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精神分裂癥是一種綜合征，包括妄想狂、幻聽、幻想、緊張癥、 行為異常和抑郁多種癥狀。精神分裂癥患者約占總?cè)丝诘?％。由于 發(fā)病在幼年，所以病人一生中的絕大多數(shù)時(shí)間都需要醫(yī)學(xué)和精神病學(xué) 監(jiān)護(hù)，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此精神分裂癥是工業(yè)化 社會(huì)代價(jià)最高的疾病之一。
因?yàn)檫€未闡明精神分裂癥的生化基礎(chǔ)，目前診斷仍然僅僅基于精 神病學(xué)評(píng)價(jià)。此外，盡管精神安定藥物可以減輕癥狀，但目前沒有精 神分裂癥的有效療法。
許多報(bào)告提示免疫系統(tǒng)與幾類精神失常的病因?qū)W和發(fā)病過程相 關(guān)。在精神分裂癥患者血液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與腦抗原有交叉反應(yīng)的血清抗 體(1-6)，這表明精神分裂癥也是一種自體免疫性疾病(7-9)。此外， 血小板作為一種神經(jīng)組織模型已得到應(yīng)用(10，11)，在精神分裂癥和癡 呆患者中已經(jīng)檢測(cè)到血小板自體抗體水平升高，但在躁狂抑郁癥、抑 郁癥、人格障礙或分裂情感性失調(diào)患者中則檢測(cè)不到(12-14)。
一種抗自體血小板的細(xì)胞應(yīng)答也在精神分裂癥患者中得到證明， 將從他們自身血液中提取的血小板給患者自身注射，患者表現(xiàn)出遲發(fā) 型超敏(DTH)反應(yīng)(16)。
因此本發(fā)明的目的是提供一種用于在受試者中診斷精神分裂癥的 測(cè)試。
發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)是，給精神分裂癥患者注射一種特定的 血小板蛋白質(zhì)的新級(jí)分，患者表現(xiàn)出典型的遲發(fā)型超敏反應(yīng)特征。在 此把這種新級(jí)分稱為“Pool?2蛋白”。Pool?2蛋白組成本發(fā)明的 一個(gè)方面，其特征在于等電點(diǎn)(pI)大于約6.5，優(yōu)選的范圍在約6.5 至約9.5之間。注射Pool?2蛋白后，精神分裂癥患者表現(xiàn)出遲發(fā)型 過敏(DTH)反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)指出，雖然可以把患者對(duì)Pool?2蛋白的反應(yīng)歸為強(qiáng)的或弱 的DTH反應(yīng)，但可能會(huì)有這樣的情況，患者對(duì)Pool?2蛋白反應(yīng)的時(shí) 間曲線不同于典型的DTH反應(yīng)。
因此本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)制品(在下文中稱為“Pool?2蛋 白”)，其中包含血小板來源的蛋白質(zhì)或其級(jí)分(“Pool?2蛋白”)， 其等電點(diǎn)(pI)大于約6.5，優(yōu)選的范圍在約6.5至約9.5之間，通 過將該制品給個(gè)體注射，能夠引起精神分裂癥個(gè)體中的DTH反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在受試者中測(cè)定精神分裂癥的診斷方 法，包括：
(a)得到一種制品，其中包含作為活性成分的血小板來源的蛋白質(zhì) 或其級(jí)分(“Pool?2蛋白”)，其等電點(diǎn)(pI)大于約6.5， 優(yōu)選的范圍在約6.5至約9.5之間；
(b)將所述的蛋白質(zhì)制品注射入受試者；以及
(c)檢查受試者注射部位遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，以強(qiáng)于在非精神 分裂癥受試者中觀察到的反應(yīng)作為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表明該 受試者患精神分裂癥的可能性高。
根據(jù)本發(fā)明，還有一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，Pool?2蛋白可以由待 測(cè)個(gè)體的自體血小板中制備，或者是由待測(cè)受試者以外的大批個(gè)體中 得到的異體血小板混合物中制備。在絕大多數(shù)的病例中，還可以令人 驚訝的發(fā)現(xiàn)，注射了由異體血小板混合物中得到的Pool?2蛋白之精 神分裂癥患者的DTH反應(yīng)明顯較強(qiáng)，注射了由自體血小板中得到的 Pool?2蛋白的受試者的DTH反應(yīng)則較弱。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了制備Pool?2 蛋白質(zhì)制品的優(yōu)越性，既可以立即使用，也可以在合適的條件下(如 冷藏)將其保存，用于不同時(shí)期在大批個(gè)體中診斷精神分裂癥。這避 免了在實(shí)施本發(fā)明的診斷檢測(cè)前，需要立即重復(fù)得到包含受試個(gè)體血 小板的血液樣品。
因此，通過一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備用 于精神分裂癥診斷的試劑的方法，包括：
(a)由大批個(gè)體中得到血液樣品，由所述的樣品中制備混合物，從 中收集血小板；
(b)由所述的血小板制品中制備蛋白質(zhì)級(jí)分，該血小板制品包含等 電點(diǎn)大于約6.5，優(yōu)選的范圍在約6.5至約9.5之間的蛋白質(zhì)或 其級(jí)分。
由異種個(gè)體中制備的Pool?2蛋白，可以由大批患有精神分裂癥 的個(gè)體中制備，或者是由獲自精神分裂癥患者和健康個(gè)體的血液樣品 混合物中制備。
本發(fā)明進(jìn)一步又提供了用于在受試者中測(cè)定精神分裂癥的診斷方 法，包括：
(a)由受試個(gè)體以外的大批精神分裂癥和/或非精神分裂癥個(gè)體中 得到血液樣品，并從中收集血小板；
(b)由所述的血小板分離物中制備蛋白質(zhì)級(jí)分，該血小板分離物中 包含等電點(diǎn)(pI)大于約6.5，優(yōu)選的范圍在約6.5至約9.5之 間的蛋白質(zhì)或其級(jí)分；
(c)將所述的蛋白質(zhì)制品注射入受試者；以及
(d)檢查受試者注射部位遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，以強(qiáng)于在非精神 分裂癥受試者中觀察到的反應(yīng)作為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表明該 受試者患有精神分裂癥的可能性高。
通過優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了在個(gè)體中診斷精神分裂癥的方法， 如上所述，在合適條件下將在步驟(b)中收集的蛋白質(zhì)級(jí)分保存， 供日后用于大批受試個(gè)體時(shí)的重復(fù)使用，如在步驟(c)和(d)中描 述。
雖然，如上文所解釋的，由受試個(gè)體以外的大批個(gè)體中制備Pool 2蛋白混合物有其優(yōu)越性，但根據(jù)本發(fā)明的診斷方法，也可以使用由 受試個(gè)體自體血小板中制備的Pool?2蛋白制品。
因此本發(fā)明提供了用于在受試者中測(cè)定精神分裂癥的診斷方法， 包括：
(a)由個(gè)體中得到血液樣品，并從中收集血小板；
(b)由所述的血小板樣品中收集蛋白質(zhì)或其級(jí)分，所述蛋白質(zhì)或其 級(jí)分的pI大于約6.5，優(yōu)選的范圍在約6.5至約9.5之間；
(c)將所述收集的蛋白質(zhì)或其級(jí)分注射入受試者；以及
(d)檢查受試者注射部位遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，以強(qiáng)于在非精神 分裂癥受試者中觀察到的反應(yīng)作為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表明該 受試者患有精神分裂癥的可能性高。
一般，通過讓收集的血小板蛋白質(zhì)經(jīng)過等電聚焦的方法收集Pool 2蛋白，其中用本領(lǐng)域公知的方法收集等電點(diǎn)大于約6.5，優(yōu)選的范 圍在約6.5至約9.5之間的蛋白質(zhì)。
然而，根據(jù)本發(fā)明也可發(fā)現(xiàn)，通過不包括等電聚焦的方法也可以 制備Pool?2蛋白制品，例如，通過使用諸如去污劑可以由血小板樣 品中提取蛋白質(zhì)，這種提取方法可使Pool?2蛋白具有需要的等電點(diǎn) 數(shù)值，該蛋白質(zhì)也能夠引起精神分裂癥患者的DTH反應(yīng)。
如果需要，通過以上所述的任意一種方法得到的Pool?2蛋白制 品都可以用來進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)分離步驟，例如進(jìn)行薄層層析，進(jìn)行高 壓液相色譜或其它多種眾所周知的純化級(jí)分的方法。因此可以測(cè)試每 個(gè)得到級(jí)分的活性，即它們引起精神分裂癥患者DTH反應(yīng)的能力。這 些能夠引起精神分裂癥患者DTH反應(yīng)的純化的級(jí)分以及Pool?2蛋白 中的單個(gè)蛋白質(zhì)、多肽或肽，也是本發(fā)明的一個(gè)方面。
根據(jù)本發(fā)明制備的用于本發(fā)明診斷方法的Pool?2蛋白制品包 括，由Pool?2蛋白純化得到的蛋白質(zhì)、包含這些蛋白質(zhì)序列的多肽 或肽類，其級(jí)分，以及與Pool?2蛋白的蛋白質(zhì)有序列相似性或同源 性的(例如大于70％，優(yōu)選地大于80％，一般，同源性大于90％)， 通過合成或基因工程方法得到的蛋白質(zhì)、多肽或肽類。
根據(jù)本發(fā)明，用于本發(fā)明診斷測(cè)定的Pool?2蛋白能夠引起注射 個(gè)體的DTH活性，可通過本領(lǐng)域公知的方法測(cè)試DTH活性。簡(jiǎn)言之， 在受試個(gè)體前臂或大腿皮內(nèi)注射Pool?2蛋白，在24、48、72小時(shí) 后，通過測(cè)量硬結(jié)周圍的反應(yīng)直徑評(píng)價(jià)注射位點(diǎn)的反應(yīng)。如上所述， 可能會(huì)有這樣的情況，反應(yīng)的時(shí)間曲線可不同于典型的DTH反應(yīng)時(shí)間 曲線。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于精神分裂癥診斷的試劑盒，包括所述的 Pool?2蛋白、由其得到的活性蛋白質(zhì)級(jí)分，或所述的Pool?2蛋白 來源的單個(gè)活性蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，這樣的蛋白質(zhì)以可注射的形式 或是以適于制備可注射制劑的形式，例如冷凍干燥的形式提供。試劑 盒一般提供使用說明或指導(dǎo)記錄結(jié)果方法的圖表或圖片。
附圖簡(jiǎn)述
圖1表示注射了下列制品的精神分裂癥患者前臂的反應(yīng)： i.Pool?2蛋白(標(biāo)記為P2) ii.Pool?1蛋白(標(biāo)記為P1) iii.自體血小板(標(biāo)記為A) iv.PBS(標(biāo)記為C＝對(duì)照)
結(jié)合上面的附圖，本發(fā)明將在以下的實(shí)施例中得到說明。
實(shí)施例
在以色列Sha’ar?Menashe精神健康醫(yī)院、Pardes?Hana老年病 醫(yī)院以及Weizmann科學(xué)研究所，進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于受試者注射了由他 (或她)自身血液中收集的血小板或注射了Pool?2蛋白后反應(yīng)的研 究。 實(shí)施例1：自體蛋白質(zhì)的注射 1.血小板制備
取受試者靜脈血10毫升，20℃，150g離心20分鐘。收集含有 血小板的上清液，20℃，2000g離心10分鐘，共離心三次，然后將 血小板在含有5mM?EDTA的磷酸緩沖鹽液(PBS)中重懸。最后一次 洗滌后，將血小板在無菌PBS中重懸，終濃度為2×108血小板/毫升。 2.自體皮膚測(cè)試和遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的測(cè)量
將如上法獲得的特定受試者的0.1毫升血小板懸液皮內(nèi)注射回同 一受試者的前臂。在距離樣品注射部位大約10厘米處第二次注射0.1 毫升PBS作為對(duì)照。
注射部位的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的測(cè)量應(yīng)依照本領(lǐng)域公知的方法 (Skornik，Y.，等人，癌癥免疫學(xué)免疫治療(Cancer?Immunol Immunother.)，11：93-96，1981)。 結(jié)果
測(cè)試分組實(shí)施： a)18位65歲以下的健康受試者。 b)10位65歲以上的健康受試者。 c)41位精神分裂癥患者。 d)21位癡呆患者。
此測(cè)試結(jié)果如下表1中所示。 表1 用于精神分裂癥檢測(cè)的人自體(自身)抗血小板皮膚反應(yīng) 多中心研究概要 精神分裂癥患者人數(shù) n＝41 非精神分裂癥患者人數(shù) n＝49 皮膚反應(yīng)陽(yáng)性：25 皮膚反應(yīng)陽(yáng)性：0 皮膚反應(yīng)臨界：13 皮膚反應(yīng)臨界：1 皮膚反應(yīng)陰性：3 皮膚反應(yīng)陰性：48 總計(jì) 敏感性：92％ 總計(jì) 特異性：98％
由此可見，41例精神分裂癥患者中有38例呈DTH反應(yīng)，但在18 位65歲以下健康受試者中僅有一位健康個(gè)體呈陽(yáng)性反應(yīng)。在10位65 歲以上的健康個(gè)體以及21位癡呆患者中無陽(yáng)性反應(yīng)。因此此項(xiàng)測(cè)試 的敏感性為92％，特異性為98％。
如表所示，僅有一例健康個(gè)體呈陽(yáng)性DTH反應(yīng)，然而幾乎所有受 試的精神分裂癥患者對(duì)由他們自體血小板中制備的Pool?2蛋白呈DTH 反應(yīng)。因此，本發(fā)明的診斷檢測(cè)方法對(duì)于受試個(gè)體精神分裂癥的診斷 具有很高的敏感性和特異性。 實(shí)施例2：Pool?1和Pool?2蛋白的制備 方法
如實(shí)施例1，得到含有大約20克總蛋白質(zhì)的血小板懸液，加入40 毫升含0.5％去污劑NP-40和Triton-X-100的溶液，室溫下輕微震搖 5分鐘使血小板溶解。然后將此溶液在20℃，4000g離心15分鐘。 收集上清液，將沉淀用10毫升0.1％Triton-X-100再提取兩次。合 并三次上清液，加入BioRad的Bio-Lyte?AmpholyteTM?3/10(40％)至 終濃度為1％。溶解的蛋白質(zhì)用來做等電聚焦。60毫升的樣品加入 BioRad的RoToforTM系統(tǒng)，陽(yáng)極溶液為0.1M?H3PO4，陰極溶液為0.1M NaOH。10℃下10瓦恒定功率下等電聚焦大約4小時(shí)直到電流恒定30 分鐘。依照它們的等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)被分為兩類：等電點(diǎn)范圍在2-6.5 的蛋白質(zhì)歸為Pool?1蛋白，而等電點(diǎn)范圍在6.5-10的蛋白質(zhì)歸為Pool 2蛋白。分別收集Pool?1和Pool?2蛋白，用PBS?1∶50稀釋。 實(shí)施例3：注射Pool?1和Pool?2蛋白 方法 以下4種制品皮內(nèi)注射入精神分裂癥患者的前臂： i.Pool?2蛋白(標(biāo)記為P2) ii.Pool?1蛋白(標(biāo)記為P1) iii.自體血小板(標(biāo)記為A) iv.PBS
在4個(gè)不同的注射部位分別注射以上制品各0.1毫升，每個(gè)注射 部位之間相互間隔大約10厘米。在注射后24小時(shí)、48小時(shí)和72小 時(shí)監(jiān)視每個(gè)注射部位的皮膚反應(yīng)。 結(jié)果
結(jié)果如圖1所示，(i)為前臂上最高注射部位，(iv)則為前臂上 最低注射部位。
由圖所示，按上述方法測(cè)量DTH反應(yīng)，在兩位精神分裂癥患者的 Pool?2蛋白注射部位上觀察到DTH反應(yīng)，而在P1注射部位則沒有DTH 反應(yīng)。此外，與自體血小板注射部位的DTH反應(yīng)相比，P2注射部位 的DTH反應(yīng)大大增強(qiáng)。因此，在絕大多數(shù)情況下，在本發(fā)明的診斷測(cè) 試中，優(yōu)選地使用由數(shù)個(gè)異源個(gè)體中得到的血液樣品混合物制備的P2 蛋白制品。
參考文獻(xiàn)目錄
以下是幫助理解本發(fā)明背景的相關(guān)參考文獻(xiàn)目錄。
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