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作為血液代用品葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備方法

閱讀：957發(fā)布：2020-05-18

專利匯可以提供作為血液代用品葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且一種具有50kD-500kD的平均分子量的血紅蛋白(Hb)-葡聚糖(Dx)共軛物提供了獲得可接受的紅血球沉淀速度(ESR)和排泄速度(EXC)的 血液代用品 。本 發(fā)明 的DxHb共軛物可作為血液代用品用于各種目的。，下面是作為血液代用品葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種載氧化合物的制備方法，所述化合物包含與葡聚糖分子共價相連的血紅蛋白的共軛物，所述方法包括：
1)將葡聚糖與溴化合物反應以在所述葡聚糖上提供含溴基團，由此提供活化葡聚糖；
2)用過濾器將所述活化葡聚糖過濾；
3)將所述活化葡聚糖與血紅蛋白反應由此提供共軛的葡聚糖-血紅蛋白分子；
4)用具有使保留物具有大于500kD分子量的孔徑的過濾器將所述葡聚糖-血紅蛋白分子過濾，再通過具有使過濾物包含大于80kD分子量的孔徑的過濾器過濾。
2.權利要求1的方法，其中所述葡聚糖具有20kD的平均分子量。
3.權利要求1的方法，還包括用具有使保留物具有大于500kD分子量的孔徑的過濾器過濾所述活化葡聚糖。
4.權利要求1的方法，其中所述血紅蛋白是無基質(zhì)的血紅蛋白。
5.一種載氧化合物的制備方法，所述化合物包含與葡聚糖分子共價相連的血紅蛋白的共軛物，所述方法包括：
1)將葡聚糖與溴化合物反應以在所述葡聚糖上提供含溴基團，由此提供活化葡聚糖；
2)用過濾器將所述活化多糖過濾；
3)將所述活化葡聚糖與血紅蛋白反應由此提供共軛的葡聚糖-血紅蛋白分子；
4)用具有使保留物具有大于300kD分子量的孔徑的過濾器將所述葡聚糖-血紅蛋白分子過濾，再通過具有使過濾物包含大于80kD分子量的孔徑的過濾器過濾。
6.權利要求5的方法，其中所述葡聚糖具有20kD的平均分子量。
7.權利要求5的方法，其中所述血紅蛋白是無基質(zhì)的血紅蛋白。

說明書全文

作為血液代用品葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備方法

[0001] 本申請是2001年9月19日提交的申請?zhí)枮?1817437.X、發(fā)明題目為“葡聚糖-血紅蛋白共軛物作為血液代用品”的分案申請。
[0002] 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及血液代用品，及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及用作哺乳動物的血液代用品的改進的多糖-血紅蛋白共軛物以及這種共軛物的制備方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 近年來，尋找安全的血液代用品快速增加。這種需要經(jīng)常超過了可從人供體獲得的血液的供應。此外，世界上許多地區(qū)，全血供應可能是危險的。因此，需要開發(fā)血液代用
品。
[0006] 血液最重要的功能之一是從肺攜帶氧支持組織呼吸。血紅蛋白(Hb)在開發(fā)臨床血液代用品中是一種吸引人的氧載體，原因是它屬于廣泛溶解性的呼吸色素，攝取和
釋放氧，并且首先是其運輸大量氧的能力。然而，游離Hb本身作為血液代用品的一個根
本缺陷在于其相對小的分子大小(為64.5kD)和因此高的腎排泄速度(EXC)，從而導致
從循環(huán)中快速清除。因此，為了防止Hb的腎排泄并延長其血漿半衰期，已采用與載體聚
合物的共價共軛。這些共軛物被稱之為血紅蛋白基氧載體(HBOC)。這些聚合物的實例
包括：葡聚糖和葡聚糖的生物聚合物衍生物、菊粉、羥乙基淀粉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷
酮(S.P.Tsai和J.T.-F.Wong，葡聚糖-血紅蛋白，其中：Winslow，R.N.、Vandegriff，
K.D.和Intaglietta，M.[編輯]，1997血液代用品的優(yōu)點：Industrial Opportunities and
Medical Challenges，Birlchauser，Boston；將這些文獻的內(nèi)容通過引用加入本文)。
[0007] 氧傳送的效率是由總血液流量和體積、氧含量、紅細胞或血紅蛋白質(zhì)量、氧親和力和氧消耗的速度決定的。氧含量、傳送和利用之間的關系最好通過Fick等式列舉。因此顯
而易見，單位體積可以運載和傳送最大量氧同時保持優(yōu)異流變特性的血液代用品將是理想
的。
[0008] 葡聚糖-血紅蛋白(DxHb)是一種已作為血液代用品提出的共軛物。水溶性、在廣泛分子大小的可用性、和沒有顯著毒性或組織向性的組合，在可生物降解聚合物中賦予了
葡聚糖成為優(yōu)異的藥物載體。葡聚糖(Dx)與血紅蛋白(Hb)共價共軛增加了Hb的有效大
小，并因此減少了其通過腎臟系統(tǒng)的排泄速度(EXC)。
[0009] 已提出了該共軛物溶液的粘度的穩(wěn)定方法，并進行了與狗和獼猴中的DxHb交換輸血(Tam等，1976，Tam等，1978，Wong 1988)。然而，迄今還沒有研究該共軛物的流動性。
在美國專利US 4,064,118和4,650,786中提供了DxHb共軛物的實例，將這些文獻的內(nèi)容
通過引用加入本文。其中′118專利教導一種可用作血液代用品或血液膨脹劑的組合物，
它是將血紅蛋白(Hb)與分子量為約5kD-2000kD的葡聚糖(Dx)偶聯(lián)制備的。該DxHb共軛
物的分子量是70-2000kD。然而已發(fā)現(xiàn)，與血紅蛋白相比，根據(jù)美國專利US 4,064,118的產(chǎn)
品趨于顯示對氧或多或少較大的親和力，但是保留了血紅蛋白的主要氧運輸和釋放能力。
[0010] 美國專利US 4,650,786公開了一種氧親和力降低的改進的葡聚糖-血紅蛋白復合物。該DxHb復合物的分子量是70-2000kD。
[0011] 與DxHb復合物，或改進的DxHb復合物相伴的問題之一是，貯藏時共軛物溶液的粘度增加，由此使該溶液不適宜施用。上面問題的解決方法描述在美國專利US 4,900,816，將
其內(nèi)容通過引用加入本文。已顯示葡聚糖部分的活化位置可以被封閉，并且貯藏時的粘度
得以穩(wěn)定，沒有影響該血紅蛋白復合物的氧運輸性能。美國專利US4,900,816教導一種分
子量為約70kD-約2000kD的化合物，包含血紅蛋白殘基、降低氧親和力的配體、多糖(例如
葡聚糖)、共價連接的化 學橋接基團和封閉活化基團。
[0012] 正如上面所述的，血液代用品的一個重要特性是其流變特性-就代用品而言為了成為生理可接受的，其粘度不要高至阻礙血液流動。盡管紅細胞的凝聚是造成血液粘度增
加，尤其是在較低剪切速度下，的一個重要因素，但是紅細胞凝聚的實際機理仍然未完全闡
明。紅細胞的凝聚可以通過各種方式引起。一般說來，粘度和RBC凝聚都隨免疫球蛋白的
濃度增加而增加；然而，兩者之間的精確關系顯然是很復雜的。因此重要的是表征DxHb在
其開發(fā)為血液代用品時的可能的物理-化學性能。
[0013] 正如下面所述的，在本發(fā)明中，合成了各種DxHb制品，并且通過測定這些溶液的粘度及其凝聚趨勢來測定其流變性能，該凝聚趨勢是以紅血球沉淀速度(ESR)試驗
(Dintenfass 1985，將其內(nèi)容通過引用加入本文)來評估的。高分子以一定“臨界濃度”存
在于血漿中可能會誘導紅細胞(RBC)凝聚并依次增加血液粘度，尤其是在低剪切速度下。
[0014] 血液在低剪切區(qū)域，特別是在靜脈循環(huán)中的流動，因其紅血球凝聚的增強而大大降低，該紅血球凝聚增加血液粘度并通過形成沉淀物而阻礙毛細管流動(Dintenfass
1981)。紅細胞，RBC，凝聚是高分子在相鄰紅血球表面之間橋接的結(jié)果。當未包封的血紅
蛋白-基血液代用品被輸入循環(huán)時，這些高分子還會與紅血球相互作用并誘導RBC凝聚，
ESR是受這種凝聚影響的一種最早的血液流變學參數(shù)。依次，根本感興趣的是測定血紅蛋
白-基血液代用品在其設計和開發(fā)過程中的ESR強化效果。
[0015] 已知分子大小是通過高分子橋接機理強化ESR的一個關鍵性決定物。20kD的葡聚糖不誘導RBC凝聚，因此ESR沒有升高，但是大于40kD的葡聚糖完全能夠提高ESR(Chien
和Jan 1973；將其內(nèi)容通過引用加入本文)。前面的研究顯示，大于220kD的高分子結(jié)合的
血紅蛋白將誘導RBC凝聚，這樣可以增加低剪切速度的血液粘度并影響RBC在循環(huán)中的分
布(Tsai和Wong 1996；將其內(nèi)容通過引用加入本 文)。
[0016] 本發(fā)明提供了一種具有導致低EXC和ESR水平的分子量的DxHb共軛物，因此提供了一種有效的血液代用品或血漿膨脹劑。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種載氧化合物，包含一種與多糖共價相連的血紅蛋白的共軛物，該共軛物具有約50kD-約500kD的平均分子量。
[0019] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供了一種載氧化合物的制備方法，該化合物包含與多糖共價相連的血紅蛋白的共軛物，該方法包括：
[0020] 1)將多糖與溴化合物反應以在多糖上提供溴基，由此提供一活化多糖；
[0021] 2)用第一過濾器將該活化多糖過濾；
[0022] 3)將該活化多糖與血紅蛋白反應由此提供一偶聯(lián)的葡聚糖-血紅蛋白分子；
[0023] 4)用第二過濾器將該葡聚糖-血紅蛋白分子過濾。
[0024] 附圖簡述
[0025] 參照附圖，通過以下詳細描述，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的這些和其它特征將變得顯而易見，其中：
[0026] 圖1描述了由兩個開始大小，10kD(DxT10)和20kD(DxT20)的葡聚糖分子合成的葡聚糖-血紅蛋白的紅血球沉淀速度(ESR)和排泄速度(EXC)的大小依賴性。
[0027] 圖2描述了用標準蛋白校準凝膠過濾柱，SuperdexTM200、26/600。
[0028] 圖3描述了用FPLC和MiniDawn激光檢測器測定的四個最優(yōu)選DxHb制品的分子量分布。
[0029] 圖4和5描述了實施例5的試驗結(jié)果。
[0030] 優(yōu)選實施方式的描述
[0031] 本文所用的術語“血紅蛋白”將理解為包含由任何哺乳動物的紅細胞獲得的血紅蛋白。盡管主要涉及人血紅蛋白，但是本發(fā)明同樣適用于由其它動物獲得的血紅蛋白并包
括牛和豬血紅蛋白。
[0032] 在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了一種載體多糖-血紅蛋白共軛物，更優(yōu)選一種用作血液代用品或HBOC的改進的葡聚糖-血紅蛋白(DxHb)共軛物。正如下面進一步
討論的，該DxHb共軛物，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，具有約50kD-約500kD，更優(yōu)選約
89kD-116kD的分子量(MW)。由于Hb的大小通常是恒定的事實，因此該分子大小范圍主要是
以Hb和Dx分子之間的共軛量為基礎的。已發(fā)現(xiàn)這種范圍的共軛物大小使得分子在大小上
比Hb足夠大，以便這種分子的EXC速度不高，同時也提供在大小上足夠小的分子，以便這種
分子的ESR也不高。正如下面進一步所述的，與EXC速度有關的術語“高”是1％，對ESR而
言是20mm/hr。本發(fā)明還提供了這種共軛物的生產(chǎn)方法。本文所含的實施例僅僅是為了描
述目的提供的，并不意味著限制本發(fā)明的范圍，這一點對本領域技術人員將是顯而易見的。
[0033] 1.無基質(zhì)的人血紅蛋白(SFH)的制備
[0034] 通過溶解紅細胞并釋放用于本發(fā)明方法的血紅蛋白生產(chǎn)一種純血紅蛋白溶液。然后對這些制品加工除去溶液中的基質(zhì)以避免腎損害。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，通過
Winslow和Chapman(Meth.Enzymol.，1994，231：3-16)所述的標準過濾工藝制備一高純度
的血紅蛋白溶液，，將該文獻的內(nèi)容通過引用加入本文。
[0035] 2.通過烷基化法活化葡聚糖
[0036] 正如上面討論的，多糖與血紅蛋白共價共軛增加了其有效大小，因此防止了其腎排泄。本發(fā)明的多糖具有確定的生物相容性并且能夠與血紅蛋白結(jié)合。本發(fā)明的優(yōu)選多糖
是葡聚糖。
[0037] 本發(fā)明的葡聚糖可以具有10kD(稱之為葡聚糖T10)-20kD (稱之為葡聚糖T20)的平均分子量。應指出的是可商購獲得的葡聚糖通過其平均分子量分類并且葡聚糖分子的
大小變化是固有的。推測當使用10kD葡聚糖時DxHb存在較高的腎以及非腎排泄。因此，
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，葡聚糖最優(yōu)選的開始大小是20kD。
[0038] 為了將葡聚糖改性為能夠與血紅蛋白反應，它必須被“活化”，優(yōu)選通過烷基化反應。具體地說，該葡聚糖在堿性pH下與溴化氰(CNBr)反應，接著與二氨基乙烷反應。將所
得氨基乙基氨基-葡聚糖透析。該透析步驟用于洗滌掉小的反應分子或反應過的殘余物
質(zhì)，例如二氨基乙烷。
[0039] 這之后，在中性pH下將氨基乙基氨基-葡聚糖用溴代-乙酰溴?；又鄬λM行透析并冷凍干燥。葡聚糖活化的該方法由S.C.Tam、J.Blumenstein和J.T.F.Wong
詳細描述在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，73：2128-2131；將其內(nèi)容通過引用加入本文。
[0040] 兩個試驗，茚三酮和硝酸銀試驗，用于監(jiān)控透析結(jié)束。具體地說，對來自透析步驟的濾液進行這些試驗，由此通過S.Moore和W.H.Stein(J.Biol.Chem.，1948，176：367-388；
將其內(nèi)容通過引用加入本文)所述的茚三酮試驗檢測氨基的存在。進行硝酸銀試驗以檢測
溴基的存在，如下面討論的。下面還將進一步描述這兩個試驗。
[0041] 3.葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備
[0042] 通過向稱之為N-溴-乙酰氨基-乙基氨基-葡聚糖(DxBr)的活化的葡聚糖中加入無基質(zhì)的血紅蛋白進行血紅蛋白與葡聚糖偶聯(lián)的最終步驟。該偶聯(lián)反應包括除去活化葡
聚糖(DxBr)的-Br基和除去血紅蛋白的巰基(-SH)的氫原子，使Dx-與HbS-結(jié)合從而獲
得DxHb。溴代-氨基乙基氨基-葡聚糖(DxBr)和Hb之間的連接是在β-93半胱氨酸(共
價連接的位置)通過自由-SH介導的。在偶聯(lián)反應的過程中，-Br從DxBr分離并變成自由
Br離子，它后來被透析掉?？梢允褂孟跛徙y試驗(下面進一步描述)測定Br離子的存在。
[0043] 葡聚糖與血紅蛋白的共軛是按照S.C.Tam、J.Blumenstein和J.T.F.Wong(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，73：2128-2131，將其內(nèi)容通過引用加入本文)進行的。根據(jù)本
發(fā)明的優(yōu)選實施方式，該共軛反應是通過將DxBr和無基質(zhì)的血紅蛋白混合入含有0.33％
DxBr和1％無基質(zhì)的血紅蛋白溶液的水溶液中進行的。Hb和DxBr的這種濃度確保3∶1
重量或1∶1摩爾質(zhì)量比的DxHb偶聯(lián)。然而，獲得這些比例的反應物的其它最初濃度對本
領域技術人員將是顯而易見的。
[0044] 溴代-葡聚糖(DxBr)與高濃度的血紅蛋白溶液的偶聯(lián)(即共軛)試驗使得交聯(lián)度較高，由此使得所得共軛物的摩爾重量較高。因此，為了具有較高比例的相對小的DxHb分
子，優(yōu)選使用較低(即1％)濃度的Hb進行該偶聯(lián)反應。然而，應理解的是可以進行DxBr
與或者比1％濃度高或者比其低的血紅蛋白的偶聯(lián)。
[0045] 在具有碳酸氫鈉緩沖劑的pH為9.5的溶液中進行該偶聯(lián)反應。溶液混合物首先用0.22μm過濾器殺菌并按照H.Xue和J.T.F.Wong(Meth.Enzymol，1994，231：308-322，將
其內(nèi)容通過引用加入本文)所述的方法在4℃下將該偶聯(lián)反應進行過夜。將該偶聯(lián)反應進
行約10-16小時，最優(yōu)選16小時。較長的偶聯(lián)時間，由于交聯(lián)度較高，因此獲得較高平均分
子量的DxHb。
[0046] 然后將β-巰基丙酸加入與DxBr上的任何殘余溴基反應，由此使偶聯(lián)反應停止。而且，隨著這加入也使交聯(lián)反應停止，由此防止了溶液粘度的任何進一步升高(S.P.Tsai
和J.T.F.Wong，在：Winslow，R.W.、Vandegriff，K.D.和Intaglietta，M.(編輯)，Advances
inBlood Substitutes，1997，Birkhauser，Boston，將其內(nèi)容通過引用加入本文)。然后將
該溶液經(jīng)過相對磷酸鹽緩沖液的透析以清除任何殘余的反應物和反應副產(chǎn)物。
[0047] 因此，獲得上面共軛的烷基化方法可以匯總?cè)缦?如Blumenstein等，Experimental Transfusion of Dextran-Hemoglobin，(1978)中所述；將其內(nèi)容通過引用
加入本文)：
[0048] 1)Dx+CNBr→活化Dx
[0049] 2)活化Dx+二氨基乙烷→氨基乙基氨基-葡聚糖
[0050] 3)氨基乙基氨基-葡聚糖+溴代乙酰溴→N-溴-乙酰氨基乙基氨基-葡聚糖
[0051] 4)N-溴-乙酰氨基乙基氨基-葡聚糖+血紅蛋白-SH→血紅蛋白-S-乙酰氨基乙基氨基-葡聚糖
[0052] 4.DxHb分餾和ESR、EXC和MW之間的關系
[0053] 在發(fā)現(xiàn)通過過大DxHb分子強化ESR之后加入分餾步驟。為了確定分子大小、ESR和EXC之間的關系，該DxHb優(yōu)選由具有至少兩個開始平均大小10kD(DxT10)和20kD(DxT20)
的葡聚糖分子合成。所得共軛物，DxT10Hb和DxT20Hb，使用Waters 650E先進蛋白質(zhì)提純
TM TM
系統(tǒng)進行分餾。更具體地說，該分餾是在Hiload 26/60Superdex 200預備級凝膠過濾柱
(Pharmacia)上進行的。使用10mM磷酸鹽緩沖溶液，pH 7.4，作為洗脫緩沖液并且洗脫流
速是0.5ml/min。所用樣品是8ml的8％DxHb。使用ISCO Retriever II收集餾份(餾份
收集8分鐘，即每一餾份4ml)。如下所述測定餾份的ESR和EXC。然而，由于由柱分餾步驟
獲得的樣品量不夠ESR和EXC試驗，因此將幾次餾份匯集并用Centriprep 30(Amicon)濃
縮，以便有足夠樣品(每一大小的)進行這兩種試驗。還測定每一餾份的平均MW。盡管上
面提到的分餾步驟描述涉及到DxHb，但是本領域技術人員應理解的是，這種分餾步驟也可
以對DxBr前體分子進行。在這種情況下，使用上述方法將DxBr餾出物與Hb共軛，從而獲
得所需大小范圍的DxHb餾份。下面描述按照本發(fā)明優(yōu)選實施方式進行的測定的細節(jié)。
[0054] 4.1.ESR測定
[0055] 紅血球沉淀速度(ESR)是一種定量紅細胞凝聚的方式。這種凝聚通常是因高分子的存在引起的。為了該測定，優(yōu)選通過將6.0％試驗溶液與等體積的剛抽出的檸檬酸化大鼠
全血制備樣品。ESR測定應在 抽出鮮血之后的3-4小時內(nèi)進行，這是因為懸液穩(wěn)定性的潛
在變化和長時間靜置下紅細胞的紅血球變形性。當使用取自大鼠的血液時發(fā)現(xiàn)這一點。根
據(jù)廠商Clay Adams，Division of Becton Dickison andCompany，Parisippany，N.J.，07054
USA提供的說明進行ESR測定。以垂直位置將溶液在可重復使用的Clay Adams Wintrobe
Blood沉淀管(115mm長，具有3.0mm孔)中于ESR支架(ChaseInstruments)上室溫(約
20-22℃)下保持60分鐘。該方法在本文通常稱之為“Wintrobe法”并且該方法的描述提
供于″Introductionto Medical Laboratory Technology″，Baker和Silverstein(編
輯)，第5版第605-606頁，Butterworths，將其內(nèi)容通過引用加入本文。
[0056] 將這些沉淀管以1mm間隔劃刻度。就一些制品而言，沉淀和上清液之間沒有清楚的邊界，但是在ESR管的上面部分觀察到漸漸的顏色變化。就這些制品而言，ESR以一個范
圍(例如1-18mm/hr，表2)表示。可接受的ESR呈現(xiàn)為20mm/hr。
[0057] 應指出的是ESR的其它測定方法對本領域技術人員來說是顯而易見的。例如，代替上面所述的Wintrobe法，也可以使用″Introduction to Medical Laboratory
Technology″，Baker和Silverstein(編輯)，第5版，第606-607頁，Butterworths中所
述的Westergren法，將其內(nèi)容通過引用加入本文。這些方法將獲得不同的ESR值，然而，在
本情況下將得出相同結(jié)論。
[0058] 4.2.EXC測定
[0059] 進行排泄速度(EXC)試驗以測定本發(fā)明的DxHb共軛物的腎排泄程度。為了測定EXC，將DxHb共軛物的試驗溶液輸注入平均重量為約300-350g的麻醉的雄性
Sprague-Dawley大鼠的頸靜脈中。通過D.L.Drabkin和J.H.Austin，(J.Biol.Chem.，1935，
112：51-65，將其內(nèi)容通過引用加入本文)所述的方法測定大鼠尿樣中的血紅蛋白的濃度
來評價排泄速度。盡管該EXC值優(yōu)選是0，但是可接受的值可以 是小于1％。在該水平以
上，發(fā)現(xiàn)大鼠的尿呈微紅色。
[0060] 4.3.分子量測定
[0061] 使用凝膠過濾色譜法測定DxHb共軛物的分子量，其中分子從柱洗脫以降低分子量。當DxHb分子在凝膠過濾柱上分餾時，檢測器監(jiān)控其停留時間。將Fast Protein
Liquid Chromatography(FPLC)用于本發(fā)明的DxHb共軛物的分子量測定，然而也可以使
用高效液相色譜法(HPLC)。為了描述本發(fā)明的目的，使用Waters 650E AdvancedProtein
Purification System測定分子量。在該系統(tǒng)中串聯(lián)使用以下兩個柱：1)TSK-Gel
GMPWXL(7.8x300)；和2)PharmaciaSuperose 6 HR10/30。洗脫緩沖液由10mM Tris-HCl、
0.05％疊氮化鈉組成，pH 8.0，所用流速是0.4ml/min。在該優(yōu)選實施方式中，使用可用于
DxHb的MW測定的檢測器檢驗洗脫液的組成。例如，可以將Wyatt Technology MiniDAWN激
光檢測器或紫外線檢測器用于本目的。在該優(yōu)選實施方式中，將以下3個檢測器串聯(lián)使用：
Waters 440UV Detector A280；Wyatt Technology MiniDAWN檢測器和Waters410差示折
射儀。下表1列出了生產(chǎn)的各種DxHb的峰分子量值。而且，使用上述系統(tǒng)獲得以下分子量
數(shù)據(jù)：
[0062]量
子 D
分均 k)7- D D Dk
平算 /+66 k0.6 k4.4 6.51
計 ( 1 2 1
物
留
保
的
分
組
的
Dk
08
于
大
有
具
液 得
濾 獲
的 濾
分 過
組 后
的Dk 然，
003 液濾
于 的
低 分
有 組
具 的Dk
)ai 得獲 005
camr 后之 于
ahP- 濾過 低有
P02T ，)rB 具得
xD(P xD( 獲后
02T 糖聚 之濾
bH 糖聚 葡化 過，bH
品樣 純)1 葡)2 活)3 xD)4

[0063] 通過將討論的分子的Ve/Vo比與已知分子量的蛋白質(zhì)標準的Ve/Vo相比確定各種餾份的分子量(Ve是洗脫體積，Vo是空隙體 積)。給定柱的空隙體積是以洗脫大分子如
Blue Dextran等所需的洗脫液的體積為基礎的。然后通過將蛋白質(zhì)標準的已知分子量的對
數(shù)相對它們各自的Ve/Vo值繪圖制備校準曲線。
[0064] 應指出的是測定的分子量值可以根據(jù)所用設備/方法而改變。例如，S.P.Tsai和J.F.T.Wong(Artificial Cells Blood Subst.Immob.Biotech.，1996，24：513-523)報道測
定血紅蛋白的分子量時反常。根據(jù)該報道，Hb分子，由于其致密，發(fā)現(xiàn)圓形分子結(jié)構和形狀
通過FPLC系統(tǒng)測定具有僅46kD的MW測定，而其理論值是64.5kD。如上所述，使用MiniDAWN
激光法測定Hb的分子量發(fā)現(xiàn)是66+/-7kD，范圍是58-73kD，這非常接近理論值。而且，葡聚
糖，由于其直鏈結(jié)構，使用凝膠過濾獲得一分子量讀數(shù)，即比其理論值高。當測定用于本發(fā)
明DxHb共軛物的MW限制時應考慮到這一事實。為此，為了獲得更精確結(jié)果而使用上述激
光檢測器。例如，使用這種激光檢測器，發(fā)現(xiàn)測定的Hb的分子量與其理論值接近。
[0065] 4.4.ESR和EXC對DxHb共軛物的大小依賴性
[0066] 在如上所述的洗脫體積的峰值下測定的ESR、EXC和MW數(shù)據(jù)提供于表1并描述在圖1中。
[0067] 表1.ESR和EXC對由兩個開始大小(10kD和20kD)的葡聚糖分子合成的DxHb共軛物的大小依賴性
[0068]Dx(T10)-Hb Dx(T20)-Hb
洗脫體積(mL) MW (kD) ESR(mm/hr) EXC(％) ESR (mm/hr) EXC(％)
124 1217 75
128 1067 74 73
132 935 73
136 820 72 73
140 719 71
144 630 67 70
148 553 53
152 484 43 46
156 425 13 28
160 372 8 0.00 16
164 326 2 5
168 286 1 1
172 251 0.5
176 220 0.00 0.00
180 193 0.2 0.2
184 169 0.09
188 148 0.2 0.00
192 130 0.2 0.00
196 114 0.00
200 100 0.2 0.56
204 88 1.44 1.34
208 77 0.2
212 67 2.85 1.03
216 59 0.2
220 52 7.77
224 45 0.2
228 40 16.49
[0069] 正如上面所討論的，血紅蛋白本身快速排泄的問題顯然是由于其相對低的分子量的結(jié)果。為了增加血紅蛋白的分子量從而能夠適當?shù)谋Ａ?，將其與例如葡聚糖等的多糖
偶聯(lián)。理想地，如果血紅蛋白以作 為血液代用品的DxHb共軛物的形式施用的話不應觀
察到血紅蛋白的腎排泄。然而，優(yōu)選排泄速度低于約1％，更優(yōu)選低于約0.2％(S.C.Tam
和J.T.F.Wong，大鼠中無基質(zhì)的血紅蛋白的腎功能的損害，J.Lab.Clin.Med，1988，111：
189-193；將其內(nèi)容通過引用加入本文)。
[0070] 同樣正如上面討論的，盡管較高分子量導致EXC降低，但是這種較大分子量會導致ESR的增加。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，ESR應小于約20mm/hr，更優(yōu)選ESR應小于約
1mm/hr。
[0071] 在使用凝膠過濾色譜法將本發(fā)明的DxHb共軛物以分子量為基礎分餾并測定收集的餾份對ESR的影響之后，發(fā)現(xiàn)峰分子量小于約500kD的DxHb餾份在高達20mm/hr的可接
受限度下未提高ESR。另一方面，大于約50kD的峰分子量的DxHb共軛物導致EXC值在0-1％
的可接受的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，這些結(jié)果定義了獲得所需水平的ESC和
ESR的DxHb共軛物分子量的可接受范圍是約50kD-約500kD。
[0072] 5.選擇最佳分餾步驟以獲得優(yōu)選的Dxhb共軛物
[0073] 一旦測定了DxHb共軛物的上面所需的分子量范圍，就開始搜索最佳分餾步驟。確定最佳分餾步驟所考慮的一個因素是使DxHb產(chǎn)品的產(chǎn)率最大化。高產(chǎn)率的最終產(chǎn)品避免
了DxHb的任何不必要的浪費。
[0074] 使用幾個方法達到獲得最佳分子大小的最終DxHb產(chǎn)品的目標。這些方法包括乙醇沉淀、開始葡聚糖的選擇、以及過濾。在活化步驟之前和之后，以及在共軛步驟之前和之
后，將Dx、DxBr和DxHb分餾，從而篩選較好的生產(chǎn)步驟。對各種DxHb制品的所用步驟和所
得ESR和EXC列于下表2。
[0075] 表2.通過各種方法獲得的DxHb共軛物的紅血球沉淀速度和排泄速度
[0076]# 制品 ESR (mm/hr) EXC (％) 產(chǎn)率 DxBr 產(chǎn)率 DxHb 總產(chǎn)率
Hb 無基質(zhì)的人血紅蛋白 ＜1 30-40

以DxT20P**為基礎的DxHb制品
1 DxT20P，活化，＜100kD(Millipore)，偶聯(lián) 60 ND* 57 100 57
2 DxT20P，活化，＞100kD(Millipore)，偶聯(lián) 78 ND 30 100 30
3 DxT20P，活化，＜100kD(A/G)***，偶聯(lián) 32 ND 38 100 38
4 DxT20P，活化，＞100kD(A/G)，偶聯(lián) 50 ND 53 100 53
5 DxT20P，活化，＜300kD(A/G)，偶聯(lián) 30 ND 35 100 35
6 DxT20P，活化，＞300kD(A/G)，偶聯(lián) 78 ND 60 100 60
7 DxT20P，活化，＜500kD(A/G)，偶聯(lián) 57 ND 49 100 49
8 DxT20P，活化，＞500kD(A/G)，偶聯(lián) 64 ND 42 100 42

偶聯(lián)之后分餾DxHb的不同過濾器
9 DxT20P，活化，偶聯(lián)，＜500kD＞70kD(A/G) 1-20 ND 100 49.5 49.5
10 DxT20P，活化，偶聯(lián)，＞500kD(A/G) 76 ND 100 33 33
11 DxT20P，活化，偶聯(lián)，＜750kD＞70kD(A/G) 51 ND 100 54.8 54.8
12 DxT20P，活化，偶聯(lián)，＞750kD(A/G) 73 ND 100 23.7 23.7

在偶聯(lián)之前和之后所用的選擇的過濾器
13 DxT20P，活化，＜300kD，偶聯(lián)，＜500kD＞80kD (A/G) 1 ND 35 100.2 35
14 DxT20P，活化，＜300kD，偶聯(lián)，＜500kD(A/G) 1 ND 35 99.2 34.7
15 DxT20P，活化，＜300kD，偶聯(lián)，＞500kD(A/G) ND ND 35 0.8 0.3
16 DxT20P，活化，＜500kD，偶聯(lián)，＜500kD(A/G) 1-18 ND 49 91.1 44.6
17 DxT20P，活化，＜500kD，偶聯(lián)，＞500kD(A/G) 77 ND 49 8.9 4.4
18 DxT20P，活化，＜500kD，偶聯(lián)，＜750kD＞70kD (A/G) 25 ND 49 86.3 42.3
19 DxT20P，活化，＜500kD，偶聯(lián)，＞750kD(A/G) 80 ND 49 13.7 6.7

分餾由DxT20P制備的DxBr的不同商標的過 濾器
20 T20，活化，偶聯(lián)，＞10kD(A/G) 76 0.24 100 100 100
21 T20，活化，＜30kD(A/G)，偶聯(lián) ＜1 1.60 8 100 8
22 T20，活化，＞30kD(A/G)，偶聯(lián) 76 0.30 85 100 85
[0077]4 19 41 58 41 18 81 28 71 28 22 37 001 9.99 4.99 4.89 7.56 001 8.99 6.79 2.59 9 93 9.83 2.83 2.53 5 66 52 76
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9. 4. 4. 7. 0 8. 6. 2. 0 7. 9. 3. 0 0 0 0
01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 99 99 89 56 01 99 79 59 9 01 99 79 09 01 01 01 01
4 19 41 58 41 18 81 28 71 28 22 37 001 001 001 001 001 001 001 001 001 001 93 93 93 93 5 66 52 76

DN DN DN DN DN DN DN DN DN DN DN DN 80.0 70.0 72.0 40.0 00.0 53.1 88.0 73.0 32.0 60.0 06.2 65.1 91.0 12.0 35.2 74.0 07.4 DN
81- 6 9- 4 5 4 63- 7 2 4 3 4 6 D D D D 51- D D D D D D D 5.0 0 1 5
1 7 1 7 4 7 1 7 3 7 5 7 7 N N N N 1 N N N N 1 N N N ＜ 1 ＜ 3
)G )G )G )G
/A( /A( /A( /A(
Dk0 Dk0 Dk0 Dk0
1 3 5 7
聯(lián) 聯(lián) 聯(lián) 聯(lián) ＞， ＞， ＞， ＞， 聯(lián)
聯(lián) 聯(lián) 偶，) 偶，) 偶，) 偶，) 聯(lián)偶， 聯(lián)偶， 聯(lián)偶， 聯(lián)偶， 聯(lián)偶， 偶，)M
聯(lián) 聯(lián) 偶，)n 偶，)n nort nort 聯(lián) 聯(lián) nort nort 聯(lián) 聯(lián) 品 )G )G )G )G )G/ )G )G )G )G )G/ )G/A )G/A )G/A )G/A )M(D (Dk5 聯(lián)
偶，)G/A(Dk05 偶，)G/A(Dk05 ogorciM(Dk05 ogorciM(Dk05 liFluaP(Dk05 liFluaP(Dk05 偶，)G/A(Dk06 偶，)G/A(Dk06 liFluaP(Dk07 liFluaP(Dk07 偶，)G/A(Dk001 偶，)G/A(Dk001 制bHxD的礎基 /A(Dk01＞，聯(lián) /A(Dk03＞，聯(lián) /A(Dk05＞，聯(lián) /A(Dk07＞，聯(lián) A(Dk001＞，聯(lián) /A(Dk01＞，聯(lián) /A(Dk03＞，聯(lián) /A(Dk05＞，聯(lián) /A(Dk07＞，聯(lián) A(Dk001＞，聯(lián) (Dk01＞Dk03 (Dk01＞Dk03 (Dk01＞Dk03 (Dk01＞Dk03 k5＞)M(Dk05 聯(lián)偶，)M(Dk05 ＞)G/A(Dk06 偶，)G/A(Dk06
＜ ＞ ＜ ＞ ＜ ＞ ＜ ＞ ＜ ＞ ＜ ＞ 為 偶 偶 偶 偶 偶 偶 偶 偶 偶 偶 ＜ ＜ ＜ ＜ ＜ ＞ ＜ ＞
， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， P ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，
化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 01TxD 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，02 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01 化活，01
T T T T T T T T T T T T 以 T T T T T T T T T T T T T T T T T T
42 52 62 72 82 92 03 13 23 33 43 53 63 73 83 93 04 14 24 34 44 54 64 74 84 94 05 15 25 35
[0078]
54 T10，＞50kD(M)，活化，偶聯(lián) 1 0.18 66 100 66
用于分餾DxT10所用的乙醇
55 T10，0-55％乙醇ppt****，活化，＜30kD＞10kD (A/G)，偶聯(lián)，＞10kD(A/G) ＜1 0.41 45 100 45
56 T10，0-55％乙醇ppt，活化，＜30kD＞10kD (A/G)，偶聯(lián)，＞30kD(A/G) ND 0.51 45 99.8 44.9
57 T10，0-55％乙醇ppt，活化，＜30kD＞10kD (A/G)，偶聯(lián)，＞50kD(A/G) ND 0.47 45 97.9 44.1
58 T10，0-55％乙醇ppt，活化，＜30kD＞10kD (A/G)，偶聯(lián)，＞70kD(A/G) ND 0.13 45 96.1 43.2
59 T10，0-55％乙醇ppt，活化，＜30kD＞10kD (A/G)，偶聯(lián)，＞100kD(A/G) ND 0.00 45 40.2 18.1

60 T10，0-49％乙醇ppt，活化，偶聯(lián) 62 ND 19 100 19
61 T10，49-55％乙醇ppt，活化，偶聯(lián) 15 ND 17 100 17
62 T10，55-80％乙醇ppt，活化，偶聯(lián) ＜1 ND 11 100 11
63 T20，0-46％乙醇ppt，活化，偶聯(lián) 73 ND 40 100 40
64 T20，46-75％乙醇ppt，活化，偶聯(lián) 23 ND 54 100 54
[0079] 其中：
[0080] 1)“DxT10”和“DxT20”是指葡聚糖(Dx)分子的開始大小；即平均分子量分別為10或20kD。
[0081] 2)“活化”意思是Dx通過如上所述的烷基化活化。
[0082] 3)“偶聯(lián)”是指DxBr與Hb如上所述的共軛、或偶聯(lián)。
[0083] 4)“＜100kD”或“＞500kD”等是指在DxBr或DxHb的過濾步驟期間所用的過濾器的截留值。而且，符號“＜”和“＞”分別是指濾液和保留物各自的值。例如，“＜100kD”
是指過濾器提供僅含分子量小于100kD的那些分子的濾液。類似地，“＞500kD”是指過濾
器提供具有分子量大于500kD的分子的保留物。
[0084] *ND＝未檢出
[0085] **所有Dx樣品(即T10、T20、T20P)都是從Pharmacia BiotechAB獲得的。
[0086] ***A/G＝A/G Technology Corp.，Needham，MA，USA
[0087] ****乙醇ppt＝乙醇沉淀(下面將進一步討論)
[0088] 偶聯(lián)反應之后所用的截留值較大(例如500kD)的過濾器有助于去除過大的DxHb共軛物(大于約500kD的那些-優(yōu)選產(chǎn)品的上限)。共軛之后所用的中間過濾器(例如
50kD、70kD)用于除去小于優(yōu)選產(chǎn)品的下限(約50kD)的分子。小過濾器(例如10kD)的
實際功能與共軛反應之后進行的透析方法的相同，即除去任何殘余反應物(例如巰基丙酸
等)。
[0089] 乙醇沉淀的功能是在活化步驟之前去除過大的葡聚糖分子。乙醇以逐步方式加入。例如，在制品#55-59(表2)中乙醇從最初濃度的0％開始至高至最終濃度55％慢慢加
入。結(jié)果，一些過大的葡聚糖分子沉淀、成顆粒并再次溶解用于后面的活化。
[0090] 從表2所列的選擇幾個DxHb制品作為最優(yōu)選的。這些制品在表2中以編號：13、14和16加以鑒定。所選制品的選擇是以所需的ESR和EXC值以及產(chǎn)品的產(chǎn)率為基礎。
[0091] 如上所述測定這些制品的峰分子量并描述于圖3中。如圖3所示，優(yōu)選制品，兩個批次的制品#14和兩個批次的制品#16，的峰MW分析為102、96、93、89kD。此外，盡管圖3
中沒有顯示，但是制品#13的平均MW分析為116kD。這些數(shù)據(jù)定義了本發(fā)明的最優(yōu)選DxHb
制品的平均MW的最優(yōu)選范圍。
[0092] 因此，根據(jù)本發(fā)明，DxHb共軛物的優(yōu)選大小范圍是約50kD-約500kD，最優(yōu)選范圍是約89kD-約116kD。合成這些制品的最佳步驟包括將開始大小為20kD的葡聚糖活化，將
活化的DxBr通過500kD或300kD過濾器過濾，將過濾的產(chǎn)物與無基質(zhì)的血紅蛋白偶聯(lián)，將
所得DxHb通過500kD過濾器過濾以去除任何過大的共軛物。生產(chǎn)本發(fā)明的DxHb共軛物的
最優(yōu)選步驟還包括將所得共軛物通過80kD過濾器以去除可能潛在增加EXC值的任何過小
的共軛物的最終步驟。
[0093] 下表3呈現(xiàn)了與表2類似的DxHb共軛物制品的數(shù)據(jù)。然而，表 3包括涉及不同共軛物的附加的進一步制備和分析信息。表3中的數(shù)據(jù)還顯示了各個批次的分子量分布。
[0094] 表3：Dx-Hb的制備步驟和分析結(jié)果：
[0095]
[0096]
[0097] 注：
[0098] -(1)：Dx Hb的偶聯(lián)顯示相當于Hb濃度的％值。例如，就批次5.5而言，DxHb偶聯(lián)是用1％Hb和0.33％DxBr進行的。
[0099] -(2)：最終DxHb分餾步驟的常規(guī)產(chǎn)率，顯示生產(chǎn)的Dx-Hb的％組 分。
[0100] -(3)：表3包括通過ESR值分類的數(shù)據(jù)并顯示ESR值如上面定義的可接受的“截留”。
[0101] 以下實施例用于描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，無論如何不打算限制本發(fā)明。
[0102] 實施例1：無基質(zhì)的人血紅蛋白(SFH)的制備
[0103] 根據(jù)上面所述的方法制備本發(fā)明的SFH。舊人血是由香港紅十字輸血站供應的。將15單位(約4.5升)全血，A、AB或O型，匯集并與4.5L的10mM PBS(磷酸鹽緩沖液-10mM
磷酸鈉緩沖液和154mMNaCl的混合物)，pH 7.4混合于一10-升玻璃瓶中。紅細胞(RBC)
TM
用7體積的冷緩沖液洗滌，用安裝于FlexStrand (A/G TechnologyCorp.，Needham，MA)上
的0.65μm(CFP-6-D-6A)中空纖維過濾器以約10L的恒定體積滲濾。然后將RBC用低滲
10mM磷酸鹽緩沖液于與0.1μm膜筒(CFP-1-E-6A，A/G Technology Corp)相同的pH下
慢慢溶解。該體積的RBC微粒用高達5體積的緩沖液充分洗滌。然后將濾液通過500kD
過濾器(UFP-500-E5A，A/G Technology Corp.)滲濾以確保無基質(zhì)，然后通過10kD膜盒
(UFP-10-E-9A，A/GTechnology Corp.)循環(huán)濃縮至20g/dL。溶液用10mM PBS，pH7.4滲
濾，它是最后貯藏的緩沖液。將最終血紅蛋白溶液通過串聯(lián)的預過濾器和0.22μm過濾器
(293mm，Millipore)進一步確定它無菌。將該無基質(zhì)的血紅蛋白溶液裝瓶并于4℃下貯藏。
[0104] 實施例2：通過烷基化方法將葡聚糖活化
[0105] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式通過烷基化方法將葡聚糖活化的描述包括小規(guī)模和中試規(guī)模活化。小規(guī)模的葡聚糖活化可以獲得僅以有限量生產(chǎn)DxHb，它僅足夠研究目的，而
中試規(guī)模的葡聚糖活化步驟可較大量地用于接下來共軛DxHb的工業(yè)設施。
[0106] a)小規(guī)?；罨?/div>
[0107] 將溶于3mL乙腈的0.3g溴化氰(CNBr)(Riedel-de Haen)加入到95mL的2％葡聚糖(平均MW 20kD，Pharmacia)，并進行5分鐘的活化?；罨陂g，通過連續(xù)加入1M NaOH
將pH保持在10.8。之后，用2M HCl將其降至2.0-2.5。然后，將2mL二氨基乙烷(Sigma)
與附加的HCl一起加入以防止pH超過9.5。在4℃下攪拌過夜之后，將混合物相對蒸餾水
充分透析。優(yōu)選通過用茚三酮法測定透析液證實透析結(jié)束。因此獲得氨基乙基氨基-葡聚
糖。然后將固體Na2HPO4加入混合物中至濃度為0.1M和pH 7.0，并在2小時內(nèi)加入3mL的
溴代乙酰溴(Fluka)，在劇烈攪拌下結(jié)束并通過加入1M NaOH將pH保持在7.0。然后將混
合物再次相對蒸餾水透析。優(yōu)選通過用硝酸銀溶液測定透析液證實透析結(jié)束。透析之后，
將產(chǎn)物N-溴乙酰基-氨基乙基氨基-葡聚糖(DxBr)冷凍干燥并貯藏在冰箱中，備用。
[0108] b)中試規(guī)?；罨?/div>
[0109] 將28g CNBr(Riedel-de Haen)溶于50mL乙腈中，然后加入到4.0L的3.5％葡聚糖(Pharmacia)中。通過持續(xù)5-10分鐘連續(xù)加入6M NaOH(約50mL)將溶液的pH保持在
10.8。之后，加入約50mL的6N HCl將pH降至約2.0。然后，將210mL二氨基乙烷(Sigma)
與6N HCl(約500mL)一起加入以保持pH低于9.5。在4℃下攪拌過夜之后，用Millipore
Pellicon Cassette Filter AcrylicHolder和3個疊卡PTGC 0005盒(Millipore)以
約8L/min的流速將混合物相對40L蒸餾水充分透析。使用帶有易裝卸泵頭(7529-80型，
MasterFlex)的Cole-Parmer蠕動泵(7549-40型)保持葡聚糖溶液循環(huán)。循環(huán)體積保持在
3-4L。為了監(jiān)控透析結(jié)束，然后將濾液經(jīng)受如下所述的茚三酮試驗。
[0110] 接下來，在劇烈攪拌下2小時內(nèi)慢慢加入180mL溴代-乙酰溴(Fluka)，這期間通過加入6M NaOH將溶液保持在中性pH。然后， 用Pellicon盒相對蒸餾水(約50L)將混合
物充分透析。通過使濾液經(jīng)受如下所述的硝酸銀試驗證實透析結(jié)束。將活化的溴代葡聚糖
冷凍干燥并貯藏在-20℃。
[0111] c)茚三酮試驗
[0112] 首先，如前面Moore，S.和Stein，W.H.(J.Biol.Chem.，1948，176：367-388；加入本文作為參考)所述的制備茚三酮溶液。簡言之，通過將1.0L的4.0M醋酸鈉pH 5.5與3.0L
乙二醇一甲酯(Sigma)混合制備茚三酮溶液。混合物用氮氣冒泡1小時。然后，加入80g
茚三酮(Sigma)和7.5mL的21％三氯化鈦溶液(Sigma)。將該茚三酮溶液保持在氮氣下。
[0113] 為了進行試驗，將1.0mL茚三酮溶液與1.0mL DxBr溶液混合并使混合物在100℃下反應15分鐘?？梢酝ㄟ^加入2.0mL的50％乙醇穩(wěn)定的藍色顯示陽性結(jié)果。在570nm下
分光光度地獲得定量分析。使用乙胺校準。將導致無色溶液的氨基的缺少顯示反應徹底。
[0114] 可以進行較簡單的茚三酮試驗以獲得定量結(jié)果，其中將1.0g茚三酮(Sigma)溶于50mL蒸餾水中。將一半mL的該茚三酮溶液與等體積的DxBr溶液混合。如果存在任何殘余
氨基，那么混合物將變?yōu)辄S色。
[0115] d)硝酸銀試驗
[0116] 使用硝酸銀(AgNO3)(Nalcalai Tesque)溶液進行該試驗。首先通過堿水解釋放溴基。向每個0.5mL DxBr樣品中加入3滴1MNaOH并將溶液于37℃下培養(yǎng)30分鐘。接著，
加入3滴濃硝酸，之后加入另3滴1％AgNO3。如果存在溴離子，將獲得溴化銀白色沉淀，并
且溶液將變?yōu)槿榘咨?。在上述實際試驗中，沒有白色沉淀，說明在DxBr溶液中沒有溴基。
[0117] 實施例3：葡聚糖-血紅蛋白共軛物的制備
[0118] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過將16.7g的DxBr溶于5L(0.33％DxBr)的1％無基質(zhì)的血紅蛋白溶液中進行該共軛反應。加入碳酸氫鈉緩沖液至最終濃度為0.1M并用1M NaOH將
其pH調(diào)整至9.5。首先將溶液混合物通過0.22μm過濾器(Millipore)殺菌，攪拌并使該
偶聯(lián)反應在4℃下進行高達16小時。加入16mM β-巰基丙酸(Sigma，用NaOH將pH調(diào)整
至0.5)以與任何殘余溴基反應并使偶聯(lián)反應停止。將溶液相對10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4
經(jīng)受透析，60分鐘之后清除任何殘余反應物如β-巰基丙酸、溴基等。將常規(guī)透析袋用于小
試驗管規(guī)模，而將10kD過濾器盒(UFP-10-E-9A，A/G Technol.)用于中試規(guī)模的透析。
[0119] 實施例4：分子量測定：過濾柱的校準
[0120] 使用凝膠過濾色譜法測定本發(fā)明的DxHb制品的分子量的優(yōu)選步驟概括在TM
Technical Bulletin No.GF-3，Sigma Chemical Company，1987年10月。使用Superdex
200，26/600凝膠過濾柱(Pharmacia)。在測定本發(fā)明的DxHb共軛物的MW之前柱用標準蛋
白質(zhì)校準。所用標準蛋白質(zhì)如下：細胞色素c(MW 12.4kD)、碳酸酐酶(MW 29kD)、白蛋白(MW
66kD)、醇脫氫酶(MW 150kD)、β-淀粉酶(MW200kD)、鐵蛋白(MW 440kD)。校準曲線示于圖
2，其中就每一蛋白質(zhì)標準將分子量相對Ve/Vo繪圖。由于每一餾份可以含有不同MW值的
DxHb，因此測定每一餾份的平均分子量。
[0121] 實施例5：在豚鼠內(nèi)開發(fā)出血模型
[0122] 方法
[0123] 將6個正常、健康的豚鼠用于出血條件的優(yōu)化從而開發(fā)有用的出血模型，進而研究對存活的影響和向組織輸送氧的評價。在試驗之前將豚鼠圈養(yǎng)至少1周。隨欲望供應食
物和水。
[0124] 用腹膜內(nèi)(i.p.)注射戊巴比妥將這些動物麻醉，由于已知豚鼠具有較窄的呼吸道因此避免用醚。將頸靜脈和頸動脈插套管灌注對照或 試驗溶液并且用分別與電子放大
器和10mV記錄器連接的壓強傳感器測定血壓。持續(xù)頭10分鐘以30％、50％、70％、90％和
100％的最大出血使動物流血，然后以約0.2-0.5ml的較小體積保持血壓較低。如下計算流
出的血液體積：
[0125] 血液總體積(TBV)＝體重(g)x8％
[0126] 最大流血(MBO)＝TBVx60％
[0127] 10-分鐘流血(10BO)＝MBOx不同百分比
[0128] 放血并保持約25mmHg的低血壓持續(xù)90分鐘之后，抽取0.2ml血液用血清乳酸酯試劑盒(Sigma)測定乳酸酯。Sigma診斷試劑盒上所述的步驟如下。簡言之，將血液與等體
積的TCA溶液混合，靜置幾分鐘之后離心。將上清液貯藏用于后面的乳酸酯試驗。將血管
包扎，并將傷口用氨芐青霉素沖洗并縫合。然后監(jiān)控動物并記錄存活和體重數(shù)據(jù)。生活超
過7天的動物分為“存活者”。
[0129] 結(jié)果與討論
[0130] 獲得以下存活結(jié)果和90-分鐘血液乳酸酯水平：
[0131]10BO (％MBO) ＞7-天 存活(％) 90-分鐘血清 乳酸酯(mg/dl) 標準誤差
0 100 6.2 1.3
30 83.3 32.2 10.0
50 58.3 44.8 26.4
70 27.3 62.1 16.3
90 8.3 77.5 26.3
100 0.0 115.1 32.5
[0132] 圖4和5描述了10-分鐘流血體積對血容量減少性休克動物的長期存活的影響以及存活結(jié)果與90-分鐘乳酸酯水平之間的關系。一般說來，出血越快，乳酸酯水平越高，暗
示動物厭氧呼吸并且動物處于血容量減少性休克的狀態(tài)。而且，乳酸酯水平越高，長期存活
越低。 試驗之后存活者可以存活超過2個月并且觀察到重量漸漸增加。相反，如果動物沒
有恢復，將連續(xù)失重并且最終在頭幾天內(nèi)死掉。
[0133] 實施例6：豚鼠在其它致命出血之后用葡聚糖-血紅蛋白溶液復生
[0134] 方法
[0135] 將體重為350-550g的可商購獲得的豚鼠絕食過夜(16小時)，然后用戊巴比妥(Sigma)通過腹膜內(nèi)注射麻醉。通過后趾收縮反應評價麻醉量并通過進一步給予戊巴比妥
注射連續(xù)保持足夠的反應。將頸動脈插套管放血并用與電子放大器和10mV圖表記錄器相
連的壓強傳感器測定動脈血壓。將頸靜脈插套管以灌注液體。
[0136] 在頭10分鐘內(nèi)通過頸動脈放血與70％的MBO相當?shù)捏w積，這期間血壓從85mmHg變?yōu)?0mmHg。接著，在以下的80分鐘內(nèi)偶爾放血0.2-0.5ml以保持血壓在25-30mmHg。在
90分鐘時，在60分鐘內(nèi)在腎透析液中注入放血體積的對照緩沖液、血紅蛋白(Hb)或分餾的
葡聚糖-血紅蛋白(Dx-Hb)。由于在試驗期間放血技術不一致可能使乳酸酯水平太低或者
過高，因此僅包括90-分鐘乳酸酯水平在50-90mg/dl之間的那些。
[0137] 結(jié)果和討論
[0138]試驗溶液 n 存活％
腎透析液(KDF) 7 75.0
KDF中5％Hb(#29) 6 50.0
5％Dx(ZHB)-Hb＞70kD 6 83.3
5％Dx(ZGB)-Hb＞70kD 6 66.7
5％Dx(DBB)-Hb＞70kD 5 60.0
5％Dx(DBB)-Hb＞70kD 6 16.7
KDF中5％Dx(DBB)-Hb 70-300kD 9 77.8
KDF中5％Dx(DDB2)-Hb 70-500kD 9 100.0
KDF中5％Dx(DBB)-Hb 70-500kD 8 87.5
KDF中5％Dx(DBB)-Hb 70-750kD 4 50.0
KDF中5％Dx(DBB)-Hb 70-1,000kD 9 66.7
KDF中5％Dx(DBB)-Hb 70-1,000kD 5 20.0
KDF中5％Dx(DDB)-Hb＞1,000kD 3 0.0
[0139] 所用DxHb共軛物的描述：
[0141]葡聚糖商 標 葡聚糖大 小(MW) 體積 葡聚糖 重量(g) CNBr重量 二氨基乙 烷 溴代乙酰溴 產(chǎn)率 (％)
ZGB Fisons 20,000 5L 120g 24g 180ml 180ml 63％
ZHB Fisons 20,000 5L 120g 24g 180ml 180ml 100％
DBB Phamacia 20,000 5L*7 143g*7 28g*7 210ml*7 210ml*7 94％
DDB Phamacia 20,000 5L*15 66g*15 10g*15 100ml*15 125ml*10 82％

DDB2 75％
[0140] DDB2：由DDB用＜500K A/G盒獲得。
[0141] 本領域技術人員應理解的是本發(fā)明的DxHb共軛物可用于各種目的并且可以各種方式使用。主要的是本發(fā)明的共軛物可用作血液代用品或血液膨脹劑。例如，這些DxHb共
軛物可用作血液代用品以防止出血性休克(在外傷病房)或用于血液透析。
[0142] 盡管參照一些特定實施方式描述了本發(fā)明，但是在不背離本發(fā)明精神和其附加權利要求書所概括的范圍的情況下，其各種改變對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。
[0143] 參考文獻
[0144] 以下列出了上面討論的一些參考文獻。將以下內(nèi)容通過引用加入本文。
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