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本發(fā)明所引用的技術(shù)文獻(xiàn)

Su；Sheng-Hui等人美國(guó)專利No.6,130,323。Non-nucleotide?linking?reagents。10月10 日，2000。

Nelsen，p.S.等人，Nuclear?Acids?Research.20：6253，1992。

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所屬領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫，及信號(hào)檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明技術(shù)背景

目前基因芯片分析中通常用熒光染料(即CyTM3或CyTM5)作為標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物可以在 cDNA合成時(shí)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄[reverse?transcription]技術(shù)直接引入，aRNA放大或者后aRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) [post-aRNA?reverse?transcription(RT)reaction]，或在任何酶反應(yīng)之后通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行連接。直接標(biāo) 記需要酶反應(yīng)在cDNA，aRNA或RT產(chǎn)物中引入Cy標(biāo)記的dNTP/NTP核苷酸結(jié)構(gòu)類似物。

目前，基因芯片在實(shí)際操作中，來(lái)自實(shí)驗(yàn)樣品和參照樣品的cDNA[代表mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品]用不同的熒 光染料標(biāo)記、混合、并被雜交到芯片上。所測(cè)得的熒光強(qiáng)度無(wú)法與其實(shí)際轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的豐度成正比。

雖然直接標(biāo)記法看上去更方便，但卻存在一些問(wèn)題。首先，引入的被標(biāo)記的堿基U的數(shù)量將取決于 cDNA的堿基組成，即mRNA中堿基A的含量。其次，參入到標(biāo)記分子中的核苷數(shù)量也取決于轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物的長(zhǎng)度。很長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或/及含有大量堿基A的模板會(huì)產(chǎn)生被更強(qiáng)的熒光信號(hào)標(biāo)記的cDNA。在此 情況下，強(qiáng)的信號(hào)不代表高的表達(dá)豐度，因此，對(duì)雜交上的靶序列的標(biāo)記與實(shí)際雜交的靶序列的量不成 正比關(guān)系，這為對(duì)基因芯片檢測(cè)中的精確定量造成困難。第三，Cy5和Cy3在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引入水平 或效率不高，而且各自效率不同，會(huì)產(chǎn)生不同的量子效率以及各種各樣的熒光強(qiáng)度，因此，對(duì)熒光強(qiáng)度 的歸一化將十分必要，這是對(duì)下游數(shù)據(jù)分析的影響。第四，采用直接法標(biāo)記進(jìn)行信號(hào)放大受到放大倍數(shù) 的限制。目前的大多數(shù)方法需要最少20微克的總RNA樣品，或2微克poly(A)RNA樣品[Schena?M 等人，Duggan?D.等人]，對(duì)于研究一些稀有組織或樣品量比較少的樣品往往顯得無(wú)能為力。第五，過(guò)多的 參入熒光分子往往導(dǎo)致雜交效率或特異性降低。而且有資料顯示，探針或靶基因中多重被標(biāo)記核苷的參 入會(huì)減少它們所形成的雜交雙鏈的穩(wěn)定性。資料顯示，帶有多重?zé)晒馑鼗鶊F(tuán)的合成寡聚核苷酸、帶有多 重生物素基的生物來(lái)源的核酸探針、以及兼有生物素基團(tuán)和熒光素基團(tuán)的合成寡聚核苷酸的雜交雙鏈的 穩(wěn)定性都下降[Su，Sheng-Hui等人，美國(guó)專利No.6,130,323]。

間接標(biāo)記通常在將要被熒光染料標(biāo)記的核酸分子上引入一個(gè)堿基媒介。這個(gè)堿基媒介可以是氨基修 飾[氨基烯丙基-]的堿基，然后，用Cy5或Cy3分子與之結(jié)合。但在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，間接方法沒(méi)有克服 直接標(biāo)記中熒光強(qiáng)度取決于cDNA長(zhǎng)度和堿基組成的問(wèn)題。

本發(fā)明的目的

本發(fā)明的目的是為基因芯片產(chǎn)品提供一套利用酶學(xué)或化學(xué)的方法、利用高荷信號(hào)載體大幅度提升檢 測(cè)靈敏度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性的信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)及試劑盒。同時(shí)解決直接法標(biāo)記中非線性標(biāo)記而出現(xiàn)的無(wú)法 精確定量、靈敏度不足、成本高昂等缺陷，使產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與基因表達(dá)中的實(shí)際豐度成放大了的 正比例關(guān)系。本發(fā)明中的技術(shù)方案同時(shí)解決了基因芯片直接標(biāo)記中cDNA的雜交效率對(duì)標(biāo)記過(guò)程的影響 問(wèn)題。

本發(fā)明與背景技術(shù)相比所產(chǎn)生的積極效果

本發(fā)明中所提供的方法不僅提高了基因芯片檢測(cè)靈敏度，降低成本，而且克服了直接標(biāo)記技術(shù)中存 在的無(wú)法準(zhǔn)確定量的各種技術(shù)因素，如在本發(fā)明中可以被視為加尾標(biāo)記的末端轉(zhuǎn)移酶方法和捕獲序列方 法所表示的方法。

歸納起來(lái)，本發(fā)明所帶來(lái)的有益效果有如下幾個(gè)方面：

1、為一般的基因芯片技術(shù)產(chǎn)品提供了超靈敏檢測(cè)的技術(shù)基礎(chǔ)，技術(shù)比現(xiàn)有的體外轉(zhuǎn)錄[IVT]標(biāo)記、Cy 系列熒光分子標(biāo)記技術(shù)有著更強(qiáng)大的信號(hào)放大效果，可以根據(jù)需要選擇不同規(guī)格的高荷信號(hào)載體將 信號(hào)放大倍數(shù)提高到102-107不等。

2、為降低基因芯片處理系統(tǒng)的成本及運(yùn)行成本提供了技術(shù)支持，有利于基因芯片的普及應(yīng)用；

3、克服了PCR等基因擴(kuò)增技術(shù)中的假陽(yáng)性問(wèn)題；

4、克服了利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中Cy3/Cy5熒光分子參入法直接標(biāo)記技術(shù)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度還取決于 cDNA長(zhǎng)度和堿基組成所造成的不確定性，本發(fā)明中的標(biāo)記方法所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度則僅取決于 cDNA的分子數(shù)目，因此可以線性定量檢測(cè)。因此，本發(fā)明所述的技術(shù)方案所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度 與基因表達(dá)的實(shí)際豐度成正比例線性關(guān)系。

5、間接標(biāo)記中的末端標(biāo)記技術(shù)的雜交過(guò)程在標(biāo)記反應(yīng)之前，而且雜交分子的堿基在雜交之前沒(méi)有被修 飾，克服了直接標(biāo)記中雜交效率低下或錯(cuò)配雜交的問(wèn)題，提高了雜交分子的穩(wěn)定性，同時(shí)也有利于 探針和靶基因的嚴(yán)謹(jǐn)雜交。

專用名詞注解

模板[Template，T]

各種酶[如DNA/RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等]的核酸分子底物，在生物樣品中是待檢測(cè)的核酸分子。模 板經(jīng)過(guò)加工

引物[Primer]

位于待合成或轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA片段的某個(gè)特定序列并與該序列序列互補(bǔ)的一段核酸片段，可引導(dǎo) 相應(yīng)的DNA或RNA合成酶等啟動(dòng)DNA活RNA的合成或轉(zhuǎn)錄。

探針[Probe]

含有某一特定核酸或肽核酸堿基序列的被固定在基因芯片基片上的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸 [peptide?nucleic?acid，PNA]片段。

靶序列[Target?Sequence，TS]

用于與基因芯片上的核酸探針進(jìn)行雜交的互補(bǔ)核酸或肽核酸序列。

報(bào)告基團(tuán)[Reporter?Group，Y-]

在核酸標(biāo)記反應(yīng)中，本發(fā)明不是直接將信號(hào)標(biāo)記物[如熒光信號(hào)分子等]連接到靶序列上，而是首先 將一個(gè)中介基團(tuán)連接到靶序列上，或通過(guò)合成的方法在靶序列上產(chǎn)生一個(gè)報(bào)告基團(tuán)。報(bào)告基團(tuán)作為一個(gè) 標(biāo)簽、燈塔或接頭，其目的是在下一步標(biāo)記反應(yīng)中，表明在基因芯片某個(gè)位點(diǎn)的某個(gè)探針?lè)肿由想s交事 件的發(fā)生，同時(shí)準(zhǔn)備與標(biāo)記分子的連接。

報(bào)告引物[Reporter?Primer]

通過(guò)酶學(xué)或化學(xué)方法合成的，連接有報(bào)告基團(tuán)的引物序列。

報(bào)告靶序列[Report?Target?Sequence，RTS]

在DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽氨酸分子末端或其他部位帶有一個(gè)或若干個(gè)報(bào)告基團(tuán)的靶序列。 報(bào)告核苷酸[Reporter?Nucleotide]

各種帶有報(bào)告基團(tuán)的[脫氧或雙脫氧]核苷酸或核苷酸類似物，如氨基烯丙基脫氧核苷酸 [aminoallyl?deoxynucleotides，aa-dUTP等]、生物素基雙脫氧核苷酸[biotin-ddUTP]等。在酶或化學(xué) 作用下，這些報(bào)告核苷酸被摻入或連接到報(bào)告引物或報(bào)告靶序列中。

接頭基團(tuán)[Y’-]

通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵力能夠與報(bào)告基團(tuán)可以發(fā)生特異性相互作用并與之結(jié)合的生物或化學(xué)分子 或基團(tuán)。

隨機(jī)報(bào)告引物[Random?Reporter?Primer，RRP]

通過(guò)DNA合成儀合成的具有所有可能堿基序列的報(bào)告引物的總和。報(bào)告引物的引物部分通常是六聚 或八聚核苷酸。

捕獲序列

一個(gè)連接到靶序列上的一個(gè)特定堿基序列的核酸或肽核酸片段。捕獲序列起著靶序列報(bào)告基團(tuán)的作 用，為下一步與高荷信號(hào)載體[HSC]的標(biāo)記反應(yīng)做好準(zhǔn)備。它可以通過(guò)與固定在HSC表面的接頭序列互 補(bǔ)雜交而形成一條核酸雙鏈的連接。

接頭序列

固定[通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接]在HSC表面，與捕獲序列堿基互補(bǔ)配對(duì)的一段核酸序列。

本發(fā)明的技術(shù)原理

本發(fā)明提出一種間接法基因芯片線性放大標(biāo)記技術(shù)，其原理是，將攜帶報(bào)告基團(tuán)(Reporter?Group) [Y-]的報(bào)告核苷酸[Reporter?Nucleotides]，以樣品中待測(cè)基因序列為模板，在酶或化學(xué)作用下?lián)饺氲桨行?列中，合成報(bào)告靶序列[Reporter?target?sequences]，后者與被固定在基因芯片上的探針陣列雜交，形成報(bào) 告靶序列與其互補(bǔ)探針的雜合雙鏈，用表面修飾有報(bào)告基團(tuán)接頭基團(tuán)[Y’-]的高荷信號(hào)載體[HSC]與該雜 合雙鏈反應(yīng)并與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大標(biāo)記。

這種基因芯片由基底及其表面的鍍層或涂層和固定在基底[縮寫為S]或鍍層[縮寫為C]表面的不少于 兩個(gè)陣列式排列的探針組成，用于檢測(cè)樣品中的生物或化學(xué)靶物質(zhì)?；缀?或鍍層或涂層的材料可以由 但不限于如下材料中任意一種或一種以上不同材料組合制成：·

(1)無(wú)機(jī)片狀或平板狀材料類如玻璃、石英、云母，透明導(dǎo)電材料如透明導(dǎo)電氧化物類[TCO]， 如氧化銦錫[indium?tin?oxide，ITO，或?qū)憺镮n2O3：Sn]、InAs、SnO2:F、砷化鎵[GaAs]、 氧化鎂等鍍層，氧化錫[tin?oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶復(fù)合導(dǎo)電陶瓷，各種半導(dǎo)體材料等，以及多孔板模式，如微 孔板、微滴板，

(2)單質(zhì)類：鉑、金、銀、鋁、鉻[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金屬以及硅等非金屬，

(3)有機(jī)物類：各種有機(jī)分子及其由此制成的自組裝單分子膜或自組裝多分子膜，

(4)高分子類：尼龍膜、塑料、橡膠、樹脂，硝酸纖維素膜。

基底的結(jié)構(gòu)可以是但不限于如下種類：

(1)薄片/平板式：如玻璃片、硅片、尼龍膜、塑料片、

(2)多孔板式：如微孔板，微滴板式等，

(3)電極式：在薄片式基因芯片上以一定規(guī)律排列而成的各種電極陣列，如在半導(dǎo)體、絕緣 體等基底上制成的鉑電極、金電極等，

(4)微管式：由毛細(xì)管或有毛細(xì)管管狀內(nèi)腔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的其它材料，按預(yù)先設(shè)定的位置對(duì)應(yīng)規(guī) 則排列而成的各種矩陣式毛細(xì)管基因芯片[二維平面排列]、線形毛細(xì)管基因芯片[一維線 形排列]、以及在基片式結(jié)構(gòu)中制作出的各種不少于一個(gè)微管道式空腔結(jié)構(gòu)的矩陣式并行 排列[即微流體電泳芯片等]，

本發(fā)明所說(shuō)的基因芯片用來(lái)檢測(cè)的探針、靶序列或者模板[T]可以是，但不限于如下種類之一或不同 種類的組合或下面種類的某種成分，提取物：

(1)核糖核酸[RNA]，各種核糖核酸[″ribonucleic?acid″and″RNA″]，包括信使RNA[簡(jiǎn)稱mRNA]、轉(zhuǎn) RNA[簡(jiǎn)稱tRNA]、放大核糖核酸[amplified?RNA]或反義核糖核酸[anti-sense?RNA，簡(jiǎn)稱 aRNA]、互補(bǔ)RNA[cRNA]等，

(2)脫氧核糖核酸[DNA]如DNA，互補(bǔ)DNA[cDNA]等，

(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脫氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，簡(jiǎn)稱ODNs]，寡聚核糖 核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，

(4)核酸結(jié)構(gòu)相似物[DNA-DNA，RNA-RNA?or?RNA-DNA?mimic?duplexes，triplexes?or?quadroplexes， 等]]如肽核酸[peptide?nucleic?acids，簡(jiǎn)稱PNA]，

(5)脫氧核糖核酸、核糖核酸、肽核酸及其結(jié)構(gòu)相似物的互補(bǔ)雙鏈、三[重]鏈、四[重]鏈等形式的雜 交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA， PNA-DNA-PNA]等。

本發(fā)明在基因芯片處理技術(shù)中采用高荷信號(hào)載體(高分子熒光微球或含有大量熒光染料、半導(dǎo)體納 米晶量子點(diǎn)、電致發(fā)光分子等的高分子顆粒，通過(guò)合成技術(shù)將大量信號(hào)分子聚合為一體的各種形式的巨 型信號(hào)分子，硅氧光學(xué)磁珠[silica?beads]，膠體金[或納米金顆粒，colloidal?gold?nanoparticles]， 或通過(guò)任何其他手段將熒光染料，非熒光染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)、電致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光物質(zhì)信 號(hào)分子等固定于微粒的表面或包埋于其內(nèi)部等多種形式的高荷信號(hào)載體)作為標(biāo)記物進(jìn)行分子信號(hào)放 大。

本發(fā)明所要介紹的基因芯片信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，是以各種形式的高荷信號(hào)載體或信號(hào)體應(yīng)用于標(biāo)記 各種形式的基因芯片探針、靶或探針-靶雜交體。

這里所說(shuō)的基因芯片包括但不限于如下類型：基因芯片[包括各種DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜 芯片，實(shí)驗(yàn)室芯片，微流體芯片等]、以電化學(xué)原理或生物電子學(xué)原理為基礎(chǔ)的各種生物傳感器等。

本發(fā)明所使用基因芯片的檢測(cè)原理可以是，但不限于如下種類之一或不同原理的結(jié)合：

(1)通過(guò)對(duì)固相表面定位在不同位置的探針-靶特異性親合反應(yīng)結(jié)合體或雜交體進(jìn)行光學(xué)信 號(hào)[如熒光分子、化學(xué)發(fā)光等]標(biāo)記，然后經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光、化學(xué)或生物發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)。 以玻璃、硅片、尼龍膜等為材質(zhì)的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取這種模式；

(2)通過(guò)對(duì)標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針或靶在施加了電壓的液相中的移動(dòng)速度或遷移率進(jìn)行檢 測(cè)，即電泳技術(shù)或由電泳技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳[capillary electrophoresis，CE]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[capillary?zone?electrophoresis，CZE]、毛細(xì)管凝膠電 泳[CGE]、高效毛細(xì)管電泳[HPCE]、毛細(xì)管等電聚焦[capillary?isoelectric?focusing (CIEF)]、等速電泳[isotachophoresis(ITP)]、動(dòng)電色譜[electrokinetic chromatography(EKC)]、膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜[micellar?electrokinetic?capillary chromatography(MECC?OR?MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛細(xì)管電泳[non-aqueous?capillary electrophoresis(NACE)]等，

(3)通過(guò)探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如 親和層析[affinity?chromatography]，SEC[size?exclusion?chromatography]，GPC[gel permeation?chromatography]，MCC[metal?chelate?chromatography]等，

(4)利用具有氧化還原性質(zhì)的分子或分子的部分結(jié)構(gòu)[即化學(xué)基團(tuán)或功能團(tuán)]、金屬絡(luò)合物或 (核酸)嵌入劑與被定位并固定在固相表面不同位置或電極上的探針、靶或探針-靶絡(luò)合 物結(jié)合并在外加適當(dāng)方式或適當(dāng)大小的電壓(或電勢(shì)差)作用(直流電壓或交變電流或 脈沖電場(chǎng)或電壓)下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使從還原性分子或基團(tuán)(電子授體，electron donor)的電子轉(zhuǎn)移到氧化性分子或基團(tuán)(電子受體，electron?acceptor)，形成電子流， 通過(guò)電極傳送到檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，所測(cè)得的電流強(qiáng)度大小與雜交并被標(biāo)記的雙鏈核酸 的量成正比，

(5)利用雙鏈核酸和單鏈核酸的導(dǎo)電性能差異，或利用由序列完全互補(bǔ)配對(duì)的核酸雜交所形 成的雙鏈核酸分子與有錯(cuò)配堿基對(duì)(Mismatches)存在的雙鏈核酸(nucleic?acids?duplexes) 分子之間在導(dǎo)電性能差異，通過(guò)對(duì)經(jīng)由核酸分子傳導(dǎo)的電子流大小的測(cè)量而對(duì)核酸分子 由此所反映的其他方面所進(jìn)行的各種鑒別、檢測(cè)和考察，如在基因突變、基因多態(tài)性、 基因測(cè)序、基因表達(dá)譜研究、疾病機(jī)理分析和疾病診斷等方面的應(yīng)用，

(6)將發(fā)生在核酸分子上或由具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)(包括但不限于，具有氧化還原性質(zhì) 的金屬絡(luò)合物以及由金屬絡(luò)合物或金屬絡(luò)合物的衍生物為單體聚合而成的聚合物、熒光 分子、核酸嵌入劑等)所發(fā)生的電子或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)或電子流轉(zhuǎn)換成其他可檢測(cè)或可考 察形式的檢測(cè)技術(shù)，如通過(guò)電致發(fā)光[Electroluminescence]原理，利用電致發(fā)光分子將電 子流轉(zhuǎn)換為光信號(hào)所進(jìn)行的檢測(cè)，

(7)直接或間接以具有氧化還原性物質(zhì)(如二茂鐵基)對(duì)探針或靶分子標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記后 可以使標(biāo)記物接近電極表面而發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)生在電極表面的生物或 化學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)。如摩托羅拉公司的eSensor?Chips。

(8)通過(guò)探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如 親和層析[affinity?chromatography]，SEC[size?exclusion?chromatography]，GPC[gel permeation?chromatography]，MCC[metal?chelate?chromatography]、動(dòng)電色譜 [electrokinetic?chromatography(EKC)]、膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜[micellar electrokinetic?capillary?chromatography(MECC?OR?MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法 [capillary?electrochromatography(CEC)]等。

這里所說(shuō)基因芯片的高荷信號(hào)載體[HSC]是指通過(guò)任何方式將信號(hào)分子濃縮在微小顆粒內(nèi)部、表 面、掛載在表面上或三者兼而有之。這些HSC包括但不限于如下類型，以各種微小顆粒形式存在的 高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號(hào)載體，它可以是量子點(diǎn)微球[QD-tagged?Microbeads]、高聚 物熒光微球或高分子熒光微球[polymer?microspheres]或膠體微珠[latex?beads]，在顆粒表面、內(nèi)部通過(guò) 固定、包埋、化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合等方式將信號(hào)分子如熒光染料分子、化學(xué)發(fā)光分子、發(fā)色分子等濃集 起來(lái)的[磁性]硅氧微珠[silica?beads]、膠體發(fā)光半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[colloidal?fluorescent?semiconductor nanocrystal?quantum?dots]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高分子或樹形分子[star dendrimers，dendrimeric?stars?or?dendrimers]、蛋白質(zhì)包裹的半導(dǎo)體納米顆?；蛭⑿☆w?；蛄孔狱c(diǎn)[如 Chaperonin?mediated?semiconductor?nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin?GroEL蛋白和T.th?cpn 蛋白包裹效果最佳]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular?magnets]、膠囊式微球[encapsulated?spheres]、 膠體納米金[colloidal?gold?nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent?molecules]、二茂金屬基共 聚物微球[polymetalcene?block?copolymers，如二茂鐵基聚合物[polyferrocene?block?copolymers，PFC， 或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金屬基修飾或接枝 的樹枝狀高分子[包括但不限于，聚二茂鐵基接枝的樹枝狀高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金屬基或多聚二茂金屬基修飾或接枝的納米金膠體[包括但不限于，胺基二茂鐵 基功能化的納米金膠體(Gold?colloids?functionalized?with?amidoferrocenyl?structures)等]、共聚物微球 或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā) 光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，藻膽蛋白類[phycobiliproteins]及其各 種衍生物或生物或化學(xué)修飾物，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長(zhǎng)、電磁學(xué) 性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合。

本發(fā)明所要介紹的信號(hào)放大技術(shù)情景之一，是一種末端轉(zhuǎn)移酶[Terminal?Deoxyribonucleotidyl Transferase，簡(jiǎn)寫為TdT]介導(dǎo)的基因芯片信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，將修飾了的核苷[modified nucleotides]和未經(jīng)修飾的核苷在該酶的作用下，利用樣品中的待測(cè)基因(DNA、RNA或寡聚核苷酸) 為模板，合成修飾了的靶序列。用此新合成的靶序列與固定在基因芯片表面的基因探針進(jìn)行雜交。之后， 經(jīng)洗脫過(guò)程，再用表面修飾有可與該靶序列上的報(bào)告基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)基團(tuán)的高荷信號(hào) 載體與基因芯片上具有靶序列的雜交雙鏈進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交分子的特異性信 號(hào)放大標(biāo)記。

TdT是一個(gè)作用與模板序列無(wú)關(guān)的的DNA聚合酶，可以在3’-末端的羥基上加一個(gè)脫氧核苷，雙鏈 或單鏈上突出的、縮入的和平頭的3’-末端都可以成為TdT的底物。

本發(fā)明所要介紹的信號(hào)放大技術(shù)情景之二，是一種隨機(jī)報(bào)告引物法[Random?Reporter?Primer，簡(jiǎn)寫 為RRP]標(biāo)記。這種方法是以隨機(jī)引物法為基礎(chǔ)的。即，由DNA聚合酶中具有5’→3’DNA合成活性的 Klenow酶介導(dǎo)的基因芯片隨機(jī)引物放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，將修飾了的核苷[modified?nucleotides]和 未經(jīng)修飾的核苷在該酶的作用下，以所有可能序列的寡聚核苷酸的混合物為引物，利用樣品中的待測(cè)基 因(DNA或RNA)為模板，合成修飾了的新核酸序列作為靶序列[Target?Sequence，簡(jiǎn)寫為TS]。在這種 報(bào)告引物合成時(shí)，我們摻入氨基烯丙基脫氧核糖核苷[aminoallyl?deoxynucleotide?triphosphate，簡(jiǎn)寫為 aa-dNTPs]，生成帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基修飾的引物。我們稱之為報(bào)告引物[Reporter?Primer]。所以，以此 為引物合成的TS，在5’-末端帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基。稱之為報(bào)告靶序列[Reporter?Target?Sequence，簡(jiǎn)寫為 RTS]。報(bào)告引物中的氨基數(shù)目可以在DNA合成儀合成時(shí)進(jìn)行控制，最佳數(shù)目為一個(gè)。其實(shí)即使不是一 個(gè)，由于報(bào)告引物的長(zhǎng)度有限，合成的RTS在后續(xù)的標(biāo)記中會(huì)因?yàn)榭臻g位阻，達(dá)到僅有一個(gè)HSC被共 價(jià)鍵偶聯(lián)標(biāo)記。

用此新合成RTS與固定在基因芯片表面的基因探針進(jìn)行雜交。之后，經(jīng)洗脫過(guò)程，再用表面修飾有 可與該新模板上的功能團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)基團(tuán)的高荷信號(hào)載體與基因芯片上具有RTS的雜 交雙鏈進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交分子的特異性線性放大標(biāo)記。

合成的所有可能序列的隨機(jī)報(bào)告引物[RRP]混合物對(duì)樣品溶液中的模板進(jìn)行DNA或RNA合成、逆 轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)，從而合成相應(yīng)的可用于雜交的報(bào)告靶序列[RTS]。在這樣的RTS在互補(bǔ)雜交到 基因芯片探針上之后，與表面固定了可與報(bào)告分子反應(yīng)并發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)的HSC反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)線性放 大標(biāo)記。

本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之三，是一種通過(guò)捕獲序列為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行定量。利用此方法，未修 飾或未標(biāo)記的dNTP被分別加到試驗(yàn)cDNA和參照cDNA中，而oligo(dT)引物被加到RNA溶液中。所 不同的是，這里的oligo(dT)引物含有一個(gè)捕獲序列。比如，TTTTT------表示加到試驗(yàn)RNA溶液中、而 TTTTT+++++++表示加到參照RNA溶液中的捕獲序列。連接到上述引物上的兩種不同的捕獲序列分別 用------和++++++表示。接著，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的試驗(yàn)cDNA和參照cDNA混合并與基因芯片雜交。雜 交和洗脫之后與高荷信號(hào)載體[HSC]標(biāo)記物一起溫浴。每個(gè)高荷信號(hào)載體[HSC]的表面分別固定有與上述 捕獲序列互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列，稱為接頭序列，用于與基因芯片表面被雜交固定的捕獲序列進(jìn)行雜交。

這樣，每一個(gè)cDNA分子只會(huì)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)強(qiáng)度。而且，合成的cDNA并不是一開始就被信號(hào)標(biāo)記， 而是先在引物上加上一個(gè)捕獲序列，只是在溫育階段才被信號(hào)標(biāo)記。

本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之四，是通過(guò)化學(xué)法在作為靶基因的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸 或寡聚PNA的5’-端或3’-端合成一個(gè)可以特異性地發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)并形成共價(jià)鍵連接的基團(tuán)，如氨 基[-NH2]、巰基[-SH]等。在該靶基因與基因芯片上的探針雜交之后，該基團(tuán)作為報(bào)告分子可以進(jìn)一步與 標(biāo)記分子[HSC]上的對(duì)應(yīng)的特異性反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，從而形成牢固的共價(jià)鍵標(biāo)記。這里的合成可以是 在生物來(lái)源的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸或寡聚PNA上進(jìn)行的合成一個(gè)化學(xué)功能基團(tuán)。

本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之五，是直接在DNA、RNA或寡聚核苷酸酸分子合成時(shí)，在其末端加 上一個(gè)這樣的特異性化學(xué)功能團(tuán)，作為后續(xù)標(biāo)記過(guò)程的報(bào)告分子。只是這樣的核酸或寡聚核苷酸酸序列 根據(jù)不同的分子生物學(xué)過(guò)程，可以分別有不同的序列和功能要求。

如果靶基因是mRNA，那么可以通過(guò)合成與之5’-末端的poly(A)序列互補(bǔ)的oligo(dT)。同時(shí)，在 oligo(dT)的5’-末端加上氨基或者巰基等基團(tuán)，形成5’-H2N-Oligo(dT)-3’或5’-HS-Oligo(dT)-3’等。之后， 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在新合成的引物上，以靶基因mRNA為模板合成序列互補(bǔ)的5’-H2N-Oligo(dT) -cDNA-3’，或5’-HS-Olig(dT)-cDNA-3’新的靶基因序列。該序列將被用于與基因芯片上的基因探針直 接雜交。并與后續(xù)表面固定有可與上述特異性化學(xué)功能團(tuán)[氨基、巰基等]反應(yīng)并形成共價(jià)鍵連接的基團(tuán) 的高荷信號(hào)載體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記反應(yīng)。

通過(guò)酶學(xué)方法[如末端轉(zhuǎn)移酶[terminal?transferase，縮寫為TT]、逆轉(zhuǎn)錄酶、(Taq)DNA聚合酶、 Klenow酶[統(tǒng)稱為酶，并用字母E表示]]合成的、或化學(xué)方法合成的標(biāo)記反應(yīng)可以用如下通式表示，

樣品制備、雜交和標(biāo)記過(guò)程的程式可以表示如下，

1.模板(T，可以是各種單鏈或雙鏈的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸)在酶(E)或 化學(xué)作用下，形成靶序列ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA、RNA、寡聚核苷酸或核酸類似 物序列]，

???????T→ZNA(Y)n??????????????????????????????[I]

2.靶序列ZNA(Y)n與基因芯片上的核酸探針雜交，

???????ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n????????????[II]

3.表面修飾有可與Y-報(bào)告基團(tuán)特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)接頭基團(tuán)Y’-的高荷信號(hào)載體與 基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，

??????_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→_XNA:ZNA(Y)n-p[-Y-Y’-]p-HSC(Y’)m-p[III]

上述n，m，p為從0到無(wú)窮大的任一自然數(shù)數(shù)值1，2，3...。但對(duì)上述技術(shù)情景之一、之三，p＝1 時(shí)為最佳值。

XNA為基因芯片上的核酸探針或肽核酸探針序列，HSC為高荷信號(hào)載體。

Y-可以是但不限于：地高辛-，抗地高辛抗體-、氨基[如氨基烯丙基-，aa-，N-羥基琥珀酰亞胺 基]等[見(jiàn)下表]。

由模板制備靶序列的酶[E]和酶學(xué)作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之組合，

1.末端轉(zhuǎn)移酶，[Terminal?Deoxyribonucleotidyl?Transferase，簡(jiǎn)稱TdT]及在DNA的3’- 末端加上一個(gè)[雙脫氧核苷(dideoxynucleotides，如2’，3’-雙脫氧腺嘌呤-5’-三磷酸 (2′，3′-Dideoxy-adenosine?5′triphosphate，ddATP)，ddUTP，ddTTP，ddCTP)] 或多個(gè)[脫氧核苷(deoxynucleotides，如(dUTP，dTTP，dCTP等)]堿基的末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)，

2.逆轉(zhuǎn)錄酶，包括但不限于Superscript?II?RT、禽白血病毒(Avian?Myoblastosis Virus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，或者StrataScript逆 轉(zhuǎn)錄酶、PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶，可用于逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中摻入媒介核苷，如Taq酶，

3.DNA聚合酶，如Taq酶，大腸埃希菌或大腸桿菌DNA聚合酶I，

4.具有5’→3’DNA合成活性的DNA聚合酶的Klenow片段，

5.RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌體RNA聚合酶[phage?RNA?polymerases]， 可用于體外轉(zhuǎn)錄[in?vitro?transcription]法標(biāo)記，Superscript?II?RT，

6.DNA聚合酶I[polymerase?I]。

Y-功能團(tuán)修飾核苷[modified?nucleotides]可以是，但不限于：

1.氨基烯丙基-核苷，如氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]，

2.生物素化的雙脫氧核苷，如生物素化的雙脫氧尿嘧啶[biotin-16-ddUTP]、

3.?地高辛修飾的雙脫氧核苷，如DIG-11-ddUTP，雙脫氧尿嘧啶三磷酸[djdeoxyuridine-triphosphate]， 如(e.g-，IG-ddUTP)，

其中的Y-和Y’-可以分別是，但不限于如下表所示的反應(yīng)對(duì)之一或它們的組合； Y-或Y’- ZNA-Y、NTP-Y、 ZNA-、NTP、 dNTP-Y和ddNTP實(shí)例 dNTP、ddNTP實(shí)例 Phenyldiboronic?acid，PDBA， SHA- ? 地高辛-，DIG- 地高辛-，抗地高辛抗體- ? ? 氨基，如氨基烯丙基-，aa-，N-羥 基琥珀酰亞胺基-， 氨基-[aminolinker-]，地高辛-， DIG-NHS酯，N-羥基琥珀酰亞胺基 [NHS-]-，抗地高辛抗體-， 生物素基-，親和素-，鏈霉親和素- ? 氯甲基[chloromethyl]、氨基 ? 巰基[sulfhydryl]，鹵乙酸基 [Haloacetyls]、烷基鹵[Alkyl ?halide]衍生物、馬來(lái)酰亞胺 [Maleimides]、吖啶[Aziridines]； 丙烯酰[Acryloyl]衍生物；芳基化 [Arylating]試劑；巰基-雙硫化合 物置換試劑等 捕獲序列，5’-ATTCGGAA-3’； 接頭序列，3’-TAAGCCTT-5’ ? ? ? ? PDBA-UTP ? ? DIG-11-UTP Digoxigenin-11-ddUTP ? ? aa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.# 8437) DIG-X-NHS酯 ? ? Biotin-UTP，biotin-dCTP， biotin-dUTP，biotin-ddUTP等 aa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.# 8437) 5’-HS-C6-Oligo(dT) -cDNA-OH-3’， 5’-HS-cDNA-OH-3’等 ? ? ? ? 攜帶捕獲序列的寡聚核苷酸酸 引物[oligodeoxynucleotide primers?containing?capture secquences]，如3’-oligo(dT)- TAAGCCTT-5’或3’-oligo(dT)- GTAGCAAT-5’ 核苷三磷酸-，UTP-、ATP-、 ? CTP-、GTP-、TTP- ? 雙脫氧核糖核苷三磷酸 -[ddNTP-]，如ddATP-，ddCTP-， ddUTP-，ddGTP-，ddTTP-. ? ? ? ? ? 脫氧核糖核苷三磷酸[dNTP]，如 dATP，dCTP，dUTP，dGTP，dTTP. 同上 ? 5’-cDNA-OH-3’，5’-Oligo(dT) -3’ ? ? ? ? ? 寡聚核苷酸酸引物，如oligo(dT)， oligo(dA)... ? ? ? ?

這些修飾核苷的特點(diǎn)是，可以在核酸合成、轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，能夠在酶的作用下，被摻入到合 成后的靶基因序列中去。

本發(fā)明的間接標(biāo)記反應(yīng)，可以是，但不限于如下過(guò)程之一或不同過(guò)程之組合，

(1)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal?Deoxyribonucleotidyl?Transferase，縮寫為TdT)作用下將 三磷酸脫氧核苷酸中的單磷酸核苷轉(zhuǎn)移到DNA分子的3′-端羥基上的反應(yīng)。末端脫氧核 苷酸[TdT]轉(zhuǎn)移過(guò)程。

(2)用Klenow酶的5’→3’DNA合成活性、以所有可能的堿基序列的寡聚核苷酸酸之混合物 為引物的DNA合成過(guò)程，隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)，

(3)在逆轉(zhuǎn)錄酶[Reverse?transcriptase]作用下對(duì)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，

(4)用捕獲序列連接的寡聚核苷酸酸引物進(jìn)行的雜交標(biāo)記反應(yīng)。

HSC表示以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號(hào)載體，它可以是高聚 物或共聚物熒光微球、表面或內(nèi)部固定有熒光染料或其他信號(hào)分子的硅氧[或者二氧化硅]微小顆粒[silica beads]、半導(dǎo)體等無(wú)機(jī)物的量子點(diǎn)[quantum?dots]、半導(dǎo)體等無(wú)機(jī)物納米晶[nanocrystal?particles]、樹枝狀 高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高聚物納米球[dendrimeric?stars]、膠束[micelles]、分子磁體 [molecular?magnets]、膠囊式微球[encapsulated?spheres]、膠體納米金[colloidal?gold?nanoparticles]、電致發(fā) 光分子[electroluminescent?molecules]、多聚二茂金屬共聚物微球[polymetalcene?block?copolymers，如多聚 二茂鐵共聚物[polyferrocene?block?copolymers，PFC]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]共聚物微球 或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光 [chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、 光學(xué)發(fā)射光波長(zhǎng)、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不 同載體之間的相互組合，其表面修飾有可以與通式(I)，(II)，(III)化合物中的探針?lè)肿咏宇^Y’-特異性反應(yīng)的 功能團(tuán)或作用對(duì)Y-。

實(shí)例一用生物素或地高辛修飾的雙脫氧核苷的末端標(biāo)記

該種方法的特點(diǎn)是只在每個(gè)被標(biāo)記模板基因或靶基因的末端僅定量標(biāo)記一個(gè)特異性功能團(tuán)Y-，從而 可以保障信號(hào)線性比例放大。當(dāng)Y-為生物素基-、或地高辛基時(shí)，技術(shù)過(guò)程如下：

一、樣品制備

用地高辛修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[簡(jiǎn)寫為DIG-ddUTP]或生物素化的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[簡(jiǎn)寫 為Biotin-ddUTP]核苷進(jìn)行寡核苷酸的3’-末端標(biāo)記。

末端轉(zhuǎn)移酶[Terminal?Transferase]可用來(lái)在單鏈[ssDNA]、雙鏈[dsDNA]以及寡聚核苷酸 [oligonucleotides]的3’-末端加上單個(gè)經(jīng)修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[dideoxyuridine?triphosphate]，如 (e.g?，DIG-ddUTP)。過(guò)程如下：

1.將純化的試驗(yàn)組寡聚核苷酸溶解在無(wú)菌的雙蒸水中，

2.在雙蒸水中，制備1mM的X-ddUTP[X＝DIG-，Biotin-，氨基烯丙基(aminoallyl-)或氨基己基 (aminocaproyl-)等]，

3.將下述成分在冰浴中加入到微離心管：1)4μl的5×反應(yīng)緩沖溶液[1M鉀，0.125M?Tris-HCl，1.25mg/ml BSA；pH6.6，25℃](試管1)。2)4μl的25mM?CoCl2(試管2)。3)100pmole寡聚核苷酸[模板或靶基 因，或cDNA]。4)1μl?1mM?DIG-ddUTP(試管3)，或1μl?1mM?Biotin-ddUTP。5)1μl(50U)末端 轉(zhuǎn)移酶(200mM甲次砷酸鉀[potassium?cacodylate]，1mM?EDTA，200mM?KCl，0.2mg/ml，小牛血清 蛋白[BSA])，50％丙三醇[glycerol]，pH6.5[25℃](試管4).6)加入雙蒸水直至中容量20μl.

4.將上述反應(yīng)成分充分混合并簡(jiǎn)單離心，

5.在37℃下溫育15分鐘，然后放置到冰上。

6.用下述方法之一終止反應(yīng)：

1)將200μl?0.2M?EDTA(pH8.0)和1μl的糖原質(zhì)溶液混合[濃度為20mg/ml的雙蒸水]。

2)在反應(yīng)混合物加2μl的糖原質(zhì)-EDTA混合液。

7.用下述步驟沉淀標(biāo)記了的寡聚核苷酸[可選步驟]：[1]在反應(yīng)試管中，加入2.5μl?4M的LiCl和75μl預(yù) 先在-15℃到-25℃冰鎮(zhèn)的絕對(duì)乙醇。充分混勻：[2]在-70℃沉淀30分鐘；[3]在13,000×g和2-8℃條件 下離心15分鐘；[4]棄上清液；[5]用50μl冰鎮(zhèn)的70％(v/v)洗滌沉淀小粒；[6]在2-8℃條件下離心5 分鐘；[7]棄上清液；[8]在真空下干燥沉淀小粒。

8.將沉淀小粒溶解在微量無(wú)菌、雙蒸水中，然后在雜交緩沖溶液中稀釋等量的探針溶液以適合直接使 用。

9.用上述與步驟1-8同樣方法制備一個(gè)參照組報(bào)告分子標(biāo)記的cDNA或寡聚核苷酸溶液。

生物素化的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[Biotin-16-ddUTP]、地高辛修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸 [Digoxigenin-11-ddUTP]、重組末端轉(zhuǎn)移酶[自E.Coli]等購(gòu)自Roche?Applied?Science公司。其它常規(guī) 試劑有市售。

二、雜交

下述過(guò)程介紹將兩種樣品[標(biāo)記了的參照組cDNA和試驗(yàn)組cDNA]雜交到一個(gè)寡聚核苷酸微點(diǎn)陣上 去。

材料：總?cè)莘e為42ul試驗(yàn)組和對(duì)照組報(bào)告分子標(biāo)記了的cDNA或寡聚核苷酸溶液[各21ul]20×，SSC (Ambion?Cat#9765)，10％SDS，雜交室，寡聚核苷酸微點(diǎn)陣；98℃?heating?block；42℃水浴；2X雜 交緩沖溶液：50％甲醛，10x?SSC，0.2％SDS

技術(shù)流程：

1.加入12ul競(jìng)爭(zhēng)性DNA?mix；

2.確定樣品體積，并加水直到總體積為54微升，

3.將樣品在98℃加熱3分鐘，

4.將2x雜交緩沖溶液和上述cDNA或寡聚核苷酸報(bào)告分子標(biāo)記溶液在42℃下溫育20分鐘，

5.將玻片微點(diǎn)陣在100℃的dH2O中加熱10min，再用輕緩空氣流干燥，

6.將蓋玻片洗凈、干燥并放置在玻片微點(diǎn)陣上，

7.將60ul(1x體積)的2X雜交緩沖液加入到上述cDNA或寡聚核苷酸報(bào)告分子標(biāo)記溶液并充分混 合，

8.將雜交溶液加載到蓋玻片下面；通過(guò)毛細(xì)管作用讓雜交溶液緩慢從微點(diǎn)陣的一端被吸向另一端， 并覆蓋微點(diǎn)陣的全部面積。

9.將2個(gè)各5ul的2X?SSC加注到雜交溶液未覆蓋的部位。

10.封閉雜交室并沉浸在42℃的水浴中過(guò)夜。

11.將玻片微點(diǎn)陣從雜交室中移走。

12.將其浸入一個(gè)50ml的裝有45ml?2X?SSC/0.1％SDS的試管中，并使蓋玻片通過(guò)重力作用自然與 玻片微點(diǎn)陣分離。

13.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml?2X?SSC/0.1％SDS的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。

14.重復(fù)步驟13。

15.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml?2X?SSC的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。

16.重復(fù)步驟15。

17.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml?2X?SSC的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。

18.重復(fù)步驟17。

19.將微點(diǎn)陣浸入到0.06X?SSC的溶液中并轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中。

20.將玻片微點(diǎn)陣從0.06X?SSC溶液中那走，并放入一個(gè)空試管中，并立即在800rpm離心2-3min。

要確保微點(diǎn)陣在離心前處于濕潤(rùn)狀態(tài)。

三、標(biāo)記

標(biāo)記過(guò)程即是使高荷信號(hào)載體[HSC]表面固定的可與靶基因上連接的報(bào)告分子特異性反應(yīng)的基團(tuán)或 分子與之反應(yīng)并形成共價(jià)鍵偶聯(lián)的過(guò)程。為此，需首先合成這種HSC。以本實(shí)施例中作為報(bào)告分子的生 物素而言，應(yīng)該合成表面固定有親和素的HSC。[合成過(guò)程參見(jiàn)本人的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)：基因芯片酶法 微球放大標(biāo)記。申請(qǐng)?zhí)枺?31420818]。

四、洗脫

洗脫緩沖溶液A：SDS?2％，2X?SSC。洗脫緩沖溶液B：SDS?1％，0.06X?SSC。

洗脫緩沖溶液C：ddH2O。

1.將cDNA或寡聚核苷酸微點(diǎn)陣從經(jīng)過(guò)標(biāo)記處理過(guò)程的反應(yīng)室中取出，

2.轉(zhuǎn)移到裝有400ml?1X洗脫緩沖溶液A的Wash?Station。

3.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌5min。

4.轉(zhuǎn)移到裝有400ml?1X洗脫緩沖溶液B的Wash?Station.

5.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌5min.

6.轉(zhuǎn)移到裝有400ml?1X洗脫緩沖溶液C的Wash?Station.

7.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌2min。

8.用實(shí)驗(yàn)用擦紙將微點(diǎn)陣上的剩余緩沖溶液瀝干。

9.在500×g條件下離心。

10.在掃描上對(duì)微點(diǎn)陣進(jìn)行掃描，獲取熒光圖像。

實(shí)例二用氨基修飾的雙脫氧腺嘌呤的末端標(biāo)記

該種方法的原理和過(guò)程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。

胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤-5’-三磷酸 (3′-amino-2′，3’-dideoxyadenosine-5′-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddATP，或AddATP。(TriLink Biotechnologies?Inc，San?Diego，CA)]。

實(shí)例三用氨基修飾的雙脫氧胞嘧啶的末端標(biāo)記

該種方法的原理和過(guò)程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。

胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶-5’-三磷酸 (3’-amino-2’，3’-dideoxycytidine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddCTP，或AddCTP.(TriLink Biotechnologies?Inc，San?Diego，CA)]。

實(shí)例四用氨基修飾的雙脫氧鳥嘌呤的末端標(biāo)記

該種方法的原理和過(guò)程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。

胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤-5’-三磷酸 (3’-amino-2’，3’-dideoxyguanosine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddGTP，或AddGTP。(TriLink Biotechnologies?Inc，San?Diego，CA)]。

實(shí)例五用氨基修飾的雙脫氧鳥嘌呤的末端標(biāo)記

該種方法的原理和過(guò)程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。

胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧尿嘧啶-5’-三磷酸 (3’-amino-2′，3’-dideoxyuridine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddUTP，或AddUTP。(TriLink Biotechnologies?Inc，San?Diego，CA)]。

實(shí)例六通過(guò)捕獲序列和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量

Stears，Robin?L.等人利用樹狀分子[Dendrimer]通過(guò)捕獲序列對(duì)微點(diǎn)陣進(jìn)行信號(hào)放大可以將RNA樣 品需求量減少16倍。本實(shí)施例使用熒光微球等為HSC。本方法允許在單個(gè)基因芯片上進(jìn)行多通道檢測(cè)。 和樹狀分子一樣，由于熒光微球等在信號(hào)放大能力上優(yōu)于前者，所以會(huì)產(chǎn)生更高的信噪比，并更容易對(duì) 雜交在基因芯片上的cDNA單個(gè)計(jì)數(shù)，從而確立較之于樹狀分子更好的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

另外，本實(shí)施例所使用的方法比DNA樹狀分子方法更簡(jiǎn)單、快捷。

在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，目前通用的將熒光分子修飾核苷酸摻入進(jìn)去的Cy3/Cy5方法需要大量的起始樣 品，多達(dá)50μg的總RNA或1μg的mRNA。

本實(shí)施例以高分子熒光微球或二氧化硅熒光微球?yàn)镠SC。

1.HSC結(jié)合探針的合成經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄(Modified?RT，簡(jiǎn)稱mRT)引物序列合成如下(由 Integrated?DNA?Technologies公司)(5’to?3’)：cap3D1，g?gCg?ggA?CAg?AAg?ACg?CgC?AgT?gAg TCg?gCC，oligo?d(T)，cap3D2，A?CCg?gAg?Cgg?CAC?ggg?AAA?ATg?AgC?AAC?Agg，oligo?dT。1皮摩爾 的mRT引物可用于40μg的總RNA分析。

2.HSC含有下列接頭序列用于RT反應(yīng)：cpl3D1(與cap3D1互補(bǔ))，ggC?CgA?CTC?ACT?gCg?CgT CTT?CTg?TCC?CgC?C；cpl3D2(與cap3D2互補(bǔ))，CCT?gTT?gCT?CTA?TTT?CCC?gTg?CCg CTC?Cgg?T(Genisphere)。

3.RT反應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的GIBCO，SuperScript?RT?II技術(shù)流程進(jìn)行。反應(yīng)進(jìn)行完成之后，加入3.5μl 的0.5M?NaOH/50mM?EDTA，并且被加熱到65℃?10min以使DNA/RNA雜交雙鏈變性解 鏈。

4.用5μl的1M?Tris，pH?7.5溶液中和該反應(yīng)。對(duì)于雙重標(biāo)記(雙色標(biāo)記)的檢測(cè)，用直接摻入法Cy3/Cy5 RT反應(yīng)技術(shù)流程見(jiàn)Stears?R.L.等人和DeRisi?JL等人的所介紹的高密度DNA微點(diǎn)陣直接標(biāo)記法進(jìn) 行。

5.對(duì)于HSC檢測(cè)，2.0μl兩種各自不同激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)[分別為543nm/570nm和640nm/675nm] 的二氧化硅熒光微球[激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)接近Cy3-和Cy5-標(biāo)記系統(tǒng)](上海邁克沃生物科技公司)被重 新懸浮于15μl的4×SSC-2％SDS并被施加到微點(diǎn)陣玻璃片上。微點(diǎn)陣用蓋玻片蓋好，在基因 芯片雜交室(Telechem?International)中和65℃條件下溫育6-8h。按Stears?R.L.等人和DeRisi JL等人的所介紹的方法雜交、洗脫并在ScanArray?3000激光共聚焦掃描儀(GSI?Lumonics)上 進(jìn)行檢測(cè)。

6.信號(hào)和本底噪音用Imagene的定量軟件進(jìn)行定量分析。以微點(diǎn)陣網(wǎng)格中每個(gè)圓圈中的平均像素光 強(qiáng)度信號(hào)作為信號(hào)測(cè)定值。以微點(diǎn)陣中沒(méi)有cDNA的空白點(diǎn)的平均像素光強(qiáng)度為平均本底噪音[背 景]并被作為網(wǎng)格圓圈外部平均像素的光強(qiáng)度，用于計(jì)算特定的信號(hào)值。

7.HSC試劑制備選取??表面修飾有伯胺基的上述兩種光學(xué)特性的二氧化硅熒光微球[上海邁克沃 生物科技公司]為HSC。通過(guò)DNA合成儀合成5′-末端為巰基的5′-SH-mRT引物序列。進(jìn)行化學(xué) 偶聯(lián)時(shí)，通過(guò)離心沉淀將HSC沉淀為固態(tài)小粒，溶解在絕對(duì)乙醇中。在室溫條件下，在試管內(nèi)加 入上述HSC、5′-SH-mRT引物序列以及雙異功能基的聚乙烯醇[PEG]連接臂[NHS-PEG-MAL]的 絕對(duì)乙醇溶液，經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)合成表面固定有接頭序列的 HSC-(NH-CO-PEG-MAL-S-5′-mRT-3′)n，簡(jiǎn)寫為HSC-(mRT)n。反應(yīng)混合物再經(jīng)離心沉淀、棄 去上清液、再次將沉淀溶解在絕對(duì)乙醇中、用絕對(duì)乙醇洗滌沉淀小粒。在避光、-20℃存儲(chǔ)。使用 時(shí)，用無(wú)菌雙蒸水制備的1％SDS溶液溶解沉淀小粒至固體物濃度為1-5％。

8.半導(dǎo)體量子點(diǎn)作為HSC??因?yàn)槊總€(gè)半導(dǎo)體量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度一致性比較強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)誤差較小，一般 可以控制在4-5％，所以，作為標(biāo)記試劑的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題參見(jiàn)Stears?Robin?L.等人的方法確定。

9.高分子或二氧化硅熒光微球作為HSC試劑的標(biāo)準(zhǔn)化??對(duì)這兩種光學(xué)微球，雖然它們的標(biāo)準(zhǔn)誤差較 樹狀分子大，一般隨著體積增大，直徑標(biāo)準(zhǔn)誤差變小。比如Duke?Scientific公司的高分子熒光微球 的CV[coefficient?of?variation]一般直徑在0.90um時(shí)，CV＜3％；0.03微米時(shí)，直徑的CV＜-20％。由 于基因芯片的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)通常是大量分子的標(biāo)記，所以，比較可行的方法是對(duì)這種標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù) 據(jù)分析。首先，用體式熒光顯微鏡[Nikon或Olympus]對(duì)散布在空白玻片上限定區(qū)域內(nèi)的熒光微球 進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。然后，在基因芯片激光共聚焦掃描儀上，對(duì)該限定區(qū)域上在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)生的熒 光信號(hào)總強(qiáng)度進(jìn)行積分。這樣就可以求得平均每個(gè)HSC的信號(hào)強(qiáng)度。獲得這個(gè)平均值之后，可以根 據(jù)基因芯片的檢測(cè)中測(cè)得的某個(gè)基因點(diǎn)的熒光總強(qiáng)度求的其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的固定在該點(diǎn)上的雜交基 因的個(gè)數(shù)。

實(shí)例七通過(guò)報(bào)告分子和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量

本實(shí)施例與實(shí)例六相近。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件和過(guò)程與實(shí)例六相同或相近。它是直接在DNA、RNA或 寡聚核苷酸酸分子合成時(shí)，在其末端加上一個(gè)特異性生物或化學(xué)功能團(tuán)，作為后續(xù)標(biāo)記過(guò)程的報(bào)告分子。 通式I、II、III中，XNA為mRNA，ZNA為5’-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’，ZNA(Y)n為 5’-H2N-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’或5’-HS-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’等，HSC-Y′n中的Y′-為 琥珀酰亞胺酯或馬來(lái)酰亞胺酯，E為逆轉(zhuǎn)錄酶[Reverse?Transcriptase，RT]，化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記反應(yīng)過(guò)程同 實(shí)例六。

實(shí)例八隨機(jī)報(bào)告引物法(Random?Reporter?Primer?Method，簡(jiǎn)稱RRP方法)

使用TriLink?Biotechnologies公司生產(chǎn)的5’-末端帶有C12連接臂的氨基修飾的寡聚核苷酸。合成 帶有5′-C12-NH2各種可能序列的六聚核苷酸[Hexamers]或八聚核苷酸 [Octomers][3′-oligonucleotide-5′-OPO3--(CH2)n-NH2，n為自然數(shù)。產(chǎn)品號(hào)：0-0003、0-0004、0-0005 等]作為RT反應(yīng)引物，即RRP。用Charlie?C.Xiang等人的RNA純化、逆轉(zhuǎn)錄、雜交、洗脫及檢測(cè)條件， 進(jìn)行試驗(yàn)。

HSC可以選取Duke?Scientific，Molecular?Probes等公司的表面修飾氨基的熒光聚苯乙烯微球。HSC 標(biāo)記反應(yīng)過(guò)程—化學(xué)偶聯(lián)參見(jiàn)實(shí)例六。

實(shí)例九用氨基烯丙基核苷酸合成RRP

在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dUTP [5-Aminoallyl—2′-deoxyuridine-5′-Triphosphate(TriLink?Biotechnologies，Inc)]為RRP，通過(guò) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。其他反應(yīng)過(guò)程及條件可參見(jiàn)實(shí)例六。

實(shí)例十用氨基烯丙基核苷酸合成RRP

在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dCTP [5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink?Biotechnologies，Inc]為RRP，通過(guò) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。其他反應(yīng)過(guò)程及條件可參見(jiàn)實(shí)例九。

實(shí)例十一5’-氨基-Oligo-dT報(bào)告引物法(5’-amino-Oligo-dT?Reporter?Primer?Method，簡(jiǎn)稱 5’-H2N-OT-RP)

在cDNA合成中，用5’-NH2修飾過(guò)的Oligo-dT合成5’-NH2-Linker-Oligo(dT)-OH-3’為報(bào)告引物，通 過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-NH2-Linker-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。其他反應(yīng)過(guò)程及條件可參見(jiàn)實(shí)例九。

實(shí)例十二5′-巰基-Ollgo-dT-3’報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HS-OT-RP)

在cDNA合成中，用5’-末端C6巰基連接臂修飾過(guò)的Oligo-dT合成 5’-HS-C6-Oligo(dT)-OH-3’[TriLink?Biotechnologies，Inc]]為報(bào)告引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 5’-HS-C6-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。HSC(Y’)中的Y’為氨基，雙異功能團(tuán)連接臂仍然選用NHS-PEG-MAL 或NHS-PEG-VS[琥珀酰亞胺基-聚乙二醇(連接臂)-乙烯基砜]。偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)實(shí)例六。其他反應(yīng)過(guò) 程及條件見(jiàn)實(shí)例九。

實(shí)例十三5′-巰基-RP-3’報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HS-RRP-3’)

在cDNA合成中，用客戶訂做的方法合成各種可能序列的5’-末端-C6-巰基連接臂修飾過(guò)的六聚核 苷酸或八聚核苷酸5’-HS-C6-RP-OH-3’，作為5’-巰基隨機(jī)報(bào)告引物(5′-HS-RRP-3)[TriLink Biotechnologies，Inc提供此業(yè)務(wù)。產(chǎn)品編號(hào)：O-0016]，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-HS-cDNA-OH-3’。 HSC(Y’)中的Y’為氨基，雙異功能團(tuán)連接臂仍然選用NHS-PEG-MAL或NHS-PEG-VS[琥珀酰亞胺基 -聚乙二醇(連接臂)-乙烯基砜]。偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)實(shí)例六。其他反應(yīng)過(guò)程及條件見(jiàn)實(shí)例九。

實(shí)例十四??5′-羧基-RP-3′報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HOOC-RRP-3′)

在cDNA合成中，用客戶訂做的方法合成各種可能序列的5’-末端-羧基-DADE連接臂修飾過(guò)的六聚 核苷酸或八聚核苷酸5’-HOOC-DADE-RP-OH-3’，作為5’-巰基隨機(jī)報(bào)告引物 (5′-HOOC-RRP-3)[TriLink?Biotechnologies，Inc提供此業(yè)務(wù)。產(chǎn)品編號(hào)：O-0015]，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)合成5’-HOOC-cDNA-OH-3’。RP為六聚核苷酸或八聚核苷酸。

HSC(Y’)中的Y’為氨基。偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程無(wú)須使用雙異功能團(tuán)連接臂。選用水溶性碳二亞胺 [1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC]為偶聯(lián)劑。其他反應(yīng)過(guò)程及條件見(jiàn)實(shí) 例九。共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)如下：

熒光微球，10％固體濃度，250μl。EDAC，40mg。

緩沖液A：NaH2PO4-10mM，pH?6.0。

偶聯(lián)方法：

1.將所有可能序列的5′-HOOC-RRP-3′混合物溶解在緩沖溶液A中。

2.在5毫升的玻璃試管中，將1000μl的緩沖溶液A與250微升10％的HSC混合。

3.將EDAC溶解在緩沖溶液A中，至最終濃度為20mg/ml。

4.將125μl的溶解的EDAC加入到稀釋的HSC懸浮液中，混合。

5.將上述混合物在室溫下輕微振蕩溫育2小時(shí)，或在4℃下過(guò)夜。

6.用緩沖溶液A洗滌兩次并重新懸浮于下述雜交緩沖溶液中。

實(shí)例十五氯甲基化的HSC與氨基烯丙基-RRP

在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯內(nèi)基dCTP [5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink?Biotechnologies，Inc]合成RRP，再 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。

HSC(Y’)n選用Merck?Eurolab?France公司的表面修飾了氯甲基的熒光微球。Y’-為氯甲基[ CH2Clgroup]。HSC-[CH2Cl]n與氨基的共價(jià)偶聯(lián)方法如下：

1.將10％(100mg/ml)的ESTAPOR_微球用洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液(1ml/10ml)洗滌兩次。緩沖溶液為： PBS，pH7.5。

2.在5毫升的洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液中重新懸浮[超聲波或搖擺法振蕩]。

3.將RRP溶解在5毫升的洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液中。

4.在室溫和不斷振蕩下，反應(yīng)3-4小時(shí)。洗滌，并將之重新懸浮在10毫升的反應(yīng)終止溶液中，室溫下 輕度振搖混合30分鐘。反應(yīng)終止溶液的伯胺基來(lái)源：30-40mM羥胺[hydroxylamine]，乙醇胺 [ethanolamine]或甘氨酸[glycine]等，含有0.05-1％(w/v)封閉分子[Blocking?molecules](BSA， Casein，Pepticase，Tween?20，Triton?X-100，PE?G，Sera，或者IgG).

5.洗滌，并以10mg/ml濃度重新懸浮于存儲(chǔ)緩沖溶液[存儲(chǔ)緩沖溶液：pH?7-7.5有0.01-0.1％(w/v)封 閉分子和NaN3(0.09％).]。

6.存儲(chǔ)到4℃直到應(yīng)用。

其他反應(yīng)過(guò)程及條件可參見(jiàn)實(shí)例九。