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確定癌癥患者的個(gè)性化治療策略的方法
閱讀：317發(fā)布：2020-12-10
專利匯可以提供確定癌癥患者的個(gè)性化治療策略的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 提供了一種確定個(gè)性化 治療 策略的強(qiáng)大工具。具體而言，本發(fā)明提供了用于確定來(lái)自患有實(shí)體癌的受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性 信號(hào) 通路，確定受試者的 治療方案 ，選擇受試者用于治療，確定受試者是否易受益于治療，預(yù)測(cè)受試者的臨床結(jié)果，治療受試者和/或預(yù)測(cè)實(shí)體癌對(duì)治療的敏感性的方法。，下面是確定癌癥患者的個(gè)性化治療策略的方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種用于確定來(lái)自患有實(shí)體癌的受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的體外方法，其包括
a)提供代表一些治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合在所述癌癥樣本中的表達(dá)水平；
b)確定步驟a)中提供的每個(gè)表達(dá)水平相比于相同基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在所述癌癥起源的器官中，
-在至少一種對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
-在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型中；
c)計(jì)算所述基因中的每一個(gè)的得分，所述得分代表所述基因在所述癌癥樣本中的表達(dá)相比于所述基因在所述癌癥起源的器官中、在對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中以及在所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中的表達(dá)的總體變化幅度；和
d)根據(jù)所述計(jì)算得分對(duì)所述基因進(jìn)行排序，
其中所述治療上可靶向顯性信號(hào)通路對(duì)應(yīng)于排序最高的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括，在步驟a)之前，確定所述基因集合在所述癌癥樣本中的表達(dá)水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其還包括，在步驟b)之前，確定所述基因集合在以下中的表達(dá)水平
-在所述癌癥起源器官的樣本中，
-在至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織的樣本中，和/或
-在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型的樣本中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)測(cè)量所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物或其蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物的量，優(yōu)選通過(guò)測(cè)量所述mRNA轉(zhuǎn)錄物的量來(lái)確定所述表達(dá)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)定量RT-PCR或使用高通量測(cè)序技術(shù)如RNA-Seq或使用微流體系統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)來(lái)確定所述表達(dá)水平。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中使用以下公式計(jì)算所述得分
其中
m和n是正整數(shù)并且相同或不同，以及
ΔΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)＝ΔCt(癌癥樣本)-ΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)
其中ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的感興趣基因)-Ct(癌癥樣本中的管家基因)，并且ΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)＝Ct(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型中的感興趣基因)-Ct(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型中的管家基因)。
7.一種用于確定患有實(shí)體癌的受試者的治療方案的體外方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，以及確定靶向至少一種顯性信號(hào)通路的治療方案。
8.一種用于選擇患有實(shí)體癌的受試者用于治療或確定患有實(shí)體癌的受試者是否易受益于治療的體外方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，
其中如果所述治療靶向至少一種顯性信號(hào)通路則所述受試者被選擇用于治療或者易于受益于所述治療。
9.一種用于預(yù)測(cè)患有實(shí)體癌的受試者的臨床結(jié)果的體外方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，其中如果所述受試者用靶向至少一種顯性通路的療法來(lái)治療，則預(yù)后良好。
10.一種預(yù)測(cè)實(shí)體癌對(duì)治療的敏感性的體外方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，其中如果所述治療靶向至少一種顯性信號(hào)通路，則所述癌癥對(duì)所述治療敏感。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、皮膚癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、頭頸癌和乳腺癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化-在正常腦中，
-在II級(jí)星形細(xì)胞瘤中，和
-在正常腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和/或正常腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是結(jié)腸癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常結(jié)腸中和/或在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中，
-在非癌性息肉或低級(jí)別結(jié)腸腫瘤中，和
-在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是前列腺癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常前列腺中，
-在前列腺腺體增生中，和
-在正常前列腺上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和/或前列腺成纖維細(xì)胞中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是皮膚癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常皮膚組織中，
-在至少低級(jí)別黑素瘤(0級(jí))中，和
-在至少正常表皮上皮細(xì)胞、真皮上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、默克爾細(xì)胞和/或皮膚內(nèi)皮細(xì)胞中。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是肺癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常肺中，
-在至少低級(jí)別肺腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常肺平滑肌細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和/或氣管上皮細(xì)胞中。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是胰腺癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常胰腺中，
-在至少低級(jí)別胰腺腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常胰腺內(nèi)皮細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、泡心細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、星狀細(xì)胞和/或胰島細(xì)胞(朗格漢斯)中。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是肝癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常肝臟中，
-在至少低級(jí)別肝臟腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常肝細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞和/或庫(kù)普弗細(xì)胞中。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是腎癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常腎臟中，
-在至少低級(jí)別腎臟腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常系膜細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、上皮細(xì)胞、皮質(zhì)上皮細(xì)胞和/或腎小管細(xì)胞中。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是頭頸癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常器官或組織中，即在喉、咽喉、唇、口、鼻或唾液腺中，取決于確切的腫瘤位置；
-在至少低級(jí)別頭頸部腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常口腔細(xì)胞、口咽細(xì)胞和/或下咽細(xì)胞中。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述實(shí)體癌是乳腺癌，并且其中在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
-在正常乳房中，
-在至少低級(jí)別乳房腫瘤(I或II級(jí))中，和
-在至少正常乳房成纖維細(xì)胞和/或上皮細(xì)胞中。
22.一種試劑盒，其包含引物對(duì)，探針或?qū)τ谶x自表1至4中列出的基因的至少20種基因具特異性的抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)τ谶x自以下的至少20種基因具特異性的抗體：ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)τ谥辽貶IF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因具特異性的抗體。
25.一種包含引物對(duì)、探針或?qū)τ诖砀鶕?jù)權(quán)利要求1中所定義的治療上可靶向信號(hào)通路的基因中的每一個(gè)具特異性的抗體的試劑盒的用途，其用于(i)確定來(lái)自患有實(shí)體癌的受試者的癌癥樣本中的所述治療上可靶向顯性信號(hào)通路，(ii)確定患有實(shí)體癌的受試者的治療方案，(iii)選擇患有實(shí)體癌的受試者用于治療，(iv)確定患有實(shí)體癌的受試者是否易受益于治療，(v)預(yù)測(cè)患有實(shí)體癌的受試者的臨床結(jié)果，(vi)治療癌癥患者，和/或(vii)預(yù)測(cè)實(shí)體癌對(duì)治療的敏感性。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述試劑盒是根據(jù)權(quán)利要求22至24中的任一項(xiàng)所述的試劑盒。
確定癌癥患者的個(gè)性化治療策略的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是腫瘤學(xué)領(lǐng)域。特別是，它提供了新的工具來(lái)選擇最佳治療選項(xiàng)并因此提供新的個(gè)性化治療策略。
背景技術(shù)
[0002] 復(fù)雜性顯然是細(xì)胞生物學(xué)的標(biāo)志。細(xì)胞不斷暴露于多種環(huán)境信號(hào)，從而誘導(dǎo)增殖、遷移、分化或最終細(xì)胞死亡。為了對(duì)這種無(wú)數(shù)的信息做出適當(dāng)響應(yīng)，細(xì)胞建立了由執(zhí)行動(dòng)態(tài)相互作用的膜蛋白組成的令人難以置信的復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)平臺(tái)。這種相互作用最終觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即負(fù)責(zé)將外部信號(hào)與細(xì)胞行為變化聯(lián)系起來(lái)的細(xì)胞通訊高速公路，它們自身被組織為中樞交聯(lián)通路并由此形成相互作用的細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)。這個(gè)過(guò)程的固有特征是個(gè)體元件不僅能夠與相同通路的成分相互作用，而且能夠與不同通路的成分相互作用。
[0003] 信號(hào)通路經(jīng)歷不斷的重塑，這是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的直接結(jié)果。引人注目的是，這種分子可塑性不限于正常細(xì)胞，而是在病理情形下也存在。事實(shí)上，這種適應(yīng)性是腫瘤細(xì)胞生存和發(fā)育所用的機(jī)制之一，盡管選擇性抑制重要通路可調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)。一直以來(lái)，這些信號(hào)通路的鑒定在過(guò)去的二十年中深刻地改變了抗癌藥物的設(shè)計(jì)。所謂的靶向療法導(dǎo)致高效化合物如小分子、肽或人源化抗體的鑒定和驗(yàn)證。然而，這些強(qiáng)效藥物中的大多數(shù)未能提供明確的治愈效果，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。
[0004] 一個(gè)實(shí)例是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者病例，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的原發(fā)性腦腫瘤。過(guò)去20年來(lái)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率有所增加，并且現(xiàn)在已達(dá)到5/100?000。這些腫瘤的分型仍存在困難。WHO分型提供了與腫瘤的侵襲性相關(guān)的腫瘤分級(jí)(從I到IV)。最嚴(yán)重也是最常見(jiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO?IV級(jí))，總生存期的中位數(shù)不超過(guò)15個(gè)月。這些腫瘤在腦實(shí)質(zhì)中表現(xiàn)出大量的細(xì)胞浸潤(rùn)并且高度血管化。標(biāo)準(zhǔn)的一線治療目前是基于最大限度的手術(shù)切除，伴隨放化療(60戈瑞，30次，替莫唑胺75mg/m2/d持續(xù)6周)，然后用替莫唑胺進(jìn)行輔助化療。
[0005] 與在一些癌癥適應(yīng)癥中用抗血管生成藥物獲得的成功一致，將防止血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體結(jié)合的人源化重組抗體貝伐單抗用作復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的二線治療?？寡苌芍委熞呀?jīng)在30％至60％的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中證實(shí)其功效。然而，隨著時(shí)間的推移，功效仍然不高，因?yàn)闊o(wú)進(jìn)展生存期達(dá)到6個(gè)月，而生存期不超過(guò)9個(gè)月(Omuro等,《神經(jīng)生物學(xué)新見(jiàn)(Curr?Opin?Neurol.)》,2008?21(6):717-9)。各種研究評(píng)估了貝伐單抗聯(lián)合替莫唑胺、伊立替康(包括兩項(xiàng)具有相反結(jié)果的不同研究)、卡鉑、依托泊苷、西妥昔單抗或厄洛替尼，但沒(méi)有一種組合表現(xiàn)出優(yōu)于單獨(dú)貝伐單抗的優(yōu)勢(shì)。因此，與過(guò)去二十年來(lái)其它藥物獲得的結(jié)果相比，貝伐單抗表現(xiàn)為最佳治療選項(xiàng)，展現(xiàn)出令人印象深刻的效果。該結(jié)果因此導(dǎo)致通過(guò)將貝伐單抗作為一線治療來(lái)改變臨床實(shí)踐。然而，貝伐單抗功效數(shù)據(jù)的匯編顯示，至多地，應(yīng)答率范圍為11％至79％，中位無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)為4.2至7.6個(gè)月并且中位總生存期(OS)為4.6至12.6個(gè)月(Koukourakis?GV《,關(guān)于炎癥和過(guò)敏癥藥物發(fā)現(xiàn)的最新專利(Recent?Pat?Inflamm?Allergy?Drug?Discov.)》,2012?6(1):70-7)。最近公布的III期試驗(yàn)AVAglio和RTOG證實(shí)了貝伐單抗治療的患者在PFS方面而不是OS方面的顯著優(yōu)勢(shì)(Soffietti等《, 神經(jīng)治療學(xué)專家評(píng)論(Expert?Rev?Neurother.)》,2014年1月；14(1):1-3)?？傮w而言，少于50％的患者似乎受益于貝伐單抗治療。
[0006] 因此，患者分層(stratification)是改善治療方案的根本問(wèn)題。這個(gè)問(wèn)題不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者。事實(shí)上，由于治療手段的擴(kuò)展，作為男性和女性中第三大常見(jiàn)癌癥的結(jié)腸直腸癌(CRC)的管理，也正經(jīng)歷著深刻的突變。管理通常遵循根據(jù)腫瘤分級(jí)的決策樹(shù)(Stinzing?S.,F1000Prime?reports,2014)。雖然一線治療是顯而易見(jiàn)的(FOLFOX/FOLFIRI方案)，但二線治療不太清楚，并且抗血管生成劑的添加令人困惑。在前列腺癌中使用抗血管生成化合物也出現(xiàn)類似的問(wèn)題(Bilusic和Wong,AS；《男性學(xué)雜志(J.Andrology)》,2014)。
[0007] 因此，盡管舉例說(shuō)明了對(duì)指導(dǎo)治療方法的需求，但這些結(jié)果說(shuō)明了開(kāi)發(fā)幫助臨床醫(yī)生對(duì)于給定患者選擇最佳治療選項(xiàng)的工具的可能性有多重要。
發(fā)明內(nèi)容
[0008] 本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種強(qiáng)大的工具，該工具幫助確定癌癥患者的最佳治療策略，特別是在可用的治療手段中。根據(jù)患者活檢，本發(fā)明方法允許確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，從而對(duì)患者分層或選擇最佳治療選項(xiàng)。
[0009] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于確定來(lái)自患有實(shí)體癌的受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法，其包括
[0010] a)提供代表一些治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合在所述癌癥樣本中的表達(dá)水平；
[0011] b)確定步驟a)中提供的每個(gè)表達(dá)水平相比于相同基因在以下中的表達(dá)水平的變化
[0012] -在所述癌癥起源的器官中，
[0013] -在至少一種對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0014] -在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型中；
[0015] c)計(jì)算所述基因中的每一個(gè)的得分，所述得分代表所述基因在癌癥樣本中的表達(dá)相比于所述基因在所述癌癥起源的器官中、在對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中和在所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中的表達(dá)的總體變化幅度；和
[0016] d)根據(jù)所述計(jì)算得分對(duì)所述基因進(jìn)行排序，
[0017] 其中所述治療上可靶向顯性信號(hào)通路對(duì)應(yīng)于具有最高次序的基因。
[0018] 所述方法還可包括，在步驟a)之前，確定所述基因集合在所述癌癥樣本中的表達(dá)水平。
[0019] 所述方法還可包括，在步驟b)之前，確定所述基因集合在以下中的表達(dá)水平：
[0020] -在所述癌癥起源器官的樣本中，
[0021] -在對(duì)應(yīng)于所述癌癥的至少一個(gè)低級(jí)別或良性腫瘤組織的樣本中，和/或
[0022] -在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型的樣本中。
[0023] 可通過(guò)測(cè)量所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物或其蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物的量，優(yōu)選通過(guò)測(cè)量所述mRNA轉(zhuǎn)錄物的量來(lái)確定表達(dá)水平。優(yōu)選地，通過(guò)定量RT-PCR來(lái)確定表達(dá)水平。
[0024] 在步驟c)中，可使用以下公式來(lái)計(jì)算得分
[0025]
[0026] 其中
[0027] m和n是正整數(shù)并且相同或不同，以及
[0028] ΔΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)＝ΔCt(癌癥樣本)-ΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)
[0029] 其中ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的感興趣基因)-Ct(癌癥樣本中的管家基因)，并且ΔCt(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型)＝Ct(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型中的感興趣基因)-Ct(器官、低級(jí)別或良性腫瘤組織或細(xì)胞亞型中的管家基因)。
[0030] 本發(fā)明還涉及一種用于確定患有實(shí)體癌的受試者的治療方案的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，以及確定靶向至少一種顯性信號(hào)通路的治療方案。
[0031] 本發(fā)明還涉及一種用于選擇患有實(shí)體癌的受試者用于治療或確定患有實(shí)體癌的受試者是否易受益于治療的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，其中如果所述治療靶向至少一種顯性信號(hào)通路則所述受試者被選擇用于治療或者易于受益于所述治療。
[0032] 本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)測(cè)患有實(shí)體癌的受試者的臨床結(jié)果的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，其中如果所述受試者用靶向至少一種顯性通路的療法治療，則預(yù)后良好。
[0033] 本發(fā)明還涉及一種預(yù)測(cè)實(shí)體癌對(duì)治療的敏感性的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，其中如果所述治療靶向至少一種顯性信號(hào)通路，則所述癌癥對(duì)所述治療敏感。
[0034] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、皮膚癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、頭頸癌和乳腺癌，優(yōu)選選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述實(shí)體癌是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并且在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在正常腦中、在II級(jí)星形細(xì)胞瘤中以及在正常腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和/或正常腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平的變化。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述實(shí)體癌是結(jié)腸癌，并且在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在正常結(jié)腸中和/或在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中、在非癌性息肉或低級(jí)別結(jié)腸腫瘤中以及在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平的變化。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述實(shí)體癌是前列腺癌，并且在步驟b)中，確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在正常前列腺中、在前列腺腺體增生中以及在正常前列腺上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和/或前列腺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平的變化。
[0038] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含一對(duì)引物，一條探針或?qū)τ诖碇委熒峡砂邢蛐盘?hào)通路的基因中的每一個(gè)具特異性的抗體，以及所述試劑盒用于以下的用途：(i)確定來(lái)自患有實(shí)體癌的受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，(ii)確定患有實(shí)體癌的受試者的治療方案，(iii)選擇患有實(shí)體癌的受試者用于治療，(iv)確定患有實(shí)體癌的受試者是否易受益于治療，(v)預(yù)測(cè)患有實(shí)體癌的受試者的臨床結(jié)果，(vi)治療實(shí)體癌患者，和/或(vii)預(yù)測(cè)實(shí)體癌對(duì)治療的敏感性。附圖說(shuō)明
[0039] 圖1：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活檢中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的確定。(A)當(dāng)將數(shù)據(jù)相對(duì)于腦、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和低級(jí)別星形細(xì)胞瘤歸一化時(shí)獲得每個(gè)基因的得分。(B)然后將所得值排序并轉(zhuǎn)換為任意單位。(C)雷達(dá)模式顯示歸一化得分的對(duì)數(shù)值。
[0040] 圖2：在該研究中僅包含可用藥物的靶基因的受限標(biāo)簽(restricted?signature)的得分(A)和雷達(dá)模式(B)。
[0041] 圖3：21例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的個(gè)人標(biāo)簽(personal?signature)的雷達(dá)模式?；颊逪B1至HB12(A)和HB13至HB21(B)。
[0042] 圖4：15例結(jié)腸直腸癌患者的個(gè)人標(biāo)簽的雷達(dá)模式。
[0043] 圖5：15例前列腺癌患者的個(gè)人標(biāo)簽的雷達(dá)模式。
[0044] 圖6：從GBM活檢(HB2)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與腦、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和低級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0045] 圖7：從GBM活檢(HB6)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與腦、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和低級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0046] 圖8：從GBM活檢(HB7)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與腦、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和低級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0047] 圖9：從CC活檢(結(jié)腸1)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與正常結(jié)腸、人上皮結(jié)腸細(xì)胞、微血管結(jié)腸細(xì)胞和低級(jí)別結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0048] 圖10：從CC活檢(結(jié)腸4)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與正常結(jié)腸、人上皮結(jié)腸細(xì)胞、微血管結(jié)腸細(xì)胞和低級(jí)別結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0049] 圖11：從CC活檢(結(jié)腸8)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)和四步歸一化(E)的雷達(dá)模式。A、B、C和D分別是指通過(guò)與正常結(jié)腸、人上皮結(jié)腸細(xì)胞、微血管結(jié)腸細(xì)胞和低級(jí)別結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0050] 圖12：從前列腺腺癌活檢(1)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)、四步歸一化(E)和五步歸一化(F)的雷達(dá)模式。A、B、C、D和E分別是指通過(guò)與正常前列腺、上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、前列腺成纖維細(xì)胞和低級(jí)別前列腺癌中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0051] 圖13：從前列腺腺癌活檢(2)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)、四步歸一化(E)和五步歸一化(F)的雷達(dá)模式。A、B、C、D和E分別是指通過(guò)與正常前列腺、上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、前列腺成纖維細(xì)胞和低級(jí)別前列腺癌中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0052] 圖14：從前列腺腺癌活檢(3)獲得的個(gè)人標(biāo)簽。原始數(shù)據(jù)(A)、一步歸一化(B)、兩步歸一化(C)、三步歸一化(D)、四步歸一化(E)和五步歸一化(F)的雷達(dá)模式。A、B、C、D和E分別是指通過(guò)與正常前列腺、上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、前列腺成纖維細(xì)胞和低級(jí)別前列腺癌中的表達(dá)相比較的歸一化。
[0053] 圖15：從CC模型(CR-IC-028M)獲得的個(gè)人受限標(biāo)簽的得分(A)和雷達(dá)模式(B)。體內(nèi)CC模型中使用的抑制劑和治療方案(C)。用曲妥珠單抗、西妥昔單抗、西地尼布或媒介物治療的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)展(D)。
[0054] 圖16：從GBM模型(HB21)獲得的個(gè)人受限標(biāo)簽的得分(A)和雷達(dá)模式(B)。體內(nèi)GBM模型中使用的抑制劑和治療方案(C)。SB-3CT、西地尼布和厄洛替尼與TMZ相比的功效(％)(D)。
[0055] 圖17：從PC模型(HID-28)獲得的個(gè)人受限標(biāo)簽的得分(A)和雷達(dá)模式(B)。體內(nèi)PC模型中使用的抑制劑和治療方案(C)。用西地尼布、厄洛替尼、多西他賽或媒介物治療的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)展(D)。
[0056] 圖18：包含從腦腫瘤樣本中獲得的22種基因和8種(30種基因)或22種(44種基因)額外基因的標(biāo)簽。
具體實(shí)施方式
[0057] 定義
[0058] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“樣本”是指含有源自受試者的細(xì)胞的任何樣本，優(yōu)選含有核酸的樣本。所述樣本的實(shí)例包括流體如血液、血漿、唾液、尿液、腦脊液和精液樣本以及活檢組織、器官、組織或細(xì)胞樣本。樣本可在其使用前進(jìn)行處理。它可能是新鮮的、冷凍的或固定的(例如甲醛或石蠟固定的)樣本。
[0059] 術(shù)語(yǔ)“癌癥樣本”或“腫瘤樣本”是指含有源自患者的腫瘤細(xì)胞的任何樣本。優(yōu)選地，樣本僅包含腫瘤細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥樣本是活檢組織或源自在手術(shù)期間從患者獲得的活檢組織。
[0061] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”或“腫瘤”是指存在具有致癌細(xì)胞的典型特征例如不受控制的增殖、永生性、轉(zhuǎn)移潛能、快速生長(zhǎng)和增殖速率以及某些特有的形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括早期、局部化癌癥；晚期、局部晚期癌癥；和轉(zhuǎn)移期癌癥。優(yōu)選地，該術(shù)語(yǔ)是指實(shí)體癌。更優(yōu)選地，所述癌癥選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、肺癌、胃腸癌、黑素瘤、頭頸部腫瘤。甚至更優(yōu)選地，所述癌癥選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌。
[0062] 術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)膠質(zhì)瘤”是指由腦或脊髓的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或其前體產(chǎn)生的腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的組織學(xué)定義是基于它們是否主要表現(xiàn)出星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并通過(guò)細(xì)胞性、核異型性、壞死、有絲分裂象和微血管增殖進(jìn)行分級(jí)。星形細(xì)胞瘤有兩種主要類型：高級(jí)別和低級(jí)別。高級(jí)別腫瘤生長(zhǎng)迅速，充分血管化，并且可以容易地傳遍大腦。低級(jí)別星形細(xì)胞瘤通常是局部化的，并且在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)緩慢生長(zhǎng)。高級(jí)別腫瘤更具侵襲性，需要非常密集的治療，并且與低級(jí)別腫瘤相比，生存期長(zhǎng)度較短。這些腫瘤可發(fā)生在腦和脊髓中的任何地方。一些較常見(jiàn)的低級(jí)別星形細(xì)胞瘤是：青少年毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、原纖維型星形細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤和胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮瘤。兩種最常見(jiàn)的高級(jí)別星形細(xì)胞瘤是間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)(GBM)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
[0063] 術(shù)語(yǔ)“前列腺癌”是指前列腺的任何癌癥。前列腺癌可以是腺癌、肉瘤、小細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或移行細(xì)胞癌。優(yōu)選地，前列腺癌是腺癌。
[0064] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)腸癌”是指任何組織學(xué)類型的大腸(包括結(jié)腸和直腸)中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于惡性上皮腫瘤。結(jié)腸癌可以是腺癌、類癌瘤、粘液腺癌(也稱為膠樣腺癌)、印戒細(xì)胞腺癌、硬皮瘤、單純癌或肉瘤。優(yōu)選地，結(jié)腸癌是腺癌。
[0065] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“皮膚癌”是指任何組織學(xué)類型的皮膚中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于基底細(xì)胞癌、默克爾細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌或黑素瘤。優(yōu)選地，皮膚癌是黑素瘤。
[0066] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肺癌”是指任何組織學(xué)類型的肺中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌(包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌)。優(yōu)選地，癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
[0067] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胰腺癌”是指任何組織學(xué)類型的胰腺中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于外分泌腫瘤和內(nèi)分泌腫瘤。胰腺腫瘤可以是腺癌、腺泡細(xì)胞癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性贅瘤、粘液性囊腺癌、胰高血糖素瘤、胰島瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤1型。優(yōu)選地，胰腺癌是外分泌腫瘤。
[0068] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肝癌”是指任何組織學(xué)類型的肝臟中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于肝細(xì)胞癌、纖維板層癌、膽管癌。優(yōu)選地，肝癌是肝細(xì)胞癌。
[0069] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腎癌”是指任何組織學(xué)類型的腎中出現(xiàn)的癌癥，包括但不限于腎細(xì)胞癌(也稱為腎細(xì)胞腺癌或腎上腺樣瘤)。腎細(xì)胞癌可能是透明細(xì)胞性腎癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞腎細(xì)胞癌。優(yōu)選地，腎癌是腎細(xì)胞癌。
[0070] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“頭頸癌”是指在頭部和頸部的組織和器官中出現(xiàn)的癌癥。它們包括任何組織學(xué)類型的喉癌、咽喉癌、唇癌、口癌、鼻癌和唾液腺癌。頭頸部腫瘤可能是鱗狀細(xì)胞癌癥(鱗狀細(xì)胞癌)、腺癌或肉瘤。優(yōu)選地，頭頸部腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌。
[0071] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乳腺癌”是指任何組織學(xué)類型的乳腺的任何癌癥。乳腺癌可能是導(dǎo)管原位癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌。優(yōu)選地，乳腺癌是浸潤(rùn)性乳腺癌。
[0072] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”或“療法”是指旨在改善患者健康狀況的任何行為，例如治療、防止、預(yù)防和延緩疾病。在某些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指改善或根除疾病或與疾病相關(guān)的癥狀。在其它實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指由于將一種或多種治療劑施用于具有這種疾病的受試者而引起的所述疾病的擴(kuò)散或惡化的最小化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，療法是化療。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)治療”或“化療”是指使用化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)，特別是使用一種或幾種抗腫瘤劑的癌癥治療性處理。
[0073] “治療有效量”意指向患者施用足以構(gòu)成癌癥治療的治療劑的量。
[0074] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“不良預(yù)后”是指降低的患者生存期和/或早期疾病進(jìn)展和/或增加的疾病復(fù)發(fā)和/或增加的轉(zhuǎn)移形成。相反，術(shù)語(yǔ)“良好預(yù)后”是指增加的患者生存期和/或延遲的疾病進(jìn)展和/或減少的疾病復(fù)發(fā)和/或減少的轉(zhuǎn)移形成。
[0075] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)通路”是指任何細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，細(xì)胞將一種信號(hào)或刺激轉(zhuǎn)換為另一種信號(hào)或刺激，最通常涉及細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)的有序序列，所述反應(yīng)通過(guò)酶進(jìn)行并且通過(guò)激素和生長(zhǎng)因子(細(xì)胞間)以及第二信使(細(xì)胞內(nèi))連接。
[0076] “治療上可靶向信號(hào)通路”是可以通過(guò)治療手段調(diào)節(jié)，優(yōu)選已經(jīng)可用或正在開(kāi)發(fā)的信號(hào)通路。
[0077] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”是指其表達(dá)模式可以確定并與已知條件相關(guān)，特別是與信號(hào)通路的激活相關(guān)的差異表達(dá)基因。
[0078] 如本文所公開(kāi)的本發(fā)明方法可以是體內(nèi)、離體或體外方法，優(yōu)選體外方法。
[0079] 本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種強(qiáng)大的工具，該工具幫助確定癌癥患者的最佳治療策略，特別是在可用的治療手段中。事實(shí)上，該工具旨在為臨床醫(yī)生提供幫助選擇為達(dá)到最佳治療效果必須靶向哪個(gè)腫瘤信號(hào)通路的決策工具。如實(shí)驗(yàn)部分中所示，本發(fā)明人證實(shí)，可通過(guò)確定代表治療上可靶向通路的基因集合的表達(dá)水平并施用多步歸一化程序而從患者活檢獲得個(gè)人預(yù)測(cè)分級(jí)。他們表明，這種連續(xù)歸一化必須考慮到腫瘤的異質(zhì)性和復(fù)雜性并提供可靠的結(jié)果。
[0080] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于在來(lái)自患有癌癥的受試者的癌癥樣本中確定可被治療靶向的腫瘤中的顯性信號(hào)通路、即治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法。
[0081] 所述方法包括
[0082] a)提供代表一些治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合在來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的表達(dá)水平；
[0083] b)確定步驟a)中提供的所述基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平相比于所述基因在以下中的表達(dá)水平的變化
[0084] -在所述癌癥起源的器官中，
[0085] -在至少一種對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0086] -在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型中；
[0087] c)計(jì)算所述基因中的每一個(gè)的得分，所述得分代表所述基因在癌癥樣本中的表達(dá)相比于所述基因在所述癌癥起源的器官中、在對(duì)應(yīng)于所述癌癥的低級(jí)別或良性腫瘤組織中和在所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中的表達(dá)的總體變化幅度；和
[0088] d)根據(jù)所述計(jì)算得分對(duì)所述基因進(jìn)行排序，
[0089] 其中所述治療上可靶向顯性信號(hào)通路對(duì)應(yīng)于排序最高的基因。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括，在步驟a)之前，在所述癌癥樣本中確定代表一些治療上可靶向信號(hào)通路的所述基因的表達(dá)水平。任選地，所述方法還可包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本，例如在手術(shù)期間從患者獲得的癌癥樣本。
[0091] 可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)確定基因的表達(dá)水平。具體而言，可(i)通過(guò)測(cè)量mRNA的量和/或(ii)通過(guò)測(cè)量編碼蛋白的量來(lái)確定表達(dá)水平。
[0092] 用于確定mRNA量的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且包括但不限于定量或半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)定量或半定量RT-PCR、Nanostring技術(shù)、基于測(cè)序的方法或轉(zhuǎn)錄組方法。
[0093] 樣本(例如從患者制備的細(xì)胞或組織)中所含的核酸可首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法例如使用裂解酶或化學(xué)溶液提取或者按照制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)核酸結(jié)合樹(shù)脂提取。這些核酸可以在使用前冷凍儲(chǔ)存。
[0094] 然后可通過(guò)雜交(例如Northern印跡分析)和/或擴(kuò)增(例如RT-PCR)檢測(cè)提取的mRNA。定量或半定量RT-PCR是優(yōu)選的。實(shí)時(shí)定量或半定量RT-PCR是特別有利的。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)引物對(duì)以重疊內(nèi)含子，從而區(qū)分cDNA擴(kuò)增與推定的基因組污染。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)這樣的引物。其它擴(kuò)增方法包括但不限于連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。
[0095] 可選地，mRNA的量也可使用Nanostring的NCOUNTERTM數(shù)字基因表達(dá)系統(tǒng)(Geiss等,2008《自然-生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)》,26:317-325)測(cè)量，該系統(tǒng)捕獲mRNA轉(zhuǎn)錄物并通過(guò)分子條形碼技術(shù)對(duì)各個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)并且由Nanostring?Technologies商業(yè)化；或使用 Plex?2.0測(cè)定法(Affymetrix)測(cè)量。
[0096] mRNA的量還可以使用基于高通量測(cè)序技術(shù)如RNA-Seq(Wang等《, 自然評(píng)論-遺傳學(xué)(Nat?Rev?Genet.)》,2009年1月；10(1):57-63)或使用微流體系統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)的方法來(lái)確定。
[0097] 基因的表達(dá)水平還可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組方法，特別是通過(guò)使用DNA微陣列測(cè)量mRNA的量來(lái)確定。為了確定基因的表達(dá)水平，任選地首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的樣本被標(biāo)記并且在雜交條件下與微陣列接觸，導(dǎo)致形成與連接到微陣列表面的探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間的復(fù)合物。然后檢測(cè)被標(biāo)記的雜交復(fù)合物并且可以是定量或半定量的。標(biāo)記可以通過(guò)各種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)使用放射性或熒光標(biāo)記。微陣列雜交技術(shù)的許多變體可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所用。適用于測(cè)量感興趣基因的表達(dá)水平的DNA生物芯片的實(shí)例包括但不限于人類基因組U133?Plus?2.0陣列(Affymetrix)。
[0098] 也可以使用下一代測(cè)序方法(NGS)。
[0099] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)定量RT-PCR來(lái)測(cè)量mRNA的量。
[0100] 用于測(cè)量編碼蛋白的量或活性的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且方法的選擇取決于編碼蛋白。通常，這些方法包括使樣本與能夠選擇性地與樣本中存在的蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合搭配物接觸。結(jié)合搭配物通常是多克隆或單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。通過(guò)半定量蛋白質(zhì)印跡、免疫化學(xué)(酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫測(cè)定法，例如ELISA、生物素/抗生物素蛋白類型測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、免疫電泳或免疫沉淀)或通過(guò)蛋白質(zhì)或抗體陣列來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的量。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)反相蛋白質(zhì)微陣列(RPPM)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。還可以在癌癥樣本的組織切片(例如冷凍或福爾馬林固定的石蠟包埋材料)上通過(guò)免疫組織化學(xué)來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。反應(yīng)通常包括顯示標(biāo)記，例如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性、酶標(biāo)記或染料分子，或用于檢測(cè)抗原和與其反應(yīng)的一種或多種抗體之間的復(fù)合物形成的其它方法。也可以使用比活性測(cè)定法，特別是當(dāng)編碼蛋白是酶時(shí)。
[0101] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)利用定量RT-PCR測(cè)量mRNA的量來(lái)確定基因的表達(dá)水平。
[0102] 優(yōu)選地，將步驟a)中提供和/或如上所述測(cè)定的基因的表達(dá)水平相對(duì)于參考表達(dá)水平，優(yōu)選相對(duì)于一種或多種管家(或?qū)φ栈騾⒖?基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。
[0103] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“管家基因”是指涉及維持細(xì)胞所需的基本功能的基因。管家基因以相對(duì)恒定的水平被轉(zhuǎn)錄，因此用于對(duì)不同樣本之間變化的基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。管家基因的實(shí)例包括但不限于GAPDH(Gene?ID?NCBI?2597)、核糖體18S基因(RNA18S5，Gene?ID?NCBI:100008588)、β-葡糖苷酸酶、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、泛素、RPLPO、HPRT1和B2M基因。
[0104] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)利用定量RT-PCR測(cè)量mRNA的量來(lái)確定每個(gè)基因的表達(dá)水平，并利用2-ΔCt方法相對(duì)于管家基因、優(yōu)選地核糖體18S(R18S)和/或GAPDH參考基因?qū)ζ溥M(jìn)行歸一化。
[0105] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于以下指示來(lái)選擇代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合。任選地，所述方法還可包括，在步驟a)之前，確定代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合。
[0106] 由于本發(fā)明的方法而排序的信號(hào)通路可以變化，特別是根據(jù)癌癥的類型和新的治療靶標(biāo)的發(fā)展。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于以下來(lái)選擇代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因：i)相關(guān)生物學(xué)功能的良好知識(shí)，ii)表達(dá)水平與腫瘤侵襲性之間的相關(guān)性，和/或iii)已經(jīng)臨床使用的治療手段(包括超說(shuō)明書(shū)藥物)的存在。
[0107] 優(yōu)選地，代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因集合包括腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物，包括炎癥、癌癥干細(xì)胞、缺氧、細(xì)胞死亡、翻譯后修飾和增殖的標(biāo)志物；樣本的血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物，包括微血管密度、內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞、促血管生成/促淋巴管生成因子和促血管生成/促淋巴管生成受體的標(biāo)志物；腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志物，包括細(xì)胞外成分及其受體和細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物；以及腫瘤細(xì)胞遷移活性的標(biāo)志物，包括促遷移因子、促遷移因子受體、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及與細(xì)胞遷移相關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物。
[0108] 腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物
[0109] 腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物反映了樣本中的炎癥、癌癥干細(xì)胞、缺氧的水平，細(xì)胞死亡水平，翻譯后修飾水平和增殖水平。
[0110] 炎癥標(biāo)志物
[0111] 炎癥由炎性細(xì)胞(T或B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和炎癥因子(細(xì)胞因子、一氧化氮)的存在定義。
[0112] 樣本中的炎癥水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于SDF1通路成員，例如SDF1、CXCR4、CRCR7、JAK?2、STAT3和NFkB；其它反映炎癥水平的分子，例如VCAM-1、ICAM-1、pSelectin、TNFa；腫瘤促進(jìn)細(xì)胞因子，例如IL-6、IL-23、IL-1、IL-13和其它家族成員、IGF-1、BAFF、CSF-1、MSP、TGFb和一氧化氮(NO)；趨化因子，例如CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1b、CCL5或RANTES、CCL8和MCP-2；免疫細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)志物，例如CD163、CD204、CD4、CD8、CD68、CD66b、CD25、OX40(CD134)、Foxp3和CD20(Grivennikov等《, 細(xì)胞(Cell)》,2010,140(6):883-899；Xueqing等《, 癌癥與轉(zhuǎn)移綜述(Cancer?Metastasis?Rev.)》,2010年12月；29(4):709-722；Beverly等《, 臨床癌癥研究(Clin? Cancer? Res)》；16(11)；2927-31；Shiao等,《基因與發(fā)育(Genes?and?
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2004,521-530)。
[0113] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣本中的炎癥水平通過(guò)測(cè)定SDF1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估。SDF1(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，也被稱為CXCL12；Gene?ID：6387)是一種體內(nèi)平衡的CXCα-趨化因子，一種小的促炎性趨化性細(xì)胞因子，其在多種組織類型中表達(dá)，包括淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞。它有助于腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的交流。它促進(jìn)中性粒細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的遷移、浸潤(rùn)、激活。它還介導(dǎo)一些類型的癌癥中的腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0114] SDF1信號(hào)通路可以在治療上例如用普樂(lè)沙福(商品名Mozobil，目前處于與貝伐單抗聯(lián)合用于復(fù)發(fā)性高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床試驗(yàn)中)靶向，它是一種用于在非霍奇金淋巴瘤患者中刺激干細(xì)胞從骨髓釋放進(jìn)入血液中并阻斷SDF1受體CXCR4的造血干細(xì)胞動(dòng)員劑(Beverly?A.T.,Simon?P.F.,《臨床癌癥研究(Clinical?Cancer?Research)》,16(2010),16:11；Xueqing?Sun,Guangcun?Cheng等《, 癌癥轉(zhuǎn)移綜述(Cancer?Metastasis?Rev.)》,(2010),29(4):709-722)。
[0115] 癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物
[0116] 癌癥干細(xì)胞被定義為展現(xiàn)與干細(xì)胞共有的標(biāo)志物或標(biāo)志物組合的腫瘤細(xì)胞的亞群。癌癥干細(xì)胞限定在大多數(shù)癌癥類型中具有許多臨床意義的癌細(xì)胞亞群，所述臨床意義包括：引發(fā)微觀和宏觀轉(zhuǎn)移，造成治療抗性和癌癥復(fù)發(fā)。這些多重功能反映了不同信號(hào)通路如Notch、Wnt/β-連環(huán)蛋白、TGF-β、刺猬蛋白、PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT通路的激活。
[0117] 癌癥干細(xì)胞的存在可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于CD133、巢蛋白、CD15、CD24、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49f(整聯(lián)蛋白α6鏈)、CD166、CD171、CD184(CXCR4)、CD325(N-鈣粘蛋白)、CD326(EpCAM)、CD338(ABCG2)、HER-2/neu、Lgr5、Notch1、Notch2、SSEA-1、BMI-1、Β-連環(huán)蛋白、CDX-2、雙皮質(zhì)素、EZH2、纖維連接蛋白、GFAP、核干細(xì)胞因子(Nucleosemin)、Oct3/4、Sox2、波形蛋白、ALDH1、Trop2、TGFb、Musashi、NRP1、Wnt/β-連環(huán)蛋白通路、TGF-β通路、刺猬蛋白通路、PI3K/Akt/mTOR通路和JAK/STAT通路(Klonisch等《, 分子醫(yī)學(xué)趨勢(shì)(Trends?Mol?Med.)》,2008,450-60；Wu等《, 實(shí)驗(yàn)與臨床癌癥研究雜志(Journal?of?Experimental&Clinical?Cancer?Research)》,2015,34:44；Medema《,自然-細(xì)胞生物學(xué)(Nat?Cell?Biol.),2013年4月；15(4):338-44；Dahlrot?RH等,《丹麥醫(yī)學(xué)雜志(Dan?Med?J.)》,2014,B4944；Zhong?Li《, 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)和腫瘤學(xué)(Experimental?Hematology&Oncology)》,(201)3,2:17)。
[0118] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定CD133的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本的癌癥干細(xì)胞含量。CD133，也被稱為PROM1(GeneID:8842)，是祖細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物。它通過(guò)抑制分化來(lái)維持干細(xì)胞特性。它的表達(dá)與一些類型的癌癥有關(guān)。它有助于腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、化療耐藥和不良預(yù)后。它也涉及轉(zhuǎn)分化。
[0119] CD133信號(hào)通路，即Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，可以在治療上例如用目前處于臨床前試驗(yàn)中的端錨聚合酶(Tankyrase)抑制劑XAV939進(jìn)行靶向。XAV939通過(guò)使破壞復(fù)合物的濃度限制成分axin穩(wěn)定化來(lái)刺激β-連環(huán)蛋白降解(Zhong?Li,《實(shí)驗(yàn)血液學(xué)和腫瘤學(xué)(Experimental?Hematology&Oncology)》,30(201)3,2:17)。
[0120] 缺氧標(biāo)志物
[0121] 缺氧(組織缺氧或血液缺氧)是身體或身體某個(gè)區(qū)域缺乏足夠氧氣供應(yīng)的狀況。大多數(shù)腫瘤產(chǎn)生血管供應(yīng)不足的區(qū)域，因此呈現(xiàn)嚴(yán)重的缺氧。在許多缺氧但存活的區(qū)域中，氧分壓幾乎比正常組織低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。缺氧細(xì)胞對(duì)放療或化療有抗性，因此是腫瘤復(fù)發(fā)的來(lái)源。
[0122] 樣本的缺氧狀態(tài)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于HIF及其靶基因、GLUT-1、CA?IX碳酸酐酶IX、LDH-5乳酸脫氫酶同工酶5、MCT-1和MCT-4(Vaupel等《, 癌癥轉(zhuǎn)移綜述(Cancer?Metastasis?Rev)》,2007,26:225-239；Rademakers等《, BMC癌癥(BMC?Cancer)》,2011,11:167)。
[0123] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定HIF1α(Gene?ID:3091)的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本的缺氧狀態(tài)。HIF1A是缺氧誘導(dǎo)因子家族(HIF家族)的成員。它作為缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其與惡性進(jìn)展、侵襲、血管生成、代謝改變和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。它在抵抗治療的癌癥中也有作用。
[0124] HIF1α信號(hào)通路可以在治療上例如用以下進(jìn)行靶向：地高辛，一種非特異性HIF1a抑制劑，目前正在肺癌和前列腺癌的早期階段試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估；或硼替佐米，其抑制HIF-1α蛋白表達(dá)，獲準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤并且目前正在實(shí)體瘤的早期階段試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估(Favaro等《, 基因組醫(yī)學(xué)(Genome?Medicine)》,(2011),3:55))。
[0125] 細(xì)胞死亡標(biāo)志物
[0126] 細(xì)胞死亡可以通過(guò)根據(jù)其性質(zhì)和生理影響限定的不同機(jī)制發(fā)生。這包括凋亡、壞死和自噬性細(xì)胞死亡。
[0127] 樣本中的細(xì)胞死亡水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于凋亡標(biāo)志物，例如BCL-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、A1/Bfl-1、CED-9、cFLIP、PARG、Bax和相關(guān)的抗凋亡因子；壞死標(biāo)志物，例如RIP3和胱天蛋白酶8；自噬標(biāo)志物，例如PI3K和Beclin1(Portt等《,生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochimica?et?Bio-physica?Acta)》,2011?238-259；Cory等《, 致癌基因(Oncogene)》,2003,22,8590-8607；Liu等《,國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志(Int?J?Biochem?Mol?Biol)》,2012,165-178；Su等《,分子癌癥(Mol?Cancer)》,2015,10.1186)。
[0128] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定BCL-2和/或PARG，優(yōu)選BCL-2和PARG的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中的細(xì)胞死亡水平。
[0129] 作為BCL-2家族成員的BCL-2(B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2；GeneID：596)是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白并抑制某些形式的壞死性細(xì)胞死亡。它在多種人類惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)。BCL-2信號(hào)通路可以在治療上例如用ABT-199進(jìn)行靶向，所述ABT-199是目前正在白血病和淋巴瘤的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估的一種有效和選擇性的BCL-2抑制劑(KW?Yip和JC?Reed,《致癌基因(Oncogene)》,(2008)27,6398-6406；Souers等《, 自然醫(yī)學(xué)(Nature?Medicine)》,19,202-
208,2013)。
208,2013)。
[0130] PARG(聚ADP-核糖糖水解酶；GeneID：8505)是一種負(fù)責(zé)催化聚(ADP-核糖)(PAR)聚合物(一種可逆的染色體蛋白質(zhì)共價(jià)調(diào)節(jié)劑)的形成和降解的主要酶。PARG在DNA修復(fù)和損傷，染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞死亡中發(fā)揮作用。PARG信號(hào)通路可以在治療上例如用GPI?16552進(jìn)行靶向，所述GPI?16552目前處于黑素瘤的臨床前研究中(Rafiqul?I.,Fumiaki?K.,24(2014)3802-3806；Lucio?T.,Carlo?L.《,歐洲癌癥雜志(European?Journal?of?Cancer)》,41,(2005)2948-2957)。
[0131] 翻譯后修飾標(biāo)志物
[0132] 許多細(xì)胞反應(yīng)(包括細(xì)胞增殖、遷移或?qū)NA雙鏈斷裂的響應(yīng))涉及許多觸發(fā)泛素化的蛋白質(zhì)和其它泛素樣調(diào)節(jié)劑，如SUMO化、磷酸化、甲基化、乙?；駻DP核糖基化。
[0133] 樣本中的翻譯后修飾水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于PARG，PARP?1和2，組蛋白脫乙酰酶(HDAC)，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，組蛋白脫甲基酶，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)，蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)，蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)，賴氨酸脫甲基酶，激酶Aurora-B，SUMO家族和N/O糖基化標(biāo)志物如凝集素(Nilufer?Jasmine?Selimah?Fauzee和Juan?Pan《, 病理學(xué)與腫瘤學(xué)研究(Pathol.Oncol.Res.)》,(2010)16:469-478；Wan?Feng,Bin?Zhang等,《癌癥通訊(Cancer?Letters)》,347(2014)183-190；Debby?M.E.I.Hellebrekers,Arjan?W.Griffioen等《, 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochimica?et?Biophysica?Acta)》,1775(2007)76-91；Roy?M.Pollock,Victoria?M.Richon《,今日藥物發(fā)現(xiàn)：治療策略(Drug?Discovery?Today:Therapeutic?Strategies)》,(2009)6-2；Robert?A?Copeland,Edward?J?Olhava《, 化學(xué)生物學(xué)最新觀點(diǎn)(Current?Opinion?in?Chemical?Biology)》,(2010),14:505-510；Ruth?G.F.和Frauke?M.,《自然評(píng)論：分子細(xì)胞生物學(xué)(Nature?Reviews?molecular?cell?biology)》,(2007),8；Niall?O'D.《, 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochimica?et?Biophysica)》,(2002)336-345)。
[0134] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)確定PARG的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中的翻譯后修飾水平。
[0135] 增殖標(biāo)志物
[0136] 細(xì)胞增殖，更特別是不受控制的細(xì)胞增殖是癌癥進(jìn)展的非常重要的組成部分。已知許多因素，無(wú)論是細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素等，都直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。
[0137] 樣本中的增殖水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于PDGFR/PDGF、EGFR/EGF、HER、C-MET/HGF、IGFR/IGF、FGFR/FGF、軸突導(dǎo)向蛋白(Semaphorin)、神經(jīng)氈蛋白、神經(jīng)叢蛋白、VEGFR/VEGF、RAS致癌基因和細(xì)胞外基質(zhì)元件(Masaubmi?Shibuya《, 血管生成(Angiogenesis)》,(2006)9:225-230；Masaubmi?Shibuya等《, 生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志(Journal?of?biochemistry?and?molecular?biology)》,5:469-478；Seker和Harvey《, 發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn)》,(2015)244:323-331；Alexander?K.,Satdarshan?P.M.《, 基因表達(dá)(Gen?Expr)》,(2015),16(3):109-127；Juan?Carlos?Samamé?Pérez-Vargas等,《國(guó)際分子科學(xué)雜志(Int.J.Mol.Sci.)》,2013,14,18056-18077；
Y.Yarden《,歐洲癌癥雜志(European?Journal?of?Cancer)》,37(2001)S3-S8；Perez?EA等,《癌癥治療綜述(Cancer?Treat?Rev)》,(2014)276-284；Nicholas?T.,Richard?G.《,自然癌癥綜述(nature?review?cancer)》,(2010)10)。
Y.Yarden《,歐洲癌癥雜志(European?Journal?of?Cancer)》,37(2001)S3-S8；Perez?EA等,《癌癥治療綜述(Cancer?Treat?Rev)》,(2014)276-284；Nicholas?T.,Richard?G.《,自然癌癥綜述(nature?review?cancer)》,(2010)10)。
[0138] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定以下各物的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中的增殖水平：EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、TNW、IntB1、CMET和/或FGF2，優(yōu)選地EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、TNW、IntB1、CMET和FGF2，并且更優(yōu)選地EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、IntB1、CMET和FGF2。
[0139] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物選自表1中列出的基因。
[0140] 表1：優(yōu)選的腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物的列表
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0146] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物選自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0147] 血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物
[0148] 血管生成和淋巴管生成狀態(tài)是指樣本中的血管或淋巴管內(nèi)容物，這些血管是由先前存在的血管或淋巴管周圍的腫瘤產(chǎn)生的。血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物反映了微血管密度，內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的水平，促血管生成/促淋巴管生成因子的水平以及促血管生成/促淋巴管生成受體的表達(dá)水平。
[0149] 微血管密度標(biāo)志物
[0150] 微血管密度是指與血管生成開(kāi)關(guān)相關(guān)的新生血管床，其被認(rèn)為是進(jìn)一步腫瘤發(fā)展所需的腫瘤血液供應(yīng)增加的關(guān)鍵步驟。
[0151] 微血管密度可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于CD34、LYVE1、NG2、VE鈣粘蛋白、整聯(lián)蛋白同種型如ITGB1和CD31(Sidney等《,干細(xì)胞(stem?cells)》,2014,10.1002；Armulik等《,循環(huán)研究(Circulation?Research)》,2005,10.1161)。
[0152] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定CD34和/或ITGB1，優(yōu)選CD34和ITGB1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中的微血管密度。
[0153] CD34(GeneID：947)是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的跨膜糖蛋白標(biāo)志物，也是作為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的非造血細(xì)胞類型的標(biāo)志物。
[0154] ITGB1(或INTB1，GeneID：3688)，即整聯(lián)蛋白β1，是整聯(lián)蛋白受體的β亞基，一種基質(zhì)體成員。它是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移、血管生成、分化和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的基礎(chǔ)。它以動(dòng)態(tài)的方式參與細(xì)胞粘附的周轉(zhuǎn)。它也是EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的參與者和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)因子。ITGB1信號(hào)通路可以在治療上例如用目前在許多癌癥臨床研究中的西侖吉肽進(jìn)行靶向(Timothy?ME,S.,Maddy?P.,《細(xì)胞生物學(xué)新見(jiàn)(Current?Opinion?in?Cell?Biology)》,(2011),23:562-568)。
[0155] 內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物
[0156] 內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞包括能夠產(chǎn)生新血管的造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞。
[0157] 內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的水平可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于CD34、CD144、VEGFR2或KDR、CD45、CD133、CD146和NRP1(Urbich等,《循環(huán)研究(Circulation?Research)》,2004,10.1161；Yoder《, 冷泉港醫(yī)學(xué)展望(Cold?Spring?Harb?Perspect?Med.)》,2012,10.1101)。
[0158] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定CD34、NRP1和/或CD133，優(yōu)選CD34、NRP1和CD133的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的水平。
[0159] NRP1(神經(jīng)氈蛋白-1，GeneID：8829)結(jié)合許多配體如第3類軸突導(dǎo)向蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，并具有多種類型的共受體。它影響細(xì)胞的存活、遷移和吸引。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、血管生成、腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。它也是基質(zhì)體的一部分。
[0160] NRP1信號(hào)通路可以在治療上例如用抗體抗-NRP1或MTP-NRP1(靶向神經(jīng)氈蛋白-1的肽)進(jìn)行靶向(Nasarre?C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:2381-2392；Lee?M.Ellis《, 分子癌癥療法(Mol?Cancer?Ther)》,(2006)5(5))。
[0161] 促血管生成/促淋巴管生成因子的標(biāo)志物
[0162] 在血管構(gòu)建過(guò)程中，多種分泌或膜結(jié)合因子已經(jīng)顯示促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移或分化。
[0163] 促血管生成/促淋巴管生成因子的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于VEGF同種型，PLGF，血管生成素，JAG1,2，NICD，DLL，肝配蛋白，Wnt家族，軸突導(dǎo)向蛋白，白細(xì)胞介素，F(xiàn)GF和細(xì)胞外基質(zhì)分子如肌腱蛋白，MMP等(Shibuya《, 生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志(Journal?of?Biochemistry?and?Molecular?Biology)》,2006,469-478；Zheng,《臨床研究雜志(The? Journal?of?Clinical?Investigation)》,2014,10.1172；Carmeliet等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Duong等,《腫瘤學(xué)雜志(Journal?of?oncology)》,2012,10.1155；Weis等《, 自然(Nature)》,2011,
10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,14；407；Secker等《, 發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn.)》,2015,10.1002；Andersson等《,自然(Nature)》,2014,10.1038)。
10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,14；407；Secker等《, 發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn.)》,2015,10.1002；Andersson等《,自然(Nature)》,2014,10.1038)。
[0164] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定VEGFA、JAG、Sema3A?FGF2、TNC、TNW、MMP-2和/或MMP-9，優(yōu)選VEGFA、JAG、Sema3A?FGF2、TNC、TNW、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中促血管生成/促淋巴管生成因子的水平。
[0165] VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；GeneID：7422)是一種關(guān)鍵的血管生成激活因子。它增加血管滲透性，血管發(fā)生，淋巴管生成，和源自動(dòng)脈、靜脈和淋巴的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。它在許多類型的癌癥中異常過(guò)表達(dá)。VEGFA信號(hào)通路可以在治療上例如用目前用作膠質(zhì)母細(xì)胞瘤二線治療的貝伐單抗進(jìn)行靶向(Napoleone?F.,Hns-Peter?G.等,(2003)9-6)。
[0166] JAG1(Jagged1；GeneID：182)是促進(jìn)血管生成的Notch受體配體。它激活內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和出芽。它是血管平滑肌細(xì)胞覆蓋新血管以及CD34介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和血管周細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵因子。它也是基質(zhì)體的一部分。它涉及許多癌癥類型。JAG1信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤I期和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌II期中的RO4929097進(jìn)行靶向(Demin?Li,Massimo?Masiero等,(2004)4?254；Emma?R.Andersson,Urban?Lendahl《, 藥物發(fā)現(xiàn)(drug?discovery)》,(2014),13)。
[0167] MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2；GeneID：4313)在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用中起作用。它控制血管生成，細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡。它涉及多種通路，包括在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，血管生成的調(diào)節(jié)，和轉(zhuǎn)移。由于其降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，它是EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的參與者，導(dǎo)致許多組織中的細(xì)胞遷移。MMP2信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于肺癌III期等中的因環(huán)利定(Incyclidine)或馬立馬司他進(jìn)行靶向(Jialiang?Hu等《,自然評(píng)論：藥物發(fā)現(xiàn)(Nature?Reviews?Drug?Discovery)》,2007年6月；6,480-498；Gillian?Murphy《, 醫(yī)學(xué)的分子方面(Mol?Aspects?Med.)》,2008年10月；29(5):290-308)。
[0168] MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9；GeneID：4318)在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用中發(fā)揮作用。它控制血管生成，細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡和細(xì)胞分化。它還涉及胚胎發(fā)育，生殖，組織重塑和轉(zhuǎn)移。由于其降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，它是EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的參與者，導(dǎo)致其它組織中的細(xì)胞遷移。MMP9信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于前列腺癌I期的馬立馬司他和PCK?3145進(jìn)行靶向(Jialiang?Hu等《, 自然評(píng)論：藥物發(fā)現(xiàn)(Nature?Reviews?Drug?Discovery)》,2007年6月；6,480-498；Gillian?Murphy《, 醫(yī)學(xué)的分子方面(Mol?Aspects?Med.)》,2008年10月；29(5):290-308)。
[0169] SEMA3A(第3類軸突導(dǎo)向蛋白，GeneID：10371)是軸突導(dǎo)向蛋白家族的成員。它涉及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，軸突吸引和排斥，細(xì)胞遷移，細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，免疫應(yīng)答，細(xì)胞凋亡，器官發(fā)生，腫瘤抑制和促進(jìn)，以及脈管系統(tǒng)發(fā)育。它也是基質(zhì)體的成員。
[0170] TNW(也稱為T(mén)NN或肌腱蛋白N，GeneID：63923)涉及許多細(xì)胞機(jī)制，例如細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖、遷移、分化和血管生成。在大多數(shù)成人器官中不表達(dá)，但在實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)。
[0171] TNC(肌腱蛋白-C；GeneID：3371)是一種參與細(xì)胞粘附，組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成和遷移，特別是在發(fā)育分化和傷口愈合過(guò)程中的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白。它涉及指導(dǎo)遷移神經(jīng)元以及發(fā)育過(guò)程中的軸突，突觸可塑性和神經(jīng)元再生。TNC促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、傳播和轉(zhuǎn)移。TNC信號(hào)通路可以在治療上例如用努拉達(dá)布(Neuradiab)(Bradmer?Pharmaceuticals,Inc.)進(jìn)行靶向。
[0172] FGF2(GeneID：2247)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFR)家族的配體。它通過(guò)參與細(xì)胞分裂、存活和遷移以及血管生成而在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。它也是基質(zhì)體的成員。FGF2信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于肺癌II期的Vargatef或AZD4547進(jìn)行靶向(Nicholas?T.,Richard?G.《,自然評(píng)論：癌癥(nature?review?cancer)》,(2010)10)。
[0173] 促血管生成受體的標(biāo)志物
[0174] 促血管生成受體的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于NOTCH1,2,3,4、VEGFR、TIE、PDGFR、EGFR、神經(jīng)氈蛋白、JAK、FGFR、WNT、EPHR、神經(jīng)叢蛋白、Alk受體、CXCR4/12、HER2和整聯(lián)蛋白(Shibuya《,生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志(Journal?of?Biochemistry?and?Molecular?Biology)》,2006,469-478；Zheng《,臨床研究雜志(The?Journal?of?Clinical?Investigation)》,2014,10.1172；Carmeliet等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Duong等《, 腫瘤學(xué)雜志(Journal?of?oncology)》,2012,10.1155；Weis等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,
14；407；Secker等,《發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn)》,2015,10.1002；Andersson等,《自然(Nature)》,2014,10.1038)。
14；407；Secker等,《發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn)》,2015,10.1002；Andersson等,《自然(Nature)》,2014,10.1038)。
[0175] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定VEGFR1、VEGFR2、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1和/或INTB1，優(yōu)選VEGFR1、VEGFR2、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1和INTB1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中促血管生成受體的水平。
[0176] VEGFR1(Flt1)在血管生成和血管發(fā)生中起重要作用。它促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。VEGFR1信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床試驗(yàn)中的凡達(dá)特尼、帕唑帕尼、舒尼替尼或阿西替尼進(jìn)行靶向(Masaubmi?Shibuya,《血管生成(Angiogenesis)》,(2006)9:225-230)。
[0177] VEGFR2(KDR/Flk1)是VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮增殖、存活、遷移、管狀形態(tài)發(fā)生和出芽的主要介體。它在淋巴脈管系統(tǒng)中也很重要。VEGFR2信號(hào)通路可以在治療上例如用處于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌等的臨床試驗(yàn)中的帕納替尼或西地尼布進(jìn)行靶向(Masabumi?Shibuya《, 血管生成(Angiogenesis)》,(2006),5:469-478；Seker和Harvey《, 發(fā)育動(dòng)力學(xué)(Dev?Dyn)》,(2015)244:323-331)。
[0178] HER2(表皮生長(zhǎng)因子受體2)在某些侵襲性類型的乳腺癌和其它癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。它參與細(xì)胞存活、遷移和血管生成。HER2信號(hào)通路可以在治療上例如用乳腺癌治療中使用的拉帕替尼、阿法替尼或曲妥珠單抗 進(jìn)行靶向(Perez?EA等《, 癌癥治療綜述(Cancer?Treat?Rev)》,(2014)276-284)。
[0179] EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)代表著癌癥治療的重要靶標(biāo)。它導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)，進(jìn)展(包括增殖)，遷移，血管生成，侵襲和轉(zhuǎn)移。它與大量癌癥相關(guān)。它是EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的參與者。EGFR信號(hào)通路可以在治療上例如用目前在結(jié)腸直腸癌中用作一線治療的拉帕替尼、阿法替尼或西妥昔單抗 進(jìn)行靶向(Yarden《, 歐洲癌癥雜志(European?Journal?of?Cancer)》,37(2001)S3-S8)。
[0180] PLEXA1(神經(jīng)叢蛋白A1)是NRP的搭配物并與Rho-GTP酶蛋白相互作用。它觸發(fā)神經(jīng)元中的生長(zhǎng)錐塌陷，以及遷移和血管生成。它是基質(zhì)體的一部分。PLEXA1信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于臨床前研究中的MTP-PlexA1進(jìn)行靶向。
[0181] PLEXB1(神經(jīng)叢蛋白B1)與Rho-GTP酶蛋白相互作用，它在軸突導(dǎo)向、侵襲性生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移和血管生成中發(fā)揮作用。它是基質(zhì)體的一部分。
[0182] NRP2(神經(jīng)氈蛋白-2)是第3類軸突導(dǎo)向蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的共受體。它在神經(jīng)元導(dǎo)向中發(fā)揮作用。它涉及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。NRP2信號(hào)通路可以在治療上例如用目前處于臨床前研究中的MTP-NRP2進(jìn)行靶向(Parker和Vander?Kooin,《分析生物化學(xué)(Anal?Biochem.)》,2014年5月,15；453:4-6)。
[0183] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物選自表2中列出的基因。
[0184] 表2：優(yōu)選的血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物的列表
[0185]
[0186]
[0187]
[0188] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物選自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，優(yōu)選選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0189] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0190] 腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志物
[0191] 腫瘤微環(huán)境定義為腫瘤發(fā)展的細(xì)胞和分子環(huán)境。一般來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞和或周圍基質(zhì)細(xì)胞所分泌的任何分子/因子都是腫瘤微環(huán)境的一部分。這種微環(huán)境既是腫瘤發(fā)生的原因又是其后果。腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物反映細(xì)胞外成分及其受體的水平和細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的水平。
[0192] 細(xì)胞外成分及其受體的標(biāo)志物
[0193] 優(yōu)選地，研究了已知在腫瘤類型中異常表達(dá)的細(xì)胞外成分及其受體。標(biāo)志物優(yōu)選在被定義為包含約300種蛋白質(zhì)的“基質(zhì)體”的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分列表中選擇。
[0194] 細(xì)胞外成分及其受體的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于膠原同種型；細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、肌腱蛋白；蛋白聚糖如基膜蛋白多糖(Perlecan)、核心蛋白聚糖(Decorin)、粘結(jié)蛋白聚糖(Syndecan)；和整聯(lián)蛋白(Langlois等,《腫瘤靶標(biāo)(Oncotarget)》,2014,10529-10545；Hynes等《, 冷泉港生物學(xué)展望(Cold?Spring?Harb?Perspect?Biol)》,2012,10.1101；Lu等,《細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell?Biol.)》,2012,10.1083)。
[0195] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定TNC、TNW和/或IntB1，優(yōu)選TNC、TNW和IntB1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中細(xì)胞外成分及其受體的水平。
[0196] 細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物
[0197] 細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子是指已知為ECM修飾酶、ECM結(jié)合生長(zhǎng)因子和其它ECM相關(guān)蛋白的龐大蛋白質(zhì)集合。細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于ECM修飾酶，例如金屬蛋白酶如MMP2和MMP9；ECM結(jié)合生長(zhǎng)因子，例如VEGF同種型、PLGF、血管生成素、FGF和TGF；其它ECM相關(guān)蛋白，例如JAG1,2、DLL、肝配蛋白、Wnt家族、軸突導(dǎo)向蛋白、白細(xì)胞介素、神經(jīng)突起生長(zhǎng)導(dǎo)向因子(Netrin)和Slit(Egeblad等《,自然(Nature)》,2002,10.10388)。
[0198] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定MMP2、MMP9、FGF2、Sema3A、VEGFA和/或JAG，優(yōu)選MMP2、MMP9、FGF2、Sema3A、VEGFA和JAG的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的水平。
[0199] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志物選自表3中列出的基因。
[0200] 表3：優(yōu)選的腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物的列表
[0201]
[0202]
[0203] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物選自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1和DDR2。
[0204] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物選自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0205] 遷移活性標(biāo)志物
[0206] 腫瘤細(xì)胞遷移是涉及腫瘤周圍基質(zhì)定殖的腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵步驟。這也包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生(即腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)傳播并最終在多個(gè)器官中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)腫瘤塊)的過(guò)程。遷移活性標(biāo)志物反映了促遷移因子的水平，促遷移因子受體的水平，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的指標(biāo)水平以及與細(xì)胞遷移相關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的水平。
[0207] 促遷移因子標(biāo)志物
[0208] 促遷移因子包括已顯示調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的大量可溶性或膜相互作用因子。
[0209] 促遷移因子的水平可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于ECM因子和調(diào)節(jié)因子，例如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、MMP、肌腱蛋白；導(dǎo)向分子，例如神經(jīng)突起生長(zhǎng)導(dǎo)向因子、肝配蛋白、軸突導(dǎo)向蛋白、Slit；生長(zhǎng)因子，例如TGFα、GDNF、IGF、FGF、VEGF同種型；趨化因子，例如SDF1；和Shh(Dützmann等《, 細(xì)胞粘附與遷移(Cell?adhesion?and?migration)》,2010,10.4161；Frield等《, 自然(Nature)》,2013,10.1038；Gaillard等《, 神經(jīng)學(xué)評(píng)論(Rev?Neurol)》,2005,153-72；Nasarre?C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:2381-2392；Nasarre?C等《, 細(xì)胞粘附與遷移(Cell?Adh?Migr)》,
2009,3:383-389；Heath?G.P.,Yuxiao?W.等《,生物物理學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress?in?Biophysics?and?Molecular?Biology)》,(2015)1-8)。
2009,3:383-389；Heath?G.P.,Yuxiao?W.等《,生物物理學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress?in?Biophysics?and?Molecular?Biology)》,(2015)1-8)。
[0210] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定SDF1、VEGFA、MMP2、MMP9、TNC、TNW、FGF2和/或Sema3A，優(yōu)選SDF1、VEGFA、MMP2、MMP9、TNC、TNW、FGF2和Sema3A的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中促遷移因子的水平。
[0211] 促遷移因子受體標(biāo)志物
[0212] 與促遷移因子的多樣性一致，許多受體參與促遷移因子的結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)。促遷移因子受體的水平可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于神經(jīng)叢蛋白、神經(jīng)氈蛋白、EGRF、FGFR、VEGFR、PDGFR、HER2、DCC/UNC5、整聯(lián)蛋白、鈣粘蛋白、EPH受體、C-MET和CXCR4(Dützmann等,《細(xì)胞粘附與遷移(Cell?adhesion?and?migration)》,2010,10.4161；Frield等《, 自然(Nature)》,2013,10.1038；Gaillard等《, 神經(jīng)學(xué)評(píng)論(Rev?Neurol)》,2005,153-72；Nasarre?C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:
2381-2392；Nasarre?C等《, 細(xì)胞粘附與遷移(Cell?Adh?Migr)》,2009,3:383-389；Heath?G.P.,Yuxiao?W.等《, 生物物理學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress?in?Biophysics?and?Molecular?Biology)》,(2015)1-8)。
2381-2392；Nasarre?C等《, 細(xì)胞粘附與遷移(Cell?Adh?Migr)》,2009,3:383-389；Heath?G.P.,Yuxiao?W.等《, 生物物理學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress?in?Biophysics?and?Molecular?Biology)》,(2015)1-8)。
[0213] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定VEGFR1、VEGFR2、INTB1、CMET、PDGFRA、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1和/或PlexB1，優(yōu)選VEGFR1、VEGFR2、INTB1、CMET、PDGFRA、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1和PlexB1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中促遷移因子受體的水平。
[0214] PDGFRα(血小板衍生生長(zhǎng)因子α，也稱為PDGFR2，GeneID?5156)是PDGFR家族的同種型。它參與細(xì)胞增殖、存活、遷移、分化、生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展。它在EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)中也起作用。它涉及一些癌癥。PDGFRα信號(hào)通路可以在治療上例如用目前用于慢性粒細(xì)胞白血病和胃腸道間質(zhì)腫瘤的阿西替尼或伊馬替尼 進(jìn)行靶向(Kikuchi和Monga《,基因表達(dá)(Gene?Expression)》,(2015),16(3):109-127)。
[0215] cMET(也稱為MET，GeneID：4233)在一些生物活性如運(yùn)動(dòng)、增殖、遷移、細(xì)胞存活、血管生成中起著關(guān)鍵的作用。它是EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的參與者。它參與許多不同腫瘤類型的發(fā)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)展。cMET信號(hào)通路可以在治療上例如用目前用作非小細(xì)胞肺癌治療的SU11274或克唑替尼 進(jìn)行靶向(Juan?Carlos?Samamé?Pérez-Vargas等《,國(guó)際分子科學(xué)雜志(Int.J.Mol.Sci.)》,2013,14,18056-18077)。
[0216] EMT標(biāo)志物
[0217] 如上所述，EMT是上皮細(xì)胞失去其細(xì)胞極性和細(xì)胞-細(xì)胞粘附并獲得遷移和侵入性質(zhì)的過(guò)程。EMT指標(biāo)的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于平滑肌肌動(dòng)蛋白SMA，波形蛋白，結(jié)蛋白，IGFR/IGF，C-MET/HGF，EGFR/EGF，PDGFR/PDGF，TGFb，整聯(lián)蛋白，Alk-5，b-連環(huán)蛋白，Slug，鈣粘蛋白，Wnt，Notch，基質(zhì)降解酶如MMP2和MMP9，以及緊密連接蛋白(Kalluri等《, 臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)》,2000,10.1172；Heerboth等,《臨床和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(Clinical?and?Translational?Medicine)》,
2015,10.1186；Li等《, 藥理學(xué)和治療學(xué)(Pharmacology&Therapeutics)》,2015,33-46；
Samatov等《, 分子癌癥(Molecular?Cancer)》,2013,12:107；Margadant等《, 細(xì)胞生物學(xué)新見(jiàn)(Current?Opinion?in?Cell?Biology)》,2011,10.1016)。
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[0218] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過(guò)測(cè)定INTB1、MMP2和/或MMP9，優(yōu)選INTB1、MMP2和MMP9的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中的EMT指標(biāo)水平。
[0219] 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物
[0220] 細(xì)胞遷移過(guò)程涉及細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的連續(xù)重構(gòu)。該過(guò)程由不同家族的肌動(dòng)蛋白-調(diào)節(jié)蛋白或與肌動(dòng)蛋白-調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)(如表16中所述)的復(fù)雜作用產(chǎn)生。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)志物來(lái)評(píng)估，所述標(biāo)志物包括但不限于α-輔肌動(dòng)蛋白、神經(jīng)叢蛋白、RHO-GTP酶、RAC、CDC42、肌球蛋白輕鏈、整聯(lián)蛋白和原肌球蛋白(Shankar等,《癌細(xì)胞(Cancer?Cells)》,PLOS?ONE?2015,10.1371；Rottner等《, 細(xì)胞生物學(xué)新見(jiàn)(Current?Opinion?in?Cell?Biology)》,2011,10.1016)。
[0221] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定PLEXA1、PLEXB1和/或INTB1，優(yōu)選PLEXA1、PLEXB1和INTB1的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估樣本中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的水平。
[0222] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述遷移活性標(biāo)志物選自表4中列出的基因。
[0223] 表4：優(yōu)選的遷移活性標(biāo)志物的列表
[0224]
[0225]
[0226]
[0227] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述遷移活性標(biāo)志物選自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb?
1、TGFb?2(LDS4)、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4和CXCL10。
1、TGFb?2(LDS4)、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4和CXCL10。
[0228] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述遷移活性標(biāo)志物選自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0229] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述基因集合包含
[0230] (i)樣本的腫瘤狀態(tài)的標(biāo)志物，其包含
[0231] -至少一種炎癥標(biāo)志物，
[0232] -至少一種癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物，
[0233] -至少一種缺氧標(biāo)志物，
[0234] -至少一種細(xì)胞死亡標(biāo)志物，
[0235] -至少一種翻譯后修飾標(biāo)志物，和
[0236] -至少一種增殖標(biāo)志物；
[0237] (ii)樣本的血管生成和淋巴管生成狀態(tài)的標(biāo)志物，其包含
[0238] -至少一種微血管密度標(biāo)志物，
[0239] -至少一種內(nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物，
[0240] -至少一種促血管生成/促淋巴管生成因子的標(biāo)志物，和
[0241] -至少一種促血管生成/促淋巴管生成受體的標(biāo)志物；
[0242] (iii)樣本的腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志物，其包含
[0243] -至少一種細(xì)胞外成分及其受體的標(biāo)志物，和
[0244] -至少一種細(xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物；和
[0245] (iv)樣本的腫瘤細(xì)胞的遷移活性的標(biāo)志物，其包含
[0246] -至少一種促遷移因子標(biāo)志物，
[0247] -至少一種促遷移因子受體標(biāo)志物，
[0248] -至少一種上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物，和
[0249] -至少一種與細(xì)胞遷移相關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物。
[0250] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因集合包含
[0251] (i)至少一種、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7、8、9、10或11種，更優(yōu)選至少12種腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物，其選自表1中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A，更優(yōu)選選自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0252] ii)至少一種、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7或8種，更優(yōu)選至少9種血管生成和淋巴管生成狀態(tài)標(biāo)志物，其選自表2中列出的基因，優(yōu)選選自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，優(yōu)選選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2，更優(yōu)選選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0253] iii)至少一種或2種，優(yōu)選至少3或4種，更優(yōu)選至少5種腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物，其選自表3中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1和DDR2，更優(yōu)選選自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；和
[0254] iv)至少一種、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7或8種，更優(yōu)選至少9種細(xì)胞遷移活性標(biāo)志物，其選自表4中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4和CXCL10，優(yōu)選選自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0255] 這些標(biāo)志物中的任一個(gè)都可能被另一個(gè)反映相同通路或相同靶標(biāo)的標(biāo)志物代替。
[0256] 應(yīng)注意到，相同的基因可以是不同特征的標(biāo)志物。
[0257] 選擇包括在所述集合中的基因優(yōu)選編碼可以被治療劑靶向的蛋白質(zhì)。特別是，所述基因集合必須包括必須確定預(yù)測(cè)功效排序的治療靶標(biāo)。優(yōu)選地，治療靶標(biāo)選自編碼酪氨酸激酶受體或其配體的標(biāo)志物。
[0258] 然而，所述基因集合還可以包括不可靶向的基因，即僅代表信號(hào)通路的基因，所述信號(hào)通路包含治療靶標(biāo)。
[0259] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因集合包含
[0260] -SDF1、BCL2、CD133、HIF1A和/或PARG，優(yōu)選SDF1、BCL2、CD133和/或HIF1A作為腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物，
[0261] -CD34、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，優(yōu)選VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，更優(yōu)選CD34、VEGFA、VEGFR2和/或JAG1作為血管生成和淋巴管生成狀態(tài)標(biāo)志物，
[0262] -MMP9、MMP2、TNC、TNW和/或INTB1，優(yōu)選MMP9、MMP2、TNC和/或INTB1，更優(yōu)選MMP9和/或MMP2作為腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物，和/或
[0263] -cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1和/或PLEXB1，優(yōu)選cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2和/或PLEXA1，更優(yōu)選cMET、PDGFRA、HER2和/或EGFR作為遷移活性標(biāo)志物。
[0264] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述基因集合包含SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和/或FGF2，優(yōu)選SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，更優(yōu)選SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和/或FGF2，并且甚至更優(yōu)選SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、PDGFRA、c-MET、EGFR和/或HER2。這些標(biāo)志物中的任一個(gè)可被另一個(gè)反映相同通路或相同靶標(biāo)的標(biāo)志物代替。
[0265] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述基因集合包含(i)至少HIF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因，和(ii)腫瘤狀態(tài)、血管生成和淋巴管生成狀態(tài)、腫瘤微環(huán)境和遷移活性的其它標(biāo)志物，其優(yōu)選選自表1至4中列出的基因，更優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BRAF、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0266] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因集合包含至少20、30、40、50、60、70、80或90種基因，其選自表1至4中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述基因集合包含所有這些基因。這些標(biāo)志物中的任一個(gè)可被另一個(gè)反映相同通路或相同靶標(biāo)的標(biāo)志物代替。
[0267] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供或確定表達(dá)水平的基因集合包含少于10?000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000種不同基因，優(yōu)選少于900、800、700、600、
500、400、300、200、150、120或100種基因，并且更優(yōu)選少于90、80、70、60、50、40或30種基因。
具體而言，標(biāo)簽中包括的基因集合可包含10至1000種基因，更特別是10、12、14、16、18、20、
22、24、26、30、40、50、60、70、80、90至200種基因，并且甚至更特別是10、20、30、40、50、60、
70、80、90至150或100種基因。
500、400、300、200、150、120或100種基因，并且更優(yōu)選少于90、80、70、60、50、40或30種基因。
具體而言，標(biāo)簽中包括的基因集合可包含10至1000種基因，更特別是10、12、14、16、18、20、
22、24、26、30、40、50、60、70、80、90至200種基因，并且甚至更特別是10、20、30、40、50、60、
70、80、90至150或100種基因。
[0268] 如實(shí)驗(yàn)部分中所示，表達(dá)水平的原始數(shù)據(jù)(例如表示為2-ΔCt，其中ΔCt對(duì)應(yīng)于給定基因表達(dá)相比于兩種內(nèi)部參考基因18S和GAPDH的平均表達(dá)的變化)不允許確定癌癥樣本中的顯性信號(hào)通路。
[0269] 本發(fā)明人表明這些通路可以通過(guò)歸一化過(guò)程來(lái)揭示，所述歸一化過(guò)程被定義為感興趣基因在參考正常組織、低級(jí)別或良性腫瘤組織和所述組織的主要細(xì)胞類型中的表達(dá)的多輪比較。
[0270] 因此，在本發(fā)明方法的步驟b)中，將步驟a)中提供的每個(gè)表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0271] -在所述癌癥起源的器官中，即在對(duì)應(yīng)于所述癌癥或與所述癌癥組織學(xué)匹配的正常組織中，
[0272] -在至少一種低級(jí)別或良性的，優(yōu)選低級(jí)別的對(duì)應(yīng)于所述癌癥或與所述癌癥組織學(xué)匹配的腫瘤組織中，和
[0273] -在所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型，即可見(jiàn)于與所述癌癥組織學(xué)匹配的組織中的至少一種正常細(xì)胞亞型中。
[0274] 參考的組織和細(xì)胞類型取決于癌癥的類型并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地限定。
[0275] 本發(fā)明的方法還可包括，在步驟b)之前，提供
[0276] -所述癌癥起源器官的樣本，即對(duì)應(yīng)于所述癌癥或與所述癌癥組織學(xué)匹配的正常組織的樣本，
[0277] -低級(jí)別或良性的，優(yōu)選低級(jí)別的對(duì)應(yīng)于所述癌癥或與所述癌癥組織學(xué)匹配的腫瘤組織的樣本，和/或
[0278] -所述癌癥起源器官的至少一種正常細(xì)胞亞型的樣本。
[0279] 參考的組織和細(xì)胞類型的樣本可以從癌癥患者，另一受試者或健康受試者(即沒(méi)有患癌癥的受試者)提供。參考的組織和細(xì)胞類型的樣本也可以從組織庫(kù)提供。
[0280] 所述方法還可包括確定代表一些治療上可靶向信號(hào)通路并且如上所述的基因集合在所述樣本中的表達(dá)水平。
[0281] 正常組織或器官不含任何腫瘤細(xì)胞，并且優(yōu)選包含多種細(xì)胞亞型，優(yōu)選全部或幾乎全部的可產(chǎn)生癌癥的細(xì)胞亞型。在轉(zhuǎn)移的情況下，癌癥起源的器官可能不同于腫瘤的最終定位。
[0282] 低級(jí)別或良性腫瘤組織根據(jù)科學(xué)和醫(yī)學(xué)組織(即世界衛(wèi)生組織WHO；國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟UICC；美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì))所定義和使用的國(guó)際公認(rèn)的命名法來(lái)選擇。優(yōu)選地，如本文所用，“低級(jí)別腫瘤”是指I級(jí)和II級(jí)腫瘤或根據(jù)TNM癌癥分期標(biāo)記系統(tǒng)的O或I期。術(shù)語(yǔ)“良性腫瘤”在本文中用于指非惡性的，即不以無(wú)限的侵略性方式生長(zhǎng)，不侵入周圍組織并且不轉(zhuǎn)移的腫瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)癌癥類型容易地選擇低級(jí)別或良性腫瘤。一種或幾種(例如2或3種)低級(jí)別和/或良性腫瘤可以用作參考。
[0283] 根據(jù)癌癥的類型，可以使用一種、兩種、三種或更多種主要組織細(xì)胞亞型作為參考。細(xì)胞亞型優(yōu)先反映癌癥起源的非腫瘤組織或器官的正常組成。例如，對(duì)于腦腫瘤，細(xì)胞亞型可能是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和/或小膠質(zhì)細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)癌癥類型，特別是根據(jù)所述癌癥起源的細(xì)胞類型，容易地選擇組織細(xì)胞亞型。一種或幾種(例如2、3或4種)細(xì)胞類型可以用作參考。優(yōu)選地，至少一種細(xì)胞類型是所述癌癥起源或所述癌癥疑似起源的細(xì)胞類型。
[0284] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自神經(jīng)膠質(zhì)瘤，優(yōu)選來(lái)自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基因在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0285] -在正常腦，即所述癌癥起源的正常器官中，
[0286] -在至少低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤例如I或II級(jí)星形細(xì)胞瘤，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0287] -在至少正常腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞，優(yōu)選正常腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0288] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自結(jié)腸癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基因在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0289] -在正常結(jié)腸中或在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞即正常組織或器官中，
[0290] -在至少非癌性息肉或低級(jí)別結(jié)腸腫瘤(I或II級(jí))，優(yōu)選息肉，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0291] -在至少正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0292] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自前列腺癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0293] -在正常前列腺，即正常器官或組織中，
[0294] -在至少低級(jí)別前列腺腫瘤(I或II級(jí))或良性前列腺增生，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0295] -在至少正常前列腺上皮細(xì)胞、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和/或前列腺成纖維細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0296] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自皮膚癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0297] -在正常皮膚組織，即正常器官或組織中，
[0298] -在至少低級(jí)別黑素瘤(0級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0299] -在至少正常表皮上皮細(xì)胞、真皮上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、默克爾細(xì)胞和/或皮膚內(nèi)皮細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0300] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自肺癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0301] -在正常肺，即正常器官或組織中，
[0302] -在至少低級(jí)別肺腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0303] -在至少正常肺平滑肌細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和/或氣管上皮細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0304] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自胰腺癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0305] -在正常胰腺，即正常器官或組織中，
[0306] -在至少低級(jí)別胰腺腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0307] -在至少正常胰腺內(nèi)皮細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、泡心細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞，星狀細(xì)胞和/或胰島細(xì)胞(朗格漢斯)，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0308] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自肝癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0309] -在正常肝臟，即正常器官或組織中，
[0310] -在至少低級(jí)別肝臟腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0311] -在至少正常肝細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞和/或庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0312] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自腎癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0313] -在正常腎臟，即正常器官或組織中，
[0314] -在至少低級(jí)別腎臟腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0315] -在至少正常系膜細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、上皮細(xì)胞、皮質(zhì)上皮細(xì)胞和/或腎小管細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0316] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自頭頸癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0317] -在正常器官或組織中，即在喉、咽喉、唇、口、鼻或唾液腺中，取決于確切的腫瘤位置；
[0318] -在至少低級(jí)別頭頸部腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0319] -在至少來(lái)自口腔(例如口底、舌)的正常細(xì)胞，來(lái)自口咽(例如扁桃體、舌根、軟腭、喉)的正常細(xì)胞和/或來(lái)自下咽(例如梨狀竇)的正常細(xì)胞，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0320] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述癌癥樣本來(lái)自乳腺癌，并且在本發(fā)明方法的步驟b)中，將所述集合的每個(gè)基團(tuán)在癌癥樣本中的表達(dá)水平與相同基因在以下中的表達(dá)水平進(jìn)行比較：
[0321] -在正常乳房，即正常器官或組織中，
[0322] -在至少低級(jí)別乳房腫瘤(I或II級(jí))，即低級(jí)別或良性腫瘤組織中，和
[0323] -在至少正常乳房成纖維細(xì)胞和/或上皮細(xì)胞(例如導(dǎo)管細(xì)胞、小葉細(xì)胞)，即所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型中。
[0324] 任選地，浸潤(rùn)感興趣器官的免疫細(xì)胞可以進(jìn)一步包括為正常細(xì)胞亞型。
[0325] 這些參考組織或細(xì)胞類型中的集合的每個(gè)基因的表達(dá)水平可以通過(guò)上述任何方法確定，優(yōu)選通過(guò)與癌癥樣本所用相同的方法確定。
[0326] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)定量RT-PCR確定每個(gè)基因在這些參考組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)水平。
[0327] 將本發(fā)明方法的步驟a)中提供的集合的每個(gè)基因的表達(dá)水平的變化與所述基因在上述每種參考組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)水平進(jìn)行比較。
[0328] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)定量RT-PCR來(lái)確定表達(dá)水平，并且通過(guò)通常稱為ΔΔCt方法的方法來(lái)獲得變化：
[0329] ●ΔΔCt(器官)＝ΔCt(癌癥樣本)-ΔCt(器官樣本)
[0330] 其中
[0331] ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的靶基因)-Ct(癌癥樣本中的管家基因)，和[0332] ΔCt(器官樣本)＝Ct(癌癥起源器官樣本中的靶基因)-Ct(癌癥起源器官樣本中的管家基因)
[0333] ●ΔΔCt(低級(jí)別或良性腫瘤組織)＝ΔCt(癌癥樣本)-ΔCt(低級(jí)別或良性腫瘤組織樣本)
[0334] 其中
[0335] ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的靶基因)-Ct(癌癥樣本中的管家基因)，和[0336] ΔCt(低級(jí)別或良性腫瘤組織樣本)＝Ct(低級(jí)別或良性腫瘤組織樣本中的靶基因)-Ct(低級(jí)別或良性腫瘤組織樣本中的管家基因)
[0337] ●ΔΔCt(正常細(xì)胞亞型)＝ΔCt(癌癥樣本)-ΔCt(正常細(xì)胞亞型)
[0338] 其中
[0339] ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的靶基因)-Ct(癌癥樣本中的管家基因)，和[0340] ΔCt(正常細(xì)胞亞型樣本)＝Ct(正常細(xì)胞亞型樣本中的靶基因)-Ct(正常細(xì)胞亞型樣本中的管家基因)
[0341] 在癌癥樣本中獲得的集合的每個(gè)基因的表達(dá)水平相比于所述基因在參考組織或細(xì)胞類型中(即在癌癥起源器官樣本中，在對(duì)應(yīng)于所述癌癥或與所述癌癥組織學(xué)匹配的低級(jí)別或良性腫瘤組織的樣本中，以及在所述癌癥起源器官的正常細(xì)胞亞型的樣本中)的表達(dá)水平相比的變化因此可以通過(guò)取2-ΔΔCt獲得。
[0342] 在本發(fā)明方法的步驟c)中，對(duì)于所述集合的每個(gè)基因計(jì)算得分，并且其表示所述基因在癌癥樣本中的表達(dá)相比于在正常器官或組織、低級(jí)別或良性腫瘤組織以及組織細(xì)胞亞型中的表達(dá)的總體變化幅度。所述得分與基因表達(dá)的總體變化幅度的絕對(duì)值成比例。
[0343] 在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)基因的得分通過(guò)將在每個(gè)參考組織或細(xì)胞類型中確定的變化相加而獲得。
[0344] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)定量RT-PCR確定表達(dá)水平，并且如下獲得每個(gè)基因的得分：
[0345]
[0346] 其中n和m是正整數(shù)并且相同或不同。
[0347] 因此通過(guò)將對(duì)于每個(gè)參考組織或細(xì)胞類型獲得的2-ΔΔCt值相加來(lái)獲得每個(gè)基因的得分(即得分＝2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型1)+2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型2)+...+2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型n))。
[0348] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如下獲得每個(gè)基因的得分：
[0349] 得分＝2-ΔΔCt(器官)+2-ΔΔCt(低級(jí)別或良性腫瘤組織1)+...+2-ΔΔCt(低級(jí)別或良性腫瘤組織n)+2-ΔΔCt(細(xì)胞亞型1)+...+2-ΔΔCt(細(xì)胞亞型m)
[0350] 其中n和m是正整數(shù)并且相同或不同。
[0351] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，m是1或2并且n是1或2。
[0352] 在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用允許在給定樣本(例如nanostring或微流體PCR)中直接定量每個(gè)RNA分子的技術(shù)來(lái)確定表達(dá)水平并且可使用以下計(jì)算獲得在癌癥樣本中獲得的所述集合的每個(gè)基因的表達(dá)水平相比于所述基因在參考組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)水平的變化：
[0353] 基因在癌癥樣本中的表達(dá)水平相比于所述基因在參考組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)水平的變化＝|癌癥樣本中的RNA量-參考組織或細(xì)胞類型中的RNA量|
[0354] 其中癌癥樣本中以及參考組織或細(xì)胞類型中的RNA量?jī)?yōu)選用一種或兩種管家基因的RNA量進(jìn)行歸一化。
[0355] 在這些實(shí)施方案中，通過(guò)將相比于正常器官或組織、低級(jí)別或良性腫瘤組織和組織細(xì)胞亞型的變化相加來(lái)獲得每個(gè)基因的得分。
[0356] 如實(shí)驗(yàn)部分中所示，獲得的得分對(duì)于每個(gè)患者是特定的。
[0357] 任選地，可以通過(guò)將任意值歸屬于最高得分而對(duì)關(guān)于所述集合的每個(gè)基因獲得的得分進(jìn)行歸一化。
[0358] 在本發(fā)明方法的步驟d)中，所述集合的基因(即代表治療上可靶向信號(hào)通路)根據(jù)計(jì)算得分進(jìn)行排序，從而允許確定癌癥樣本的顯性信號(hào)通路，即對(duì)應(yīng)于排序最高的基因的通路。這些顯性通路被認(rèn)為是最佳治療靶標(biāo)。
[0359] 優(yōu)選地，前三個(gè)治療上可靶向基因被認(rèn)為是顯性信號(hào)通路并且因此作為最佳治療靶標(biāo)。
[0360] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，前兩個(gè)治療上可靶向基因被認(rèn)為是顯性信號(hào)通路。
[0361] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，排序第一的治療上可靶向基因決定顯性信號(hào)通路和最佳治療靶標(biāo)。
[0362] 基于這些結(jié)果，可以考慮單藥治療(例如靶向排序第一的治療上可靶向信號(hào)通路之一，例如三種排序第一的治療上可靶向信號(hào)通路之一，優(yōu)選排序第一的治療上可靶向信號(hào)通路)或聯(lián)合治療(例如靶向排序第一的治療上可靶向信號(hào)通路中的一種、兩種或全部，例如前三種通路)。
[0363] 因此，在第二方面，本發(fā)明涉及一種用于確定患有癌癥的受試者的治療方案的方法，所述方法包括根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，以及確定靶向這些顯性通路中的至少一種，優(yōu)選前三種治療上可靶向通路或基因中的至少一種，更優(yōu)選前兩種治療上可靶向通路或基因中的至少一種，并且甚至更優(yōu)選至少排序第一的治療上可靶向通路或基因的治療方案。
[0364] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療方案被設(shè)計(jì)來(lái)靶向兩個(gè)或三個(gè)顯性通路，尤其是兩個(gè)或三個(gè)治療上可靶向基因，優(yōu)選使用聯(lián)合治療。
[0365] 可用于靶向標(biāo)簽基因的治療劑的實(shí)例呈現(xiàn)于下表1中。這些實(shí)例應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性而不是限制性的。
[0366] 表5：靶向代表信號(hào)通路的基因的治療劑的實(shí)例
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371]
[0372]
[0373] 在這個(gè)方面也考慮了公開(kāi)用于確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法的所有實(shí)施方案。
[0374] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本并確定代表一些治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因集合的表達(dá)水平的步驟。
[0375] 在另一方面，本發(fā)明還涉及用于選擇患有癌癥的受試者用于治療或確定患有癌癥的受試者是否易受益于治療的方法，所述方法包括根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路。
[0376] 在該方法中，所述受試者被選擇用于治療，或者如果治療靶向至少一個(gè)顯性通路，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)顯性通路，則所述受試者易受益于治療。
[0377] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者被選擇用于治療，或者如果治療至少靶向排序第一的治療上可靶向通路或基因，則所述受試者易受益于治療。
[0378] 在這個(gè)方面也考慮了公開(kāi)用于確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法的所有實(shí)施方案。
[0379] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本并確定代表一些治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因集合的表達(dá)水平的步驟。
[0380] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)患有癌癥的受試者的臨床結(jié)果的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路。
[0381] 在該方法中，如果受試者用靶向至少一個(gè)顯性通路，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)顯性通路的療法來(lái)治療，則預(yù)后良好。
[0382] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果受試者用至少靶向排序第一的治療上可靶向通路或基因的療法來(lái)治療，則預(yù)后良好。
[0383] 當(dāng)所述療法不是靶向至少一個(gè)治療上可靶向顯性通路時(shí)，可通過(guò)修改療法以靶向至少一個(gè)顯性通路，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)顯性通路來(lái)改善預(yù)后。
[0384] 在這個(gè)方面也考慮了公開(kāi)用于確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法的所有實(shí)施方案。
[0385] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本并確定代表一些治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因集合的表達(dá)水平的步驟。
[0386] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)癌癥對(duì)治療的敏感性的方法，其包括根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路。如果所述治療靶向至少一個(gè)顯性通路，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)顯性通路，則所述癌癥被認(rèn)為可能對(duì)該治療敏感。
[0387] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果所述治療至少靶向排序第一的治療上可靶向通路或基因，則所述癌癥被認(rèn)為可能對(duì)該治療敏感。
[0388] 在這個(gè)方面也考慮了公開(kāi)用于確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法的所有實(shí)施方案。
[0389] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本并確定代表一些治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因集合的表達(dá)水平的步驟。
[0390] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥患者的方法，其包括
[0391] 根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法確定來(lái)自所述受試者的癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，以及
[0392] 施用治療有效量的靶向至少一個(gè)顯性通路的療法。
[0393] 優(yōu)選地，所述療法是靶向至少兩個(gè)或三個(gè)顯性通路的組合療法。
[0394] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述療法至少靶向排序第一的治療上可靶向通路或基因。
[0395] 在這個(gè)方面也考慮了公開(kāi)用于確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的方法的所有實(shí)施方案。
[0396] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供來(lái)自受試者的癌癥樣本并確定代表一些治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因集合的表達(dá)水平的步驟。
[0397] 本發(fā)明還涉及一種用于篩選或鑒定適合于治療癌癥的分子的方法，其包括
[0398] 根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路；
[0399] 將來(lái)自所述癌癥樣本的腫瘤細(xì)胞移植到非人類動(dòng)物模型中；
[0400] 將一種或幾種候選分子施用于所述模型并分析對(duì)疾病進(jìn)展的影響。
[0401] 分子的功效可以例如通過(guò)分析動(dòng)物的壽命、轉(zhuǎn)移發(fā)生率和/或腫瘤進(jìn)展來(lái)評(píng)估。所有這些特征都必須與由未經(jīng)治療的非人類動(dòng)物模型組成的對(duì)照進(jìn)行比較。優(yōu)選地，所述非人類動(dòng)物模型是免疫缺陷小鼠。
[0402] 該方法允許建立特定腫瘤標(biāo)簽與治療功效之間的相關(guān)性。由于該方法而選擇的候選分子因此可用于患有展現(xiàn)類似顯性信號(hào)通路的癌癥的患者。
[0403] 在另一方面，本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含引物、探針和/或?qū)λ黾系幕?即代表治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因)具特異性的抗體，以及任選地提供使用這種試劑盒的指南的活葉。
[0404] 特別是，所述試劑盒可包含
[0405] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅难装Y標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0406] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅陌┌Y干細(xì)胞標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0407] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅娜毖鯓?biāo)志物具特異性的抗體，
[0408] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅募?xì)胞死亡標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0409] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅姆g后修飾標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0410] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅脑鲋硺?biāo)志物具特異性的抗體，
[0411] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅奈⒀苊芏葮?biāo)志物具特異性的抗體，
[0412] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅膬?nèi)皮干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0413] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅拇傺苌?促淋巴管生成因子標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0414] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅拇傺苌?促淋巴管生成受體標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0415] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅募?xì)胞外成分及其受體的標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0416] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅募?xì)胞外成分調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0417] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅拇龠w移因子標(biāo)志物具特異性的抗體，
[0418] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅拇龠w移因子受體標(biāo)志物具特異性的抗體，[0419] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅纳掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物具特異性的抗體，和/或
[0420] -至少一對(duì)引物，探針或?qū)θ缟纤龅呐c細(xì)胞遷移相關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子的標(biāo)志物具特異性的抗體。
[0421] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含
[0422] -一對(duì)引物，探針或?qū)IF1A具特異性的抗體，
[0423] -一對(duì)引物，探針或?qū)DF1具特異性的抗體，
[0424] -一對(duì)引物，探針或?qū)MP9具特異性的抗體，
[0425] -一對(duì)引物，探針或?qū)AG1具特異性的抗體，
[0426] -一對(duì)引物，探針或?qū)CL2具特異性的抗體，和/或
[0427] -一對(duì)引物，探針或?qū)D133基因具特異性的抗體。
[0428] 所述試劑盒還可包含一對(duì)引物，探針或?qū)χ辽僖环N基因具特異性的抗體，所述基因選自PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、MMP2、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，優(yōu)選選自PARG、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、MMP2、TNC、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，優(yōu)選一對(duì)引物，探針或?qū)@些基因中的每一個(gè)具特異性的抗體。
[0429] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含
[0430] (i)引物對(duì)，探針或?qū)χ辽僖环N、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7、8、9、10或11種，更優(yōu)選至少12種腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物具特異性的抗體，所述腫瘤狀態(tài)標(biāo)志物選自表1中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A，更優(yōu)選選自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0431] ii)引物對(duì)，探針或?qū)χ辽僖环N、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7或8種，更優(yōu)選至少9種血管生成和淋巴管生成狀態(tài)標(biāo)志物具特異性的抗體，所述血管生成和淋巴管生成狀態(tài)標(biāo)志物選自表2中列出的基因，優(yōu)選選自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，優(yōu)選選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2，更優(yōu)選選自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0432] iii)引物對(duì)，探針或?qū)χ辽僖环N或2種，優(yōu)選至少3或4種，更優(yōu)選至少5種腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物具特異性的抗體，所述腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物選自表3中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1和DDR2，更優(yōu)選選自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；和
[0433] iv)引物對(duì)，探針或?qū)χ辽僖环N、兩種、三種或四種，優(yōu)選至少5、6、7或8種，更優(yōu)選至少9種細(xì)胞遷移活性標(biāo)志物具特異性的抗體，所述細(xì)胞遷移活性標(biāo)志物選自表4中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4和CXCL10，優(yōu)選選自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0434] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含
[0435] -引物對(duì)，探針或?qū)DF1、BCL2、CD133、HIF1A和/或PARG，優(yōu)選SDF1、BCL2、CD133和/或HIF1A具特異性的抗體，
[0436] -引物對(duì)，探針或?qū)D34、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，優(yōu)選VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，更優(yōu)選CD34、VEGFA、VEGFR2和/或JAG1具特異性的抗體，
[0437] -引物對(duì)，探針或?qū)MP9、MMP2、TNC、TNW和/或INTB1，優(yōu)選MMP9、MMP2、TNC和/或INTB1，更優(yōu)選MMP9和/或MMP2具特異性的抗體，和
[0438] -引物對(duì)，探針或?qū)MET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1和/或PLEXB1，優(yōu)選cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2和/或PLEXA1，更優(yōu)選cMET、PDGFRA、HER2和/或EGFR具特異性的抗體。
[0439] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)x自SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、PDGFRA、c-MET、EGFR和HER2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12種基因具特異性，優(yōu)選對(duì)所有這些基因具特異性的抗體。
[0440] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含(i)引物對(duì)，探針或?qū)χ辽貶IF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因具特異性的抗體，和(ii)引物對(duì)，探針或?qū)δ[瘤狀態(tài)、血管生成和淋巴管生成狀態(tài)、腫瘤微環(huán)境和遷移活性的其它標(biāo)志物具特異性的抗體，所述標(biāo)志物優(yōu)選選自表1至4中列出的基因，更優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0441] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)χ辽?0、30、40、50、60、70、80或90種基因具特異性的抗體，所述基因選自表1至4中列出的基因，優(yōu)選選自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK?1(MAP2K1)、MEK?2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受體)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH?1、NOTCH?2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK?1、ROCK?2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb?1、TGFb?2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT?2、WNT?3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)λ羞@些基因具特異性的抗體。
[0442] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含引物對(duì)，探針或?qū)ι儆?0000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000種不同基因，優(yōu)選少于900、800、700、600、500、400、
300、200、150、120或100種基因并且更優(yōu)選少于90、80、70、60、50、40或30種基因具特異性的抗體。
300、200、150、120或100種基因并且更優(yōu)選少于90、80、70、60、50、40或30種基因具特異性的抗體。
[0443] 優(yōu)選地，所述試劑盒包含一種陣列，其中對(duì)代表如上所述的治療上可靶向顯性信號(hào)通路的基因具特異性的探針被固定。所述探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地設(shè)計(jì)。
[0444] 任選地，所述試劑盒還可包含至少一對(duì)引物，探針或?qū)缟鲜龉芗一蚓咛禺愋缘目贵w。
[0445] 所述試劑盒還可包含其它試劑，例如緩沖劑、酶或核苷酸。
[0446] 本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明并且如上文所公開(kāi)的試劑盒的用途，其根據(jù)如上文所公開(kāi)的本發(fā)明方法用于(i)確定癌癥樣本中的治療上可靶向顯性信號(hào)通路，(ii)確定患有癌癥的受試者的治療方案，(iii)選擇患有癌癥的受試者用于治療，(iv)確定患有癌癥的受試者是否易受益于治療，(v)預(yù)測(cè)患有癌癥的受試者的臨床結(jié)果，(vi)治療癌癥患者和/或(vii)預(yù)測(cè)癌癥對(duì)治療的敏感性。
[0447] 在這個(gè)方面也考慮了對(duì)于本發(fā)明方法所公開(kāi)的所有實(shí)施方案。
[0448] 將在下面的實(shí)施例中描述本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)，所述實(shí)施例應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性而非限制性的。
[0449] 實(shí)施例
[0450] 材料和方法
[0451] 腫瘤樣本收集
[0452] 在Strasbourg?Hautepierre醫(yī)院(法國(guó))的神經(jīng)外科部門(mén)收集了21例患者膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活檢組織。僅使用了腫瘤診斷或組織收集所不需要的手術(shù)剩余材料。獲得患者同意書(shū)并由CRB(Centre?de?resources?biologiques)系統(tǒng)地維護(hù)，并且從神經(jīng)病理學(xué)部門(mén)獲得患者診斷。研究樣本是匿名的研究。在手術(shù)期間直接收集活檢組織，儲(chǔ)存在具有10％FBS(胎牛血清；10270-106)、100U/mL青霉素-100μg/mL鏈霉素的4℃DMEM(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基高葡萄糖L0104-500)細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后立即機(jī)械解離?；顧z組織的一部分保存在-80℃。使細(xì)胞懸浮液通過(guò)由100μm直徑孔制成的篩，以800rpm離心5分鐘。除去上清液，加入20mL培養(yǎng)基以懸浮細(xì)胞沉淀，并以800rpm離心5分鐘。該步驟重復(fù)3次以洗滌細(xì)胞懸浮液并消除紅血球。然后將細(xì)胞重懸于5mL?PBS?1x中，保留3mL用于RNA提取并且將2mL用于小鼠中的異種移植。
[0453] 在小鼠中異種移植并經(jīng)皮下連續(xù)傳代的來(lái)自15個(gè)確定患者源結(jié)腸直腸腫瘤的冷凍片段由Oncodesign提供。(CR-IC-004M-P4/CRIC-006M-P3/CR-IC-007M-P4/CR-IC-009M-P3/CR-IC-0013M-P3/CR-IC-0021M-P4/CRIC-0025M-P3/CR-IC-0028M-P3/CR-IGR-002M-P4/CR-IGR-0023M-P3/CR-IGR-048M-P3/CR-IGR-052C-P4/CR-LRB-008M-P4/CR-LRB-009C-P4/CR-LRB-019C-P5)。對(duì)于每個(gè)模型，將用液氮在DMSO/SVF/RPMI?1640培養(yǎng)基(10/10/80)中冷凍的來(lái)自人類原發(fā)腫瘤的片段在37℃解凍5分鐘，在RPMI?1640培養(yǎng)基中沖洗兩次，然后植入9只CB17?SCID小鼠的右側(cè)腹。
[0454] 我們還收集了來(lái)自10個(gè)I或IV級(jí)結(jié)腸腫瘤的RNA(BIOSERVE；Z5ALYRSH/OQMNOR32/FC1AVRAA/4QDH8RIJ/RVBKJR34/EK21MRMMZ/R5NSMRQV/565HFAF2/65SVOR2E/38U4VRSY)。所述RNA樣本儲(chǔ)存在-20℃。
[0455] 我們還收集了來(lái)自4個(gè)前列腺腺癌的RNA(CLINISCIENCE；CR561921/CR559759/CR562458/CR560249)、來(lái)自5個(gè)PDX的RNA(由XENTECH提供的患者源異種移植物，PAC120/HID28/HID28-CAS/HID110-CAS/HID115-CAS)，和來(lái)自6個(gè)II、III或IV期前列腺腫瘤的RNA(BIOSERVE；GT55QRIQ；T523WRU4；1XYXGRIR；VRS8ER21；PR3CURKH；MBUQ4RW3)。所有ARN樣本儲(chǔ)存在-20℃。
[0456] RNA提取
[0457] 對(duì)于前列腺的5個(gè)PDX，首先將腫瘤樣本粉碎。將樣本放置在具有(MOLECULAR?RESEARCH?CENTER；RNA/DNA分離試劑；TR118)和5個(gè)珠粒(BERTIN?
TECHNOLOGIES；2.8mm氧化鋯珠粒039661-1-102)的管(BERTIN?TECHNOLOGIES；Precellys?
24裂解試劑盒KT03961-1-403.2)中。管在15秒內(nèi)用組織裂解器(BERTIN?TECHNOLOGIES；
Precellys?24)在6500次振蕩/分鐘下振蕩，在4℃下在14分鐘內(nèi)以14?000rpm離心
(EPPENDORF；Eppendorf離心機(jī)5417R)。保持水相以提取RNA。
TECHNOLOGIES；2.8mm氧化鋯珠粒039661-1-102)的管(BERTIN?TECHNOLOGIES；Precellys?
24裂解試劑盒KT03961-1-403.2)中。管在15秒內(nèi)用組織裂解器(BERTIN?TECHNOLOGIES；
Precellys?24)在6500次振蕩/分鐘下振蕩，在4℃下在14分鐘內(nèi)以14?000rpm離心
(EPPENDORF；Eppendorf離心機(jī)5417R)。保持水相以提取RNA。
[0458] 總RNA用Tri (MOLECULAR?RESEARCH?CENTER；RNA/DNA分離試劑；TR118)提取。加入200μL氯仿(VWR?Chemicals，22706.292)；將樣本劇烈混合并在室溫下溫育15分鐘，然后在4℃以12000g離心15分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到新管中并加入500μL異丙醇(VWR?Chemicals，20839.366)，將樣本混合，并且在室溫下10分鐘后，將它們?cè)?℃以12000g短暫離心8分鐘。將RNA沉淀與1mL?75％乙醇混合并在4℃以7500g離心5分鐘。該步驟重復(fù)3次。除去乙醇(VWR?Chemicals，20821.365)，將RNA沉淀風(fēng)干30分鐘至1小時(shí)，然后溶于超純水中，并在50-60℃溫育10分鐘。短暫離心后，用nanodrop?5(Thermo?Scientific；Nanodrop?1000分光光度計(jì))測(cè)量ARN濃度。RNA在-20℃儲(chǔ)存直至使用。
[0459] 逆轉(zhuǎn)錄
[0460] 高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(APLLIED?BIOSYSTEM；4368814)用于進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。將RNA以2μg/10μL稀釋并在由7.8μL超純水、2μL?10X?DNASE?I反應(yīng)緩沖液、0.2μL?DNASE(10U/μL)組成的RNA?MIX溶液中在室溫下溫育15分鐘，然后在85℃下溫育10分鐘。然后將樣本冷卻，混合并旋轉(zhuǎn)。將樣本的一半與2μL?RT緩沖液10X、0.8μL?DNTP混合物、2μL隨機(jī)引物
10X、4.2μL水和1μL逆轉(zhuǎn)錄酶一起溫育。樣本在25℃溫育10分鐘，37℃溫育2小時(shí)，以及85℃溫育5分鐘。然后將cDNA以1/50稀釋于超純水中并在-20℃保存。
10X、4.2μL水和1μL逆轉(zhuǎn)錄酶一起溫育。樣本在25℃溫育10分鐘，37℃溫育2小時(shí)，以及85℃溫育5分鐘。然后將cDNA以1/50稀釋于超純水中并在-20℃保存。
[0461] RTqPCR
[0462] 使用Applied?Biosystems(APPLIED；Custom?TaqMan?Array?Plates)專門(mén)為此項(xiàng)目生產(chǎn)的定制微孔板從患者活檢組織新鮮制備的RNA提取物來(lái)確定構(gòu)成腫瘤標(biāo)簽的靶基因的表達(dá)水平。這個(gè)項(xiàng)目使用了3個(gè)不同的批次。
[0463] 表6
[0464]
[0465]
[0466] 將27μL?cDNA與 主混合溶液(APPLIED?BIOSYSTEM；4369016)混合，獲得每20μL反應(yīng)物1至100ng的濃度。將TaqMAn平板以1000rpm短暫離心1分鐘，然后將蓋從平板上移去，并將20μL?cDNA和主混合溶液分配在平板的適當(dāng)孔中。使用 光學(xué)粘性
膜(APPLIED?BIOSYSTEM；4311971)覆蓋平板并以1000rpm短暫離心(EPPENDORF離心機(jī)
5417R)1分鐘，使溶液到達(dá)孔的底部。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行RTqPCR。
膜(APPLIED?BIOSYSTEM；4311971)覆蓋平板并以1000rpm短暫離心(EPPENDORF離心機(jī)
5417R)1分鐘，使溶液到達(dá)孔的底部。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行RTqPCR。
[0467] 歸一化過(guò)程
[0468] 定量RT-qPCR提供靶基因相比于2種管家基因核糖體18S和GAPDH的相對(duì)表達(dá)水平(ΔCt，ΔCt(癌癥樣本)＝Ct(癌癥樣本中的靶基因)-平均Ct(癌癥樣本中的管家基因)；ΔCt(參考組織或細(xì)胞類型)＝Ct(參考組織或細(xì)胞類型中的靶基因)-平均Ct(參考組織或細(xì)胞類型中的管家基因))。
[0469] 歸一化過(guò)程是基于癌癥樣本中的表達(dá)水平與靶基因在每種腫瘤類型(正常組織、低級(jí)別或良性腫瘤組織和組織細(xì)胞亞型)的特定參考中的表達(dá)水平的多輪比較。
[0470] 計(jì)算所有中間相對(duì)表達(dá)水平(2-ΔΔCt，2-ΔΔCt＝2-ΔCt(癌癥樣本)-2-ΔCt(參考組織或細(xì)胞類型))并相加(加和＝2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型1)+2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型2)+...+2-ΔΔCt(參考組織或細(xì)胞類型n))。
[0471] 在對(duì)每個(gè)靶標(biāo)的得分進(jìn)行排序之后，假定1000分為最高水平來(lái)確定歸一化得分。
[0472] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的參考是來(lái)自正常腦(AGILENT?TECHNOLOGIES；540005)、星形細(xì)胞瘤(CLINISCIENCES；CR562205)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(SCIENCELL；1805)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(BIOCHAIN；R1234045-10)的總RNA。
[0473] 結(jié)腸腫瘤的參考是來(lái)自人類結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(CLINISCIENCES；2945-SC)、人結(jié)腸上皮細(xì)胞(CLINISCIENCES；2955-SC)和息肉的總RNA。
[0474] 前列腺腫瘤的參考是來(lái)自前列腺上皮細(xì)胞(CLINISCIENCES；4405-SC)、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CLINISCIENCES；4415-SC)、前列腺成纖維細(xì)胞(CLINISCIENCES；4435-SC)、正常范圍內(nèi)的前列腺(CLINISCIENCES；CR559759)和前列腺腺體增生(CLINISCIENCES；CR560153)的總RNA。
[0475] 將利用不同參考樣本獲得的中間相對(duì)表達(dá)水平2-ΔΔCt相加，然后對(duì)基因進(jìn)行降序排列以計(jì)算得分。將得分最高的基因設(shè)定為1000分的任意單位，并且利用該值對(duì)其它基因進(jìn)行歸一化。每個(gè)基因得到[0；1000]之間的得分。(圖1)。
[0476] 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型
[0477] 所有使用動(dòng)物的程序都已提交給動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)并獲得批準(zhǔn)。
[0478] 在0.5L?O2下用3％異氟烷(BAXTER)麻醉免疫受損小鼠，并接受皮下注射1％1.5mL/Kg酮洛芬(MERIAL)。切開(kāi)頭皮，并且在注射器引入后5分鐘，將100?000個(gè)解離膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活檢組織細(xì)胞用安裝在立體定位儀(HARVARD?APPARATUS)上的2μL?Hamilton注射器(HARVARD?APPARATUS；HAM-88400)在以下坐標(biāo)從前囟植入：x:-2mm；y:+1mm；z:-3.5mm，速度為0.66μl/min。注射后，將注射器原位保持5分鐘，然后每分鐘提高1mm。用7.5mm?Michel不銹鋼傷口夾(A75，PERFECT)縫合頭皮。使動(dòng)物在加熱燈下恢復(fù)幾分鐘，然后將它們放回籠中。
[0479] 在腫瘤發(fā)展52天后，將小鼠隨機(jī)分為4組治療。第一組用靜脈內(nèi)40mg/kg替莫唑胺(n＝9)治療連續(xù)5天，第二組用口服25mg/kg?SB-3CT(n＝9)治療10天，在5天后以2天洗脫中斷，第三組用口服6mg/kg西地尼布(n＝10)治療10天，在5天后以2天洗脫中斷，最后一組用每周1次口服50mg/kg厄洛替尼(n＝9)治療3周。施用量是100μL。在終止當(dāng)天(第一次治療后21天)，通過(guò)頸椎脫臼處死所有小鼠，移出大腦(總共38個(gè)樣本)，并且包含在低溫包埋培養(yǎng)基 中并儲(chǔ)存在-80℃。
[0480] 用安裝在刀片(Superfrost?Super?Plus)上的低溫恒溫器(LEICA?CM?3050S)將大腦切成20μm切片，并儲(chǔ)存于-20℃。為了使腫瘤可視化，將腦切片在蒸餾水中解凍，并用2％稀釋的Giemsa染色劑(SUBRA；RAL?diagnostic?320310-1000)在蒸餾水中于37℃染色2小時(shí)。然后將切片用蒸餾水沖洗，在0.5％乙酸水溶液(SIGMA；33209-12)中溫育15秒，在甲苯(VWR?Chemicals；28676.297)中的70％、95％和100％ETOH浴中快速脫水，并固定在蓋玻片(KNITTEL?GLASS)下。通過(guò)將每個(gè)部分體積相加來(lái)計(jì)算腫瘤體積：[V總＝Σ部分體積＝Σd1x(S1+S2)/2+d2x(S2+S3)/2+...+dnx(Sn+Sn+1)]。通過(guò)用ZEN軟件包圍每個(gè)腦切片的腫瘤界限來(lái)獲得所有表面。
[0481] 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：結(jié)腸直腸腫瘤模型
[0482] 所有使用動(dòng)物的程序都提交給法國(guó)當(dāng)局同意的Oncodesign(Oncomet)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)。
[0483] 在結(jié)腸直腸癌腫瘤動(dòng)物模型中測(cè)試計(jì)算得分的預(yù)測(cè)值。將小腫瘤片段(CR-IC-004M-P4/CR-IC-006M-P3/CR-IC-007M-P4/CR-IC-009M-P3/CR-IC-0013M-P3/CR-IC-0021M-P4/CR-IC-0025M-P3/CR-IC-0028M-P3/CRIGR-002M-P4/CR-IGR-0023M-P3/CR-IGR-048M-P3/CR-IGR-052C-P4/CR-LRB-008MP4/CR-LRB-009C-P4/CR-LRB-019C-P5)皮下植入
CB17SCID小鼠的右側(cè)腹。當(dāng)腫瘤達(dá)到200-300mm3的平均體積時(shí)，開(kāi)始治療。使用Vivo軟件(Biosystemes,Couternon,France)將動(dòng)物根據(jù)其個(gè)別腫瘤體積隨機(jī)分為2
組。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(方差分析)以檢驗(yàn)各組間的同質(zhì)性。第一組用每周1次腹膜內(nèi)12.5mg/kg西妥昔單抗(n＝10)治療3周，第二組用西妥昔單抗0.9％NaCl媒介物治療。通過(guò)[(a?x?b2)/
2]計(jì)算腫瘤體積，其中a是最大腫瘤直徑，b是用卡尺測(cè)量的垂直腫瘤直徑。
CB17SCID小鼠的右側(cè)腹。當(dāng)腫瘤達(dá)到200-300mm3的平均體積時(shí)，開(kāi)始治療。使用Vivo軟件(Biosystemes,Couternon,France)將動(dòng)物根據(jù)其個(gè)別腫瘤體積隨機(jī)分為2
組。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(方差分析)以檢驗(yàn)各組間的同質(zhì)性。第一組用每周1次腹膜內(nèi)12.5mg/kg西妥昔單抗(n＝10)治療3周，第二組用西妥昔單抗0.9％NaCl媒介物治療。通過(guò)[(a?x?b2)/
2]計(jì)算腫瘤體積，其中a是最大腫瘤直徑，b是用卡尺測(cè)量的垂直腫瘤直徑。
[0484] 在根據(jù)所得標(biāo)簽選擇的一個(gè)PDX模型(ONCODESIGN；CR-IC-028M)中測(cè)試了標(biāo)簽的預(yù)測(cè)值，并且先前的結(jié)果證明這兩個(gè)模型對(duì)西妥昔單抗沒(méi)有響應(yīng)。將小腫瘤片段皮下植入9只CB17SCID小鼠的右側(cè)腹。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到500-700mm3時(shí)，手術(shù)切除腫瘤并將小腫瘤片段皮下植入52只受者SWISS裸鼠的右側(cè)腹。
[0485] 當(dāng)腫瘤達(dá)到平均體積200-300mm3時(shí)開(kāi)始治療。使用Vivo 軟件(Biosystemes,Couternon,France)將40只動(dòng)物根據(jù)其個(gè)別腫瘤體積隨機(jī)分為4組，每組10只動(dòng)物。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(方差分析)以檢驗(yàn)各組間的同質(zhì)性。
[0486] 模型CR-IC-028M的第一組用每周1次腹膜內(nèi)12.5mg/kg西妥昔單抗(n＝10)治療3周，第二組用每周兩次腹膜內(nèi)1mg/kg曲妥珠單抗(n＝10)治療3周，第三組用口服6mg/kg西地尼布(n＝10)治療10天，在5天后以2天洗脫中斷。最后一組，即對(duì)照組，接受西妥昔單抗和西地尼布的媒介物的混合物。兩個(gè)模型的施用量是10mL/kg(200μL/20g小鼠)，根據(jù)小鼠的最近個(gè)體體重進(jìn)行調(diào)整。
[0487] 通過(guò)[(a?x?b2)/2]計(jì)算腫瘤體積，其中a是最大腫瘤直徑并且b是每3天用卡尺測(cè)量的垂直腫瘤直徑。
[0488] 在終止當(dāng)天(第一次治療后31天)，通過(guò)氣體麻醉超劑量(異氟烷)處死小鼠(總共40個(gè)樣本)，然后頸椎脫臼或放血并且從所有小鼠收集腫瘤。
[0489] 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：前列腺腫瘤模型
[0490] 通過(guò)The?Direction?des?Services?Vétérinaires,Ministère?de?l'Agriculture?et?de?la?Pêche,France獲得在CERFE設(shè)施中使用動(dòng)物的授權(quán)。動(dòng)物護(hù)理和圈養(yǎng)符合法國(guó)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)的監(jiān)管法規(guī)。所有實(shí)驗(yàn)都是根據(jù)法國(guó)關(guān)于保護(hù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的法規(guī)以及根據(jù)法國(guó)農(nóng)業(yè)和漁業(yè)部頒布的關(guān)于脊椎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)行有效許可證進(jìn)行的。
[0491] 根據(jù)所得標(biāo)簽選擇一種PDX模型(XENTECH；HID-28，激素難治性前列腺癌(HRPC)變體)，并且先前的結(jié)果證明該模型對(duì)多西他賽有響應(yīng)。將小腫瘤片段皮下植入無(wú)胸腺裸鼠的側(cè)腹。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到1000至2000mm3時(shí)，手術(shù)切除腫瘤并將小腫瘤片段(大約40mm3)植入82只裸鼠的肩胛間區(qū)域的皮下組織中。本研究納入36只具有確定生長(zhǎng)的腫瘤并且腫瘤體積范圍為60至200mm3的小鼠，并根據(jù)其個(gè)別腫瘤體積隨機(jī)分為4組，每組9只小鼠。腫瘤標(biāo)簽在擴(kuò)增期間以及植入后得到驗(yàn)證。
[0492] 第一組用每周1次口服50mg/kg厄洛替尼(n＝9)治療3周，第二組用口服6mg/kg西地尼布(n＝9)治療3個(gè)5天周期，其中以2天洗脫中斷，第三組用厄洛替尼和西地尼布的媒介物混合物(0.5％羧甲基纖維素鈉、15％captisol、1％DMSO和0.5％甲基纖維素)治療，并且最后一組用腹膜內(nèi)20mg/kg多西他賽(n＝9)治療2個(gè)周期，每3周1次注射。
[0493] 每?jī)芍芡ㄟ^(guò)用卡尺測(cè)量腫瘤直徑來(lái)評(píng)估腫瘤體積。將使用公式TV(mm3)＝[長(zhǎng)度(mm)×寬度(mm)2]/2，其中長(zhǎng)度和寬度分別是腫瘤的最長(zhǎng)和最短直徑。
[0494] 在終止當(dāng)天(第一次治療后28天)，通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠，從所有小鼠收集腫瘤(總共36個(gè)腫瘤樣本)，并且從每組5只小鼠收集血清(總共20個(gè)血清樣本)。
[0495] 藥物和制劑
[0496] 將Temodal(Selleckchem)溶于20％DMSO中，在30％DMSO中制備SB-3CT(Selleckchem)。將西地尼布(Selleckchem)溶于0.5％甲基纖維素中。將厄洛替尼
(Selleckchem)溶于0.5％羧甲基纖維素鈉、15％captisol(Cydex?pharmaceuticals)、1％DMSO中。所有藥物都用PBS?1X稀釋。將西妥昔單抗溶于0.9％NaCl(Aguettant,Lyon,France)中。曲妥珠單抗在0.9％NaCl(75mg/mL)中制備。在研究的整個(gè)持續(xù)時(shí)間內(nèi)，儲(chǔ)備溶液保持在+4℃。對(duì)小鼠施用的每一天，儲(chǔ)備溶液用0.9％NaCl稀釋。多西他賽在12％乙醇和
0.9％NaCl中制備。
(Selleckchem)溶于0.5％羧甲基纖維素鈉、15％captisol(Cydex?pharmaceuticals)、1％DMSO中。所有藥物都用PBS?1X稀釋。將西妥昔單抗溶于0.9％NaCl(Aguettant,Lyon,France)中。曲妥珠單抗在0.9％NaCl(75mg/mL)中制備。在研究的整個(gè)持續(xù)時(shí)間內(nèi)，儲(chǔ)備溶液保持在+4℃。對(duì)小鼠施用的每一天，儲(chǔ)備溶液用0.9％NaCl稀釋。多西他賽在12％乙醇和
0.9％NaCl中制備。
[0497] 結(jié)果
[0498] 個(gè)人標(biāo)簽的確定：
[0499] 本發(fā)明旨在為臨床醫(yī)生提供患者個(gè)人分子標(biāo)簽，其允許確定實(shí)體癌的最佳治療。這里闡述了包括腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)、結(jié)腸癌(CC)和前列腺癌(PC)的三種代表性實(shí)體腫瘤的概念驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)不同輪歸一化后獲得個(gè)人標(biāo)簽，其比較靶基因在活檢組織中與如上所述的不同參考樣本中的表達(dá)。最終標(biāo)簽顯示由于每個(gè)靶標(biāo)的不同比較而產(chǎn)生的藥物功效預(yù)測(cè)排序。如圖1中關(guān)于GBM活檢所示，通過(guò)將數(shù)據(jù)相對(duì)于腦(中間相對(duì)表達(dá)1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)2)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)3)和低級(jí)別星形細(xì)胞瘤(中間相關(guān)表達(dá)4)歸一化時(shí)獲得的值(2-ΔΔCt)相加來(lái)獲得得分。然后將所得值轉(zhuǎn)換為任意單位，設(shè)置最高得分為1000分。數(shù)據(jù)最終以雷達(dá)模式表示，其顯示歸一化得分的對(duì)數(shù)值(圖1)。
[0500] 最佳治療靶標(biāo)被認(rèn)為是歸一化后顯示最高得分的靶標(biāo)。然后可以從該列表中提取受限標(biāo)簽。該受限列表僅由保留可用藥物的靶基因限定。在這種情況下，得分最高的靶基因被設(shè)定為1000分，然后以雷達(dá)模式表示數(shù)據(jù)，其顯示最佳可用治療工具/藥物得分的對(duì)數(shù)值(圖2)。
[0501] 如圖3中關(guān)于21例GBM患者所示，所有標(biāo)簽都彼此不相同。在一些情況下，所述標(biāo)簽在得分最高的基因方面有相似之處，但總是存在具有特定得分的基因，與所有其他患者不同(圖3A、圖3B)。
[0502] 對(duì)15例CC患者進(jìn)行了類似的研究(圖4)。在這種情況下，從患者源異種移植活檢收集RNA樣本。對(duì)于該腫瘤類型，通過(guò)將數(shù)據(jù)相對(duì)于正常結(jié)腸(中間相對(duì)表達(dá)1)、人上皮結(jié)腸細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)2)、微血管結(jié)腸細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)3)和低級(jí)別結(jié)腸腫瘤(中間相對(duì)表達(dá)4)歸一化時(shí)獲得的值(2-ΔΔCt)相加來(lái)獲得得分。圖4示出不同的標(biāo)簽。雖然表現(xiàn)出較小的變異性，但每個(gè)標(biāo)簽再次顯示出每個(gè)靶基因的高度特異性和個(gè)別表達(dá)水平，產(chǎn)生每個(gè)患者特異性的個(gè)體標(biāo)簽。因此，我們對(duì)9例PC患者進(jìn)行了分析(4例活檢和5例患者源異種移植活檢)。對(duì)于該腫瘤類型，通過(guò)當(dāng)將數(shù)據(jù)相對(duì)于正常前列腺(中間相對(duì)表達(dá)1)、上皮細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)2)、前列腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)3)、前列腺成纖維細(xì)胞(中間相對(duì)表達(dá)
4)和低級(jí)別前列腺癌(中間相對(duì)表達(dá)5)歸一化時(shí)獲得的值(2-ΔΔCt)相加來(lái)獲得得分。此外，每個(gè)患者都展示了最終共有一些靶基因的共同特性的個(gè)人標(biāo)簽(圖5)。
4)和低級(jí)別前列腺癌(中間相對(duì)表達(dá)5)歸一化時(shí)獲得的值(2-ΔΔCt)相加來(lái)獲得得分。此外，每個(gè)患者都展示了最終共有一些靶基因的共同特性的個(gè)人標(biāo)簽(圖5)。
[0503] 歸一化過(guò)程的驗(yàn)證：
[0504] 使用在本實(shí)施例中包括4-5個(gè)步驟(對(duì)于GBM和CC是4個(gè)步驟，對(duì)于PC是5個(gè)步驟)的歸一化過(guò)程來(lái)獲得個(gè)人標(biāo)簽。每個(gè)步驟對(duì)應(yīng)于靶基因的表達(dá)水平與該基因在如本文所述定義的參考樣本中的表達(dá)水平的比較。為了驗(yàn)證歸一化的不同步驟的重要性，通過(guò)一步歸一化(與參考A、B、C或D進(jìn)行比較)或兩個(gè)步驟的組合(與AD、AC、BC、BD、CD進(jìn)行比較)或三個(gè)步驟的組合(與參考ABC、ABD、ADC、BCD進(jìn)行比較)或全部4步歸一化(ABCD)獲得的標(biāo)簽呈現(xiàn)于圖6至圖14中。在PC的情況下，該過(guò)程包括5個(gè)歸一化步驟，其需要更多組合(A、B、C、D、E)或(AB、AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE)或(ABC、ABD、ABE、BCD、BCE、CDE)或(ABCD、ABCE、ABDE、ACDE、BCDE)或(ABCDE)。引人注目的是，中間標(biāo)簽(具有1、2、3、4或5個(gè)歸一化步驟)的總體分析揭示了最終標(biāo)簽(包括所有輪歸一化)不同于所有中間(部分)標(biāo)簽(對(duì)于PC，僅具有1、2或3輪歸一化或者1、2、3和4輪歸一化)。在所有情況下，重要的是要注意最終標(biāo)簽總是不同于用原始數(shù)據(jù)獲得的標(biāo)簽，即未經(jīng)歸一化的基因表達(dá)水平。相反，在第一輪歸一化之后，無(wú)論使用什么參考樣本，標(biāo)簽都改變。在整個(gè)過(guò)程中都可以看到這種演變，其中靶基因作為參考樣本和/或歸一化輪數(shù)的函數(shù)而出現(xiàn)高或低表達(dá)。在大多數(shù)情況下，從第3輪歸一化獲得的標(biāo)簽與最終標(biāo)簽類似，但它們總是保留一些特定的變化，從而表明每個(gè)步驟和每個(gè)參考樣本對(duì)于得到具有藥物功效預(yù)測(cè)值的最終標(biāo)簽的重要性。這里呈現(xiàn)3例GBM(圖6-8)、3例CC(圖
9-11)和3例PC(圖12-14)的詳細(xì)和系統(tǒng)分析，但適用于所有處理樣本。
9-11)和3例PC(圖12-14)的詳細(xì)和系統(tǒng)分析，但適用于所有處理樣本。
[0505] 排序的預(yù)測(cè)值的驗(yàn)證
[0506] 歸一化過(guò)程允許根據(jù)靶基因的表達(dá)水平與各種參考樣本進(jìn)行比較而對(duì)其進(jìn)行排序。每個(gè)靶標(biāo)所獲得的排序是從這一點(diǎn)反映了腫瘤中激活的信號(hào)通路的層級(jí)。因此，當(dāng)考慮到最高排序?qū)?yīng)于腫瘤生長(zhǎng)期間最重要的信號(hào)通路時(shí)，這種層級(jí)限定了選擇最佳治療選項(xiàng)的一個(gè)客觀標(biāo)準(zhǔn)。
[0507] 激發(fā)結(jié)腸癌患者CR-IC-028M中的標(biāo)簽：
[0508] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證排序的該預(yù)測(cè)值，我們?cè)谌航M中選擇了第二患者源活檢組織，其也對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答。在該測(cè)定中，從在裸鼠中生長(zhǎng)的患者源異種移植物重新確定標(biāo)簽以擴(kuò)增腫瘤樣本并產(chǎn)生移植有所述腫瘤樣本的小鼠以進(jìn)行功能測(cè)定(40只小鼠)。在樣本的RNA提取和質(zhì)量控制之后，對(duì)于滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的基因集合確定標(biāo)簽。先前的結(jié)果表明，這種CC模型對(duì)護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)物西妥昔單抗(靶向EGFR)耐藥。事實(shí)上，如圖15所示，在歸一化過(guò)程之后，EGFR排序僅為潛在治療靶標(biāo)的7/9。然而，我們發(fā)現(xiàn)CMET、VEGFR1和VEGFR2是得分最高的靶標(biāo)。我們決定使用單一藥物(西地尼布)阻斷VEGFR1和VEGFR2。我們決定通過(guò)用西地尼布(抑制VEGFR1和VEGFR2分別排序?yàn)?/9和3/9)治療帶有CC腫瘤的動(dòng)物與西妥昔單抗治療動(dòng)物(排序?yàn)?/9并且預(yù)計(jì)應(yīng)答很小或無(wú)應(yīng)答)相比來(lái)激發(fā)獲得的標(biāo)簽。因此，我們還用曲妥珠單抗阻斷HER2(一種具有中間排序的靶基因)來(lái)治療動(dòng)物。正如所預(yù)期，西妥昔單抗治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響。類似地，曲妥珠單抗在阻斷腫瘤發(fā)展方面無(wú)效。然而，西地尼布在該模型中表現(xiàn)出非常顯著的抗腫瘤活性。它降低了腫瘤體積(-50％，p＝0.01，在方案終點(diǎn)的T檢驗(yàn))和腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展(P<0.0001)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的方法允許在一系列可用藥物中選擇最佳治療選項(xiàng)。
[0509] 激發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者HB21的標(biāo)簽
[0510] 在該測(cè)定中，對(duì)于一名診斷為GBM的74歲患者確定標(biāo)簽。在樣本的RNA提取和質(zhì)量控制之后，對(duì)于滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的基因集合確定標(biāo)簽。活檢組織的第二部分被用于移植40只小鼠以復(fù)制患者的腫瘤來(lái)進(jìn)行功能性生長(zhǎng)測(cè)定(植入腦中的原位腫瘤)。如圖16所示，我們發(fā)現(xiàn)MMP9和VEGFR2表現(xiàn)出最高排序。我們決定用護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)物(替莫唑胺，一種將甲基遞送至DNA的嘌呤堿基的烷基化劑前藥)處理來(lái)產(chǎn)生4組荷瘤小鼠(原位移植紋狀體中的腫瘤細(xì)胞)，一組接受MMP9抑制劑(SB-3CT)，一組接受VEGFR2抑制劑并且一組接受EGFR抑制劑(厄洛替尼，EGFR的選擇性抑制劑)。結(jié)果表明，抑制MMP9或VEGFR2可誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)抑制，這與用護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)物獲得的腫瘤生長(zhǎng)抑制相同(圖16)。這證實(shí)了歸一化過(guò)程能夠鑒定對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)而言重要的靶基因，并且阻斷這些靶標(biāo)能夠減少腫瘤生長(zhǎng)。引入注目的是，盡管沒(méi)有顯著差異，但用EGFR抑制劑獲得了更差的抗腫瘤作用(與所有其它藥物相比為-60％功效)，所述靶標(biāo)具有比MMP9和VEGFR2更低的排序。因此，該功能測(cè)定證實(shí)，靶向歸一化后排序最高者產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用。因?yàn)樘婺虬凡⒎前邢蛑委煟圆豢赡軐⑵浒袠?biāo)整合在標(biāo)簽中來(lái)計(jì)算相應(yīng)的得分并將它與其它靶標(biāo)進(jìn)行比較。
[0511] 激發(fā)前列腺癌中的標(biāo)簽
[0512] 為了驗(yàn)證在前列腺癌中的排序預(yù)測(cè)值，我們?cè)谌航M中選擇了患者源活檢組織，其對(duì)當(dāng)前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)物多西他賽有應(yīng)答。
[0513] 在該測(cè)定中，從在裸鼠中生長(zhǎng)的患者源異種移植物重新確定標(biāo)簽以擴(kuò)增腫瘤樣本并產(chǎn)生移植有所述腫瘤樣本的小鼠以進(jìn)行功能測(cè)定。在樣本的RNA提取和質(zhì)量控制之后，對(duì)于滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的基因集合確定標(biāo)簽。我們發(fā)現(xiàn)VEGFR2是排序最高的靶標(biāo)。我們決定通過(guò)用西地尼布(抑制VEGFR2排序?yàn)?/9)治療帶有PC腫瘤的動(dòng)物與多西他賽治療動(dòng)物相比(非靶向治療作為護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)并且已知其對(duì)該P(yáng)DX模型有效)來(lái)激發(fā)所獲得的標(biāo)簽。因此，我們還用厄洛替尼阻斷排序較低的靶基因EGFR(排序?yàn)?/9)來(lái)治療動(dòng)物。正如所預(yù)期，通過(guò)用多西他賽治療可抑制腫瘤生長(zhǎng)。厄洛替尼在阻斷腫瘤發(fā)展方面無(wú)效。然而，西地尼布在該模型中表現(xiàn)出非常顯著的抗腫瘤活性。它降低了腫瘤體積(-78％，p＝0.002，方案終點(diǎn)的T檢驗(yàn))和腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展(P<0.0001)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的方法允許在前列腺癌的一系列可用藥物中選擇最佳治療選項(xiàng)。(圖17)。
[0514] 本發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)，可以在不改變先前存在基因的相對(duì)排序的情況下擴(kuò)展代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因列表。
[0515] 從如上所述的腦腫瘤樣本獲得包含22種基因的標(biāo)簽。然后通過(guò)添加8種和14種新基因來(lái)擴(kuò)大基因列表。如圖18所示，在添加這些新基因之前存在的基因的相對(duì)層級(jí)沒(méi)有改變，即新基因被插入排序中而不改變先前存在基因的相對(duì)位置。
[0516] 這個(gè)結(jié)果表明，可以容易地?cái)U(kuò)展代表治療上可靶向信號(hào)通路的基因列表，以便添加治療靶標(biāo)和/或信號(hào)通路。
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