位素)、PEG-(
量子點(diǎn))、PEG-低聚糖、PEG-多聚糖、PEG-
激素、PEG-右旋糖酐、PEG-低聚核苷酸、PEG-
碳水化物、PEG-神經(jīng)傳遞介質(zhì)、PEG-半抗原、PEG-類胡蘿卜素。
[0025] “納米膠乳”指的是其具有小于100nm流水動(dòng)力直徑的疏水聚合物顆粒。
[0026] “水分散的交聯(lián)聚合顆粒”指的其為連續(xù)、交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)的聚合顆粒，通過(guò)此網(wǎng)絡(luò)穿越鍵(through-bond)的途徑其可在顆粒中的任何兩個(gè)
原子間被示蹤(不包括反離子)。該顆粒能夠以分區(qū)狀態(tài)存在于水中，從而使得每一單獨(dú)的顆粒網(wǎng)絡(luò)通過(guò)水連續(xù)相與每個(gè)其它顆粒分離。
[0027] “疏水性交聯(lián)聚合物”指的是含有至少45重量％水不溶性單體的聚合物。該聚合物是連續(xù)的網(wǎng)狀，通過(guò)此網(wǎng)絡(luò)穿越鍵的途徑其可在任何兩個(gè)原子間被示蹤(不包括反離子)。
[0028] “生物相容的”指的是組合物不能擾亂其侵入的生物系統(tǒng)的正常功能。生物相容的組合物通常要與血液相容，并且不另外在體內(nèi)引起不利的反應(yīng)。例如，為了生物相容，該材料必須不能有毒、產(chǎn)生免疫性或者形成血栓。
[0029] “膠態(tài)穩(wěn)定”指的是顆粒能夠存在于
磷酸鹽緩沖的鹽水(在pH7.4下，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)的狀態(tài)，在這種狀態(tài)下每一個(gè)單獨(dú)的顆粒通過(guò)沒(méi)有形成聚集物的水連續(xù)相與每個(gè)其它顆粒分離(含有多個(gè)緊密
接觸獨(dú)立顆粒的實(shí)體)或者沒(méi)有大量絮凝發(fā)生。
[0030] “承載”或“植入”指的是在染料和聚合顆粒之間非共價(jià)連接，以使得當(dāng)膠乳以小于系統(tǒng)中染料總量10％，小于1％的濃度分散于水中時(shí)，其可以被萃取至水連續(xù)相之中。
[0031] 本發(fā)明的膠乳含有重復(fù)交聯(lián)的烯鍵式不飽和單體。該膠乳可以具有5和100nm，優(yōu)選8至50nm的體積平均
水動(dòng)力學(xué)直徑，其在磷酸鹽緩沖鹽水中(pH7.4下，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4)通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射測(cè)定。
[0032] 本發(fā)明的一種承載的膠乳顆粒含有如由下式表示的混合物制成的膠乳材料：
[0033] (X)m-(Y)n-(Z)o-(W)p
[0034] 式1
[0035] 其中X為至少一種水不溶性含有烷氧乙基的單體，Y為至少一種具有至少兩個(gè)烯鍵式不飽和化學(xué)官能團(tuán)的單體；Z為至少一種具有平均分子量在300和10,000之間的聚乙二醇大分子單體；W為不同于X、Y或Z的烯基單體。m、n、o和p分別為每種單體的重量百分比，其中m為介于40-90重量％，優(yōu)選45-60重量％的范圍，n為介于1-10重量％，優(yōu)選2-6重量％的范圍，o為介于20-60重量％，優(yōu)選40-50重量％的范圍，且p至多達(dá)10重量％。
[0036] 在式1中，X為下面式2描述的水不溶性含有烷氧乙基的單體。在式2中，R1是甲基或氫。R2是含有至多達(dá)10個(gè)碳原子的烷基或芳基。優(yōu)選的X是甲基丙烯酸甲氧基乙基酯或丙烯酸烷氧基乙基酯。
[0037]
[0038] 式2
[0039] 在式1中，Y為水不溶性或水溶性的含有至少兩個(gè)烯鍵式不飽和化學(xué)官能團(tuán)的單體。這些官能團(tuán)可以是乙烯基基團(tuán)、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烯丙基、乙烯基醚和乙烯基酯。Y單體包括但不必然限于芳族的二乙烯基化合物，例如二乙烯基苯、二乙烯基
萘或其衍生物；二亞乙基
羧酸酯和酰胺，例如二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸二乙二醇酯、二丙烯酸1，4-丁二醇酯、二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯、二丙烯酸1，3-丁二醇酯、二甲基丙烯酸1，3-丁二醇酯、二丙烯酸環(huán)己烷二甲醇酯、二甲基丙烯酸環(huán)己烷二甲醇酯、二丙烯酸二乙二醇酯、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、二丙烯酸二丙二醇酯、二甲基丙烯酸二丙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸1，6-己二醇酯、二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯、二丙烯酸新戊二醇酯、二甲基丙烯酸新戊二醇酯、二丙烯酸四甘醇酯、二甲基丙烯酸四甘醇酯、二丙烯酸三甘醇酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯、二丙烯酸三丙二醇酯、二甲基丙烯酸三丙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、三丙烯酸三羥甲基丙烷酯、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯、五丙烯酸二季戊四醇酯、四丙烯酸二三羥甲基丙烷酯和四丙烯酸季戊四醇酯；二乙烯基酯，例如
己二酸二乙烯基酯；其他二乙烯基化合物，例如乙烯硫醚或二乙烯基砜化合物的甲基丙烯酸烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、環(huán)己烷二甲醇二乙烯基醚二烯丙基鄰苯二
甲酸酯、
馬來(lái)酸二烯丙酯；二烯
烴諸如丁二烯、異戊二烯和其混合物。
[0040] W單體基本上包括為以某種方式改進(jìn)性質(zhì)而加入的任何其他惰性單體。W是非化學(xué)性質(zhì)上的
反應(yīng)性單體，其可以以少量加入以賦予膠乳以期望的性質(zhì)，例如水分散性、荷電性、更溫和的染料載入或者使得膠乳更疏水。W單體為水溶性單體，例如丙烯酸2-磷酸乙基酯
鉀鹽、甲基丙烯酸3-磷酸丙基酯銨鹽、乙烯基膦酸和其鹽、乙烯基咔唑、乙烯咪唑、乙烯基吡咯烷
酮、乙烯吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、馬來(lái)酸和其鹽、丙烯酸磺丙基酯和甲基丙烯酸磺丙基酯、丙烯酸和其鹽、甲基丙烯酸和其鹽、N-乙烯基吡咯烷酮，烷基膦酸酯、苯乙烯、丙烯酸和含胺類或銨基官能團(tuán)的甲基丙酸烯單體的丙烯酸酯；烷基膦酸酯、苯乙烯、丙烯酸和含胺類或銨基官能團(tuán)的甲基丙酸烯單體的甲基丙烯酸酯；苯乙烯磺酸和其鹽、
烷基磺酸的丙烯酸和甲基丙烯酸酯、乙烯磺酸和其鹽；乙烯吡啶、丙烯酸羥乙基酯、丙烯酸甘油酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺和N-乙烯基吡咯烷酮。W可以由水不溶性單體替換，例如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸異丁基酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸芐基酯、甲基丙烯酸環(huán)己酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯酸/丙烯酸酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸芐基酯、丙烯酸苯氧基乙基酯、丙烯酸環(huán)己基酯和丙烯酸縮水甘油酯，苯乙烯類，例如苯乙烯、a-甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、3-和4-氯甲基苯乙烯、鹵素取代的苯乙烯和烷基取代的苯乙烯，鹵乙烯、亞乙烯基鹵化物(vinylidene halides)、N-烷基化的丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺；乙烯基酯，例如
醋酸乙烯酯和
苯甲酸乙烯酯；和烯丙醇及其醚類和酯；和不飽合酮類和
醛類，例如丙烯醛和甲基乙烯酮、異戊二烯、丁二烯和丙烯腈。
[0041] Z單體為具有在300和10,000之間分子量的聚乙二醇大分子單體，優(yōu)選500至5000。優(yōu)選地，該連接聚合物為在每個(gè)末端具有特定功能端基的聚乙二醇主鏈，這樣所述聚乙二醇通過(guò)所述兩個(gè)功能端基在兩種物質(zhì)之間起到連接基的作用。
[0042] 該聚乙二醇大分子單體含有在一個(gè)末端含有可自由基聚合的基團(tuán)。該基團(tuán)可以但是不必然限于甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰基酰胺、苯乙烯、烯丙基、乙烯基、馬來(lái)酰亞胺和馬來(lái)酸酯。優(yōu)選地，該聚乙二醇大分子單體在其他末端另外含有反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)，其可以作為其它化合單元的連接點(diǎn)，例如猝滅劑或抗體。這些反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)可以當(dāng)不限于醇、硫醇、羧酸類、伯胺或仲胺、乙烯基磺?；?、醛、環(huán)氧化物、酰肼、琥珀酰亞胺酯、馬來(lái)酰亞胺、a-鹵代羰基部分(例如碘代乙?；?、異氰酸酯、異硫氰酸酯和氮雜環(huán)丙烷。優(yōu)選地，這些官能團(tuán)可以是羧酸、伯胺、馬來(lái)酰亞胺、乙烯基磺酰基或仲胺。
[0043] 可用式3描述一端具有反應(yīng)性聚合基團(tuán)的一類聚乙二醇大分子單體。
[0044]
[0045] 式3
[0046] 在式3中，R1是氫或甲基，q為10-200，r為O-10，且RG是氫或反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)，其可以是醇、硫醇、羧酸、伯胺或仲胺、乙烯基磺?；?、醛、環(huán)氧化物、酰肼、琥珀酰亞胺酯、馬來(lái)酰亞胺、取代或未取代的醋酸酯或者取代的氨基甲?；⑷〈?a href='/zhuanli/list-13837-1.html' target='_blank'>硫酸酯、取代或未取代的a-鹵代羰基部分(例如碘代乙酰基)、異氰酸酯、異硫氰酸酯和氮雜環(huán)丙烷。
[0047] 通常以兩種方式利用該連接的聚合物。第一種，單連接的聚合物可以用于與一個(gè)其它有關(guān)的功能性化合物相連，從而生產(chǎn)具有兩個(gè)不同期望功能的單一化合物。多連接聚合物還可以在一個(gè)末端與單獨(dú)大顆?；蛑榱Ｏ噙B和在另一端與其它想要的化合物相連，從而生產(chǎn)大量有效荷載想要的功能性化合物的單一載體顆粒。
[0048] 連接聚合物可以以?；屯榛绞绞褂茫⑶夷軌蚺c含水和
有機(jī)溶劑體系相配伍，因此在與有用的基團(tuán)反應(yīng)中更有靈活性，并且期望的產(chǎn)品在水環(huán)境例如生理學(xué)的環(huán)境下更加穩(wěn)定。連接聚合物至少具有兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，一個(gè)是用于形成納米凝膠和膠乳的丙烯酸酯，且通過(guò)邁克爾加成與硫醇反應(yīng)，另外的反應(yīng)性基團(tuán)用于與對(duì)比物、染料、蛋白、氨基酸、多肽、抗體、生物配位體、治療劑和酶抑制劑綴合。該連接聚合物可以是支鏈的或者非支鏈的。優(yōu)選地，為了終產(chǎn)品制劑的治療應(yīng)用，連接聚合物將是藥學(xué)上可接受的。
[0049] 在式3中的RG是氫或反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)。反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)使得承載的膠乳共價(jià)連接至生物分子，且該生物分子的
位置能夠由熒光顯像確定。該共價(jià)連接提供了一個(gè)對(duì)以下穩(wěn)定的連接：處理、改變?nèi)軇?、pH和離子強(qiáng)度以及溫度。在承載的膠乳顆粒和生物分子之間的穩(wěn)定相關(guān)聯(lián)對(duì)于確認(rèn)熒光信號(hào)是非常重要的，被檢測(cè)的熒光信號(hào)與生物分子的存在有關(guān)。如果承載的膠乳不是共價(jià)連接的并不能通過(guò)離子吸引或范德華力與生物分子相相關(guān)聯(lián)，那么該染料將被孤立，且期望的生物分子信號(hào)將降低，錯(cuò)誤信號(hào)可以自分離的承載的膠乳獲得，從而使熒光圖像不能顯示生物分子的位置。該反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(RG)將使得在
有機(jī)溶劑(例如N，N-二甲基酰胺、二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮)和非有機(jī)溶劑(例如水)中發(fā)生共價(jià)連接。
[0050] 反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(RG)允許使用連接子(linker)，該連接子被設(shè)計(jì)為在承載的膠乳上的反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(RG)與在生物分子上的連接基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，其中生物分子為例如胺類、醇、源自氨基酸的羧酸、源自氨基酸的硫醇、肽、蛋白、細(xì)胞、RNA、DNA或其它已加入到生物分子中的連接子，以顧及在連接生物分子至其它材料的方法中和更大靈活性。這樣的連接子包括但不限于雜-雙官能或高-雙官能連接子，例如雙硫代琥珀酰辛二酸酯、3-[2-(氨乙基)二硫代]丙酸、p-疊氮苯甲?；ｋ?、雙馬來(lái)酰亞胺基己烷、N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨ァ-硫代琥珀酰亞胺-4-疊氮苯基-1，3’-二硫代丙酸酯、琥珀酰亞胺4-[對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基]丁酸酯、N-琥珀酰亞胺[4-碘代乙?；鵠氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亞胺-[全氟代疊氮苯甲酰氨基]乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、琥珀酰亞胺3-[溴乙酰胺基]丙酸酯、硫代琥珀酰亞胺2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙?；ｋ?；N-e-馬來(lái)酰亞胺基己酰氧基]琥珀酰亞胺酯、N-[4-(對(duì)疊氮水楊酰氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶二硫代)丙酰胺、琥珀酰亞胺4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯、4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸酰肼
鹽酸鹽、辛二酸二琥珀酰亞胺酯、Lomant試劑、硫代琥珀酰亞胺[2-6-(生物素氨基)-2-(p-疊氮苯甲酰氨基)-己基氨基]-乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、[β]-[三(羥甲基)膦基]丙酸(甜菜
堿)、(硫代琥珀酰亞胺[對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基]丁酸鹽)、雙馬來(lái)酰亞胺乙烷、雙[b-(4-疊氮水楊?；被?乙基]二硫化物、琥珀酰亞胺4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧基[6-氨基己酸酯]、N-[對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基]異氰酸酯、間-馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯、硫代琥珀酰亞胺4-N-馬來(lái)酰亞胺甲基環(huán)己烷-1-羧酸酯、二[硫代琥珀酰亞胺]辛二酸酯、N-[g-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亞胺酯、N-琥珀酰亞胺4-戊酸酯(pentynoate)和N-琥珀酰亞胺4-疊氮丁酸酯。
[0051] 該反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)還可用作螯
合金屬的金屬螯合基連接點(diǎn)，連接點(diǎn)，其中所述金屬為例如放射性同位素(用于PET成像)和釓(用于MRI成像)。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬螯合基為S-2-(4-異硫氰酸酯芐基)1，4，7，10-四氮雜十二烷-四乙酸或2-(4-異硫氰酸酯芐基)二乙三胺五乙酸。該金屬螯合基團(tuán)可以結(jié)合至放射性同位素或重金屬。
[0052] 通過(guò)適當(dāng)使用反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(RG)，該承載的膠乳可以共價(jià)連接至任何藥物或生物分子，以此方式優(yōu)化熒光信號(hào)且干擾生物分子的正常功能。羧酸連接基團(tuán)可以轉(zhuǎn)化為活性酯而形成共價(jià)鍵。N-羥基琥珀酰亞胺酯是活化羧酸基團(tuán)的優(yōu)選方法。羧酸連接基團(tuán)還可以因形成與碳化二亞胺試劑(例如二環(huán)己基碳化二亞胺)的共價(jià)鍵而被活化。羥基連接基團(tuán)可以通過(guò)形成氯甲酸酯(例如對(duì)-硝基苯基氯甲酸酯)共價(jià)鍵而被活化。胺連接基團(tuán)可以通過(guò)使用碳化二亞胺活化劑與生物分子的羧酸官能團(tuán)反應(yīng)而形成的共價(jià)鍵而被活化，或者形成異氰酸酯(酯)或異硫氰酸酯(酯)或使用上述列舉的胺反應(yīng)性連接基團(tuán)。該馬來(lái)酰亞胺連接基團(tuán)能夠與硫醇基團(tuán)反應(yīng)，其中硫醇基團(tuán)通常由生物分子的半胱氨酸殘基或上述列舉的硫醇連接基團(tuán)獲得?？梢灾苯邮褂卯惽杷狨?酯)或異硫氰酸酯(酯)與生物分子的胺基團(tuán)反應(yīng)。該三烷氧基甲硅烷可以用于與其它三烷氧基甲硅烷或硅氧化物改性的分子或顆粒反應(yīng)。炔烴和疊氮酰基(azidoyl)可以用于形成通常用
銅(I)催化的穩(wěn)定三唑連接，這樣如果染料含有炔基，那么疊氮?；B接基團(tuán)就被置于生物分子上或反過(guò)來(lái)，其中疊氮?；B接基團(tuán)是在染料上的連接基團(tuán)，且炔基基團(tuán)加成至生物分子上。
[0053] 在這里使用的一種特別優(yōu)選的水溶性連接聚合物是式4的聚乙二醇衍生物。該聚乙二醇(PEG)是親水、生物相容且無(wú)毒的通式H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中n>4。
[0054] 式4
[0055]
[0056] 其中X＝CH3或H，Y＝O、NR或S，L是連接基或間隔基，F(xiàn)G為官能團(tuán)，n為大于4并小于1000。更優(yōu)選地，X＝CH3，Y＝O，L是烷基或芳基，并且FG為NH2或COOH，以及n在6至500之間或在10和200之間。更優(yōu)選地，n＝16。
[0057] 可以通過(guò)連接至生物學(xué)上重要的材料、染料和用于檢測(cè)的顯影劑和
疾病和代謝活性研究的顯影劑、治療疾病的治療劑、用于增稠的物質(zhì)、藥物和
化妝品而使用該連接聚合物。優(yōu)選的用于連接連接聚合物的生物學(xué)重要材料包括當(dāng)連接時(shí)可以極大改善效果的靶向劑、
診斷劑和治療劑。
[0058] 靶向劑是具有有用的基團(tuán)的化合物，其可以辨別并與特殊位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，例如疾病位點(diǎn)，為了更多的效果該顆?；蚓Y合材料在這一位點(diǎn)被濃縮。此外特別感興趣的是PEG-抗體。抗體，還被稱為免疫球蛋白(Igs)是有助于分辨免疫系統(tǒng)外來(lái)物質(zhì)例如細(xì)菌或病毒或任何帶有抗原物質(zhì)的蛋白，并且抗體有益于分辨并與特殊的生物靶點(diǎn)相相關(guān)聯(lián)。生物配位體是與在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞上或與酶表達(dá)的受體位點(diǎn)相相關(guān)聯(lián)的有用基團(tuán)。生物配位體的實(shí)例是生長(zhǎng)因子例如生物素和葉酸、特種蛋白和氨基酸肽序列或具有對(duì)酶活性位點(diǎn)強(qiáng)結(jié)合能力的分子或者有助于物質(zhì)滲透或在想要的細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)的濃縮的分子。
[0059] 診斷劑是當(dāng)用光、聲、磁、電子和放射性能量源掃描物質(zhì)而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。實(shí)例是染料，例如UV、可見(jiàn)或紅外吸收的染料，尤其是熒光染料，例如吲哚羰花青和熒光素，MR顯影劑例如釓和
鐵離子復(fù)合物，以及X-射線顯影劑例如聚碘代
芳香族化合物。承載的膠乳顆?？梢杂抿匣鶊F(tuán)官能化，螯合基團(tuán)例如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或1，4，7，
10-四-氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。這些螯合基團(tuán)可以螯合金屬例如釓，用于磁共振和X-射線成像。四-和五-乙酸螯合基團(tuán)使得承載的膠乳能用放射性同位素標(biāo)記，用于放射性閃爍顯像、單一的
光子發(fā)射和正發(fā)射層析
X射線攝影法。
[0060] 該被標(biāo)記的組分可以在包括其它物質(zhì)的組合物中。在其中發(fā)生標(biāo)記反應(yīng)的混合物可以是液體混合物，特別是水混合物。該檢測(cè)步驟可以與混合物在液體或干的條件下(例如
顯微鏡載物片)發(fā)生。
[0061] “標(biāo)記”指的是承載的膠乳或承載的膠乳綴合物與一種物質(zhì)相連以助于該物質(zhì)的識(shí)別。優(yōu)選地，該物質(zhì)通過(guò)光學(xué)檢測(cè)方法識(shí)別。
[0062] “生物相容的”指的是組合物不能擾亂其侵入的生物系統(tǒng)的正常功能。生物相容的組合物通常要與血液相容，并且不另外在體內(nèi)引起不利的反應(yīng)。例如，為了生物相容，該材料必須不能有毒、產(chǎn)生免疫性或者形成血栓。
[0063] “
生物降解的”指的是該物質(zhì)能夠在生理學(xué)條件下在酶或
水解下降解為更小的可以通過(guò)正常途徑排出體外的分子。
[0064] 術(shù)語(yǔ)“診斷劑”包括能夠發(fā)揮顯影劑的組分，且從而產(chǎn)生在宿主或試驗(yàn)樣本中可檢測(cè)的指示信號(hào)。該可檢測(cè)的指示信號(hào)可以是γ-發(fā)射的、放射性的、發(fā)生回波的、熒光的或生理學(xué)的信號(hào)等等。
[0065] 在此處使用的術(shù)語(yǔ)“生物醫(yī)用試劑”包括在治療生理學(xué)疾病上有效的生物學(xué)活性物質(zhì)、藥物、酶、激素、甾族化合物、重組體產(chǎn)品等等。治療劑的示例是抗生素、血栓溶解酶(例如尿激酶或鏈激酶)、胰島素、生長(zhǎng)激素、化療劑例如阿霉素和抗病毒劑例如干擾素和阿昔洛韋。
[0066] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，承載的膠乳與選擇性標(biāo)記靶向劑且任選檢測(cè)的物質(zhì)相關(guān)聯(lián)。例如核酸檢測(cè)通常包括用核酸探針探查被認(rèn)為含有靶核酸的樣本，該探針含有核酸序列，其特異性識(shí)別靶核酸序列，從而使核酸探針和靶核酸的結(jié)合產(chǎn)生雜交對(duì)。該核酸探針通常含有大于4堿基至好幾萬(wàn)的堿基，即探查全部
染色體可以包括數(shù)百萬(wàn)的堿基。任意下述染料綴合物可以用于標(biāo)記相應(yīng)的靶向物質(zhì)。
[0067] 承載的膠乳連接的組分或綴合物還稱之為標(biāo)記的組分，其可以是抗體、蛋白、肽、酶底物、激素、淋巴細(xì)胞活素、代謝產(chǎn)物、受體、抗原、半抗原、外源凝集素、毒素、碳水化物、糖、低聚糖、多糖、核酸、脫氧核酸、衍生的核酸、衍生的脫氧核酸、DNA
片段、核糖核酸片段、衍生的DNA片段、衍生的核糖核酸片段、天然藥物、病毒顆粒、細(xì)菌顆粒、病毒組分、
酵母組分、血細(xì)胞、血細(xì)胞組分、生物細(xì)胞、非細(xì)胞的血液組分、細(xì)菌、細(xì)菌組分、自然的和合成脂囊泡、合成藥物、毒藥、環(huán)境污染物、聚合物、聚合物顆粒、玻璃顆粒、玻璃表面、塑料顆粒和塑料表面。
[0068] 各種承載的膠乳綴合物可以用本發(fā)明的承載的膠乳制備，包括抗體、甾類、維生素、藥物、半抗原、代謝產(chǎn)物、毒素、環(huán)境污染物、氨基酸、肽、蛋白、核酸、核酸聚合物、碳水化物、脂類和聚合物的綴合物。在另外的實(shí)施方案中，綴合物是氨基酸、肽、蛋白、多糖、核苷酸、低聚核苷酸、核酸、半抗原、藥、脂類、磷脂、脂蛋白、脂多糖、脂質(zhì)體、親油性聚合物、聚合物、聚合的微粒、生物細(xì)胞或病毒。在本發(fā)明的一個(gè)方面，綴合物用本發(fā)明的多種承載的膠乳標(biāo)記，該承載的膠乳可以相同或不同。
[0069] 承載的膠乳用作用于探針的標(biāo)記和用于免疫分析，且還用作用于體內(nèi)顯像和體內(nèi)
腫瘤治療的標(biāo)記。當(dāng)這樣使用，可以把這些標(biāo)記的膠乳連接到特定連接對(duì)的一個(gè)成員(“標(biāo)記的結(jié)合伙伴(binding partner)”)或這樣一個(gè)成員的類似物以形成承載的膠乳綴合物。
[0070] 這些承載的膠乳可用作用于體內(nèi)的
顯像劑。當(dāng)用于顯像劑時(shí)，這些承載的膠乳與特定連接對(duì)的一個(gè)成員綴合，以得到標(biāo)記的綴合物/結(jié)合互補(bǔ)物(binding complement)?？蓪⒊休d的膠乳綴合物引入至動(dòng)物。如果特定連接對(duì)的其它成員存在，該承載的膠乳綴合物將結(jié)合至那里，并且可測(cè)定通過(guò)染料產(chǎn)生的信號(hào)和對(duì)其進(jìn)行
定位鑒別。
[0071] 這些承載的膠乳還可以用于體內(nèi)腫瘤治療。例如包括使用另外的染料組分連接至作為
光敏劑的納米粒表面的光動(dòng)力學(xué)療法。具有光敏化劑的承載的膠乳進(jìn)一步與結(jié)合伙伴綴合，該結(jié)合伙伴對(duì)可以特異性識(shí)別且連接至腫瘤細(xì)胞部分。定位的三聯(lián)體在通過(guò)光的激發(fā)后從連接的染料-承載的膠乳綴合物發(fā)射，引發(fā)化學(xué)反應(yīng)和選擇性傷害和/或破壞腫瘤細(xì)胞。
[0072] 靶被分析物
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方案體中，采用一種承載的膠乳或承載的膠乳綴合物來(lái)探查樣品溶液中存在或不存在靶被分析物。此處，“靶被分析物”或“被分析物”或其語(yǔ)法上的等同物指的是探測(cè)或評(píng)價(jià)結(jié)合伙伴(bindingpartners)的任何原子、分子、離子、分子離子、化合物或顆粒。如本領(lǐng)域所希望的那樣，在本發(fā)明中可以使用大量的被分析物；基本上，可使用任何結(jié)合的生物活性劑或結(jié)合伙伴所尋找的靶被分析物(例如備選藥物)。
[0074] 靶向材料可任選為以分子或分子的基團(tuán)形式存在的生物的或合成的原料，包括但不限于抗體、氨基酸、蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、激素、淋巴因子、
代謝物、抗原、半抗原、血凝素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、毒素、毒藥、環(huán)境污染物、碳水化合物、低聚糖、多糖、糖蛋白、糖脂類、核苷、寡核苷酸、核酸、核酸衍生物(包括脫氧核酸或核糖核酸)、DNA或RNA的片段和其衍生物(包括單股或多股片段)、天然和合成藥物、受體、病毒顆粒、細(xì)菌顆粒、病毒組分、生物細(xì)胞、孢子、細(xì)胞組分(包括細(xì)胞膜和細(xì)胞器)、天然或合成的脂囊泡、聚合物膜、聚合物表面和顆粒以及玻璃和塑料表面和顆粒。靶被分析物通常以獲自生物或環(huán)境體系的樣品的組分或雜質(zhì)形式存在。特別優(yōu)選的被分析物為核酸和蛋白。
[0075] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，綴合物為生物活性物質(zhì)。靶向材料也任選為生物活性物質(zhì)。生物活性物質(zhì)是與衍生自生物體系的分子反應(yīng)或結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)論這類分子是天然形成的或由體系的某種外部干擾而形成(例如，疾病、中毒、基因操縱)。通過(guò)舉例說(shuō)明，生物活性物質(zhì)包括生物分子(例如生物源分子，包括但不限于聚合的生物分子，例如肽、蛋白、多糖、寡核苷酸、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、DNA和RNA，也包括非聚合生物分子，例如生物素、洋地黃毒苷和重均分子量通常低于1000的其它的半抗原)，顯
微生物體，例如病毒和細(xì)菌，以及合成半抗原(例如激素、維生素或藥物)。典型的靶補(bǔ)體或靶向材料或這兩者為氨基酸、肽(包括多肽)，或蛋白(MW高于多肽)；或者是核苷、寡核苷酸(少于20堿基)，或核酸(例如分子量大于寡核苷酸的聚合物，包括RNA和單股或多股DNA和其片段和其片段衍生物)；或者是糖類或糖類衍生物，包括單糖、多糖、寡糖、糖脂類和糖蛋白；或者是半抗原(除了與一個(gè)更大載體分子綴合而不能引起免疫學(xué)反應(yīng)的一種化合物)，半抗原任選與其它生物分子綴合；或顯微有
機(jī)體，或顯微有機(jī)體的組分。對(duì)于這類生物活性物質(zhì)，可以用多種已知的方法來(lái)選擇有用的與靶向材料的相應(yīng)綴合互補(bǔ)物的對(duì)。
[0076] 當(dāng)多于一種材料同時(shí)被靶向時(shí)，任選包括多種為靶互補(bǔ)物的綴合物(每種用于相應(yīng)的靶向材料)。選擇的靶互補(bǔ)物具有需要的特異性或?qū)λ邢虿牧系倪x擇性。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，靶被分析物是蛋白。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所覺(jué)察到的那樣，對(duì)結(jié)合伙伴而言，使用本發(fā)明，可檢測(cè)或評(píng)估綴合物的大量蛋白靶被分析物。適合的蛋白靶被分析物包括但不限于，(1)免疫球蛋白；(2)酶(和其它蛋白)；(3)激素和細(xì)胞活素類(其中許多都作為用于細(xì)胞受體的配體)；和(4)其它蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶被分析物為核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針用于基因診斷中。例如，用此處公開(kāi)的技術(shù)制備探針以檢測(cè)靶序列，所述靶序列例如為用于非息肉病性克隆癌癥的基因、BRCA1乳癌基因、一種與各種癌癥相關(guān)的基因P53、能增加患阿爾茨海默病的
風(fēng)險(xiǎn)的Apo E4基因，容易用于病人癥狀發(fā)生前的篩選、囊腫性纖維化基因的突變或任何其他在該領(lǐng)域中所熟知的基因。
[0078] 在另一實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的復(fù)合物進(jìn)行毒菌和細(xì)菌檢測(cè)。在這一實(shí)施方案中，探針被設(shè)計(jì)為從各種細(xì)菌和病毒中檢測(cè)靶序列。例如，當(dāng)前的血液篩檢技術(shù)依靠于抗HIV抗體的檢測(cè)。此處公開(kāi)的方法可以直接篩檢臨床樣品以檢測(cè)HIV核酸序列，特別是高度轉(zhuǎn)化的HIV序列。此外，其允許直接監(jiān)測(cè)病人體內(nèi)的循環(huán)病毒，這是一種改進(jìn)的評(píng)估抗毒素治療劑功效的方法。類似地，與白血病、HTLV-I和HTLV-II有關(guān)的病毒也可用這種方法檢測(cè)。也可以檢測(cè)細(xì)菌感染，例如
肺結(jié)核、衣原體病和其他性傳播疾病。
[0079] 在另一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的核酸可用作篩檢水或食物樣品中毒性細(xì)菌的探針。例如，樣品可經(jīng)過(guò)細(xì)菌細(xì)胞溶解處理以釋放其中的核酸，然后所設(shè)計(jì)探針用來(lái)識(shí)別菌株，包括但不限于病原株，例如沙
門(mén)氏菌、彎曲桿菌、弧菌霍亂菌、利什曼原蟲(chóng)，E大腸菌腸毒素株和美國(guó)退伍軍人疾病細(xì)菌。
[0080] RME
[0081] 所描述的組合物可進(jìn)一步含有包括識(shí)別特定靶細(xì)胞的靶向部分的生物學(xué)的、藥學(xué)的或診斷的組分。通過(guò)與承載的膠乳相關(guān)聯(lián)的靶向部分識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞表面受體是所述組合物的一個(gè)特征。該特征對(duì)于理解細(xì)胞表面結(jié)合作用經(jīng)常是細(xì)胞流的初始階段，會(huì)導(dǎo)致一定范圍的觸發(fā)事件，特別是通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用是非常有利的。術(shù)語(yǔ)“受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用”(“RME”)通常形容一種機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制分布在細(xì)胞表面上的受體通過(guò)結(jié)合配體而被催化，結(jié)合受體的配體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。許多蛋白和經(jīng)由受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的其它結(jié)構(gòu)，包括胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、甲狀腺激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、降血
鈣素、胰高血糖素和許多其他結(jié)構(gòu)。
[0082] 受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用(以下稱為“RME”)提供了一種將染料綴合物，其可能與其他生物學(xué)的、藥學(xué)的或診斷的組分相組合傳輸至細(xì)胞內(nèi)部的便捷機(jī)制。
[0083] 在RME中，通過(guò)分布在細(xì)胞表面上的受體結(jié)合配體可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，其中包括細(xì)胞內(nèi)吞作用的響應(yīng)。因此，與靶向部分相關(guān)聯(lián)的承載的膠乳形成的承載的膠乳綴合物可以在細(xì)胞表面上結(jié)合并且隨后內(nèi)陷和陷入細(xì)胞內(nèi)部。在本發(fā)明組合物中，代表性的、可用作靶向劑的結(jié)構(gòu)部分為例如，但不限于，選自：蛋白、肽、aptomers、有機(jī)小分子、毒素、diptheria毒素、假單胞菌毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素、拌刀豆球蛋白A、勞斯(氏)肉瘤病毒、塞姆利基森林病毒、水泡性口膜炎病毒、腺病毒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低
密度脂蛋白、鈷胺素傳遞蛋白、蛋黃蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、降血鈣素、胰高血糖素、促泌乳激素、促黃體激素、甲狀腺激素、血小板源生長(zhǎng)因子、干擾素、兒茶酚胺、肽、糖脂類、糖蛋白和多糖的組。也可用所述結(jié)構(gòu)部分的同源體或片段。這些靶向部分可以與承載的膠乳相關(guān)聯(lián)用作指引承載的膠乳綴合物到靶細(xì)胞，并隨后陷入細(xì)胞。這里并不需要所有的部分都被用作靶向部分。已知的能與特定受體或其他結(jié)構(gòu)反應(yīng)的這些部分中較小的片段也可作為靶向部分。
[0084] 抗體或抗體片段代表一類普遍使用的靶向部分，這類靶向部分可用于增強(qiáng)承載的膠乳或承載的膠乳綴合物向細(xì)胞內(nèi)的吸收。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些技術(shù)中的任何方法制備抗體。參見(jiàn)，例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備抗體，其中包括單克隆抗體的增殖或經(jīng)由抗體基因進(jìn)入相配的細(xì)菌細(xì)胞或
哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的
轉(zhuǎn)染以制備重組抗體。在一種技術(shù)中，最初將一種包含多肽的免疫原注入寬范圍哺乳動(dòng)物中的任何一種(例如，小鼠、大鼠、兔、
綿羊或山羊)。如果多肽與一種載體蛋白(例如
牛血清清蛋白或鑰孔蟲(chóng)戚血蘭素)相結(jié)合，會(huì)引起更強(qiáng)烈的免疫響應(yīng)。該免疫原注入動(dòng)物宿主，優(yōu)選地，根據(jù)預(yù)訂的時(shí)間表?yè)饺胍环N或多種促升免疫劑，并將動(dòng)物周期性
放血。隨后多肽特有的多克隆抗體可從這種抗血清中純化，例如采用將多肽連接到合適的固體載體上的親和色譜法純化。
[0085] 與抗原多肽有關(guān)的特有單克隆抗體可通過(guò)如下方法制備，例如，采用Kohler和Milstein的技術(shù)，“Derivation of specific antibody-producingtissue culture and tumor lines by cell fusion.＂Eur.J.Immunol.6：511-519，1976”，及其改良。
[0086] 單克隆抗體可從生長(zhǎng)的雜種細(xì)胞群的上清液中分離。此外，可用各種方法提高產(chǎn)率，例如將雜種細(xì)胞系注入適合的
脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔中，例如小鼠。隨后單克隆抗體可從腹水或血液中收集。雜質(zhì)可通過(guò)常規(guī)技術(shù)從抗體中去除，常規(guī)技術(shù)例如色譜、凝膠過(guò)濾、沉淀和萃取。在純化工藝?yán)缬H和色譜步驟中可使用多肽。
[0087] 大量“人源化”抗體分子含有一個(gè)獲自非人類免疫球蛋白的抗原結(jié)合位，如已經(jīng)描述在Winter等(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220-4224。這些“人源化”分子用以降低對(duì)嚙齒動(dòng)物反人類抗體分子的不希望發(fā)生的免疫學(xué)反應(yīng)，這種反應(yīng)限制了那些結(jié)構(gòu)部分在人類患者中治療應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間和效力。
[0088] 維生素和其它主要礦物和營(yíng)養(yǎng)物可被用作靶向部分以增強(qiáng)承載的膠乳或承載的膠乳綴合物向細(xì)胞內(nèi)的吸收。特別是，維生素配體可選自：葉酸、結(jié)合葉酸類似物的葉酸受體和其它葉酸配體-結(jié)合受體、生物素、結(jié)合生物素類似物的生物素受體和其它生物素配體-結(jié)合受體、核黃素，結(jié)合核黃素類似物的核黃素受體和其它核黃素配體-結(jié)合受體以及硫胺素，結(jié)合硫胺素類似物的硫胺素受體和其它硫胺素配體-結(jié)合受體。其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被認(rèn)為能引發(fā)受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用，因此還可根據(jù)目前公開(kāi)的方法使用。該其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為肉毒堿、肌醇、硫辛酸、煙酸、泛酸、吡哆醛和維生素C以及脂溶性維生素A、D、E和K。此外，
現(xiàn)有技術(shù)中描述的任何“免疫脂質(zhì)體”(具有連接至脂質(zhì)體表面抗體的脂質(zhì)體)適合與所述的承載的膠乳或承載的膠乳綴合物一起使用。
[0089] 因不是所有的天然細(xì)胞膜都擁有生物活性生物素或葉酸受體，在體外對(duì)特定的細(xì)胞系應(yīng)用所述組合物，可首先改變或修飾細(xì)胞系以保證生物素或葉酸受體存在生物活性。因此，通過(guò)在缺乏生物素或葉酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞系以促進(jìn)生物素或葉酸受體的產(chǎn)生而增加在細(xì)胞膜上生物素或葉酸受體的數(shù)量，或通過(guò)向生物素或葉酸受體相對(duì)應(yīng)的蛋白或脫輔基蛋白中插入外來(lái)基因以增加在細(xì)胞膜上生物素或葉酸受體的數(shù)量。
[0090] RME不是承載的膠乳或承載的膠乳綴合物進(jìn)入細(xì)胞的唯一方法。其它進(jìn)入的方法可在承載的膠乳或承載的膠乳綴合物上連接適合的實(shí)體，包括膜孔的有效利用。吞噬作用的和胞飲作用的機(jī)制也可提供有利的機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制承載的膠乳或承載的膠乳綴合物可陷入細(xì)胞內(nèi)部。
[0091] 識(shí)別部分可進(jìn)一步含有受到酶或電化學(xué)分裂的序列。因此識(shí)別部分可包括對(duì)分裂敏感的序列，其通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)存在各種位置的酶，例如蛋白酶或限制性內(nèi)切酶(例如DNAse或RNAse)分裂序列。
[0092] 生物學(xué)應(yīng)用
[0093] 水分散的承載的膠乳還可用于其它生物學(xué)應(yīng)用，包括但不限于器官的
斷層X光成像、器官功能的監(jiān)測(cè)、
冠狀動(dòng)脈造影術(shù)、熒光
內(nèi)窺鏡檢查法、探測(cè)、成像、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效率的確定以及癌癥的治療、激光輔助引導(dǎo)手術(shù)、光聲法
和聲熒光法。
[0094] 本發(fā)明的組合物可配制為用于腸內(nèi)或腸胃外
給藥的診斷組合物。這些組合物包含有效量的染料和適合預(yù)期藥物類型的常規(guī)藥劑學(xué)載體和賦形劑。例如，注射用藥物制劑有利的是含有本發(fā)明所述的消毒水溶液或染料懸浮液。注射用藥物組合物可直接注射或與大量注射用組合物混合用于全身給藥。這樣的溶液可以包含藥學(xué)上可接受的緩沖溶液和，任選的
電解質(zhì)例如
氯化鈉。
[0095] 如本領(lǐng)域熟知的那樣，用于
腸內(nèi)給藥的制劑可以大范圍變化。通常，這種制劑是含有有效量的染料水溶液或懸浮液的液體。這樣的腸內(nèi)給藥制劑可任選含有緩沖溶液、
表面活性劑、觸變劑等等?？诜o藥的組合物還可以包含芳香劑和能增強(qiáng)其感官
質(zhì)量的其它組分。
[0096] 給予有效量的診斷組合物以達(dá)到所需的增強(qiáng)效力。根據(jù)使用的特定染料、作為成像程序的目標(biāo)的器官或組織和所用成像器材等等，該劑量可以大范圍變化。
[0097] 采用常規(guī)方法使用本發(fā)明的診斷組合物。該組合物施用于患者，典型的是溫血?jiǎng)游?，?duì)全身或局部器官或組織成像，然后患者經(jīng)歷成像步驟。
[0098] 給藥技術(shù)包括
腸胃外給藥、靜脈給藥和直接灌輸至任意期望靶組織，靶組織包括但不限于實(shí)體瘤或瘤形成的組織?？赏ㄟ^(guò)使用最終純化步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)純化，其在一包含適合的藥物組合物的媒介中分布承載的膠乳或承載的膠乳綴合物組合物。適合的藥物組合物通常包括許多所需的承載的膠乳或承載的膠乳綴合物連同依照劑量信息采用的活性劑(基于逐個(gè)具體實(shí)例)。所述的顆粒與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑(例如無(wú)菌水溶液)混合以獲得適合的最終濃度。這種制劑通常包括緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖液(PBS)，或其它添加劑例如藥物賦形劑、穩(wěn)定劑(例如BSA或HAS)，或鹽類如氯化鈉。
[0099] 對(duì)于腸胃外給藥通常需要通過(guò)確保其無(wú)菌、非免疫原性和非致熱原性，以進(jìn)一步提供藥學(xué)上可接受的組合物。該技術(shù)在本領(lǐng)域已知。此外，對(duì)人體給藥，制備應(yīng)符合FDA生物標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)所要求的無(wú)菌、致熱原性和常規(guī)安全以及純凈的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)所述的承載的膠乳或承載的膠乳綴合物被引入細(xì)胞培養(yǎng)物中的懸浮細(xì)胞時(shí)，其能夠在適合的菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中與納米顆粒共同培養(yǎng)細(xì)胞，例如Luria broth(LB)或者適合的細(xì)胞培養(yǎng)基。其它介紹的方法也可以，但更優(yōu)選介紹的這種處理方法并且承載的膠乳載體的表面上不存在實(shí)體時(shí)也能實(shí)行。
[0100] 單色或多色檢測(cè)體系中應(yīng)用的前述承載的膠乳綴合物與包含靶向材料的樣品結(jié)合使用。通常在承載的膠乳綴合物水懸浮液中培養(yǎng)樣品。當(dāng)使用單色檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，水懸浮液含有實(shí)質(zhì)上完全相同的承載的膠乳綴合物。當(dāng)使用多色檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，水懸浮液含有許多不同的可被檢測(cè)的承載的膠乳綴合物。在每種情況下，承載的膠乳綴合物對(duì)特定的靶或靶組合是特異性的。
[0101] 在與承載的膠乳綴合物混合之前，通過(guò)一種能使樣品中的靶向材料接近探針的方法制備樣品。靶向材料在標(biāo)記或檢測(cè)前可能需要純化或分離。例如，樣品可包含純化的核酸、蛋白或碳水化合物、單獨(dú)的或在混合物中的核酸、蛋白或碳水化合物物種；樣品可在溶解的細(xì)胞中含有核酸、蛋白或碳水化合物，其中溶解的細(xì)胞含有其它細(xì)胞組分；或者樣品可在基本上完整的可滲透細(xì)胞中含有核酸、蛋白或碳水化合物。樣品的制備取決于在樣品中含有的靶向材料的方式。當(dāng)樣品中含有細(xì)胞核酸(例如染色體或細(xì)胞中負(fù)載質(zhì)體基因，RNA或DNA病毒或支原體感染細(xì)胞，或細(xì)胞內(nèi)的RNA)或蛋白時(shí)，除已經(jīng)描述的變性和中和之外，樣品的制備還包括溶解細(xì)胞或透化細(xì)胞。
[0102] 在用承載的膠乳綴合物標(biāo)記樣品后，任選采用常規(guī)方法從樣品中去除未結(jié)合的承載的膠乳綴合物，例如水洗。
[0103] 檢測(cè)
[0104] 為檢測(cè)靶向材料，用使承載的膠乳綴合物發(fā)出熒光的設(shè)施照射樣品。通常，使用發(fā)射承載的膠乳綴合物激發(fā)峰范圍的激發(fā)能的
光源。可利用光照所產(chǎn)生的熒光、已與靶向材料形成絡(luò)合物承載的膠乳綴合物來(lái)測(cè)定靶向材料的存在、位置或數(shù)量。
[0105] 可通過(guò)多種成像技術(shù)使承載的膠乳綴合物發(fā)出的熒光直觀，包括尋常光或熒光顯微鏡和激光掃描共焦顯微鏡和CCD
照相機(jī)。共焦顯微鏡中的三維空間成像解析技術(shù)利用了顯微鏡的點(diǎn)分布函數(shù)(點(diǎn)光源成像)來(lái)在其合適的視
角內(nèi)調(diào)整未聚焦的光。多重標(biāo)記的靶向材料任選以空間、時(shí)間順序、尺寸或利用可檢測(cè)的不同
光譜特性(包括激發(fā)和發(fā)射極限、熒光強(qiáng)度或其組合)來(lái)解析。多重標(biāo)記的靶向材料通常利用不同承載的膠乳綴合物對(duì)每種靶向材料的獨(dú)特光譜特性進(jìn)行解析。作為選擇，承載的膠乳綴合物是相同的，但樣品被標(biāo)記并且順序觀測(cè)或者空間分離。如果不需要解析多重靶，像在大規(guī)模篩檢那樣(例如泛-病毒或細(xì)菌污染物篩檢)，無(wú)需將含有多重靶補(bǔ)體的承載的膠乳綴合物分別應(yīng)用于樣品。
[0106] 治療劑是有效增強(qiáng)或抑制細(xì)胞功能、血流量、生物擾動(dòng)或生物吸收的材料。實(shí)例可以是用于治療癌癥、心臟病、遺傳病、細(xì)菌和
病毒感染以及其它紊亂的藥物。
[0107] 其它可用于綴合的材料為PEG-肽、PEG-蛋白、PEG-酶抑制劑、PEG-寡糖、PEG-多糖、PEG-激素、PEG-右旋糖酐、PEG-低聚核苷酸、PEG-糖類、PEG-神經(jīng)傳遞介質(zhì)、PEG-半抗原、PEG-類胡蘿卜素。
[0108] PEG可以同這些材料的混合物共同起作用以提高效用。
[0109] 以下是優(yōu)選連接聚合物的列表，但并不是本發(fā)明所述所有連接聚合物的詳盡和完整列表：
[0110]
[0111]
[0112] 在一種使用方法中，多重連接聚合物連接于納米凝膠上。例如，在水中制備想要的單體、連接聚合物和引發(fā)劑的第一混合物。第一混合物被加入到附加的引發(fā)劑的第二混合物中并反應(yīng)，此后可添加附加的引發(fā)劑以產(chǎn)生納米凝膠組合物。在另一優(yōu)選的使用方法中，多重連接聚合物被連接于納米膠乳上。在水中制備單體、連接聚合物、引發(fā)劑、表面活性劑和緩沖劑的混合物。將這一混合物加至引發(fā)劑、表面活性劑和緩沖劑的水溶液中并反應(yīng)，以生產(chǎn)本發(fā)明的納米膠乳顆粒。
[0113] 通常，可在任何合適的條件下通過(guò)將生物活性物質(zhì)與活性的水溶性連接聚合物分子反應(yīng)制得衍生物。通常，酰化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件取決于已知參數(shù)和所需結(jié)果的具體實(shí)例。例如，PEG:蛋白的比例越高，
聚乙二醇化的產(chǎn)物所占的百分比越高?？梢赃x擇通過(guò)?；?或烷基化方法制備連接聚合物/多肽綴合物分子的混合物。此方法的優(yōu)勢(shì)在于可選擇混合物中均聚物/多肽綴合物的比例。
[0114] 本發(fā)明所用的膠乳可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的用于制備平均直徑在5到100nm的顆粒的方法制備。特別有用的方法包括乳液和微乳液聚合。這樣的技術(shù)在“Suspension，Emulsion，and Dispersion Polymerization：aMethodological Survey”Colloid.Polym.Sci.vol.270，p.717-732，1992和Lovell，P.A.；El-Aaser，M.S.“Emulsion Polymerization and EmulsionPolymers”，Wiley：Chichester，1997中進(jìn)行了綜述。另一種方法涉及在分子內(nèi)交聯(lián)各個(gè)聚合物鏈以形成非常小的顆粒的方法。該方法描述在美國(guó)
專利US6,890,703中。
[0115] 本發(fā)明可用的染料是熒光、憎水染料，其在400-1000nm波長(zhǎng)下發(fā)射熒光。這類染料包括但不必須限于oxonol、吡喃洋、squaric、croconic、rodizonic、聚氮雜吲達(dá)省(polyazaindacenes)或香豆素，閃爍染料(通常是噁唑和噁二唑)、芳基和雜芳基-取代的聚烯烴(C2-C8烯烴部分)、部花青、羰花青、酞菁、噁嗪、carbostyryl、卟啉染料和二吡咯亞甲基
硼雙氟化物染料、氮雜-二吡咯亞甲基硼雙氟化物染料和噁嗪染料。可商購(gòu)的熒光染料如表1所列，通式結(jié)構(gòu)如表2所示。優(yōu)選的染料為羰花青，酞菁或氮雜-二吡咯亞甲基硼雙氟化物。
[0116] 表1.可商購(gòu)的熒光染料
[0117] 5-氨基-9-二乙基亞胺基苯并(a)吩噁嗪高氯酸鹽
[0118] 7-氨基-4-甲基carbostyryl
[0119] 7-氨基-4-甲基香豆素
[0120] 7-氨基-4-三氟甲基香豆素
[0121] 3-(2’-苯并咪唑基)-7-N，N-二乙基氨基香豆素
[0122] 3-(2’-苯并咪唑基)-7-二乙基氨基香豆素
[0123] 2-(4-聯(lián)苯基)-5-(4-叔丁基苯基)-1，3，4-噁二唑
[0124] 2-(4-聯(lián)苯基)-5-苯基-1，3，4-噁二唑
[0125] 2-(4-聯(lián)苯基)-6-苯基苯并噁唑-1，3
[0126] 2，5-二-(4-聯(lián)苯基)-1，3，4-噁二唑
[0127] 2，5-二-(4-聯(lián)苯基)-噁唑
[0128] 4，4″′-二-(2-丁基辛氧基)-對(duì)-四聯(lián)苯
[0129] 對(duì)-二(鄰-甲基苯乙烯基)-苯
[0130] 5，9-二氨基苯并(a)吩噁嗪高氯酸鹽
[0131] 4-二氰基亞甲基-2-甲基-6-(對(duì)-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃
[0132] 1，1’-二乙基-2，2’-羰花青碘化物
[0133] 1，1’-二乙基-4，4’-羰花青碘化物
[0134] 3，3’-二乙基-4，4’，5，5’-二苯并硫雜三羰花青碘化物
[0135] 1，1’-二乙基-4，4’-二羰花青碘化物
[0136] 1，1’-二乙基-2，2’-二羰花青碘化物
[0137] 3，3’-二乙基-9，11’-新亞戊基硫雜三羰花青碘化物
[0138] 1，3’-二乙基-4，2’-喹啉基氧雜羰花青碘化物
[0139] 1，3’-二乙基-4，2’-喹啉基硫雜羰花青碘化物
[0140] 3-二乙基氨基-7-二乙基亞胺基吩噁嗪高氯酸鹽
[0141] 7-二乙基氨基-4-甲基香豆素
[0142] 7-二乙基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0143] 7-二乙基氨基香豆素
[0144] 3，3’-二乙基氧雜二羰花青碘化物
[0145] 3，3’-二乙基硫雜羰花青碘化物
[0146] 3，3’-二乙基硫雜二羰花青碘化物
[0147] 3，3’-二乙基硫雜三羰花青碘化物
[0148] 4，6-二甲基-7-乙基氨基香豆素
[0149] 2，2″′-二甲基-對(duì)-四聯(lián)苯
[0150] 2，2″-二甲基-對(duì)-三聯(lián)苯
[0151] 7-二甲基氨基-1-甲基-4-甲氧基-8-氮雜喹諾酮-2
[0152] 7-二甲基氨基-4-甲基喹諾酮-2
[0153] 7-二甲基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0154] 2-(4-(4-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑鎓高氯酸鹽[0155] 2-(6-(對(duì)-二甲基氨基苯基)-2，4-新亞戊基-1，3，5-己三烯基)-3-甲基苯并噻唑鎓高氯酸鹽
[0156] 2-(4-(對(duì)二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-1，3，3-三甲基-3氫-吲哚鎓高氯酸鹽
[0157] 3，3’-二甲基氧雜三羰花青碘化物
[0158] 2，5-二聯(lián)苯呋喃
[0159] 2，5-二苯基噁唑
[0160] 4，4’-二苯基茋
[0161] 1-乙基-4-(4-(對(duì)-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-吡啶鎓高氯酸鹽[0162] 1-乙基-2-(4-(對(duì)-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-吡啶鎓高氯酸鹽[0163] 1-乙基-4-(4-(對(duì)-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-喹諾鎓高氯酸鹽[0164] 3-乙基氨基-7-乙基亞胺基-2，8-二甲基吩噁嗪-5-鎓高氯酸鹽
[0165] 9-乙基氨基-5-乙基氨基-10-甲基-5氫-苯并吩噁嗪高氯酸鹽
[0166] 7-乙基氨基-6-甲基-4-三氟甲基香豆素
[0167] 7-乙基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0168] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基-4，4’，5，5’-二苯并-2，2’-碘化三羰花青碘化物[0169] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚二羰花青碘化物
[0170] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚三羰花青碘化物
[0171] 2-甲基-5-叔丁基-對(duì)-四聯(lián)苯
[0172] 3-(2’-N-甲基苯基亞胺基偶氮基)-7-N，N-二乙基氨基香豆素
[0173] 2-(1-萘基)-5-苯基茋
[0174] 2-2’-對(duì)-亞苯基(phenylen)-二(5-苯基噁唑)
[0175] 3，5，3″″′，5″″′-四-叔丁基-對(duì)-六聯(lián)苯
[0176] 3，5，3″″′，5″″′-四-叔丁基-對(duì)-五聯(lián)苯
[0177] 2，3，5，6-1H，4H-四氫-9-乙?；鵴uinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0178] 2，3，5，6-1H，4H-四氫-9-羰基乙氧基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0179] 2，3，5，6-1H，4H-四氫-8-甲基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素
[0180] 2，3，5，6-1H，4H-四氫-9-(3-吡啶基)-quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0181] 2，3，5，6-1H，4H-四氫-8-三氟甲基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0182] 2，3，5，6-1H，4H-四氫quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素
[0183] 3，3′，2″，3″′-四甲基-對(duì)-四聯(lián)苯
[0184] 2，5，2″″，5″″-四甲基-對(duì)-五聯(lián)苯
[0185] 對(duì)-三聯(lián)苯
[0186] 對(duì)-四聯(lián)苯
[0187] 尼羅紅
[0188] 羅丹明700
[0189] 噁嗪750
[0190] 羅丹明800
[0191] IR125
[0192] IR144
[0193] IR140
[0194] IR132
[0195] IR26
[0196] IR5
[0197] 二苯基己三烯
[0198] 二苯基丁二烯
[0199] 四苯基丁二烯
[0200] 萘
[0201] 蒽
[0202] 苝
[0203]
[0204] 紅熒烯
[0205] 六苯并苯
[0206] 菲
[0207] 芴
[0209] 八乙基卟啉鉑
[0210] 表2熒光染料舉例
[0211]
[0212]
[0213]
[0214] 與膠乳顆粒一同使用的熒光染料可溶于溶液且不溶于水。當(dāng)染料被承載入水溶性膠乳顆粒時(shí)，可觀測(cè)到的
熒光量子產(chǎn)率比染料在含水溶劑中時(shí)可觀測(cè)到的量子產(chǎn)率大。
[0215] 產(chǎn)率產(chǎn)率熒光染料可通過(guò)各種已知方法承載至膠乳之中。例如，如US6,706,460、US4,368,258、US4,199,363和US6,964,844所述，可將染料在水-混溶有機(jī)溶劑的溶液與膠乳混合，然后通過(guò)
蒸發(fā)、用水稀釋或
透析去除溶劑。如US5,594,047所述，染料在水-混溶有機(jī)溶劑的溶液可與水性膠乳混合，然后將混合物高速剪切攪拌。作為選擇，可在制備膠乳時(shí)引入染料。這種方法在描述在Journal of Polymer Science Part A：Polymer Chemistry，Vol.33，p.2961-2968，1995和Colloid and PolymerScience，vol.282，p.119-126，2003中。
[0216] 承載的膠乳顆?？捎米鞒上裉结槕?yīng)用于動(dòng)物和其他生理學(xué)體系中。該顆粒可用作診斷顯影元件或用于在其他生物體外/生物體內(nèi)的生理學(xué)成像應(yīng)用。優(yōu)選地，顆粒以含水、生物相容的分散液提供。
[0217] 所述組合物可進(jìn)一步包含生物學(xué)、藥物學(xué)或診斷的組分，該組分包括識(shí)別特定靶細(xì)胞或其它靶生物分子的靶向部分。此處使用的“靶細(xì)胞”指的是健康細(xì)胞、疾病細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或
植物細(xì)胞。“靶生物分子”包括但不限于蛋白、蛋白片段、核酸或任意實(shí)質(zhì)上的代謝物。
[0218] 代表性的、非限制性可與本發(fā)明組合物一同使用的靶試劑的結(jié)構(gòu)部分列表為選自：蛋白、肽、aptomers、有機(jī)小分子、毒素、diptheria毒素、假單胞菌毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素、拌刀豆球蛋白A、勞斯(氏)肉瘤病毒、塞姆利基森林病毒、水泡性口膜炎病毒、腺病毒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、鈷胺素傳遞蛋白、蛋黃蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、降血鈣素、胰高血糖素、促泌乳激素、促黃體激素、甲狀腺激素、血小板源生長(zhǎng)因子、干擾素、兒茶酚胺、肽、糖脂類、糖蛋白和多糖。還可以使用這些結(jié)構(gòu)部分的同系物或片段。這些靶向部分可與納米微粒相相關(guān)聯(lián)用于指引納米顆粒結(jié)合所選的靶。這里并不需要所有的部分都被用作靶向部分。已知的能與特定受體或其他結(jié)構(gòu)反應(yīng)的這些部分中較小的片段也可作為靶向部分。
[0219] 抗體或抗體片段代表一類普遍使用的靶向部分，這類靶向部分可用于連接至納米膠乳。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些技術(shù)中的任何方法制備抗體。參見(jiàn)，例如Harlow和 Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備抗體，其中包括單克隆抗體的增殖或經(jīng)由抗體基因進(jìn)入合適的細(xì)菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的轉(zhuǎn)染以制備抗體。在一種技術(shù)中，最初將一種包含多肽的免疫原注入寬范圍哺乳動(dòng)物中的任何一種(例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)。如果多肽與一種載體蛋白(例如牛血清清蛋白或鑰孔蟲(chóng)戚血蘭素)相結(jié)合，會(huì)引起更強(qiáng)烈的免疫響應(yīng)。該免疫原注入動(dòng)物宿主，優(yōu)選地，根據(jù)預(yù)訂的時(shí)間表?yè)饺胍环N或多種促升免疫劑，并將動(dòng)物周期性放血。隨后對(duì)多肽特異性的多克隆抗原可從這種抗血清中純化，例如采用將多肽連接到合適的固體載體上的親和色譜法純化。
[0220] 對(duì)抗原多肽特異性的單克隆抗體可通過(guò)如下方法制備，例如，采用Kohler和Milstein的技術(shù)，Eur.J.Immunol.6：511-519，1976”，及其改進(jìn)。
[0221] 單克隆抗體可從生長(zhǎng)的雜種細(xì)胞群的上清液中分離。此外，可用各種方法提高產(chǎn)率，例如將雜種細(xì)胞系注入適合的脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔中，例如小鼠。隨后單克隆抗體可從腹水或血液中收集。雜質(zhì)可通過(guò)常規(guī)技術(shù)從抗體中去除，例如色譜、凝膠過(guò)濾、沉淀和萃取。在純化工藝?yán)缬H和色譜步驟中可使用多肽。
[0222] 大量“人源化”抗體分子含有一個(gè)獲自非人類免疫球蛋白的抗原結(jié)合位，如已經(jīng)描述在Winter等(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220-4224。這些“人源化”分子被設(shè)計(jì)用以降低對(duì)嚙齒動(dòng)物反人類抗體分子的不希望發(fā)生的免疫學(xué)反應(yīng)，其限制了那些結(jié)構(gòu)部分在人類患者中治療應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間和效力。
[0223] 識(shí)別部分可進(jìn)一步包括能通過(guò)
選定靶識(shí)別的肽或核酸的序列。肽和核酸可選自本領(lǐng)域已知的能結(jié)合到選定靶的序列，或者選自能結(jié)合到選定靶的組合肽或核酸庫(kù)。
[0224] 維生素和其它主要礦物和營(yíng)養(yǎng)物可被用作靶向部分以增強(qiáng)承載的膠乳或承載的膠乳顆粒向靶的結(jié)合。特別是，維生素配體可選自：葉酸、結(jié)合葉酸類似物的葉酸受體和其它葉酸受體-結(jié)合配體、生物素、結(jié)合生物素類似物的生物素受體和其它生物素受體-結(jié)合配體、核黃素，結(jié)合核黃素類似物的核黃素受體和其它核黃素受體-結(jié)合配體以及硫胺素，結(jié)合硫胺素類似物的硫胺素受體和其它硫胺素受體-結(jié)合配體。
[0225] 因不是所有的天然細(xì)胞膜都擁有生物活性生物素或葉酸受體，在體外對(duì)特定的細(xì)胞系應(yīng)用所述組合物，可首先改變或修飾細(xì)胞系以保證生物素或葉酸受體存在生物活性。因此，通過(guò)在缺乏生物素或葉酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞系以促進(jìn)生物素或葉酸受體的產(chǎn)生而增加在細(xì)胞膜上生物素或葉酸的數(shù)量，或通過(guò)向生物素或葉酸受體相對(duì)應(yīng)的蛋白或脫輔基蛋白中插入外來(lái)基因以增加在細(xì)胞膜上生物素或葉酸的數(shù)量。
[0226] 識(shí)別部分可進(jìn)一步含有酶或電化學(xué)分裂的序列。因此識(shí)別部分可包括對(duì)分裂敏感的序列，其通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)存在各種位置的酶，例如蛋白酶或限制性內(nèi)切酶(例如DNAse或RNAse)分裂該序列。
[0227] 對(duì)于細(xì)胞靶向來(lái)說(shuō)，細(xì)胞表面識(shí)別序列不是必須的。因此，雖然細(xì)胞表面受體靶向部分能夠?qū)o定的細(xì)胞類型靶向，或者誘導(dǎo)納米顆粒和細(xì)胞表面的相關(guān)聯(lián)，但是納米膠乳顆粒表面不需存在細(xì)胞表面受體靶向部分。
[0228] 為了將生物學(xué)的、藥學(xué)的或診斷的組分組配成所述的納米微粒載體，這些組分可以通過(guò)聯(lián)接與納米顆粒載體相關(guān)聯(lián)。“相關(guān)聯(lián)”指的是納米顆粒負(fù)載該組分，例如在納米顆粒表面負(fù)載。該組分可以以非共價(jià)形式溶解和引入顆粒中。優(yōu)選的相關(guān)聯(lián)這些組分的方法是通過(guò)在表面的胺官能團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合。
[0229] 通常，在想要的靶向部分和納米膠乳微粒載體間形成聯(lián)接的任何方法都是可用的。這包括配體以共價(jià)鍵、離子鍵或氫鍵直接或間接通過(guò)連接基團(tuán)連接到外部分子上。通過(guò)靶向部分、生物學(xué)的、藥學(xué)的或診斷的組分的共作連接形成的連接共價(jià)通常連接到納米顆粒載體上，其中該連接是在配合物的各自組分上由酸、醛、羥基、氨基或肼?lián)位鶊F(tuán)之間形成了酰胺、酯或亞氨基鍵。優(yōu)選的是本領(lǐng)域公認(rèn)的不穩(wěn)定共價(jià)連接例如亞氨基鍵和所謂“活性的”酯，其含有-COOCH、-O-O-或-COOCH連接基團(tuán)。氫鍵結(jié)合，例如在核酸互補(bǔ)株間形成的氫鍵，還可用于形成連接。
[0230] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向部分是以共價(jià)鍵連接于聚乙二醇大分子單體末端的活性基團(tuán)上的。所用的共價(jià)鍵取決于聚乙二醇末端的活性基團(tuán)。例如，如果活性基團(tuán)是胺，它可與靶向部分上的活性羧酯衍生物反應(yīng)(例如，N-羥基琥珀酰亞胺酯)以形成酰胺鍵。如果活性基團(tuán)是乙烯基砜，其可與靶向部分上的伯胺反應(yīng)以提供第二個(gè)氨鍵。
[0231] 提供以下實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明。
[0232] 表3染料結(jié)構(gòu)
[0233]
[0234]*
[0235] 獲自GE醫(yī)療**
[0236] 獲自GE醫(yī)療/Amersham生物科學(xué)
[0237] 染料1、染料5、染料8和染料10的通用合成步驟1
[0238] 向 3H- 吲 哚 鎓 鹽 (2eqv.) 和 N-(5-( 苯 基 氨 基 )-2，4- 戊 二 烯 基pentadienylidene)-苯胺單鹽酸鹽(雙苯胺)(1eqv.)的乙腈溶液中加入乙酸酐和三乙胺(1.5eqv.)。將該混合物加熱至回流5～25分鐘。所得的混合物隨后冷卻至室溫，將其倒入水或醚中得到粗產(chǎn)物，該粗產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)硅膠色譜法或再結(jié)晶法或反相高效液相色譜法純化。
[0239] 染料合成實(shí)施例1-染料1的制備
[0240] 采用2，3，3-三甲基-1-十八烷基-3H-吲哚鎓高氯酸鹽(4.28g，10mmol)和雙苯胺(1.4g，5mmol)置于40ml含有三乙胺(1.5g，15mmoles)的乙酸酐中，按上述通用步驟制備該染料。反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。該反應(yīng)冷卻至25℃并在劇烈攪拌下傾倒入2升
冰水中。將水層分出，油層溶解在100mL80/20二氯甲烷-甲醇溶液中。用色譜法在硅膠柱中用80/20二氯甲烷-甲醇溶液洗脫該物質(zhì)。用無(wú)水
硫酸鎂干燥后將溶液蒸發(fā)得到純?nèi)玖?4g，32％產(chǎn)率)。在甲醇中的λmax＝747nm，
消光系數(shù)＝220,020。
[0241] 染料合成實(shí)施例2-染料5的制備
[0242] 采用2，3，3-三甲基-1-丁基-3H-吲哚鎓高氯酸鹽(12g，38mmol)和雙苯胺(5.4g，19mmol)置于100ml含有三乙胺(10.5g，57mmoles)的乙酸酐中，按上述通用步驟制備該染料。反應(yīng)15分鐘，冷卻至25℃并在劇烈攪拌下傾倒入2000mL冰水中。將水層分出，油層用色譜法在硅膠柱中用90/10二氯甲烷-甲醇溶液洗脫該物質(zhì)。用無(wú)水硫酸鎂干燥后將溶液蒸發(fā)得到純?nèi)玖?8g，71％產(chǎn)率)。在甲醇中的λmax＝746nm，消光系數(shù)＝259,500。
[0243] 染料合成實(shí)施例3-染料8的制備
[0244] 采用1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓四溴化硼(5.22g，20mmol)和雙苯胺(2.84g，10mmol)置于25ml含有乙酸酐(3ml)和三乙胺(5.6ml)的異丙醇中反應(yīng)兩小時(shí)，按上述通用步驟制備該染料。該反應(yīng)冷卻至25℃并在劇烈攪拌下傾倒入1升冰水中。過(guò)濾收集粗產(chǎn)
1
物并再用水洗。粗產(chǎn)物用從熱
乙醇溶液中再結(jié)晶的方法純化。獲得3.4g純產(chǎn)物。H NMR譜圖與其結(jié)構(gòu)相符。在甲醇中的λmax＝739nm，消光系數(shù)＝294,000。
[0245] 染料合成實(shí)施例4-染料10的制備
[0246] 采用2，3，3-三甲基-1-(4-硫代丁基)-3H-吲哚鎓內(nèi)鹽(2.3g，6.7mmol)和雙苯胺(0.95g，3.3mol)置于20ml乙酸酐中，按上述通用步驟制備該染料。劇烈攪拌下加入三乙胺(2g，20mmol)并加熱至回流反應(yīng)5分鐘。冷卻該反應(yīng)并用二乙醚稀釋至300mL，攪拌10分鐘。將乙醚從油層分出，并加入25mL純乙醇。將混合物加熱至回流然后加入1.5g(0.01mmol)的碘化鈉。繼續(xù)加熱3分鐘然后將混合物攪拌冷卻至25℃。過(guò)濾出固體物質(zhì)，并用純乙醇洗滌并干燥。Wt＝2.4g(94％產(chǎn)率，85％純度)。將產(chǎn)品用反相高效液相色譜純化得到1g的所需染料(HPLC純化的產(chǎn)率為39％，純度為99％)。在甲醇中的λmax＝784nm，消光系數(shù)＝221,700。
[0247] 染料合成實(shí)施例5-染料2的制備
[0248] 應(yīng)用文獻(xiàn)中描述的合成方法合成染料2(例如Zhao，W.等Chem.Int.Ed.2005，44，1677中所述)。在甲醇中的λmax＝739nm，消光系數(shù)＝129945。
[0249] 染料合成實(shí)施例6-染料3的制備
[0250] 將異硬脂醇(1.8g，6.6mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(50ml)混合，用氫化鈉(50％的油混合物0.31g，6.6mmol)處理，在氮?dú)夥諊聰嚢?小時(shí)。加入酞菁二氯化物，反應(yīng)加熱至回流過(guò)夜。該反應(yīng)物被分配在水層和乙酸乙酯層之間，將有機(jī)層用水洗三次。有機(jī)層1
用硫酸鎂干燥、過(guò)濾并濃縮。所得殘留物用色譜法硅膠純化得到0.8g的產(chǎn)物。H NMR譜圖與其結(jié)構(gòu)相符。在
甲苯中的λmax＝672nm。
[0251] 染料合成實(shí)施例6-染料4的制備
[0252] 將3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-十八烷基-高氯酸鹽(2.14g，5mmol)、N-((2-氯-3-((苯基氨基)亞甲基)-1-環(huán)己烯-1-基)亞甲基)-苯胺單鹽酸鹽(0.9g，2.5mmol)和1-甲基-2-吡咯烷酮(30ml)的混合物60℃下加熱過(guò)夜。將混合物冷卻至室溫并倒入水中。通過(guò)過(guò)濾、水洗和
真空干燥收集該染料以獲得粗產(chǎn)物(1.8g)，該粗產(chǎn)物染料不需進(jìn)一步的純化而應(yīng)用于下一步驟。
[0253] 在室溫下向
苯酚(130mg，1.4mmol)的無(wú)水四氫呋喃溶液中加入氫化鈉(60mg，1.4mmol，60％礦物油溶液)。將混合物攪拌30分鐘，然后加入染料(0.8g，0.9mmol)，該混合物加熱至60℃加熱過(guò)夜。然后去除溶劑并用色譜法純化殘留物(硅膠柱；二氯甲烷和2％
1
的甲醇)以獲得純凈的染料產(chǎn)物560mg)。在丙酮中的λmax＝771nm，質(zhì)譜和HNMR譜圖與其結(jié)構(gòu)相符。
[0254] 染料合成實(shí)施例7-染料6的制備
[0255] 向裝有3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-十八烷基-，
對(duì)甲苯磺酸鹽(PTS)(5.75g，12mmol)、N-(3-(苯基氨基)-2-亞丙烯基)-苯胺單鹽酸鹽(1.55g，6mmol)和乙腈(15ml)的圓底燒瓶中加入乙酸酐(1.3ml)和三乙胺(3.4ml)。該混合物加熱至回流并加入另一部分的三乙胺(2.0ml)。該反應(yīng)混合物回流兩小時(shí)?；旌衔锢鋮s至室溫后，攪拌下加入水。通過(guò)過(guò)濾和空氣干燥收集作為反離子的帶有PTS的染料粗產(chǎn)物(6.2g)。
[0256] 染料的PTS反離子接下來(lái)用高氯酸鹽交換。在染料(6.1g)的甲醇(55ml)溶液中加入高氯酸鈉(1.3g)的甲醇溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時(shí)，染料沉淀出來(lái)并過(guò)濾收集。染料用在甲醇溶液中再結(jié)晶的方法進(jìn)一步純化。得到3.2g染料6。在甲醇中的λmax5
＝682nm，消光系數(shù)＝2.33×10。
[0257] 染料合成實(shí)施例8-染料7的制備
[0258] 根據(jù)帶有增加一個(gè)離子交換步驟的染料合成實(shí)施例7的方法合成該染料。使用3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-丁基，對(duì)苯磺酸鹽(10.76g，20mmol)、N-(3-(苯基氨基)-2-亞丙烯基)-苯胺，單鹽酸鹽(2.6g，10mmol)、乙腈(30ml)、乙酸酐(2.5ml)和三乙胺(6.5ml)進(jìn)行該縮合步驟。得到10.2g粗產(chǎn)物，使用染料合成實(shí)施例7的方法離子交換成高氯酸鹽。交換過(guò)程應(yīng)用染料粗產(chǎn)物(10g，18.6mmol)、MeOH(70ml)和高氯酸鈉(2.6g，21.2mmol)。獲得8.2g染料的高氯酸鹽。在甲醇(300ml)中將粗高氯酸鹽粗染料與amberlite IRA-400(Cl)
樹(shù)脂(40g)攪拌幾小時(shí)。濾除樹(shù)脂，然后用第二份樹(shù)脂重復(fù)該過(guò)程。用旋轉(zhuǎn)
蒸發(fā)器除去溶劑，染料在60℃下真空干燥過(guò)夜。獲得的終產(chǎn)物染料7(4.7g)在5
甲醇中的λmax＝641nm，消光系數(shù)＝2.56×10。
[0259] 染料合成實(shí)施例9-染料11的制備
[0260] 根據(jù)Lou Kai-yan，Qian Xu-huong，Song Gong-hua，華中理工大學(xué)學(xué)報(bào)，28，(2)，212-5，2002.中所述的方法制備染料11。在甲醇中的λmax＝751nm，消光系數(shù)＝5
2.31×10。
[0261] 實(shí)施例10.端胺基聚乙二醇大分子單體的制備
[0262]
[0263] 將聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(Aldrich，Mn＝875,335g)與100mL的甲醇混合并用半胱胺(Aldrich，5.8g)和二異丙基乙胺(Hunigs堿)處理，然后在室溫下攪拌2天后用
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。所得殘留物用1L乙酸乙酯溶解并用10％鹽酸水溶液萃取。收集水層并加入50％的氫氧化鈉水溶液使其成堿性，然后用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用硫酸鎂干燥并濃縮。所得殘留物用無(wú)水二乙醚溶解并用氣態(tài)氯化氫處理并保持穩(wěn)定(stand)。將醚倒出留下深藍(lán)色油。將其用新鮮的二乙醚沖洗，并將二乙醚倒出。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮深藍(lán)色油，得到37g所需產(chǎn)物的鹽酸鹽。
[0264] 1H-NMR(300MHZ，CDCl3)：D1.18(d，3H)，1.93(bs，3H)，2.04(bs，2H)，2.43-2.77(bm，7H)，3.6-3.7(vbs，-CH2CH2O-)，3.73(bt，2H)，3.29(bt，2H)，5.56(bs，1H)，6.12(bs，1H).[0265] 實(shí)施例11.包含甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的納米膠乳1的制備
[0266] 將500ml的三頸燒瓶底部加上Ace#15玻璃線和一連串的適配器以使得其能連接1/16英寸型號(hào)的聚四氟乙烯管。該燒瓶(此后指代″header″燒瓶)配備了機(jī)械攪拌器、帶針頭
注射器氮?dú)馊肟诘?a href='/zhuanli/list-20697-1.html' target='_blank'>
橡膠隔膜。Header燒瓶中裝入甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、
碳酸氫鈉(0.06g)和蒸餾水(159.13g)。向配備機(jī)械攪拌器、回流
冷凝器、氮?dú)膺M(jìn)口和橡膠隔膜(此后指代“反應(yīng)器”)的
1L三頸圓底燒瓶中裝入2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、碳酸氫鈉(0.06g)和蒸餾水(159.13g)。header和反應(yīng)器中的內(nèi)容物都攪拌至均相，并通入氮?dú)馀艢舛昼?。將反?yīng)燒瓶置于60℃自動(dòng)控溫的水浴中，然后在通氣2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)用QG6實(shí)驗(yàn)室
泵模型(Fluid Metering Inc.Syossett，NY)向反應(yīng)器中加入header內(nèi)容物。該反應(yīng)混合物在60℃下攪拌16小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物用3.5K尺寸截?cái)嗄ぴ诔掷m(xù)補(bǔ)充水的水浴中透析48小時(shí)。得到286.0g的2.64％固體的無(wú)色分散體。準(zhǔn)彈性光散射(QELS)測(cè)得的體積平均直徑為10.8nm，變異系數(shù)為0.25。采用Nanotrac Ultrafme粒子分析器(MicrotracInc.Montgomeryville，PA)在3％-5％的固體上進(jìn)行QELS。
[0267] 實(shí)施例12.納米膠乳2(納米膠乳1的離子交換重復(fù)作業(yè))的制備
[0268] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。在header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(22.50g)、二乙烯基苯(2.50g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(22.50g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.25g)、碳酸氫鈉(0.25g)和蒸餾水(313.50g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(636.50g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.25g)、碳酸氫鈉(0.25g)。得到771g5.59％固體的澄清分散體。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為10.4nm，變化系數(shù)為0.27。將200g的膠乳于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)。
然后在約15cc Dowex50Wx4離子交換樹(shù)脂中攪拌透析膠乳(轉(zhuǎn)換成鈉離子形式并用蒸餾水洗滌3次)以獲得3.85％固含量的離子交換分散體。
[0269] 實(shí)施例13.納米膠乳3的制備(納米膠乳1制備過(guò)程的大規(guī)模重復(fù)作業(yè))
[0270] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。在header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00g)、二乙烯基苯(5.00g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(50.00g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.50g)、碳酸氫鈉(0.50g)和蒸餾水(627.00g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(1273.00g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.50g)、碳酸氫鈉(0.50g)。用有30K尺寸截?cái)嗦菪p繞彈筒的Amicon LP1透析過(guò)濾系統(tǒng)(Millipore Inc)對(duì)膠乳進(jìn)行
超濾。蒸餾水沖洗8次后用約600ccDowex50Wx4離子交換樹(shù)脂處理膠乳(轉(zhuǎn)換成鈉離子形式并用蒸餾水洗滌3次)以獲得5.67％固體的離子交換分散體。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為12.0nm，變異系數(shù)0.28。
[0271] 實(shí)施例14.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(45％)和苯乙烯磺酸鈉(5％)的納米膠乳4的制備。
[0272] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(22.50g)、二乙烯基苯(2.50g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(22.50g，Mn＝1100)、過(guò)硫酸鈉(0.50g)、碳酸氫鈉(0.25g)和蒸餾水(313.50g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(636.50g)、偏亞硫酸氫鈉(0.36g)、碳酸氫鈉(0.50)。獲得759g的4.94％固體的澄清分散體。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為22.2nm，變異系數(shù)0.25。將200g的膠乳于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)以獲得292g的3.24％固體的分散體。
[0273] 實(shí)施例15.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(45％)和甲基丙烯酸(5％)的納米膠乳5的制備。
[0274] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(112.50g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(11.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.63g)和蒸餾水(156.75g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(1.88g)。將膠乳與200cc Dowex88離子交換樹(shù)脂攪拌1小時(shí)(2次)，然后于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)以獲得含4.39％固體的澄清乳液。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為10.98nm，變異系數(shù)0.29。
[0275] 實(shí)施例16.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、實(shí)施例1的端氨基聚乙二醇大分子單體(50％)的納米膠乳6的制備。
[0276] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氫鈉(0.06g)和蒸餾水(78.38g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、碳酸氫鈉(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。將膠乳用100cc Dowex88離子交換樹(shù)脂處理2次，然后于14K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)以獲得含3.26％固體的澄清乳液312g。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為20.89nm，變異系數(shù)0.24。
[0277] 實(shí)施例17.含有苯乙烯(70％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(25％)的納米膠乳7的制備。
[0278] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：苯乙烯(8.75g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(3.13g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)和蒸餾水(78.38g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.63g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。該膠乳于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)以獲得含3.38％固體的澄清乳液251g。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為12.82nm，變異系數(shù)0.36。
[0279] 實(shí)施例18.含有苯乙烯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的納米膠乳8的制備。
[0280] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：苯乙烯(11.25g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(12.5g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氫鈉(0.13)、蒸餾水(156.75g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。該膠乳于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)，并用250cc Dowex88離子交換樹(shù)脂處理以獲得含4.08％固體的澄清乳液561.23g。
準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為13.22nm，變異系數(shù)0.19。
[0281] 實(shí)施例19.含有甲基丙烯酸甲酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的納米膠乳9的制備。
[0282] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸甲酯(11.25g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(12.5g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氫鈉(0.13)和蒸餾水(156.75g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.13g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。該膠乳于3.5K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)，并用250cc Dowex88離子交換樹(shù)脂處理以獲得含3.71％固體的澄清乳液610.25g。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為13.30nm，變異系數(shù)0.18。
[0283] 實(shí)施例20.含有丙烯酸丁酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的納米膠乳10的制備。
[0284] 采用與實(shí)施例2相同的方法制備該納米膠乳。header中的內(nèi)容物為：丙烯酸丁酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氫鈉(0.13)和蒸餾水(78.38g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、碳酸氫鈉(0.06)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。該膠乳于14K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)以獲得含4.32％固體的澄清乳液263g。準(zhǔn)彈性光散射的體積平均直徑為24.56nm，變異系數(shù)0.29。
[0285] 實(shí)施例21：承載染料1的納米膠乳1
[0286] 在暗光環(huán)境下通過(guò)以下步驟制備0.2784％w/w的染料儲(chǔ)備液：將0.0280g染料1溶解于足量的四氫呋喃中得到重量為24.5244g的最終溶液。將1.4365g部分染料溶液加至細(xì)頸瓶中，并用四氫呋喃稀釋至最終重量為10.0g。將9.9960g膠乳1加入細(xì)頸瓶中并在
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將溶液
汽提至約40-50體積％。用3-5ml蒸餾水洗兩次進(jìn)一步去除剩余的四氫呋喃，汽提1/4至1/3的揮發(fā)物。得到含有4.27％固體的承載的膠乳(LL-1A)9.4069g，-3每克固體膠乳含有3.94×10 mol染料。另外三個(gè)具有更高承載量的樣品(LL-IB、1C、ID)選用下表的試劑量用同樣的方法制備：
[0287] 表4：承載染料1的納米膠乳1
[0288]承載的 染料溶液 納米膠乳 最終重量 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳名稱 (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
(mol/L) (％w/w)
LL-1A 1.4365 9.9960 9.4069 3.94×10-3 4.27
LL-1B 1.9153 10.1257 7.0755 4.95×10-3 5.76
LL-1C 2.3942 10.0720 11.5965 6.49×10-3 3.50
LL-1D 2.8730 10.0135 10.4086 7.65×10-3 3.88
[0289] 實(shí)施例22：承載染料2的納米膠乳1
[0290] 在暗光環(huán)境下通過(guò)以下步驟制備0.0919％w/w的染料儲(chǔ)備液：將0.0138g染料2溶解于足量的四氫呋喃中得到重量為15.0239g的最終溶液。采用實(shí)施例12所述方法制備在棕色細(xì)頸瓶中從納米膠乳1制備承載的膠乳L(zhǎng)L-2A和2B。為了將膠乳漿轉(zhuǎn)為磷酸緩沖鹽水，向下面列舉量的每一個(gè)樣品中加入部分鹽混合物(NaCl137份、KCl2.7份、Na2HPO410份、KH2PO42份)。
[0291] 表5：承載染料2的納米膠乳1
[0292]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-2A 0.3076 10.0642 4.6215 0.0459 1.51×10-3 6.63
LL-2B 1.1953 10.0268 7.0755 0.0831 5.89×10-3 3.66
[0293] 實(shí)施例23：承載染料3的納米膠乳4
[0294] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳4制備承載的膠乳L(zhǎng)L-3A和3B。將0.0296g染料3溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為29.8012g的染料儲(chǔ)備液(0.0903％w/w)。
[0295] 表6：承載染料2的納米膠乳4
[0296]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-3A 1.9627 10.0185 9.4467 0.0938 4.97×10-3 3.45％
-3
LL-3B 3.9254 10.0014 9.3620 0.0930 1.01×10 3.50％
[0297] 實(shí)施例24：承載染料1的納米膠乳2
[0298] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳2制備承載的膠乳L(zhǎng)L-4A、4B和4C。將0.0101g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為25.1201g的染料儲(chǔ)備液(0.0402％w/w)。
[0299] 表7：承載染料1的納米膠乳2
[0300]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-4A 3.9146 10.0451 10.9030 0.1083 4.99×10-3 3.56％
LL-4B 5.2195 10.0267 10.5013 0.1043 5.00×10-3 3.69％
LL-4C 6.5243 10.0238 10.1695 0.1010 4.97×10-3 3.81％
[0301] 實(shí)施例25：承載染料6的納米膠乳3
[0302] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳3制備承載的膠乳L(zhǎng)L-5A。將0.0087g染料6溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為24.3270g的染料儲(chǔ)備液(0.0358％w/w)。
[0303] 表8：承載染料6的納米膠乳3
[0304]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-5A 6.0514 10.0812 10.9062 0.1083 4.93×10-3 5.34％
[0305] 實(shí)施例26：承載染料7的納米膠乳3
[0306] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳3制備承載的膠乳L(zhǎng)L-6A。將0.0096g染料7溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為24.9403g的染料儲(chǔ)備液(0.0385％w/w)。
[0307] 表9：承載染料7的納米膠乳3
[0308]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
-3
LL-6A 4.5138 10.0472 10.6326 0.1056 4.99×10 5.46％
[0309] 實(shí)施例27：承載染料1的納米膠乳6
[0310] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳6制備承載的膠乳L(zhǎng)L-7A、7B和7C。將0.0197g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為28.4269g的染料儲(chǔ)備液(0.0693％w/w)。
[0311] 表10：承載染料1的納米膠乳6
[0312]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-7A 1.9231 10.0733 10.1517 0.1008 4.96×10-3 3.25％
LL-7B 3.8463 10.0458 10.2093 0.1414 9.94×10-3 3.23％
LL-7C 5.7694 10.0434 10.2493 0.1018 1.48×10-2 323％
[0313] 實(shí)施例28：承載染料9的納米膠乳6
[0314] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳6制備承載的膠乳L(zhǎng)L-8A、8B和8C。將0.0096g染料9溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為24.9403g的染料儲(chǔ)備液(0.0385％w/w)。
[0315] 表11：承載染料9的納米膠乳6
[0316]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-8A 2.7393 10.0427 10.8418 0.1077 5.02×10-3 5.35％
LL-8B 8.1328 10.0048 10.4790 0.1041 1.49×10-2 5.56％
[0317] 實(shí)施例29：承載染料4的納米膠乳6
[0318] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳6制備承載的膠乳L(zhǎng)L-9A和9B。將0.0200g染料4溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為21.9372g的染料儲(chǔ)備液(0.0912％w/w)。
[0319] 表12：承載染料4的納米膠乳6
[0320]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-9A 3.0311 10.0935 10.2335 0.1016 4.98×10-3 5.71％
LL-9B 9.0000 10.0165 10.5145 0.1044 1.48×10-2 5.57％
[0321] 實(shí)施例30：承載染料5的納米膠乳3
[0322] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳3制備承載的膠乳L(zhǎng)L-11A。將0.0075g染料5溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為30.0000g的的染料儲(chǔ)備液(0.0250％w/w)。
[0323] 表13：承載染料5的納米膠乳3
[0324]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
-3
LL-10A 6.8762 10.0645 10.1517 0.1008 4.99×10 5.73％
[0325] 實(shí)施例31：承載染料1的納米膠乳3
[0326] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳3制備承載的膠乳L(zhǎng)L-12A。將0.0197g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備終溶液重量為28.4269g的染料儲(chǔ)備液(0.0693％w/w)。
[0327] 表14：承載染料1的納米膠乳3
[0328]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
LL-11A 4.0788 10.3676 10.6559 0.1058 5.76×10-3 5.63％
[0329] 實(shí)施例32：連接承載的膠乳L(zhǎng)L-7A至生物素靶向結(jié)構(gòu)部分
[0330] 向1ml承載染料的膠乳樣品LL-7A中加入5mlPBS緩沖液，隨后加入5mgNHS-PEG-生物素(MW5000，Nektar)。避光攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用YM-30(Millipore)過(guò)濾器過(guò)濾溶液，并用PBS緩沖液洗滌4次。包括沒(méi)有承載染料的膠乳對(duì)比樣品。
[0331] 進(jìn)行如下的HABA/抗生物素蛋白替換結(jié)合分析以確定連接在染料承載納米膠乳表面的生物素的量。方法如下：在1cm黑壁樣品池中將HABA/抗生物素蛋白分析預(yù)混料(Pierce Biotechnology)溶解于800μLPBS緩沖液中。記錄在500nm處的吸收度。然后將100μL連接了生物素的承載染料的納米膠乳樣品加入樣品池中，15分鐘后重新測(cè)定500nm處的吸光度。用容積校正后的吸收差異測(cè)定生物素連接的量。每毫克承載染料的納米膠乳樣品上連接約80μg生物素。
[0332] 對(duì)比實(shí)施例1：承載染料1的苯乙烯納米膠乳7
[0333] 以實(shí)施例12所述方法和下表的試劑量從納米膠乳7制備對(duì)比的承載的膠乳CLL-1A。將0.0795g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備溶液終重量為28.5549g的染料儲(chǔ)備液(0.2784％w/w)。
[0334] 表15：承載染料1的苯乙烯納米膠乳7
[0335]承載 染料溶液 納米膠乳7 最終重量 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
CLL-1A 0.4783 10.0571 12.8983 4.77×10-3 2.65％
[0336] 對(duì)比實(shí)施例2：承載染料1的苯乙烯納米膠乳8
[0337] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳8制備對(duì)比的承載的膠乳CLL-2A。將0.0100g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備溶液終重量為28.5743g的染料儲(chǔ)備液(0.0350％w/w)。
[0338] 表16：承載染料1的苯乙烯納米膠乳8
[0339]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
CLL-2A 4.7661 10.0018 10.6570 0.1058 4.98×10-3 3.84％
[0340] 對(duì)比實(shí)施例3：承載染料1的甲基丙烯酸甲酯納米膠乳9
[0341] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳9制備對(duì)比的承載的膠乳CLL-3A。將0.0100g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備溶液終重量為28.5743g的染料儲(chǔ)備液(0.0350％w/w)。
[0342] 表17：承載染料1的甲基丙烯酸甲酯納米膠乳8
[0343]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
CLL-3A 4.3785 10.0418 9.7027 0.0964 4.97×10-3 3.89％
[0344] 對(duì)比實(shí)施例4：承載染料1的丙烯酸丁酯納米膠乳10
[0345] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳10制備對(duì)比的承載的膠乳CLL-4A。將0.0100g染料1溶解于足量的四氫呋喃中制備溶液終重量為28.5743g的染料儲(chǔ)備液(0.0350％w/w)。
[0346] 表18：承載染料1的丙烯酸丁酯納米膠乳10
[0347]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
CLL-4A 5.0465 10.3420 9.8740 0.0981 4.79×10-3 4.54％
[0348] 對(duì)比實(shí)施例5：承載染料8的納米膠乳3
[0349] 以實(shí)施例13所述方法和下表的試劑量從納米膠乳3制備對(duì)比的承載的膠乳CLL-5A。將0.0075g染料8溶解于足量的四氫呋喃中制備溶液終重量為24.4668g的染料儲(chǔ)備液(0.0307％w/w)。
[0350] 表19：承載染料8的納米膠乳3
[0351]承載 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
名稱 (mol/L) (％w/w)
CLL-5A 4.0794 10.0272 10.5456 0.1047 4.35×10-3 5.49％
[0352] 實(shí)施例24：熒光相對(duì)量子產(chǎn)率的測(cè)定
[0353] 熒光相對(duì)量子產(chǎn)率的測(cè)定詳見(jiàn)HORIBA Jobin Yvon ApplicationNote，“A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields”(可從英國(guó)米德?tīng)柸怂箍oriba Jobin Yvon獲得)。
[0354] 用磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4)體積稀釋染料承載的膠乳水分散液以獲得一系列-7 -8染料濃度范圍在10 -10 mol/L的溶液，這樣在1cm徑長(zhǎng)范圍內(nèi)它們的吸收最大峰值不超過(guò)
0.1。一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度(參比)染料由以下方法制備：首先在室溫條件下將固體染料溶解在-7 -8
光譜級(jí)甲醇中，然后用PBS緩沖液稀釋甲醇染料溶液以形成范圍在10 -10 mol/L的染料濃度系列。最終染料溶液的甲醇含量通常小于1％。
[0355] 所有的稀釋過(guò)程均在避光的條件下完成，且樣品置于琥珀色圓底旋蓋離心管中儲(chǔ)藏使光分解最小化。所有的樣品均在稀釋后數(shù)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。
[0356] 將染料溶液置于5cm的帶塞樣品池中，使用Perkin Elmer Lambda900UV/VIS/NIR分光計(jì)測(cè)量吸收度。染料的吸收強(qiáng)度在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)，該激發(fā)波長(zhǎng)用于溶劑-去除和基線-歸零吸收譜的熒光測(cè)量。所測(cè)得的吸收值轉(zhuǎn)化為用于RQY測(cè)定的相當(dāng)于1cm徑長(zhǎng)樣品池的值。
[0357] 1cm徑長(zhǎng)樣品池染料溶液的熒光譜用SPEX fluorolog 16800.22m雙分光計(jì)的光-角檢測(cè)模式記錄。設(shè)備的參數(shù)設(shè)置和用于本發(fā)明和參比染料的激發(fā)波長(zhǎng)都是優(yōu)選的，且對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是相同的。每個(gè)染料樣品的基線-解析熒光譜對(duì)溶劑影響和儀器反應(yīng)特征作為發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)進(jìn)行校正，測(cè)量了積分熒光強(qiáng)度。
[0358] 將每個(gè)染料樣品的積分熒光強(qiáng)度作為在想要激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量的吸收度(1cm徑長(zhǎng)當(dāng)量)的函數(shù)繪制出來(lái)。所得的F/A圖與零截距呈線性，回歸系數(shù)大于0.97。F/A圖的斜率與染料的熒光量子產(chǎn)率呈正比。本發(fā)明染料的斜率然后歸一化至用于參比染料染料的斜率值，以得到本發(fā)明染料的“歸一化的RQY”公制值。該數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。
[0359] 上表數(shù)據(jù)證明與親水性染料結(jié)構(gòu)類似物直接溶解在PBS緩沖液中相比，用疏水
近紅外染料承載并分散在PBS緩沖液中的納米膠乳顆粒的熒光量子產(chǎn)率獲得了顯著改進(jìn)(實(shí)施例17、LL-6A對(duì)染料12，實(shí)施例18、LL-7A對(duì)染料11，實(shí)施例22、LL-11A對(duì)染料11)。
[0360] 上表數(shù)據(jù)還證明與溶于有機(jī)溶劑(如甲醇)中的同樣疏水染料相比，用疏水近紅外染料承載并分散在PBS緩沖液中的納米膠乳顆粒的熒光量子產(chǎn)率獲得了顯著改進(jìn)(實(shí)施例16、LL-5A對(duì)染料6和實(shí)施例17、LL-6A對(duì)染料7)。
[0361] 上表數(shù)據(jù)還證明與親水性近紅外熒光團(tuán)、靛青綠相比，用不同結(jié)構(gòu)的疏水近紅外染料(碳菁、偶氮-氟硼二吡咯和酞青)承載并分散在PBS緩沖液中的納米膠乳顆粒的熒光量子產(chǎn)率液獲得了顯著改進(jìn)(實(shí)施例13、LL-2A對(duì)染料10，實(shí)施例14、LL-3A對(duì)染料10、實(shí)施例15、LL-4A對(duì)染料10，實(shí)施例19、LL-8A對(duì)染料10)。
[0362] 上表數(shù)據(jù)還證明用碳菁承載的納米膠乳顆粒的熒光量子產(chǎn)率能通過(guò)增加二-N-烷基疏水部分尺寸得以改善(對(duì)比實(shí)施例5、染料8承載的CLL-5A對(duì)比染料1承載的LL-11A)。
[0363] 上表數(shù)據(jù)還證明甲基丙烯酸甲氧基乙基酯單體衍生的網(wǎng)格與苯乙烯(對(duì)比實(shí)施例1和2)、甲基丙烯酸甲酯(對(duì)比實(shí)施例3)或丙烯酸丁酯(對(duì)比實(shí)施例4)單體衍生的網(wǎng)格相比，用近紅外親水性染料承載的納米膠乳顆粒的熒光量子產(chǎn)率得到顯著改善。
[0364] 表20承載的膠乳的相對(duì)量子產(chǎn)率
[0365]本發(fā)明 承載染料的膠乳染料承載染料的 參比的染料溶液
實(shí)施例 膠乳名稱 膠乳“歸一化
RQY”
12 LL-1A 1 20 PBS中的染料10
LL-1B 1 20
LL-1C 1 19
LL-1D 1 19
13 LL-2A 2 16 PBS中的染料10
LL-2B 2 12
14 LL-3A 3 21 PBS中的染料10
LL-3B 3 18
15 LL-4A 1 22 PBS中的染料10
LL-4B 1 20
LL-4C 1 21
16 LL-5A 6 1.7 甲醇中的染料6
17 LL-6A 7 1.6 甲醇中的染料7
17 LL-6B 7 1.3 PBS中的染料12
18 LL-7A 1 22 PBS中的染料10
LL-7A 1 2.1 PBS中的染料11
LL-7B 1 19
LL-7C 1 13
19 LL-8A 9 16 PBS中的染料10
LL-8B 13
20 LL-9A 4 16 PBS中的染料10
LL-9B 11
21 LL-10A 5 20 PBS中的染料10
22 LL-11A 1 22 PBS中的染料10
LL-11B 1 2.1 PBS中的染料11
對(duì)比1 CLI-1A 1 0.6 LL-11A
對(duì)比2 CLI-2A 1 0.7 LL-11A
對(duì)比3 CLI-3A 1 0.8 LL-11A
對(duì)比4 CLI-4A 1 0.7 LL-11A
對(duì)比5 CLI-5A 8 0.5 LL-11A
[0366] 在實(shí)施例33中，通式中的R2是由甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(R2＝用于納米膠乳X和X1的甲基)、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯(R2＝用于納米膠乳X2的乙基)、甲基丙烯酸丁氧基乙基酯(R2＝用于納米膠乳X3的丁基)、甲基丙烯酸苯氧基乙基酯(R2＝用于納米膠乳X4的苯基)制備的各種聚合物。表格中顯示不同的
納米粒子具有類似的尺寸和聚合分散性。表中顯示不同R2基團(tuán)具有類似的熒光量子產(chǎn)率。
[0367] 實(shí)施例33.制備用于比較研究的甲基丙烯酸烷氧乙基酯膠乳的通用方法[0368] 用于研究的納米膠乳X含有甲基丙烯酸烷氧乙基酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和實(shí)施例1中端氨基聚乙二醇大分子單體(氨基-PEGMA)(50％)。
[0369] 采用實(shí)施例2描述的相同方法制備納米膠乳X1-X4。header中的內(nèi)容物為：甲基丙烯酸烷氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量為乙基苯乙烯異構(gòu)體的純度80％的異構(gòu)體混合物)、聚乙二醇單甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氫鈉(0.06g)和蒸餾水(78.38g)。反應(yīng)器中有蒸餾水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亞甲基異丁基脒)二鹽酸鹽(0.06g)、碳酸氫鈉(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。將膠乳用100cc Dowex88離子交換樹(shù)脂處理2次，于14K的尺寸截?cái)嗄ぶ型肝?8小時(shí)，用約
50cc Dowex50Wx4離子交換樹(shù)脂處理(轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽形式并用蒸餾水洗滌3次)以獲得澄清乳液。
[0370] 表21 R2對(duì)粒子尺寸(Dv)和聚合分散性(CV)的影響
[0371]納米膠乳 烷氧基乙基單體 PEG單體 ％固體 Dv(nm) CV
X 甲基丙烯酸甲氧基 氨基 3.98 21.2 0.37
乙基酯 -PEGMA
45％ 50％
X1 甲基丙烯酸甲氧基 PEGMA 4.17 14.6 0.20
乙基酯 50％
45％
X2 甲基丙烯酸乙氧基 PEGMA 3.76 18.2 0.23
乙基酯 50％
45％
X3 甲基丙烯酸丁氧基 PEGMA 3.44 17.5 0.22
乙基酯 50％
45％
X4 甲基丙烯酸苯氧基 PEGMA 3.98 16.9 0.19
乙基酯 50％
45％
[0372] 實(shí)施例34承載染料1的甲基丙烯酸烷氧乙基酯膠乳
[0373] 在暗光環(huán)境下通過(guò)以下步驟制備0.0440％w/w的染料儲(chǔ)備液：將0.0132g染料1溶解于足量的四氫呋喃中得到最終溶液重量為30.00g的染料儲(chǔ)備液。采用實(shí)施例12所述方法和下表所列試劑量在棕色細(xì)頸瓶中從納米膠乳X-X4制備承載的膠乳。為了將膠乳漿轉(zhuǎn)為磷酸緩沖鹽水，向下面列舉量的每一個(gè)樣品中加入部分鹽混合物(NaCl137份、KCl2.7份、Na2HPO410份、KH2PO42份)。
[0374] 表22 不同R2基團(tuán)的熒光染料承載的膠乳制劑
[0375]承載的 染料溶液 納米膠乳 最終重量 緩沖鹽 固體膠乳中 終產(chǎn)物
膠乳名 (g) (g) (g) (g) 染料濃度 固體％
稱 (mol/L) (％w/w)
(R2)
-3
LL-X 2.950 10.22 10.23 0 4.89×10 3.18
(甲基)
LL-X1 3.881 10.017 10.20 0.101 4.98×10-3 4.11
(甲基)
LL-X2 3.418 10.089 9.27 0.094 4.83×10-3 4.11
(乙基)
LL-X3 3.200 10.060 9.45 0.094 4.96×10-3 3.68
(丁基)
LL-X4 3.793 10.756 10.27 0.106 4.75×10-3 4.03
(苯基)
[0376] 表23.R2基團(tuán)對(duì)熒光量子產(chǎn)率的影響
[0377]本發(fā)明 染料承載的 膠乳染料 承載染料的膠 參考的染料溶液
實(shí)施例 膠乳名稱 乳“歸一化
RQY”
XX LL-X 1 22 PBS中的染料10
(甲基)
XX LL-X1 1 21 PBS中的染料10
(甲基)
XX LL-X2 1 22 PBS中的染料10
(乙基)
XX LL-X3 1 21 PBS中的染料10
(丁基)
XX LL-X4 1 21 PBS中的染料10
(苯基)
[0378] 實(shí)施例35：光穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
[0379] 取同等體積的在PBS緩沖液中的染料1承載的膠乳分散液和在PBS緩沖液中的染料11(都含0.45mmole/L染料)置于半透明Nalgene HDPE瓶中。用長(zhǎng)頂
熒光燈(Dazor Manufacturing Corporation制造，配有2個(gè)Sylvania4100K，F(xiàn)15T8/CW15W熒光“冷白“
燈泡)在大約2kLux光強(qiáng)下連續(xù)照射約30小時(shí)。用Perkin Elmer Lambda900UV/VIS/NIR分光計(jì)在5cm長(zhǎng)度的帶塞樣品池測(cè)定染料最大λ處的光吸收減少對(duì)時(shí)間的函數(shù)。
[0380] 在PBS緩沖液中的染料1承載的膠乳分散液LL-1A的染料光退色(吸光率損失)的一級(jí)速率常數(shù)2.8倍慢于在PBS緩沖液中的染料11的一級(jí)速率常數(shù)。
[0381] 實(shí)施例36避光穩(wěn)定性評(píng)估
[0382] 取同等體積的在PBS緩沖液中的染料1承載的膠乳分散液LL-1A和在PBS緩沖液中的染料11(5cm長(zhǎng)度的帶塞樣品池中的“零時(shí)“吸收值均為0.37)在室溫下儲(chǔ)存置于帶塞Nalgene瓶中。按照一定間隔移去等分量并用Perkin Elmer Lambda 900UV/VIS/NIR分光計(jì)測(cè)定染料最大λ處光密度。
[0383] 測(cè)定在λ-max染料光譜吸收的減少對(duì)“黑暗儲(chǔ)存”時(shí)間的函數(shù)。在PBS緩沖液中的染料1承載的膠乳分散液LL-1A的染料光退色(吸光率的損失)的一級(jí)速率常數(shù)1.7倍慢于在PBS緩沖液中的染料11的一級(jí)速率常數(shù)。
[0384] 實(shí)施例37.將承載的膠乳L(zhǎng)L1A與山羊抗兔二級(jí)抗體綴合
[0385] A.連接子修飾的承載硫代-SMCC
[0386]
[0387] 1)取2.2ml LL1A膠乳溶液并加入1.1ml PBS緩沖液(7.4)。
[0388] 2)將7.3mg硫代-SMCC(Pierce Biotechnology)溶于73μl DMSO中，并加入上述膠乳溶液。
[0389] 3)在渦旋或攪拌的條件下反應(yīng)1小時(shí)。
[0390] 4)將反應(yīng)液倒入YM-30離心超濾管(Millipore)中，加入大量PBS緩沖液(約15ml)，然后離心超濾除去過(guò)量的連接子。離心過(guò)濾后，膠乳溶液應(yīng)為約700μL。通常需要進(jìn)行2-3次離心過(guò)濾。(由15ml開(kāi)始且最后約700μl)。
[0391] B.二級(jí)抗體連接子修飾
[0392] 5)稱取12mg DTT(二硫代蘇糖醇)，將其溶于100uL含1mMEDTA(
乙二胺四乙酸)的PBS緩沖溶液，pH7.4。
[0393] 6)將1mg二級(jí)抗體(山羊抗兔)溶于500μl(濃度2mg/mL)含1mMEDTA的PBS緩沖溶液，pH7.4。
[0394] 7)向抗體溶液中加入5uL DTT溶液，攪拌反應(yīng)1小時(shí)。
[0395] 8)用YM-30過(guò)濾器將過(guò)量的DTT從樣品中過(guò)濾，用含1mM EDTA的PBS緩沖溶液，pH7.4洗三次。最后一次洗滌樣品量小于1mL。
[0396] C.承載的膠乳-抗體綴合物的形成
[0397] 9)將功能化-連接子的承載的膠乳溶液與DTT修飾的抗體溶液混合，在超過(guò)4℃室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。
[0398] 實(shí)施例38.用承載的膠乳-抗體綴合物檢測(cè)蛋白的試驗(yàn)
[0399] 在一小
塊硝化纖維上點(diǎn)上靶向兔蛋白，放置15min。所制備的載物片用5％blotto的PBS溶液處理30min并用新鮮的PBS溶液洗滌。
[0400] 用含有5％blotto乳液的10ml PBS緩沖液(pH7.4)稀釋承載的膠乳-綴合的抗體(100μl通過(guò)步驟9制備的溶液)。將該稀釋液與待測(cè)硝化纖維一起震蕩30min，然后用新鮮的PBS緩沖液洗滌。將硝化纖維條帶置于柯達(dá)成像工作站MM4000中，并暴露1分鐘以記錄熒光(720nm激發(fā)光40nm帶通過(guò)過(guò)濾器/790發(fā)射光40nm帶通過(guò)過(guò)濾器)。如圖1所示，硝化纖維條帶的亮斑顯示了承載標(biāo)記抗體綴合物與被斑點(diǎn)化兔蛋白的結(jié)合率水平非常低，因此容易檢測(cè)到靶向蛋白的存在。
