組織生成的方法
專利匯可以提供組織生成的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法。在一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物。在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物和至少一種包含細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組合物。在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物、至少一種包含細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組合物、和至少一種其他附加組分。，下面是組織生成的方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種形成三維組織的方法，包括將至少一種細(xì)胞組合物和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積在受試者體內(nèi)或體表的表面上。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物和所述ECM均被沉積在所述表面上。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物和所述ECM均被打印在所述表面上。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述表面是人造表面。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述人造表面是假體裝置或結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述表面是脫細(xì)胞組織或脫細(xì)胞器官。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面是在所述受試者外部之上的表面。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面是在所述受試者內(nèi)部之內(nèi)的表面。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述表面是在所述受試者體腔、骨、或器官之內(nèi)的表面。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，包括掃描所述受試者體內(nèi)或體表的所述表面，以形成表面地圖，并利用所述表面地圖指導(dǎo)所述沉積。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述掃描包括使用激光、電子束、磁共振成像、微波、或計(jì)算機(jī)斷層掃描。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述ECM包含哺乳動(dòng)物ECM、軟體動(dòng)物ECM、魚類ECM、和或植物ECM。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物ECM是胎盤ECM。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述ECM包含端肽胎盤膠原。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述端肽胎盤膠原包含堿處理的、去垢劑處理的I型端肽胎盤膠原。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其中，所述膠原未被化學(xué)修飾或與蛋白酶接觸。
17.權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述胎盤ECM包含未被化學(xué)修飾或與蛋白酶接觸的堿處理的和/或去垢劑處理的I型端肽胎盤膠原，其中所述ECM包含按重量計(jì)少于5％的纖連蛋白或少于5％的層粘連蛋白；按重量計(jì)在25％-92％之間的I型膠原；和按重量計(jì)
2％-50％的III型膠原或2％-50％的IV型膠原。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述胎盤ECM包含未被化學(xué)修飾或與蛋白酶接觸的堿處理的和/或去垢劑處理的I型端肽胎盤膠原，其中所述ECM包含按重量計(jì)少于1％的纖連蛋白或少于1％的層粘連蛋白；按重量計(jì)在74％和92％之間的I型膠原；和按重量計(jì)
4％-6％的III型膠原或2％-15％的IV型膠原。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括水凝膠的沉積。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述水凝膠是熱敏水凝膠。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述水凝膠是光敏水凝膠。
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ECM和所述水凝膠以按重量計(jì)約
10:1至1:10的比例組合。
23.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括合成聚合物的沉積。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述合成聚合物是熱敏的。
25.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述合成聚合物是光敏的。
26.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述合成聚合物包含熱塑性聚合物。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述合成聚合物是聚(L-丙交酯-共-乙交酯)
(PLGA)。
28.權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述熱塑性聚合物是聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸、聚對(duì)苯二甲酸丁二酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚乙酸乙烯酯、或聚氯乙烯。
29.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述合成聚合物是聚丙烯酰胺、聚偏二氯乙烯、聚(鄰-羧基苯氧基)-對(duì)二甲苯)(聚(o-CPX))、聚(丙交酯-酸酐)(PLAA)、n-異丙基丙烯酰胺、季戊四醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纖維素、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
30.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括腱生蛋白C或其片段的沉積。
31.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括鈦-鋁-釩(Ti6Al4V)組合物的
沉積。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述鈦-鋁-釩組合物以纖維的連通多孔網(wǎng)絡(luò)的形式進(jìn)行沉積。
33.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述在所述沉積之前將端肽膠原衍生化。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述端肽膠原用細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞粘附蛋白、細(xì)胞因子、或葡萄糖氨基聚糖中的一種或多種進(jìn)行衍生化。
35.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述ECM包含細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞粘附蛋白、細(xì)胞因子、或葡萄糖氨基聚糖或用細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞粘附蛋白、細(xì)胞因子、或葡萄糖氨基聚糖進(jìn)行衍生化。
36.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、或骨形成蛋白(BMP)。
37.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述細(xì)胞粘附肽是包含一個(gè)或多個(gè)RGD基序的細(xì)胞響應(yīng)肽。
38.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)。
39.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含組培塑料貼壁CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盤干細(xì)胞。
– – –
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述胎盤干細(xì)胞另外還是CD45 、CD80 、CD86 、或+
CD90中的一種或多種。
– – –
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述胎盤干細(xì)胞另外還是CD45 、CD80 、CD86 、和+
CD90。
42.權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述胎盤干細(xì)胞在所述受者中抑制免疫反應(yīng)。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述胎盤干細(xì)胞在所述受者中局部抑制免疫反應(yīng)。
44.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、組織塑料貼壁胎盤干細(xì)胞(PDACs)、臍帶干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、羊膜來源的貼壁細(xì)胞(AMDACs)、成骨胎盤貼壁細(xì)胞(OPACs)、脂肪干細(xì)胞、角膜緣干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞、脫落牙齒來源的干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、真皮干細(xì)胞、單性生殖來源干細(xì)胞、重編程干細(xì)胞、羊膜來源的貼壁細(xì)胞、或側(cè)群干細(xì)胞。
45.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含分化的細(xì)胞。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述分化的細(xì)胞包含內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、和/或基質(zhì)細(xì)胞。
47.權(quán)利要求45的方法，其中，所述分化的細(xì)胞是唾液腺粘液細(xì)胞、唾液腺漿液細(xì)胞、von Ebner's腺細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淚腺細(xì)胞、耵聹腺細(xì)胞、外分泌汗腺暗細(xì)胞、頂泌汗腺細(xì)胞、墨氏腺細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、鮑曼氏腺細(xì)胞、十二指腸腺細(xì)胞、精囊細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、尿道球腺細(xì)胞、巴多林氏腺細(xì)胞、利特雷氏腺細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、分離的杯狀細(xì)胞、胃粘膜粘液細(xì)胞、胃腺酶原細(xì)胞、胰腺腺泡細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞，生長(zhǎng)激素細(xì)胞、乳促素細(xì)胞、促甲狀腺細(xì)胞、促性腺細(xì)胞、促皮質(zhì)激素細(xì)胞、中間垂體細(xì)胞、大細(xì)胞神經(jīng)分泌細(xì)胞、腸細(xì)胞、呼吸道細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、副濾泡細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞、黃體細(xì)胞、粒層黃體細(xì)胞、黃體膜細(xì)胞、近腎小球細(xì)胞、致密斑細(xì)胞、極周細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞，血管和淋巴血管內(nèi)皮有窗孔細(xì)胞、血管和淋巴血管內(nèi)皮連續(xù)細(xì)胞、血管和淋巴血管內(nèi)皮脾細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、漿膜細(xì)胞(腹膜、胸膜、和心包腔)、鱗狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、暗細(xì)胞、前庭膜細(xì)胞(耳膜內(nèi)淋巴空間)、血管紋基底細(xì)胞、血管紋邊緣細(xì)胞(耳膜內(nèi)淋巴空間)、克勞氏細(xì)胞、伯特謝爾細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、軟膜蛛網(wǎng)膜鱗狀細(xì)胞、色素睫狀體上皮細(xì)胞。非色素睫狀體上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、栓細(xì)胞，
呼吸道纖毛細(xì)胞、輸卵管纖毛細(xì)胞、子宮內(nèi)膜纖毛細(xì)胞、睪丸網(wǎng)纖毛細(xì)胞、輸出精小管纖毛細(xì)胞、纖毛室管膜細(xì)胞，
表皮角質(zhì)細(xì)胞、表皮基底細(xì)胞、指甲和趾甲的角質(zhì)細(xì)胞、甲床基底細(xì)胞、髓質(zhì)毛干細(xì)胞、皮質(zhì)毛干細(xì)胞、角質(zhì)毛干細(xì)胞、角質(zhì)毛根鞘細(xì)胞、赫胥黎氏層毛根鞘細(xì)胞、亨利氏層毛根鞘細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞、毛基質(zhì)細(xì)胞，
復(fù)層鱗狀上皮的表面上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞基底細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞，
螺旋器的聽覺內(nèi)毛細(xì)胞、螺旋器的聽覺外毛細(xì)胞、嗅上皮基底細(xì)胞、冷敏感的初級(jí)感覺神經(jīng)元、熱敏感的初級(jí)感覺神經(jīng)元、上皮梅克爾細(xì)胞、嗅感覺神經(jīng)元、疼痛敏感初級(jí)感覺神經(jīng)元、視桿細(xì)胞、藍(lán)色敏感視錐細(xì)胞、紅色敏感視錐細(xì)胞、本體感受初級(jí)神經(jīng)元、I型頸動(dòng)脈體細(xì)胞、II型頸動(dòng)脈體細(xì)胞(血液pH傳感器)、I型耳前庭器毛細(xì)胞(加速度和重力)、II型耳前庭器毛細(xì)胞、I型味蕾細(xì)胞，
類膽堿神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞、肽能神經(jīng)細(xì)胞，
螺旋器的內(nèi)柱細(xì)胞、螺旋器的外柱細(xì)胞、螺旋器的內(nèi)指細(xì)胞、螺旋器的外指細(xì)胞、螺旋器的邊緣細(xì)胞、螺旋器的漢森細(xì)胞、前庭器支持細(xì)胞、味蕾支持細(xì)胞、嗅上皮支持細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、腸膠質(zhì)細(xì)胞，
星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、寡樹突膠質(zhì)細(xì)胞、紡錘體神經(jīng)元，
前晶狀體上皮細(xì)胞、含晶狀體蛋白的晶狀體纖維細(xì)胞，
肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、白色脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞、肝臟脂肪細(xì)胞，
腎臟腎小球壁細(xì)胞、腎臟腎小球足細(xì)胞、腎臟近端小管刷狀邊緣細(xì)胞、細(xì)尿管袢薄段細(xì)胞、腎臟遠(yuǎn)端小管細(xì)胞、腎臟集尿管細(xì)胞、I型肺泡細(xì)胞、胰管細(xì)胞、非紋狀管細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、腸刷狀邊緣細(xì)胞、外分泌腺紋狀管細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞、輸出精小管非纖毛細(xì)胞、附睪主細(xì)胞、附睪基底細(xì)胞，
成釉細(xì)胞上皮細(xì)胞、半月面上皮細(xì)胞、螺旋器齒間上皮細(xì)胞、疏松結(jié)締組織成纖維細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞、肌腱成纖維細(xì)胞、骨髓網(wǎng)狀組織成纖維細(xì)胞、非上皮成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、髓核細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞/牙骨質(zhì)細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞、牙質(zhì)細(xì)胞、透明軟骨軟骨細(xì)胞、彈性軟骨軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、體細(xì)胞、星形細(xì)胞(耳)、肝星形細(xì)胞(Ito細(xì)胞)、胰腺stelle細(xì)胞，
紅色骨骼肌細(xì)胞、白色骨骼肌細(xì)胞、中間骨骼肌細(xì)胞、肌梭核袋細(xì)胞、肌梭核鏈細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、普通心肌細(xì)胞、結(jié)節(jié)心肌細(xì)胞、浦肯野纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、虹膜肌上皮細(xì)胞、外分泌腺肌上皮細(xì)胞，
網(wǎng)織紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、結(jié)締組織巨噬細(xì)胞、表皮朗格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，
黑色素細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，
卵原細(xì)胞/卵母細(xì)胞、精細(xì)胞、精母細(xì)胞、精原細(xì)胞、精子、卵泡細(xì)胞、塞爾托利細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞、和/或間質(zhì)性腎細(xì)胞。
48.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物中的細(xì)胞是原代培養(yǎng)細(xì)胞。
49.權(quán)利要求1-48中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物中的細(xì)胞是已在體外培養(yǎng)的細(xì)胞。
50.權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述細(xì)胞已經(jīng)傳代至少一次。
51.權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述細(xì)胞已經(jīng)傳代不超過六次。
52.權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述細(xì)胞是來自所述受試者的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中，制備所述受試者體內(nèi)或體表的所述表面以便于所述沉積。
54.權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞已被基因工程化以產(chǎn)生并非由所述細(xì)胞天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，或者被基因工程化從而以大于由所述細(xì)胞天然產(chǎn)生量的量產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽，其中所述細(xì)胞組合物包含分化的細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)或多肽是細(xì)胞因子或包含其活性部分的肽。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(Ang)、骨形成蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、紅細(xì)胞生成素(Epo)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GNDF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長(zhǎng)分化因子(GDF-9)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝細(xì)胞瘤源性生長(zhǎng)因子(HDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、促移行因子、肌肉生長(zhǎng)抑制素(GDF-8)、髓單核細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、促血小板生成素(Tpo)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、TGF-β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、或Wnt蛋白。
57.權(quán)利要求55或權(quán)利要求56所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)
6
培養(yǎng)基中，1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述細(xì)胞因子。
58.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)或多肽是AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、GNDF、G-CSF、GM-CSF、GDF-9、HGF、HDGF、IGF、促移行因子、GDF-8、MGF、NGF、PlGF、PDGF、Tpo、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、或Wnt蛋白的可溶性受體。
59.權(quán)利要求58所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM所述可溶性受體。
60.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是白介素。
61.權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述白介素是白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaα亞基、IL-1240kDaβ亞基、IL-12α和β亞基二者、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同種型1、IL-17F同種型2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19亞基、IL-23p40亞基、IL-23p19亞基和IL-23p40亞基一起、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-27B和IL-27-p28一起、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γ。
62.權(quán)利要求60或權(quán)利要求61所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)
6
培養(yǎng)基中，1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述白介素。
63.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)或多肽是IL-1α、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaα亞基、IL-1240kDaβ亞基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同種型1、IL-17F同種型2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19亞基、IL-23p40亞基、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γ的可溶性受體。
64.權(quán)利要求63所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述可溶性受體。
65.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是干擾素(IFN)。
66.權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述干擾素是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、或IFN-v。
67.權(quán)利要求64或權(quán)利要求65所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)
6
培養(yǎng)基中，1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述干擾素。
68.權(quán)利要求53的方法，其中所述蛋白質(zhì)或多肽是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、或IFN-v的可溶性受體。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述可溶性受體。
70.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是胰島素或胰島素原。
71.權(quán)利要求70所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述蛋白質(zhì)。
72.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是胰島素受體。
73.權(quán)利要求71或權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述細(xì)胞另外被基因工程化以產(chǎn)生激素原轉(zhuǎn)化酶1、激素原轉(zhuǎn)化酶2、或羧肽酶E中的一種或多種。
74.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是瘦素(LEP)。
75.權(quán)利要求74所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述蛋白質(zhì)。
76.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是紅細(xì)胞生成素。
77.權(quán)利要求76所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述蛋白質(zhì)。
78.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是血小板生成素。
79.權(quán)利要求78所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述蛋白質(zhì)。
80.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是酪氨酸3-單加氧酶。
81.權(quán)利要求80所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述蛋白質(zhì)。
82.權(quán)利要求80或權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以表達(dá)芳香L-氨基酸脫羧酶。
83.權(quán)利要求82所述的方法，其中，在24小時(shí)內(nèi)，在體外培養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，
6
1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生至少1.0-10μM的所述芳香L-氨基酸脫羧酶。
84.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是激素或激素原。
85.權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述激素是抗苗勒氏管激素(AMH)、脂聯(lián)素
(Acrp30)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血管緊張素(AGT)、血管緊張素原(AGT)、抗利尿激素(ADH)、加壓素、心房鈉尿肽(ANP)、降鈣素(CT)、縮膽囊素(CCK)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、紅細(xì)胞生成素(Epo)、促卵泡激素(FSH)、睪酮、雌激素、胃泌素(GRP)、胃饑餓素、胰高血糖素(GCG)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、生長(zhǎng)激素(GH)、生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤催乳素(HPL)、抑制素、黃體化激素(LH)、促黑素細(xì)胞激素(MSH)、增食欲素、催產(chǎn)素(OXT)、甲狀旁腺激素(PTH)、催乳素(PRL)、松弛素(RLN)、分泌素(SCT)、生長(zhǎng)激素抑制素(SRIF)、血小板生成素(Tpo)、促甲狀腺激素(Tsh)、和/或促甲狀腺激素釋放激素(TRH)。
86.權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶
(P450SCC)。
87.權(quán)利要求86所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是在患有遺傳障礙或遺傳病的受試者中缺失或發(fā)生功能障礙的蛋白質(zhì)。
88.權(quán)利要求87所述的方法，其中：
所述遺傳病是家族性高膽固醇血癥，且所述蛋白質(zhì)是低密度脂蛋白受體(LDLR)；
所述遺傳病是多囊腎病，且所述蛋白質(zhì)是多囊蛋白-1(PKD1)、PKD-2或PKD3；或者所述遺傳病是苯丙酮尿癥，且所述蛋白質(zhì)是苯丙氨酸羥化酶。
89.權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過在所述打印之前將包含生物分子的組合物沉積在所述表面上來制備所述表面。
90.權(quán)利要求89所述的方法，其中，所述生物分子是一種類型的膠原、一種類型的纖連蛋白、一種類型的層粘連蛋白、或組織粘合劑，或者包含一種類型的膠原、一種類型的纖連蛋白、一種類型的層粘連蛋白、或組織粘合劑。
91.權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過用脫細(xì)胞組織覆蓋所述表面的全部或部分來制備所述表面。
92.權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述脫細(xì)胞組織是脫細(xì)胞羊膜、脫細(xì)胞隔膜、脫細(xì)胞皮膚、或脫細(xì)胞筋膜。
93.權(quán)利要求1-92中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面是受試者中的心臟、血管、皮膚、肝、胰、肺、腎、甲狀腺、部分腸、胃、氣管、食道、或十二指腸的表面。
94.權(quán)利要求1-92中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面是損傷的皮膚。
95.權(quán)利要求94所述的方法，其中，所述皮膚由于灼燒而受到損傷。
96.權(quán)利要求94或95所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含表皮細(xì)胞。
97.權(quán)利要求94或95所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含真皮細(xì)胞。
98.權(quán)利要求94或95所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞。
99.權(quán)利要求94或95所述的方法，其中，所述至少一種細(xì)胞組合物包含第一細(xì)胞組合物、第二細(xì)胞組合物和第三細(xì)胞組合物，其中所述第一細(xì)胞組合物包含表皮細(xì)胞，所述第二細(xì)胞組合物包含真皮細(xì)胞，所述第三細(xì)胞組合物包含間充質(zhì)干細(xì)胞。
100.權(quán)利要求99所述的方法，其中，所述方法包括(a)首先將所述間充質(zhì)干細(xì)胞打印到所述表面上，然后(b)將所述真皮細(xì)胞打印到所述表面上，然后(c)將所述表皮細(xì)胞打印到所述表面上。
101.權(quán)利要求99所述的方法，其中，所述方法包括(a)首先將將所述真皮細(xì)胞打印到所述表面上，然后(b)將所述表皮細(xì)胞打印到所述表面上。
102.權(quán)利要求99所述的方法，包括在兩次或更多次打印過程中打印所述第一細(xì)胞組合物、所述第二細(xì)胞組合物和/或所述第三細(xì)胞組合物。
103.權(quán)利要求94-102中任一項(xiàng)所述的方法，包括在所述表面和所述第一細(xì)胞組合物之間；所述第一細(xì)胞組合物和所述第二細(xì)胞組合物之間；所述第二細(xì)胞組合物和所述第三細(xì)胞組合物之間沉積ECM；或其任意組合。
104.權(quán)利要求103所述的方法，其中，在同一細(xì)胞組合物中包含所述表皮細(xì)胞和所述真皮細(xì)胞；所述真皮細(xì)胞和所述間充質(zhì)干細(xì)胞；或者所述表皮細(xì)胞、所述真皮細(xì)胞、和所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
105.權(quán)利要求1-92中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面是所述受試者中腎的表面。
106.權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述細(xì)胞組合物包含至少一種類型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和一種類型的基質(zhì)細(xì)胞。
107.權(quán)利要求106所述的方法，其中，所述一種類型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和所述一種類型的基質(zhì)細(xì)胞存在于由自體同源或同種異源的腎組織解聚的腎細(xì)胞群中。
108.權(quán)利要求106或107所述的方法，其中，所述至少一種類型的基質(zhì)細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
109.權(quán)利要求106或107所述的方法，其中，所述至少一種類型的基質(zhì)細(xì)胞是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
110.權(quán)利要求106或107所述的方法，其中，所述至少一種類型的基質(zhì)細(xì)胞是組培塑料貼壁CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盤干細(xì)胞。
111.權(quán)利要求105所述的方法，其中，包含所述表面的所述腎的至少一部分被損傷或發(fā)生功能障礙。
112.權(quán)利要求105所述的方法，包括分析所述腎的損傷的或功能障礙的表面，以確定所述損傷的或功能障礙的表面中的腎細(xì)胞類型，并在所述表面上沉積相同類型的細(xì)胞。
113.權(quán)利要求112所述的方法，其中，通過手術(shù)修補(bǔ)所述損傷的或功能障礙的腎，以除去所述損傷的或功能障礙的部分。
114.權(quán)利要求113所述的方法，其中，所述表面是在所述手術(shù)修補(bǔ)之后保留的所述腎的表面。
115.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，包括至少部分根據(jù)包含所述表面的組織或器官的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算機(jī)模型來沉積所述細(xì)胞組合物和/或所述ECM。
116.權(quán)利要求115所述的方法，另外還包括根據(jù)從對(duì)所述表面的掃描獲得的數(shù)據(jù)來沉積所述細(xì)胞組合物和/或所述ECM。
117.權(quán)利要求116所述的方法，其中，對(duì)所述表面的所述掃描從計(jì)算機(jī)輔助斷層攝影、磁共振成像、電子束、或x射線獲得。
118.權(quán)利要求117所述的方法，其中，對(duì)所述表面的所述掃描的分辨率為至少100微米。
119.權(quán)利要求117所述的方法，其中，對(duì)所述表面的所述掃描的分辨率為至少1微米。
120.權(quán)利要求1-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述沉積通過腹腔鏡進(jìn)行。
121.權(quán)利要求1-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述沉積通過霧化實(shí)現(xiàn)。
122.權(quán)利要求1-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述沉積通過噴霧實(shí)現(xiàn)。
123.權(quán)利要求1-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述沉積通過打印實(shí)現(xiàn)。
124.權(quán)利要求1-119中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述沉積通過噴墨打印實(shí)現(xiàn)。
125.權(quán)利要求124所述的方法，其中，使用具有多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴的打印機(jī)進(jìn)行所述噴墨打印。
126.權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述多個(gè)打印頭或打印噴嘴中的每一個(gè)可單獨(dú)控制。
127.權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述打印頭或打印噴嘴中的每一個(gè)獨(dú)立于其余的所述打印頭或打印噴嘴操作。
128.權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述多個(gè)打印頭或打印噴嘴中的至少一個(gè)打印所述細(xì)胞組合物，而所述多個(gè)打印頭或打印噴嘴中的至少另一個(gè)打印所述基材。
129.權(quán)利要求23所述的方法，其中，以物理支持所述ECM和所述細(xì)胞組合物的方式沉積所述合成聚合物。
130.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述合成聚合物在所述組織中作為一系列纖維進(jìn)行沉積。
131.權(quán)利要求130所述的方法，其中，所述合成聚合物沉積兩次或更多次，并且在所述兩次或更多次中的至少一次中，與其余的情況相比，以不同的取向進(jìn)行沉積。
132.權(quán)利要求130所述的方法，其中，所述合成聚合物沉積兩次或更多次，并且在所述兩次或更多次中的每一次以不同的方向進(jìn)行沉積。
133.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述表面不是皮膚、表皮、或真皮。
組織生成的方法
2.背景技術(shù)
準(zhǔn)移植方法中所使用的供者來源的組織和器官的有前景的替代物。
物。在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物和至少一種包含細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組合物。
在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表
的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物，至少一種包含細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組合物，和
至少一種其他附加組分。下述4.1.1節(jié)描述了根據(jù)本文所述方法可用的細(xì)胞。下述4.1.2
節(jié)描述了根據(jù)本文所述的方法可以沉積在其上的組織和器官的細(xì)胞、ECM、和/或其他附加
組分。下述4.1.3節(jié)描述了根據(jù)本文所述方法可用的ECM。在下述4.1.4節(jié)描述了根據(jù)本
文所述的方法可以沉積在其上的表面細(xì)胞，ECM，和/或其他附加組分。
的方法中使用的細(xì)胞和ECM作為不同的組合物的部分進(jìn)行沉積。在一種具體實(shí)施方式中，
本文描述的在體內(nèi)形成三維組織的方法中使用的ECM包含可流動(dòng)ECM。在另一種具體實(shí)施
方式中，本文描述的在體內(nèi)形成三維組織的方法中使用的細(xì)胞和ECM作為不同的組合物的
部分沉進(jìn)行積，例如，其中ECM與細(xì)胞的沉積分開沉積，例如在細(xì)胞沉積之前沉積，和/或其中在細(xì)胞沉積之前使ECM脫水。在ECM脫水的實(shí)施方式中，它可以之后在期望的時(shí)間再水
化，例如在細(xì)胞沉積到已經(jīng)沉積有ECM和細(xì)胞的表面上的時(shí)間。
是通過不包括生物打印的方法將其施加于所述表面上。在一種具體實(shí)施方式中，將不是被
生物打印到受試者體內(nèi)或體表的表面上的細(xì)胞和/或ECM施加于已經(jīng)過生物打印的表面
上，例如將細(xì)胞和/或可流動(dòng)ECM施加到已經(jīng)過生物打印到受試者體內(nèi)或體表的支架，例如
合成支架(如合成基質(zhì))上。在一種具體實(shí)施方式中，細(xì)胞和/或ECM僅被施加于支架(例
如表面)的一部分，例如一面上。在另一種具體實(shí)施方式中，細(xì)胞和/或ECM被施加于支架
的所有面上，即整個(gè)支架都具有施加于其上的細(xì)胞和/或ECM。在另一種具體實(shí)施方式中，
該支架是聚己酸內(nèi)酯(PCL)。
噴墨打印機(jī))。在某些實(shí)施方式中，本文所述的在體內(nèi)形成三維組織的方法中使用的細(xì)胞和可流動(dòng)ECM(以及附加組分)被噴涂到所述表面上。在某些實(shí)施方式中，本文所述的在體內(nèi)
形成三維組織的方法中使用的細(xì)胞和/或可流動(dòng)ECM(以及附加組分)通過霧化沉積到所
述表面上。
分沉積于其上的表面包括受試者(例如人受試者)的組織或一種具體的實(shí)施方式中，根據(jù)
本文描述的方法，可將ECM、和/或附加組分沉積于其上的表面是已進(jìn)行生物打印，例如已
根據(jù)本文所述的方法進(jìn)行生物打印的表面。在一種具體實(shí)施方式中，該表面是聚己酸內(nèi)酯
(PCL)。
器官)上，所述受試者將會(huì)從所述細(xì)胞的沉積中受益。這種方法可以另外包括將ECM(例如
可流動(dòng)ECM)和/或附加組分沉積到所述受試者的所述表面上。
在一個(gè)或多個(gè)容器中，以及根據(jù)本文所述的一種或多種方法使用所述組合物的說明書。
4.具體實(shí)施方式
少一種包含細(xì)胞的組合物。在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物和至少一種包含細(xì)胞
外基質(zhì)(ECM)的組合物。在另一種實(shí)施方式中，本文提供了在體內(nèi)形成三維組織的方法，包括在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積至少一種包含細(xì)胞的組合物、至少一種包含細(xì)胞外基
質(zhì)(ECM)的組合物、和至少一種其他附加組分。下述4.1.1節(jié)描述了根據(jù)本文所述的方法
可用的細(xì)胞。下述4.1.2節(jié)描述了根據(jù)本文所述的方法細(xì)胞、ECM、和/或其他附加組分可
以沉積在其上的組織和器官。下述4.1.3節(jié)描述了根據(jù)本文所述的方法可用的ECM。在下
述4.1.4節(jié)描述了根據(jù)本文所述的方法細(xì)胞、ECM，、和/或其他附加組分可以沉積在其上的表面。
機(jī)來沉積所述細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含單一類型的細(xì)胞。在另一種
具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含多于一種類型的細(xì)胞。
組合物，其中所述ECM包含可流動(dòng)ECM。在一種具體實(shí)施方式中，使用生物打印機(jī)來沉積所
述細(xì)胞和所述ECM。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含單一類型的細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含多于一種類型的細(xì)胞。
ECM。在一種具體實(shí)施方式中，使用生物打印機(jī)來沉積所述細(xì)胞和所述ECM。在另一種具體
實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含單一類型的細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含多于一種類型的細(xì)胞。
合物，和至少一種其他附加組分。在一種具體實(shí)施方式中，使用生物打印機(jī)來沉積所述細(xì)
胞、所述ECM和所述一種或多種附加組分。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含單一類型的細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含多于一種類型的細(xì)胞。在另一種具體
實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞、所述ECM和所述一種或多種附加組分配制成同一組合物的部分。
在另一種具體實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞、所述ECM和所述一種或多種附加組分配制成單獨(dú)
的組合物的部分。在另一種具體實(shí)施方式中，所述一種或多種附加組分是生長(zhǎng)因子、可聚合單體、交聯(lián)劑、聚合物和水凝膠。
表面可以被脫細(xì)胞，例如進(jìn)行處理以從組織或器官的全部或部分表面除去細(xì)胞。在一種具
體實(shí)施方式中，根據(jù)本文描述的方法，可將ECM、和/或附加組分沉積于其上的表面是已進(jìn)
行生物打印，例如已根據(jù)本文所述的方法進(jìn)行生物打印的表面。在一種具體實(shí)施方式中，該表面包含合成材料，例如合成聚合物。在另一種實(shí)施方式中，合成聚合物是PCL。
表上的表面上沉積一層ECM，然后在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積一層細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，可以在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積多層ECM，然后在受試者體內(nèi)或體表的表面上沉積多層細(xì)胞，反之亦然。同樣地，根據(jù)本文所述的方法，與細(xì)胞和/或ECM沉積同時(shí)，或在其之前或之后沉積的附加組分可以在細(xì)胞和ECM之間成層。
以使得受試者體內(nèi)或體表的沉積表面部分被細(xì)胞和ECM覆蓋。
例如機(jī)械控制打印頭以使其沿著特定的路徑旋轉(zhuǎn)。本文所使用的三維打印和三維沉積與本
領(lǐng)域已知的生物打印的標(biāo)準(zhǔn)方法相反，在所述標(biāo)準(zhǔn)方法中通過在扁平/平面/二維表面上
開始構(gòu)建組織進(jìn)行打印。
Boland等的US 7,051,654、Yoo等的US 2009/0208466和Xu等的US 2009/0208577中描
述，通過合并將其全文公開的內(nèi)容合并入本文。另外，適用于本文所述方法的生物打印機(jī)是TM
可商購的，例如Envisiontec GmbH(Gladbeck,德國)的3D-Bioplotter ；和Organovo(San
TM
Diego,CA)的NovoGen MMX Bioprinter 。
(firing frequency)的機(jī)構(gòu)和/或軟件。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選可以構(gòu)建和/或設(shè)定生
物打印機(jī)軟件和/或硬件，以在打印過程中保持細(xì)胞溫度為大約37℃。
生物打印機(jī)可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)容器，例如每一種細(xì)胞類型或每一種ECM使用一個(gè)容器，用于構(gòu)建本文所述的組織和器官?？梢酝ㄟ^氣壓、機(jī)械壓力、或通過其他方式將細(xì)胞從容器遞送至噴墨閥。典型地，生物打印機(jī)(例如生物打印機(jī)中的打印
頭)是計(jì)算機(jī)控制的，以使得一種或多種細(xì)胞類型，和所述ECM以預(yù)定的模式進(jìn)行沉積。所
述預(yù)定的模式可以是這樣的模式，其在作為細(xì)胞來源的或用于獲得細(xì)胞的器官或組織中再
造或重演所述一種或多種類型的細(xì)胞的天然排列，或者是這樣的模式，其不同于所述一種
或多種類型的細(xì)胞的天然排列。
30kHz的頻率和12-100瓦特的動(dòng)力源。生物打印機(jī)打印頭噴嘴，在一些實(shí)施方式中，各自
獨(dú)立地直徑在0.05-200微米之間，或者直徑在0.5-100微米之間，或者直徑在10-70微米
之間，或者直徑在20-60微米之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，噴嘴各自獨(dú)立地直徑為大約
40-50微米?？梢允褂镁哂邢嗤虿煌睆降亩鄠€(gè)噴嘴。在一些實(shí)施方式中，噴嘴具有圓形開口；在其他實(shí)施方式中，可以使用其他適當(dāng)?shù)男螤?，例如橢圓形、正方形、長(zhǎng)方形等等，而不背離本發(fā)明的精神。
在某些實(shí)施方式中，每一個(gè)所述的打印頭或打印噴嘴與其余的所述打印頭或打印噴嘴獨(dú)立
操作。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述的多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴可以打印包含細(xì)胞
的組合物，并且至少一個(gè)所述的多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴可以打印包含ECM的組合物。
在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述的多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴可以打印包含細(xì)胞的組合
物，至少一個(gè)所述的多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴可以打印包含ECM的組合物，并且至少一
個(gè)所述的多個(gè)打印頭或多個(gè)打印噴嘴可以打印包含附加組分的組合物。
術(shù)器械，例如腹腔鏡連接來改變打印頭或打印噴嘴。根據(jù)這樣的實(shí)施方式，可以為手術(shù)器械提供一個(gè)或多個(gè)有助于打印程序的其他部件，例如照相機(jī)。
織或器官的結(jié)構(gòu)的三維表面上進(jìn)行三維打印的程序。例如，如果希望在骨上打印，可以構(gòu)建骨的解剖圖像并生成指導(dǎo)生物打印機(jī)的打印頭在打印過程中圍繞受試者表面內(nèi)部的三維
骨旋轉(zhuǎn)的程序。
試者體內(nèi)或體表的表面上。
供。ECM，包括可流動(dòng)ECM在下述4.1.3節(jié)中描述。
多種細(xì)胞類型作為同一個(gè)組合物的部分進(jìn)行沉積，即細(xì)胞來源是包含多種細(xì)胞類型的單一
組合物。在另一種具體實(shí)施方式中，多種細(xì)胞類型作為不同的組合物的部分進(jìn)行沉積，即細(xì)胞來源是包含多種細(xì)胞類型的不同組合物。在另一種具體實(shí)施方式中，多種細(xì)胞類型的一
部分作為一個(gè)組合物的部分進(jìn)行沉積(例如兩個(gè)或更多種細(xì)胞類型在單一組合物中)，并
且多種細(xì)胞類型的另一部分作為不同的組合物進(jìn)行沉積(例如一種或多種細(xì)胞類型在單
一組合物中)。根據(jù)這種方法可使用的示例性細(xì)胞類型在下述4.1.2節(jié)中提供。
可流動(dòng)ECM在受試者體內(nèi)或體表的表面上作為不同的組合物的部分一起沉積。在另一種具
體實(shí)施方式中，要沉積的細(xì)胞和可流動(dòng)ECM在受試者體內(nèi)或體表的表面上分別(即在不同
時(shí)間)沉積。
物中。在另一種實(shí)施方式中，將一種或多種附加組分與ECM配制在同一個(gè)組合物中。在另
一種實(shí)施方式中，將一種或多種附加組分與細(xì)胞和ECM配制在同一個(gè)組合物中(即一個(gè)組
合物包含細(xì)胞、可流動(dòng)ECM、和一種或多種附加組分)。在另一種實(shí)施方式中，將一種或多種附加組分配制在與包含細(xì)胞和/或ECM的組合物不同的組合物中，并且在受試者體內(nèi)或體
表的表面上與細(xì)胞和/或ECM同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。在某些實(shí)施方式中，一種
或多種附加組分促進(jìn)細(xì)胞的生存、分化、增殖等。在另一種具體實(shí)施方式中，一種或多種附加組分包含細(xì)胞交聯(lián)劑(參見4.1.3.2節(jié))。在另一種具體實(shí)施方式中，一種或多種附加組
分包含水凝膠。在另一種具體實(shí)施方式中，一種或多種附加組分包含合成聚合物。
可以是同時(shí)的或是順序的，或者是其任意組合，并且一些組分(例如細(xì)胞、可流動(dòng)ECM、或附加組分)可以以第一種模式的形式打印，而一些組分可以以第二種模式的形式打印，等等。
打印的特定組合和方式將取決于在其上打印的受試者中的特定組織或器官。
例如，成特定角度，例如30度角、45度角、60度角的生物打印材料(例如細(xì)胞、ECM、基質(zhì)、和本文所述的其他組分)，以產(chǎn)生特定的模式。根據(jù)這種打印方法，可以生成具有所希望品質(zhì)，例如培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的能力的生物打印結(jié)構(gòu)。參見下述實(shí)施例1。在某些實(shí)施方式中，在所述生物打印基質(zhì)上以有益于支持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的特定模式對(duì)基質(zhì)，例如合成基質(zhì)進(jìn)
行生物打印。在某些實(shí)施方式中，合成基質(zhì)是PCL。
物種的基因不相同成員)或異種的(即來自與受者受試者不同物種的成員)。同系細(xì)胞包
括自體的(即來自受者受試者)和同系的(即來自基因相同但是不同的受試者，例如來自
同卵雙胞胎)。細(xì)胞可以自，例如供者(活體或尸體)獲得，或者來自于已建立的細(xì)胞株或
細(xì)胞系。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)活組織檢查技術(shù)從供者收獲細(xì)胞(例如潛在的
受者)。
0.9N鹽溶液、Kreb's溶液、改良的Kreb's溶液、Eagle's培養(yǎng)基、修飾的伊格爾氏培養(yǎng)基
(MEM)、達(dá)爾伯克改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)、Hank's平衡鹽等)等中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PDACs是CD34–、CD10+、CD105+、和CD200+。在另一
個(gè)實(shí)施方式中所述PDACs是CD34–、CD10+、CD105+、和CD200+，此外還是CD45–、CD80–、CD86–、和/或CD90+。
另一個(gè)實(shí)施方式中，所述AMDACs是CD49f+。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述AMDACs是Oct4-和
CD49f+。
重力)、II型耳前庭器毛細(xì)胞、I型味蕾細(xì)胞、類膽堿神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞、和/或肽能神經(jīng)細(xì)胞。
骨軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、體細(xì)胞、星形細(xì)胞(耳)、肝星形細(xì)胞(Ito細(xì)胞)、胰腺stelle細(xì)胞、紅色骨骼肌細(xì)胞、白色骨骼肌細(xì)胞、中間骨骼肌細(xì)胞、肌梭核袋細(xì)胞、肌梭核鏈細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、普通心肌細(xì)胞、結(jié)節(jié)心肌細(xì)胞、浦肯野纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、虹膜肌上皮細(xì)胞、和/或外分泌腺肌上皮細(xì)胞。
胞群體是同質(zhì)的。在其他實(shí)施方式中，將根據(jù)本文所述的方法中使用的細(xì)胞配制在包含多
于一種細(xì)胞類型的組合物中，即組合物中的細(xì)胞群體是異質(zhì)的。
獨(dú)的組合物的一部分，與所述細(xì)胞的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。在某些實(shí)施方式中，將根據(jù)本文所述的方法使用的細(xì)胞配制在另外包含一種或多種合成單體或聚合物的
組合物中?；蛘?，根據(jù)本文所述的方法，所述合成單體或聚合物可以作為單獨(dú)的組合物的一部分，與所述細(xì)胞的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。在某些實(shí)施方式中，將根據(jù)本文所述的方法使用的細(xì)胞配制在另外包含可流動(dòng)ECM和一種或多種合成單體或聚合物的組
合物中。在某些實(shí)施方式中，將根據(jù)本文所述的方法中使用的細(xì)胞配制在另外包含交聯(lián)劑
的組合物中?；蛘撸鶕?jù)本文所述的方法，所述交聯(lián)劑可以作為單獨(dú)的組合物的一部分，與所述細(xì)胞的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。
因子(1、2和3)、骨橋蛋白、骨形成蛋白-2、生長(zhǎng)激素如促生長(zhǎng)素、細(xì)胞引誘劑和粘附劑等、及其混合物?；蛘?，根據(jù)本文所述的方法，所述一種或多種促進(jìn)細(xì)胞的存活、分化、增殖等的附加組分可以作為單獨(dú)組合物的一部分，與所述細(xì)胞的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。
產(chǎn)生量。在某些實(shí)施方式中，這種細(xì)胞包含分化的細(xì)胞或由其組成。在另一種具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含指導(dǎo)所述蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)生的質(zhì)粒。這種細(xì)胞可以以這樣的方式進(jìn)行培
養(yǎng)，可以控制和/或優(yōu)化蛋白質(zhì)或多肽的量。例如，所述細(xì)胞可以被工程化以使得在體外培
6
養(yǎng)中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在大約24小時(shí)中大約1×10個(gè)所述細(xì)胞產(chǎn)生大約或至少0.01-0.1、
0.1-1.0、1.0-10.0、或10.0-100.0μM所述蛋白質(zhì)或多肽。
不限于，腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(Ang)、骨形成蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子
(BDNF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、紅細(xì)胞生成素(Epo)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GNDF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子
(GM-CSF)、生長(zhǎng)分化因子(GDF-9)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝細(xì)胞瘤源性生長(zhǎng)因子(HDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、促移行因子(migration-stimulating factor)、肌肉生長(zhǎng)抑制素(GDF-8)、髓單核細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、促血小板生成素(Tpo)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、TGF-β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、或Wnt蛋白。
例性的可溶性受體包括，但不限于，AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、GNDF、G-CSF、GM-CSF、GDF-9、HGF、HDGF、IGF、促移行因子、GDF-8、MGF、NGF、PlGF、PDGF、Tpo、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、和Wnt蛋白的可溶性受體。
不限于，IL-1α、IL-1β、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaα亞基、IL-1240kDaβ亞基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同種型1、IL-17F同種型2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23p19亞基、IL-23p40亞基、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、和IL-36γ的可溶性受體。
IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、和IFN-v。
但不限于，IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、和IFN-v的可溶性受體。
因工程化，以產(chǎn)生胰島素受體。在某些實(shí)施方式中，所述被基因工程化以產(chǎn)生胰島素或胰島素原、和/或胰島素受體的細(xì)胞，另外被基因工程化以產(chǎn)生激素原轉(zhuǎn)化酶1、激素原轉(zhuǎn)化酶
2、或羧肽酶E的一種或多種。
基因工程化，以產(chǎn)生血小板生成素。在另一種具體實(shí)施方式中，根據(jù)本文所述的方法中使用的細(xì)胞被基因工程化，以產(chǎn)生酪氨酸3-單加氧酶，一種能由l-酪氨酸產(chǎn)生L-DOPA的蛋白。
在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以表達(dá)芳香L-氨基酸脫羧酶，其由L-DOPA產(chǎn)
生多巴胺。
素(AMH)、脂聯(lián)素(Acrp30)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血管緊張素(AGT)、血管緊張素原
(AGT)、抗利尿激素(ADH)、加壓素、心房鈉尿肽(ANP)、降鈣素(CT)、縮膽囊素(CCK)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、紅細(xì)胞生成素(Epo)、促卵泡激素(FSH)、睪酮、雌激素、胃泌素(GRP)、胃饑餓素、胰高血糖素(GCG)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、生長(zhǎng)激素(GH)、生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤催乳素(HPL)、抑制素、黃體化激素(LH)、促黑素細(xì)胞激素(MSH)、增食欲素、催產(chǎn)素(OXT)、甲狀旁腺激素(PTH)、催乳素(PRL)、松弛素(RLN)、分泌素(SCT)、生長(zhǎng)激素抑制素(SRIF)、血小板生成素(Tpo)、促甲狀腺激素(Tsh)、和促甲狀腺激素釋放激素(TRH)。
得一旦細(xì)胞被打印，單體就進(jìn)行聚合，形成捕捉細(xì)胞和/或?yàn)榧?xì)胞提供物理支持的凝膠。
例如，包含細(xì)胞的組合物可以包含丙烯酰胺單體，進(jìn)而在生物打印前即時(shí)向組合物中加入
TEMED和過硫酸銨，或核黃素。組合物中的細(xì)胞沉積到表面上以后，丙烯酰胺聚合、匯集并支持細(xì)胞。
劑的組合物中，所述軟組織粘合劑包括，但不限于氰基丙烯酸鹽粘合劑、血纖蛋白粘合劑、和/或明膠-間苯二酚-甲醛膠。在另一種具體實(shí)施方式中，將根據(jù)本文所述方法使用的
細(xì)胞配制在另外包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)配體、細(xì)胞外蛋白、和/或細(xì)胞外蛋
白類似物的組合物中。
表面上。
單一類型的細(xì)胞，或者可以包含多種細(xì)胞類型，例如兩種、三種、四種、五種或更多種細(xì)胞類型。
內(nèi)或體表的表面上。這種組織可以包含單一類型的細(xì)胞，或者可以包含多種細(xì)胞類型，例如兩種、三種、四種、五種或更多種細(xì)胞類型。
或體表的表面上。在不同的實(shí)施方式中，細(xì)胞、或包含細(xì)胞的組合物的體積，是大約0.5、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、20、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮升，或者在大約1-90皮升、大約5-85皮升、大約10-75皮升、大約15-70皮升、大約20-65
皮升、或大約25-大約60皮升之間。
還提供了在受試者中的已有器官內(nèi)或其上生物打印組織的方法，以及在受試者中生成新器
官的方法。
方式中，在受試者體內(nèi)或體表打印的組織包含多種細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方式中，在受試者體內(nèi)或體表打印的組織包含多于一種類型的組織。
述表面包含受試者的器官。
結(jié)締組織)上。
體表的肌肉組織)上。肌肉組織可以包含內(nèi)臟(平滑)肌組織、骨骼肌組織、或心肌組織。
體表的神經(jīng)組織)上。神經(jīng)組織可以包含中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織(例如腦組織或脊髓組織)或
外周神經(jīng)系統(tǒng)組織(例如腦神經(jīng)和脊神經(jīng))。
體表的上皮組織)上。上皮組織可以包含內(nèi)皮。
胞、ECM、和/或其他組分被打印在肺組織、或肺或其部分上。在另一種具體實(shí)施方式中，在受試者體內(nèi)或體表打印的細(xì)胞、ECM、和/或其他組分被打印在肝組織、或肝或其部分上。在另一種具體實(shí)施方式中，在受試者體內(nèi)或體表打印的細(xì)胞、ECM、和/或其他組分被打印在
神經(jīng)組織、或神經(jīng)或其部分上。
以來源于任何已知的ECM來源，并且可以用本領(lǐng)域已知的任何方法制成可流動(dòng)的。在某些
實(shí)施方式中，ECM包括可流動(dòng)ECM。可以使用，例如下述4.1.3節(jié)所述的方法將ECM制成可
流動(dòng)的。在某些實(shí)施方式中，可以用下述4.1.3.2節(jié)所述的方法使ECM交聯(lián)。
ECM來自于胎盤(例如人胎盤)。在另一種具體實(shí)施方式中，所述來自胎盤的ECM包含端肽
膠原。
5％的纖連蛋白或少于5％的層粘連蛋白；按重量計(jì)在25％-92％之間的I型膠原；和按重
量計(jì)2％-50％的III型膠原或2％-50％的IV型膠原。
1％的纖連蛋白或少于1％的層粘連蛋白；按重量計(jì)在74％和92％之間的I型膠原；和按重
量計(jì)4％-6％的III型膠原或2％-15％的IV型膠原。
胎盤可以儲(chǔ)存在室溫、或大約2℃-8℃的溫度，直至進(jìn)一步處理。優(yōu)選除去胎盤血液，即完全排出生產(chǎn)后剩余的胎盤和臍帶血。在某些實(shí)施方式中，在生產(chǎn)之前對(duì)待產(chǎn)婦女篩查例如
HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV、和已知污染胎盤組織的其他病毒病原體。
中詳細(xì)描述的，通過引用將其全文內(nèi)容合并入本文。
何滲透休克條件下進(jìn)行滲透休克。這種條件包括在高滲透勢(shì)、或低滲透勢(shì)或高滲透勢(shì)和低
滲透勢(shì)交替的溶液中溫育組織。高滲透勢(shì)溶液可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何高滲透勢(shì)
溶液，例如包含NaCl(例如0.2-1.0M或0.2-2.0M)、KCl(例如0.2-1.0或0.2-2.0M)、硫酸
銨、單糖、二糖(例如20％蔗糖)、親水聚合物(例如聚乙二醇)、甘油等的一種或多種的溶
液。在某些實(shí)施方式中，高滲透勢(shì)溶液是氯化鈉溶液，例如至少0.25M、0.5M、0.75M、11.0M、
1.25M、1.5M、1.75M、2M、或2.5M NaCl。在一些實(shí)施方式中，氯化鈉溶液是大約0.25-5M、大約0.5-4M、大約0.75-3M、或大約1.0-2.0M NaCl。低滲透勢(shì)溶液可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已
知的任何低滲透勢(shì)溶液，例如水，例如根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行去離子化的水。在一些實(shí)施方式中，滲透休克溶液包含滲透休克勢(shì)小于50mM NaCl的滲透休克勢(shì)的水。在某些
實(shí)施方式中，在氯化鈉溶液中進(jìn)行滲透休克，然后在水溶液中進(jìn)行滲透休克。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行一種或兩種NaCl溶液處理，然后再進(jìn)行水洗。
離子型去垢劑、脫氧膽酸鹽、十二烷基硫酸鈉、Triton X 100、TWEEN等?？梢栽诖蠹s0℃至大約30℃、大約5℃至大約25℃、大約5℃至大約20℃、大約5℃至大約15℃、大約0℃、大
約5℃、大約10℃、大約15℃、大約20℃、大約25℃、或大約30℃進(jìn)行去垢劑處理。去垢劑處理可以進(jìn)行，例如大約1-24小時(shí)、大約2-20小時(shí)、大約5-15小時(shí)、大約8-12小時(shí)、或大
約2-5小時(shí)。
小時(shí)。
2％和50％之間的III型膠原；按重量計(jì)在2％和50％之間的IV型膠原；和/或按重量計(jì)
少于40％的彈性蛋白。在更具體的實(shí)施方式中，該工藝導(dǎo)致產(chǎn)生堿處理的、去垢劑處理的
I型端肽胎盤膠原，其中所述膠原未被化學(xué)修飾或與蛋白酶接觸，且其中所述組合物包含按重量計(jì)少于1％的纖連蛋白；按重量計(jì)少于1％的層粘連蛋白；按重量計(jì)在74％和92％之
間的I型膠原；按重量計(jì)在4％和6％之間的III型膠原；按重量計(jì)在2％和15％之間的IV
型膠原；和/或按重量計(jì)少于12％的彈性蛋白。
型，例如上述4.1.1節(jié)中詳細(xì)描述的細(xì)胞類型的一種或多種?；蛘?，根據(jù)本文所述的方法，所述細(xì)胞可以作為單獨(dú)的組合物的一部分，與所述ECM的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。
物的一部分，與所述ECM的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。
組合物以使ECM：水凝膠的比例在按重量計(jì)大約10:1至大約1:10的范圍內(nèi)。
物的合適的水凝膠包括自組裝肽，例如RAD16。水凝膠形成材料包括多糖例如藻酸鹽或其
鹽、肽、聚膦嗪、和聚丙烯酸酯，其進(jìn)行離子交聯(lián)；或嵌段聚合物例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分別通過溫度或pH交聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，水凝膠或基質(zhì)可以是生物可
降解的。
二甲苯)(聚(CPX))、聚(丙交酯-酸酐)(PLAA)、n-異丙基丙烯酰胺、季戊四醇二丙烯酸
酯(pent erythritol diacrylate)、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纖維素、和/或聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)。在另一種具體實(shí)施方式中，合成聚合物包括熱塑性聚合物，例如聚己酸內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸、聚對(duì)苯二甲酸丁二酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚乙酸乙烯酯、和/或聚氯乙烯?；蛘?，根據(jù)本文所述的方法，一種或多種合成聚合物可以作為單獨(dú)的組合物的一部分，與所述ECM的沉積同時(shí)、在其之前、或在其之后沉積。在某些實(shí)施方式中，合成聚合物是PCL。
蛋白進(jìn)行的衍生化、使用細(xì)胞因子(例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、或骨形成蛋白(BMP))
進(jìn)行的衍生化、和使用葡糖氨基聚糖進(jìn)行的衍生化。
ECM被制成可流動(dòng)的，如果需要的話，可以通過本領(lǐng)域已知的方法將含ECM的組合物制成中
性的，或者達(dá)到所希望的pH。
文所述的方法使用的ECM制成可流動(dòng)的。在另一種具體實(shí)施方式中，通過剪切ECM，例如使
用攪拌機(jī)或其他來源，將根據(jù)本文所述的方法使用的ECM制成可流動(dòng)的。在另一種具體實(shí)
施方式中，通過切割ECM，將根據(jù)本文所述的方法使用的ECM制成可流動(dòng)的。在某些實(shí)施方
式中，當(dāng)通過使用物理方法使ECM更易流動(dòng)時(shí)，可以在冷凍狀態(tài)(例如ECM被凍干或在液氮
中冷凍)下對(duì)ECM進(jìn)行操作。
物中，并且，必要時(shí)，可以在ECM打印之前在引起ECM交聯(lián)的條件下處理包含ECM和交聯(lián)劑
的組合物。
將交聯(lián)劑打印到所述表面上(即ECM和交聯(lián)劑作為單獨(dú)的組合物打印)，在其被施加于受試
者體內(nèi)或體表的表面上之后使ECM交聯(lián)。根據(jù)該實(shí)施方式，必要時(shí)，可以隨后在引起ECM交
聯(lián)的條件下處理ECM和交聯(lián)劑使ECM交聯(lián)。
受試者體內(nèi)或體表的表面上之后交聯(lián)。
的示例性手段包括在例如Burdick和Prestwich,2011,Adv.Mater.23:H41-H56中描述的那
些。
Mater.23:H41-H56)。
酰胺酶(參見，例如Griffin等人,2002,J.Biochem.368:377-96)。
實(shí)施方式中，所述人造表面是假體?？梢曰谒鼈儗?duì)受試者，例如人受試者的施用和/或移植的適合性選擇這種人造表面。例如，可以選擇使用已知不具有免疫原性的人造表面(即
不引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的表面)。在某些實(shí)施方式中。可以對(duì)人造表面進(jìn)行處理以使其適合
于施用和/或移植給受試者，例如人受試者。
其上的示例性類型的塑料表面包括，但不限于聚酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、和聚氨酯。
其上的示例性類型的塑料表面包括，但不限于，鋁、鉻、鈷、銅、金、鐵、鉛、鎂、錳、貢、鎳、鉑、銀、錫、鈦、鎢、和鋅。
體表的表面可以被脫細(xì)胞，例如被處理以從組織或器官的全部或部分表面除去細(xì)胞。
種類型的膠原、一種類型的纖連蛋白、一種類型的層粘連蛋白、或組織粘合劑，或者包含它們。
織是結(jié)締組織(包括骨)、肌肉組織(包括內(nèi)臟(平滑)肌組織、骨骼肌組織、和心肌組織)、
神經(jīng)組織(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織(例如腦組織或脊髓組織)或外周神經(jīng)系統(tǒng)組織(例如
腦神經(jīng)和脊髓神經(jīng)))、或上皮組織(包括內(nèi)皮)。在另一種具體實(shí)施方式中，提供打印表
面的受試者的器官來自任何已知的哺乳動(dòng)物器官系統(tǒng)，包括消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、和/或骨骼系統(tǒng)、在另一種具體實(shí)施方式中，提供打印表面的受試者的器官是肺、肝、心、腦、腎、皮膚、骨、胃、胰、膀胱、膽囊、小腸、大廠、前列腺、睪丸、卵巢、胸腺、和脾的全部或部分。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的胰為本文所述的方法提供打印表面。
表面在所述個(gè)體的內(nèi)部。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞、可流動(dòng)ECM、和/或任何附加組分沉積在(打印在)受試者體內(nèi)或體表的表面上，其中所述表面在所述個(gè)體的體腔或器官內(nèi)部。
表的表面是已進(jìn)行生物打印的表面，例如已根據(jù)本文所述的方法進(jìn)行生物打印。在某些實(shí)
施方式中，生物打印表面包含合成材料。在某些實(shí)施方式中，合成材料是PCL。
另一種實(shí)施方式中，本文提供了根據(jù)本文所述方法適合使用的包含可流動(dòng)ECM(例如上述
4.1.3節(jié)中所述的可流動(dòng)ECM)的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了根據(jù)本文所述方法
適合使用包含一種或多種交聯(lián)劑(例如上述4.1.3.2節(jié)中所述的交聯(lián)劑)的組合物。
含干細(xì)胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)、組織塑料貼壁胎盤干細(xì)胞(PDACs)、
和/或羊膜來源的貼壁細(xì)胞(AMDACs)。在另一種具體實(shí)施方式中，可流動(dòng)ECM來自胎盤(例
如人胎盤)。
4.1.3.2節(jié)中所述的交聯(lián)劑)的組合物。
4.1.3.2節(jié)中所述的交聯(lián)劑)之外，還可以另外包含其他組分。在某些實(shí)施方式中，本文提
供的組合物另外包含水凝膠(例如熱敏水凝膠和/或光敏水凝膠)?；蛘撸梢詫⑺z配
制在獨(dú)立于本文提供的含細(xì)胞和ECM組合物的組合物中。在某些實(shí)施方式中，本文提供的
組合物另外包含合成聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚偏二氯乙烯、聚(鄰-羧基苯氧基)-對(duì)二
甲苯)(聚(o-CPX))、聚(丙交酯-酸酐)(PLAA)、n-異丙基丙烯酰胺、季戊四醇二丙烯酸
酯(pent erythritol diacrylate)、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纖維素、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、和/或熱塑性聚合物(例如聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸、聚對(duì)苯二甲酸丁二酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚乙酸乙烯酯、和/或聚氯乙烯)?；蛘?，可以將合成聚合物配制在獨(dú)立于本文提供的含細(xì)胞和ECM組合物的組合物中。在某些實(shí)施方式中，本文提供的組
合物另外包含腱生蛋白C或其片段?；蛘?，可以將腱生蛋白C或其片段配制在獨(dú)立于本文
提供的含細(xì)胞和ECM組合物的組合物中。在某些實(shí)施方式中，本文提供的組合物另外包含
鈦-鋁-釩(Ti6Al4V)。或者，可以將Ti6Al4V配制在獨(dú)立于本文提供的含細(xì)胞和ECM組合
物的組合物中。
因子、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(1、2和3)、骨橋蛋白、骨形成蛋白-2、生長(zhǎng)激素如促生長(zhǎng)素、細(xì)胞引誘劑和粘附劑等、及其混合物。或者，可以將一種或多種促進(jìn)組合物中使用的細(xì)胞的生存、分化、增殖等的附加組分配制在獨(dú)立于本
文提供的含細(xì)胞和ECM組合物的組合物中。
植)的受試者。移植，包括移植(grafting)(例如皮膚移植)的方法和手術(shù)移植程序?qū)Ρ?br>領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并且可以對(duì)其進(jìn)行修改以符合本文所述的方法。
于另一個(gè)受試者，例如供者、尸體等。在某些實(shí)施方式中，本文所述的方法中使用的細(xì)胞來自于移植受者，而本文所述的方法中使用的ECM并非來自于移植受者，而是來自于另一個(gè)
來源。在某些實(shí)施方式中，本文所述的方法中使用的ECM來自于胎盤(例如人胎盤)。在某
些實(shí)施方式中，本文所述的方法中使用的ECM來自于移植受者，而本文所述的方法中使用
的細(xì)胞并非來自于移植受者，而是來自于另一個(gè)來源。
至少一種細(xì)胞組合物包含間充質(zhì)干細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，該方法中使用的一種
或多種細(xì)胞組合物(the cellular composition(s))包含表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、和間充質(zhì)干細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者皮膚的一部分。
或骨癌)。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的一塊或多塊骨。
方式中，所述受試者已被診斷患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病)。在另一
種具體實(shí)施方式中，所述受試者受到外傷，損壞了受試者的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)，例如受試者經(jīng)受了外傷性腦損傷(TBI)或脊髓損傷(SCI)。在另一種具體實(shí)施方式中，所述受試者是
人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的腦。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的脊髓。
肝。
肺。
織(例如受試者患有心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病、或心臟瓣膜問題)。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的心臟。在另一種具體實(shí)施
方式中，受試者的表面是受試者的一條或多條動(dòng)脈或靜脈。
些實(shí)施方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，方法中使用的細(xì)胞組合物包
含至少一種類型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和一種類型的基質(zhì)細(xì)胞。在另一種具體實(shí)施方式中，所述一種
類型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和所述一種類型的基質(zhì)細(xì)胞存在于由自體同源(autologous)或同種異源
(allogeneic)的腎組織解聚的腎細(xì)胞群中。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受
試者的一個(gè)或兩個(gè)腎。
中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的胰臟。
些實(shí)施方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的前列腺。
中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的胃。
方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的結(jié)腸。
織(例如受試者患有腸部疾病)。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是人。在另一種具體實(shí)施
方式中，受試者的表面是受試者小腸的一部分。在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者大腸的一部分。
在另一種具體實(shí)施方式中，受試者的表面是受試者的食道。
述的一種或多種因子，例如受試者缺乏所述的一種或多種因子(例如由于基因突變或遺傳
易感性)。在某些實(shí)施方式中，受試者是人，例如具有遺傳病或失調(diào)的人，其中所述遺傳病或失調(diào)可以全部或部分地用所述一種或多種因子進(jìn)行治療。在另一種具體實(shí)施方式中，受試
者是患有可以全部或部分地用所述的一種或多種因子治療的疾病的人。根據(jù)這樣的實(shí)施方
式，細(xì)胞可以沉積在所述受試者體內(nèi)或體表的任何表面上，只要由所述細(xì)胞表達(dá)的一種或
多種因子的量足以治療所涉及的疾病或失調(diào)。所述細(xì)胞可以沉積在其上的受試者體內(nèi)或體
表的示例性組織和器官在上述4.1.2節(jié)中描述?？梢杂伤黾?xì)胞產(chǎn)生的示例性因子在上述
4.1.1節(jié)中描述。
病或失調(diào)的受試者。
實(shí)施方式中，本文所述的方法用于在已被診斷為骨或結(jié)締組織肉瘤、腦癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌(例如小細(xì)胞肺癌(SCLC)、(NSCLC)、喉癌、和間皮瘤)、結(jié)腸癌和/或前列腺癌的受試者中構(gòu)建組織。
腦膜炎、阿爾茨海默病、帕金森氏病、中風(fēng)、或多發(fā)性硬化。
損傷(SCI)。
性心肌病)、心力衰竭、中風(fēng)、驗(yàn)證性心臟病、高血壓性心臟病、或心臟瓣膜病。
在某些實(shí)施方式中，接受根據(jù)本文所述方法生成的組織或器官移植的受試者是人。
類嬰兒。在某些實(shí)施方式中，接受根據(jù)本文所述方法生成的組織或器官移植的受試者是人
類兒童。
藥物或生物制品的制造、使用或銷售的公告(notice)，所述公告表明獲得政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)進(jìn)
行制造、使用或銷售，用于人給藥。
打印合成材料和ECM的支架(混合支架)代表了一種合適的基材，用于細(xì)胞，包括胎盤細(xì)
胞，例如胎盤干細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。
(54×54×0.64mm)。打印條件如下：溫度為90℃，打印壓力為3～5.5巴，打印速度為2～
6mm/s，用合適尺寸的針頭。如前所述從人胎盤中分離ECM(參見，例如Bhatia MB,Wounds
20,29,2008)。將分離的ECM施加于生物打印PCL支架的兩面，使其干燥(脫水)，以生成
包含PCL和ECM的混合支架。將獲得的混合PCL-ECM支架插入10mm直徑的盤上，用介質(zhì)
預(yù)濕過夜，并用根據(jù)本文所述方法制備的胎盤干細(xì)胞(參見，例如4.1.1節(jié))接種，密度為
2
12,500個(gè)細(xì)胞/cm。細(xì)胞培養(yǎng)8天的時(shí)間。在不同的時(shí)間點(diǎn)(n＝3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行
鈣黃綠素染色和MTS增殖檢測(cè)，以確定細(xì)胞活力和增殖。
結(jié)構(gòu)的打印使得能夠制造包含不同性能的混合支架。
8天的培養(yǎng)期中，接種在混合支架上的胎盤干細(xì)胞證明有良好的活性，如鈣黃綠素染色所顯示的(圖4)。這些數(shù)據(jù)共同表明PCL-ECM混合支架支持細(xì)胞粘附、生存、和生長(zhǎng)。
在支架的每一層中，首先打印PCL，然后打印ECM/細(xì)胞組分以充滿PCL紋路之間的空隙。這
種層打印兩層或五層，并用CaCl2溶液交聯(lián)已生成混合支架。培養(yǎng)生物打印的含細(xì)胞支架
(細(xì)胞/ECM/PCL)七天，在不同的時(shí)間點(diǎn)通過鈣黃綠素染色和MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞增
殖和存活。
支架中的ECM，表明ECM促進(jìn)細(xì)胞粘附和在ECM水凝膠中的散布。通過將細(xì)胞在單獨(dú)的藻酸
鹽中的位置與細(xì)胞在支架中的位置進(jìn)行比較可以證明這一點(diǎn)。此外，如圖9所示，MTS細(xì)胞
增殖檢測(cè)證明對(duì)于2層和5層的支架，細(xì)胞數(shù)量均增加，表明這些混合支架支持細(xì)胞生長(zhǎng)。
支架的組分(ECM和PCL)一起進(jìn)行生物打印，并且所述細(xì)胞在生物打印過程中存活。進(jìn)一
步，當(dāng)在這種支架上培養(yǎng)時(shí)，與混合支架組分一起進(jìn)行生物打印的細(xì)胞增殖，并且與在單獨(dú)的細(xì)胞基質(zhì)(藻酸鹽)中培養(yǎng)時(shí)相比，更好地散布于整個(gè)支架上。
酸內(nèi)酯(PCL)，然后打印β-TC-6細(xì)胞，以藻酸鹽-ECM水凝膠(1％藻酸鹽和12％ECM)中15
百萬個(gè)細(xì)胞/ml的量在PCL紋路之間混合。將整個(gè)支架浸在1％氯化鈣溶液中交聯(lián)20分
鐘。然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在6孔板中在含有15％胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中(每孔3-5ml
培養(yǎng)基)培養(yǎng)支架。在不同的時(shí)間點(diǎn)，收獲支架進(jìn)行鈣黃綠素染色和MTS增殖檢測(cè)，以分別
表征細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖。圖10顯示了生物打印支架的結(jié)構(gòu)。
測(cè)證明胰島素產(chǎn)生β-TC-6細(xì)胞保持存活達(dá)3周，存活細(xì)胞的總體數(shù)量保持恒定(參見圖
11)。
并通過小鼠胰島素ELISA試劑盒(Millipore)測(cè)量來自每一個(gè)支架的上清等分的胰島素濃
度。在第0天檢測(cè)到最高水平的胰島素產(chǎn)生(參見圖12)。在之后的培養(yǎng)物中(第3天和
第6天)分泌的胰島素水平下降，但從第3天至第6天在培養(yǎng)物中保持穩(wěn)定(參見圖12)。
因此在進(jìn)行生物打印后β-TC-6細(xì)胞保持產(chǎn)生和分泌胰島素的能力。
是否保持此功能(參見圖13)。將一個(gè)支架(圖13中的“A”)暴露于葡萄糖饑餓條件(不
含葡萄糖的IMDM培養(yǎng)基，含10％FCS)兩天，然后負(fù)荷以胰島素產(chǎn)生條件(50mM葡萄糖/1mM
IBMX)。作為對(duì)照，將生物打印支架保持在具有穩(wěn)定葡萄糖水平的正常培養(yǎng)基中(圖13的
“B”和“C”)。在對(duì)照中，在對(duì)測(cè)試支架(即圖13的A)進(jìn)行胰島素產(chǎn)生條件負(fù)荷的同時(shí)更
換培養(yǎng)基。每半個(gè)小時(shí)對(duì)每一個(gè)培養(yǎng)物(A、B和C)的上清進(jìn)行取樣并通過ELISA測(cè)定每一
個(gè)上清的胰島素濃度。圖13顯示了不同時(shí)間點(diǎn)每一個(gè)培養(yǎng)物的胰島素產(chǎn)生水平，并證明暴
露于葡萄糖饑餓條件，并隨后負(fù)荷以胰島素產(chǎn)生條件的生物打印支架(即圖13的A)在負(fù)
荷后3小時(shí)產(chǎn)生的胰島素比負(fù)荷后0.5小時(shí)產(chǎn)生的胰島素水平高多于80倍，而對(duì)照(即圖
13的B和C)產(chǎn)生更少的胰島素(在更換培養(yǎng)基后3小時(shí)產(chǎn)生的胰島素僅僅比更換培養(yǎng)基
后0.5小時(shí)產(chǎn)生胰島素水平高大約2倍)。
附附圖而變得顯而易見。這種修改將落入所附權(quán)利要求的范圍。
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