檢測方法
閱讀：984發(fā)布：2020-06-18
專利匯可以提供檢測方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本文提供了用于從人類或非人類動物 糞便 樣品分離真核核酸的材料和方法。還提供了分析存在于人類或非人類動物糞便樣品中的真核 生物 標(biāo)志物的方法。，下面是檢測方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種從糞便樣品分離真核核酸的方法，所述方法包含：
a)將所述樣品與緩沖劑、表面活性劑和核糖核酸酶抑制劑混合以形成懸浮液；
b)將所述懸浮液分離成富含真核細(xì)胞的部分和富含細(xì)菌細(xì)胞的部分，并且保留所述富含真核細(xì)胞的部分；
c)向所述富含真核細(xì)胞的部分添加離液劑和任選地表面活性劑以形成裂解物；
d)將所述裂解物分級成細(xì)胞碎片層，包含真核核酸的層，和脂質(zhì)層；和
e)收集所述包含真核核酸的層和任選地所述脂質(zhì)層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含提供糞便樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述糞便樣品是人類糞便樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述糞便樣品是非人類動物糞便樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非人類動物選自由以下組成的群組：狗、貓、非人類靈長類動物、反芻動物、熊科動物、馬科動物、豬、綿羊、山羊、駱駝、水牛、鹿、麋鹿、駝鹿、鼬科動物、兔、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠、厚皮動物、犀牛和灰鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述非人類動物是狗。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述非人類動物是貓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離步驟包含離心。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離步驟包含基于柱的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離步驟利用結(jié)合真核細(xì)胞的靶向探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離步驟利用差異過濾。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a和b重復(fù)一次、兩次、三次、四次或更多次。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分級步驟包含離心。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分級步驟利用特異性結(jié)合真核核酸的靶向探針。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分級步驟利用差異過濾。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟d和e重復(fù)兩次或更多次。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用小孔尖端收集所述包含真核核酸的層。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含從所述收集的包含真核核酸的層提取所述真核核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述提取方法是基于磁性顆粒、基于柱、基于過濾器、基于珠?；蚧?a href='/zhuanli/list-14093-1.html' target='_blank'>有機(jī)溶劑的方法。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸包含DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA，或任何DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA的組合。
21.一種檢測糞便樣品中的真核生物標(biāo)志物的方法，所述方法包含：通過微陣列測序、分子條形碼、探針捕獲、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、ddPCR、RT-PCR、RT-qPCR或核酸測序分析權(quán)利要求1的所述提取的核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述真核生物標(biāo)志物選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的生物標(biāo)志物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述真核生物標(biāo)志物是B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白。
24.一種確定受試者是否有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的方法，所述方法包含：
a)測量來自所述受試者的生物樣品中的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；
b)比較所述生物樣品中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物樣品包含根據(jù)權(quán)利要求1至20所述的方法分離的人類核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因含于圖5A中所示的200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇內(nèi)并且含于圖5B中所示的與所述結(jié)腸直腸癌相關(guān)的共同途徑內(nèi)。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的所述生物標(biāo)志物。
28.一種為患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的受試者選擇臨床計劃的方法，所述方法包含：
a)測量來自所述受試者的生物樣品中的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；
b)比較所述生物樣品中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險；和
c)基于步驟b選擇臨床計劃。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述生物樣品包含根據(jù)權(quán)利要求1至20所述的方法分離的人類核酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因含于圖5A中所示的200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇內(nèi)并且含于圖5B中所示的與所述結(jié)腸直腸癌相關(guān)的共同途徑內(nèi)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的所述生物標(biāo)志物。
32.一種確定非人類動物是否有胃腸病癥風(fēng)險的方法，所述方法包含：
a)測量來自所述受試者的生物樣品中的一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因的表達(dá)水平；
b)比較所述樣品中的所述一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因的所測量表達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者有胃腸病癥風(fēng)險。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述生物樣品包含根據(jù)權(quán)利要求1至20所述的方法分離的非人類動物核酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述胃腸病癥包含胃腸淋巴瘤或炎性腸病。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述非人類動物是貓。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述非人類動物是狗。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述生物樣品包含糞便樣品。
檢測方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2016年10月27日提交的美國臨時申請第62/413,708號、2017年6月22日提交的美國臨時申請第62/523,511號和2017年8月17日提交的美國臨時申請第62/547,
046號的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請的公開內(nèi)容以全文引用的方式明確地并入本文中。
046號的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請的公開內(nèi)容以全文引用的方式明確地并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)
[0004] 胃腸病癥，例如胃腸癌，和其它消化疾病，如炎性腸病、腸易激綜合征和克羅恩病(Crohn's?disease)，是普遍存在的。在美國，胃腸病癥估計每年影響6000萬至7000萬人。對于一些病癥，早期篩查和診斷已經(jīng)使得患者的死亡率降低和生活品質(zhì)提高。然而，標(biāo)準(zhǔn)診斷
方法，如結(jié)腸鏡檢查，是侵入性的，耗時的，并且與相對高的成本相關(guān)。胃腸病癥還可以影響動物，例如，作為寵物飼養(yǎng)的動物，如貓和狗。篩查此類病癥的獸醫(yī)學(xué)方法同樣是侵入性的
并且成本很高。一直需要在人類和動物中診斷胃腸病癥的非侵入性方法。
方法，如結(jié)腸鏡檢查，是侵入性的，耗時的，并且與相對高的成本相關(guān)。胃腸病癥還可以影響動物，例如，作為寵物飼養(yǎng)的動物，如貓和狗。篩查此類病癥的獸醫(yī)學(xué)方法同樣是侵入性的
并且成本很高。一直需要在人類和動物中診斷胃腸病癥的非侵入性方法。
發(fā)明內(nèi)容
[0005] 本文提供了用于從糞便樣品分離真核核酸的材料和方法。所述方法可以包括以下步驟：將所述樣品與緩沖劑、表面活性劑和核糖核酸酶抑制劑混合以形成懸浮液；將所述懸
浮液分離成富含真核細(xì)胞的部分和富含細(xì)菌細(xì)胞的部分，并且保留所述富含真核細(xì)胞的部
分；向所述富含真核細(xì)胞的部分添加離液劑和任選地表面活性劑以形成裂解物；將所述裂
解物分級成細(xì)胞碎片層，包含真核核酸的層，和脂質(zhì)層；和收集所述包含真核核酸的層和任
選地所述脂質(zhì)層。所述糞便樣品可以是人類或非人類動物糞便樣品。在一些實施例中，所述
非人類動物糞便樣品可以是從狗或貓獲得的樣品。所述方法可以進(jìn)一步包括從所述收集的
包含真核核酸的層提取所述真核核酸。所述核酸可以包括DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、
rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA，或任何DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA的組合。
浮液分離成富含真核細(xì)胞的部分和富含細(xì)菌細(xì)胞的部分，并且保留所述富含真核細(xì)胞的部
分；向所述富含真核細(xì)胞的部分添加離液劑和任選地表面活性劑以形成裂解物；將所述裂
解物分級成細(xì)胞碎片層，包含真核核酸的層，和脂質(zhì)層；和收集所述包含真核核酸的層和任
選地所述脂質(zhì)層。所述糞便樣品可以是人類或非人類動物糞便樣品。在一些實施例中，所述
非人類動物糞便樣品可以是從狗或貓獲得的樣品。所述方法可以進(jìn)一步包括從所述收集的
包含真核核酸的層提取所述真核核酸。所述核酸可以包括DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、
rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA，或任何DNA、RNA、總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno?RNA的組合。
[0006] 還提供了用于檢測糞便樣品中的真核生物標(biāo)志物的材料和方法。所述方法可以包括以下步驟：通過微陣列測序、分子條形碼、探針捕獲、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、ddPCR、RT-PCR、RT-qPCR或核酸測序分析所述提取的核酸。在一些實施例中，所述真核生物標(biāo)志物選自圖6
(A組)或圖13(B組)中列出的生物標(biāo)志物。在一些實施例中，所述真核生物標(biāo)志物可以是B細(xì)
胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白。
(A組)或圖13(B組)中列出的生物標(biāo)志物。在一些實施例中，所述真核生物標(biāo)志物可以是B細(xì)
胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白。
[0007] 還提供了用于確定受試者是否有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的材料和方法。所述方法可以包括以下步驟：測量來自所述受試者的生物樣品中的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物
基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；比較所述樣品中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸
贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述兩種或更多種基因的所述
測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差
異指示所述受試者有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。在一些實施例中，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因可以含于圖5A中所示的200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇內(nèi)并且含于圖5B中所示的與結(jié)腸直腸
癌相關(guān)的共同途徑內(nèi)。在一些實施例中，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以選自圖6(A
組)或圖13(B組)中列出的所述生物標(biāo)志物。
基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A組)或圖13(B組)中列出的
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；比較所述樣品中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸
贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述兩種或更多種基因的所述
測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差
異指示所述受試者有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。在一些實施例中，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因可以含于圖5A中所示的200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇內(nèi)并且含于圖5B中所示的與結(jié)腸直腸
癌相關(guān)的共同途徑內(nèi)。在一些實施例中，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以選自圖6(A
組)或圖13(B組)中列出的所述生物標(biāo)志物。
[0008] 還提供了用于患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的受試者的臨床計劃的材料和方法。所述方法可以包括以下步驟：測量來自所述受試者的生物樣品中的兩種或更多種
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A
組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；比較所述樣品中的所
述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩
種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述兩種或更多種基因
的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水
平的差異指示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險；和基于以下選擇臨床計
劃：所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種
基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，所述結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因選自圖6(A
組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因中的任一種；比較所述樣品中的所
述兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所述測量的表達(dá)水平與對照中的所述兩
種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平，其中所述兩種或更多種基因
的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水
平的差異指示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險；和基于以下選擇臨床計
劃：所述兩種或更多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對照中的所述兩種或更多種
基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。
[0009] 還提供了用于確定非人類動物是否有胃腸病癥風(fēng)險的方法和組合物。所述方法可以包括以下步驟：測量來自所述受試者的生物樣品中的一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球
蛋白基因的表達(dá)水平；比較所述樣品中的所述一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因
的所述測量的表達(dá)水平與對照中的一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因的所測量表
達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對
照中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者有胃腸病癥風(fēng)
險。所述胃腸病癥可以是胃腸淋巴瘤或炎性腸病。所述非人類動物可以是貓或狗。所述生物
樣品可以是糞便樣品。
附圖說明
蛋白基因的表達(dá)水平；比較所述樣品中的所述一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因
的所述測量的表達(dá)水平與對照中的一種或多種B細(xì)胞、T細(xì)胞或免疫球蛋白基因的所測量表
達(dá)水平，其中所述生物樣品中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平相對于所述對
照中的所述一種或多種基因的所述測量的表達(dá)水平的差異指示所述受試者有胃腸病癥風(fēng)
險。所述胃腸病癥可以是胃腸淋巴瘤或炎性腸病。所述非人類動物可以是貓或狗。所述生物
樣品可以是糞便樣品。
附圖說明
[0010] 本發(fā)明的這些和其它特征和優(yōu)勢將在本發(fā)明的優(yōu)選實施例的以下詳細(xì)描述中更充分公開或顯而易見，所述詳細(xì)描述將與附圖一起考慮，其中類似數(shù)字表示類似部分，并且
此外其中：
此外其中：
[0011] 圖1是電泳文件運(yùn)行。電泳分析用于檢查提取的RNA的品質(zhì)。
[0012] 圖2是電泳圖。電泳圖用于檢查提取的RNA的品質(zhì)。
[0013] 圖3是提取概述。這描繪了使用實例2中描述的提取方法評估的120個樣品的品質(zhì)檢查的概述。
[0014] 圖4A是描繪比較總RNA提取方法的實驗的結(jié)果的圖。圖4A展示了使用實例2中描述的提取方法通過品質(zhì)檢查的樣品的總數(shù)目。
[0015] 圖4B描繪了來自各種提取方法的五次電泳運(yùn)行
[0016] 圖5A是展示差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇的熱圖。如所展示，使用200個轉(zhuǎn)錄物簇產(chǎn)生熱圖，所述轉(zhuǎn)錄物簇映射到187個不同基因，并且在訓(xùn)練集中分析265個樣品。樣品按組排序：
癌癥(紅色)、癌前腺瘤(橙色)和正常(綠色)。
癌癥(紅色)、癌前腺瘤(橙色)和正常(綠色)。
[0017] 圖5B展示了使用GAGE?R-Package的差異表達(dá)的GO項和途徑(p<0.05)。每個條的高度詳述了每個途徑內(nèi)富集基因的集大小，并且藍(lán)色線展示了每個途徑的-log(p值)。紅色虛
線指示顯著性(p＝0.05)。
線指示顯著性(p＝0.05)。
[0018] 圖6展示了鑒定為在結(jié)腸直腸贅瘤中差異表達(dá)的基因的列表。
[0019] 圖7A描繪了電泳運(yùn)行，展示4個個別貓樣品和4個個別犬樣品。
[0020] 圖7B展示了4個個別貓樣品和4個個別犬樣品的RNA完整性數(shù)(RIN)和所有八個樣品的平均值。
[0021] 圖7C展示了4個個別貓樣品和4個個別犬樣品的從電泳運(yùn)行估算的真核RNA濃度(ng/uL)和所有8個樣品的平均質(zhì)量。
[0022] 圖8A描繪了用于鑒定犬樣品中淋巴細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的存在的IgM?Cμ重鏈區(qū)的RT-qPCR結(jié)果。
[0023] 圖8B描繪了犬樣品中的T細(xì)胞受體γ區(qū)的兩次重組的RT-qPCR結(jié)果。
[0024] 圖9描繪了貓樣品中的肌動蛋白-B的RT-qPCR結(jié)果。
[0025] 圖10A描繪了使用昂飛(Affymetrix)人類轉(zhuǎn)錄物組陣列的70,524個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的4個技術(shù)重復(fù)。
[0026] 圖10B描繪了使用昂飛人類轉(zhuǎn)錄物組陣列的70,524個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的4個生物重復(fù)。
[0027] 圖10C描繪了使用昂飛人類轉(zhuǎn)錄物組陣列分析70,524個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的間隔6個月測試的6個技術(shù)重復(fù)。
[0028] 圖11A描繪了使用昂飛人類轉(zhuǎn)錄物組陣列的5,149個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的4個技術(shù)重復(fù)。
[0029] 圖11B描繪了使用昂飛人類轉(zhuǎn)錄物組陣列的5,149個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的4個生物重復(fù)。
[0030] 圖11C描繪了使用昂飛人類轉(zhuǎn)錄物組陣列分析5,149個轉(zhuǎn)錄物簇表達(dá)水平的間隔6個月測試的6個技術(shù)重復(fù)。
[0031] 圖12A描繪了來自文獻(xiàn)中的提取方法的比較電泳圖和電泳文件運(yùn)行。
[0032] 圖12B描繪了來自實例2中描述的提取方法的電泳圖和電泳文件運(yùn)行。
[0033] 圖13展示了鑒定為在結(jié)腸直腸贅瘤中差異表達(dá)的基因以及牽涉癌癥、結(jié)腸直腸贅瘤和/或胃腸健康的基因的列表。
[0034] 圖14描繪了來源于4個個別貓的8個樣品的電泳文件運(yùn)行，證明了生物重復(fù)當(dāng)中的真核和原核RNA特征的一致性。
[0035] 圖15A是展示用于犬樣品的RT-qPCR分析的引物的表。
[0036] 圖15B是展示用于貓樣品的RT-qPCR分析的引物的表。
[0037] 圖16A描繪了用于鑒定犬樣品中淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物的存在的B細(xì)胞免疫球蛋白的兩次重排的RT-qPCR結(jié)果。
[0038] 圖16B描繪了用于鑒定貓樣品中淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物的存在的T細(xì)胞受體γ區(qū)的六次重排的RT-qPCR結(jié)果。
具體實施方式
[0039] 對優(yōu)選實施例的此類描述希望結(jié)合附圖來閱讀，附圖被視為本發(fā)明的整個書面描述的一部分。圖未必按比例繪制，并且為了清楚和簡明起見，本發(fā)明的某些特征可能在比例
上放大地示出或以某種程度上示意性形式示出。在說明書中，相對術(shù)語如“水平”、“垂直”、“向上”、“向下”、“頂部”和“底部”以及其衍生物(例如，“水平地”、“朝下”、“朝上”等)應(yīng)被解釋為指代所描述的方向或如所討論的圖中所示。這些相對術(shù)語是為了便于描述，并且通常
并不意圖要求特定的方向。包括“朝內(nèi)”對“朝外”、“縱向”對“橫向”等的術(shù)語適當(dāng)時應(yīng)當(dāng)相對于彼此或相對于伸長軸或旋轉(zhuǎn)軸或旋轉(zhuǎn)中心來解釋。關(guān)于附接、偶聯(lián)等的術(shù)語(如“連接”和“互連”)是指其中結(jié)構(gòu)彼此間直接地或經(jīng)由插入結(jié)構(gòu)間接地固定或附接的關(guān)系，以及可
移動或剛性附接或關(guān)系兩者，除非以其它方式明確地描述。術(shù)語“可操作地連接”是此類附
接、偶聯(lián)或連接，其使得相關(guān)結(jié)構(gòu)憑借所述關(guān)系按預(yù)期操作。當(dāng)僅說明單個機(jī)器時，術(shù)語“機(jī)器”還應(yīng)被視為包括機(jī)器的任何集合，所述機(jī)器個別地或共同地執(zhí)行一組(或多組)指令以
執(zhí)行本文中論述的方法中的任一個或多個。在權(quán)利要求書中，裝置加功能條款(如果使用的
話)旨在涵蓋由用于執(zhí)行所述功能的書面描述或圖式所描述、建議或顯而易見的結(jié)構(gòu)，不僅
包括結(jié)構(gòu)等效物而且包括等效結(jié)構(gòu)。
上放大地示出或以某種程度上示意性形式示出。在說明書中，相對術(shù)語如“水平”、“垂直”、“向上”、“向下”、“頂部”和“底部”以及其衍生物(例如，“水平地”、“朝下”、“朝上”等)應(yīng)被解釋為指代所描述的方向或如所討論的圖中所示。這些相對術(shù)語是為了便于描述，并且通常
并不意圖要求特定的方向。包括“朝內(nèi)”對“朝外”、“縱向”對“橫向”等的術(shù)語適當(dāng)時應(yīng)當(dāng)相對于彼此或相對于伸長軸或旋轉(zhuǎn)軸或旋轉(zhuǎn)中心來解釋。關(guān)于附接、偶聯(lián)等的術(shù)語(如“連接”和“互連”)是指其中結(jié)構(gòu)彼此間直接地或經(jīng)由插入結(jié)構(gòu)間接地固定或附接的關(guān)系，以及可
移動或剛性附接或關(guān)系兩者，除非以其它方式明確地描述。術(shù)語“可操作地連接”是此類附
接、偶聯(lián)或連接，其使得相關(guān)結(jié)構(gòu)憑借所述關(guān)系按預(yù)期操作。當(dāng)僅說明單個機(jī)器時，術(shù)語“機(jī)器”還應(yīng)被視為包括機(jī)器的任何集合，所述機(jī)器個別地或共同地執(zhí)行一組(或多組)指令以
執(zhí)行本文中論述的方法中的任一個或多個。在權(quán)利要求書中，裝置加功能條款(如果使用的
話)旨在涵蓋由用于執(zhí)行所述功能的書面描述或圖式所描述、建議或顯而易見的結(jié)構(gòu)，不僅
包括結(jié)構(gòu)等效物而且包括等效結(jié)構(gòu)。
[0040] 本發(fā)明部分基于本發(fā)明人開發(fā)的一種將糞便樣品(例如從哺乳動物獲得的糞便樣品)中的真核細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞分離的方法。在結(jié)腸內(nèi)，每克腸內(nèi)容物約有1012個細(xì)菌細(xì)胞。這種結(jié)腸微生物群可以包括300-1000個物種。糞便或大便樣品是一種復(fù)雜的大分子混合物，
不僅包括從胃腸道腸腔中脫落的真核細(xì)胞，而且包括微生物，包括細(xì)菌和任何胃腸寄生蟲，
難以消化的未被吸收的食物殘渣、腸細(xì)胞分泌物、和排泄物如粘液和色素。正常糞便由約
75％的水和25％的固體物質(zhì)組成。細(xì)菌占糞便總干質(zhì)量的約60％。高細(xì)菌負(fù)荷可導(dǎo)致用于
檢測來自糞便樣品的真核生物標(biāo)志物的信噪比不利。此外，真核信號可能會大幅衰減。此類
真核核酸的提取和處理可能會促進(jìn)或加速衰減，這會嚴(yán)重限制進(jìn)一步分析。
不僅包括從胃腸道腸腔中脫落的真核細(xì)胞，而且包括微生物，包括細(xì)菌和任何胃腸寄生蟲，
難以消化的未被吸收的食物殘渣、腸細(xì)胞分泌物、和排泄物如粘液和色素。正常糞便由約
75％的水和25％的固體物質(zhì)組成。細(xì)菌占糞便總干質(zhì)量的約60％。高細(xì)菌負(fù)荷可導(dǎo)致用于
檢測來自糞便樣品的真核生物標(biāo)志物的信噪比不利。此外，真核信號可能會大幅衰減。此類
真核核酸的提取和處理可能會促進(jìn)或加速衰減，這會嚴(yán)重限制進(jìn)一步分析。
[0041] 本文公開的方法和材料包括從糞便樣品分離真核核酸的方法?？梢栽u估此類真核核酸的特定生物標(biāo)志物的水平，其可以指示真核生物(例如哺乳動物)中的胃腸病癥或疾
病。哺乳動物可以是人類或非人類動物，例如人類、狗、貓、非人類靈長類動物、反芻動物、熊科動物、馬科動物、豬、綿羊、山羊、駱駝、水牛、鹿、麋鹿、駝鹿、鼬科動物、兔、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠、厚皮動物、犀?；蚧沂?。
病。哺乳動物可以是人類或非人類動物，例如人類、狗、貓、非人類靈長類動物、反芻動物、熊科動物、馬科動物、豬、綿羊、山羊、駱駝、水牛、鹿、麋鹿、駝鹿、鼬科動物、兔、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠、厚皮動物、犀?；蚧沂?。
[0042] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，他們可以有效地將真核生物糞便樣品中的真核細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞分離。本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，他們可以檢測從此類真核細(xì)胞分離的RNA中的真核生物標(biāo)志
物。此類生物標(biāo)志物可以用于檢測胃腸病癥，例如結(jié)腸直腸癌、脂瀉病、克羅恩病、胃炎、腸胃炎、胃癌、胃潰瘍、壞死性小腸結(jié)腸炎、胃腸間質(zhì)瘤、胃腸淋巴瘤、胃腸瘤形成、淋巴肉瘤、腺癌、炎性腸病、腸易激綜合征、胰臟瘤形成、肝臟瘤形成、膽管癌、結(jié)腸炎、貓白血病病毒、牛病毒性腹瀉、空腸出血綜合征、腸胃炎、惡性卡他熱(malignant?catarrhal?fever)、貓泛白細(xì)胞減少癥、小腸纖維化、浸潤性結(jié)腸疾病、隱孢子蟲病、球蟲病和其它動物性寄生蟲感
染，或冠狀病毒、微小病毒、星狀病毒、諾如病毒或輪狀病毒感染。本文提供了用于確定受試者(例如人類、狗或貓)是否有胃腸疾病(例如結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤或炎性腸病或其它疾病)
風(fēng)險的材料和方法。還提供了用于診斷疾病的材料和方法以及鑒定受試者的健康狀態(tài)的方
法。
物。此類生物標(biāo)志物可以用于檢測胃腸病癥，例如結(jié)腸直腸癌、脂瀉病、克羅恩病、胃炎、腸胃炎、胃癌、胃潰瘍、壞死性小腸結(jié)腸炎、胃腸間質(zhì)瘤、胃腸淋巴瘤、胃腸瘤形成、淋巴肉瘤、腺癌、炎性腸病、腸易激綜合征、胰臟瘤形成、肝臟瘤形成、膽管癌、結(jié)腸炎、貓白血病病毒、牛病毒性腹瀉、空腸出血綜合征、腸胃炎、惡性卡他熱(malignant?catarrhal?fever)、貓泛白細(xì)胞減少癥、小腸纖維化、浸潤性結(jié)腸疾病、隱孢子蟲病、球蟲病和其它動物性寄生蟲感
染，或冠狀病毒、微小病毒、星狀病毒、諾如病毒或輪狀病毒感染。本文提供了用于確定受試者(例如人類、狗或貓)是否有胃腸疾病(例如結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤或炎性腸病或其它疾病)
風(fēng)險的材料和方法。還提供了用于診斷疾病的材料和方法以及鑒定受試者的健康狀態(tài)的方
法。
[0043] 本文公開的方法和組合物通常并且不同地用于檢測、診斷和治療胃腸健康。檢測方法可以包括測量來自患有胃腸病癥或疑似患有胃腸病癥的受試者(例如患者)的樣品中
的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物在糞便樣品中的表達(dá)水平，以及比較所述測量的表達(dá)水
平與對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平。受試者樣品中的一種、兩
種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平相對于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物
的所測量表達(dá)水平的差異是受試者患有胃腸病癥的指示。在一些實施例中，受試者樣品中
的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平相對于對照中的一種、兩種或更多種
生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平的差異是受試者(例如患者)有胃腸病癥風(fēng)險的指示。
的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物在糞便樣品中的表達(dá)水平，以及比較所述測量的表達(dá)水
平與對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平。受試者樣品中的一種、兩
種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平相對于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物
的所測量表達(dá)水平的差異是受試者患有胃腸病癥的指示。在一些實施例中，受試者樣品中
的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平相對于對照中的一種、兩種或更多種
生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平的差異是受試者(例如患者)有胃腸病癥風(fēng)險的指示。
[0044] 在另一實施例中，檢測疾病的方法可以包括測量受試者的糞便樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的相對表達(dá)水平比例(例如相對比率)，和比較這些生物標(biāo)志物的相
對比例與對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的相對表達(dá)水平比例。受試者樣品中的
一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量相對表達(dá)水平比例相對于對照的差異是受試者患
有胃腸疾病的指示。在一些實施例中，受試者樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所
測量表達(dá)水平比例相對于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平比例
的差異是受試者有胃腸病癥風(fēng)險的指示。
對比例與對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的相對表達(dá)水平比例。受試者樣品中的
一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量相對表達(dá)水平比例相對于對照的差異是受試者患
有胃腸疾病的指示。在一些實施例中，受試者樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所
測量表達(dá)水平比例相對于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平比例
的差異是受試者有胃腸病癥風(fēng)險的指示。
[0045] 所述方法可以包括測定從由患者獲得的糞便樣品分離的人類RNA中的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，確定兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因
的水平相對于對照中的相同兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平是否不同。
示例性結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因展示于圖6(A組)和圖13(B組)中。圖6(A組)和圖13(B
組)中列出的一些或所有結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以形成組。在一些實施例中，圖6
(A組)和圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因還可以包括結(jié)腸直腸贅瘤生物
標(biāo)志物基因的子集。所述組合物可以包括被配置成用于特異性檢測本文公開的標(biāo)志物組的
基因陣列和探針集。所述組合物還可以包括試劑盒，其包含被配置成用于特異性檢測本文
公開的標(biāo)志物組的基因陣列和探針集。
的水平相對于對照中的相同兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平是否不同。
示例性結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因展示于圖6(A組)和圖13(B組)中。圖6(A組)和圖13(B
組)中列出的一些或所有結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以形成組。在一些實施例中，圖6
(A組)和圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因還可以包括結(jié)腸直腸贅瘤生物
標(biāo)志物基因的子集。所述組合物可以包括被配置成用于特異性檢測本文公開的標(biāo)志物組的
基因陣列和探針集。所述組合物還可以包括試劑盒，其包含被配置成用于特異性檢測本文
公開的標(biāo)志物組的基因陣列和探針集。
[0046] 本文提供了用于診斷結(jié)腸直腸癌或癌前病變的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因和結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因組。生物標(biāo)志物通常是可以客觀地測量和定量并用于評估生
物過程(例如結(jié)腸直腸贅瘤發(fā)展、進(jìn)展、緩解和復(fù)發(fā))的特征。生物標(biāo)志物可以采取多種形
式，包括核酸、多肽、代謝物或物理或生理參數(shù)。
物過程(例如結(jié)腸直腸贅瘤發(fā)展、進(jìn)展、緩解和復(fù)發(fā))的特征。生物標(biāo)志物可以采取多種形
式，包括核酸、多肽、代謝物或物理或生理參數(shù)。
[0047] 來自真核細(xì)胞的這些生物標(biāo)志物可以包括：a)脫氧核糖核酸(DNA)序列，b)核糖核酸(RNA)序列，c)預(yù)測的氨基酸序列，其包含蛋白質(zhì)的主鏈，d)核糖核酸生物標(biāo)志物的表達(dá)
水平，e)預(yù)測的氨基酸序列表達(dá)水平，或f)上述任何組合。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可
以是T細(xì)胞標(biāo)志物或B細(xì)胞標(biāo)志物。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可以是可用于檢測T細(xì)胞或
B細(xì)胞的克隆擴(kuò)增的生物標(biāo)志物。示例性生物標(biāo)志物可以包括IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、T細(xì)胞γ受體、T細(xì)胞α受體、T細(xì)胞β受體、T細(xì)胞δ受體區(qū)或B細(xì)胞互補(bǔ)決定區(qū)。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可用于標(biāo)準(zhǔn)化，如GADPH。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可用于檢測特定細(xì)胞類型，如使用肌動蛋白-B檢測上皮細(xì)胞或使用IgM?C-μ檢測淋巴細(xì)胞。在一些實施例中，生物標(biāo)志
物可用于檢測疾病特異性標(biāo)志物，如檢測T細(xì)胞受體γ以檢測淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。在一些
實施例中，生物標(biāo)志物可以包含用于檢測病毒和寄生蟲的那些，包括用于衣殼、殼粒、復(fù)制
酶和卵囊壁蛋白的那些。
水平，e)預(yù)測的氨基酸序列表達(dá)水平，或f)上述任何組合。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可
以是T細(xì)胞標(biāo)志物或B細(xì)胞標(biāo)志物。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可以是可用于檢測T細(xì)胞或
B細(xì)胞的克隆擴(kuò)增的生物標(biāo)志物。示例性生物標(biāo)志物可以包括IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、T細(xì)胞γ受體、T細(xì)胞α受體、T細(xì)胞β受體、T細(xì)胞δ受體區(qū)或B細(xì)胞互補(bǔ)決定區(qū)。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可用于標(biāo)準(zhǔn)化，如GADPH。在一些實施例中，生物標(biāo)志物可用于檢測特定細(xì)胞類型，如使用肌動蛋白-B檢測上皮細(xì)胞或使用IgM?C-μ檢測淋巴細(xì)胞。在一些實施例中，生物標(biāo)志
物可用于檢測疾病特異性標(biāo)志物，如檢測T細(xì)胞受體γ以檢測淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。在一些
實施例中，生物標(biāo)志物可以包含用于檢測病毒和寄生蟲的那些，包括用于衣殼、殼粒、復(fù)制
酶和卵囊壁蛋白的那些。
[0048] 生物樣品可以是含有細(xì)胞或其它細(xì)胞物質(zhì)的樣品，可以從中獲得核酸或其它分析物。生物樣品可以是對照或?qū)嶒灅悠?。生物樣品可以是糞便樣品。生物樣品可以在廁所、地
面或收集裝置中排便后立即獲得。在一些實施例中，生物樣品可以按照如灌腸或內(nèi)窺鏡檢
查的程序獲得。生物樣品可以立即進(jìn)行測試?；蛘?，生物樣品可以在測試之前儲存在緩沖液
中，所述緩沖液例如水性緩沖液、基于甘油的緩沖液、基于極性溶劑的緩沖液、滲透平衡緩
沖液或足以保存生物樣品的其它緩沖液。另外或替代地，生物樣品可以被收集并且在測試
之前儲存，例如在4℃冷藏，或例如在0℃、-20℃、-80℃、-140℃或更低冷凍。生物樣品可以在測試之前儲存1個月、2個月、4個月、6個月、1年、2年或更久。
面或收集裝置中排便后立即獲得。在一些實施例中，生物樣品可以按照如灌腸或內(nèi)窺鏡檢
查的程序獲得。生物樣品可以立即進(jìn)行測試?；蛘?，生物樣品可以在測試之前儲存在緩沖液
中，所述緩沖液例如水性緩沖液、基于甘油的緩沖液、基于極性溶劑的緩沖液、滲透平衡緩
沖液或足以保存生物樣品的其它緩沖液。另外或替代地，生物樣品可以被收集并且在測試
之前儲存，例如在4℃冷藏，或例如在0℃、-20℃、-80℃、-140℃或更低冷凍。生物樣品可以在測試之前儲存1個月、2個月、4個月、6個月、1年、2年或更久。
[0049] 生物樣品可以來源于真核生物，例如哺乳動物。哺乳動物可以是人類或非人類動物，例如人類、狗、貓、非人類靈長類動物、反芻動物、熊科動物、馬科動物、豬、綿羊、山羊、駱駝、水牛、鹿、麋鹿、駝鹿、鼬科動物、兔、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠、厚皮動物、犀牛或灰鼠。
[0050] 方法
[0051] 本文提供用于從富含真核核酸之生物樣品(例如糞便樣品)分離核酸的有用方法。所述方法可包括用緩沖液破壞糞便樣品?？梢詫悠愤M(jìn)行渦旋、搖晃、攪拌、旋轉(zhuǎn)或其它足
以分散固體和糞便細(xì)菌的攪動方法。進(jìn)行攪動和離心步驟的溫度可以改變，例如，從約4℃
到約20℃，從約4℃到約1℃，從約4℃到約10℃，從約4℃到約6℃。破壞后可以對樣品進(jìn)行一輪或多輪離心。在一些實施例中，破壞步驟和離心可以重復(fù)一次、兩次、三次或更多次?？缮藤彽脑噭?，例如 試劑可以用于糞便破壞、洗滌和細(xì)胞裂解。裂解
緩沖液也可以裂解真核細(xì)胞。裂解物可以進(jìn)一步離心且上清液用于輸入到自動化RNA分離
機(jī)器(例如 儀器)中。在一些實施例中，可以用DNA酶處理提取的核酸以清理DNA
溶液?？梢允褂闷渌椒?，包括機(jī)械性或酶促細(xì)胞破壞然后是固相方法，例如柱色譜法或用
有機(jī)溶劑萃取，例如苯酚-氯仿或硫氰酸酯-苯酚-氯仿萃取。在一些實施例中，可以將核酸
提取到功能化珠粒上。在一些實施例中，功能化珠?？梢赃M(jìn)一步包含磁芯(“磁珠”)。在一些實施例中，功能化珠粒可以包括用帶電荷部分功能化的表面。帶電荷部分可以選自：胺、羧
酸、羧酸鹽、季胺、硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽。
以分散固體和糞便細(xì)菌的攪動方法。進(jìn)行攪動和離心步驟的溫度可以改變，例如，從約4℃
到約20℃，從約4℃到約1℃，從約4℃到約10℃，從約4℃到約6℃。破壞后可以對樣品進(jìn)行一輪或多輪離心。在一些實施例中，破壞步驟和離心可以重復(fù)一次、兩次、三次或更多次?？缮藤彽脑噭?，例如 試劑可以用于糞便破壞、洗滌和細(xì)胞裂解。裂解
緩沖液也可以裂解真核細(xì)胞。裂解物可以進(jìn)一步離心且上清液用于輸入到自動化RNA分離
機(jī)器(例如 儀器)中。在一些實施例中，可以用DNA酶處理提取的核酸以清理DNA
溶液?？梢允褂闷渌椒?，包括機(jī)械性或酶促細(xì)胞破壞然后是固相方法，例如柱色譜法或用
有機(jī)溶劑萃取，例如苯酚-氯仿或硫氰酸酯-苯酚-氯仿萃取。在一些實施例中，可以將核酸
提取到功能化珠粒上。在一些實施例中，功能化珠?？梢赃M(jìn)一步包含磁芯(“磁珠”)。在一些實施例中，功能化珠粒可以包括用帶電荷部分功能化的表面。帶電荷部分可以選自：胺、羧
酸、羧酸鹽、季胺、硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽。
[0052] 為了提取核酸，可以在一種或多種緩沖液、表面活性劑和核糖核酸酶抑制劑的存在下破壞糞便樣品以形成懸浮液。緩沖液可以是生物相容的緩沖液，例如，漢克斯(Hanks)
平衡鹽溶液，阿氏(Alsever's)溶液，厄爾氏(Earle's)平衡鹽溶液，蓋伊氏(Gey's)平衡鹽
溶液，磷酸鹽緩沖鹽水，帕克氏(Puck's)平衡鹽溶液，林格氏(Ringer's)平衡鹽溶液，西姆
氏(Simm's)平衡鹽溶液，TRIS-緩沖鹽水或臺氏(Tyrode's)平衡鹽溶液。表面活性劑可以是
離子或非離子表面活性劑，例如Tween-20或Triton-X-100。核糖核酸酶抑制劑可以是溶劑
基，蛋白質(zhì)基或其它類型的防止RNA破壞的方法，包括例如Protector?RNase?Inhibitor
(Roche)， (Promega)，SUPERase-InTM(Thermo?Fisher?Scientific)，RNAseOUTTM
(Thermo?Fisher?Scientific)，抗RNA酶，重組RNA酶抑制劑或克隆的RNA酶抑制劑?？梢砸?br>各種方式破壞糞便樣品，例如通過渦旋、搖晃、攪拌、旋轉(zhuǎn)或足以分散固體和糞便細(xì)菌的其
它攪動方法。在一些實施例中，可以使用以下：經(jīng)涂覆的珠粒；磁珠或攪拌工具，例如玻璃
棒，金屬棒，木棒或木制刀片來破壞糞便樣品。
平衡鹽溶液，阿氏(Alsever's)溶液，厄爾氏(Earle's)平衡鹽溶液，蓋伊氏(Gey's)平衡鹽
溶液，磷酸鹽緩沖鹽水，帕克氏(Puck's)平衡鹽溶液，林格氏(Ringer's)平衡鹽溶液，西姆
氏(Simm's)平衡鹽溶液，TRIS-緩沖鹽水或臺氏(Tyrode's)平衡鹽溶液。表面活性劑可以是
離子或非離子表面活性劑，例如Tween-20或Triton-X-100。核糖核酸酶抑制劑可以是溶劑
基，蛋白質(zhì)基或其它類型的防止RNA破壞的方法，包括例如Protector?RNase?Inhibitor
(Roche)， (Promega)，SUPERase-InTM(Thermo?Fisher?Scientific)，RNAseOUTTM
(Thermo?Fisher?Scientific)，抗RNA酶，重組RNA酶抑制劑或克隆的RNA酶抑制劑?？梢砸?br>各種方式破壞糞便樣品，例如通過渦旋、搖晃、攪拌、旋轉(zhuǎn)或足以分散固體和糞便細(xì)菌的其
它攪動方法。在一些實施例中，可以使用以下：經(jīng)涂覆的珠粒；磁珠或攪拌工具，例如玻璃
棒，金屬棒，木棒或木制刀片來破壞糞便樣品。
[0053] 然后可以將懸浮液分離成液體部分和固體部分。分離可以例如通過離心，過濾，特異性結(jié)合真核細(xì)胞的靶向探針，抗體，基于柱的過濾，基于珠粒的過濾或色譜色譜方法來進(jìn)
行。液體部分富含細(xì)菌核酸并且可以丟棄。在存在或不存在表面活性劑和存在或不存在核
糖核酸酶的情況下，可以將固體部分再懸浮于緩沖液中。分離步驟可以重復(fù)一次、兩次、三
次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次。
行。液體部分富含細(xì)菌核酸并且可以丟棄。在存在或不存在表面活性劑和存在或不存在核
糖核酸酶的情況下，可以將固體部分再懸浮于緩沖液中。分離步驟可以重復(fù)一次、兩次、三
次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次。
[0054] 進(jìn)行破壞和分離步驟的溫度可以改變，例如，從約4℃到約20℃，從約4℃到約15℃，從約4℃到約10℃，從約4℃到約6℃。
[0055] 從分離步驟獲得的所得丸粒可以懸浮在裂解緩沖液(例如包含離液劑和任選的表面活性劑的緩沖液)中以形成裂解物。在一些實施例中，離液劑可以是硫氰酸胍并且表面活
性劑可以是Triton-X-100。在一些實施例中，裂解緩沖液可以包括或不包括Tris-HCl、乙二
胺四乙酸(EDTA)，十二烷基硫酸鈉(SDS)、Nonidet?P-40、脫氧膽酸鈉或二硫蘇糖醇。
性劑可以是Triton-X-100。在一些實施例中，裂解緩沖液可以包括或不包括Tris-HCl、乙二
胺四乙酸(EDTA)，十二烷基硫酸鈉(SDS)、Nonidet?P-40、脫氧膽酸鈉或二硫蘇糖醇。
[0056] 裂解物可以分級分離成富含真核核酸的部分。分級分離可以例如通過離心、過濾、特異性結(jié)合真核核酸的靶向探針、抗體、基于柱的過濾、基于珠粒的過濾或色譜方法來進(jìn)
行。在一些實施例中，通過離心分級分離可以導(dǎo)致形成底層(丸粒)，其包含細(xì)胞碎片，包含
真核核酸的親水中間層和包含脂質(zhì)和膜級分的疏水頂層?？梢允占虚g層。在一些實施例
中，中間層和頂層可以一起收集。中間層可以通過窄孔口收集。窄孔口可以是移液器吸頭或
裝有針頭的注射器。移液器吸頭可以是例如1、5、10、20μL或100μL移液器吸頭。針可以是例如18號針或15號針。
行。在一些實施例中，通過離心分級分離可以導(dǎo)致形成底層(丸粒)，其包含細(xì)胞碎片，包含
真核核酸的親水中間層和包含脂質(zhì)和膜級分的疏水頂層?？梢允占虚g層。在一些實施例
中，中間層和頂層可以一起收集。中間層可以通過窄孔口收集。窄孔口可以是移液器吸頭或
裝有針頭的注射器。移液器吸頭可以是例如1、5、10、20μL或100μL移液器吸頭。針可以是例如18號針或15號針。
[0057] 可以對包含真核核酸的收集層進(jìn)行進(jìn)一步提取。進(jìn)一步提取的方法可以改變。示例性方法包括基于磁性顆粒的方法，基于柱的方法，基于過濾器的方法，基于珠粒的方法或基于有機(jī)溶劑的方法。基于磁性顆粒的方法可以包括可商購試劑，例如試劑(生物梅里埃(bioMerieux))。
[0058] 可以分析提取的核酸用于與胃腸病癥或胃腸細(xì)胞相關(guān)的真核生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物可以提供關(guān)于個體(即受試者)健康狀態(tài)的信息。來自真核細(xì)胞的這些生物標(biāo)志物可以
包括：a)脫氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)預(yù)測的氨基酸序列，其包含蛋
白質(zhì)的主鏈；d)RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或者表達(dá)水平比例；e)氨基酸序列的預(yù)測表達(dá)水
平或預(yù)測表達(dá)水平比例；或f)上述的任何組合。從真核細(xì)胞中分離生物標(biāo)志物可以考慮實
驗樣品與對照之間的比較。從真核細(xì)胞中分離這些生物標(biāo)志物可以提供檢測實驗樣品中腸
道疾病的方法。比較可以包括評估：a)DNA序列的變異；b)RNA序列的變異；c)預(yù)測的氨基酸
序列的變異；d)RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的變異或表達(dá)水平比例的變異；e)氨基酸序列的
預(yù)測表達(dá)水平的變異或預(yù)測表達(dá)水平比例的變異；或f)構(gòu)成上述任何組合的變異。當(dāng)測量
的實驗樣品的生物標(biāo)志物與測量的對照中的生物標(biāo)志物不同時，可以測定變異。
包括：a)脫氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)預(yù)測的氨基酸序列，其包含蛋
白質(zhì)的主鏈；d)RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或者表達(dá)水平比例；e)氨基酸序列的預(yù)測表達(dá)水
平或預(yù)測表達(dá)水平比例；或f)上述的任何組合。從真核細(xì)胞中分離生物標(biāo)志物可以考慮實
驗樣品與對照之間的比較。從真核細(xì)胞中分離這些生物標(biāo)志物可以提供檢測實驗樣品中腸
道疾病的方法。比較可以包括評估：a)DNA序列的變異；b)RNA序列的變異；c)預(yù)測的氨基酸
序列的變異；d)RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的變異或表達(dá)水平比例的變異；e)氨基酸序列的
預(yù)測表達(dá)水平的變異或預(yù)測表達(dá)水平比例的變異；或f)構(gòu)成上述任何組合的變異。當(dāng)測量
的實驗樣品的生物標(biāo)志物與測量的對照中的生物標(biāo)志物不同時，可以測定變異。
[0059] 所述方法可以包括獲得實驗樣品和對照，例如糞便樣品。糞便樣品含有脫落的真核細(xì)胞，可以評估其生物標(biāo)志物。在一些實施例中，真核細(xì)胞可以是腸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腸嗜鉻樣細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞或其它細(xì)胞。所述方法提供了一種方式，借此方式可以評估糞便樣品中的真核細(xì)胞的真核生物標(biāo)志物。生物標(biāo)
志物可以包括DNA序列，RNA序列，預(yù)測的氨基酸序列，RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或表達(dá)水
平的比例，氨基酸序列的預(yù)測的表達(dá)水平或預(yù)測表達(dá)水平比例或上述的任何組合。在一個
方面，評估步驟包含任何類型的微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。
志物可以包括DNA序列，RNA序列，預(yù)測的氨基酸序列，RNA生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或表達(dá)水
平的比例，氨基酸序列的預(yù)測的表達(dá)水平或預(yù)測表達(dá)水平比例或上述的任何組合。在一個
方面，評估步驟包含任何類型的微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。
[0060] 所述方法和組合物還可用于為患有腸道疾病的個體選擇臨床計劃。通過這種方法，臨床計劃可以包括施用進(jìn)一步診斷程序。在一些實施例中，臨床計劃可以包括治療方
法。
法。
[0061] 可以使用各種方法評估真核生物標(biāo)志物的水平。表達(dá)水平可以在核酸水平(例如RNA水平)或在多肽水平測定。RNA表達(dá)可以包涵總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、
miRNA和snoRNA的表達(dá)?？梢酝ㄟ^測量對應(yīng)于相關(guān)RNA的cDNA水平直接或間接測量在RNA水
平上的表達(dá)。或者或另外，還可以分析由RNA編碼的多肽、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因的RNA調(diào)
節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄因子多肽的水平。在mRNA水平測定基因表達(dá)的方法包括例如微陣列分析，基因
表達(dá)的系列分析(SAGE)，RT-PCR，印跡，基于數(shù)字條形碼定量分析的雜交，多重RT-PCR，數(shù)字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度計，RT-qPCR，qPCR，UV光譜，RNA測序，下一代測序，利用分支鏈DNA信號擴(kuò)增的基于裂解物的雜交分析(例如QuantiGene?2.0?SingleΡlex)和分支
鏈DNA分析方法。數(shù)字條形碼定量分析可以包括珠粒陣列(BeadArray)(啟迪(Illumina))，
xMAP系統(tǒng)(路明克斯(Luminex))，nCounter(Nanostring)，高通量基因組學(xué)(HTG)分子，
BioMark(富魯達(dá)(Fluidigm))或Wafergen微陣列。分析可以包括DASL(啟迪)、RNA-Seq(啟
迪)、TruSeq(啟迪)、SureSelect(安捷倫(Agilent))、生物分析儀(Bioanalyzer)(安捷倫)
和TaqMan(賽默飛(ThermoFisher))。
miRNA和snoRNA的表達(dá)?？梢酝ㄟ^測量對應(yīng)于相關(guān)RNA的cDNA水平直接或間接測量在RNA水
平上的表達(dá)。或者或另外，還可以分析由RNA編碼的多肽、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因的RNA調(diào)
節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄因子多肽的水平。在mRNA水平測定基因表達(dá)的方法包括例如微陣列分析，基因
表達(dá)的系列分析(SAGE)，RT-PCR，印跡，基于數(shù)字條形碼定量分析的雜交，多重RT-PCR，數(shù)字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度計，RT-qPCR，qPCR，UV光譜，RNA測序，下一代測序，利用分支鏈DNA信號擴(kuò)增的基于裂解物的雜交分析(例如QuantiGene?2.0?SingleΡlex)和分支
鏈DNA分析方法。數(shù)字條形碼定量分析可以包括珠粒陣列(BeadArray)(啟迪(Illumina))，
xMAP系統(tǒng)(路明克斯(Luminex))，nCounter(Nanostring)，高通量基因組學(xué)(HTG)分子，
BioMark(富魯達(dá)(Fluidigm))或Wafergen微陣列。分析可以包括DASL(啟迪)、RNA-Seq(啟
迪)、TruSeq(啟迪)、SureSelect(安捷倫(Agilent))、生物分析儀(Bioanalyzer)(安捷倫)
和TaqMan(賽默飛(ThermoFisher))。
[0062] 我們可以互換地使用術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”來指代RNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA、合成DNA和含有核酸類似物的DNA(或RNA)，其中任何一種都可以編碼本發(fā)明的多肽并且其全部都包涵在本發(fā)明中。多核苷酸基本上可以具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈
或單鏈的(即有義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)
含子、信使RNA(mRNA)和其部分、轉(zhuǎn)移RNA、微RNA、核糖體RNA、siRNA、微RNA、核糖酶、cDNA、重組多核苷酸、分支鏈多核苷酸、質(zhì)體、載體、任何序列的經(jīng)分離DNA、任何序列的經(jīng)分離RNA、核酸探針和引子以及核酸類似物。在本發(fā)明的上下文中，核酸可以編碼生物標(biāo)志物，例如B
細(xì)胞或T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的生物標(biāo)志物；或其生物活性變體的片段。
或單鏈的(即有義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)
含子、信使RNA(mRNA)和其部分、轉(zhuǎn)移RNA、微RNA、核糖體RNA、siRNA、微RNA、核糖酶、cDNA、重組多核苷酸、分支鏈多核苷酸、質(zhì)體、載體、任何序列的經(jīng)分離DNA、任何序列的經(jīng)分離RNA、核酸探針和引子以及核酸類似物。在本發(fā)明的上下文中，核酸可以編碼生物標(biāo)志物，例如B
細(xì)胞或T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的生物標(biāo)志物；或其生物活性變體的片段。
[0063] “經(jīng)分離”核酸可以是例如DNA分子或其片段，條件是通常緊密側(cè)接基因組中的DNA分子的核酸序列中的至少一個已移除或不存在。因此，經(jīng)分離核酸包括但不限于作為單獨
分子、獨立于其它序列存在的DNA分子(例如化學(xué)合成核酸，或通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或限
制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。經(jīng)分離核酸還指并入載體、自主復(fù)制質(zhì)體、
病毒或原核生物或真核生物的基因組DNA中的DNA分子。另外，經(jīng)分離核酸可以包括經(jīng)工程
改造的核酸，如DNA分子，其為雜交或融合核酸的一部分。存在于例如cDNA庫或基因組庫內(nèi)
的多個(例如幾十個或數(shù)百個到數(shù)百萬個)其它核酸或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠
片中的核酸并非經(jīng)分離核酸。
分子、獨立于其它序列存在的DNA分子(例如化學(xué)合成核酸，或通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或限
制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。經(jīng)分離核酸還指并入載體、自主復(fù)制質(zhì)體、
病毒或原核生物或真核生物的基因組DNA中的DNA分子。另外，經(jīng)分離核酸可以包括經(jīng)工程
改造的核酸，如DNA分子，其為雜交或融合核酸的一部分。存在于例如cDNA庫或基因組庫內(nèi)
的多個(例如幾十個或數(shù)百個到數(shù)百萬個)其它核酸或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠
片中的核酸并非經(jīng)分離核酸。
[0064] 經(jīng)分離核酸分子可以以各種方式產(chǎn)生。舉例來說，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可用于獲得含有本文所述核苷酸序列(包括編碼本文所述多肽的核苷酸序列)的經(jīng)分離核酸。PCR
可用于擴(kuò)增來自DNA以及RNA的特定序列，包括來自總基因組DNA或總細(xì)胞RNA的序列。通常，
使用來自關(guān)注或遠(yuǎn)端區(qū)域的末端的序列信息設(shè)計寡核苷酸引物，其序列與待擴(kuò)增的模板的
相反鏈相同或類似。還可以使用各種PCR策略，通過其可以將位點特異性核苷酸序列修飾引
入模板核酸中。
可用于擴(kuò)增來自DNA以及RNA的特定序列，包括來自總基因組DNA或總細(xì)胞RNA的序列。通常，
使用來自關(guān)注或遠(yuǎn)端區(qū)域的末端的序列信息設(shè)計寡核苷酸引物，其序列與待擴(kuò)增的模板的
相反鏈相同或類似。還可以使用各種PCR策略，通過其可以將位點特異性核苷酸序列修飾引
入模板核酸中。
[0065] 經(jīng)分離核酸也可以化學(xué)合成，作為單個核酸分子(例如在3'至5'方向使用自動化DNA合成使用亞磷酰胺技術(shù))或作為一系列寡核苷酸。舉例來說，可合成一對或多對含有所
需序列的長寡核苷酸(例如>50-100個核苷酸)，每對含有互補(bǔ)性短片段(例如約15個核苷
酸)從而在寡核苷酸對退火時形成雙鏈體。DNA聚合酶用于擴(kuò)展寡核苷酸，每個寡核苷酸對
產(chǎn)生單個雙鏈核酸分子，其接著可連接到載體中。
需序列的長寡核苷酸(例如>50-100個核苷酸)，每對含有互補(bǔ)性短片段(例如約15個核苷
酸)從而在寡核苷酸對退火時形成雙鏈體。DNA聚合酶用于擴(kuò)展寡核苷酸，每個寡核苷酸對
產(chǎn)生單個雙鏈核酸分子，其接著可連接到載體中。
[0066] 可以將兩種核酸或其編碼的多肽描述為彼此具有一定程度的同一性。舉例來說，選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因和其生物活性變體可以被描述
為展現(xiàn)一定程度的同一性?？梢酝ㄟ^在蛋白質(zhì)信息研究(PIR)站點(http://
pir.georgetown.edu)中定位短序列然后用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast)上的“短的幾乎相同的序列”基本局部比對搜索工具(BLAST)算法分析來組裝比對。
為展現(xiàn)一定程度的同一性?？梢酝ㄟ^在蛋白質(zhì)信息研究(PIR)站點(http://
pir.georgetown.edu)中定位短序列然后用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast)上的“短的幾乎相同的序列”基本局部比對搜索工具(BLAST)算法分析來組裝比對。
[0067] 如本文所用，術(shù)語“序列同一性百分比”是指任何給定查詢序列與主題序列之間的同一性程度。舉例來說，圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因序列
可以是查詢序列，且圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因序列的
片段可以是主題序列。類似地，圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因序列的片段可以是查詢序列，且其生物活性變體可以是主題序列。
可以是查詢序列，且圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因序列的
片段可以是主題序列。類似地，圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因序列的片段可以是查詢序列，且其生物活性變體可以是主題序列。
[0068] 為了測定序列同一性，可以使用計算機(jī)程序(例如ClustalW(1.83版，默認(rèn)參數(shù)))將查詢核酸或氨基酸序列分別與一個或多個目標(biāo)核酸或氨基酸序列比對，其允許核酸或蛋
白質(zhì)序列比對在其整個長度中進(jìn)行(全局比對)。
白質(zhì)序列比對在其整個長度中進(jìn)行(全局比對)。
[0069] 本文所述的核酸和多肽可稱為“外源的”。術(shù)語“外源的”表示核酸或多肽是重組核酸構(gòu)筑體的一部分或由重組核酸構(gòu)筑體編碼，或不在其天然環(huán)境中。舉例來說，外源核酸可以是來自被引入到另一物種中的一種物種的序列，即異源核酸。通常，通過重組核酸構(gòu)筑體
將此類外源核酸引入到其它物種中。外源核酸還可以是生物體原生并且被重新引入所述生
物體的細(xì)胞中的序列。往往可通過連接到外源核酸的非天然序列(例如側(cè)接重組核酸構(gòu)筑
體中的原生序列的非原生調(diào)節(jié)序列)的存在來區(qū)分包括原生序列的外源核酸與原生序列。
另外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)型的外源核酸通常在除發(fā)現(xiàn)原生序列的位置以外的位置整合。
將此類外源核酸引入到其它物種中。外源核酸還可以是生物體原生并且被重新引入所述生
物體的細(xì)胞中的序列。往往可通過連接到外源核酸的非天然序列(例如側(cè)接重組核酸構(gòu)筑
體中的原生序列的非原生調(diào)節(jié)序列)的存在來區(qū)分包括原生序列的外源核酸與原生序列。
另外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)型的外源核酸通常在除發(fā)現(xiàn)原生序列的位置以外的位置整合。
[0070] 本發(fā)明的核酸可以包括具有圖6(A組)或圖13(B組)中列出的任何一種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的核苷酸序列或與圖6(A組)或圖13(B組)中列出的核酸至少約70％、至少約
75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％相同的核酸序列的核酸。
75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％相同的核酸序列的核酸。
[0071] 核酸，例如對靶核酸具有特異性的寡核苷酸(例如探針或引物)將在合適的條件下與靶核酸雜交。我們可以將雜交稱為寡核苷酸單鏈在限定的雜交條件下通過堿基配對與互
補(bǔ)鏈退火的過程。其是兩個互補(bǔ)多核苷酸之間的特異性(即非隨機(jī)的)相互作用。雜交和雜
交強(qiáng)度(即核酸之間締合的強(qiáng)度)受如核酸之間的互補(bǔ)程度，所涉及的條件的嚴(yán)格度和所形
成的雜交體的解鏈溫度(Tm)等因素的影響。雜交產(chǎn)物可以是在溶液中或在固體支撐物上與
標(biāo)靶形成的雙螺旋體或三螺旋體。
補(bǔ)鏈退火的過程。其是兩個互補(bǔ)多核苷酸之間的特異性(即非隨機(jī)的)相互作用。雜交和雜
交強(qiáng)度(即核酸之間締合的強(qiáng)度)受如核酸之間的互補(bǔ)程度，所涉及的條件的嚴(yán)格度和所形
成的雜交體的解鏈溫度(Tm)等因素的影響。雜交產(chǎn)物可以是在溶液中或在固體支撐物上與
標(biāo)靶形成的雙螺旋體或三螺旋體。
[0072] 在一些實施例中，核酸可以包括適用于在圖6或13中列出的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的分析和定量的短核酸序列。.此類經(jīng)分離核酸可以是寡核苷酸引物。一般來說，
寡核苷酸引物是與靶核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸，例如圖6或13中列出的任何結(jié)腸直腸贅
瘤生物標(biāo)志物基因的核苷酸序列，其可以充當(dāng)通過在DNA或RNA聚合酶存在下向引物的3'末
端添加核苷酸來合成DNA的起點。引物的3'核苷酸通常應(yīng)與相應(yīng)核苷酸位置處的靶序列相
同以進(jìn)行最佳延伸和/或擴(kuò)增。引物可以采取多種形式，包括例如肽核酸引物，鎖核酸引物，解鎖核酸引物和/或硫代磷酸酯修飾的引物。在一些實施例中，正向引物可以是與dsDNA的
反義鏈互補(bǔ)的引物，且反向引物可以是與dsDNA的有義鏈互補(bǔ)的引物。我們也可以參考引物
對。在一些實施例中，5'靶引物對可以是包括至少一個正向引物和至少一個反向引物的引
物對，其擴(kuò)增靶核苷酸序列的5'區(qū)域。在一些實施例中，3'靶引物對可以是包括至少一個正
向引物和至少一個反向引物的引物對，其擴(kuò)增靶核苷酸序列的3'區(qū)域。在一些實施例中，引
物可以包括可檢測標(biāo)記，如下文所論述。在一些實施例中，可檢測標(biāo)記可以是可定量標(biāo)記。
寡核苷酸引物是與靶核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸，例如圖6或13中列出的任何結(jié)腸直腸贅
瘤生物標(biāo)志物基因的核苷酸序列，其可以充當(dāng)通過在DNA或RNA聚合酶存在下向引物的3'末
端添加核苷酸來合成DNA的起點。引物的3'核苷酸通常應(yīng)與相應(yīng)核苷酸位置處的靶序列相
同以進(jìn)行最佳延伸和/或擴(kuò)增。引物可以采取多種形式，包括例如肽核酸引物，鎖核酸引物，解鎖核酸引物和/或硫代磷酸酯修飾的引物。在一些實施例中，正向引物可以是與dsDNA的
反義鏈互補(bǔ)的引物，且反向引物可以是與dsDNA的有義鏈互補(bǔ)的引物。我們也可以參考引物
對。在一些實施例中，5'靶引物對可以是包括至少一個正向引物和至少一個反向引物的引
物對，其擴(kuò)增靶核苷酸序列的5'區(qū)域。在一些實施例中，3'靶引物對可以是包括至少一個正
向引物和至少一個反向引物的引物對，其擴(kuò)增靶核苷酸序列的3'區(qū)域。在一些實施例中，引
物可以包括可檢測標(biāo)記，如下文所論述。在一些實施例中，可檢測標(biāo)記可以是可定量標(biāo)記。
[0073] 本文所提供的寡核苷酸引物對圖6(A組)或圖13(B組)中列出的任何結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因序列的擴(kuò)增是有用的。在一些實施例中，寡核苷酸引物可與兩個或更多個
本文公開的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因互補(bǔ)，例如圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸
直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因。引物長度可以根據(jù)探針的特定核酸序列的核苷酸堿基序列和組
成以及使用探針的具體方法而改變。一般來說，有用的引物長度可以是約8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個核苷酸堿基。有用的引物長度范圍可以是8個核苷酸堿基到約60個核苷酸堿基；約12個核苷酸堿基到約50個核苷酸
堿基；約12個核苷酸堿基到約45個核苷酸堿基；約12個核苷酸堿基到約40個核苷酸堿基；約
12個核苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約15個核苷酸堿基到約40個核苷酸堿基；約15個核
苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約50個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿
基到約40個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約
30個核苷酸堿基；；約20個核苷酸堿基到約30個核苷酸堿基；約20個核苷酸堿基到約25個核
苷酸堿基。
本文公開的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因互補(bǔ)，例如圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸
直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因。引物長度可以根據(jù)探針的特定核酸序列的核苷酸堿基序列和組
成以及使用探針的具體方法而改變。一般來說，有用的引物長度可以是約8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個核苷酸堿基。有用的引物長度范圍可以是8個核苷酸堿基到約60個核苷酸堿基；約12個核苷酸堿基到約50個核苷酸
堿基；約12個核苷酸堿基到約45個核苷酸堿基；約12個核苷酸堿基到約40個核苷酸堿基；約
12個核苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約15個核苷酸堿基到約40個核苷酸堿基；約15個核
苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約50個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿
基到約40個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約35個核苷酸堿基；約18個核苷酸堿基到約
30個核苷酸堿基；；約20個核苷酸堿基到約30個核苷酸堿基；約20個核苷酸堿基到約25個核
苷酸堿基。
[0074] 還提供了探針，即經(jīng)分離核酸片段，其選擇性結(jié)合并與圖6(A組)和圖13(B組)中列出的任何結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因序列互補(bǔ)。探針可以是核苷酸堿基或主鏈中的寡核
苷酸或多核苷酸，DNA或RNA，單鏈或雙鏈以及天然的或經(jīng)修飾的。探針可以通過各種方法產(chǎn)
生，包括化學(xué)或酶促合成。
苷酸或多核苷酸，DNA或RNA，單鏈或雙鏈以及天然的或經(jīng)修飾的。探針可以通過各種方法產(chǎn)
生，包括化學(xué)或酶促合成。
[0075] 探針長度可以根據(jù)探針的特定核酸序列的核苷酸堿基序列和組成以及使用探針的具體方法而改變。一般來說，有用的探針長度可以是大約8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、
100、110、120、140、150、175或200個核苷酸堿基。一般來說，有用的探針長度范圍是長度為約8到約200個核苷酸堿基；約12到約175個核苷酸堿基；約15到約150個核苷酸堿基；約15到
約100個核苷酸堿基，約15到約75個核苷酸堿基；約15到約60個核苷酸堿基；約20到約100個
核苷酸堿基；約20到約75個核苷酸堿基；約20到約60個核苷酸堿基；約20到約50個核苷酸堿
基。在一些實施例中，探針組可包含針對至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、
90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、
550、575種或更多種或所有圖6(A組)和圖13(B組)中的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的探
針。
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、
100、110、120、140、150、175或200個核苷酸堿基。一般來說，有用的探針長度范圍是長度為約8到約200個核苷酸堿基；約12到約175個核苷酸堿基；約15到約150個核苷酸堿基；約15到
約100個核苷酸堿基，約15到約75個核苷酸堿基；約15到約60個核苷酸堿基；約20到約100個
核苷酸堿基；約20到約75個核苷酸堿基；約20到約60個核苷酸堿基；約20到約50個核苷酸堿
基。在一些實施例中，探針組可包含針對至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、
90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、
550、575種或更多種或所有圖6(A組)和圖13(B組)中的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的探
針。
[0076] 本文公開的引物和探針可以被可檢測地標(biāo)記。標(biāo)記可以是可檢測的或?qū)е驴蓹z測響應(yīng)的分子部分或化合物，其可以直接或間接連接至核酸。直接標(biāo)記可以使用鍵或相互作
用來連接標(biāo)記和探針，其包括共價鍵、非共價相互作用(氫鍵，疏水和離子相互作用)或螯合
物或配位絡(luò)合物。間接標(biāo)記可以使用直接或間接標(biāo)記的橋接部分或連接子(例如抗體、寡聚
物或其它化合物)，其可以擴(kuò)增信號。標(biāo)記包括任何可檢測部分，例如放射性核素；配體，如生物素或抗生物素蛋白；酶；酶底物；反應(yīng)性基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)(可檢測的染料，顆?；蛑榱?；熒光團(tuán)或發(fā)光化合物(生物發(fā)光、磷光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)。標(biāo)記可以在均相分析中檢測，其中混
合物中的結(jié)合標(biāo)記探針與未結(jié)合標(biāo)記探針相比展現(xiàn)可檢測的變化，例如穩(wěn)定性或差異性降
解，而不需要從未結(jié)合形式的物理分離結(jié)合。
用來連接標(biāo)記和探針，其包括共價鍵、非共價相互作用(氫鍵，疏水和離子相互作用)或螯合
物或配位絡(luò)合物。間接標(biāo)記可以使用直接或間接標(biāo)記的橋接部分或連接子(例如抗體、寡聚
物或其它化合物)，其可以擴(kuò)增信號。標(biāo)記包括任何可檢測部分，例如放射性核素；配體，如生物素或抗生物素蛋白；酶；酶底物；反應(yīng)性基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)(可檢測的染料，顆?；蛑榱?；熒光團(tuán)或發(fā)光化合物(生物發(fā)光、磷光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)。標(biāo)記可以在均相分析中檢測，其中混
合物中的結(jié)合標(biāo)記探針與未結(jié)合標(biāo)記探針相比展現(xiàn)可檢測的變化，例如穩(wěn)定性或差異性降
解，而不需要從未結(jié)合形式的物理分離結(jié)合。
[0077] 合適的可檢測標(biāo)記可包括本身可檢測的分子(例如熒光部分、電化學(xué)標(biāo)記、金屬螯合物等)以及可通過產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物(例如酶，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)或通
過本身可檢測的特異性結(jié)合分子(例如生物素、洋地黃毒苷、麥芽糖、寡聚組氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸鹽、ssDNA、dsDNA等)可間接檢測的分子。如上文所論述，一個或多個配體基元和/或配體與可檢測標(biāo)記的偶聯(lián)可以是直接的或間接的。檢測可以是原位，活體內(nèi)，活體
外在組織切片上或在溶液中等。
過本身可檢測的特異性結(jié)合分子(例如生物素、洋地黃毒苷、麥芽糖、寡聚組氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸鹽、ssDNA、dsDNA等)可間接檢測的分子。如上文所論述，一個或多個配體基元和/或配體與可檢測標(biāo)記的偶聯(lián)可以是直接的或間接的。檢測可以是原位，活體內(nèi)，活體
外在組織切片上或在溶液中等。
[0078] 在一些實施例中，方法包括使用堿性磷酸酶綴合的多核苷酸探針。當(dāng)使用堿性磷酸酶(AP)-綴合的多核苷酸探針時，在依序添加適當(dāng)?shù)牡孜?例如固藍(lán)或固紅底物)后，AP分
解底物以形成沉淀物，其允許原位檢測特異性靶RNA分子。堿性磷酸酶可與許多底物一起使
用，例如固藍(lán)、固紅或5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)。參見例如US?5,780,277和US?7,
033,758中一般性描述的。
解底物以形成沉淀物，其允許原位檢測特異性靶RNA分子。堿性磷酸酶可與許多底物一起使
用，例如固藍(lán)、固紅或5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)。參見例如US?5,780,277和US?7,
033,758中一般性描述的。
[0079] 在一些實施例中，熒光團(tuán)-綴合物探針可以是熒光染料綴合的標(biāo)記探針，或利用除堿性磷酸酶之外的其它酶促途徑用于產(chǎn)色檢測途徑，例如使用辣根過氧化物酶綴合的探針
與如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的底物。
與如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的底物。
[0080] 綴合標(biāo)記探針中使用的熒光染料通?？煞譃槎鄠€家族，例如熒光素和其衍生物；羅丹明和其衍生物；花青和其衍生物；香豆素和其衍生物；Cascade?BlueTM和其衍生物；螢黃(Lucifer?Yellow)和其衍生物；BODIPY和其衍生物等等。示例性熒光團(tuán)包括吲哚羰花青
(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas?Red)、太平洋藍(lán)(Pacific?Blue)、俄勒岡綠(Oregon?Green)488、 -355、Alexa?Fluor?488、
Alexa?Fluor?532、Alexa?Fluor?546、Alexa?Fluor-555、Alexa?Fluor?568、Alexa?Fluor?
594、Alexa?Fluor?647、Alexa?Fluor?660、Alexa?Fluor?680、JOE、麗絲胺(Lissamine)、羅丹明綠、BODIPY、異硫氰酸熒光素(FITC)、羧基熒光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamineTM)、羧基四甲基羅丹明(TAMRATM)、羧基-X-羅丹明(ROXTM)、LIZTM、VICTM、NEDTM、PETTM、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等等。熒光團(tuán)及其用途的描述可以在其它地方，在
R.Haugland，《熒光探針和研究產(chǎn)物手冊》(Handbook?of?Fluorescent?Probes?and?
Research?Products)，第9版(2002)，Molecular?Probes,Eugene,Oreg.；M.Schena,微陣列
分析(Microarray?Analysis)(2003),John?Wiley&Sons,Hoboken,N.J.；合成藥物化學(xué)
2003/2004目錄(Synthetic?Medicinal?Chemistry?2003/2004?Catalog),Berry?and?
Associates,Ann?Arbor,Mich.；G.Hermanson,生物綴合技術(shù)(Bioconjugate?Techniques),
Academic?Press(1996)；及格倫研究2002目錄(Glen?Research?2002?Catalog),Sterling,
Va中找到。近紅外染料明確地在術(shù)語熒光團(tuán)和熒光報道基團(tuán)的預(yù)期含義內(nèi)。
(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克薩斯紅(Texas?Red)、太平洋藍(lán)(Pacific?Blue)、俄勒岡綠(Oregon?Green)488、 -355、Alexa?Fluor?488、
Alexa?Fluor?532、Alexa?Fluor?546、Alexa?Fluor-555、Alexa?Fluor?568、Alexa?Fluor?
594、Alexa?Fluor?647、Alexa?Fluor?660、Alexa?Fluor?680、JOE、麗絲胺(Lissamine)、羅丹明綠、BODIPY、異硫氰酸熒光素(FITC)、羧基熒光素(FAM)、藻紅蛋白、羅丹明、二氯羅丹明(dRhodamineTM)、羧基四甲基羅丹明(TAMRATM)、羧基-X-羅丹明(ROXTM)、LIZTM、VICTM、NEDTM、PETTM、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等等。熒光團(tuán)及其用途的描述可以在其它地方，在
R.Haugland，《熒光探針和研究產(chǎn)物手冊》(Handbook?of?Fluorescent?Probes?and?
Research?Products)，第9版(2002)，Molecular?Probes,Eugene,Oreg.；M.Schena,微陣列
分析(Microarray?Analysis)(2003),John?Wiley&Sons,Hoboken,N.J.；合成藥物化學(xué)
2003/2004目錄(Synthetic?Medicinal?Chemistry?2003/2004?Catalog),Berry?and?
Associates,Ann?Arbor,Mich.；G.Hermanson,生物綴合技術(shù)(Bioconjugate?Techniques),
Academic?Press(1996)；及格倫研究2002目錄(Glen?Research?2002?Catalog),Sterling,
Va中找到。近紅外染料明確地在術(shù)語熒光團(tuán)和熒光報道基團(tuán)的預(yù)期含義內(nèi)。
[0081] 在一些實施例中，可以在基因陣列上分析真核生物標(biāo)志物的水平?？梢栽诙ㄖ频幕蜿嚵猩线M(jìn)行微陣列分析?；蛘呋蛄硗猓梢愿鶕?jù)制造商的說明書和方案使用可商購的
系統(tǒng)進(jìn)行微陣列分析。示例性商購系統(tǒng)包括昂飛 技術(shù)(昂飛，加利福尼亞州圣
克拉拉(Santa?Clara,CA))、安捷倫微陣列技術(shù)、 分析系統(tǒng)(
技術(shù))和珠粒陣列微陣列技術(shù)(啟迪)。從糞便樣品中提取的核酸可以與基因陣列上的探針
雜交。可以通過化學(xué)發(fā)光檢測探針-靶雜交以測定特定序列的相對豐度。
系統(tǒng)進(jìn)行微陣列分析。示例性商購系統(tǒng)包括昂飛 技術(shù)(昂飛，加利福尼亞州圣
克拉拉(Santa?Clara,CA))、安捷倫微陣列技術(shù)、 分析系統(tǒng)(
技術(shù))和珠粒陣列微陣列技術(shù)(啟迪)。從糞便樣品中提取的核酸可以與基因陣列上的探針
雜交。可以通過化學(xué)發(fā)光檢測探針-靶雜交以測定特定序列的相對豐度。
[0082] 在一些實施例中，探針和探針組可以配置為基因陣列。基因陣列(也稱為微陣列或基因芯片)是有序的核酸陣列，其允許平行分析復(fù)雜的生物樣品。通常，基因陣列包括附接
于固體底物(例如微芯片、玻璃載片或珠粒)的探針。附接通常涉及產(chǎn)生底物與探針之間的
共價鍵的化學(xué)偶聯(lián)。陣列中探針的數(shù)量可以改變，但每個探針固定在陣列或微芯片上的特
定可尋址位置。在一些實施例中，探針的長度可以是約18個核苷酸堿基、約20個核苷酸堿
基、約25個核苷酸堿基、約30個核苷酸堿基、約35個核苷酸堿基或約40個核苷酸堿基。在一
些實施例中，探針組包含針對至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、
150種或更多種或所有圖6(A組)和圖13(B組)中的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的探針。探
針組可并入到包含5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、
500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,
000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000個更多個不同探針的高密度陣列中。
于固體底物(例如微芯片、玻璃載片或珠粒)的探針。附接通常涉及產(chǎn)生底物與探針之間的
共價鍵的化學(xué)偶聯(lián)。陣列中探針的數(shù)量可以改變，但每個探針固定在陣列或微芯片上的特
定可尋址位置。在一些實施例中，探針的長度可以是約18個核苷酸堿基、約20個核苷酸堿
基、約25個核苷酸堿基、約30個核苷酸堿基、約35個核苷酸堿基或約40個核苷酸堿基。在一
些實施例中，探針組包含針對至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、
150種或更多種或所有圖6(A組)和圖13(B組)中的結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的探針。探
針組可并入到包含5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、
500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,
000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000個更多個不同探針的高密度陣列中。
[0084] 可以使用各種方法評估真核標(biāo)志物的水平。表達(dá)水平可以在核酸(例如RNA水平)或在多肽水平測定。RNA表達(dá)可以包涵總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、miRNA和
snoRNA的表達(dá)?？梢酝ㄟ^測量對應(yīng)于相關(guān)RNA的cDNA水平直接或間接測量在RNA水平上的表
達(dá)。或者或另外，還可以分析由RNA編碼的多肽、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因的RNA調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)
錄因子多肽的水平。在mRNA水平測定基因表達(dá)的方法包括例如微陣列分析，基因表達(dá)的系
列分析(SAGE)，RT-PCR，印跡，基于數(shù)字條形碼定量分析的雜交，多重RT-PCR，數(shù)字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度計，qRT-qPCR，qPCR，UV光譜，RNA測序，下一代測序，利用分支鏈DNA信號擴(kuò)增的基于裂解物的雜交分析(例如QuantiGene?2.0?SingleΡlex)和分支鏈DNA
分析方法。數(shù)字條形碼定量分析可以包括珠粒陣列(啟迪)，xMAP系統(tǒng)(路明克斯)，nCounter
(Nanostring)，高通量基因組學(xué)(HTG)分子，BioMark(Fluidigm)或Wafergen微陣列。分析可
以包括DASL(啟迪)、RNA-Seq(啟迪)、TruSeq(啟迪)、SureSelect(安捷倫)、生物分析儀(安
捷倫)和TaqMan(賽默飛)。
snoRNA的表達(dá)?？梢酝ㄟ^測量對應(yīng)于相關(guān)RNA的cDNA水平直接或間接測量在RNA水平上的表
達(dá)。或者或另外，還可以分析由RNA編碼的多肽、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因的RNA調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)
錄因子多肽的水平。在mRNA水平測定基因表達(dá)的方法包括例如微陣列分析，基因表達(dá)的系
列分析(SAGE)，RT-PCR，印跡，基于數(shù)字條形碼定量分析的雜交，多重RT-PCR，數(shù)字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度計，qRT-qPCR，qPCR，UV光譜，RNA測序，下一代測序，利用分支鏈DNA信號擴(kuò)增的基于裂解物的雜交分析(例如QuantiGene?2.0?SingleΡlex)和分支鏈DNA
分析方法。數(shù)字條形碼定量分析可以包括珠粒陣列(啟迪)，xMAP系統(tǒng)(路明克斯)，nCounter
(Nanostring)，高通量基因組學(xué)(HTG)分子，BioMark(Fluidigm)或Wafergen微陣列。分析可
以包括DASL(啟迪)、RNA-Seq(啟迪)、TruSeq(啟迪)、SureSelect(安捷倫)、生物分析儀(安
捷倫)和TaqMan(賽默飛)。
[0085] 還可以通過DNA測序分析真核生物標(biāo)志物的水平。DNA測序可以通過測序方法執(zhí)行，例如靶向測序、全基因組測序或外顯子組測序。測序方法可包括：Sanger測序或高通量
測序。高通量測序可涉及合成測序、焦磷酸測序、連接測序、實時測序、納米孔測序和Sanger測序。在一些實施例中，經(jīng)分離RNA可用于生成對應(yīng)的cDNA并且可對cDNA測序。
測序。高通量測序可涉及合成測序、焦磷酸測序、連接測序、實時測序、納米孔測序和Sanger測序。在一些實施例中，經(jīng)分離RNA可用于生成對應(yīng)的cDNA并且可對cDNA測序。
[0086] 本文所述的測序方法可以以多重形式進(jìn)行，使得同時操作多種不同的靶核酸。在一些實施例中，可以在共同的反應(yīng)容器中或在特定底物的表面上處理不同的靶核酸，使得
能夠方便地遞送測序試劑，移除未反應(yīng)的試劑并以多重方式檢測并入事件。在涉及表面結(jié)
合靶核酸的一些實施例中，靶核酸可以是陣列形式。在陣列形式中，靶核酸通?？梢砸钥臻g
可區(qū)分的方式與表面偶聯(lián)。舉例來說，靶核酸可以通過直接共價附接、附接于珠?；蚱渌w
?；蚺c附接于表面的聚合酶或其它分子締合來結(jié)合。陣列可以包括每個位點(也稱為特征
部)處的靶核酸的單拷貝或者具有相同序列的多拷貝可以存在于每個位點或特征部處。通
過擴(kuò)增方法產(chǎn)生多拷貝，例如橋式擴(kuò)增、PCR或乳液PCR。
能夠方便地遞送測序試劑，移除未反應(yīng)的試劑并以多重方式檢測并入事件。在涉及表面結(jié)
合靶核酸的一些實施例中，靶核酸可以是陣列形式。在陣列形式中，靶核酸通?？梢砸钥臻g
可區(qū)分的方式與表面偶聯(lián)。舉例來說，靶核酸可以通過直接共價附接、附接于珠?；蚱渌w
?；蚺c附接于表面的聚合酶或其它分子締合來結(jié)合。陣列可以包括每個位點(也稱為特征
部)處的靶核酸的單拷貝或者具有相同序列的多拷貝可以存在于每個位點或特征部處。通
過擴(kuò)增方法產(chǎn)生多拷貝，例如橋式擴(kuò)增、PCR或乳液PCR。
[0087] 在一些實施例中，標(biāo)準(zhǔn)化步驟可用于控制核酸回收和樣品之間的變異。在一些實施例中，可以將限定量的外源對照核酸添加(“摻入”)至提取的真核核酸。外源對照核酸可
以是具有對應(yīng)于一個或多個真核序列的序列的核酸?；蛘呋蛄硗?，外源對照核酸可具有對
應(yīng)于在另一物種中發(fā)現(xiàn)的序列的序列，例如細(xì)菌序列，如枯草芽孢桿菌(Bacilis?
subtilis)序列。在一些實施例中，方法可以包括測定一種或多種管家基因的水平。在一些
實施例中，方法可以包括將生物標(biāo)志物的表達(dá)水平歸一化至管家基因的水平。
以是具有對應(yīng)于一個或多個真核序列的序列的核酸?；蛘呋蛄硗?，外源對照核酸可具有對
應(yīng)于在另一物種中發(fā)現(xiàn)的序列的序列，例如細(xì)菌序列，如枯草芽孢桿菌(Bacilis?
subtilis)序列。在一些實施例中，方法可以包括測定一種或多種管家基因的水平。在一些
實施例中，方法可以包括將生物標(biāo)志物的表達(dá)水平歸一化至管家基因的水平。
[0088] 方法包括測定步驟，不管實驗樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平是否不同于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平。在另一
實施例中，方法包括測定步驟，不管實驗樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水
平比例是否不同于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平比例。表達(dá)
水平或表達(dá)水平比例的差異可以是增加或減少。
實施例中，方法包括測定步驟，不管實驗樣品中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水
平比例是否不同于對照中的一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的所測量表達(dá)水平比例。表達(dá)
水平或表達(dá)水平比例的差異可以是增加或減少。
[0089] 本文公開的組合物通常且以各種方式可用于結(jié)腸直腸癌的檢測、診斷和治療。檢測的方法可以包括測量選自圖6(A組)或圖13(B組)中任一個中列出的生物標(biāo)志物的兩種或
更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的糞便樣品中的表達(dá)水平，并比較的樣品中兩種或更多種
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平與在對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平。患者樣品中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因的所測量表達(dá)水平相對于對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量
表達(dá)水平的差異指示患者患有結(jié)腸直腸癌。在一些實施例中，患者樣品中兩種或更多種結(jié)
腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平相對于對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平的差異指示患者具有癌前病變和/或有結(jié)腸直腸癌的風(fēng)
險。這些方法可以進(jìn)一步包括鑒定患有結(jié)腸直腸贅瘤(例如結(jié)腸直腸癌或癌前病變)或有罹
患結(jié)腸直腸贅瘤風(fēng)險的受試者(例如患者且更具體地說人類患者)的步驟。
更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的糞便樣品中的表達(dá)水平，并比較的樣品中兩種或更多種
結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平與在對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平。患者樣品中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因的所測量表達(dá)水平相對于對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量
表達(dá)水平的差異指示患者患有結(jié)腸直腸癌。在一些實施例中，患者樣品中兩種或更多種結(jié)
腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平相對于對照中兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的所測量表達(dá)水平的差異指示患者具有癌前病變和/或有結(jié)腸直腸癌的風(fēng)
險。這些方法可以進(jìn)一步包括鑒定患有結(jié)腸直腸贅瘤(例如結(jié)腸直腸癌或癌前病變)或有罹
患結(jié)腸直腸贅瘤風(fēng)險的受試者(例如患者且更具體地說人類患者)的步驟。
[0090] 結(jié)腸直腸贅瘤可以包括任何形式的結(jié)腸直腸癌。結(jié)腸直腸贅瘤還可以包括息肉，例如癌前病變。結(jié)腸直腸癌通常在結(jié)腸或直腸的腔襯里中以生長(稱為息肉)開始。結(jié)腸直
腸息肉一般分為兩類：腺瘤性息肉，也稱為腺瘤；和增生性和炎性息肉。腺瘤性息肉可引起
結(jié)腸直腸癌。最常見的結(jié)腸直腸癌形式——腺癌，起源于排列在結(jié)腸和/或直腸內(nèi)部的腸腺
細(xì)胞。腺癌可以包括管狀腺癌，其是有蒂莖上的腺癌；和絨毛腺癌，其是平坦地位于結(jié)腸表
面的腺癌。其它結(jié)腸直腸癌通過其起源組織區(qū)分。這些包括胃腸間質(zhì)瘤(GIST)，其源自
Cajal的間質(zhì)細(xì)胞；原發(fā)性結(jié)腸直腸淋巴瘤，其源自血液細(xì)胞；平滑肌肉瘤，其是由結(jié)締組織或平滑肌引起的肉瘤；黑色素瘤，其源自黑色素細(xì)胞；鱗狀細(xì)胞癌，其源自分層鱗狀上皮組
織且限制于直腸；和粘液性癌，其是通常與不良預(yù)后相關(guān)的上皮癌，。
腸息肉一般分為兩類：腺瘤性息肉，也稱為腺瘤；和增生性和炎性息肉。腺瘤性息肉可引起
結(jié)腸直腸癌。最常見的結(jié)腸直腸癌形式——腺癌，起源于排列在結(jié)腸和/或直腸內(nèi)部的腸腺
細(xì)胞。腺癌可以包括管狀腺癌，其是有蒂莖上的腺癌；和絨毛腺癌，其是平坦地位于結(jié)腸表
面的腺癌。其它結(jié)腸直腸癌通過其起源組織區(qū)分。這些包括胃腸間質(zhì)瘤(GIST)，其源自
Cajal的間質(zhì)細(xì)胞；原發(fā)性結(jié)腸直腸淋巴瘤，其源自血液細(xì)胞；平滑肌肉瘤，其是由結(jié)締組織或平滑肌引起的肉瘤；黑色素瘤，其源自黑色素細(xì)胞；鱗狀細(xì)胞癌，其源自分層鱗狀上皮組
織且限制于直腸；和粘液性癌，其是通常與不良預(yù)后相關(guān)的上皮癌，。
[0091] 結(jié)腸直腸癌的癥狀可包括但不限于排便習(xí)慣的變化，包括腹瀉或便秘或糞便稠度變化持續(xù)超過四周；直腸出血或便血；持續(xù)性腹部不適，如痙攣，脹氣或疼痛；感覺腸道不能完全排空；虛弱或疲勞以及無法解釋的體重減輕。疑似患有結(jié)腸直腸癌的患者可接受外周
血試驗，包括全血細(xì)胞計數(shù)(CBC)；糞便隱血試驗(FOBT)；肝功能分析；糞便免疫化學(xué)試驗
(FIT)和/或某些腫瘤標(biāo)志物的其它分析，例如癌胚抗原(CEA)和CA19-9。結(jié)腸直腸癌往往基
于結(jié)腸鏡檢查診斷。在結(jié)腸鏡檢查期間，將所指出的任何息肉移除、活組織檢查并分析以確
定息肉是否含有結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或經(jīng)受癌前變化的細(xì)胞。當(dāng)通過內(nèi)窺鏡檢視時，上文所列
的每種特定癌癥可能看起來不同。絨毛腺瘤黑色素瘤和鱗狀細(xì)胞癌通常是扁平的或無蒂
的，而管狀腺瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤和GIST腫瘤通常是有蒂的。然而，胃腸病醫(yī)生在結(jié)腸鏡檢查期間可能會遺漏扁平和無蒂腺瘤?？梢曰谔囟ɑ虻幕蜃兓蛭⑿l(wèi)星不穩(wěn)定性對
活組織檢查樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析。
血試驗，包括全血細(xì)胞計數(shù)(CBC)；糞便隱血試驗(FOBT)；肝功能分析；糞便免疫化學(xué)試驗
(FIT)和/或某些腫瘤標(biāo)志物的其它分析，例如癌胚抗原(CEA)和CA19-9。結(jié)腸直腸癌往往基
于結(jié)腸鏡檢查診斷。在結(jié)腸鏡檢查期間，將所指出的任何息肉移除、活組織檢查并分析以確
定息肉是否含有結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或經(jīng)受癌前變化的細(xì)胞。當(dāng)通過內(nèi)窺鏡檢視時，上文所列
的每種特定癌癥可能看起來不同。絨毛腺瘤黑色素瘤和鱗狀細(xì)胞癌通常是扁平的或無蒂
的，而管狀腺瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤和GIST腫瘤通常是有蒂的。然而，胃腸病醫(yī)生在結(jié)腸鏡檢查期間可能會遺漏扁平和無蒂腺瘤?？梢曰谔囟ɑ虻幕蜃兓蛭⑿l(wèi)星不穩(wěn)定性對
活組織檢查樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析。
[0092] 其它診斷方法可包括乙狀結(jié)腸鏡檢查；成像試驗，例如算機(jī)斷層攝影(CT或CAT)掃描；超聲，例如腹部、直腸內(nèi)或手術(shù)中超聲；磁共振成像(MRI)掃描，例如直腸內(nèi)MRI?？梢赃M(jìn)行其它試驗(例如血管造影和胸部X射線)以確定結(jié)腸直腸癌是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移。
[0093] 已經(jīng)研發(fā)了各種用于分期結(jié)腸直腸癌的方法。最常用的系統(tǒng)——TNM系統(tǒng)基于三個因素：1)原發(fā)腫瘤(T)生長到腸壁和附近區(qū)域的距離；2)腫瘤是否已擴(kuò)散到附近區(qū)域淋巴
結(jié)(N)；3)癌癥是否已轉(zhuǎn)移至其它器官(M)。其它分期方法包括Dukes分期和Astler-Coller
分級。
結(jié)(N)；3)癌癥是否已轉(zhuǎn)移至其它器官(M)。其它分期方法包括Dukes分期和Astler-Coller
分級。
[0094] TNM系統(tǒng)提供結(jié)腸直腸癌的四階段分級。在階段1(T1)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤已經(jīng)生長到結(jié)腸壁的層中，但是沒有擴(kuò)散到結(jié)腸壁外或擴(kuò)散到淋巴結(jié)中。如果癌癥是管狀腺瘤息
肉的一部分，則進(jìn)行簡單的切除并且患者可以繼續(xù)接受針對未來癌癥發(fā)展的常規(guī)試驗。如
果癌癥是高級別或扁平/無蒂息肉的一部分，則可能需要更多手術(shù)并且將截取更大的余量；
這可能包括切除一部分結(jié)腸的部分結(jié)腸切除術(shù)。在階段2(T2)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤已經(jīng)生長
到結(jié)腸壁中并可能生長到附近組織中但尚未擴(kuò)散到附近的淋巴結(jié)。通常進(jìn)行腫瘤的手術(shù)移
除和部分結(jié)腸切除術(shù)?？梢允┯幂o助療法，例如用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸或卡培他濱
(capecitabine)的藥劑化療。此類腫瘤不大可能復(fù)發(fā)，但通常需要增加對患者的篩查。在階
段3(T3)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤已擴(kuò)散到附近的淋巴結(jié)但未擴(kuò)散到身體的其它部位。將需要手
術(shù)移除結(jié)腸部分和所有受感染的淋巴結(jié)。通常建議用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利
鉑(oxaliplatin)或卡培他濱與奧沙利鉑組合的藥劑化療。根據(jù)患者的年齡和腫瘤的侵襲
性，還可使用放療。在階段4(T4)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤通過血液從結(jié)腸擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官。結(jié)腸直腸癌最常轉(zhuǎn)移至肝、肺和/或腹膜。手術(shù)不大可能治愈這些癌癥，并且通常需要化療和/或
放療來提高存活率。
肉的一部分，則進(jìn)行簡單的切除并且患者可以繼續(xù)接受針對未來癌癥發(fā)展的常規(guī)試驗。如
果癌癥是高級別或扁平/無蒂息肉的一部分，則可能需要更多手術(shù)并且將截取更大的余量；
這可能包括切除一部分結(jié)腸的部分結(jié)腸切除術(shù)。在階段2(T2)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤已經(jīng)生長
到結(jié)腸壁中并可能生長到附近組織中但尚未擴(kuò)散到附近的淋巴結(jié)。通常進(jìn)行腫瘤的手術(shù)移
除和部分結(jié)腸切除術(shù)?？梢允┯幂o助療法，例如用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸或卡培他濱
(capecitabine)的藥劑化療。此類腫瘤不大可能復(fù)發(fā)，但通常需要增加對患者的篩查。在階
段3(T3)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤已擴(kuò)散到附近的淋巴結(jié)但未擴(kuò)散到身體的其它部位。將需要手
術(shù)移除結(jié)腸部分和所有受感染的淋巴結(jié)。通常建議用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利
鉑(oxaliplatin)或卡培他濱與奧沙利鉑組合的藥劑化療。根據(jù)患者的年齡和腫瘤的侵襲
性，還可使用放療。在階段4(T4)結(jié)腸直腸癌中，腫瘤通過血液從結(jié)腸擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官。結(jié)腸直腸癌最常轉(zhuǎn)移至肝、肺和/或腹膜。手術(shù)不大可能治愈這些癌癥，并且通常需要化療和/或
放療來提高存活率。
[0095] 本文公開的方法通?？捎糜诮Y(jié)腸直腸癌的診斷和治療。在生物樣品中測量兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平，所述生物樣品是來自受試者的樣品。受試者
可以是具有一種或多種上述指示患者有結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險的癥狀的患者。受試者也可以是
沒有癥狀但是基于與結(jié)腸直腸癌較高風(fēng)險相關(guān)的年齡(例如50歲以上)；家族病史；肥胖；飲
食；飲酒；吸煙；結(jié)腸直腸息肉的先前診斷；種族和種族背景；炎性腸病以及遺傳綜合征，如家族性腺瘤性息肉病、加德納(Gardner)綜合征、林奇(Lynch)綜合征、透克(Turcot)綜合
征、普-杰二氏(Peutz-Jeghers)綜合征和MUTYH相關(guān)息肉病可能有患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險的
患者。本文公開的方法還可用于監(jiān)測先前已被診斷和治療結(jié)腸直腸癌的患者以監(jiān)測緩解和
檢測癌癥復(fù)發(fā)。
可以是具有一種或多種上述指示患者有結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險的癥狀的患者。受試者也可以是
沒有癥狀但是基于與結(jié)腸直腸癌較高風(fēng)險相關(guān)的年齡(例如50歲以上)；家族病史；肥胖；飲
食；飲酒；吸煙；結(jié)腸直腸息肉的先前診斷；種族和種族背景；炎性腸病以及遺傳綜合征，如家族性腺瘤性息肉病、加德納(Gardner)綜合征、林奇(Lynch)綜合征、透克(Turcot)綜合
征、普-杰二氏(Peutz-Jeghers)綜合征和MUTYH相關(guān)息肉病可能有患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險的
患者。本文公開的方法還可用于監(jiān)測先前已被診斷和治療結(jié)腸直腸癌的患者以監(jiān)測緩解和
檢測癌癥復(fù)發(fā)。
[0096] 在一些實施例中，通過病理學(xué)評估確定受試者(即人類或非人類動物患者)的疾病狀態(tài)。舉例來說，在一種類型的疾病(例如結(jié)腸直腸癌)中，疾病的程度被分級為階段1(T1)、階段2(T2)、階段3(T3)和階段4(T4)。結(jié)腸直腸癌可以是管狀腺癌、絨毛腺癌、胃腸間質(zhì)瘤、原發(fā)性結(jié)腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌或粘液癌。在另一類型的疾病
中(如炎性腸病)，通過疾病沿腸道的位置和組織學(xué)特征如肉芽腫、白細(xì)胞浸潤和/或隱窩膿
腫確定疾病狀態(tài)。用于確定疾病狀態(tài)的其它方法，如醫(yī)師確定、生理癥狀、糞便隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗、乙狀結(jié)腸鏡檢查、FIT-DNA、CT結(jié)腸成像或結(jié)腸鏡檢查也可以與本文公開
的方法結(jié)合使用。
中(如炎性腸病)，通過疾病沿腸道的位置和組織學(xué)特征如肉芽腫、白細(xì)胞浸潤和/或隱窩膿
腫確定疾病狀態(tài)。用于確定疾病狀態(tài)的其它方法，如醫(yī)師確定、生理癥狀、糞便隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗、乙狀結(jié)腸鏡檢查、FIT-DNA、CT結(jié)腸成像或結(jié)腸鏡檢查也可以與本文公開
的方法結(jié)合使用。
[0097] 還提供了確定受試者是否有腸道疾病風(fēng)險的方法。腸道疾病可包括腸癌、結(jié)腸直腸癌、指示癌前變化的腺瘤性息肉、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病或其它腸道疾
病。確定受試者是否有腸道疾病風(fēng)險的方法可以是通過使用本發(fā)明來檢測以下來確定：a)
脫氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)預(yù)測的氨基酸序列，其包含蛋白質(zhì)的主
鏈；d)核糖核酸生物標(biāo)志物的表達(dá)水平；e)預(yù)測氨基酸中序列的變異或f)上述任何組合，其
中對照和實驗樣品之間的差異可以指示受試者有患腸病的風(fēng)險。
病。確定受試者是否有腸道疾病風(fēng)險的方法可以是通過使用本發(fā)明來檢測以下來確定：a)
脫氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)預(yù)測的氨基酸序列，其包含蛋白質(zhì)的主
鏈；d)核糖核酸生物標(biāo)志物的表達(dá)水平；e)預(yù)測氨基酸中序列的變異或f)上述任何組合，其
中對照和實驗樣品之間的差異可以指示受試者有患腸病的風(fēng)險。
[0098] 所述方法和組合物還可用于為患有腸道疾病的受試者選擇臨床計劃。通過這種方法，臨床計劃可以包括施用進(jìn)一步診斷程序。在一些實施例中，臨床計劃可以包括治療方
法。
法。
[0099] 可以在有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險或患有結(jié)腸直腸癌的受試者中分析選自圖6(A組)或圖13(B組)的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平。在一些實施例中，可以在有
結(jié)腸直腸癌風(fēng)險或患有結(jié)腸直腸癌的受試者中分析選自圖6(A組)或圖13(B組)的一種、兩
種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平。圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直
腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以形成組。在一些實施例中，兩種或更多種生物標(biāo)志物可以包括
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、
50、60、70、80、90、100、120、140、160、180種更多種圖6(A組)或圖13(B組)中的標(biāo)志物的組合。在一些實施例中，標(biāo)志物可以含在差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇和/或與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的常見
途徑中。示例性途徑包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、染色體不穩(wěn)定性(CIN)和CpG島甲基化表型
(CIMP)。在一些實施例中，途徑可以是細(xì)胞組分途徑，應(yīng)力的細(xì)胞反應(yīng)，應(yīng)力和RNA結(jié)合途
徑。
結(jié)腸直腸癌風(fēng)險或患有結(jié)腸直腸癌的受試者中分析選自圖6(A組)或圖13(B組)的一種、兩
種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的水平。圖6(A組)或圖13(B組)中列出的結(jié)腸直
腸贅瘤生物標(biāo)志物基因可以形成組。在一些實施例中，兩種或更多種生物標(biāo)志物可以包括
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、
50、60、70、80、90、100、120、140、160、180種更多種圖6(A組)或圖13(B組)中的標(biāo)志物的組合。在一些實施例中，標(biāo)志物可以含在差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇和/或與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的常見
途徑中。示例性途徑包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、染色體不穩(wěn)定性(CIN)和CpG島甲基化表型
(CIMP)。在一些實施例中，途徑可以是細(xì)胞組分途徑，應(yīng)力的細(xì)胞反應(yīng)，應(yīng)力和RNA結(jié)合途
徑。
[0100] 例如，用于確定診斷、狀態(tài)或?qū)χ委煹姆磻?yīng)的算法可以確定特定臨床病況。本文所提供的方法中使用的算法可以是并入多個參數(shù)的數(shù)學(xué)函數(shù)，其可不受限制地定量使用醫(yī)療
設(shè)備、臨床評估分?jǐn)?shù)或生物樣品的生物/化學(xué)/物理試驗。每個數(shù)學(xué)函數(shù)可以是確定為與所
選臨床病況相關(guān)的參數(shù)水平(例如測量水平)的權(quán)重調(diào)整表達(dá)。由于技術(shù)涉及加權(quán)和評估多
個標(biāo)志物組，具有合理計算能力的計算機(jī)可用于分析數(shù)據(jù)。
設(shè)備、臨床評估分?jǐn)?shù)或生物樣品的生物/化學(xué)/物理試驗。每個數(shù)學(xué)函數(shù)可以是確定為與所
選臨床病況相關(guān)的參數(shù)水平(例如測量水平)的權(quán)重調(diào)整表達(dá)。由于技術(shù)涉及加權(quán)和評估多
個標(biāo)志物組，具有合理計算能力的計算機(jī)可用于分析數(shù)據(jù)。
[0101] 因此，診斷方法可以包括從有結(jié)腸直腸癌風(fēng)險或疑似患有結(jié)腸直腸癌的患者獲得糞便樣品；測定選自圖6(A組)或圖13(B組)中的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基
因的表達(dá)并通過并入選自結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因組中任一個的多個結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的機(jī)器學(xué)習(xí)算法提供帶有預(yù)定義系數(shù)的測試值。示例性機(jī)器學(xué)習(xí)算法包括
Support?Vector?Machine、Gradient?Boosting、Adaptive?Boosting、Random?Forest、
Naive?Bayes、Decision?Tree和k-Nearest?Neighbors。多個結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因
的表達(dá)相對于對照(例如健康個體群體)的顯著變化指示患者患有結(jié)腸直腸癌和/或癌前病
變的可能性增加。在一些實施例中，樣品中測量的表達(dá)水平用于推導(dǎo)或計算概率或置信度
分?jǐn)?shù)。這個數(shù)值從表達(dá)水平導(dǎo)出?；蛘呋蛄硗?，值可以從表達(dá)值與其它因素(例如患者的病
史、年齡和遺傳背景)的組合導(dǎo)出。在一些實施例中，方法可進(jìn)一步包含將試驗值傳達(dá)給患
者的步驟。
因的表達(dá)并通過并入選自結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因組中任一個的多個結(jié)腸直腸贅瘤
生物標(biāo)志物基因的機(jī)器學(xué)習(xí)算法提供帶有預(yù)定義系數(shù)的測試值。示例性機(jī)器學(xué)習(xí)算法包括
Support?Vector?Machine、Gradient?Boosting、Adaptive?Boosting、Random?Forest、
Naive?Bayes、Decision?Tree和k-Nearest?Neighbors。多個結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因
的表達(dá)相對于對照(例如健康個體群體)的顯著變化指示患者患有結(jié)腸直腸癌和/或癌前病
變的可能性增加。在一些實施例中，樣品中測量的表達(dá)水平用于推導(dǎo)或計算概率或置信度
分?jǐn)?shù)。這個數(shù)值從表達(dá)水平導(dǎo)出?；蛘呋蛄硗?，值可以從表達(dá)值與其它因素(例如患者的病
史、年齡和遺傳背景)的組合導(dǎo)出。在一些實施例中，方法可進(jìn)一步包含將試驗值傳達(dá)給患
者的步驟。
[0102] 可以(例如適當(dāng)?shù)亟?jīng)編程)使用和實施標(biāo)準(zhǔn)計算設(shè)備和系統(tǒng)以執(zhí)行本文所描述的方法，例如執(zhí)行測定本文所述值所需的計算。計算設(shè)備包括各種形式的數(shù)字計算機(jī)，如筆記
本電腦、臺式機(jī)、移動設(shè)備、工作站、個人數(shù)字助理、服務(wù)器、刀片式服務(wù)器、大型機(jī)和其它適當(dāng)?shù)挠嬎銠C(jī)。在一些實施例中，計算設(shè)備是移動設(shè)備，如個人數(shù)字助理、蜂窩式電話、智能電話、平板電腦或其它類似的計算設(shè)備。
本電腦、臺式機(jī)、移動設(shè)備、工作站、個人數(shù)字助理、服務(wù)器、刀片式服務(wù)器、大型機(jī)和其它適當(dāng)?shù)挠嬎銠C(jī)。在一些實施例中，計算設(shè)備是移動設(shè)備，如個人數(shù)字助理、蜂窩式電話、智能電話、平板電腦或其它類似的計算設(shè)備。
[0103] 在一些實施例中，計算機(jī)可用于將信息傳達(dá)給例如醫(yī)療保健專業(yè)人員?？梢酝ㄟ^使信息電子化(例如以安全的方式)將信息傳達(dá)給專業(yè)人員。舉例來說，可以將信息放在計
算機(jī)數(shù)據(jù)庫上，使得醫(yī)療保健專業(yè)人員可以訪問所述信息。另外，可以將信息傳達(dá)給專業(yè)人
員代理的醫(yī)院，診所或研究機(jī)構(gòu)。通過開放網(wǎng)絡(luò)(例如互聯(lián)網(wǎng)或電子郵件)傳輸?shù)男畔⒖梢?br>被加密?；颊叩幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)和分析可以通過加密存儲在云中。具有篡改保護(hù)的256位AES
方法可用于磁盤加密；SSL協(xié)議優(yōu)選地可以確保數(shù)據(jù)傳輸中的保護(hù)，并且密鑰管理技術(shù)
SHA2-HMAC可以允許對數(shù)據(jù)進(jìn)行認(rèn)證訪問。也可以使用其它安全數(shù)據(jù)存儲裝置。
算機(jī)數(shù)據(jù)庫上，使得醫(yī)療保健專業(yè)人員可以訪問所述信息。另外，可以將信息傳達(dá)給專業(yè)人
員代理的醫(yī)院，診所或研究機(jī)構(gòu)。通過開放網(wǎng)絡(luò)(例如互聯(lián)網(wǎng)或電子郵件)傳輸?shù)男畔⒖梢?br>被加密?；颊叩幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)和分析可以通過加密存儲在云中。具有篡改保護(hù)的256位AES
方法可用于磁盤加密；SSL協(xié)議優(yōu)選地可以確保數(shù)據(jù)傳輸中的保護(hù)，并且密鑰管理技術(shù)
SHA2-HMAC可以允許對數(shù)據(jù)進(jìn)行認(rèn)證訪問。也可以使用其它安全數(shù)據(jù)存儲裝置。
[0104] 上文此類分析的結(jié)果可以作為主治臨床醫(yī)生的隨訪和治療的基礎(chǔ)。如果選自圖6(A組)或圖13(B組)的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平并非顯著不
同于對照中相同的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，臨床醫(yī)生可以確定
患者目前沒有結(jié)腸直腸癌或癌前病變的風(fēng)險?？梢怨膭畲祟惢颊邔矸祷剡M(jìn)行重新篩查。
本文公開的方法可用于監(jiān)測結(jié)腸直腸贅瘤標(biāo)志物水平隨時間的任何變化。在初始篩查和/
或診斷后，可以監(jiān)測受試者任何時間長度。舉例來說，可以監(jiān)測受試者至少2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月或更長時間或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年。
同于對照中相同的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，臨床醫(yī)生可以確定
患者目前沒有結(jié)腸直腸癌或癌前病變的風(fēng)險?？梢怨膭畲祟惢颊邔矸祷剡M(jìn)行重新篩查。
本文公開的方法可用于監(jiān)測結(jié)腸直腸贅瘤標(biāo)志物水平隨時間的任何變化。在初始篩查和/
或診斷后，可以監(jiān)測受試者任何時間長度。舉例來說，可以監(jiān)測受試者至少2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60個月或更長時間或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年。
[0105] 本文公開的方法和組合物可用于為有結(jié)腸直腸贅瘤風(fēng)險或患有結(jié)腸直腸贅瘤的受試者選擇臨床計劃。臨床計劃可包括施用進(jìn)一步的診斷程序，例如糞便隱血試驗、糞便免
疫化學(xué)試驗或結(jié)腸鏡檢查以移除息肉或癌前病變。在一些實施例中，臨床計劃可以包括治
療方法。在一些實施例中，方法包括為患有結(jié)腸直腸癌的受試者選擇治療的方法。如果選自
圖6(A組)或圖13(B組)的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平顯著不同
于對照中相同的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，則患者可能患有
結(jié)腸直腸癌。在這些情況下，可以建議進(jìn)一步篩查，例如使用本文公開的方法提高篩查頻率
以及胎兒隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗和/或結(jié)腸鏡檢查。在一些實施例中，可以建議治療，包括例如結(jié)腸鏡檢查結(jié)合移除息肉、化療或手術(shù)(如腸切除術(shù))。因此，所述方法可用于測定
兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，然后確定治療過程。只要發(fā)生臨
床上有益的結(jié)果，就可以有效地治療受試者(即患者)。這可能意味著，例如疾病癥狀的完全
消退，疾病癥狀嚴(yán)重程度的降低，或疾病進(jìn)展的減緩。這些方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：
a)鑒定患有結(jié)腸直腸癌的受試者(例如患者，且更具體地說人類患者)；及b)向受試者提供
抗癌治療，例如治療劑、手術(shù)或放療。提供給受試者的引起疾病癥狀完全消退、疾病癥狀嚴(yán)
重度降低或疾病進(jìn)展減緩的一定量的治療劑被視為治療有效量。本發(fā)明方法還可以包括監(jiān)
測步驟以幫助最優(yōu)化給藥和日程安排以及預(yù)測結(jié)果。監(jiān)測還可以用于檢測抗藥性的發(fā)作，
以快速區(qū)分有反應(yīng)患者和無反應(yīng)患者或評估癌癥的復(fù)發(fā)。當(dāng)存在抗性或非反應(yīng)性跡象時，
臨床醫(yī)生可在腫瘤產(chǎn)生額外的逃避機(jī)制之前選擇替代性或輔助性藥劑。
疫化學(xué)試驗或結(jié)腸鏡檢查以移除息肉或癌前病變。在一些實施例中，臨床計劃可以包括治
療方法。在一些實施例中，方法包括為患有結(jié)腸直腸癌的受試者選擇治療的方法。如果選自
圖6(A組)或圖13(B組)的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平顯著不同
于對照中相同的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，則患者可能患有
結(jié)腸直腸癌。在這些情況下，可以建議進(jìn)一步篩查，例如使用本文公開的方法提高篩查頻率
以及胎兒隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗和/或結(jié)腸鏡檢查。在一些實施例中，可以建議治療，包括例如結(jié)腸鏡檢查結(jié)合移除息肉、化療或手術(shù)(如腸切除術(shù))。因此，所述方法可用于測定
兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，然后確定治療過程。只要發(fā)生臨
床上有益的結(jié)果，就可以有效地治療受試者(即患者)。這可能意味著，例如疾病癥狀的完全
消退，疾病癥狀嚴(yán)重程度的降低，或疾病進(jìn)展的減緩。這些方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：
a)鑒定患有結(jié)腸直腸癌的受試者(例如患者，且更具體地說人類患者)；及b)向受試者提供
抗癌治療，例如治療劑、手術(shù)或放療。提供給受試者的引起疾病癥狀完全消退、疾病癥狀嚴(yán)
重度降低或疾病進(jìn)展減緩的一定量的治療劑被視為治療有效量。本發(fā)明方法還可以包括監(jiān)
測步驟以幫助最優(yōu)化給藥和日程安排以及預(yù)測結(jié)果。監(jiān)測還可以用于檢測抗藥性的發(fā)作，
以快速區(qū)分有反應(yīng)患者和無反應(yīng)患者或評估癌癥的復(fù)發(fā)。當(dāng)存在抗性或非反應(yīng)性跡象時，
臨床醫(yī)生可在腫瘤產(chǎn)生額外的逃避機(jī)制之前選擇替代性或輔助性藥劑。
[0106] 本文公開的方法還可以與用于診斷和治療結(jié)腸直腸癌的常規(guī)方法組合使用。因此，診斷方法可以與結(jié)腸直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法一起使用。舉例來說，所述方法可以與糞便
隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗或結(jié)腸鏡檢查組合使用。所述方法還可以與其它結(jié)腸直腸癌
標(biāo)志物一起使用，例如KRAS、NRAS、BRAF、CEA、CA?19-9、p53、MSL、DCC和MMR。
隱血試驗、糞便免疫化學(xué)試驗或結(jié)腸鏡檢查組合使用。所述方法還可以與其它結(jié)腸直腸癌
標(biāo)志物一起使用，例如KRAS、NRAS、BRAF、CEA、CA?19-9、p53、MSL、DCC和MMR。
[0107] 本文公開的診斷方法還可以與結(jié)腸直腸癌治療組合使用。結(jié)腸直腸癌治療方法一般分為幾類：手術(shù)、化療、放療、靶向療法和免疫療法。手術(shù)可以包括結(jié)腸切除術(shù)，結(jié)腸造口術(shù)連同部分肝切除或直腸切除術(shù)。化療可以是全身化療或局部化療，其中化療劑直接放置
在受感染器官附近。示例性化療劑可包括5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其衍生物、伊立替康
(irinotecan)或其衍生物、甲酰四氫葉酸或卡培他濱、絲裂霉素C、順鉑和多柔比星
(doxorubicin)。放療可以是外部放療(使用機(jī)器將放射線引向癌癥)，或者內(nèi)部放療，其中
放射性物質(zhì)直接放置在結(jié)腸直腸癌中或附近。靶向藥劑可包括抗血管生成劑(如貝伐單抗
(bevacizumab))或EGFR抑制劑單克隆抗體(西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗
(panitumumab))，雷莫蘆單抗(ramuciramab)(抗VEGFR2)，阿柏西普(aflibercept)，瑞格非
尼(regorafenib)，三氟尿苷-提普來昔(tripfluridine-tipiracil)或其組合。靶向藥劑也
可以與標(biāo)準(zhǔn)化療劑組合。免疫療法可包括投予特異性抗體，例如抗PD-1抗體、抗PD-L-1抗體
和時間-CTLA-4抗體、抗-CD?27抗體；癌癥疫苗、過繼細(xì)胞療法、溶瘤病毒療法、輔助免疫療法和基于細(xì)胞因子的療法。其它治療方法包括干細(xì)胞移植、熱療、光動力療法、血液制品捐
贈和輸血或激光治療。
在受感染器官附近。示例性化療劑可包括5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其衍生物、伊立替康
(irinotecan)或其衍生物、甲酰四氫葉酸或卡培他濱、絲裂霉素C、順鉑和多柔比星
(doxorubicin)。放療可以是外部放療(使用機(jī)器將放射線引向癌癥)，或者內(nèi)部放療，其中
放射性物質(zhì)直接放置在結(jié)腸直腸癌中或附近。靶向藥劑可包括抗血管生成劑(如貝伐單抗
(bevacizumab))或EGFR抑制劑單克隆抗體(西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗
(panitumumab))，雷莫蘆單抗(ramuciramab)(抗VEGFR2)，阿柏西普(aflibercept)，瑞格非
尼(regorafenib)，三氟尿苷-提普來昔(tripfluridine-tipiracil)或其組合。靶向藥劑也
可以與標(biāo)準(zhǔn)化療劑組合。免疫療法可包括投予特異性抗體，例如抗PD-1抗體、抗PD-L-1抗體
和時間-CTLA-4抗體、抗-CD?27抗體；癌癥疫苗、過繼細(xì)胞療法、溶瘤病毒療法、輔助免疫療法和基于細(xì)胞因子的療法。其它治療方法包括干細(xì)胞移植、熱療、光動力療法、血液制品捐
贈和輸血或激光治療。
[0108] 我們可以使用術(shù)語“增加的(increased)”、“增加(increase)”或“上調(diào)的(up-regulated)”來通常意指生物標(biāo)志物水平的統(tǒng)計學(xué)上顯著量的增加。在一些實施例中，與對
照相比，增加可以是至少10％的增加，例如至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或至多且包括
100％增加的增加，或與對照相比在10％與100％之間的任何增加、或至少約0.5倍、或至少
約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或最少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍、或與對照相比在1.0倍與10倍或更大增加之間的任何增加。
照相比，增加可以是至少10％的增加，例如至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或至多且包括
100％增加的增加，或與對照相比在10％與100％之間的任何增加、或至少約0.5倍、或至少
約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或最少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍、或與對照相比在1.0倍與10倍或更大增加之間的任何增加。
[0109] 我們可以使用術(shù)語“減少(decrease)”、“減少的(decreased)”、“減小(reduced)”、“減小(reduction)”或“下調(diào)的(down-regulated)”來指真核生物標(biāo)志物水平的統(tǒng)計學(xué)上顯著量的降低。在一些實施例中，與對照相比，減少可以是至少10％的減少，例如至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或至多且包括100％減少(即與對照相比不存在)的減少，或與對照相
比在10％與100％之間的任何減少、或至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至
少約1.5倍、或至少約2倍、或最少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍、或與對照相比在1.0倍與10倍或更大減少之間的任何減少。
比在10％與100％之間的任何減少、或至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至
少約1.5倍、或至少約2倍、或最少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍、或與對照相比在1.0倍與10倍或更大減少之間的任何減少。
[0110] 真核生物標(biāo)志物的增加或真核生物標(biāo)志物的減少的統(tǒng)計顯著性可以表示為p值。根據(jù)特定的真核生物標(biāo)志物，p值可小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.002、小于0.001或小于0.0005。
[0111] 對照可以是從患者或一組患者獲得的生物樣品。在一些實施例中，對照可以是參考值?？梢詮囊驯辉\斷為健康的個體或個體群體獲得對照。健康個體可包括例如在上一年
內(nèi)的糞便寄生蟲試驗、糞便細(xì)菌試驗或內(nèi)窺鏡檢查中檢測為陰性的個體。可以從已被診斷
為患病的個體或個體群體獲得對照?；疾€體可包括例如在上一年內(nèi)的糞便寄生蟲試驗、
糞便細(xì)菌試驗或內(nèi)窺鏡檢查中檢測為陽性的個體。對照可以從先前已被診斷患有疾病但目
前處于緩解或目前未患所述疾病的個體或個體群體中獲得?？梢栽谝粋€、兩個或更多個時
間點從個體獲得對照。舉例來說，對照可以是在較早時間點從受試者獲得的生物樣品。對照
可以是特定生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)參考值?？梢曰谠u估具有相似年齡、性別(sex)、性別
(gender)、體型、品種，種族背景或一般健康狀況的個體來推導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)參考值。
內(nèi)的糞便寄生蟲試驗、糞便細(xì)菌試驗或內(nèi)窺鏡檢查中檢測為陰性的個體。可以從已被診斷
為患病的個體或個體群體獲得對照?；疾€體可包括例如在上一年內(nèi)的糞便寄生蟲試驗、
糞便細(xì)菌試驗或內(nèi)窺鏡檢查中檢測為陽性的個體。對照可以從先前已被診斷患有疾病但目
前處于緩解或目前未患所述疾病的個體或個體群體中獲得?？梢栽谝粋€、兩個或更多個時
間點從個體獲得對照。舉例來說，對照可以是在較早時間點從受試者獲得的生物樣品。對照
可以是特定生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)參考值?？梢曰谠u估具有相似年齡、性別(sex)、性別
(gender)、體型、品種，種族背景或一般健康狀況的個體來推導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)參考值。
[0112] 實驗樣品可以是從受試者獲得的生物樣品?？梢詮木哂幸阎蛭粗】禒顟B(tài)的受試者獲得實驗樣品。在一些實施例中，可以例如通過分析實驗樣品、活組織檢查、身體檢查、實驗室研究、目視檢查或遺傳分析來確定受試者的健康狀況。可以通過實驗樣品確定的受
試者的健康狀況可以是患病的、有疾病風(fēng)險的或健康的。
試者的健康狀況可以是患病的、有疾病風(fēng)險的或健康的。
[0113] 制品
[0114] 還提供了用于檢測和定量生物樣品(例如糞便樣品)中的所選結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物的試劑盒。因此，包裝產(chǎn)品(例如，含有一種或多種本文所述組合物并且以濃縮或即
用濃度包裝用于儲存、運(yùn)輸或銷售的無菌容器)和試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。產(chǎn)品可以包
括含有一種或多種本發(fā)明組合物的容器(例如，小瓶、廣口瓶、瓶、袋、微量板、微芯片或珠粒)。另外，制品可以進(jìn)一步包括例如包裝材料、使用說明書、注射器、遞送裝置、緩沖劑或其它控制試劑。
用濃度包裝用于儲存、運(yùn)輸或銷售的無菌容器)和試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。產(chǎn)品可以包
括含有一種或多種本發(fā)明組合物的容器(例如，小瓶、廣口瓶、瓶、袋、微量板、微芯片或珠粒)。另外，制品可以進(jìn)一步包括例如包裝材料、使用說明書、注射器、遞送裝置、緩沖劑或其它控制試劑。
[0115] 試劑盒可以包括能夠檢測生物樣品中對應(yīng)于選自圖6(A組)或圖13(B組)的兩種或更多種結(jié)腸直腸贅瘤生物標(biāo)志物基因的RNA的化合物或藥劑；和標(biāo)準(zhǔn)品；和任選地執(zhí)行檢
測、定量或擴(kuò)增所必需的一種或多種試劑。在一些實施例中，試劑盒可以包括能夠檢測生物
樣品中對應(yīng)于B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的RNA的化合物
或藥劑；和標(biāo)準(zhǔn)品；和任選地執(zhí)行檢測、定量或擴(kuò)增所必需的一種或多種試劑?；衔?、藥劑和/或試劑可以包裝在合適的容器中。試劑盒可以進(jìn)一步包含使用試劑盒檢測和定量核酸
的說明書。舉例來說，試劑盒可以包括：(1)與對應(yīng)于選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸
直腸生物標(biāo)志物基因、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的核
酸序列雜交的探針，例如寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸，或(2)可用于擴(kuò)增對應(yīng)于
選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸直腸生物標(biāo)志物基因、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物
或免疫球蛋白中的兩種或更多種的核酸分子的一對引物。試劑盒可以進(jìn)一步包括可用于擴(kuò)
增一種或多種管家基因的探針和引物。試劑盒還可以包括緩沖劑、防腐劑和/或核酸或蛋白
質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包括檢測可檢測藥劑(例如酶或底物)所必需的組分。試劑盒還可
以含有一對照或一系列對照，可以對其進(jìn)行分析并且與所含有的測試樣品進(jìn)行比較。試劑
盒的每種組分可以密封在個別容器內(nèi)并且所有各種容器可以連同用于解釋使用所述試劑
盒進(jìn)行的分析的結(jié)果的說明書一起在單一包裝內(nèi)。在一些實施例中，試劑盒可以包括對一
種或多種對照標(biāo)志物具有特異性的引物或寡核苷酸探針。在一些實施例中，試劑盒包括特
異性用于定量選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸直腸生物標(biāo)志物、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)
胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的試劑。
測、定量或擴(kuò)增所必需的一種或多種試劑。在一些實施例中，試劑盒可以包括能夠檢測生物
樣品中對應(yīng)于B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的RNA的化合物
或藥劑；和標(biāo)準(zhǔn)品；和任選地執(zhí)行檢測、定量或擴(kuò)增所必需的一種或多種試劑?；衔?、藥劑和/或試劑可以包裝在合適的容器中。試劑盒可以進(jìn)一步包含使用試劑盒檢測和定量核酸
的說明書。舉例來說，試劑盒可以包括：(1)與對應(yīng)于選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸
直腸生物標(biāo)志物基因、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的核
酸序列雜交的探針，例如寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸，或(2)可用于擴(kuò)增對應(yīng)于
選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸直腸生物標(biāo)志物基因、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)胞標(biāo)志物
或免疫球蛋白中的兩種或更多種的核酸分子的一對引物。試劑盒可以進(jìn)一步包括可用于擴(kuò)
增一種或多種管家基因的探針和引物。試劑盒還可以包括緩沖劑、防腐劑和/或核酸或蛋白
質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包括檢測可檢測藥劑(例如酶或底物)所必需的組分。試劑盒還可
以含有一對照或一系列對照，可以對其進(jìn)行分析并且與所含有的測試樣品進(jìn)行比較。試劑
盒的每種組分可以密封在個別容器內(nèi)并且所有各種容器可以連同用于解釋使用所述試劑
盒進(jìn)行的分析的結(jié)果的說明書一起在單一包裝內(nèi)。在一些實施例中，試劑盒可以包括對一
種或多種對照標(biāo)志物具有特異性的引物或寡核苷酸探針。在一些實施例中，試劑盒包括特
異性用于定量選自選自圖6(A組)或圖13(B組)的結(jié)腸直腸生物標(biāo)志物、或B細(xì)胞標(biāo)志物、T細(xì)
胞標(biāo)志物或免疫球蛋白中的兩種或更多種的試劑。
[0116] 在一些實施例中，試劑盒可以包括特異性用于從患者糞便樣品將人類細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞和其它糞便組分分離和提取人類mRNA的試劑。因此，試劑盒可以包括緩沖液、乳液珠
粒、二氧化硅珠粒、穩(wěn)定試劑和各種用于離心的過濾器和容器。試劑盒還可以包括用于糞便
處理，以最小化樣品的污染并確保糞便樣品中人類mRNA的穩(wěn)定性的說明。試劑盒還可以包
括確保樣品保存的物品，例如冷卻劑或加熱包。在一些實施例中，試劑盒可以包括糞便收集
裝置。
粒、二氧化硅珠粒、穩(wěn)定試劑和各種用于離心的過濾器和容器。試劑盒還可以包括用于糞便
處理，以最小化樣品的污染并確保糞便樣品中人類mRNA的穩(wěn)定性的說明。試劑盒還可以包
括確保樣品保存的物品，例如冷卻劑或加熱包。在一些實施例中，試劑盒可以包括糞便收集
裝置。
[0117] 產(chǎn)品還可以包括圖例(例如，印刷標(biāo)簽或插入物或描述產(chǎn)品使用的其它介質(zhì)(例如，音頻或錄像帶或計算機(jī)可讀介質(zhì)))。圖例可以與容器相關(guān)聯(lián)(例如，附著到容器)并且可
以描述可以使用試劑的方式。試劑可以準(zhǔn)備好使用(例如，存在于適當(dāng)單位中)，并且可以包
括一種或多種另外的佐劑、載體或其它稀釋劑?；蛘?，試劑可以用稀釋劑并且根據(jù)對稀釋度
的說明以濃縮形式提供。
以描述可以使用試劑的方式。試劑可以準(zhǔn)備好使用(例如，存在于適當(dāng)單位中)，并且可以包
括一種或多種另外的佐劑、載體或其它稀釋劑?；蛘?，試劑可以用稀釋劑并且根據(jù)對稀釋度
的說明以濃縮形式提供。
[0118] 實例
[0119] 實例1：人類糞便樣品采集
[0120] 人類糞便收集：要求患者排便到套在馬桶座上的桶中，并將所得樣品儲存在冷凍柜中，直到所述樣品被運(yùn)送到哈爾科夫國立醫(yī)科大學(xué)(Kharkiv?National?Medical?
University)(烏克蘭哈爾科夫(Kharkiv,Ukraine))。將糞便等分到50mL錐形管中并儲存
在-80℃。將樣品在干冰上從哈爾科夫國立醫(yī)科大學(xué)裝運(yùn)到Capital?Biosciences(馬里蘭
州蓋瑟斯堡(Gaithersburg,MD))，并立即轉(zhuǎn)移到-80℃冷凍柜。將樣品在干冰上從那里裝運(yùn)
到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯(Saint?Louis,MO))，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
University)(烏克蘭哈爾科夫(Kharkiv,Ukraine))。將糞便等分到50mL錐形管中并儲存
在-80℃。將樣品在干冰上從哈爾科夫國立醫(yī)科大學(xué)裝運(yùn)到Capital?Biosciences(馬里蘭
州蓋瑟斯堡(Gaithersburg,MD))，并立即轉(zhuǎn)移到-80℃冷凍柜。將樣品在干冰上從那里裝運(yùn)
到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯(Saint?Louis,MO))，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
[0121] 人類樣品類型：從195例結(jié)腸直腸癌(I-IV期)患者、126例癌前腺瘤患者、125例結(jié)腸鏡檢查結(jié)果陰性患者和8例良性息肉患者獲得糞便樣品，產(chǎn)生總計454個樣品。健康個體
是沒有結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、脂瀉病、腸易激綜合征、最近20天內(nèi)腹瀉或任何其它胃腸疾
病史的患者?；疾〉膫€體是被診斷患有結(jié)腸直腸癌和癌前息肉的患者。結(jié)腸直腸癌患者在
過去一個月內(nèi)通過結(jié)腸鏡檢查和隨后的活組織檢查被診斷為I期-IV期結(jié)腸直腸癌，并且尚
未接受任何活組織檢查后治療，所述治療可以包括化療、放射和/或手術(shù)。息肉患者在進(jìn)行
結(jié)腸鏡檢查之前提供糞便樣品，其中醫(yī)生通過隨后的活組織檢查和組織學(xué)評估檢測到被認(rèn)
為是癌前的息肉?；谛詣e和年齡段(50-60歲、60-70歲、70-80歲和80-90歲)，健康個體與
息肉和癌癥患者匹配。本研究使用的患者都獲得Capital?Biosciences的同意。舒爾曼內(nèi)部
審查委員會(Schulman?Internal?Review?Board)為本研究提供了道德監(jiān)督。
是沒有結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、脂瀉病、腸易激綜合征、最近20天內(nèi)腹瀉或任何其它胃腸疾
病史的患者?；疾〉膫€體是被診斷患有結(jié)腸直腸癌和癌前息肉的患者。結(jié)腸直腸癌患者在
過去一個月內(nèi)通過結(jié)腸鏡檢查和隨后的活組織檢查被診斷為I期-IV期結(jié)腸直腸癌，并且尚
未接受任何活組織檢查后治療，所述治療可以包括化療、放射和/或手術(shù)。息肉患者在進(jìn)行
結(jié)腸鏡檢查之前提供糞便樣品，其中醫(yī)生通過隨后的活組織檢查和組織學(xué)評估檢測到被認(rèn)
為是癌前的息肉?；谛詣e和年齡段(50-60歲、60-70歲、70-80歲和80-90歲)，健康個體與
息肉和癌癥患者匹配。本研究使用的患者都獲得Capital?Biosciences的同意。舒爾曼內(nèi)部
審查委員會(Schulman?Internal?Review?Board)為本研究提供了道德監(jiān)督。
[0122] 實例2：人類核酸提取
[0123] 總核酸提?。簩⒚總€糞便樣品放到50mL錐形管中。添加約1,000-25,000mg糞便到每個管。添加另外的20-40mL溶液到每個管。這種溶液含有漢克斯平衡鹽溶液(Hanks?
Balanced?Salt?Solution，HBSS)(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))與0.05％Tween-20
(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧德里奇)的混合物。將糞便懸浮到
溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清
液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)到球粒并且將球粒再懸浮到溶液
中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。在差速離心期間，溶液分成三層。
底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部
的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。
這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水層，
并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸
頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到 一次性料筒(Disposable?
cartridge)(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)到料
筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與
珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個核酸溶液移取到
1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同 一次性料
筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外的2mL親水層以篩選出
大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器將
珠粒混合到溶液中0.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠
粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個核酸溶液移取到已經(jīng)
含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
Balanced?Salt?Solution，HBSS)(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))與0.05％Tween-20
(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧德里奇)的混合物。將糞便懸浮到
溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清
液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)到球粒并且將球粒再懸浮到溶液
中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。在差速離心期間，溶液分成三層。
底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部
的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。
這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水層，
并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸
頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到 一次性料筒(Disposable?
cartridge)(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)到料
筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與
珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個核酸溶液移取到
1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同 一次性料
筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外的2mL親水層以篩選出
大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器將
珠粒混合到溶液中0.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠
粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個核酸溶液移取到已經(jīng)
含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
[0124] DNA酶處理：將140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃處理20-40分鐘。將1-2mL等分的 裂解緩沖液添加到DNA酶處理的溶液中，并將樣品轉(zhuǎn)移
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
[0125] 實例3：人類糞便樣品中的人類核酸水平的測量
[0126] 提取結(jié)果：使用以上提取的樣品，使用安捷倫2100生物分析儀(Bioanalyzer)評估1μL的總核酸和RNA完整性。定性和定量分析樣品。電泳分析用于檢查提取的RNA的品質(zhì)。通
過凝膠電泳分析生物分析儀輸出的結(jié)果，如圖1和圖2所示。通過比較每個樣品的條帶與RNA
梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一泳道中)并鑒定18S和28S核糖體RNA
條帶來讀取電泳文件(圖1)。核糖體RNA(rRNA)是標(biāo)準(zhǔn)化梯上2,000個核苷酸標(biāo)志物周圍的
兩個大而突出的條帶。定性地，足夠的條帶化和較暗的條帶強(qiáng)度表明足夠的完整核酸可用
于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。圖2展示了電泳圖的一實例。電泳圖是每個電泳的圖形表示，其中定量了總RNA質(zhì)量、RIN和總
rRNA質(zhì)量。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性的信息。分析每個樣品的電泳圖式
和電泳圖以確定樣品是否符合下游分析的條件。在一個實例中，分析使用本發(fā)明中描述的
方法提取的120個樣品的RNA品質(zhì)，使得在分析的120個樣品中，110個通過RNA完整性和RNA
質(zhì)量的品質(zhì)檢查(圖3)。
過凝膠電泳分析生物分析儀輸出的結(jié)果，如圖1和圖2所示。通過比較每個樣品的條帶與RNA
梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一泳道中)并鑒定18S和28S核糖體RNA
條帶來讀取電泳文件(圖1)。核糖體RNA(rRNA)是標(biāo)準(zhǔn)化梯上2,000個核苷酸標(biāo)志物周圍的
兩個大而突出的條帶。定性地，足夠的條帶化和較暗的條帶強(qiáng)度表明足夠的完整核酸可用
于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。圖2展示了電泳圖的一實例。電泳圖是每個電泳的圖形表示，其中定量了總RNA質(zhì)量、RIN和總
rRNA質(zhì)量。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性的信息。分析每個樣品的電泳圖式
和電泳圖以確定樣品是否符合下游分析的條件。在一個實例中，分析使用本發(fā)明中描述的
方法提取的120個樣品的RNA品質(zhì)，使得在分析的120個樣品中，110個通過RNA完整性和RNA
質(zhì)量的品質(zhì)檢查(圖3)。
[0127] 電泳圖和電泳跡線用于比較通過品質(zhì)檢查的樣品，使用本發(fā)明中描述的RNA提取方法與文獻(xiàn)中描述的RNA提取方法相比較。與文獻(xiàn)中描述的方案相比，上文所描述的核酸提
取方法將平均RIN增加到4.88(n＝168)。另外，完成方案所需的總時間從3天減少到5小時。
總RNA提取方法使符合轉(zhuǎn)錄物組分析條件的樣品數(shù)從如文獻(xiàn)中所述的50％顯著增加到所描
述方案中的98.2％(n＝168；p<0.0001)，如通過核糖體RNA完整性和質(zhì)量測量(圖4)。
取方法將平均RIN增加到4.88(n＝168)。另外，完成方案所需的總時間從3天減少到5小時。
總RNA提取方法使符合轉(zhuǎn)錄物組分析條件的樣品數(shù)從如文獻(xiàn)中所述的50％顯著增加到所描
述方案中的98.2％(n＝168；p<0.0001)，如通過核糖體RNA完整性和質(zhì)量測量(圖4)。
[0128] 實例4：RNA轉(zhuǎn)錄物的分析
[0129] 在進(jìn)行總RNA提取的454個樣品中，使用安捷倫生物分析儀基于直接觀察核糖體RNA條帶，這些樣品中的399個符合轉(zhuǎn)錄物組分析的條件。隨后，從399個可用樣品中隨機(jī)選
擇342個樣品使用昂飛GeneChipTM人類轉(zhuǎn)錄物組陣列(Human?Transcriptome?Array)2.0(加
利福尼亞州圣克拉拉)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄物組分析。在這342個樣品中，4個樣品擴(kuò)增失敗，8個具有
息肉的患者通過隨后的活組織檢查確定為具有增生性良性息肉。從分析中去除這12個樣
品，得到330個樣品用于最終分析。
擇342個樣品使用昂飛GeneChipTM人類轉(zhuǎn)錄物組陣列(Human?Transcriptome?Array)2.0(加
利福尼亞州圣克拉拉)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄物組分析。在這342個樣品中，4個樣品擴(kuò)增失敗，8個具有
息肉的患者通過隨后的活組織檢查確定為具有增生性良性息肉。從分析中去除這12個樣
品，得到330個樣品用于最終分析。
[0130] 用Ambio?WT-pico試劑盒擴(kuò)增約100ng不含DNA酶的糞便RNA，隨后按照制造商的方案與昂飛GeneChipTM人類轉(zhuǎn)錄物組陣列2.0雜交。使用信號空間變換-穩(wěn)健多陣列分析
(Signal?Space?Transformation-Robust?Multiarray?Analysis，SST-RMA)與昂飛
TM
Expression?Console 對所有樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
(Signal?Space?Transformation-Robust?Multiarray?Analysis，SST-RMA)與昂飛
TM
Expression?Console 對所有樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0131] 在昂飛微陣列中的70,523個轉(zhuǎn)錄物簇中，預(yù)選擇對應(yīng)于3,977個基因的5,149個轉(zhuǎn)錄物簇的子集以評估差異表達(dá)。這種初始選擇降低了錯誤發(fā)現(xiàn)率并過濾出在癌癥發(fā)展和進(jìn)
展中沒有已知功能的基因。我們探索了七種機(jī)器學(xué)習(xí)分類器(支持向量機(jī)、梯度增強(qiáng)、自適
應(yīng)增強(qiáng)、隨機(jī)森林、樸素貝葉斯、決策樹和k-最近鄰居)用于結(jié)腸直腸贅瘤檢測。
展中沒有已知功能的基因。我們探索了七種機(jī)器學(xué)習(xí)分類器(支持向量機(jī)、梯度增強(qiáng)、自適
應(yīng)增強(qiáng)、隨機(jī)森林、樸素貝葉斯、決策樹和k-最近鄰居)用于結(jié)腸直腸贅瘤檢測。
[0132] 將330個個體分成265個個體的訓(xùn)練集和65個個體的測試集。訓(xùn)練集用于鑒定差異表達(dá)的基因并構(gòu)建計算模型，而測試集用于確定計算模型的檢測準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)LIMMA包用于
鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物簇的子集，其在具有癌前腺瘤或CRC的個體與結(jié)腸鏡檢查結(jié)果為無的個體之
間差異表達(dá)。根據(jù)對數(shù)幾率分?jǐn)?shù)將所有生物標(biāo)志物排列，并且200個排名最高的生物標(biāo)志物
(p<0.05)充當(dāng)構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型的特征(圖4)。描述這些基因的分級聚簇的熱圖概述于圖
5A中，并且與差異表達(dá)的基因相關(guān)的顯著途徑概述于圖5B中。有五個基因簇與三個群體中
的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物相關(guān)聯(lián)，以將患有結(jié)腸直腸贅瘤的個體與健康個體分離。差異表達(dá)的
途徑展示22種共同GeneGO經(jīng)典途徑的富集，其中絕大多數(shù)(77.7％)是細(xì)胞組分途徑的上
調(diào)。最值得注意的是細(xì)胞對應(yīng)力的反應(yīng)、對應(yīng)力的反應(yīng)和RNA結(jié)合的上調(diào)。通過用GAGE軟件
分析前200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇來鑒定與疾病相關(guān)的共同途徑。與疾病相關(guān)的途徑展示
于圖5B中。選擇具有RBF內(nèi)核的支持向量機(jī)模型(v-SVM)用于模型開發(fā)。核函數(shù)允許通過將
特征擴(kuò)展到未明確計算的更高維空間來計算個體之間的距離。SVM找到分隔標(biāo)簽組的最大
邊距超平面。參數(shù)v限定用于確定最大邊距的個體的分?jǐn)?shù)的下限。使用來自訓(xùn)練集中所有
265個個體的200個轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平訓(xùn)練SVM模型。這種多靶RNA生物標(biāo)志物算法用于測試
集內(nèi)的65個個體，并且篩選結(jié)腸鏡檢查結(jié)果陽性的所有個體中檢測到79％(43個當(dāng)中的34
個)。算法正確預(yù)測了95％的具有5mm至12mm大小范圍內(nèi)的癌前腺瘤的個體、57％的患有I期
結(jié)腸直腸癌的個體、75％的患有II期結(jié)腸直腸癌的個體、66％的患有II期結(jié)腸直腸癌的個
體、以及83％的患有IV期結(jié)腸直腸癌的個體。模型對結(jié)腸直腸癌的靈敏度與大小直接相關(guān)，
使得60％的≤3.5cm的腫瘤被準(zhǔn)確檢測到，而83％的大小≥5.0cm的腫瘤被準(zhǔn)確檢測到。模
型獲得59％的特異性，其中22個結(jié)腸鏡檢查結(jié)果陰性的個體中的13個被模型正確鑒定?？?br>的來說，模型對結(jié)腸直腸贅瘤的靈敏度為79％，對癌前腺瘤的靈敏度為95％并且特異性為
59％。
鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物簇的子集，其在具有癌前腺瘤或CRC的個體與結(jié)腸鏡檢查結(jié)果為無的個體之
間差異表達(dá)。根據(jù)對數(shù)幾率分?jǐn)?shù)將所有生物標(biāo)志物排列，并且200個排名最高的生物標(biāo)志物
(p<0.05)充當(dāng)構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型的特征(圖4)。描述這些基因的分級聚簇的熱圖概述于圖
5A中，并且與差異表達(dá)的基因相關(guān)的顯著途徑概述于圖5B中。有五個基因簇與三個群體中
的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物相關(guān)聯(lián)，以將患有結(jié)腸直腸贅瘤的個體與健康個體分離。差異表達(dá)的
途徑展示22種共同GeneGO經(jīng)典途徑的富集，其中絕大多數(shù)(77.7％)是細(xì)胞組分途徑的上
調(diào)。最值得注意的是細(xì)胞對應(yīng)力的反應(yīng)、對應(yīng)力的反應(yīng)和RNA結(jié)合的上調(diào)。通過用GAGE軟件
分析前200個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物簇來鑒定與疾病相關(guān)的共同途徑。與疾病相關(guān)的途徑展示
于圖5B中。選擇具有RBF內(nèi)核的支持向量機(jī)模型(v-SVM)用于模型開發(fā)。核函數(shù)允許通過將
特征擴(kuò)展到未明確計算的更高維空間來計算個體之間的距離。SVM找到分隔標(biāo)簽組的最大
邊距超平面。參數(shù)v限定用于確定最大邊距的個體的分?jǐn)?shù)的下限。使用來自訓(xùn)練集中所有
265個個體的200個轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平訓(xùn)練SVM模型。這種多靶RNA生物標(biāo)志物算法用于測試
集內(nèi)的65個個體，并且篩選結(jié)腸鏡檢查結(jié)果陽性的所有個體中檢測到79％(43個當(dāng)中的34
個)。算法正確預(yù)測了95％的具有5mm至12mm大小范圍內(nèi)的癌前腺瘤的個體、57％的患有I期
結(jié)腸直腸癌的個體、75％的患有II期結(jié)腸直腸癌的個體、66％的患有II期結(jié)腸直腸癌的個
體、以及83％的患有IV期結(jié)腸直腸癌的個體。模型對結(jié)腸直腸癌的靈敏度與大小直接相關(guān)，
使得60％的≤3.5cm的腫瘤被準(zhǔn)確檢測到，而83％的大小≥5.0cm的腫瘤被準(zhǔn)確檢測到。模
型獲得59％的特異性，其中22個結(jié)腸鏡檢查結(jié)果陰性的個體中的13個被模型正確鑒定?？?br>的來說，模型對結(jié)腸直腸贅瘤的靈敏度為79％，對癌前腺瘤的靈敏度為95％并且特異性為
59％。
[0133] 技術(shù)和生物重復(fù)顯示所有基因的發(fā)光水平高度一致(圖10)。完美的技術(shù)重復(fù)，其中RNA在同一天被分離和評估，顯示出最高水平的一致性(R2>0.990)(圖10A)。由時間分隔
2
的技術(shù)重復(fù)也顯示出高水平的一致性(R>0.989)。通過在同一天提取兩個重復(fù)的RNA來獲
得這些重復(fù)，然而在第0天分析一個重復(fù)，并在6個月后分析第二個重復(fù)(圖10B)。最后，生物重復(fù)也顯示出高水平的一致性(R2>0.986)。通過從來源于同一個體的糞便的不同區(qū)段獲取
樣品來產(chǎn)生這些生物重復(fù)(圖10C)。在不同日期分別提取RNA并分析。
2
的技術(shù)重復(fù)也顯示出高水平的一致性(R>0.989)。通過在同一天提取兩個重復(fù)的RNA來獲
得這些重復(fù)，然而在第0天分析一個重復(fù)，并在6個月后分析第二個重復(fù)(圖10B)。最后，生物重復(fù)也顯示出高水平的一致性(R2>0.986)。通過從來源于同一個體的糞便的不同區(qū)段獲取
樣品來產(chǎn)生這些生物重復(fù)(圖10C)。在不同日期分別提取RNA并分析。
[0134] 當(dāng)僅分析與結(jié)腸直腸癌發(fā)展或進(jìn)展有關(guān)的5,149個基因(全轉(zhuǎn)錄物組的一子集)時，調(diào)整后的R平方值對于所有三個重復(fù)群組都得到改善。這些重復(fù)顯示出如上所述的相當(dāng)
水平的一致性(圖11A-C)。
水平的一致性(圖11A-C)。
[0135] 實例5：動物糞便樣品采集
[0136] 糞便收集：樣品在密蘇里州圣路易斯當(dāng)?shù)赜韶埡凸分魅耸占?。在貓排便到貓砂箱中時，要求貓主人將樣品轉(zhuǎn)移到50mL錐形管中并將管儲存在-20℃下。在狗在戶外排便時，
要求狗主人將樣品轉(zhuǎn)移到50mL錐形管中并將管儲存在-20℃下。在收集的一周內(nèi)，將樣品收
集并且人工地轉(zhuǎn)移到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯)，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
要求狗主人將樣品轉(zhuǎn)移到50mL錐形管中并將管儲存在-20℃下。在收集的一周內(nèi)，將樣品收
集并且人工地轉(zhuǎn)移到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯)，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
[0137] 樣品類型：糞便樣品都從不同年齡、品種和性別的健康動物獲得。從4只不同的貓收集4個樣品，從4只不同的狗收集另外的4個樣品，產(chǎn)生總計8個樣品。最近有一只貓被診斷
出患有癬，但所有其它動物都沒有癥狀，并且在過去30天內(nèi)沒有展現(xiàn)出任何腸胃不適的跡
象。
出患有癬，但所有其它動物都沒有癥狀，并且在過去30天內(nèi)沒有展現(xiàn)出任何腸胃不適的跡
象。
[0138] 實例6：動物核酸提取
[0139] 總核酸提?。簩⒚總€糞便樣品放到50mL錐形管中。添加約1,000-25,000mg糞便到每個管。添加另外的20-40mL溶液到每個管。這種溶液含有漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)(西格
瑪-奧德里奇)與0.05％Tween-20(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧
德里奇)的混合物。將糞便懸浮到溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以
1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)
到球粒并且將球粒再懸浮到溶液中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。
在差速離心期間，溶液分成三層。底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水
層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-
25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎
片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎
片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到
一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅
(bioMerieux)到料筒。使用移液器將珠粒混合到溶液中0.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使
用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同
一次性料筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外
的2mL親水層以篩選出大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)
到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到已經(jīng)含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
瑪-奧德里奇)與0.05％Tween-20(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧
德里奇)的混合物。將糞便懸浮到溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以
1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)
到球粒并且將球粒再懸浮到溶液中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。
在差速離心期間，溶液分成三層。底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水
層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-
25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎
片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎
片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到
一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅
(bioMerieux)到料筒。使用移液器將珠粒混合到溶液中0.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使
用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同
一次性料筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外
的2mL親水層以篩選出大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)
到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到已經(jīng)含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
[0140] DNA酶處理：將140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃處理20-40分鐘。將1-2mL等分的 裂解緩沖液添加到DNA酶處理的溶液中，并將樣品轉(zhuǎn)移
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
[0141] 實例7：動物糞便樣品中的核酸水平的測量
[0142] 提取結(jié)果：使用以上提取的樣品，使用安捷倫2100生物分析儀評估1μL每個樣品的總核酸和RNA完整性。定性和定量分析樣品。通過凝膠電泳分析生物分析儀輸出的結(jié)果，如
圖7中所示。圖7中的圖展示來自使用安捷倫RNA6000?Nano?Kits運(yùn)行的8個樣品的1μL的RNA
生物分析儀跡線。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性和質(zhì)量的信息。通過比較每
個樣品的條帶與RNA梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一泳道中)并鑒定
18S和28S真核核糖體RNA條帶來讀取電泳文件。定性地，足夠的條帶化和較暗的條帶強(qiáng)度表
明足夠的完整核酸可用于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。還使用RNA完整性數(shù)定性分析樣品品質(zhì)。圖7B展示了使用安捷倫RNA?
6000?Nano?Kits運(yùn)行的相同8個樣品中的每一個的RNA完整性值。還定量分析樣品質(zhì)量。圖
7C展示了使用安捷倫RNA?6000?Nano?Kits運(yùn)行的相同8個樣品的估算真核RNA濃度(μg/μ
L)。使用生物分析儀跡線的曲線下面積估算真核RNA濃度。如圖7B-C中所示，所有樣品的平
均RIN是4.2并且所有樣品的平均真核質(zhì)量是61.4ng/μL。定量和定性測量表明，所有樣品都
符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件(n＝8)。
圖7中所示。圖7中的圖展示來自使用安捷倫RNA6000?Nano?Kits運(yùn)行的8個樣品的1μL的RNA
生物分析儀跡線。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性和質(zhì)量的信息。通過比較每
個樣品的條帶與RNA梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一泳道中)并鑒定
18S和28S真核核糖體RNA條帶來讀取電泳文件。定性地，足夠的條帶化和較暗的條帶強(qiáng)度表
明足夠的完整核酸可用于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲。還使用RNA完整性數(shù)定性分析樣品品質(zhì)。圖7B展示了使用安捷倫RNA?
6000?Nano?Kits運(yùn)行的相同8個樣品中的每一個的RNA完整性值。還定量分析樣品質(zhì)量。圖
7C展示了使用安捷倫RNA?6000?Nano?Kits運(yùn)行的相同8個樣品的估算真核RNA濃度(μg/μ
L)。使用生物分析儀跡線的曲線下面積估算真核RNA濃度。如圖7B-C中所示，所有樣品的平
均RIN是4.2并且所有樣品的平均真核質(zhì)量是61.4ng/μL。定量和定性測量表明，所有樣品都
符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件(n＝8)。
[0143] 實例8：動物糞便樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄物的分析
[0144] 使用RT-qPCR評估符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件的所有犬樣品(n＝4)。對于這四個犬樣品，設(shè)計了5個引物以評估犬基因組的部分。通過評估犬T細(xì)胞上IgM的重鏈，設(shè)計兩
個引物充當(dāng)陽性對照。設(shè)計三個另外的引物以評估可以在犬淋巴前體中發(fā)生的兩次單獨重
排以檢測T細(xì)胞特異性RNA。每個RT-PCR反應(yīng)含有10μL?2×主混合物(Master?Mix)(新英格
蘭生物實驗室(New?England?Biolabs))、1μL?20×酶混合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL
的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?
20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技(Thermo?Scientific))。
使用應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied?Biosystems)QuantStudio5qPCR機(jī)器擴(kuò)增核酸。熱循環(huán)儀方案
如下：°°在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10
秒和在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲
線°。在進(jìn)行總RNA提取的4個犬樣品中，75％的樣品顯示陽性對照(C-μIgM)的擴(kuò)增(圖8A)。
在顯示陽性對照擴(kuò)增的個體中，100％(n＝3)顯示兩種T細(xì)胞特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。一種
T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物以35個循環(huán)擴(kuò)增，并且另一T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物以50個循環(huán)擴(kuò)增(圖
8B)。
個引物充當(dāng)陽性對照。設(shè)計三個另外的引物以評估可以在犬淋巴前體中發(fā)生的兩次單獨重
排以檢測T細(xì)胞特異性RNA。每個RT-PCR反應(yīng)含有10μL?2×主混合物(Master?Mix)(新英格
蘭生物實驗室(New?England?Biolabs))、1μL?20×酶混合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL
的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?
20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技(Thermo?Scientific))。
使用應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied?Biosystems)QuantStudio5qPCR機(jī)器擴(kuò)增核酸。熱循環(huán)儀方案
如下：°°在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10
秒和在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲
線°。在進(jìn)行總RNA提取的4個犬樣品中，75％的樣品顯示陽性對照(C-μIgM)的擴(kuò)增(圖8A)。
在顯示陽性對照擴(kuò)增的個體中，100％(n＝3)顯示兩種T細(xì)胞特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。一種
T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物以35個循環(huán)擴(kuò)增，并且另一T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物以50個循環(huán)擴(kuò)增(圖
8B)。
[0145] 使用RT-qPCR評估符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件的所有貓樣品(n＝5)。對于這四個貓樣品，設(shè)計兩種引物充當(dāng)陽性對照。這些探針評估貓肌動蛋白-B，以確定核酸提取物中
是否存在貓RNA。每個反應(yīng)含有：10μL?2×主混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混
合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O
(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°
在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒并且然
后在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集°。在進(jìn)行總RNA提取的4個貓樣品中，
75％的樣品(n＝4)顯示陽性對照(貓肌動蛋白-B)的擴(kuò)增(圖9)。
是否存在貓RNA。每個反應(yīng)含有：10μL?2×主混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混
合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O
(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°
在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒并且然
后在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集°。在進(jìn)行總RNA提取的4個貓樣品中，
75％的樣品(n＝4)顯示陽性對照(貓肌動蛋白-B)的擴(kuò)增(圖9)。
[0146] 實例9：犬B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的分析
[0147] 使用RT-qPCR評估符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件的所有犬樣品(n＝4)。對于這4個犬樣品，設(shè)計了6個引物集以評估與淋巴細(xì)胞相關(guān)的犬基因組的部分(圖15A)。在設(shè)計的6個
引物集中，使用一個引物集來評估可以在犬淋巴前體中發(fā)生的兩次單獨重排以檢測B細(xì)胞
特異性RNA。每個反應(yīng)含有10μL?2×主混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混合物
(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°在55℃
下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒和在60℃下45
秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲線°。這些擴(kuò)增反應(yīng)
的實例展示于圖16A中。對于每個樣品存在2個B細(xì)胞特異性RT-qPCR反應(yīng)(n＝8)，并且在這
些反應(yīng)中，87.5％(8個中的7個)顯示B細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物在循環(huán)
30與35之間擴(kuò)增(圖16A)。
引物集中，使用一個引物集來評估可以在犬淋巴前體中發(fā)生的兩次單獨重排以檢測B細(xì)胞
特異性RNA。每個反應(yīng)含有10μL?2×主混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混合物
(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°在55℃
下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒和在60℃下45
秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲線°。這些擴(kuò)增反應(yīng)
的實例展示于圖16A中。對于每個樣品存在2個B細(xì)胞特異性RT-qPCR反應(yīng)(n＝8)，并且在這
些反應(yīng)中，87.5％(8個中的7個)顯示B細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物在循環(huán)
30與35之間擴(kuò)增(圖16A)。
[0148] 實例10：貓樣品重復(fù)的提取
[0149] 糞便收集：樣品在密蘇里州圣路易斯當(dāng)?shù)赜韶堉魅耸占?。在貓排便到貓砂箱中時，要求貓主人將樣品轉(zhuǎn)移到50mL錐形管中并將管儲存在-20℃下。在產(chǎn)生的一周內(nèi)，將樣品收
集并且人工地轉(zhuǎn)移到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯)，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
集并且人工地轉(zhuǎn)移到BioGenerator?Labs(密蘇里州圣路易斯)，所述樣品在那里儲存在-80
℃冷凍柜中直到進(jìn)行提取。
[0150] 樣品類型：糞便樣品都從不同年齡、品種和性別的健康動物獲得。從4只不同的貓收集8個樣品。對于一些貓，收集了多達(dá)三個生物重復(fù)。我們將生物重復(fù)稱為從單獨排便收
集的同一只貓的糞便樣品。最近有一只貓被診斷出患有癬，但所有其它動物都沒有癥狀，并
且在過去30天內(nèi)沒有展現(xiàn)出任何腸胃不適的跡象。
集的同一只貓的糞便樣品。最近有一只貓被診斷出患有癬，但所有其它動物都沒有癥狀，并
且在過去30天內(nèi)沒有展現(xiàn)出任何腸胃不適的跡象。
[0151] 總核酸提取：將每個糞便樣品放到50mL錐形管中。添加約1,000-25,000mg糞便到每個管。添加另外的20-40mL溶液到每個管。這種溶液含有漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)(西格
瑪-奧德里奇)與0.05％Tween-20(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧
德里奇)的混合物。將糞便懸浮到溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以
1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)
到球粒并且將球粒再懸浮到溶液中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。
在差速離心期間，溶液分成三層。底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水
層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-
25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎
片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎
片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到
一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅
(bioMerieux)到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使
用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同
一次性料筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外
的2mL親水層以篩選出大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)
到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到已經(jīng)含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
瑪-奧德里奇)與0.05％Tween-20(西格瑪-奧德里奇)和0.0002％RNA酶抑制劑(西格瑪-奧
德里奇)的混合物。將糞便懸浮到溶液中并且在約0-10℃下旋轉(zhuǎn)0-10分鐘。將溶液在4℃以
1000rpm離心10分鐘并且丟棄上清液。添加約4-10mL 裂解緩沖液(bioMerieux)
到球粒并且將球粒再懸浮到溶液中。將溶液在20-25℃下以2500-3500rpm離心10-15分鐘。
在差速離心期間，溶液分成三層。底層包括固體細(xì)胞碎片，中間層是富含人類核酸的親水
層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。將頂部的兩個層轉(zhuǎn)移到新的15毫升錐形管中，并將溶液在20-
25℃下以2500rpm再次離心10分鐘。這個離心步驟的結(jié)果是分成三層：底層是固體細(xì)胞碎
片，中間層是富含人類核酸的親水層，并且頂層是疏水脂質(zhì)層。為了從溶液中篩選大的碎
片，將20μL移液器吸頭放到1mL移液器吸頭上，并從15mL管中移取2mL親水層并轉(zhuǎn)移到
一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL 磁性二氧化硅
(bioMerieux)到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。根據(jù)制造商的說明，使
用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技術(shù)向前一步驟中使用的相同
一次性料筒(bioMerieux)再裝載來自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外
的2mL親水層以篩選出大的碎片。添加另外的20μL 磁性二氧化硅(bioMerieux)
到料筒。使用移液器將珠?；旌系饺芤褐?.5-1分鐘。如上文所描述，根據(jù)制造商的說明，使用特異性A方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩沖溶液中。洗脫的核酸的體積是70μL。將這個
核酸溶液移取到已經(jīng)含有第一個70μL洗脫液的原始1.5mL管中，并將合并的溶液放在冰上。
[0152] DNA酶處理：將140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃處理20-40分鐘。將1-2mL等分的 裂解緩沖液添加到DNA酶處理的溶液中，并將樣品轉(zhuǎn)移
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
到新的 一次性料筒中。將整個溶液與60μL 磁性二氧化硅一起添加
到新料筒中。根據(jù)制造商的說明，使用 通用方案將與珠粒結(jié)合的核酸洗脫到緩
沖溶液中。洗脫的核酸的體積是25μL。將這個核酸溶液移取到1.5mL管中并儲存在0-6℃下。
[0153] 實例11：貓樣品重復(fù)中的核酸水平的測量
[0154] 提取結(jié)果：使用以上提取的樣品，使用安捷倫2100生物分析儀評估1μL每個樣品的總核酸和RNA完整性。定性和定量分析樣品。通過凝膠電泳分析生物分析儀輸出的結(jié)果，如
圖14中所示。圖14展示來自使用安捷倫RNA?6000Nano?Kits運(yùn)行的8個樣品的1μL的RNA生物
分析儀跡線。這包括4只個別貓。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性和質(zhì)量的信
息。通過比較每個樣品的條帶與RNA梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一
泳道中)并鑒定18S和28S真核核糖體RNA條帶來讀取電泳文件。定性地，足夠的條帶化和較
暗的條帶強(qiáng)度表明足夠的完整核酸可用于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)
(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲?；赗NA完整性數(shù)和真核物質(zhì)的量，100％的樣品符合分析條件?；谏锓治鰞x跡線的18S和28S真核核糖體RNA條帶下的面積估算真核濃
度。圖14展示了4只個別貓的生物重復(fù)。生物重復(fù)之間存在類似條帶化并且對于個別貓存在
獨特條帶化(圖14)。
圖14中所示。圖14展示來自使用安捷倫RNA?6000Nano?Kits運(yùn)行的8個樣品的1μL的RNA生物
分析儀跡線。這包括4只個別貓。凝膠電泳分析提供了關(guān)于總核酸和RNA完整性和質(zhì)量的信
息。通過比較每個樣品的條帶與RNA梯中的大小標(biāo)志物所代表的條帶(展示在電泳圖的第一
泳道中)并鑒定18S和28S真核核糖體RNA條帶來讀取電泳文件。定性地，足夠的條帶化和較
暗的條帶強(qiáng)度表明足夠的完整核酸可用于進(jìn)一步分析，如微陣列測序、聚合酶鏈反應(yīng)
(PCR)、核酸測序、分子條形碼或探針捕獲?；赗NA完整性數(shù)和真核物質(zhì)的量，100％的樣品符合分析條件?；谏锓治鰞x跡線的18S和28S真核核糖體RNA條帶下的面積估算真核濃
度。圖14展示了4只個別貓的生物重復(fù)。生物重復(fù)之間存在類似條帶化并且對于個別貓存在
獨特條帶化(圖14)。
[0155] 實例12：貓樣品重復(fù)中的RNA轉(zhuǎn)錄物的分析
[0156] 使用RT-qPCR評估符合生物標(biāo)志物表達(dá)分析條件的所有個別貓樣品(n＝5)。設(shè)計總共4個引物集以評估淋巴細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物和上皮細(xì)胞相關(guān)對照(圖15B)。設(shè)計一個引物集
以評估可以在貓淋巴前體中發(fā)生的重排以檢測T細(xì)胞特異性RNA。每個反應(yīng)含有10μL?2×主
混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下
反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒并且然后在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號
收集°。這些擴(kuò)增事件的實例展示于圖16B中。在分析用于選擇T細(xì)胞重排的五個貓樣品中，
在總共12個反應(yīng)中，75％的反應(yīng)顯示T細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。測試的所有T細(xì)胞重排都顯
示至少一只貓的擴(kuò)增(圖16B)。
以評估可以在貓淋巴前體中發(fā)生的重排以檢測T細(xì)胞特異性RNA。每個反應(yīng)含有10μL?2×主
混合物(新英格蘭生物實驗室)、1μL?20×酶混合物(新英格蘭生物實驗室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins?Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins?Genomics)、1μL?20×SYBR?Green?I、2μL?RNA和4.4μL分子生物學(xué)級H2O(賽默科技)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio5?qPCR機(jī)器擴(kuò)增溶液。熱循環(huán)儀方案如下：°°在55℃下25分鐘以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在95℃下
反轉(zhuǎn)錄酶失活1分鐘，在95℃下10秒并且然后在60℃下45秒的60個循環(huán)以用于擴(kuò)增和信號
收集°。這些擴(kuò)增事件的實例展示于圖16B中。在分析用于選擇T細(xì)胞重排的五個貓樣品中，
在總共12個反應(yīng)中，75％的反應(yīng)顯示T細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增。測試的所有T細(xì)胞重排都顯
示至少一只貓的擴(kuò)增(圖16B)。
[0157] 實例13：NanoString分析
[0158] 為了進(jìn)一步分析與人類結(jié)腸直腸癌和癌前腺瘤相關(guān)的基因，對另外70個人類樣品進(jìn)行上文所描述的RNA提取方法。使用NanoString?nCounter分析系統(tǒng)分析提取的RNA，所述
系統(tǒng)利用基于基因表達(dá)的直接多重測量的數(shù)字彩色編碼條形碼技術(shù)。在70個樣品中，使用
PanCancer途徑組(Pathways?Panel)分析48個，所述途徑組包括來自13個癌癥
相關(guān)經(jīng)典途徑的770個基因，所述途徑包括：MAPK、STAT、PI3K、RAS、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、Hedgehog、Wnt、DNA損傷控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾和TGF-β。使用 PanCancer
進(jìn)展組(Progression?Panel)分析剩余的22個樣品，所述進(jìn)展組包括來自癌癥進(jìn)展過程中
的每個步驟的770個基因，所述過程包括：血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑(ECM)、上皮細(xì)胞向間
葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移。還評估了這22個樣品的10個“加標(biāo)”基因，包括ACTB、B2M、BMP3、CD274、CD8A、GAPDH、HPRT1、N-BLR、NDRG4和RNU2-1。
系統(tǒng)利用基于基因表達(dá)的直接多重測量的數(shù)字彩色編碼條形碼技術(shù)。在70個樣品中，使用
PanCancer途徑組(Pathways?Panel)分析48個，所述途徑組包括來自13個癌癥
相關(guān)經(jīng)典途徑的770個基因，所述途徑包括：MAPK、STAT、PI3K、RAS、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、Hedgehog、Wnt、DNA損傷控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾和TGF-β。使用 PanCancer
進(jìn)展組(Progression?Panel)分析剩余的22個樣品，所述進(jìn)展組包括來自癌癥進(jìn)展過程中
的每個步驟的770個基因，所述過程包括：血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑(ECM)、上皮細(xì)胞向間
葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移。還評估了這22個樣品的10個“加標(biāo)”基因，包括ACTB、B2M、BMP3、CD274、CD8A、GAPDH、HPRT1、N-BLR、NDRG4和RNU2-1。
[0159] 除了在圖6(A組)中鑒定的基因(前200種差異表達(dá)的基因)的列表之外，我們還分析了與結(jié)腸直腸癌和癌前腺瘤相關(guān)的另外的基因。我們還分析了在NanoString?nCounter
分析系統(tǒng)中鑒定為高表達(dá)或差異表達(dá)的所有基因。這種分析包括使用
PanCancer途徑組、 PanCancer進(jìn)展組和“加標(biāo)”基因。我們使用這個信息來開發(fā)
用于結(jié)腸直腸癌和癌前腺瘤的400基因RNA生物標(biāo)志物標(biāo)簽(圖13(B組))。
分析系統(tǒng)中鑒定為高表達(dá)或差異表達(dá)的所有基因。這種分析包括使用
PanCancer途徑組、 PanCancer進(jìn)展組和“加標(biāo)”基因。我們使用這個信息來開發(fā)
用于結(jié)腸直腸癌和癌前腺瘤的400基因RNA生物標(biāo)志物標(biāo)簽(圖13(B組))。
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