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化學(xué);冶金 / 組合化學(xué) / 一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應(yīng)用
一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應(yīng)用 |
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| 申請?zhí)?/td> | CN201710552357.4 | 申請日 | 2017-07-07 | 公開(公告)號(hào) | CN107287314A | 公開(公告)日 | 2017-10-24 |
| 申請人 | 深圳華大智造科技有限公司; 華大生物科技(武漢)有限公司; | 發(fā)明人 | 鄒婧; 李全; 侯強(qiáng); 張春楊; 譚宏東; | ||||
| 摘要 | 本 發(fā)明 涉及一種檢測遺傳性 耳 聾基因的建庫 試劑 盒 和應(yīng)用，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增遺傳性耳聾基因的擴(kuò)增引物組；所述擴(kuò)增引物組包括根據(jù)GJB2、GJB3、SLC26A4基因和12s?rRNA基因的突變位點(diǎn)的多態(tài)性設(shè)計(jì)的引物。本發(fā)明采用多重PCR技術(shù)，單次反應(yīng)可檢測20個(gè)以上耳聾基因突變位點(diǎn)；配合采用“雙標(biāo)簽”系統(tǒng)，使每個(gè)樣品的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物上均帶有兩套獨(dú)立的標(biāo)簽序列，因此可將所有樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后同時(shí)測序，實(shí)現(xiàn)高通量檢測，從而大幅降低了單個(gè)樣品的檢測成本。 | ||||||
| 權(quán)利要求 | 1.一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒，其特征在于，所述建庫試劑盒包括用于擴(kuò)增遺傳性耳聾基因的擴(kuò)增引物組； |
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| 說明書全文 | 一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域背景技術(shù)[0002] 耳聾是一項(xiàng)非常常見的嚴(yán)重影響人類生活的感覺障礙性疾病，其病因復(fù)雜，單一的或者多重的基因突變極可能會(huì)導(dǎo)致重度耳聾，而受環(huán)境因素影響，諸如藥物、創(chuàng)傷、極端環(huán)境暴露等，也會(huì)突發(fā)性致聾。WHO?2013年數(shù)據(jù)估計(jì)全球聽力障礙人數(shù)達(dá)到3.6億，而據(jù)2006年12月公布的全國第二次殘疾人抽樣調(diào)查主要數(shù)據(jù)公報(bào)結(jié)果顯示，我國的語言聽力障礙人數(shù)已高達(dá)2780萬，新生兒中每年新增2萬～3萬聾兒，發(fā)病率高達(dá)1‰～3‰。 [0003] 遺傳性耳聾具有較高的異質(zhì)性，即不同耳聾致病基因可導(dǎo)致相同表型的聽覺功能障礙，而同一個(gè)基因的不同的突變可以引起不同的臨床表型的耳聾，由此造成耳聾的病因非常復(fù)雜。因此，對致聾的遺傳因素的研究成為了探究耳聾病因及有效治療手段的突破口，而有效檢測耳聾相關(guān)基因?qū)Χ@的早期防范與治療起到重要作用。目前已定位的致聾基因有150多種，但分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)遺傳性耳聾是由幾個(gè)較為常見的熱點(diǎn)突變引起的，中國人群常見耳聾突變主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體的12S?rRNA基因突變，在人群中的突變比例高達(dá)40％。 [0004] 在常染色體隱性遺傳的非綜合征性耳聾中，大約有一半是由于GJB2基因突變引起的。GJB2目前報(bào)道最多的突變位點(diǎn)是167delT、235delC、35delG和176_191del16。大量文獻(xiàn)顯示，GJB2基因在不同種族中導(dǎo)致耳聾突變的位點(diǎn)上存在很大的差異。在歐美，特別是在北歐、南歐及美國的高加索人中，主要的突變形式是35delG，占所有GJB2突變的70％；另一個(gè)突變熱點(diǎn)是167delT，在猶太耳聾人群中多見，占所有病理性突變的40％，35delG突變只占18％；而在亞洲人群中，則主要為235delC突變，在日本和中國，235delC位點(diǎn)突變在人群中的攜帶率為1.0％-1.3％，占所有GJB2病理性等位基因的80％。與GJB2相關(guān)的非綜合征性耳聾患者一般情況多為雙耳同時(shí)受累，呈對稱性耳聾，多數(shù)表現(xiàn)為先天性耳聾，聽力損失程度從輕度到極重度不等，大多數(shù)為重度和極重度耳聾，損失程度與突變的類型和位點(diǎn)有關(guān)，相同基因型的個(gè)體聽力受損程度也存在差異，臨床表現(xiàn)具有多態(tài)性，表明基因的表達(dá)可能受到修飾基因或者環(huán)境的影響。 [0005] GJB3基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳非綜合征性聾。夏家輝院士等于1998年首次在世界上成功克隆了該基因，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)GJB3定位于1p33-p35，并最早報(bào)道了兩個(gè)GJB3突變位點(diǎn)547G＞A以及538C＞T：他們篩查了42個(gè)遺傳性耳聾的家系，在浙江的一個(gè)耳聾家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)錯(cuò)義突變，Cx31基因編碼區(qū)的第547位堿基由G突變成A，使得連接蛋白Cx31的第183號(hào)氨基酸由谷氨酸變成了賴氨酸；同時(shí)他們還在湖南一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)突變，GJB3的第538位堿基由C變成T，導(dǎo)致第180號(hào)氨基酸變?yōu)榻K止密碼子。 [0006] SLC26A4基因編碼蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin屬于溶質(zhì)蛋白SLC26，通過其轉(zhuǎn)運(yùn)功能可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外氯/碘離子互換。SLC26A4基因突變和大前庭水管綜合癥以及Pendred氏綜合征有關(guān)，臨床表現(xiàn)為先天神經(jīng)性耳聾伴有不同程度的語言障礙，甲狀腺腫大，CT或MRI顯示耳蝸發(fā)育不良，前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，在中國人群的遺傳性耳聾患者中突變率僅次于GJB2。到目前為止已發(fā)現(xiàn)了150多種SLC26A4突變類型，不同人群中突變類型和發(fā)生頻率存在很大差異，IVS7-2A>G突變類型在中國大前庭水管綜合癥患者中最常見，有研究證明IVS7-2A＞G亦為始祖效應(yīng)。 [0007] 線粒體DNA(mtDNA)是唯一存在于細(xì)胞質(zhì)中的DNA，由于子代的線粒體由卵細(xì)胞提供，故線粒體遺傳屬于母系遺傳。氨基糖苷類抗生素致聾患者大部分是1555A>G、1095T>C、1494C>T突變的攜帶者，這些突變增加了個(gè)體對氨基糖苷類藥物耳毒性的敏感性，常出現(xiàn)“一針致聾”的情況，通過早期基因檢測，可給出臨床用藥建議，同時(shí)由于該突變屬母系遺傳，可對家系所有母系成員均起到警戒作用。 [0008] 目前對于遺傳性耳聾基因診斷所應(yīng)用的檢測方法主要有Sanger測序法、ARMS-PCR法、熒光PCR法、PCR導(dǎo)流雜交法、DNA微陣列技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜法等。 [0009] Sanger測序法即雙脫氧核苷酸末端終止測序法，是基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法，其原理是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待測序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的四種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，該ddNTP上偶聯(lián)上了4種不同顏色的熒光基團(tuán)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的ddNTP而定，并發(fā)出相應(yīng)的熒光。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過毛細(xì)管電泳分離大小不同的片段，并采集每種鏈終止產(chǎn)物的熒光信號(hào)，從而讀出序列模板的堿基序列。但Sanger直接測序法的每個(gè)反應(yīng)只能檢測一個(gè)位點(diǎn)，通量低，檢測位點(diǎn)少，導(dǎo)致檢測成本高，且數(shù)據(jù)分析依賴人工閱讀，速度慢。 [0010] 突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)即ARMS-PCR法(amplification?refractory?mutation?system)是一種改進(jìn)的PCR方法，其基本原理是，如果引物的3’端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般Taq?DNA聚合酶無法延伸，該方法使用4條引物進(jìn)行堿基突變檢測，先在待檢測突變位點(diǎn)外側(cè)設(shè)計(jì)上下游引物(2條外引物)，再在緊鄰待檢測突變位點(diǎn)的上下游設(shè)計(jì)兩條內(nèi)引物，一條引物的3’端堿基為突變型堿基，另一條引物的3’端堿基為野生型堿基，若存在突變，則產(chǎn)生突變型堿基的產(chǎn)物，若無突變，則產(chǎn)生野生型堿基的產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測有無擴(kuò)增片段及片段長度判定是否有點(diǎn)突變，或在內(nèi)引物上標(biāo)記2個(gè)不同熒光素，通過對產(chǎn)物熒光分析即可了解到模板中是否存在點(diǎn)突變。ARMS-PCR法的每個(gè)反應(yīng)只能檢測一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)，檢測位點(diǎn)較少，導(dǎo)致檢測成本偏高。 [0011] 熒光PCR法是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針實(shí)現(xiàn)堿基突變檢測。該方法針對同一待測位點(diǎn)的不同基因型設(shè)計(jì)兩條不同的Taqman探針，把它們同時(shí)加入到PCR反應(yīng)體系中，只有與靶序列完全匹配的探針才能被水解并釋放出熒光信號(hào)。兩條探針分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中對應(yīng)的熒光檢測通道檢測熒光信號(hào)。如果只有一條探針能釋放熒光信號(hào)，則檢測的位點(diǎn)是純合子，如果兩條探針都有熒光信號(hào)，則檢測的位點(diǎn)是雜合子。但熒光PCR法的每個(gè)反應(yīng)只能檢測一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)，檢測位點(diǎn)較少，導(dǎo)致檢測成本偏高。 [0012] PCR導(dǎo)流雜交法與DNA微陣列技術(shù)原理類似，都是根據(jù)固相雜交原則設(shè)計(jì)的檢測方法，PCR導(dǎo)流雜交法是將靶DNA用帶有生物素的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，帶生物素的PCR產(chǎn)物與膜固定的捕獲探針雜交，再加入交聯(lián)堿性磷酸酶的鏈霉親和素，洗去未結(jié)合的鏈霉親和素，加入底物顯色，由此來檢測靶DNA是否變異，而DNA微陣列技術(shù)將生物素?fù)Q為熒光基團(tuán)，通過識(shí)別不同位置的熒光信號(hào)而確定是否有DNA變異。但是PCR導(dǎo)流雜交法與DNA微陣列技術(shù)均依賴探針特異性，探針位置出現(xiàn)其他堿基變異時(shí)易出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。 [0013] 飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)首先通過設(shè)計(jì)出特異性引物，擴(kuò)增出待測位點(diǎn)的核苷酸片段，再針對待測位點(diǎn)，設(shè)計(jì)單條特異引物，退火時(shí)此引物3’端的堿基剛好與待測位點(diǎn)的前一個(gè)堿基結(jié)合。在反應(yīng)體系中加入ddNTP和DNA聚合酶，當(dāng)某一ddNTP與待測位點(diǎn)堿基互補(bǔ)并結(jié)合時(shí)，鏈延伸反應(yīng)終止，得到延伸一個(gè)堿基的延伸產(chǎn)物。由于4種堿基的分子量不同，采用樣品分子在電場中的飛行時(shí)間與分子的荷質(zhì)比成正比的原理，通過檢測延伸產(chǎn)物的飛行時(shí)間，測得延伸產(chǎn)物分子量，從而確定待測位點(diǎn)的堿基類型。但是飛行時(shí)間質(zhì)譜法依賴延伸引物的特異性，探針結(jié)合錯(cuò)誤或探針位置出現(xiàn)突變易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，同時(shí)易受干擾物質(zhì)影響出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。 發(fā)明內(nèi)容[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒和應(yīng)用，所述建庫試劑盒通過多重PCR方法及高通量測序方法檢測遺傳性耳聾基因突變。 [0015] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： [0016] 第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒，所述建庫試劑盒包括用于擴(kuò)增遺傳性耳聾基因的擴(kuò)增引物組； [0017] 所述擴(kuò)增引物組包括根據(jù)GJB2、GJB3、SLC26A4基因和12s?rRNA基因的突變位點(diǎn)的多態(tài)性設(shè)計(jì)的引物； [0018] 其中，所述GJB2基因包括35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT和235delC基因；所述GJB3基因包括538C>T和547G>A；所述SLC26A4基因包括281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G和IVS15+5G>A；所述12s?rRNA基因包括1494C>T、1555A>G和1095T>C。 [0019] 根據(jù)本發(fā)明，所述擴(kuò)增引物組如SEQ?ID?NO.1-24所示。 [0020] 所述SEQ?ID?NO.1-24所示的引物如下： [0021] [0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述擴(kuò)增引物組的每條引物的5’端加入樣品標(biāo)簽序列。 [0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述樣品標(biāo)簽序列的長度為7-10bp，優(yōu)選為7bp。 [0024] 根據(jù)本發(fā)明，所述樣品標(biāo)簽序列如SEQ?ID?NO.25-120所示。 [0025] 所述SEQ?ID?NO.25-120所示的標(biāo)簽序列如下： [0026] [0027] [0028] 本發(fā)明中，所述標(biāo)簽本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，只要能夠?qū)悠愤M(jìn)行區(qū)分都是可行的，本申請優(yōu)選采用上述SEQ?ID?NO.25-120所示的標(biāo)簽序列。 [0029] 第二方面，本發(fā)明提供一種遺傳性耳聾相關(guān)基因的文庫構(gòu)建方法，包括如下步驟： [0030] 采用第一方面所述的建庫試劑盒，在所述引物組的5’端加入建庫試劑盒中所述的樣品標(biāo)簽序列，加入反應(yīng)液中對樣品進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，將帶有不同樣本標(biāo)簽序列的多個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物等比例混合成文一個(gè)文庫樣本，得到所述遺傳性耳聾相關(guān)基因的文庫。 [0031] 根據(jù)本發(fā)明，所述文庫構(gòu)建方法還包括如下步驟：(1)PCR產(chǎn)物磷酸化；(2)末端修復(fù)；(3)連接測序接頭；(4)PCR擴(kuò)增文庫；(5)文庫環(huán)化；(6)納米球制備；(7)測序分析。 [0032] 根據(jù)本發(fā)明，所述多重PCR反應(yīng)的體系為無核酸酶水5.5μL、PCR擴(kuò)增液12.5μL、擴(kuò)增引物組2μL和DNA樣品5μL。 [0033] 根據(jù)本發(fā)明，所述多重PCR反應(yīng)的條件為94℃2min；94℃20s，56℃30s，60℃20s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min；PCR擴(kuò)增結(jié)束保存在12℃。 [0034] 本發(fā)明中，所述文庫的構(gòu)建還包括磷酸化的步驟、加A堿基的步驟和測序接頭連接的步驟，所述磷酸化的步驟、加A堿基的步驟和測序接頭連接的步驟為本領(lǐng)域的常規(guī)步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇。 [0035] 第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的方法構(gòu)建得到的遺傳性耳聾相關(guān)基因的文庫。 [0036] 第四方面，本發(fā)明提供一種用于非診斷目的的遺傳性耳聾相關(guān)基因的檢測方法，將第三方面所述遺傳性耳聾相關(guān)基因的文庫采用聯(lián)合探針錨定聚合測序法(cPAS)進(jìn)行測序。 [0037] 本發(fā)明中，所述測序采用BGISEQ-500測序儀。 [0038] 本發(fā)明中，所述擴(kuò)增引物組不僅僅可以用于所述基于cPAS技術(shù)的測序儀，其他構(gòu)建文庫測序的方法也是可行的。 [0039] 本發(fā)明中，所述測序之前還包括文庫混合和環(huán)化反應(yīng)的步驟及制備DNA納米球的步驟，所述上述步驟為了進(jìn)一步提高待測片段的濃度，從而提高測序通量和測序準(zhǔn)確度。 [0040] 第五方面，本發(fā)明提供第一方面所述的檢測遺傳性耳聾基因的建庫試劑盒、如第三方面所述的文庫或如第四方面所述的檢測方法用于非診斷目的的人遺傳性耳聾基因的檢測。 [0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果： [0042] (1)本發(fā)明采用多重PCR技術(shù)，單次反應(yīng)可檢測20個(gè)以上耳聾基因突變位點(diǎn)； [0043] (2)本發(fā)明采用“雙標(biāo)簽”系統(tǒng)，使每個(gè)樣品的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物上均帶有兩套獨(dú)立的標(biāo)簽序列，因此可將所有樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后同時(shí)測序，實(shí)現(xiàn)高通量檢測，從而大幅降低了單個(gè)樣品的檢測成本； [0045] 圖1為本發(fā)明基于cPAS測序技術(shù)的遺傳性耳聾基因檢測原理圖； [0046] 圖2為本發(fā)明基于cPAS測序的遺傳性耳聾基因檢測流程圖； [0047] 圖3為本發(fā)明cPAS測序得到的DNA序列結(jié)構(gòu)圖； [0048] 圖4為本發(fā)明文庫擴(kuò)增后的DNA片段大小及濃度。 具體實(shí)施方式[0049] 為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。 [0050] 實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。 [0051] 實(shí)施例1：引物設(shè)計(jì) [0052] 1、引物設(shè)計(jì)具體包括如下步驟： [0053] 選擇遺傳性耳聾相關(guān)的GJB2、GJB3、SLC26A4基因和12s?rRNA基因的突變位點(diǎn)21個(gè)作為檢測位點(diǎn)，分別是：GJB2基因的35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT與235delC，GJB3基因的538C>T與547G>A，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G與IVS15+5G>A，線粒體基因的 1494C>T，1555A>G，1095T>C。使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)上述基因位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物的長度在20個(gè)堿基左右。利用軟件設(shè)計(jì)評(píng)估樣品標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列包含7個(gè)堿基，設(shè)計(jì)標(biāo)簽序列時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)與測序的引物相似度高的序列和添加上標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增引物形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或二聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu)。針對上述4個(gè)耳聾基因21個(gè)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物參見表1，樣品標(biāo)簽序列參見表2。 [0054] 表1遺傳性耳聾基因21個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物 [0055] [0056] 表2樣品標(biāo)簽序列 [0057] [0058] [0059] 實(shí)施例2構(gòu)建文庫并測序 [0060] 在本實(shí)施例中，檢測24份已知上述待檢測位點(diǎn)信息(Sanger測序檢測)的臨床DNA樣品，編號(hào)為1～24，其中1～21號(hào)樣品為突變陽性樣品，22～24號(hào)樣品為突變陰性樣品。所述檢測的原理如圖1所示，檢測的流程如圖2所示。 [0061] 具體包括如下步驟： [0062] 2、PCR擴(kuò)增反應(yīng) [0064] 表3?PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合液配方 [0065] [0066] [0067] 2.2使用八道移液器按順序吸取2μL儲(chǔ)存于96孔PCR反應(yīng)板中的PCR反應(yīng)引物加入到步驟(1)的PCR反應(yīng)板的對應(yīng)孔中，貼上封口膜，置于板式離心機(jī)中4000rmp離心1分鐘； [0068] 2.3分別向步驟(2)的96孔PCR反應(yīng)板中加入24個(gè)待檢測DNA樣品，每個(gè)樣品加入5μL。完成加樣后在PCR反應(yīng)板上貼上封口膜，置于板式離心機(jī)中4000rmp離心1分鐘； [0069] 2.4將PCR反應(yīng)板置于PCR儀中，運(yùn)行表4的PCR反應(yīng)程序； [0070] 表4?PCR反應(yīng)程序 [0071] [0072] 2.5.PCR反應(yīng)結(jié)束后將PCR反應(yīng)板取出，置于板式離心機(jī)中4000rpm離心1分鐘。 [0073] 2.6.取步驟2.5的PCR反應(yīng)板的96個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物各10μL至1.5mL離心管中，振蕩混勻后置于掌式離心機(jī)離心5秒。 [0074] 3、磁珠純化 [0075] 3.1.將室溫平衡30分鐘的磁珠振蕩混勻，取180μL至1.5mL離心管中，加入100μL步驟2.6的混合樣本，混勻，室溫靜置10分鐘，磁力架上放置10分鐘至澄清，棄上清。 [0076] 3.2.向離心管加入350μL?70％乙醇，保證磁珠完全浸入70％乙醇中，水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，使管壁上的磁珠遷移至對面管壁，再次水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，棄上清。 [0077] 3.3.重復(fù)步驟3.2，打開離心管管蓋，室溫放置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)。 [0078] 3.4.取下離心管，加入25μL?DNA溶解液，與磁珠充分混勻，室溫靜置5分鐘，置于磁力架上至澄清，取上清液至新的1.5mL離心管中。 [0079] 3.5.使用Qubit?3.0熒光定量檢測儀對純化后樣本進(jìn)行定量檢測，測定質(zhì)量濃度為42.5ng/μL。 [0080] 4、文庫制備 [0081] 4.1.磷酸化反應(yīng) [0082] 4.1.1.根據(jù)表5的比例在合適的離心管中配制磷酸化反應(yīng)混合液，混勻后在冰上按6μL每反應(yīng)分裝到200μL?PCR反應(yīng)管中。 [0083] 表5磷酸化反應(yīng)混合液配方 [0084]試劑名稱 一個(gè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)量 磷酸化緩沖液 4μL 磷酸化酶 2μL 總體積 6μL [0085] 4.1.2.根據(jù)步驟3.5的定量檢測的質(zhì)量濃度(M)，按照公式(V＝200/M)計(jì)算文庫制備樣本使用體積為4.7μL，取4.7μL步驟3.5的純化后樣本加入到步驟4.1.1中200μL?PCR反應(yīng)管，再加入29.3μL的無核酸酶水混勻，使末端修復(fù)反應(yīng)體系終體積為40μL。 [0086] 4.1.3.將反應(yīng)管放置PCR儀上37℃孵育30分鐘，結(jié)束后置于掌式離心機(jī)離心5秒,獲得經(jīng)磷酸化反應(yīng)后的磷酸化文庫DNA。 [0087] 4.2.接頭連接反應(yīng) [0088] 4.2.1.根據(jù)表6的比例在合適的離心管中配制連接反應(yīng)混合液，混勻后在冰上待用。 [0089] 表6連接反應(yīng)混合液配方 [0090]試劑 一個(gè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)量 連接酶緩沖液 27.2μL 100mM腺嘌呤核苷三磷酸 0.8μL 連接酶 10μL 總體積 38μL [0091] 4.2.2.如表7所示，取38μL步驟4.2.1的連接反應(yīng)混合液至步驟4.1.3的200μL?PCR反應(yīng)管中，再取2μL標(biāo)簽接頭加入到離心管中。測序接頭序列如下，高亮標(biāo)注的堿基為文庫標(biāo)簽序列： [0092] 1鏈：TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT [0093] 2鏈： [0094] /Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATAGGTCCGATCAACTCCTTGGCTCACA[0095] 表7連接反應(yīng)體系 [0096] [0097] [0098] 4.2.3.將步驟4.2.2的離心管振蕩混勻，置于掌式離心機(jī)中離心5秒，并置于PCR儀上關(guān)閉熱蓋，25℃孵育20分鐘。 [0099] 4.2.4.反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)管置于掌式離心機(jī)上離心5秒，并將全部反應(yīng)液轉(zhuǎn)至新的1.5mL離心管中。 [0100] 4.3.磁珠純化 [0101] 4.3.1.將室溫平衡30分鐘的磁珠振蕩混勻，取72μL至步驟4.2.4的離心管中，混勻，室溫靜置10分鐘，磁力架上放置10分鐘至澄清，棄上清； [0102] 4.3.2.向離心管加入180μL?70％乙醇，保證磁珠完全浸入70％乙醇中，水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，使管壁上的磁珠遷移至對面管壁，再次水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，棄上清。 [0103] 4.3.3.重復(fù)步驟4.3.2，打開離心管管蓋，室溫放置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)； [0104] 4.3.4.取出離心管，加入25μL?DNA溶解液，與磁珠充分混勻，室溫靜置5分鐘，置于磁力架上至澄清，取7μL上清液至新的200μL?PCR反應(yīng)管中。 [0105] 4.4.文庫擴(kuò)增 [0106] 4.4.1.根據(jù)表8的比例在適合的離心管中配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合液，混勻后在冰上按18μL每反應(yīng)孔分裝到4.3.4反應(yīng)產(chǎn)物的200μL?PCR反應(yīng)管中，混勻。 [0107] 表8?PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合液配方 [0108] [0109] [0110] 4.4.2.將PCR反應(yīng)管置于掌式離心機(jī)中離心5秒鐘。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中，運(yùn)行表9的PCR反應(yīng)程序。 [0111] 表9文庫擴(kuò)增反應(yīng)程序 [0112] [0113] 4.4.3.PCR反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管取出，置于掌式離心機(jī)中離心5秒鐘。 [0114] 4.5.磁珠純化 [0115] 4.5.1.將室溫平衡30分鐘的磁珠振蕩混勻，取100μL步驟4.4.3的混合產(chǎn)物到1.5mL離心管中，加入90μL磁珠混勻。室溫靜置10分鐘，磁力架上放置10分鐘至澄清，棄上清； [0116] 4.5.2.向離心管加入350μL?70％乙醇，保證磁珠完全浸入70％乙醇中，水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，使管壁上的磁珠遷移至對面管壁，再次水平180度快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜置1分鐘，棄上清。 [0117] 4.5.3.重復(fù)步驟4.5.2，打開離心管管蓋，室溫放置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)。 [0118] 4.5.4.取出離心管，加入25μL?DNA溶解液，與磁珠充分混勻，室溫靜置5分鐘，置于磁力架上至澄清，取上清液至新的1.5mL離心管中。 [0119] 4.5.5.用安捷倫生物分析儀2100檢測步驟4.5.4中文庫擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段大小和DNA濃度，結(jié)果如圖4所示，擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段主峰范圍為240bp～310bp，文庫濃度為35.8ng/μL。 [0120] 5、環(huán)化反應(yīng) [0121] 5.1根據(jù)步驟4.5.5的文庫濃度，取4.5μL(約160ng)文庫擴(kuò)增產(chǎn)物，用分子級(jí)水將體積補(bǔ)充至48μL，充分混勻后短暫離心，置于PCR儀上95℃孵育5min，孵育完畢即刻取出PCR管放置在冰上冷卻。 [0122] 5.2在上述PCR管加入11.6μL環(huán)化反應(yīng)緩沖液、0.5μL連接酶，充分混勻，短暫離心，37℃孵育30min。 [0123] 6、DNA納米球制備 [0124] 6.1取步驟5.2的環(huán)化DNA文庫20μL到0.2mL?PCR管內(nèi)。加入20μL?DNB制備緩沖液，漩渦振蕩器震蕩混勻，離心5秒后置于PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃1min，65℃1min，40℃1min，4℃保持。 [0125] 6.2反應(yīng)完成后取出PCR管，離心5秒，加入40μL?DNB聚合酶混合液I和4μL?DNB聚合酶混合液II，漩渦振蕩器震蕩混勻，離心5秒后即刻置于PCR儀中開始反應(yīng)，反應(yīng)條件：30℃10min，4℃保持。 [0126] 6.3反應(yīng)完成后取出PCR管至于冰盒上，即刻加入20μLDNB終止緩沖液，用移液器和闊口吸頭緩慢地吹打混勻，切勿震蕩及劇烈吹打，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/div> [0127] 7、DNA納米球加載 [0128] 參照BGIDL-50全自動(dòng)樣品加載系統(tǒng)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，將步驟6.3的DNA納米球溶液加載到測序芯片上。 [0129] 8、DNA納米球上機(jī)測序 [0130] 參照基因測序儀(BGISEQ-500)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，將加載了DNA納米球的測序芯片置于測序儀中進(jìn)行cPAS測序，測序得到的DNA序列結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。 [0131] 9、數(shù)據(jù)分析 [0132] 測序完成后，使用“遺傳性耳聾基因分析軟件”對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表10-11所示： [0133] 表10?24例樣品cPAS測序檢測結(jié)果 [0134] [0135] [0136] [0137] 表11?24例樣品cPAS測序檢測結(jié)果與Sanger測序結(jié)果比較表 [0138] [0139] 從表10-11可以看出，24例樣品的21個(gè)位點(diǎn)的檢測結(jié)果均與Sanger測序檢測結(jié)果一致，21個(gè)位點(diǎn)檢測準(zhǔn)確性為100％。 |
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