技術領域
[0001] 本
發(fā)明涉及微流體裝置和方法，尤其是用于磁控制
磁性粒子的微流體裝置和方法，以及其在分析物的檢測和/或量化中的用途。
背景技術
[0002]
免疫測定法是一種廣泛應用在對于
疾病生物標志物篩選的臨床研究和醫(yī)療診斷中的功能強大的技術。該方法的顯著的特異性和靈敏度歸因于在樣本內(nèi)的大范圍材質(zhì)中的
抗體和其靶標之間的分子識別。大多數(shù)測定方法是異質(zhì)的：免疫復合物形成到固體表面上，通常形成到微量滴定板的底部上，并且在檢測之前，通過數(shù)次洗滌步驟除去未結(jié)合的分子。然而，這種安排呈現(xiàn)出多個
缺陷，其中，低的捕獲面積和表面與體積之比是最主要的，因為它們與免疫測定方法的靈敏度直接相關。
[0003] 作為用于執(zhí)行生物標志物捕獲的固體載體的磁性微粒子的出現(xiàn)能夠克服這些問題中的一個問題。微珠顯示出具有重要的粘合能
力的大的比表面，該粘合能力提供較好的捕獲功效。另外，由于磁性微粒子的超順磁特性，它們易于處理使多個免疫測定法分離和洗滌步驟更快地實施的情況。由于微流體的樣式，隨著反應時間的增加，大型捕獲區(qū)域的聯(lián)接能夠?qū)崿F(xiàn)在幾分鐘內(nèi)以良好的靈敏度檢測生物標志物的醫(yī)療點平臺。
[0004] 免疫凝集是最簡易且最快速的一步式免疫測定法之一。它在于：在具有至少兩個結(jié)合位點的靶標存在的情況下，使用功能化的珠形成聚集體[15]。該簡易過程被廣泛地應用于免疫診斷學，但仍受聚集體形成的緩慢歷程所限制。基于微流體的多個策略已經(jīng)顯示出能夠縮短反應時間且提高靈敏度，但是這些過程仍是費力的[16]。
[0005] 目前，在微流體中所進行的大多數(shù)珠式ELISA以連續(xù)流的形式實施，但是由于處理和抽吸原因?qū)е乱后w體積不能小于幾微升。對于某個臨床診斷應用而言，需要減小免疫測定法的體積，在該臨床診斷應用中，該體積樣本確實可以少量地存在，例如新生兒的
血液樣本。另外，對于一些應用而言，減小樣本體積或
試劑體積是重要的，在這些應用中，大量標準或材料或樣本需要被篩選，如藥物篩選、高通量篩選、組合化學、系統(tǒng)生物學、數(shù)字生物學、合成生物學等情況。在大多數(shù)國家中已經(jīng)建立了新生兒疾病的篩選(Clague&Thomas，2002)[5]，但對這些樣本的子微升反應會有機會從采集的相同樣本體積進行多個分析。液滴微流體能夠處理小的自封閉體積。然而，多步驟反應不易于利用常見的液滴控制(例如，合并和分裂)來執(zhí)行，這是磁性液滴處理提供簡易方式以克服這些難題且在數(shù)字微流體平臺上執(zhí)行珠式測定的原因。
[0006] 多個方法已經(jīng)被用于控制磁性粒子，以在綜合系統(tǒng)內(nèi)進行生物分析。首先，Shikida等人(Shikida等人，2006a)(Shikida等人，2006b)[6]和[7]介紹了在微流體系統(tǒng)中分散在油中的兩個
水滴之間的珠轉(zhuǎn)移。由于動磁和閘控結(jié)構(gòu)，通過分裂包含粒子的小液滴來進行提取以在提取期間保持該液滴。液滴體積已經(jīng)從約40微升減小至幾微升，以便進行PCR擴增(Tsuchiya等人，2008)[3]?；谠撐墨I，磁性珠控制的多個示例在數(shù)字微流體上得以說明。大多數(shù)示例為2D平臺，2D平臺能夠被分為兩組：一組為利用可移動磁體從放置到表面上的液滴中提取珠(Zhang等人，2010)[8](Long等人，2009)[9]，另一組為基于
電潤濕裝置，其中，使液滴移動靠近固定磁體(Sista等人，2008)[1]。盡管所有的這些系統(tǒng)都能夠執(zhí)行多個步驟分析測定，但是它們并不是簡單且易于操作的，主要是由于液滴形成和
定位到表面上和/或要實現(xiàn)的磁體移動。Lehmann等人(Lehmann等人，2006)[10]記錄了一種平臺，該平臺將線圈陣列集成在PCB襯底上，該PCB襯底與疏水性/親水性表面圖案結(jié)構(gòu)聯(lián)接以分裂液滴。盡管該集成，但是系統(tǒng)復雜性高度地增大且液滴體積和珠數(shù)量仍在微升和幾百微克的范圍內(nèi)。
[0007] 兩相微流體為形成靈活且高通量的分析系統(tǒng)提供了獨特能力。將液滴微流體與磁性粒子相結(jié)合的平臺提供了非均相分析測定的優(yōu)勢，同時能夠在不存在小份的分散、混合和合并的情況下進行復雜的操作，例如芯片上輸送?；谠摬呗缘年P注的應用被提出，尤其對2D載體使用電濕潤[1]，但它們是相對低通量的，且電濕潤增加了限制生物測定性能的難以區(qū)別的污染問題。
[0008] 因此，本發(fā)明的一個目的在于克服上述限制。特別地，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及基于微毛細管或微通道的具有集成的磁性鉗的平臺，該平臺能夠快速且穩(wěn)健地實施液滴內(nèi)的復雜的珠式生物測定。因此，該方法能夠使我們可靠地分離、運輸、混合和合并液滴，同時提供實施生物測定所必需的高通量分析和復用能力。
[0009] 另外，例如在Gu等人(Anal chem，2011，dx.doi.org/10.1021/ac201678g)中所公開的方法在未將超順磁粒子與
鐵磁粒子結(jié)合的情況下，不可以提供超順磁粒子的分裂。
[0010] 然而，鐵磁粒子在被磁化后不易分離，因此
現(xiàn)有技術的這種方法不允許再懸浮、且強烈地限制了方案步驟的數(shù)目。亞鐵磁粒子、或反鐵磁粒子也可能具有這些缺陷。
[0011] 此外，現(xiàn)有的液滴系統(tǒng)不可以提供執(zhí)行洗滌步驟和洗脫步驟的可能性。
[0012] 在其它已知的方法中[12]，通過水力動力法分裂液滴，磁體被用于優(yōu)先移動一個子液滴中的磁性粒子。然而，在該情況下，包含粒子的液滴和其它液滴具有類似的尺寸，因此分離能力較差。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于增大聚集體形成動力學、減小體積、和提供完全自動化的且低成本的用于免疫凝集的平臺。
[0014] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于通過改進的提取過程來實施化學的、生物的、物理的或生化的過程、分析或反應的方法。
[0015] 本發(fā)明的一個目的在于提供用于實施化學的、生物的、物理的或生化的過程、分析或反應的改進的方法，其中，超順磁粒子被包含在容納在微通道中的液滴中。
[0016] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種允許阻止包含在液滴內(nèi)的磁性粒子成為包含最小體積的流體的二級液滴的系統(tǒng)，而不阻止液滴的剩余物。
[0017] 本發(fā)明的一個目的在于提供用于在微流體裝置中實施可選地包括多個步驟的各種類型的分析測定的系統(tǒng)，該微流體裝置可不包括微
電極陣列或微制造的微線圈。
[0018] 本發(fā)明的一個目的在于提供用于在微流體裝置中實施可選地包括多個步驟的各種類型的分析測定的系統(tǒng)，其中，液滴通過流動或通過壓力差被運輸。
發(fā)明內(nèi)容
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種微流體系統(tǒng)，所述微流體系統(tǒng)包括：
[0020] ●微通道，該微通道尤其包括縱向軸線，和
[0021] ●用于在所述微通道內(nèi)產(chǎn)生
磁場的裝置，所述裝置包括可激活的磁性元件。
[0022] “可激活的磁性元件”指能夠被可逆地磁化的材料，從而該材料能夠在其周圍引起磁場。通常，能被直接激活的磁性元件為電磁體的芯。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的可激活的磁性元件可被間接地激活?？杉せ畹拇判栽氖纠秊檐洿判栽脑浒ㄔ跈C械裝置中，在機械裝置中，永久磁體能夠通過機械部件可逆地靠近所述軟磁性元件的一部分，其中，圍繞軸線轉(zhuǎn)動的永久磁體能夠被轉(zhuǎn)動以使其磁極與芯的一側(cè)
接觸(在這種情況下，芯被激活)，或者被轉(zhuǎn)動以不再與這種芯接觸，在這種情況下，芯未被激活。
[0024] 在優(yōu)選的實施方式中，可激活的磁性元件包括尖端。
[0025] 在優(yōu)選的實施方式中，可激活的磁性元件包括芯和尖端。
[0026] 為了便于描述，在
說明書中可區(qū)別磁性元件的“芯”和尖端，芯是磁性材料的相對大體積的件，其截面明顯地大于尖端的截面。
[0027] 在優(yōu)選的實施方式中，尖端是磁性元件的組成部分。在其它優(yōu)選的實施方式中，尖端可由可磁化的材料構(gòu)成，與磁性元件的芯磁連接，使得在所述芯中形成的磁場線傳送到所述尖端中。
[0028] 尖端是指固體材料的末端，該固體材料的末端具有凸形且具有沿著尖端的軸線減小的截面。
[0029] 所述尖端可具有橫貫于縱向軸線測量的截面，該截面沿著該縱向軸線減小。
[0030] 該減小的截面可在所述尖端內(nèi)形成磁場線的聚合，從而可增大磁場在尖端處的絕對值，同時僅僅將磁場集中于小體積上。
[0031] 例如與現(xiàn)有技術的圓柱形或矩形
磁鐵相比較，小尺寸和高磁場的這種組合可使得形成更強的
磁場梯度。
[0032] 可間接激活的元件的另一示例為軟磁材料件，其尖端面對另一可直接激活的或可間接激活的磁性元件的磁極中的一個磁極。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述磁性元件包括可被可逆磁化的芯和與該芯磁聯(lián)接的尖端。
[0033] 例如，在優(yōu)選的實施方式中，所述芯可被導電線圈環(huán)繞，該導電線圈與
電流發(fā)生器連接。
[0034] 在一些優(yōu)選的實施方式中，尤其用于實現(xiàn)復雜方案的實施方式中，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)可包括所述可激活的磁性元件中的一些磁性元件，其定位在微通道的多個不同區(qū)域上或者定位在微流體系統(tǒng)的多個不同的微通道上。
[0035] 在特別優(yōu)選的實施方式中，微流體系統(tǒng)至少包括一對可激活的磁性元件，該一對可激活的磁性元件跨過微通道彼此相對。
[0036] 在另一優(yōu)選的實施方式中，該對彼此相對的磁性元件可包括可直接激活的磁性元件和第二可間接激活的磁性元件，該第二可間接激活的磁性元件“從動于”該可直接激活的磁性元件。
[0037] 這意味著第二磁性元件為可磁化材料，該第二磁性元件的尖端面對跨過微通道的第一磁性元件的尖端且僅僅通過感應磁化而從所述第一磁性元件獲取其磁化。
[0038] 該配置的優(yōu)勢在于一對磁性元件，而不存在例如具有兩個線圈的成本。
[0039] 在根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式中，系統(tǒng)可包括多個可激活的磁性元件，該多個可激活的磁性元件定位在同一微通道的長度上的不同
位置處。
[0040] 由于這點，磁場線可被更好地定位，且磁場梯度可更強。
[0041] 沿著同一微流體通道的長度引入多個可激活的磁性元件，可允許實施液滴之間的復雜操作。
[0042] 特別地，可提供利用第一對可激活的磁性元件將磁性粒子轉(zhuǎn)移到一個液滴內(nèi)的機會，在液滴仍移動期間等待培養(yǎng)、且使用第二對可激活的磁性元件提取被培養(yǎng)的磁性粒子。因此，這些粒子可以根據(jù)需要被培養(yǎng)、洗滌多次。
[0043] 還可使液滴運動的方向反向以使液滴回到同一對的可激活的磁性元件。
[0044] 有利地，本發(fā)明可提供這樣的方法，在該方法中，液滴運動與粒子處理完全分開。
[0045] 根據(jù)另一優(yōu)選的實施方式，同一微通道或多個微通道可被定位在單個磁性元件的前方、或者定位在一對磁性元件中的兩個元件之間。
[0046] 這可使得微通道內(nèi)或者微通道陣列內(nèi)具有多個活性區(qū)，具有僅一個可激活的磁性結(jié)構(gòu)的成本和復雜性。實施這的一種方式是使用一個或兩個刀片狀的磁性元件，并且微流體系統(tǒng)包括多個微通道或者一彎曲的微通道，或者可替選地多個管或者單個管，該單個管折疊成線圈以多次在尖端附近經(jīng)過。
[0047] 有利地，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)包括微流體裝置，該微流體裝置配置成在微通道內(nèi)形成一系列的至少兩種不混溶流體的多個元件。
[0048] 通常，這樣的系列可為在周圍的不混溶的第二流體中的第一流體的液滴。所述第一流體可為水性的，在這種情況下，所述第二流體為油(氟化的或者非氟化的)或者氣體、或者任何與水不混溶的流體。很明顯，所述第一流體也可為與水不混溶的流體，且所述第二流體為水性的或者與水不混溶的另一流體，或者第二流體可為與第一流體不混溶的非水性的流體(例如，氫化油和氟化油)、或者任何其它的不混溶流體的組合。
[0049] 在特別有利的實施方式中，所述第一流體為水性的，且所述第二流體為氟化油。
[0050] 為了明確，將被另一不混溶的流體所包圍的任何種類的流體團稱作“液滴”，不論其形狀如何：例如液滴可為漂浮液滴、或者被其容器高度限制的液滴，有時在文獻中稱作“塞子(plug)”或者“彈丸(slug)”。
[0051] 另外，通過擴展，術語“液滴”在此將包含流體的任何區(qū)室化的部分，該任何區(qū)室化的部分能夠包含磁性粒子并懸浮在流體中，在該流體中，液滴可傳輸而不發(fā)生擴散。例如，液滴包括囊泡或微囊。
[0052] 根據(jù)優(yōu)選的實施方式，用在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中的磁性粒子為表面功能化的。
[0053] 每個表面功能化的磁性粒子可為靶標提供至少一個結(jié)合位點，優(yōu)選地至少兩個結(jié)合位點，例如該靶標存在于包含表面功能化的磁性粒子的液滴中。
[0054] 結(jié)合位點可包含選自以下列表的要素：抗體；
抗原；金屬；組
氨酸標簽；疏水基團；氫結(jié)合基團；蛋白A；基于核酸且能夠特異結(jié)合一些核苷酸序列的配位體；聚合
電解質(zhì)；磷脂；化學物質(zhì)；藥物；核酸；核酸和酶的組合，例如用于DNA擴增的混合物；
熒光基團；發(fā)光基團；染料；
納米粒子；金納米粒子；
量子點；DNA嵌入染料；適體；或者任何類型的被公認能夠影響細胞代謝或者膠體對象的特性(尤其它們的光學特性)的物種；催化劑；或能夠使化合物改性的酶；或者其混合物，結(jié)合位點優(yōu)選地包含抗體，靶標為相關的抗原，反之亦然。
[0055] 靶標可在表面功能化的磁性粒子的結(jié)合位點上被捕獲。
[0056] 當磁性粒子用在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中時，可形成聚集體。
[0057] “磁性粒子的聚集體”指多個彼此連接的磁性粒子或者彼此接觸的磁性粒子。
[0058] 形成聚集體的磁性粒子可通過連接橋彼此連接，該連接橋具有下列結(jié)構(gòu)：第一磁性粒子的結(jié)合位點-靶標-第二磁性粒子的結(jié)合位點，所述第二磁性粒子的結(jié)合位點與第一磁性粒子的結(jié)合位點不同。
[0059] 當施加由可激活的磁性元件形成的磁場時，磁性粒子可形成聚集體。
[0060] 然而在磁性粒子未受到可激活的磁性元件形成的磁場的影響的情況下，磁性粒子也可形成聚集體。
[0061] 事實上，有利地，在不同的磁性粒子之間的連接橋的存在允許使磁性粒子保持聚集體的形狀，即使是在不存在可激活的磁性元件形成的磁場的情況下。
[0062] (液滴內(nèi)磁性粒子的
質(zhì)量)/(包含磁性粒子且可選地包含靶標的液滴的體積)的比值可在0.1mg/mL和10mg/mL之間，和/或(液滴內(nèi)靶標的質(zhì)量)/(包含磁性粒子和靶標的液滴的體積)的比值可在10ng/mL和1000ng/mL之間。
[0063] 包含磁性粒子的液滴可為油包水型液滴。
[0064] 在一實施方式中，微通道包含多個含有磁性粒子的液滴。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一組件，該組件包括：
[0066] ●上文限定的系統(tǒng)，和
[0067] ●檢測器，該檢測器配置成測量存在于微通道內(nèi)的包含磁性粒子的液滴的至少一種特征，所述液滴優(yōu)選地包括磁性粒子的聚集體。
[0068] 檢測器可為光學檢測器且可被配置成測量液滴的至少一種光學特征，優(yōu)選地光學透射率。
[0069] 該組件可以還包括配置成照射液滴的
光源，例如，光學檢測器被配置成測量來自光源的被液滴吸收的光的量。
[0070] 根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及一種從在微通道內(nèi)流動的第一流體的第一初級液滴中提取至少一個磁性體的方法，所述方法優(yōu)選地使用上文所限定的系統(tǒng)，且該方法包括：
[0071] -通過使磁性體受到由至少一個可激活的磁性元件產(chǎn)生的磁場的作用，而在所述可激活的磁性元件附近捕獲磁性體，
[0073] -使所述第一初級液滴分裂成第一次級液滴和第二次級液滴，所述第一次級液滴包括磁性體且通過磁場而保持捕獲在可激活的磁性元件附近以從所述第一初級液滴中提取至少一個磁性體。
[0074] 引起粒子捕獲和提取的磁力可為磁場強度和磁場梯度二者的函數(shù)。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及一種控制至少一個磁性體的方法，包括：
[0076] -根據(jù)上文所限定的方法，從在微通道內(nèi)流動的第一流體的第一初級液滴中提取磁性體，和
[0077] -通過改變由可激活的磁性元件產(chǎn)生的磁場的強度和/或梯度、尤其通過終止由可激活的磁性元件產(chǎn)生的磁場，來釋放磁性體。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種控制磁性粒子的方法，所述方法優(yōu)選地使用如上所述的系統(tǒng)或者組件，所述方法包括：
[0079] ●通過使液滴中包含的磁性粒子受到由線圈激發(fā)的至少一個可激活的磁性元件、優(yōu)選地可激活的微流體元件產(chǎn)生的磁場的作用，而在所述可激活的磁性元件附近，捕獲和聚集所述磁性粒子，
[0080] 磁性粒子為表面功能化的，每一表面功能化的磁性粒子提供用于靶標的至少一個結(jié)合位點、優(yōu)選地至少兩個結(jié)合位點，靶標存在于包含磁性粒子的液滴中。
[0081] 有利地，這種方法增強了聚集體形成動力學、減小了體積且提供了完全自動化且低成本的用于免疫凝集的平臺。
[0082] 優(yōu)選地，在捕獲和聚集步驟結(jié)束之前、更優(yōu)選地在該步驟開始之前，靶標可被捕獲在表面功能化的磁性粒子的結(jié)合位點上。
[0083] 形成聚集體的磁性粒子可通過具有下列結(jié)構(gòu)的連接橋彼此連接：第一磁性粒子的結(jié)合位點-靶標-第二磁性粒子的結(jié)合位點，所述第二磁性粒子的結(jié)合位點與第一磁性粒子的結(jié)合位點不同。
[0084] (液滴內(nèi)磁性粒子的質(zhì)量)/(包含磁性粒子和靶標的液滴的體積)的比值可在0.1mg/mL和10mg/mL之間，和/或(液滴內(nèi)靶標的質(zhì)量)/(包含磁性粒子和靶標的液滴的體積)的比值可在10ng/mL和1000ng/mL之間。
[0085] 包含磁性粒子的液滴可為油包水型液滴。液滴在微通道內(nèi)的流動速率優(yōu)選地小于1μL/分鐘。
[0086] 捕獲步驟的時間段可根據(jù)樣本和粒子的培養(yǎng)所必需的時間而改變。該時間段可在0.1s和1h之間，優(yōu)選地在1s和30分鐘之間，更優(yōu)選地在10s和10分鐘之間。優(yōu)選地，聚集步驟短于捕獲步驟，且與一個液滴面對磁阱的路徑有關。聚集步驟可在0.01s和100s之間，優(yōu)選地在0.1s和10s之間，或者在0.3s和2s之間。所述方法可以還包括通過改變由可激活的磁性元件形成的磁場的強度和/或梯度、尤其通過終止由可激活的磁性元件形成的磁場來釋放磁性粒子的聚集體的步驟。
[0087] 在一實施方式中，磁性粒子在釋放步驟后仍形成聚集體。
[0088] 在一實施方式中，在釋放步驟后，液滴可流動至檢測區(qū)，在該檢測區(qū)中，測量液滴的特征，在該測量期間，所述液滴仍包含磁性粒子的聚集體。
[0089] 在該測量期間，形成聚集體的磁性粒子可通過具有下列結(jié)構(gòu)的連接橋彼此連接：第一磁性粒子的結(jié)合位點-靶標-第二磁性粒子的結(jié)合位點，所述第二磁性粒子的結(jié)合位點與第一磁性粒子的結(jié)合位點不同。
[0090] 所述特征可為液滴的光學特征，優(yōu)選地光學透射率。
[0091] 在一實施方式中，當液滴存在于檢測區(qū)中時，光源照射液滴，在所述檢測區(qū)中測量來自所述光源的被液滴吸收的光的量。
[0092] 多個包含磁性粒子的液滴可存在于微通道內(nèi)。
[0093] 在一實施方式中，所述方法還包括通過在導電線圈中引發(fā)交流電流而實施的可激活的磁性元件的消磁步驟，其中，該交流電流的強度隨著時間減小，所述強度尤其減小為0。
[0094] 沿著微通道的縱向軸線測量的可激活的磁性元件的尖端的厚度小于液滴的長度，優(yōu)選地以小于1:5的比率、更優(yōu)選地以小于1:10的比率。
[0095] 微流體系統(tǒng)可被配置成通過流或者壓力差來傳輸液滴。
[0096] 流或者壓力差可通過
泵或者本領域技術人員已知的任何其它合適的裝置來產(chǎn)生。
[0097] 微流體系統(tǒng)可包括壓力
傳感器和/或壓力
控制器。在一實施方式中，微流體系統(tǒng)包括允許測量流的速率的傳感器和/或用于控制這種速率的控制器。
[0098] 磁性元件
[0099] 尖端形狀
[0100] 尖端的最簡單示例為具有圓形截面的錐體。根據(jù)本發(fā)明的錐形尖端優(yōu)選地具有在
頂點處小于45°的半
角。
[0101] 尤其用在本發(fā)明中的另一類型的尖端為刀片狀尖端。
[0102] 在該情況下，當然，尖端僅在一個方向上具有尖銳的頂尖角，即在與刀片的邊緣垂直的平面內(nèi)具有尖銳的頂尖角。根據(jù)本發(fā)明的刀片狀尖端優(yōu)選地具有小于45°的頂尖角。
[0103] 然而，根據(jù)本發(fā)明的尖端可具有很多不同的形狀。
[0104] 例如，尖端的三維形狀可具有更復雜的形狀，包括橢圓形刀片、圓形刀片等。
[0105] 還出于機械制造或堅固性的原因，根據(jù)本發(fā)明的尖端在其最末端可以是鈍圓的或平的。然而，如上所述，有利的是它們?nèi)跃哂锌傮w減小的截面。
[0106] 與尖端的最大截面相比，所述平的或鈍圓的部分可僅僅表示小區(qū)域，通常小于所述最大截面的10％、優(yōu)選地小于所述最大截面的5％、且更優(yōu)選地小于所述最大截面的2％。
[0107] 然而，當技術上可行時，有利地，該尖端可不具有鈍圓的或平的端部。
[0108] 在一實施方式中，尖端具有橫貫微通道的縱向軸線的縱向軸線、尤其與微通道的縱向軸線垂直的縱向軸線。
[0109] 在一實施方式中，當朝向微通道移動時，尖端的截面在其整個長度或者部分長度上減小。
[0110] 尖端尺寸
[0111] 尖端的典型尺寸可根據(jù)應用而變化，尤其根據(jù)微通道的尺寸而變化。
[0112] 為了簡潔和明確，除非另有說明，“尖端的尺寸”指沿著以下平面的尺寸：在該平面中，尖端的會聚角最小。例如，對于刀片狀尖端，將在與刀片邊緣垂直的平面中考慮尺寸。
[0113] 除非另有說明，否則“尖端的回轉(zhuǎn)半徑”也將指在尖端的會聚角最小的平面內(nèi)的有效的回轉(zhuǎn)半徑。
[0114] 由于技術原因，尖端可以不是十分圓的，如上文陳述，尖端可具有小的鈍圓部分或者一些不規(guī)則部分，因此使用術語“有效的”，且在該情況下，有效的回轉(zhuǎn)半徑為具有最緊密地包圍尖端的端部的圓形的平滑部分的半徑。
[0115] 磁性元件的尖端可具有比得上微通道的尺寸的尺寸。
[0116] 除非另有說明，否則“微通道的尺寸”指微通道的沿著由尖端和微通道之間的最短距離所限定的線的尺寸。明顯地，如果微通道是圓柱形的，則其尺寸是其直徑。如果微通道具有矩形的截面，則尺寸指微通道的垂直于尖端軸線而計算的厚度。
[0117] 本發(fā)明的另一優(yōu)勢在于，磁性元件可被“大線圈”激活，該“大線圈”可距離微通道本身一定距離而設置。因此，與例如Gijs的EP1974821或者scherrer的WO200361470中所描述的現(xiàn)有技術相比，使加熱問題最小化，可使用更高的電流，且可形成更強的磁力。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種微流體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括微通道、在所述微通道內(nèi)形成一系列的至少兩種不混溶流體的多個元件的部件、和至少一個可激活的磁性元件，該可激活的磁性元件的尖端面向所述微通道，其中，所述尖端與磁性芯磁連接，其中，所述磁性芯具有明顯大于所述通道且明顯大于所述尖端的回轉(zhuǎn)半徑的截面。
[0118] 所形成的磁場
[0119] 因此，本發(fā)明的另一目的在于提供具有至少一個微通道和可激活的磁性元件的微流體系統(tǒng)，該可激活的磁性元件可在所述微通道的一部分中形成磁場，該磁場的強度在10mT和1T之間、優(yōu)選地在20mT和100mT之間。
[0120] 因此，本發(fā)明的另一目的在于提供具有至少一個微通道和可激活的磁性元件的微流體系統(tǒng)，該可激活的磁性元件可在所述微通道的一部分中形成磁場梯度，尤其沿著微通道的縱向軸線的磁場梯度，該磁場梯度在10T/m和10000T/m之間、更優(yōu)選在100T/m和200T/m之間、更優(yōu)選在200T/m和500T/m之間、或者500T/m和1000T/m之間。
[0121] 磁場可是連續(xù)的或者交變的，尤其是正弦的。
[0122] 微通道
[0123] 另外，應當注意，有利地，本發(fā)明中限定的“微通道”可通過
刻蝕法或者“軟刻蝕”方法來制作，但是也
指定該術語為任何管狀容器或管，例如剛性管或柔性管。
[0124] 然而，與現(xiàn)有技術中的大多數(shù)液滴磁性操控裝置(其涉及二維的平面陣列)相反，根據(jù)本發(fā)明的微通道優(yōu)選地是單維的，例如它們具有寬度、厚度和長度，該長度遠大于所述寬度和所述厚度，為所述寬度和所述厚度的至少10倍、通常100倍或者更多倍。
[0125] 除此之外，有利地，微通道是圓柱形的或者平行六面體形的，但是它們也可具有更復雜的形狀(包括楔形、凸起形、凹槽形)、其壁上的微結(jié)構(gòu)、或者可對微流體感興趣的任何特征。
[0126] 然而，作為總的特征，本發(fā)明的微通道具有亞毫米截面，即，本發(fā)明的微通道在其長度的至少一部分上、尤其是至少在其長度的面向可激活的磁性元件的部分上、尤其在其2
至少50％的長度上，具有小于1mm 的截面，或者本發(fā)明的微通道具有至少一個小于500μm的橫截面尺寸。
[0127] 在不同的優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的微通道的在其長度的至少一部分上、尤其在至少其長度的面向可激活的磁性元件的部分上、尤其在其至少50％的長度上、尤其在2 2 2 2
其整個長度上的橫截面在100μm 和1000μm 之間、或者在1000μm 和10000μm 之間、或
2 2
者在0.01mm 和0.1mm 之間。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的微流體系統(tǒng)包括至少一個微通道且可包括多個微通道。所述微通道可完全是線型的、或者分支形成網(wǎng)。因此，盡管多數(shù)是線型的，但是本發(fā)明的微通道可包括分支部分，例如側(cè)分支部分或者交叉分支部分。優(yōu)選地，分支區(qū)域沿著微通道位于與面向可激活的磁性元件的區(qū)域遠離的區(qū)域中。
[0129] 微通道內(nèi)的液滴
[0130] 液滴的尺寸和液滴產(chǎn)生
[0131] 塞子或液滴的尺寸是極其可變的，例如從1皮升(pL)到2L。
[0132] 然而，有利地，本發(fā)明可允許得到在現(xiàn)有技術中不容易獲得的尺寸范圍內(nèi)的液滴，尤其在10pL和500nL之間、尤其在10pL和100pL之間、在100pL和1nL之間、在1nL和10nL之間、在10nL和100nL之間或在100nL和500nL之間。
[0133] 現(xiàn)有技術中已知多種在微通道內(nèi)形成一系列至少兩種不混溶流體的多個元件的裝置。
[0134] 例如，它們可包括流聚焦裝置(Anna等人，Applied Physics Letters、82，第384頁、2003(DOI10.1063/1.1537519)；T-接頭(Zheng等人，Analytical Chermistry，2004，76，4977-4982)或者兩相微吸量管(Chabert等人，Analytical Chemistry，2006，78，
7722-307728)、或者其組合。
[0135] 由于這一點且與微通道的總體單維性質(zhì)結(jié)合，本發(fā)明可允許通過周圍流體的簡單流或者壓力運輸以塞子或液滴的形式的大量的樣本或試劑。
[0136] 這緩解了對于將微線圈(例如Elsenhans、Gijs等人的現(xiàn)有技術(例如，EP1974821))或者微電極(如在Pamula等人(WO2010/042637)中)集成到微系統(tǒng)的需要。
[0137] 包含在液滴內(nèi)的磁性粒子
[0138] 磁性粒子優(yōu)選地是超順磁的。
[0139] 磁性粒子的尺寸可極其多樣化。
[0140] 粒子的尺寸指所述粒子的最大尺寸。
[0141] 在優(yōu)選的實施方式中，粒子的平均尺寸在0.5μm和5μm之間。
[0142] 除非另有說明，一組粒子的平均尺寸為以D50的粒度統(tǒng)計尺寸。
[0143] 在另一實施方式中，磁性粒子包括第一組粒子和與所述第一組粒子混合的第二組粒子，所述第一組粒子的平均尺寸在1μm和5μm之間，所述第二組粒子具有較大的平均尺寸，優(yōu)選地在10μm和50μm之間、或者在50μm和100μm之間、或者在100μm和200μm之間、或者在200μm和500μm之間的平均尺寸。
[0144] 關于磁性粒子的質(zhì)量，其也可在本發(fā)明內(nèi)變化，但是通常有利的是本發(fā)明用于操控小質(zhì)量的粒子。通常，在一個液滴內(nèi)包含的磁性粒子的質(zhì)量將在0.5μg和2μg之間、或者在2μg和8μg之間。
[0145] 在一些其它實施方式中，需要高的磁場梯度和至少一個尺寸小于50μm的小的微通道，磁性粒子的質(zhì)量可在0.01μg和0.1μg之間、或者在0.1μg和0.5μg之間?？商孢x地，在其它涉及至少一個橫向尺寸大于100μm、或者甚至大于300μm的微通道的實施方式中，磁性粒子的質(zhì)量可在8μg和100μg之間。
[0146] 多種類型的超順磁粒子被本領域的技術人員所知且可用于本發(fā)明。尤其，本發(fā)明利用攜帶配位體的粒子是特別有利的。
[0147] 如本文中所使用的，配位體表示能夠與其它物種(尤其被分析物)可逆地或不可逆地連接的物種或官能團。本領域的技術人員已知多個配位體。本發(fā)明特別感興趣的配位體為抗體，例如針對COI的表面抗原的抗體。然而，可使用多種其它配位體，例如金屬、組氨酸標簽、疏水基團、氫結(jié)合基團、蛋白A等。可用于本發(fā)明的其它類型的配位體為基于核酸的配位體，且能夠與一些核苷酸序列特異性連接。本發(fā)明內(nèi)的配位體，例如聚合
電解質(zhì)、或磷脂，也可由于靜電作用而發(fā)揮它們的連接作用。
[0148] 配位體還可表示化學物質(zhì)、藥物、核酸、核酸和酶的組合(例如用于DNA擴增的混合物)、抗體、熒光基團、發(fā)光基團、染料、納米粒子、金納米粒子、量子點、DNA嵌入染料、適體、或者任何類型的被認為能夠影響細胞的代謝或根據(jù)本發(fā)明的膠狀對象的特性、尤其是其光學特性的物種。
[0149] 在其它實施方式中，本發(fā)明的磁性粒子可支承附接到其表面的能夠使化合物改性的表面催化劑、或酶。
[0150] 這樣，本發(fā)明可被用于以極其小的體積來進行各種類型的反應，尤其ELISA、核酸擴增、測序反應、蛋白消化、或化學反應，尤其催化反應。
[0151] 方法和應用
[0152] 在一些優(yōu)選的實施方式中，所述多個可激活的元件可同時被激活。
[0153] 但是，在更優(yōu)選的實施方式中，所述多個可激活的元件中的至少一些可被單獨地激活，以拓寬方案的靈活性。
[0154] 尤其，有利地，在包含磁性粒子的一個液滴經(jīng)過時，將激活可激活的元件以保留所述磁性粒子。
[0155] 相反地，當液滴經(jīng)過時可激活的磁性元件可被去激活，以使液滴經(jīng)過而其內(nèi)容物未變化、或者以將次級液滴釋放到所述液滴中，該次級液滴包含先前通過所述可激活的磁性元件所保持的磁性粒子。
[0156] 值得注意的是，所述激活和去激活可手動地、自動地或者根據(jù)需求而實施。
[0157] 值得注意的是，所述激活和去激活可與液滴的移位同步進行。在該情況下，在一個或多個可激活的磁性元件附近的液滴的位置可通過不同的裝置(例如通過光學裝置、通過磁性傳感器)或通過阻抗測定來檢測。該檢測
信號然后被發(fā)送到自動化系統(tǒng)，例如計算機中的
軟件。優(yōu)選地，所述軟件能夠響應于所述信號來激活磁性元件或去激活磁性元件。在其它實施方式中，與上述技術組合是有利的，所述軟件還可控制在微通道內(nèi)運輸液滴的載送流體的運動。
[0158] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，包含磁性粒子的第一初級液滴可被分裂成第一次級液滴和第二次級液滴，所述第一次級液滴包含大部分所述磁性粒子和在所述第一初級液滴中包含的流體中的小部分流體，所述第二次級液滴包含小部分的所述磁性粒子和在所述第一初級液滴內(nèi)包含的流體中的大部分流體。
[0159] 優(yōu)選地，所述第二次級液滴被流運載走，所述第一次級液滴保持面對磁性尖端。
[0160] 優(yōu)選地，所述第二次級液滴包含所述初級液滴中所包含的磁性粒子中的20％和10％之間、或者10％和5％之間、或者5％和2％之間、或者2％和0.5％之間、或者小于5％的磁性粒子。
[0161] 也優(yōu)選地，所述第一次級液滴包含最初包含在初級液滴內(nèi)的流體體積的20％和10％之間、或者10％和5％之間、或者5％和2％之間、或者2％和0.1％之間的流體體積。
[0162] 本發(fā)明的另一優(yōu)勢為：由于磁性元件的可激活性質(zhì)，其還允許將束縛在上述第一次級液滴內(nèi)的磁性粒子釋放到較大體積的第二初級液滴中。
[0163] 因此，本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于執(zhí)行化學的、生物的、物理或生物化學的過程、分析或反應的方法，由于再懸浮過程，束縛在第一次級液滴內(nèi)的磁性粒子被釋放到第二初級液滴內(nèi)，第二初級液滴的體積大于所述第一次級液滴的體積。
[0164] 還優(yōu)選地，所述第一次級液滴的體積在所述第二初級液滴的體積的50％和20％之間、或者20％和10％之間、或者10％和5％之間、或者5％和2％之間、或者2％和0.1％之間。
[0165] 還有利地，本發(fā)明提供了用于有效地將所述磁性粒子混合在所述第二初級液滴內(nèi)的手段。所述手段可選自：在液滴中簡單地使用
對流，通過微通道中的彎曲、或者通過微通道中的微結(jié)構(gòu)、或者通過
聲波或
超聲波、或者通過流脈動或者
壓力脈動、或者通過微通道的不均勻直徑，來提高該流，這作為非詳盡列表。
[0166] 明顯地，本發(fā)明的具體優(yōu)勢和目的還在于提供用于執(zhí)行化學的、生物的、物理或生物化學的過程、分析或反應的方法，其中，上述的提取和/或再懸浮的步驟中的幾個步驟被組合在同一微流體系統(tǒng)內(nèi)。
[0167] 在包含本發(fā)明的磁性元件的微系統(tǒng)內(nèi)實施這一點是有利的，該磁性元件面對微流體系統(tǒng)內(nèi)的多個不同位置。
[0168] 作為另一特殊的實施方式，這種方法可通過使液滴在微通道內(nèi)來回移動來實施，該微通道面對本發(fā)明的一個或多個磁性元件。根據(jù)每一尖端內(nèi)產(chǎn)生的磁場的取向，兩個活動尖端的組合可用于捕獲和提取珠或者用于引起液滴內(nèi)的混合。
[0169] 聲波，尤其是超聲波，可在微通道內(nèi)傳播。這種方法可被用于增強液滴內(nèi)的混合。然而，必須特別注意系統(tǒng)內(nèi)的超聲波引起的可能的加熱效應。
[0170] 在尖端中會觀測到剩余磁場的情況下，簡單的消磁步驟可通過在線圈中產(chǎn)生交流電流而實施，該交流電流的強度隨著時間而減小(至0)。此處為成功使用的一組參數(shù)的示例：
[0171] -電流強度：線性衰減3A->0A
[0174] -尖端材料：高導磁
合金(mu metal)或者AFK502。
[0175] 本發(fā)明的方法可為用于檢測和/或量化樣本內(nèi)的分析物的方法。
[0176] 對于本領域技術人員清楚的是，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于微反應、免疫反應、酶消化、ELISA、診斷、
預后、藥物傳輸、高通量篩選等。
[0177] 本發(fā)明的方法可被用于多種類型的分析物、生物分子、多肽、
蛋白質(zhì)、
代謝物、核酸、細胞、細胞器、微粒和納米粒子、
聚合物、膠體、感染劑、食物成分、環(huán)境樣品。
[0178] 本發(fā)明的裝置可被整合成多個復雜裝置內(nèi)的一個技術
塊，所述復雜裝置尤其為高通量篩選裝置、
芯片實驗室、護理點、實驗工具、
機器人等。
[0179] 另外，本發(fā)明的方法可整合成用于診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、靶標發(fā)現(xiàn)、藥物評估的復雜方案的一部分。
[0180] 當然，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)和本發(fā)明的方法可與本領域中所已知的所有種類的微流體部件或功能相結(jié)合、或者包括本領域中所已知的所有種類的微流體部件或功能。
[0181] 此外，由于所使用的樣品的小的尺寸，本發(fā)明對于細胞測定(尤其是單細胞的篩選)、數(shù)字生物學、數(shù)字PCR、數(shù)字化核算擴增的應用是特別關注的。
[0182] 數(shù)字化指對生物對象或化學對象的單份進行的生物操作，與這種對象的整體相對，且其中，對這些單份中的每份的操作的結(jié)果可被分離。
[0183] 生物對象或化學對象，指任何分子的、超分子的、晶體的、膠體的、細胞的、亞細胞的對象，作為非詳盡列表，包括小細胞、細胞器、病毒、天然的DNA、人工的DNA或改性的DNA、RNA或核酸變種、蛋白質(zhì)、糖蛋白、磷蛋白、任何被取代的天然的或人工蛋白、脂類、磷脂、有機分子、有機金屬分子、大分子、單晶、量子點、納米粒子、囊泡、微囊等。
[0184] 本發(fā)明對于控制或分析危險物質(zhì)也是有利的，例如
輻射物質(zhì)、納米粒子、毒性的或者爆炸的化學物質(zhì)。
[0185] 特別地，本發(fā)明可用于與各種光學檢測方法組合，尤其光學檢測方法，因為通過將磁性粒子保留在第二液滴中，可減小由于這些粒子形成的光線吸收和噪音。
[0186] 非詳盡的應用列表為底物酶轉(zhuǎn)
化成熒光產(chǎn)物、吸收檢測、
化學發(fā)光檢測、比色檢測、電化學發(fā)光檢測。
[0187] 本發(fā)明也可用于基于磁性、尤其使用基于巨磁
電阻的磁性傳感器的檢測方法，或者用于蛋白質(zhì)結(jié)晶。
附圖說明
[0188] -圖1為根據(jù)本發(fā)明的微流體裝置的局部圖解視圖；
[0189] -圖1A為根據(jù)本發(fā)明的微流體裝置的圖解視圖；
[0190] -圖2圖解地示出根據(jù)本發(fā)明的珠處理方法的不同步驟；
[0191] -圖3A和圖3B示出說明珠簇提取所需的條件的
相圖；
[0192] -圖4示出根據(jù)本發(fā)明的方法的示例；
[0193] -圖5至圖8示出通過根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的結(jié)果；
[0194] -圖9圖解地示出根據(jù)本發(fā)明的另一珠處理方法的不同步驟；
[0195] -圖10示出液滴中磁性珠的凝集的明視場顯微圖；
[0196] -圖11示出磁場強度對圖9中所描述的方法的影響；
[0197] -圖12至圖14和圖15至圖15F圖解地示出可用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的微流體裝置的變型的細節(jié)；
[0198] -圖16A和圖16B示出可激活的磁性元件的示例；和
[0199] -圖17示出根據(jù)本發(fā)明的微通道的實施方式。
具體實施方式
[0200] 可僅利用一個與電磁線圈連接的磁性尖端來成功地進行提取。此處給出了描述該尖端幾何結(jié)構(gòu)的示意說明(以虛線的線圈嵌入)：
[0201] 在本系統(tǒng)中使用的材料為高導磁合金或AFK502或AFK01(Arcelor金屬)。使用自制的圓柱形電磁線圈，其由大約1000
匝的絕緣
銅線(0.8mm直徑)構(gòu)成。所使用的電流強度從0A到4A。
[0202] 面向第一尖端的第二尖端可被加入，以形成一對可激活的磁性元件。
[0203] 該第二尖端有助于使磁場線聚焦，從而增大微流體通道內(nèi)的磁場梯度。因此，可以以較小的磁性粒子含量或者以較低的場強度(即，較小的電流)來實施液滴分裂。
[0204] 在另一配置中，第二尖端可與附加的電磁線圈連接。
[0205] 這可被完成以增大場強度，從而更促進液滴分裂和粒子提取。
[0206] 圖1示出了微流體系統(tǒng)1，其包括沿著縱向軸線X延伸的微通道2和用于產(chǎn)生磁場以捕獲磁性體且實施如圖2所示的根據(jù)本發(fā)明的方法的捕獲裝置3。
[0207] 裝置3包括至少一個可激活的磁性元件5，且在所示的示例中，裝置3包括兩個可激活的磁性元件5、6。這對元件5、6也被稱作“磁性鉗”。
[0208] 磁性元件5和磁性元件6彼此相對且沿著軸線Y延伸，該軸線Y橫穿軸線X、優(yōu)選地與軸線X垂直。磁性元件5和磁性元件6分別包括對應的具有與軸線Y垂直的橫截面的尖端5a和尖端6a，該橫截面朝向另一尖端減小。當尖端5a和尖端6a朝向所示的微通道2移動時，其橫截面變小。
[0209] 在所示的示例中，每一尖端具有細長的橫截面且各自的在與軸線X垂直的平面內(nèi)延伸的邊緣5b或邊緣6b。
[0210] 兩個邊緣5b、6b可平行于彼此延伸，如圖所示，該兩個邊緣相隔一定的距離，例如該距離不超過微通道在方向Y上的厚度的5倍。
[0211] 邊緣5b和邊緣6b可接觸限定微通道的壁，同時通過這些壁與在微通道內(nèi)流動的流體分隔開。
[0212] 尖端5a和尖端5b的寬度可大于微通道的寬度，如圖所示。
[0213] 尖端5a和尖端6a優(yōu)選地由軟磁材料(例如μ金屬)制成，以在激發(fā)后不具有剩磁或具有少量剩磁。
[0214] 尖端5a和尖端6a可與相對應的芯5c或芯6c一體制成。
[0215] 激勵線圈12繞著芯5c纏繞以產(chǎn)生與軸線Y共線的感應。
[0216] 如圖1A所示，線圈12與控制器15連接，該控制器15可包括運行軟件的計算機，該軟件配置成基于各種輸入數(shù)據(jù)且例如基于光學液滴檢測而激發(fā)線圈12。
[0217] 攝像機16可監(jiān)控微通道且向控制器15提供液滴檢測信息。當液滴位于磁性元件5附近時，該信息能夠使得自動激發(fā)線圈12以執(zhí)行例如圖2中所示的方法。
[0218] 本發(fā)明的系統(tǒng)還包括微流體裝置20，其用于產(chǎn)生微通道2內(nèi)的液滴。
[0219] 裝置20包括例如Chabert等人在[2]中所公開的形成液滴的器件。
[0220] 裝置20還能夠借助
泰勒錐(Taylor cone)現(xiàn)象來產(chǎn)生液滴，如在WO2004/091763中公開的。這兩個出版物在此通過引用方式并入本文中。
[0221] 當激發(fā)線圈12時，通過尖端5a產(chǎn)生磁場，且該磁場在尖端5a和尖端6a之間的間隙內(nèi)延伸。磁場在尖端5a和尖端6a之間是強磁場且非常窄，這能夠捕獲如圖2所示的液滴內(nèi)的磁性珠。
[0222] 所捕獲的磁性珠為超順磁粒子。
[0223] 通過利用降低幅值的交流電流對線圈12通電，控制器15被配置成對可激活的磁性元件5和磁性元件6周期性去磁。
[0224] 在圖1所示的示例中，只有可激活的磁性元件5設置有線圈。在未示出的變型中，相對的元件6也設置有激勵線圈。
[0225] 線圈12可通過DC或AC電流激發(fā)。
[0226] 優(yōu)選地，如圖所示，線圈12與尖端的邊緣隔開，例如隔開至少1cm或2cm，這可減少熱從線圈朝向微通道的轉(zhuǎn)移。
[0227] 在下文中將詳細描述所獲得的實驗結(jié)果。
[0228] 示例
[0229] 示例1：粒子提取
[0230] 利用兩種類型的裝置來進行實驗。裝置1由單個軟磁合金(AFK502R，Imphy Alloys Arcelor Mittal)制成的磁性尖端構(gòu)成。由1000圈的銅線制成的電磁線圈(直徑33.5mm)被用于控制一個尖端的磁化。該磁性尖端被放置成與特氟隆管(300μm ID和600μm OD，Sigma-Aldrich)垂直。
[0231] 使用自制的圓柱形電磁線圈，其由大約1000匝的絕緣銅線(直徑0.8mm)構(gòu)成。所使用的電流強度從0A到4A。
[0232] 在第二類型的裝置(裝置2)中，與第一尖端相對的第二尖端可被添加，以形成磁性鉗構(gòu)型(反射對稱)。
[0233] 在圖2中示出了所實施的方法的不同步驟。
[0234] 使用自動吸管機器人系統(tǒng)，在特氟隆管中產(chǎn)生液滴串。
[0235] 在具有3％的
表面活性劑(1H,1H,2H,2H-全氟癸基-1-醇，F(xiàn)luorochem)的氟化油40(FC-40，3M)中形成水滴30?？紤]100nL液滴，引入1μg的粒子M(1μm，Dynal MyOne COOH粒子)。
[0236] 系統(tǒng)由通過XYZ位移臺而承載的、且與NeMesys
注射泵系統(tǒng)(Cetoni)連接的吸取尖端(特氟隆管Sigma)構(gòu)成，XYZ位移臺和NeMesys注射泵系統(tǒng)都由圖形化編程軟件Labview(美國國家儀器公司(National Instrument))控制。樣本被儲存在微量滴定板內(nèi)。在每一孔內(nèi)，水性的樣本被氟化油
覆蓋。系統(tǒng)順序地吸取每一孔內(nèi)的水性的溶液和氟化油，以便按照150nL的間隔產(chǎn)生定制的一連串的80nL的液滴30。在液滴形成期間，包含磁性粒子懸浮物的管至少每5分鐘就混合一次，以避免珠沉淀。
[0237] 液滴串的通常速率為1mm/s。在整個實驗期間，油流動速率保持恒定。
[0238] 當經(jīng)過磁性鉗5、6時，電磁體中的電流強度對于裝置2從0A切換至1.5A、對于裝置1從0A切換至2A。所形成的磁場產(chǎn)生朝向激活的尖端的吸力。產(chǎn)生磁性珠簇35。當液滴30在磁性鉗之間通過時，磁性珠簇35保持不動直到其到達液滴的水/油交界面處。當?shù)竭_液滴的前沿時，作用在珠簇上的磁性拉力被轉(zhuǎn)移到水/油交界面上，從而使液滴變形。高于一定
閾值時，磁力克服了毛細作用力且使包含粒子的液滴31從母體液滴中分離出來。
母體液滴32被油流拖走，而所提取的液滴31保留在誘捕器中。很明顯，如果所得到的液滴的尺寸(其主要由粒子簇的體積來決定)小于內(nèi)部的毛細管尺寸，則滿足該條件。在本實驗中，被提取的液滴的體積為1nL。
[0239] 簇液滴31可保持限制在磁性鉗5、6內(nèi)，直到新的塞33自發(fā)地接觸和合并。
[0240] 在圖2中圖解地示出了這些不同步驟。
[0241] 在合并后，根據(jù)待實施的操作，磁場可：
[0242] a)維持有效，以當液滴通過時保持粒子誘捕在該誘捕器內(nèi)；
[0243] b)釋放，以使粒子再懸浮在新的液滴34中。在該情況下，由液滴運動而產(chǎn)生的再循環(huán)流導致內(nèi)部的水動力再循環(huán)流，這促進了樣本和粒子的混合。
[0244] 該策略提供了對于次微升樣本體積中的生物測定所需的全部基本功能，即粒子洗滌、提取和培養(yǎng)。受約束的液滴的操控是有利的，由于液滴具有小的體積、容易空間處理和時間處理，且引起促進樣本混合的內(nèi)部水力再循環(huán)流。與較早的操作相比較，
碳氟化合物毛細管中的氟化油的使用避免了與水塞和表面之間的接觸相關的污染。使用電磁致動的鉗，利用極短的響應時間，包含磁性粒子的液滴可單獨地被控制。例如與文獻[3、4]中的記載相比，該新的方法允許更好的提取效率和更小的樣本體積，并且，當與自動化的液滴形成平臺[2]組合時(該平臺允許形成包含任意地選自微量滴定板的任意數(shù)量的液滴的“串”的形成)，該新的方法允許容易且靈活地實施復雜的方案。
[0245] 在下文中將給出關于根據(jù)本發(fā)明的方法的多個細節(jié)。
[0246] 捕獲特征
[0247] 用于從液滴中提取磁性粒子簇的磁力Fm與磁場梯度有關：
[0248]
[0249] 在此，Q為磁性粒子的質(zhì)量，ρ為質(zhì)量
密度，χ為珠
磁化率，μ0為自由空間的
介電常數(shù)，且B為磁通密度。管內(nèi)的磁場梯度可受到尖端的幾何形狀的影響、尤其受到尖端的尖銳度的影響。
[0250] 將第二尖端添加到管的另一側(cè)能夠集中磁場線。因此，在管內(nèi)可實現(xiàn)梯度場的更高的局部值，即使第二尖端未被線圈磁化。
[0251] 當磁性珠被尖端吸引時，磁性珠對液滴側(cè)產(chǎn)生壓力，從而導致表面變形。珠的提取源自磁力和毛細作用力之間的平衡。Fm需要足夠強以克服由液滴表面變形而形成的毛細作用力(圖2)，以打破表面。毛細作用力Fc與水和油之間的估計為10mN.m-1的表面
張力γ(Dorfman等人，2005)[13]、以及珠簇的尺寸有關。通過以下公式給出毛細作用力(Shikida等人，2006)。
[0252]
[0253] 珠簇提取所需的條件
[0254] 對于約300μm/s(其對應于0.02μL/s的流速)的液滴速率，研究了磁性線圈中的電流強度和粒子負荷對珠簇提取的相對影響。在圖3A中示出了結(jié)果。
[0255] 對于0.8μg/液滴的粒子負荷，研究了磁性線圈中的電流強度和液滴速率對珠簇提取的相對影響。在圖3B中示出了結(jié)果。
[0256] 觀察到液滴速度對捕獲磁性珠的能力的影響小。
[0257] 當液滴移動過快時，縮減了形成靠近尖端的珠簇的時間。
[0258] 在一些情況下，所形成的珠簇不包含全部量的珠。由于提取珠所必需的磁性力不能夠克服毛細作用力，故這可具有一些后果，從捕獲效率的下降(一些珠保留在液滴內(nèi))到提取的損失。對于高通量應用，流與系統(tǒng)的測量能力直接相關。因此，必須將磁場調(diào)成確保所有的珠被提取。
[0259] 合并和混合
[0260] 一旦珠被提取，所形成的小液滴由磁性粒子和剩余液體構(gòu)成。通過測量該液滴的尺寸且已知簇內(nèi)的珠量，對于包含0.8μg珠的初始80nL液滴，剩余液體的體積被估計為1nL。
[0261] 當小簇與另一液滴接觸時，總是發(fā)生合并。
[0262] 事實上，當表面之間的油膜足夠薄且珠懸浮在液滴內(nèi)而不形成聚集體時，兩個液滴合并。磁性粒子分散在液體中，對于剩余液體，產(chǎn)生80倍稀釋因子。因此，對于免疫測定法所需的洗滌步驟可僅僅通過連續(xù)地合并和捕獲緩沖液滴內(nèi)的珠來實施，其耗時小于1s。
[0263] 當粒子從簇懸浮到移動的液滴中時，粒子被
擠壓在液滴端的三角形的區(qū)域中。然而，由于塞在管內(nèi)移動而不濕潤壁，在油內(nèi)產(chǎn)生再循環(huán)流，從而在液滴內(nèi)也產(chǎn)生再循環(huán)流，故珠混合是高效的(Song等人，2003)[14]。以這種方式，珠被沿著那些流向線拖動，這引起整個液體中的有效混合(圖2)。
[0264] 珠捕獲效率
[0265] 在上文中已經(jīng)討論了珠提取的驅(qū)動力和條件。在此，關注本發(fā)明系統(tǒng)的捕獲效率。為了量化珠，通過利用生物素atto550浸透抗生蛋白鏈菌素包覆的珠，來制備熒光磁性粒子。圖8示出了在捕獲和釋放過程后每一塞的熒光圖。
[0266] 由于磁性珠擠壓在末端液滴處以及由于在管后面進行熒光觀測，強度級別在該區(qū)域中部達到了恒定最大值。由于MP量與該區(qū)域的尺寸比與最大熒光強度更為相關，故在液滴長度上總計熒光性。以這種方式，能夠辨別包含在每一液滴內(nèi)的珠的量。但是總計的熒光與MP數(shù)量之間的關系不直接成比例，這是初始液滴熒光和最終液滴熒光之間的比率并不是不變的原因。由于MP擠壓導致珠的真實數(shù)量的低估，來自初始液滴和空的液滴的熒
光信號的比較給出高于99％的捕獲效率，其實際上低于真實值。剩余的磁性粒子似乎困在液滴末端處的彎液面處。然而，該捕獲效率值高得足以計劃以多個步驟實施方式使用該系統(tǒng)，例如夾心免疫測定法，而不損失
生物材料。
[0267] 示例2：液滴內(nèi)的免疫測定
[0268] 如先前所述(示例1)，對于免疫測定法所需的基本操作單元可使用液滴平臺實施：珠限制、珠洗滌、在給定液滴內(nèi)的珠釋放和混合、以及連續(xù)的熒光監(jiān)控。
[0269] 在本示例中形成的免疫測定法為夾心免疫測定，其中，捕獲抗體嫁接在磁性粒子(從微粒子至納米粒子)上。第二抗體(檢測抗體)可被熒
光標記(FITC,Alexa…)或者與酶結(jié)合(
堿性
磷酸酶、辣根過
氧化物酶等)。免疫測定法基于通過嫁接在珠上的捕獲抗體來捕獲感興趣的分析物，同時使用靶向不同表位的次級抗體來進行檢測。分析物量化基于可檢測到的次級抗體的量。使用本文中研發(fā)的磁性液滴平臺，能夠利用樣本培養(yǎng)珠、執(zhí)行洗滌步驟、利用次級抗體培養(yǎng)珠、洗滌珠、執(zhí)行檢測或者利用將轉(zhuǎn)變成熒光產(chǎn)物的酶底物培養(yǎng)珠。
[0270] 實驗性
[0271] 現(xiàn)在給出一些更具體的方案細節(jié)。
[0272] 形成液滴免疫測定法以量化100nL子血清樣本中的促甲狀腺
激素(TSH)，TSH作為用于先天性甲狀腺功能低下癥的新生兒診斷的生物標志物。磁性珠和所有的免疫測定試劑都來自Immunometrics TSH
試劑盒，除了MUP來自Sigma。捕獲抗體和檢測抗體為靶向不同TSH表位的單克隆抗體。
[0273] 如下進行液滴免疫測定法：
[0274] -生成8個液滴的串(每一液滴100nl)，其包含對于實施如圖4所示的TSH量化所需的全部試劑。小體積的液滴使用自動化的
注射器[2]生成，然后通過全氟-烷氧基毛細管(300μm ID，Sigma)內(nèi)的全氟油運輸。通過注射泵(Nemesys，Cetoni)確保液滴驅(qū)動。
[0275] -首先，磁性珠M(
羧酸，1.05μm，MyOne Dynabeads，Invitrogen)用
馬血清培養(yǎng)，馬血清摻有從0mIU/L到60mIU/L的不同TSH濃度。
[0276] -在培養(yǎng)時間5分鐘后，固定在磁性珠M上的免疫復合物(捕獲抗體/TSH)50被磁性鉗5、6磁性誘捕。
[0277] -因此，通過使TBS(Tris緩沖鹽水：50mM Tris·HCl，pH7.4和150mM NaCl)液滴流過珠簇35來洗滌珠，以避免蛋白在免疫載體上的非特異性
吸附。
[0278] -使用第二組磁性鉗7、8，這些珠被磁性限定且釋放在包含次級抗體的液滴內(nèi)，該次級抗體與堿性磷酸酶結(jié)合(培養(yǎng)時間5分鐘)。
[0279] -最后，在利用3個TBS液滴進行第二洗滌步驟以除去未結(jié)合的次級抗體后，使用第三組磁性鉗7a、8a以將粒子釋放在酶底物(4-甲基傘形
酮磷酸酯)液滴中以進行檢測。
[0280] 通過使用一組微加工的尖端(AFK502，Imphy Alloys)將磁性粒子從一個液滴轉(zhuǎn)移到下一液滴內(nèi)，始終沿著液滴串來操控磁性粒子，其中，該尖端的頂點
曲率半徑小于50μm且根據(jù)需求利用自制的線圈進行磁化。
[0281] 檢測原理
[0282] 在本示例中，檢測原理在于，使用AP以將底物轉(zhuǎn)化為具有可檢測的不同特性的產(chǎn)物。例如，這可為
顏色、熒光性、
溶解度、或者氧化還原特性的變化。
[0283] 例如，在本示例中，標記有PA的抗體與MUP一起用作底物。重點注意，為了使用PA，所有使用的緩沖劑應不包含
磷酸鹽，以避免磷酸鹽與底物競爭。使用如先前所述的TBS緩沖液。使用具有高靈敏度的攝像機和二色性裝置的落射熒光
顯微鏡來監(jiān)控熒光信號。所使用的
濾波器為“DAPI(二脒基苯基吲哚)”濾波器(λexc＝358nm和λem＝461nm)。從落射熒光顯微鏡物鏡實時直接地測量在芯片中所觀測到的熒光，該熒光表示4-甲基傘形酮的產(chǎn)生。
[0284] 量化的原理
[0285] 存在兩種主要的不同樣式以監(jiān)控ELISA反應：終點ELISA和動態(tài)ELISA。動態(tài)ELISA與終點ELISA不同，這是因為動態(tài)ELISA基于酶底物反應動力學。事實上，當?shù)孜镞^量存在時，酶濃度和底物轉(zhuǎn)換的速率之間呈線性關系。這兩種ELISA樣式都可使用這樣的平臺進行。
[0286] 本示例記錄了通過動態(tài)ELISA對液滴內(nèi)的TSH量化。圖6記錄了液滴內(nèi)的熒光信號隨著不同的初始TSH濃度的時間變化。如從酶反應預計到，對于給定的時間段，熒光信號隨著
時間線性地增加，而在后期，熒光產(chǎn)物的濃度達到穩(wěn)定時期，而反應曲線的斜率隨著TSH濃度而增大。
[0287] 通過繪制初始的酶速率對TSH濃度得到免疫測定校準曲線(圖5)。背景信號的三標準偏差(three standard deviation)所限定的
檢測限度為等于1.8pM(Planells1975)的2mIU/L，1.8pM與常規(guī)的比色的動態(tài)ELISA(2.3mIU/L)相當。與常規(guī)的ELISA所需的2小時30分鐘相比，在不到10分鐘完成整個免疫測定。
[0288] 一旦在液滴串上完成第一步驟，由于磁性鉗單獨受到控制，則能夠開始第二分析。以這種方式，免疫測定法輸出受到液滴串長度控制。對于100nL子樣品，這導致每小時120個分析物的分析通量。
[0289] 結(jié)果和討論
[0290] 該策略被應用于致力于先天性甲狀腺功能低下癥(CH)的新生兒診斷的免疫測定，先天性甲狀腺功能低下癥是高發(fā)生率疾病(1：2000到1：4000新生兒)。早期
治療的嬰兒的預后是極好的，而未治療的CH導致嚴重的發(fā)展問題。
[0291] CH的臨床診斷主要基于促甲狀腺激素的升高濃度(TSH>30mIU/L血清)。使用該微流體平臺，在10分鐘內(nèi)以100nL子體積的樣本完成整個免疫測定(與常規(guī)ELISA的2小時30分鐘和200μL比較)，這些是對于新生兒診斷的必需標準。在圖4中給出了夾心ELISA的分析次序。通過連續(xù)地監(jiān)控根據(jù)底物培養(yǎng)時間的熒光性的增加而執(zhí)行量化。
[0292] 因此，通過與酶初始速率相對應的反應曲線的斜率來確定TSH濃度(圖6)。限定為背景信號的三標準偏差的檢測限度為等于1.8pM(圖5)的2mIU/L，1.8pM與常規(guī)的比色的ELISA相當，且滿足了先天性甲狀腺功能低下癥診斷的標準。
[0293] 圖7示出了微流體液滴的結(jié)果實現(xiàn)了對于TSH檢測所需的標準靈敏度(標準閾值30mIU/L，血清中)。結(jié)果(標準化的)與常規(guī)的比色的批處理分析相比較。誤差條涉及三次測量結(jié)果。
[0294] 更一般地，在皮摩爾范圍內(nèi)的靈敏度為生物基質(zhì)內(nèi)該濃度范圍中存在的疾病生物標志物的大量分析鋪平道路。目前對復用的調(diào)查表明，一旦啟用，該平臺允許連續(xù)的液滴串的產(chǎn)生以及大于120分析/小時的最大分析速率相關的分析，且對于高通量策略的研發(fā)是非常誘人的。
[0295] 結(jié)論
[0296] 成功地開發(fā)了基于受約束的液滴和磁性粒子處理的靈活的免疫測定平臺。本發(fā)明工作適于先天性甲狀腺功能低下癥診斷，但也可擴展至幾乎任何免疫測定。本發(fā)明的結(jié)果顯示，與批處理方案相比的類似的靈敏度性能，同時提供了1000倍的體積減小和總分析時間從2小時30分縮短至10分鐘。該方法為自動的且高通量的篩選少量樣本上的生物標志物鋪平了道路。
[0297] 示例3：基于磁性珠的在受約束的液滴內(nèi)的免疫凝集測定
[0298] 如圖9所示，在油包水型液滴30內(nèi)實施凝集步驟，且該步驟由
磁約束產(chǎn)生以增強磁性珠(MB)M碰撞頻率，從而促進聚集體形成[17]。
[0299] 在氟化油內(nèi)收約束的液滴30[18、19]允許單個區(qū)室化，防止交叉污染。此外，在“管線”形式中大量產(chǎn)生液滴的可能性能夠以簡單芯片設計實現(xiàn)可靠的且高通量的分析。
[0300] 使用抗生蛋白鏈菌素包覆的MB(1μm)M(表面功能化的磁性粒子)和生物素化的堿性磷酸酶(b-PA)(靶標：38)作為模型實施該測定的第一證明(圖9)。如下文所詳細描述，磁性粒子M提供了多個結(jié)合位點39a。
[0301] 通過順序地從微量滴定板吸取限定體積的油和樣本(分別包含MB M和靶標38)而在特氟隆管內(nèi)生成液滴30。由MB M的混合物生成(1)液滴30，該混合物首先利用b-PA38培養(yǎng)5分鐘然后被運送至特氟隆管內(nèi)。靶標38因此可在粒子M的結(jié)合位點39a上被捕獲。包含自由MB的液滴進一步被朝向磁性鉗(2)5和6運送。當在磁性鉗5和6之間通過時，MB被磁性約束以促進聚集體35形成。
[0302] 一旦經(jīng)過磁性鉗5和6，液滴內(nèi)的內(nèi)部再循環(huán)流引起促進MB再分散的剪切力。該過程防止非特異性凝集，但保持粒子之間的特異性交互作用，粒子保持聚集的狀態(tài)且仍形成聚集體35a(圖9、圖10A和圖10B)。從圖9可見，聚集的磁性粒子通過橋39彼此連接，該橋39具有以下結(jié)構(gòu)：第一磁性粒子的結(jié)合位點39a–靶標38–第二磁性粒子的結(jié)合位點39b，所述第二磁性粒子的結(jié)合位點與第一磁性粒子的結(jié)合位點不同。
[0303] 圖10示出了在0(A)和100ng/mL(B)的靶標下的液滴內(nèi)的MB凝集的明場顯微照片。對于空白(S空白)和測定(S測定)實驗的集成
透射光的變化使用簡易可視的廉價USB攝像機60在透射光下監(jiān)控。信號被定義為(1-S測定/S空白)。C)對于三個不同MB濃度：1mg/mL(紅)、2mg/mL(藍)、3mg/mL(綠)，得到在5分鐘培養(yǎng)后用于b-PA靶標的校準曲線。插圖集中于0ng/mL-80ng/mL靶標濃度范圍。
[0304] 組件包括配置成照射液滴的光源61、配置成測量來自光源的被液滴吸收的光的量的光學檢測器60。
[0305] 光源61和攝像機60允許微通道的檢測區(qū)70的內(nèi)容物
可視化。
[0306] 檢測在于，測量由凝集過程誘導的通過液滴的總和光吸收的變化。聚集態(tài)的珠在與觀測方向垂直的液滴內(nèi)占據(jù)較小的面積，從而凝集增大傳輸信號。
[0307] 當存在于檢測區(qū)70時，至少10％、優(yōu)選50％、優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％的包含在液滴內(nèi)的磁性粒子可為聚集的形式。
[0308] 圖11強調(diào)了B的應用強烈地增加了聚集動力學。使用1mg/mL的MB，檢測限為大約100pM(圖10C)，其符合多數(shù)免疫診斷的要求。
[0309] 該基于液滴的平臺提供了高通量(每小時300分析物)和低成本的分析。該裝配由簡單的項目組成，而液滴形式將樣本體積減少至80nL。此外，磁性鉗的集成允許MB從一個液滴到另一液滴的提取和轉(zhuǎn)移，從而允許測定步驟的完全自動化。
[0310] 在變型中，可激活的磁性元件5或磁性元件6可具有在圖12至圖14、圖15至圖15F中所示的幾何形狀。
[0311] 如圖12和圖13所示，可激活的磁性元件5包括尖端5a，其寬度w和厚度t沿著尖端5的縱向軸線Y減小。所示的可激活的磁性元件5為凸形。
[0312] 圖15所示，磁性元件5可具有平行六面體形狀，當其尖端朝向微通道移動時具有減小的截面。尖端5a如所示橫貫微通道的軸線X延伸，尤其垂直于微通道的軸線X延伸。
[0313] 在變型中，磁性元件具有立方體形狀。
[0314] 圖16A還示出可直接激活的磁性元件的實施方式，該磁性元件為電磁體的芯。
[0315] 圖16B示出用作可激活的磁性元件的軟磁性元件的示例，其中，永久磁體可通過機械部件很靠近所述軟磁性元件。
[0316] 永久磁體可被轉(zhuǎn)動以使其磁極與芯的一側(cè)接觸，在這種情況下，芯被激活；或者永久磁體被轉(zhuǎn)動以不再與該芯接觸，在這種情況下，芯未被激活。
[0317] 圖17還示出了微通道的實施方式，其包括分支，例如側(cè)分支101、或者交叉分支102。分支區(qū)域沿著微通道被定位在遠離面對所示的可激活的磁性元件5和磁性元件6的區(qū)域的區(qū)域中。
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[0338] 表述“包括/包含”應被理解成“包括至少一個/包含至少一個”，除非另有說明。
[0339] 表述“形成一”應被理解成“形成至少一個”，除非另有說明。
[0340] 表述“包含在…和…之間”應被理解成包含邊界值，除非另有說明。
