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GLP-1誘導(dǎo)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，例如刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖 素分泌、抑制胃排空、抑制胃能動(dòng)性或腸能動(dòng)性、增強(qiáng)葡萄糖利用和誘導(dǎo) 體重減輕。GLP-1還能預(yù)防胰腺β-細(xì)胞退化，該病在非胰島素依賴型糖尿 病(NIDDM)發(fā)展時(shí)發(fā)生。GLP-1的重要特點(diǎn)是其能夠刺激刺激胰島素的分 泌而不伴隨低血糖癥的危險(xiǎn)。只有當(dāng)葡萄糖水平升高時(shí)GLP-1才誘導(dǎo)胰島 素分泌，不像其它療法那樣不管葡萄糖水平是否升高都通過(guò)增加胰島素的 表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。包含GLP-1肽的治療的有效性一直受限于GLP-1(1-37) 活性差的事實(shí)，并且兩個(gè)天然產(chǎn)生的截短肽GLP-1(7-37)OH和 GLP-1(7-36)NH2在體內(nèi)被快速清除，并且在體內(nèi)的半衰期非常短。眾所周 知，內(nèi)源產(chǎn)生的二肽基肽酶IV(DPP-IV)通過(guò)除去其N(xiāo)端的組氨酸和丙氨 酸殘基使循環(huán)的GLP-1肽失活，這是其體內(nèi)半衰期短的主要原因。
雖然已有多種方法使得GLP-1化合物比天然GLP-1具有更長(zhǎng)的半衰 期或者更大的藥效，但還需要另外的化合物進(jìn)一步降低清除率并延長(zhǎng)半衰 期，從而優(yōu)化GLP-1作為一種治療藥物的功效，將其在時(shí)間延長(zhǎng)期間的給 藥次數(shù)降至最低。編號(hào)為PCT/US2004/006082和PCT/US2000/11814的國(guó) 際申請(qǐng)闡述了一個(gè)或更多的PEG分子與不同GLP-1以及促胰島素分泌肽 (exendin)化合物的共價(jià)結(jié)合。這些化合物的半衰期超過(guò)24小時(shí)，可以減少 聚乙二醇化的GLP-1化合物的給藥次數(shù)，同時(shí)延長(zhǎng)該化合物在血液中維持 高濃度的時(shí)間。
進(jìn)一步研究已闡明一個(gè)問(wèn)題，其中在延長(zhǎng)的儲(chǔ)存期從聚乙二醇化的 GLP-1或促胰島素分泌肽化合物中發(fā)生聚乙二醇的分離。其結(jié)果是，游離 的GLP-1或促胰島素分泌肽使通過(guò)治療窗的初始峰值濃度暴露譜升高。這 有可能增加惡心和嘔吐的副作用。
本發(fā)明尋求通過(guò)引入兩個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)至GLP-1或促胰島素分泌 肽化合物，然后使這兩個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生聚乙二醇化，以此克服 與延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間和聚乙二醇可能從聚乙二醇化的GLP-1或促胰島素分泌 肽化合物中分離出的有關(guān)問(wèn)題。本方法至少有四個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：第一、該 化合物的聚乙二醇化將顯著地延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期。第二、該化合物的 聚乙二醇化將減緩其吸收速率并因此減少藥物的最初發(fā)作，這被認(rèn)為是產(chǎn) 生副作用的原因。第三、線性的聚乙二醇可直接用于聚乙二醇化并將簡(jiǎn)化 合成步驟。第四、串聯(lián)的聚乙二醇化，通過(guò)降低兩分子聚乙二醇從同一個(gè) GLP-1或促胰島素分泌肽分子中分離出的可能性，將緩解與延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間 相關(guān)的問(wèn)題、以及與聚乙二醇可能從聚乙二醇化的GLP-1或促胰島素分泌 肽化合物中分離出相關(guān)的問(wèn)題。
此外，引入兩個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)至GLP-1或促胰島素分泌肽化合物的 C-末端，然后使這兩個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生聚乙二醇化，導(dǎo)致該聚乙 二醇化的化合物比那些其中至少一個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)不在肽C-末端的聚 乙二醇化的化合物有更高的活性。此外，在GLP-1化合物的C-末端添加 一個(gè)包含兩個(gè)聚乙二醇化位點(diǎn)的接頭，然后同時(shí)使這兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生聚乙二 醇化，導(dǎo)致該聚乙二醇化GLP-1化合物比那些聚乙二醇化位點(diǎn)添加在 GLP-1化合物的C-末端而無(wú)接頭的聚乙二醇化的化合物有更高的活性。
這樣的聚乙二醇化的GLP-1化合物可以用于治療機(jī)能紊亂的受試者， 包括，但不限于，糖尿病、肥胖癥、胃和/或腸能動(dòng)性異常、β細(xì)胞缺乏(例 如β細(xì)胞不足或無(wú)功能)以及胃和/或腸排空異常，其具體的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā) 明的聚乙二醇化GLP-1化合物在24小時(shí)內(nèi)需要的劑量更少，提高了需此 治療的受試者的便利性以及受試者適應(yīng)劑量要求的可能性。
發(fā)明概述
本發(fā)明在此提供共價(jià)結(jié)合兩分子聚乙二醇(PEG)的GLP-1化合物或其 衍生物，其中每一個(gè)聚乙二醇結(jié)合到半胱氨酸殘基上，其導(dǎo)致聚乙二醇化 GLP-1化合物的消除半衰期是至少1小時(shí)，或者至少3、5、7、10、15、 20小時(shí)或者至少24小時(shí)。本發(fā)明的聚乙二醇化GLP-1化合物的清除率值 為200ml/h/kg或者更小，或者180、150、120、100、80、60ml/h/kg或者 更少，或者小于50、40或20ml/h/kg。
本發(fā)明的聚乙二醇化GLP-1化合物包含本通式的氨基酸序列：
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro- Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46，即通式I(SEQ?ID?NO：1)；
其中Xaa8是：D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；
Xaa22是：Gly、Glu、Asp或Lys；
Xaa33是：Val或Ile；
Xaa46是：Cys或者Cys-NH2，
并且其中一個(gè)PEG分子共價(jià)結(jié)合至Cys45且一個(gè)PEG分子共價(jià)結(jié)合至 Cys46或Cys46-NH2。
對(duì)通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物優(yōu)選的是：Xaa8是Gly或Val； Xaa22是Gly或Glu；Xaa33是Val或Ile；以及Xaa46是Cys或Cys-NH2。 同樣優(yōu)選的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22 是Glu；Xaa33是Val或Ile；以及Xaa46是Cys或Cys-NH2。同樣優(yōu)選的 通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33 是Val；以及Xaa46是Cys。同樣優(yōu)選的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合 物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Val；以及Xaa46是Cys-NH2。 同樣優(yōu)選的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22 是Glu；Xaa33是Ile；以及Xaa46是Cys。同樣優(yōu)選的通式I的聚乙二醇化 GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Ile；以及Xaa46 是Cys-NH2。
用于本發(fā)明的聚乙二醇(“PEG”)聚合物，其分子量范圍在500至 100,000道爾頓之間，或者在5,000至40,000道爾頓之間，或者在20,000 到60,000道爾頓之間，或者在20,000到40,000道爾頓之間，并可能是線性 的或者含支鏈的分子，以及可能是本領(lǐng)域述及的聚乙二醇衍生物。本發(fā)明 中共價(jià)結(jié)合至GLP-1化合物的PEG分子并非意在限定于特定類(lèi)型。優(yōu)選 PEG是2萬(wàn)道爾頓的線性甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺。更優(yōu)選的PEG是：

本發(fā)明包含在受試者需要這樣的刺激時(shí)刺激其GLP-1受體的方法，所 述方法包括向受試者施用在此述及的有效劑量的聚乙二醇化GLP-1化合 物的步驟。需要GLP-1受體刺激的受試者包括那些非胰島素依賴性糖尿 病、應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥、肥胖癥、胃和/或腸能動(dòng)性或排空機(jī)能紊亂(包 括例如應(yīng)激腸綜合征、β細(xì)胞缺乏以及機(jī)能性消化不良)的受試者。
發(fā)明詳述
胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是對(duì)食物攝入產(chǎn)生應(yīng)答，由腸L細(xì)胞分泌 的37個(gè)氨基酸的肽。本領(lǐng)域已有大量GLP-1類(lèi)似物及其衍生物的闡述。 本發(fā)明闡述對(duì)GLP-1的修飾，該修飾導(dǎo)致延長(zhǎng)的消除半衰期和/或降低的 清除率。摻入至肽的特定氨基酸位點(diǎn)的半胱氨酸殘基提供了巰基，其可以 與聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物共價(jià)結(jié)合以產(chǎn)生聚乙二醇化GLP-1化合 物。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“GLP-1化合物”，包括天然GLP-1、[GLP-1(7-37)OH 或GLP-1(7-36)NH2]、GLP-1類(lèi)似物、GLP-1衍生物、GLP-1生物活性片 段、延長(zhǎng)的GLP-1或類(lèi)似物或延長(zhǎng)的GLP-1肽的片段、促胰島素分泌肽 -4類(lèi)似物和促胰島素分泌肽-4衍生物。優(yōu)選的，GLP-1類(lèi)似物具有 GLP-1(7-37)OH或延長(zhǎng)的GLP-1肽的氨基酸序列，使1、2、3、4、5或6 個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH的片段在相應(yīng)位置的氨基 酸不同，或經(jīng)修飾使0、1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸與延長(zhǎng)的GLP-1肽 在相應(yīng)位置的氨基酸不同。
術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇化”當(dāng)指本發(fā)明的GLP-1化合物時(shí)是指通過(guò)兩分子的 聚乙二醇或其衍生物共價(jià)結(jié)合而化學(xué)修飾的GLP-1化合物。而且，術(shù)語(yǔ) “PEG”的意思是指在本領(lǐng)域已知的聚乙二醇或其衍生物(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān) 利號(hào)：5,445,090、5,900,461、5,932,462、6,436,386、6,448,369、6,437,025、 6,448,369、6,495,659、6,515,100和6,514,491)。在本發(fā)明的聚乙二醇化 GLP-1化合物中，優(yōu)選PEG(或它的衍生物)共價(jià)結(jié)合到GLP-1化合物中引 入的兩個(gè)半胱氨酸殘基上。在GLP-1化合物中兩個(gè)引入的半胱氨酸殘基優(yōu) 選位于45位和46位。
“促胰島素活性”是指對(duì)升高的葡萄糖水平產(chǎn)生應(yīng)答，刺激胰島素分泌， 從而導(dǎo)致細(xì)胞吸收葡萄糖以及降低血漿葡萄糖水平的能力。促胰島素的活 性可用本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行評(píng)估，包括應(yīng)用體內(nèi)試驗(yàn)和測(cè)量GLP-1受體 結(jié)合活性或受體激活作用的體外測(cè)定，例如：分別在EP?619,322?to?Gelfand 等和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,120,712中所述，利用胰島細(xì)胞或胰島素瘤細(xì)胞的測(cè)定。 在人體中是通過(guò)測(cè)量胰島素水平或C-肽水平進(jìn)行常規(guī)測(cè)定促胰島素活性。 為了達(dá)到本發(fā)明的目的，應(yīng)用體外GLP-1受體信號(hào)測(cè)定來(lái)確定本發(fā)明的聚 乙二醇化GLP-1化合物在體內(nèi)是否顯示出促胰島素活性?？梢允褂么僖葝u 素活性來(lái)證明聚乙二醇化GLP-1化合物具有生物學(xué)活性。本發(fā)明所有例證 的聚乙二醇化GLP-1化合物都具有促胰島素活性(參見(jiàn)例6)。
這里用到的“體外藥效”，是基于細(xì)胞測(cè)定對(duì)肽活化GLP-1受體能力的 測(cè)量。體外藥效用“EC50”來(lái)表示，它是在單劑量應(yīng)答試驗(yàn)中化合物產(chǎn)生 50％活性的有效濃度。為達(dá)到本發(fā)明的目的，應(yīng)用熒光測(cè)定進(jìn)行體外藥效 測(cè)定，該測(cè)定利用穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1受體的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。這 些HEK-293細(xì)胞已穩(wěn)定整合了DNA載體，其具有驅(qū)動(dòng)螢光素酶基因表達(dá) 的cAMP應(yīng)答元件(CRE)。GLP-1化合物或聚乙二醇化GLP-1化合物與其 受體的相互作用引發(fā)的信號(hào)導(dǎo)致cAMP應(yīng)答元件活化以及隨后螢光素酶表 達(dá)。列于例3中的聚乙二醇化GLP-1化合物的EC50值是使用上述螢光素 酶測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定的。通過(guò)應(yīng)用Val8-GLP-1(7-37)OH或天然GLP-1作為 對(duì)照并指定對(duì)照的參考值為100％，可以確定相對(duì)體外藥效值。
術(shù)語(yǔ)“血漿半衰期”是指一半的有關(guān)分子在被清除之前在血漿中循環(huán)的 時(shí)間?？商娲涫褂玫男g(shù)語(yǔ)是“消除半衰期”。在血漿半衰期或者消除半衰 期的情況下用到的術(shù)語(yǔ)“延長(zhǎng)的”或“更長(zhǎng)的”是指相對(duì)于參照分子(如肽的 非聚乙二醇化形式或者天然肽)在可比條件下的測(cè)定結(jié)果，在聚乙二醇化 GLP-1化合物半衰期中有具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高。優(yōu)選本發(fā)明的聚乙二醇化 GLP-1化合物的消除半衰期是至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少3、5、7、10、15、 20小時(shí)以及最優(yōu)選至少24小時(shí)。在實(shí)施例4和5中報(bào)告的半衰期是消除 半衰期；其對(duì)應(yīng)于消除的終末對(duì)數(shù)線性速率。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解半衰 期是衍生參數(shù)，其作為清除率和分布容積二者的函數(shù)而變化。
清除率是對(duì)身體消除藥物能力的度量。當(dāng)由于，例如，對(duì)藥物的修飾 而降低清除率時(shí)，半衰期將預(yù)期的升高。然而，只有當(dāng)分布容積沒(méi)有改變 的時(shí)候，這種倒數(shù)關(guān)系才準(zhǔn)確。方程式t1/2≈0.693(V/C)給出了終末對(duì)數(shù)-線 性半衰期(t1/2)、清除率(C)和分配容積(V)之間有用的近似關(guān)系。清除率不 是表明有多少藥物正被清除，而是藥物將被完全清除乃至消除的生物體液 例如血液或血漿的容積。清除率以每單位時(shí)間的容積來(lái)表達(dá)。本發(fā)明的聚 乙二醇化GLP-1化合物的清除率值為200ml/h/kg或更小，或180、150、 120、100、80、60ml/h/kg或更小，或者50、40或20ml/h/kg或更小(參 見(jiàn)實(shí)施例4和5)。
在本發(fā)明中半胱氨酸被摻入到GLP-1化合物的45和46位。該產(chǎn)生的 分子在半胱氨酸上發(fā)生聚乙二醇化產(chǎn)生保留全部或部分生物學(xué)活性的修飾 的分子，而比那些未修飾的分子或天然分子具有更長(zhǎng)的半衰期。
用于本發(fā)明的GLP-1化合物可應(yīng)用液相或固相肽合成技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方 法制備。
一旦制備并純化GLP-1化合物，其通過(guò)共價(jià)連接兩個(gè)PEG分子至 GLP-1化合物使其聚乙二醇化。本領(lǐng)域已有許多種共價(jià)綴合PEG至肽的 方法(參見(jiàn)綜述文獻(xiàn)，Roberts，M等，藥物投送進(jìn)展綜述(Advanced?Drug Delivery?Reviews)，54：459-476，2002)。肽羧基末端的聚乙二醇化可以用 重組GLP-1肽作為前體通過(guò)酶偶聯(lián)的方法或者本領(lǐng)域已知的替代方法實(shí) 施。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利4,343,898或International?Journal?of?Peptide?& Protein?Research，43：121-38，1994。本發(fā)明的制備聚乙二醇化GLP-1 化合物的一種方法涉及應(yīng)用PEG-馬來(lái)酰亞胺將PEG直接結(jié)合到肽巰基 上。通過(guò)添加或插入半胱氨酸殘基到肽的上述位置，實(shí)現(xiàn)巰基功能性的引 入。也可以將巰基功能性引入到肽的側(cè)鏈上(如含巰基酸的賴氨酸ε-氨基的 酰化作用)。本發(fā)明的聚乙二醇化方法利用邁克爾加成形成穩(wěn)定的硫醚接 頭。該反應(yīng)是高度特異性的并在有其它官能團(tuán)存在的溫和條件下發(fā)生。 PEG-馬來(lái)酰亞胺一直被作為反應(yīng)聚合物用于制備定義明確的、具有生物活 性的PEG-蛋白質(zhì)綴合物。優(yōu)選的程序是，使用相對(duì)于PEG馬來(lái)酰亞胺摩 爾數(shù)過(guò)量的含巰基GLP-1化合物以促進(jìn)反應(yīng)的完成。該反應(yīng)優(yōu)選在pH4.0 至9.0之間、室溫下反應(yīng)1至40小時(shí)。用傳統(tǒng)分離方法很容易的從聚乙二 醇化產(chǎn)物中分離未聚乙二醇化的過(guò)量含巰基肽。在實(shí)施例1和2中列出了 GLP-1化合物的聚乙二醇化所需的典型條件?？梢杂肞EG馬來(lái)酰亞胺或 分叉的PEG馬來(lái)酰亞胺進(jìn)行半胱氨酸聚乙二醇化。優(yōu)選的PEG是20kD 的線性甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺。
在其典型形式中，PEG是一個(gè)具有末端羥基的線性聚合物并有 HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH通式，其中n從大約8到4000左 右。末端氫原子可被保護(hù)性基團(tuán)例如烷基或芳基取代。PEG優(yōu)選至少含一 個(gè)羥基，更優(yōu)選的是含末端羥基。其為這樣的羥基，優(yōu)選其被活化以便與 肽反應(yīng)。多種形式的PEG對(duì)本發(fā)明是有用的。本領(lǐng)域中存在的大量PEG 衍生物適用于本發(fā)明。(參見(jiàn)，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,445,090、5,900,461、5,932,462、 6,436,386、6,448,369、6,437,025、6,448,369、6,495,659、6,515,100和 6,514,491以及Zalipsky，S.Bioconjugate?Chem.6：150-165，1995)。本發(fā)明 中與GLP-1化合物共價(jià)結(jié)合的PEG分子并非意在限于特定類(lèi)型。PEG的 分子量?jī)?yōu)選從500到100,000道爾頓，更優(yōu)選從20,000到60,000道爾頓以 及最優(yōu)選從20,000到40,000道爾頓。PEG可能是線性的或分枝的。
本發(fā)明的聚乙二醇化GLP-1化合物所具有的體外生物學(xué)活性至少是 天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH活性的0.5％。本發(fā)明的聚乙二醇化 GLP-1化合物所具有的體外生物學(xué)活性至少是天然GLP-1或Val8-GLP- 1(7-37)OH活性的1％。本發(fā)明的聚乙二醇化的GLP-1化合物所具有的體 外生物學(xué)活性至少是天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH活性的3％。這 樣的生物學(xué)活性可以通過(guò)如這里(實(shí)施例3)所述的體外藥效測(cè)定或通過(guò)其 它的本領(lǐng)域已知的GLP-1測(cè)定進(jìn)行確定。當(dāng)用特定測(cè)定法測(cè)量時(shí)，雖然本 發(fā)明的某些聚乙二醇化GLP-1化合物的生物學(xué)活性可能比天然GLP-1或 Val8-GLP-1(7-37)OH更低，但該化合物延長(zhǎng)的半衰期和/或降低的清除率 值可補(bǔ)償這種活性降低。
可以由普通技術(shù)的醫(yī)生經(jīng)由任何公知的有效途徑施用聚乙二醇化的 GLP-1化合物。外周腸胃外給藥就是這樣的一種方式。腸胃外給藥在醫(yī)學(xué) 文獻(xiàn)中的通常理解是通過(guò)無(wú)菌注射器或一些其它的醫(yī)學(xué)裝置例如輸注泵將 劑型注射到身體內(nèi)。外周腸胃外給藥途徑可包括靜脈注射、肌肉注射、皮 下注射和腹膜內(nèi)注射給藥途徑。本發(fā)明的聚乙二醇化GLP-1化合物可能也 適于通過(guò)口服、直腸、鼻腔或下呼吸道給藥，其為非腸胃外給藥途徑。在 這些非腸胃外給藥途徑中，優(yōu)選下呼吸道和口服途徑給藥。
本發(fā)明的聚乙二醇化的GLP-1化合物可用于治療多種疾病和機(jī)能紊 亂。本發(fā)明的聚乙二醇化的GLP-1化合物主要通過(guò)作用于受體(被稱為 “GLP-1受體”)發(fā)揮它們的生物學(xué)效應(yīng)?；加心軐?duì)GLP-1受體刺激或施用 GLP-1化合物順利應(yīng)答的疾病或機(jī)能紊亂的受試者，因此能用本發(fā)明的聚 乙二醇化GLP-1化合物治療。這些受試者是所謂“需要使用GLP-1化合物 治療”或“需要GLP-1受體刺激”的對(duì)象。包括那些患有非胰島素依賴性糖 尿病、胰島素依賴性糖尿病、中風(fēng)(參見(jiàn)WO?00/16797)、心肌梗塞(參見(jiàn) WO?98/08531)、肥胖癥(參見(jiàn)WO?98/19698)、手術(shù)后分解代謝改變(參見(jiàn)美 國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,006,753)、機(jī)能性消化不良和過(guò)敏性腸綜合征(參見(jiàn)WO 99/64060)的受試者。也包括需要應(yīng)用GLP-1化合物預(yù)防處理的受試者，例 如有發(fā)展非胰島素依賴性糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的受試者(參見(jiàn)WO?00/07617)。葡萄 糖耐量受損或者空腹血糖異常的受試者、體重超過(guò)與身高和體格對(duì)應(yīng)的正 常體重約25％的受試者、部分胰臟切除的受試者、有一個(gè)或更多親代患有 非胰島素依賴性糖尿病的受試者、已患有妊娠糖尿病的受試者以及已患有 急性或慢性胰腺炎有發(fā)展非胰島素依賴性糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
此處所述的聚乙二醇化的GLP-1化合物的有效劑量是，當(dāng)給需要 GLP-1受體刺激的受試者施用后，產(chǎn)生期望的療效和/或預(yù)防效果而不導(dǎo)致 難以接受的副作用的劑量?！捌谕寞熜А卑ㄒ韵乱豁?xiàng)或多項(xiàng)：1)與疾病 或機(jī)能紊亂相關(guān)癥狀的改善；2)延緩與疾病或機(jī)能紊亂相關(guān)癥狀的發(fā)生； 3)與缺乏該治療的患者相比受試者壽命延長(zhǎng)；以及4)與缺乏該治療的患者 相比受試者生活質(zhì)量提高。例如，聚乙二醇化的GLP-1化合物用于治療糖 尿病的有效劑量是與缺乏治療相比能更好地控制血糖濃度的藥量，從而導(dǎo) 致延緩糖尿病綜合癥例如視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病變或腎臟疾病的發(fā)生。聚乙二 醇化的GLP-1化合物用于預(yù)防糖尿病的有效劑量是與缺乏治療相比能延 緩發(fā)生血糖水平升高的劑量，該病要求用抗高血糖藥例如磺酰脲、噻唑二 酮、二甲雙胍、胰島素和/或雙胍化合物治療。一般地，施用本發(fā)明的聚乙 二醇化的GLP-1化合物使血漿濃度在大約5皮摩爾/升和大約200皮摩爾/ 升之間。所確定的Val8-GLP-1(7-37)OH的最佳血漿濃度是在30皮摩爾/ 升和大約200皮摩爾/升之間。
能使患者血糖恢復(fù)正常的聚乙二醇化的GLP-1化合物有效劑量依賴 于多種因素，其中包括(不限于)患者的性別、體重和年齡、失去調(diào)控血糖 能力的嚴(yán)重程度、給藥途徑和生物利用度、聚乙二醇化的GLP-1化合物的 藥代動(dòng)力學(xué)類(lèi)型、藥效及其配方。本發(fā)明的聚乙二醇化的GLP-1化合物通 常的劑量范圍為成人每天從大約0.01毫克至大約1000毫克。優(yōu)選的劑量 范圍是從每天大約0.1毫克至每天大約100毫克，更優(yōu)選的劑量范圍是從 每天大約1.0毫克至每天大約10毫克。
本發(fā)明的聚乙二醇化的GLP-1化合物優(yōu)選每?jī)芍芙o藥一次或每周給 藥一次。依據(jù)所治療的疾病，聚乙二醇化的GLP-1化合物更頻繁的給藥(例 如每周兩到三次)可能是必要的。
“受試者”是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，但也可能是動(dòng)物，如伴侶動(dòng)物(例如狗、 貓等等)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如奶牛、綿羊、豬、馬等等)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如大鼠、小 鼠、豚鼠等等)。
本發(fā)明用于生產(chǎn)聚乙二醇化的GLP-1化合物的肽可通過(guò)使用液相或 固相肽合成技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例(并非意在限制)予以說(shuō)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1、GLP-1相關(guān)類(lèi)似物的聚乙二醇化
聚乙二醇化反應(yīng)在適合硫醚鍵形成的條件下進(jìn)行。具體來(lái)講，溶液的 pH范圍在大約4到9之間，且含巰基肽濃度范圍在比甲氧基PEG2-MAL 濃度過(guò)量1摩爾到10摩爾之間。正常情況下聚乙二醇化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。 然后用反相高壓液相層析、離子交換層析分離或大小排阻層析(SEC)將聚 乙二醇化GLP-1肽分離。聚乙二醇化的GLP-1類(lèi)似物用分析RP-HPLC， HPLC-SEC，SDS-PAGE和/或MALDI質(zhì)譜確定其特性。
含巰基的GLP-1肽與聚乙烯乙二醇-馬來(lái)酰亞胺(PEG-馬來(lái)酰亞胺)反 應(yīng)，生成通過(guò)硫醚鍵與PEG共價(jià)結(jié)合的衍生物。例如，GLP-1化合物， 其長(zhǎng)度為46個(gè)氨基酸；7.5mg，1.8μmol溶于2ml的200mM磷酸鹽緩沖 液(含有20mM?EDTA，pH7.4)中。然后用氬氣沖洗該溶液。往溶液中加入 40mg甲氧基-PEG-MAL，一種線性或分枝的PEG馬來(lái)酰亞胺(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)(PEG對(duì)肽的比率為0.55mol∶1mol)。 反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。然后，25mg的該聚乙二醇化肽用RP-HPLC純化，用 大小排阻HPLC定性分析并檢測(cè)其體外活性。
實(shí)施例2、2×20kDa?PEG-馬來(lái)酰亞胺與GLP類(lèi)似物的反應(yīng)
用馬來(lái)酰亞胺活化的20kDa的線性mPEG(NOF公司)將GLP類(lèi)似物 在所引入的半胱氨酸殘基上選擇性地聚乙二醇化。為了完成該聚乙二醇化 反應(yīng)，將要被聚乙二醇化的肽溶于包含10mM?EDTA，pH6.8的100mM NH4Ac緩沖液中，并加入1.25倍摩爾數(shù)的超量的20kDa?mPEG。在室溫 下攪拌1-4小時(shí)使該反應(yīng)進(jìn)行，并且用SP-瓊脂糖陽(yáng)離子交換層析將聚乙 二醇化的化合物與游離的PEG以及游離的肽分離。該綴合物用RP-HPLC 脫鹽，然后冷凍干燥。
實(shí)施例3、體外活性測(cè)定
將用于CRE-螢光素酶系統(tǒng)的、穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1受體的HEK-293 細(xì)胞，按照每孔80μl低血清DMEM?F12培養(yǎng)基、30,000個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板中。接種后當(dāng)天，將20μl等分試樣的待測(cè)蛋白質(zhì)溶于0.5％BSA中， 與該細(xì)胞混合并孵育5小時(shí)。在加入細(xì)胞以獲得劑量應(yīng)答曲線(從該曲線測(cè) 定EC50值)之前，一般為待測(cè)GLP-1化合物制備包含從0.001nM到10nM 的10種稀釋液，以及為Val8-GLP-1(7-37)OH標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備0.0003nM和3nM 的溶液。在孵育之后，將100μl螢光素酶試劑直接加入每塊平板中并輕輕 混合2分鐘。將平板放入Tri-lux發(fā)光計(jì)中并計(jì)算螢光素酶表達(dá)導(dǎo)致的光 輸出。通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物(其中Xaa8為Val、Xaa22為 Glu、Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys)的平均EC50值是0.22±0.03nM。通式 I的聚乙二醇化的GLP-1化合物(其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、Xaa33 為Ile以及Xaa46為CyS-NH2)的平均EC50值是0.36±0.04nM。
實(shí)施例4、GLP-1衍生肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、 Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys-NH2，通過(guò)靜脈注射(IV)或皮下注射(SC)途 徑按照0.1mg/kg的劑量給雄性SD大鼠用藥。在給藥后0至192小時(shí)之間 的不同時(shí)間點(diǎn)，將該動(dòng)物(每組3只大鼠)放血。收集每個(gè)樣本的血漿并用 N-端特異的放射免疫測(cè)定法分析。用無(wú)房室法(WinNonlin?Pro)計(jì)算藥物動(dòng) 力學(xué)參數(shù)。通過(guò)靜脈注射施用，聚乙二醇化的GLP-1類(lèi)似物的消除半衰期 是大約1.2天；而通過(guò)皮下注射，聚乙二醇化的GLP-1類(lèi)似物的消除半衰 期是大約1.1天。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與靜脈注射或皮下注射0.1mg/kg藥物相關(guān)的臨 床不良反應(yīng)。觀察到該化合物消除半衰期延長(zhǎng)、清除率減慢和大約30％的 皮下生物利用度。代表性的數(shù)據(jù)如以下表1所示。
表1-
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)藥物代謝動(dòng)力學(xué) 參數(shù)值(其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys-NH2； 在向雄性SD大鼠靜脈注射或皮下注射0.1mg/kg之后)。

a最大血漿濃度
b觀測(cè)到的最大血漿濃度的時(shí)間
c從0到最后時(shí)間點(diǎn)的血漿濃度-時(shí)間曲線下的面積
d消除半衰期
e作為生物利用度函數(shù)的總體清除率
f作為生物利用度函數(shù)的穩(wěn)態(tài)分配容積
當(dāng)按照10μg/kg的劑量給Fischer344大鼠類(lèi)似地靜脈注射 Val8-GLP(7-37)OH，得到了如下所示顯著不同的清除率和消除半衰期。
清除率：1449ml/hr/kg
t1/2(hr)：0.05
實(shí)施例5、GLP-1衍生肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、 Xaa33為Ile以及Xaa46為CyS-NH2)，通過(guò)皮下注射(SC)途徑按照0.01mg/kg 的劑量給雄性短尾猴用藥。在給藥后0至168小時(shí)之間的不同時(shí)間點(diǎn)，將 該動(dòng)物放血。收集每個(gè)樣本的血漿并用N-端特異的放射免疫測(cè)定法分析。 用無(wú)房室法(WinNonlin?Pro)計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。代表性的數(shù)據(jù)如以下表 2所示。
表2-
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)藥物代謝動(dòng)力學(xué) 參數(shù)值(其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys-NH2； 在向雄性短尾猴皮下注射0.01mg/kg以后)。

縮寫(xiě)：SD＝標(biāo)準(zhǔn)差
a最大血漿濃度
b觀測(cè)到的最大血漿濃度的時(shí)間
c從0到最后時(shí)間點(diǎn)的血漿濃度-時(shí)間曲線下的面積
d消除半衰期
e作為生物利用度函數(shù)的總體清除率
f作為生物利用度函數(shù)的穩(wěn)態(tài)分配容積
實(shí)施例6、GLP-1衍生肽的藥效學(xué)分析
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、 Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys-NH2)，通過(guò)皮下注射(SC)途徑按照0.01mg/kg 的劑量給雄性短尾猴用藥。在皮下注射溶劑對(duì)照(磷酸鹽緩沖液)后立即分 步葡萄糖液輸注以及在皮下注射0.01mg/kg聚乙二醇化GLP-1類(lèi)似物后 1、5和7天分步葡萄糖液輸注。分步葡萄糖液輸注步驟是在禁食16小時(shí) 后在給與鎮(zhèn)靜劑的猴子上進(jìn)行。在開(kāi)始葡萄糖輸注10分鐘之前和馬上開(kāi)始 前抽取血液樣本定義基線。然后，以10mg/kg/min的速率分步輸注葡萄糖 (20％右旋糖)20分鐘，接下來(lái)以25mg/kg/min的速率再輸注20分鐘。在 輸注期間以10分鐘為間隔抽取血液樣本。用免疫測(cè)定法確定胰島素水平。 在單次皮下注射0.01mg/kg聚乙二醇化的GLP-1類(lèi)似物后至少7天證明 其具有促胰島素活性(相對(duì)于安慰劑；p＜0.0001)。有代表性的數(shù)據(jù)顯示如 下表3所示。
表3-
通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)藥效學(xué)參數(shù)值(其 中Xaa8為Val、Xaa22為Glu、Xaa33為Ile以及Xaa46為Cys-NH2；在向雄 性短尾猴皮下注射0.01mg/kg以后)
胰島素曲線下面積
分組????AUClast(pM＊min)
溶劑????平均值＝14983；SD＝5789；SE＝2363
第一天??平均值＝30862；SD＝10770；SE＝4397
第五天??平均值＝27203；SD＝6507；SE＝2657
第七天??平均值＝28542；SD＝7685；SE＝3137
序列表
<110>伊萊利利公司
<120>GLP-1聚乙二醇化的化合物
<130>X-17063
<160>1
<170>PatentIn?version?3.3
<210>1
<211>40
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的構(gòu)建體
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2為Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Ala為D-異構(gòu)體
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16為Gly、Glue、Asp或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa在位置27為Val或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>Xaa在位置40為Cys或Cys-NH2
<400>1
His?Xaa?Glu?Gly?Thr?Phe?Thr?Ser?Asp?Val?Ser?Ser?Tyr?Leu?Glu?Xaa
1???????????????5???????????????????10??????????????????15
Gln?Ala?Ala?Lys?Glu?Phe?Ile?Ala?Trp?Leu?Xaa?Lys?Gly?Gly?Pro?Ser
????????????20??????????????????25??????????????????30
Ser?Gly?Ala?Pro?Pro?Pro?Cys?Xaa
????????35??????????????????40