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本発明は、コード化化學(xué)ライブラリに関し、特に、コード化タグと空間的に結(jié)び付けられた(spatially associated)タグなし(tagless)化學(xué)構(gòu)造を含む核酸コード化ライブラリに関する。本発明はまた、核酸テンプレート化化學(xué)ライブラリ生成のための方法、コード化ライブラリをスクリーニングするための方法、ならびにコード化ライブラリを調(diào)製およびスクリーニングするための組成物に関する。

創(chuàng)薬は、典型的には、化合物の大きなライブラリの組み立て、それに続く、標(biāo)的に対する所望の活性(例えば、酵素活性または標(biāo)識(shí)の置換)を示す「ヒット(hits)」を同定するための標(biāo)的を含むマイクロウェルに化合物を個(gè)々に添加するアッセイまたはスクリーニングを含む。このプロセスは、ハイスループットスクリーニング(HTS)として知られる。それは、ロボット裝置を使用して何百萬(wàn)もの化學(xué)物質(zhì)をテストするために自動(dòng)化することができるが、それは労力を要しかつ高価である。

したがって、ライブラリのサイズの増加がスクリーニングの負(fù)擔(dān)を増大させるという事実から生じる根本的な問(wèn)題がある。スクリーニングアッセイの個(gè)別の性質(zhì)のために、スクリーニング時(shí)間およびコストはライブラリサイズとほぼ直線的に比例する。これは、このようなアプローチを用いてスクリーニング可能な化學(xué)ライブラリのサイズに厳しい実用の制約を課した:HTSは、典型的には、10³?10⁶のメンバーを含むライブラリに適用される。

この問(wèn)題は、選択に基づくスクリーニング技術(shù)(例えば、パンニング技術(shù))の開(kāi)発によって対処されてきた。ここでは、ライブラリ內(nèi)のすべての化合物が、ワンポット形式で目的の標(biāo)的と相互作用する能力について同時(shí)にテストされる。そのようなアッセイでは、スクリーニング工程の時(shí)間と費(fèi)用はライブラリの大きさとは無(wú)関係であり、そのため、アッセイは比較的大きなライブラリに適用することができる。10¹²のメンバーまで含むライブラリが、このようなアプローチを用いてスクリーニングされてきた。

この問(wèn)題はまた、微小液滴ベースのライブラリの開(kāi)発によっても対処されてきた。これは、マイクロ流體技術(shù)によって処理してスループットを數(shù)桁向上させることができ、かつ細(xì)胞ベースの表現(xiàn)型スクリーンと適合可能である(例えば、Clausell-Tormos et al.,(2008) Chemistry & Biology 15:427-437)。

しかし、選択ベースのアッセイおよび微小液滴ベースのスクリーニングの両方とも、選択された化合物の同一性(すなわち、「ヒット」)が容易に決定されることを要求する。スクリーニング可能であるが解読可能でないライブラリは、有用ではない。

この問(wèn)題に対する解決策は、1992年にBrennerとLernerによって最初に提案され(Brenner and Lerner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5381-5383)、そしてDNAコード化化學(xué)ライブラリ(DECL)の生成に基づく。DECLにおいて、各化合物は、その構(gòu)造または反応履歴に対応するDNA配列と結(jié)び付け(タグ付け)され、それによって、その特定の化合物のユニークな識(shí)別子として機(jī)能する(すなわち、DNAタグはその化合物を「コード化」し、そうして、分子「バーコード」として機(jī)能する)。

化合物は、種々の異なる方法でタグを付けることができ、そして、DNAタグは、単に特定の化學(xué)構(gòu)造をコードする(「DNAレコード化」)だけでなく、その合成を指向させるテンプレートとして(「DNAテンプレート化」)、使用することもできる。この技術(shù)は、近年、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47:12747-12753;Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12):5707-5717;およびMullard (2016) Nature 530:367-369によって概説されている。

DECL技術(shù)は現(xiàn)在、製薬業(yè)界內(nèi)で十分に確立されている。2007年には、GSKは、5500萬(wàn)USドルで、DECLのパイオニアである會(huì)社の1つのPraecis Pharmaceuticalsを獲得した。一方、他のトップ10の製薬會(huì)社は、それら自身のインハウスのDNAコード化ライブラリプログラムを開(kāi)始した。その他のバイオテクノロジー企業(yè)(X-Chem、Vipergen、Ensemble TherapeuticsおよびPhilochemを含む)もまた、積極的にDECL技術(shù)を開(kāi)発し、活用を進(jìn)めている。

しかしながら、現(xiàn)在のDECLの有用性は、現(xiàn)在、タグの存在と結(jié)び付けられた問(wèn)題によって制限されている。例えば、タグをコード化することは、(a)目的の標(biāo)的上の分子結(jié)合部位へのタグ付き化合物のアクセスを化學(xué)的または立體的に妨害し、その結(jié)果、回収されるヒットの數(shù)および/または種類が制限される;(b)細(xì)胞の透過(guò)性および/または拡散を制限し、細(xì)胞の取り込みを効果的に防止し、細(xì)胞質(zhì)へのアクセスに依存する細(xì)胞ベースの表現(xiàn)型スクリーンの使用を排除する;(c)タグ付けした後に化學(xué)化合物が化學(xué)的に修飾され得る程度を制限する(特定の反応は、タグと化學(xué)的に不適合である);そして(d)構(gòu)造?活性分析の有用性を制限する(そのような分析は、活性に対するタグ自體の潛在的な影響によって混亂されるため)?，F(xiàn)在の方法は低濃度で多數(shù)の化合物を含む化合物の混合プールを生じるという事実から、なおさらなる制限が生じる。これは、プールからの活性成分のデコンボリューションの必要性につながり、低濃度は、適用可能なスクリーンの形式と性質(zhì)を厳しく制限する。均一な細(xì)胞ベースの表現(xiàn)型スクリーニングは不可能である。

解読可能な化學(xué)ライブラリのスクリーニングを可能にし、上記の問(wèn)題を解決するHTS技術(shù)が必要とされている。

発明の第1の態(tài)様によれば、コード化された化學(xué)ライブラリをスクリーニングするための方法が提供され、該ライブラリが、各々コード化タグに放出可能に連結(jié)された複數(shù)の異なる化學(xué)構(gòu)造を含み、該方法は、(a)該タグ付き化學(xué)構(gòu)造のライブラリを提供する工程;(b)そのタグから各化學(xué)構(gòu)造を放出させ、複數(shù)の遊離するタグなし化學(xué)構(gòu)造(TCS)を生じさせる工程;(c)それらをアッセイシステムと、各TCSとそのタグとの間の空間的結(jié)び付けが維持される條件下で接觸させることによって該TCSをスクリーニングし、各々そのタグと空間的に結(jié)び付けられている複數(shù)の異なるスクリーニングされたTCSを生じさせる工程;および(d)スクリーニングされたTCSを、それと空間的に結(jié)び付けられたタグを解読することにより同定する工程を含む。

スクリーニングは任意の濃度のTCSで実施することができる。好ましくは、TCSの濃度は斷片ベースのスクリーニングを容易にし、そして例えば、nM?mMの範(fàn)囲にあり得る。

したがって、本発明の方法は、タグなしコード化化學(xué)構(gòu)造のライブラリのスクリーニングを可能にし、それによりコード化タグの存在に伴う問(wèn)題を回避する。

スプリット?アンド?プールDECL生成の模式図。一次ファーマコアがタグ付けされ、當(dāng)該一次ファーマコアに特異的である相補(bǔ)的オリゴヌクレオチドを介してビーズに擔(dān)持される。ビーズ中のガイドDNAのμM?mM濃度は、ビーズ中のファーマコアの対応するμM?mM濃度を生じる。伝統(tǒng)的な化學(xué)的方法を用いた一次ファーマコア周辺のアセンブリ?各付加は、コード化タグ(これはバーコードとして機(jī)能する)の末端にライゲートされた特定のDNAにカップリングされる。したがって、ビーズは固相合成に使用することができ、そして反応のために大量の反応性の二次ファーマコアを付加することができる。追加のオリゴヌクレオチドのライゲーションは、同時(shí)に(例えば、クリックまたは同様の化學(xué)反応を介して)または合成後工程によって起こり得る。

スプリット?アンド?プールDECLの模式図。図1に示すように、合成工程は、DNA配列(タグ)の付加によってコード化されたファーマコア(部分構(gòu)造)アセンブリを含む。ビーズ中のガイドDNAのμM?mM濃度は、合成された化學(xué)構(gòu)造の対応するμM?mM濃度を生じる。指標(biāo)細(xì)胞は、表現(xiàn)型スクリーニング用である。液滴內(nèi)部のタグ放出は、表現(xiàn)型スクリーンにおいて指標(biāo)細(xì)胞と相互作用するのに十分な濃度の遊離のタグなし化學(xué)構(gòu)造をもたらす。DNAタグはなお、液滴內(nèi)の遊離化學(xué)構(gòu)造と空間的に結(jié)び付けられている。ポジティブFACヒットは、化學(xué)構(gòu)造の構(gòu)造を同定するためにNGS配列決定によって配列決定される。

ビーズマウント捕捉オリゴヌクレオチドへのコード化オリゴヌクレオチドのライゲーション。

ゲル上の切斷可能なリンカーからのペイロードの酵素的放出。

100μmの水性液滴中の切斷可能なリンカーからのペイロードの酵素的放出。

ビーズ結(jié)合オリゴヌクレオチドからのヒュースゲン1,3?雙極子環(huán)化付加を用いて蛍光染料で官能基化された化學(xué)構(gòu)造ペイロードの放出。

ビーズ結(jié)合オリゴヌクレオチドからのイソチオシアネート付加を用いて蛍光染料で官能基化された化學(xué)構(gòu)造ペイロードの放出。

自己犠牲リンカーを用いた遊離化學(xué)構(gòu)造の放出の模式図。

自己犠牲ジペプチドリンカーを用いたスプリット?アンド?プールDECLの模式図。

コード化タグを有するビーズに結(jié)合したVal?Cit?PAB自己犠牲ペプチドリンカーを用いた遊離化學(xué)構(gòu)造の放出の模式図。

(タグ) 任意のコード化タグは、それがその同族の化學(xué)構(gòu)造(またはその反応履歴)をユニークに同定する情報(bào)(例えば、化學(xué)的および/または光學(xué)的性質(zhì)/特性の形態(tài)で)を含む限り、本発明に従って使用することができる。それによって、その特定の化學(xué)構(gòu)造のユニークな識(shí)別子として機(jī)能する。したがって、タグは、特定の化學(xué)構(gòu)造を「コード化」し、分子の「バーコード」として機(jī)能する。好ましい実施形態(tài)において、タグは、その情報(bào)が核酸の配列にコードされる核酸(例えば、DNA)タグである。しかし、他のタグを使用してもよく、非DNAタグ、非RNAタグ、修飾核酸タグ、ペプチドタグ、光ベースのバーコード(例えば量子ドット)およびRFIDタグを含む。

以上説明したように、化學(xué)構(gòu)造は、種々の異なる方法でタグを付けることができ、そしてDNAタグを、単に特定の化學(xué)構(gòu)造をコード化する(「DNAレコード化」)だけでなく、その合成を指向させるテンプレートとして(「DNAテンプレート化」、以下參照)、使用することもできる。この技術(shù)は、近年、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47:12747-12753;Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12):5707-5717;およびMullard (2016) Nature 530:367-369によって概説されている。

特定の実施形態(tài)では、スプリット?アンド?プールタグ付け技法が使用される(例えば、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47:1274-12753、および特に図3を參照のこと。これは、參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)。

同定工程(d)は、コード化タグを解読する工程を含み、したがって、コード化タグの性質(zhì)に従って選択される。核酸タグの場(chǎng)合、同定工程は、核酸(例えばDNA)を配列決定することを含む。

化學(xué)構(gòu)造は、(本明細(xì)書(shū)で定義される)小分子であってもよい。特定の実施形態(tài)では、構(gòu)造は、いくつかの連結(jié)した部分構(gòu)造から構(gòu)成される。他の実施形態(tài)では、例えば非薬物適用のためのスクリーニングにおいて、化學(xué)構(gòu)造は、(本明細(xì)書(shū)で定義される)大分子であり得る。

(リンカー) 化學(xué)構(gòu)造は、切斷可能なリンカーによってコード化タグに(直接的または間接的に)放出可能に連結(jié)され得る。そのような実施形態(tài)において、切斷可能なリンカーは、酵素的に切斷可能なリンカー;求核性/塩基感受性リンカー;還元感受性リンカー;光切斷可能なリンカー;求電子性/酸感受性リンカー;金屬補(bǔ)助切斷感受性リンカー;酸化感受性リンカー;および前出の2つまたはそれ以上の組合せから選択されるリンカーを含み得る。

化學(xué)構(gòu)造は、核酸ハイブリダイゼーションによって、コード化タグに(直接的または間接的に)放出可能に連結(jié)され得る。そのような実施形態(tài)において、化學(xué)構(gòu)造はまた、上記のように、切斷可能なリンカーによって、コード化タグに(直接的または間接的に)放出可能に連結(jié)され得る。

好ましい実施形態(tài)では、切斷可能なリンカーはRNAを含み得、そのような実施形態(tài)では、工程(b)は、タグ付き化學(xué)構(gòu)造をRNAseと接觸させることを含み得る。

他の実施形態(tài)では、切斷可能なリンカーはペプチドを含み得、そのような実施形態(tài)では、工程(b)は、タグ付き化學(xué)構(gòu)造をペプチダーゼと接觸させることを含み得る。

他の実施形態(tài)では、切斷可能なリンカーはDNAを含み得、そのような実施形態(tài)では、工程(b)は、タグ付き化學(xué)構(gòu)造を部位特異的エンドヌクレアーゼと接觸させることを含み得る。

化學(xué)構(gòu)造は、コード化タグに対し、(a)該コード化タグの核酸にハイブリダイズし;かつ(b)該化學(xué)構(gòu)造にカップリングされている核酸によって放出可能に連結(jié)され得る。そのような実施形態(tài)では、ハイブリダイズする核酸は、上で定義されたような切斷可能なリンカーによって化學(xué)構(gòu)造にカップリングされ得る。ここで、ハイブリダイズする核酸は、好ましくはRNAであり、その場(chǎng)合、工程(b)は、タグ付き化學(xué)構(gòu)造をRNAseと接觸させることを含み得る。

本発明の方法において、工程(b)は、化學(xué)構(gòu)造にカップリングしかつコード化タグの核酸にハイブリダイズした核酸の脫ハイブリダイゼーション、例えば融解を含み得る。

(ライブラリの微小區(qū)畫(huà)) 工程(a)のコード化化學(xué)ライブラリは、n個(gè)のクローン集団のタグ付き化學(xué)構(gòu)造を含み、各クローン集団がn個(gè)の個(gè)別のライブラリ微小區(qū)畫(huà)に閉じ込められている。 (a)n> 10³;そのような実施形態(tài)では、(a)n>10³;または(b)n>10⁴;または(c)n>10⁵;または(d)n>10⁶;または(e)n>10⁷;または(f)n>10⁸;または(g)n>10⁹;または(h)n>10¹⁰;または(i)n>10¹¹;または(j)n>10¹²;または(k)n>10¹³;(l)n>10¹⁴;または(m)n>10¹⁵。ライブラリ微小區(qū)畫(huà)は、微小液滴、微小粒子および微小小胞から選択され得る。例えば、ビーズの形態(tài)の微小粒子ライブラリ微小區(qū)畫(huà)が好ましい。

タグ付き化學(xué)構(gòu)造は、細(xì)胞ベースまたは表現(xiàn)型スクリーン(特に均一な細(xì)胞ベースの表現(xiàn)型アッセイ)を可能にするように、十分に高い濃度にてライブラリ微小區(qū)畫(huà)で存在し得る。特定の実施形態(tài)では、タグ付き化學(xué)構(gòu)造は、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)(1つまたは複數(shù))中に、少なくとも0.1nM、0.5nM、1.0nM、5.0nM、10.0nM、15.0nM、20.0nM、30.0nM、50.0nM、75.0nM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、75.0μM、100.0μM、200.0μM、300.0μM、500.0μM、1mM、2mM、5mMまたは10mMの濃度で存在し得る。

他の実施形態(tài)では、タグ付き化學(xué)構(gòu)造は、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)(1つまたは複數(shù))中に、少なくとも0.1pM、0.5pM、1.0pM、5.0pM、10.0pM、15.0pM、20.0pM、30.0pM、50.0pM、75.0pM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、5.0nM、10.0nM、15.0nM、20.0nM、30.0nM、50.0nM、75.0nM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、75.0μM、100.0μM、200.0μM、300.0μM、500.0μM、1mM、2mM、5mMまたは10mMの濃度で存在し得る。

他の実施形態(tài)では、タグ付き化學(xué)構(gòu)造は、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)(1つまたは複數(shù))中に、1μM未満;1?100μM;100μMより多い;5?50μMまたは10?20μMの濃度で存在し得る。

工程(c)の空間的な結(jié)び付けは、任意の適切な手段によって維持され得るが、好ましいのは、TCSとそのタグが空間的に近接して閉じ込められているような微小區(qū)畫(huà)化である。(以下により詳細(xì)に記載されるように)微小液滴、微小粒子、マイクロウェル、マイクロアレイおよび微小胞を含む種々の微小區(qū)畫(huà)を使用することによって、物理的閉じ込めを達(dá)成することができる。

好ましい局面において、工程(c)のタグはアッセイシステムから機(jī)能的または物理的に分離されている。これにより、アッセイ試薬によるタグの干渉が防止される。そのような実施形態(tài)では、タグは、上で定義されたように、ライブラリの微小區(qū)畫(huà)內(nèi)またはその上に分離され、隔離され、閉じ込められ、または配置され得る。

(スクリーニング微小區(qū)畫(huà)) 好ましい実施形態(tài)では、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)のそれぞれは、工程(b)の前に、例えば、マイクロカプセル化、ピコインジェクションまたは微小液滴融合によって、個(gè)別のスクリーニング微小區(qū)畫(huà)に配置さ得る。スクリーニング微小區(qū)畫(huà)は、任意の形態(tài)をとることができるが、ハイスループットスクリーニングに適した形態(tài)が好ましい。特に好ましいのは、微小液滴、マイクロウェルおよび/またはマイクロフルイディックチャネルから選択されるスクリーニング微小區(qū)畫(huà)である。

スクリーニング微小區(qū)畫(huà)は、好ましくは、(i)水性溶媒;および/または(iii)ゲル化システム、例えばヒドロゲル、および/または(iii)アッセイシステムと一緒に、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)を含む。

スクリーニング微小區(qū)畫(huà)は、好都合に、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)が該ゲル化したスクリーニング微小區(qū)畫(huà)內(nèi)に固定化されるように、同定工程(d)前にゲル化され得るゲル化システムを含む。そのような実施形態(tài)では、ゲル化工程の後、同定工程(d)前に洗浄工程が行われ得、それによって、そうでなければ解読工程の信頼性を損なう可能性がある干渉の反応物/生成物を除去する。

本発明の方法の工程(b)では、TCSは、スクリーニング微小區(qū)畫(huà)中に放出され得、一方でタグは、(a)ライブラリ微小區(qū)畫(huà)內(nèi)または上に、例えば共有結(jié)合および/または水素結(jié)合によって、保持される;(b)ライブラリまたはスクリーニング微小液滴の表面で、官能基化された界面活性剤によって隔離される;または(c)アッセイシステムの構(gòu)成要素によって隔離されている。

本発明の方法は、そのタグから各化學(xué)構(gòu)造を放出して、複數(shù)の遊離するタグなし化學(xué)構(gòu)造(TCS)を生成する工程を含む。TCSは、好都合には、拡散によって(例えば、ライブラリ微小區(qū)畫(huà)から直接拡散によって)、スクリーニング微小區(qū)畫(huà)中に放出される。

スクリーニング工程(c)は、アッセイシステム、TCSのクローン集団、およびタグを含むライブラリ微小區(qū)畫(huà)を含むスクリーニング用微小液滴內(nèi)で行われ得る。

(テンプレート化合成) 特定の実施形態(tài)では、コード核酸タグは、化學(xué)構(gòu)造のテンプレートとして機(jī)能する。そのような実施形態(tài)では、タグ付き化學(xué)構(gòu)造のライブラリは、化學(xué)構(gòu)造の核酸テンプレート化、例えばDNAテンプレート化合成によって提供される。任意の適切なテンプレート化技術(shù)が使用され得、そして適切な技術(shù)は、例えば、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47:12747-12753;Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12):5707-5717およびMullard (2016) Nature 530:367-369に記載されている。Pehr Harbury教授および共同研究者(Stanford University、米國(guó))によって開(kāi)発されたDNA経路指定アプローチもまた適切である。DNAテンプレートは、任意の方法でパターン化/構(gòu)成され得る。例えば、YoctoReactorシステムは、適切なドナー化學(xué)部分をコアアクセプター部位上に転移させることによってライブラリ合成を補(bǔ)助するために、3方向DNA?ヘアピンループ接合部を使用する(WO2006/048025を參照のこと。この開(kāi)示は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)。

代替の構(gòu)造幾何學(xué)もまた利用可能である:例えば、4方向DNAホリデイジャンクションおよび六角形構(gòu)造(Lundberg et al. (2008) Nucleic acids symposium (52):683-684によって記載されるような)、ならびにRothemund (2006) Nature 440:297-302により概説される「スキャフォールド化DNA折り紙」技術(shù)によって作成された複雑な形狀およびパターン。

(リアクタ微小區(qū)畫(huà)) コード核酸タグが化學(xué)構(gòu)造のためのテンプレートとして機(jī)能する実施形態(tài)では、テンプレート化合成は、コード化核酸テンプレートを、必要に応じてPCRによって、増幅することを含む工程の前に行われ得る。この増幅工程は、リアクタ微小區(qū)畫(huà)中で行われ得る。

したがって、本発明は、以下のライブラリ合成を企図した:(a’)(i)コード化テンプレートのクローン集団;および(ii)複數(shù)の化學(xué)部分構(gòu)造を含有するリアクタ微小區(qū)畫(huà)を提供する工程;ならびに、次いで(b’)部分構(gòu)造が、核酸テンプレート化合成によって化學(xué)構(gòu)造のクローン集団を形成するように反応する條件下で、リアクタ微小區(qū)畫(huà)內(nèi)でテンプレートを部分構(gòu)造と接觸させる工程を含み、それにより、コード化テンプレートにハイブリダイズした化學(xué)構(gòu)造のクローン集団を含むリアクタ微小區(qū)畫(huà)を生じさせる。

そのような実施形態(tài)におけるリアクタ微小區(qū)畫(huà)は、マイクロウェル、マイクロアレイ、マイクロフルイディックチャネル、微小粒子、微小小胞または微小液滴から選択され得る。微小液滴が好ましい。微小區(qū)畫(huà)はヒドロゲルを含んでもよく、そのようなヒドロゲル含有微小區(qū)畫(huà)の例は本明細(xì)書(shū)に記載されている。

ここで、この方法は、(i)コード化テンプレートから化學(xué)構(gòu)造を脫ハイブリダイズし、そして次いで(ii)リアクタ微小區(qū)畫(huà)內(nèi)で脫ハイブリダイズしたテンプレートを未反応の部分構(gòu)造と、部分構(gòu)造が核酸テンプレート化合成によって化學(xué)構(gòu)造のさらなるクローン集団を形成するように反応する條件下で接觸させ、そして次いで(iii)工程(i)および(ii)を繰り返すことによって、化學(xué)構(gòu)造の數(shù)を増幅させる工程をさらに含み得る。

そのような実施形態(tài)では、化學(xué)構(gòu)造が、リアクタ微小區(qū)畫(huà)中に、少なくとも0.1nM、0.5nM、1.0nM、5.0nM、10.0nM、15.0nM、20.0nM、30.0nM、50.0nM、75.0nM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、75.0μM、100.0μM、200.0μM、300.0μM、500.0μM、1mM、2mM、5mMまたは10mMの濃度で存在するまで、工程(i)および(ii)が繰り返され得る。従って、工程(i)および(ii)は、化學(xué)構(gòu)造がリアクタ微小區(qū)畫(huà)中に、1?100μM、5?50μMまたは10?20μMの濃度で存在するまで繰り返され得る。

本発明の方法の文脈においてテンプレート化合成は、化學(xué)構(gòu)造にカップリングされた核酸とコード化タグテンプレートの核酸との間のハイブリダイゼーションを含んでいてもよい。

(既存の化學(xué)ライブラリのクローンタグ付け) テンプレート化合成は、本発明の方法にとって必須の要件ではないが、タグ付き化學(xué)構(gòu)造のライブラリは、任意の適切な手段によって提供され得る。たとえば、本発明による使用のためのライブラリは、化學(xué)構(gòu)造のクローン集団を含んでもよく、工程(a)は、該クローン集団內(nèi)で化學(xué)構(gòu)造の各々にコード化タグを放出可能に連結(jié)する工程を含む。そのような実施形態(tài)における化學(xué)構(gòu)造のクローン集団は、市販の化學(xué)ライブラリの要素であり得る。

このような実施形態(tài)では、コード化タグは、核酸配列、例えばDNA配列を含み得る。タグは、複數(shù)の異なる架橋部位にて化學(xué)構(gòu)造に放出可能に連結(jié)され得、それによって化學(xué)構(gòu)造上の特定の部位(1つまたは複數(shù))での架橋から生じるあらゆる有害な影響を軽減する。そのような実施形態(tài)では、コード化タグは、タグ付けが複數(shù)の異なる架橋部位で起こり得るように、複數(shù)の異なる架橋部位にて官能基化され得る。

適切な核酸ベースのタグは市販されている(例えばTwist Bioscience Corporationから)が、それらは例えばWO2015/021080(その內(nèi)容は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されているように合成してもよい。

(標(biāo)的細(xì)胞) 本発明は、表現(xiàn)型の細(xì)胞ベースのアッセイにおける特定の適用を見(jiàn)出す。

従って、アッセイシステムは、均一水相アッセイシステムであり得、そしてスクリーニング工程(c)は、表現(xiàn)型スクリーンを含み得る。そのような実施形態(tài)では、アッセイシステムは、生存標(biāo)的細(xì)胞を含み得る。そのような実施形態(tài)において、任意の細(xì)胞が使用され得、これは、原核細(xì)胞および真核細(xì)胞を含む。好適な原核細(xì)胞は、古細(xì)菌細(xì)胞を含み、例えば(a)クレン古細(xì)菌(Crenarchaeota);(b)ユーリ古細(xì)菌(Euryarchaeota);(c)コル古細(xì)菌(Korarchaeota);(d)ナノ古細(xì)菌(Nanoarchaeota)および(e)タウム古細(xì)菌(Thaumarchaeota)の門(mén)から選択され、例えばハロフェラックス?ウォルカニイ(Haloferax volcanii)およびスルフォロブス屬種(Sulfolobus spp.)から選択される。

本発明に従って標(biāo)的細(xì)胞として使用するのに適した他の原核細(xì)胞は、細(xì)菌細(xì)胞を含む。そのような実施形態(tài)では、標(biāo)的細(xì)胞は病原性細(xì)菌であり得る。他の細(xì)菌標(biāo)的細(xì)胞は、グラム陽(yáng)性細(xì)菌(例えば、エンテロコッカス?フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス?フェシウム(Enterococcus faecium)およびスタフィロコッカス?アウレウス(Staphylococcus aureus));グラム陰性細(xì)菌(例えば、クレブシエラ?ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、アシネトバクター?バウマニ(Acinetobacter baumanii)およびエシェリキア?コリ(Escherichia coli)、エシェリキア?コリST131株(E. coli ST131 strains)、シュードモナス?エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター?クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター?アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)およびナイセリア?ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae));および不確定のグラム反応を示す細(xì)菌から選択される細(xì)胞を含む。

本発明の標(biāo)的細(xì)胞として使用するのに適した真核細(xì)胞は、(a)真菌細(xì)胞;(b)哺乳類細(xì)胞;(c)高等植物細(xì)胞;(d)原蟲(chóng)細(xì)胞;(e)蠕蟲(chóng)細(xì)胞;(f)藻類細(xì)胞;(g)臨床組織サンプル、例えばヒト患者サンプルに由來(lái)する細(xì)胞および(h)無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞を含む。

適切な哺乳類細(xì)胞は、癌細(xì)胞(例えばヒト癌細(xì)胞)、筋肉細(xì)胞、ヒト神経細(xì)胞、および他の細(xì)胞(疾患関連表現(xiàn)型を示す生きているヒト患者に由來(lái)する)を含む。

(標(biāo)的タンパク質(zhì)) アッセイシステムは、単離された標(biāo)的タンパク質(zhì)または単離された標(biāo)的タンパク質(zhì)複合體を含み得る。例えば、標(biāo)的タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體は、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)的タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體であり得る。標(biāo)的タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體は、溶液中にあってもよいし、膜または膜貫通タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體を構(gòu)成してもよい。このような実施形態(tài)では、化學(xué)構(gòu)造は、標(biāo)的タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體に結(jié)合するリガンドについてスクリーニングされ得る。リガンドは、標(biāo)的タンパク質(zhì)/タンパク質(zhì)複合體のインヒビターであってもよい。

アッセイシステムは、検出可能な標(biāo)識(shí)を含むか、または生成し得る。そのような実施形態(tài)では、検出可能な標(biāo)識(shí)は、上記のように、標(biāo)的細(xì)胞または単離された標(biāo)的タンパク質(zhì)もしくは単離された標(biāo)的タンパク質(zhì)複合體に連結(jié)され得る。

スクリーニング工程は、FADSおよび/またはFACSを含み得る。スクリーニング工程はまた、蛍光分析を含んでいてもよく、これは、FRET、FliM、フルオロフォアタグ付き抗體、フルオロフォアタグ付きDNA配列または蛍光染料分析を含むがこれらに限定されない。

(配列ベースの構(gòu)造活性分析) 本発明は、空間的に結(jié)び付けられているタグを解読することによってスクリーニングされたTCSを同定する工程を含む。タグが核酸配列を含む場(chǎng)合、解読工程は、核酸を配列決定することを含み得る。そのような実施形態(tài)では、方法は、複數(shù)の異なるスクリーニングされたTCSの配列を比較することをさらに含み得る。そのような工程の後に、スクリーニングされたTCSに関して配列?活性の関係の分析を?qū)g施する工程が続いてもよく、それはスクリーニングされたライブラリメンバーの異なるケモタイプへの分類を可能にし得る。

(ライブラリ) 別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するためのコード化化學(xué)ライブラリを提供し、このライブラリは、各々コード化タグに放出可能に連結(jié)された化學(xué)構(gòu)造のn個(gè)のクローン集団を含み、各クローン集団は、n個(gè)の個(gè)別のライブラリ微小區(qū)畫(huà)に閉じ込められている。

ここで、化學(xué)構(gòu)造は、例えば、切斷可能なリンカーによっておよび/または核酸ハイブリダイゼーションによって、上記のようにコード化タグに連結(jié)され得る。

別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するためのコード化化學(xué)ライブラリを提供し、このライブラリは、遊離する化學(xué)構(gòu)造のn個(gè)のクローン集団を含み、各クローン集団は、n個(gè)の個(gè)別のライブラリ微小區(qū)畫(huà)に閉じ込められ、該化學(xué)構(gòu)造は、コード化タグと共に該微小區(qū)畫(huà)內(nèi)に含まれるが、該コード化タグに共有結(jié)合されていない。

別の局面において、本発明は、本発明の方法で使用するためのアッセイ組成物を提供し、この組成物は、微小區(qū)畫(huà)內(nèi)に含まれる化學(xué)構(gòu)造がアッセイシステムと接觸される本発明のライブラリを含む。ここで、コード化タグは、アッセイシステムから機(jī)能的または物理的に分離され得る。例えば、化學(xué)構(gòu)造は、アッセイシステムを含むライブラリ微小液滴內(nèi)に含まれ得、そしてコード化タグは、ライブラリ微小液滴內(nèi)にカプセル化された微小液滴、ビーズまたは微小小胞內(nèi)または上に配置することができる。

別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するための核酸コード化化學(xué)ライブラリリアクタを提供し、これは、(a)コード化核酸テンプレート分子のクローン集団、および(b)複數(shù)の化學(xué)部分構(gòu)造を含む微小區(qū)畫(huà)を含み、該部分構(gòu)造が、核酸テンプレートアセンブリがコード化核酸タグ化化學(xué)構(gòu)造を形成するように適合され、該コード化タグが該化學(xué)構(gòu)造に放出可能に連結(jié)されている。

本発明の他の態(tài)様および好ましい実施形態(tài)は、以下に示した他の特許請(qǐng)求の範(fàn)囲において定義および説明されている。

(発明の詳細(xì)な説明) 本明細(xì)書(shū)で言及される全ての刊行物、特許、特許出願(yuàn)および他の參考文獻(xiàn)は、全ての目的でそれらの全體が參照によって援用される。あたかもそれぞれ個(gè)々の刊行物、特許または特許出願(yuàn)が具體的かつ個(gè)別に示されているかのごとく、參照によりその引用した?jī)?nèi)容全體が援用される。

(定義と全般の設(shè)定) 本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、そして他に具體的に示されない限り、以下の用語(yǔ)は、當(dāng)該用語(yǔ)が當(dāng)該技術(shù)分野において享受し得る任意のより広い(またはより狹い)意味に加えて、以下の意味を有することを意図する。

文脈によって他に必要とされない限り、本明細(xì)書(shū)における?yún)g數(shù)形の使用は複數(shù)形を含むと解釈されるべきであり、逆もまた同様である。ある実體に関して使用される「1つの」という用語(yǔ)は、その実體の1つまたは複數(shù)を指すと読まれるべきである。そのように、用語(yǔ)「a」(または「an」)、「1つまたはそれ以上」、および「少なくとも1つ」は、本明細(xì)書(shū)では互換的に使用される。

本明細(xì)書(shū)で使用されるとき、用語(yǔ)「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などのその変形は、任意の列挙された整數(shù)(integer)(例えば、特徴、要素、特質(zhì)、特性、方法/プロセス工程または制限)または整數(shù)のグループ(例えば、特徴、要素、特質(zhì)、特性、方法/プロセス工程または制限)の包含を示すと読まれるべきであるが、他の整數(shù)または整數(shù)のグループを排除するものではない。したがって、本明細(xì)書(shū)で使用されるとき、用語(yǔ)「含む(comprising)」は包括的または無(wú)制限であり、列挙されていない追加の整數(shù)または方法/プロセス工程を排除するものではない。

用語(yǔ)グラム陽(yáng)性細(xì)菌とは、特定の細(xì)胞壁染色特性に基づいてグループ化された細(xì)菌の特定のクラスを定義する用語(yǔ)である。

用語(yǔ)低G+Cグラム陽(yáng)性細(xì)菌とは、DNAの塩基組成に基づいて、グラム陽(yáng)性內(nèi)に進(jìn)化的に関連した細(xì)菌の特定のサブクラスのクラスを定義する用語(yǔ)である。サブクラスは、ストレプトコッカス屬種(Streptococcus spp.)、スタフィロコッカス屬種(Staphylococcus spp.)、リステリア屬種(Listeria spp.)、バチルス屬種(Bacillus spp.)、クロストリジウム屬種(Clostridium spp.)、エンテロコッカス屬種(Enterococcus spp.)およびラクトバチルス屬種(Lactobacillus spp.)を含む。

用語(yǔ)高G+Cグラム陽(yáng)性細(xì)菌とは、DNAの塩基組成に基づいて、グラム陽(yáng)性內(nèi)に進(jìn)化的に関連した細(xì)菌の特定のサブクラスのクラスを定義する技術(shù)用語(yǔ)である。サブクラスは、アクチノマイセス屬種(Actinomyces spp.)、アルスロバクター屬種(Arthrobacter spp.)、コリネバクテリウム屬種(Corynebacterium spp.)、フランキア屬種(Frankia spp.)、ミクロコッカス屬種(Micrococcus spp.)、ミクロモノスポラ屬種(Micromonospora spp.)、マイコバクテリウム屬種(Mycobacterium spp.)、ノカルディア屬種(Nocardia spp.)、プロピオニバクテリウム屬種(Propionibacterium spp.)およびストレプトミセス屬種(Streptomyces spp.)を含む放線菌科(actinomycetes(放線菌(actinobacteria)))を含む。

用語(yǔ)グラム陰性細(xì)菌とは、特定の細(xì)胞壁染色特性に基づいてグループ化された細(xì)菌の 特定のクラスを定義する用語(yǔ)である。グラム陰性菌屬の例は、クレブシエラ屬(Klebsiella)、アシネトバクター屬(Acinetobacter)、エシェリキア屬(Escherichia)、シュードモナス屬(Pseudomonas)、エンテロバクター屬(Enterobacter)および ナイセリア屬(Neisseria)を含む。

本明細(xì)書(shū)で使用されるように、用語(yǔ)アッセイシステムとは、所望の活性を検出するための手段を規(guī)定する。アッセイシステムは、それが、ライブラリに存在し、所望の活性を有する化學(xué)構(gòu)造と接觸するかまたは反応すると、検出可能および/または測(cè)定可能なシグナルを直接的または間接的に生成する。所望の活性は、標(biāo)的タンパク質(zhì)結(jié)合、薬理學(xué)的活性、細(xì)胞受容體結(jié)合、抗生物質(zhì)、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、駆蟲(chóng)剤、殺蟲(chóng)剤、薬理學(xué)的活性、免疫學(xué)的活性、所望の化合物の産生、化合物の産生増加または特定産物の分解であり得る。所望の活性は、薬理學(xué)的標(biāo)的細(xì)胞、細(xì)胞のタンパク質(zhì)または代謝経路に対する活性であり得る。所望の活性はまた、例えば1つまたはそれ以上の遺伝子の発現(xiàn)および/またはそれらの時(shí)間的もしくは空間的(例えば組織特異的)発現(xiàn)パターンを減少または増加させることによって、遺伝子発現(xiàn)を調(diào)節(jié)する能力であり得る。所望の活性は、例えば標(biāo)的タンパク質(zhì)に対するリガンドとして作用するための、結(jié)合活性であり得る。所望の活性はまた、種々の工業(yè)プロセスにおいて有用であるものであり得、これには、バイオレメディエーション、微生物増強(qiáng)石油回収、下水処理、食品製造、バイオ燃料生産、エネルギー生成、バイオ生産、バイオ消化/生分解、ワクチン生産およびプロバイオティクス生産が含まれる。それはまた、化學(xué)剤(例えば、フルオロフォアまたは色素)、特定の化學(xué)反応、または色、マトリックス構(gòu)造または屈折率変化に結(jié)びつくことができる任意の化學(xué)反応であってもよい。

アッセイシステムは、化學(xué)的指標(biāo)を含み得、これは、レポーター分子および検出可能な標(biāo)識(shí)(本明細(xì)書(shū)中で定義されるような)を含む。それは、例えば、比色(すなわち、可視範(fàn)囲の光を吸収する著色反応生成物をもたらす)、蛍光(例えば、酵素が基質(zhì)を反応生成物に変換し、この反応生成物は特定の波長(zhǎng)の光によって勵(lì)起されると蛍光を発することに基づく)、および/または発光(例えば、生物発光、化學(xué)発光および/またはフォトルミネッセンスに基づく)であり得る。

アッセイシステムは、細(xì)胞、例えば本明細(xì)書(shū)に記載のような標(biāo)的細(xì)胞を含み得る。アッセイシステムはまた、タンパク質(zhì)、例えば本明細(xì)書(shū)に記載のような標(biāo)的タンパク質(zhì)を含み得る。あるいは、またはさらに、アッセイシステムは、細(xì)胞畫(huà)分、細(xì)胞成分、組織、組織抽出物、多タンパク質(zhì)複合體、膜結(jié)合タンパク質(zhì)膜畫(huà)分および/またはオルガノイドを含み得る。

本明細(xì)書(shū)で使用される用語(yǔ)リガンドとは、インビボでの生物學(xué)的標(biāo)的分子に対する結(jié)合相手(例えば、酵素または受容體)を定義するために使用される。したがって、そのようなリガンドは、その結(jié)合の生理學(xué)的影響に関係なく、インビボで標(biāo)的と結(jié)合する(または直接的に物理的に相互作用する)ものを含む。したがって、本発明のリガンドは、標(biāo)的が一部を形成する細(xì)胞內(nèi)シグナル伝達(dá)カスケードの一部として標(biāo)的に結(jié)合し得る。あるいは、それらは細(xì)胞生理學(xué)の他のいくつかの局面の狀況において標(biāo)的と結(jié)合し得る。後者の場(chǎng)合、リガンドは、例えば、シグナル伝達(dá)カスケードを誘発することなく細(xì)胞表面で標(biāo)的に結(jié)合し得、その場(chǎng)合、結(jié)合は細(xì)胞機(jī)能の他の局面に影響を及ぼし得る。したがって、本発明のリガンドは細(xì)胞表面および/または細(xì)胞內(nèi)で標(biāo)的に結(jié)合することができる。

本明細(xì)書(shū)で使用する場(chǎng)合、用語(yǔ)小分子とは、1000Da以下、例えば、900Da未満、800Da未満、600Da未満、または500Da未満の分子量を有する任意の分子を意味する。好ましくは、本発明のライブラリ中に存在する化學(xué)構(gòu)造は、本明細(xì)書(shū)中で定義されるような小分子、特に600Da未満の分子量を有する小分子であり得る。

本明細(xì)書(shū)中で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)「大分子」は、1000Daより大きい分子量を有する任意の分子を意味する。

本明細(xì)書(shū)中で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)抗體とは、全抗體(ポリクローナル抗體およびモノクローナル抗體(mAb)を含む)を定義する。この用語(yǔ)はまた、F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv、Fc3および一本鎖抗體(およびそれらの組み合わせ)を含む抗體フラグメント(これらは、組換えDNA技術(shù)またはインタクトな抗體の酵素的もしくは化學(xué)的開(kāi)裂によって製造され得る)をいうために本明細(xì)書(shū)で用いられる。用語(yǔ)「抗體」はまた、二重特異性または二機(jī)能性の抗體(これらは2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結(jié)合部位を有する合成ハイブリッド抗體である)を包含するために本明細(xì)書(shū)中で使用される。二重特異性抗體は、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの連結(jié)を含む、種々の方法によって製造することができる。キメラ抗體(1つまたはそれ以上の非ヒト可変抗體免疫グロブリンドメインにカップリングしたヒト定?？贵w免疫グロブリンドメインを有する抗體、またはそのフラグメント)もまた「抗體」という用語(yǔ)に包含される。したがって、そのようなキメラ抗體は「ヒト化」抗體を含む?！缚贵w」という用語(yǔ)には、ミニボディ(WO94/09817參照)、一本鎖Fv?Fc融合體、およびトランスジェニック動(dòng)物によって産生されるヒト抗體も含まれる。「抗體」という用語(yǔ)には、多量體抗體およびタンパク質(zhì)の高次複合體(例えばヘテロ二量體抗體)も含まれる。

本明細(xì)書(shū)で使用する場(chǎng)合、用語(yǔ)ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質(zhì)とは、ペプチド結(jié)合によって共有結(jié)合された2個(gè)またはそれ以上のアミノ酸を含む有機(jī)化合物を定義するために互換的に使用される。対応する形容詞的な用語(yǔ)「ペプチド性」は、それに応じて解釈されるべきである。ペプチドは構(gòu)成アミノ酸の數(shù)に関して稱され得、すなわち、ジペプチドは2個(gè)のアミノ酸殘基を含有し、トリペプチドは3個(gè)を含有するなどである。10個(gè)以下のアミノ酸を含有するペプチドはオリゴペプチドと稱され得る。10個(gè)より多いアミノ酸殘基を有するものがポリペプチドである。そのようなペプチドはまた、修飾ならびにさらなるアミノ基およびカルボキシ基のいずれかを含んでもよい。

本明細(xì)書(shū)で使用されるように、用語(yǔ)クリックケミストリーとは、高収量で、広い範(fàn)囲で、クロマトグラフィーなしで除去することができる副生成物のみを生じ、立體特異的で、実行が簡(jiǎn)単で、そして容易に除去可能または良性の溶媒中で行われる反応を表すために、2001年にSharplessによって導(dǎo)入された技術(shù)用語(yǔ)である。それ以來(lái)、化學(xué)と生物學(xué)の両方で幅広い用途で、多くの異なる形で実行されている。クリック反応のサブクラスは、周?chē)欷紊飳W(xué)的環(huán)境に不活性な反応物を含む。このようなクリック反応は生體直交(bioorthogonal)と呼ばれる。生體直交クリックケミストリーに適した生體直交反応體ペアは、以下の特性を有する分子群である:(1)それらは相互に反応性であるが、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境において細(xì)胞生化學(xué)システムと有意に交差反応または相互作用しない;(2)それらまたはそれらの産物および副産物は、生理學(xué)的環(huán)境において安定であり、非毒性である;そして(3)それらの反応は非常に特異的で速い。反応性部分(またはクリック反応體)は、用いる特定のクリックケミストリーへの參照によって選択され得、そして當(dāng)業(yè)者に知られている生體直交クリック反応體の広範(fàn)な適合可能な対のいずれかが、本発明に従って使用され得、これは、逆電子要請(qǐng)型ディールス?アルダー環(huán)化付加反応(IEDDA)、ひずみ促進(jìn)アルキンアジド環(huán)化付加(SPAAC)およびシュタウディンガーライゲーションを含む。

用語(yǔ)単離されたとは、その材料が天然に存在するものとは異なる物理的環(huán)境に存在することを示すために、任意の材料(例えば、化合物、アッセイ試薬、標(biāo)的タンパク質(zhì)または標(biāo)的細(xì)胞)に関して、本明細(xì)書(shū)で使用される。例えば、単離された細(xì)胞は、それらが天然に存在する複雑な組織環(huán)境に関して実質(zhì)的に単離されたものであり得る(例えば精製されていてもよい)。単離された細(xì)胞は、例えば精製または分離されたものであってもよい。そのような場(chǎng)合、単離された細(xì)胞は、存在する全細(xì)胞型の少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%を占め得る。単離された細(xì)胞は、當(dāng)業(yè)者に公知の通常の技術(shù)により得られ得、このような技術(shù)は、FACS、密度勾配遠(yuǎn)心分離、富化培養(yǎng)、選択培養(yǎng)、細(xì)胞選別およびパニング(表面タンパク質(zhì)に対する固定化抗體を用いる)を含む。

単離された材料が精製されるとき、純度の絶対レベルは重要ではなく、そして當(dāng)業(yè)者は材料が置かれるべき用途に従って適切なレベルの純度を容易に決定することができる。しかしながら、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%w/wの純度レベルが好ましい。狀況によっては、単離された材料は、他の成分を含み得る組成物(例えば、他の多くの細(xì)胞成分を含む多かれ少なかれ粗製の細(xì)胞抽出物)または緩衝系の一部を形成する。

用語(yǔ)接觸するとは、少なくとも2つの異なる部分またはシステム(例えば、化學(xué)構(gòu)造およびアッセイシステム)が反応、相互作用または物理的接觸するのに十分に近位になることを可能にするプロセスをいうために、本明細(xì)書(shū)において使用される。

用語(yǔ)検出可能な標(biāo)識(shí)とは、分光學(xué)的、蛍光的、光化學(xué)的、生化學(xué)的、免疫化學(xué)的、化學(xué)的、電気化學(xué)的、無(wú)線周波數(shù)により、または任意の他の物理的手段により検出可能な部分を定義するために、本明細(xì)書(shū)において使用される。適切な標(biāo)識(shí)としては、蛍光タンパク質(zhì)、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および、(例えば、標(biāo)的ペプチドと特異的に反応するペプチドまたは抗體に放射性または蛍光標(biāo)識(shí)を取り込ませることによって)検出可能となるタンパク質(zhì)または他の実體が挙げられる。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)微小液滴とは、0.1μm?1000μmの直徑を有し、かつ/または5×10^?7pLと500nLとの間の體積を有する、個(gè)別體積が小さな流體、液體又はゲルを定義する。典型的には、微小液滴は、1000μm未満、例えば500μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、100μm未満、50μm未満、40μm未満、30μm未満、20μm未満、10μm未満、5μm未満、または1μm未満。したがって、微小液滴は、以下の直徑を有する実質(zhì)的に球形であり得る:(a)1μm未満;(b)10μm未満;(c)0.1?10μm;(d)10μm?500μm;(b)10μm?200μm;(c)10μm?150μm;(d)10μm?100μm;(e)10μm?50μm;または(f)約100μm。

本発明の微小液滴は、典型的には、第二の流體、液體またはゲル(例えば、非混和性の液體又は気體)によって完全に囲まれている第一の流體、液體またはゲルの単離された部分から構(gòu)成されている。いくつかの場(chǎng)合、液滴は、球形または実質(zhì)的に球形であり得る。しかし、いくつかの場(chǎng)合、(例えば、外部環(huán)境によって、または本明細(xì)書(shū)に記載のアッセイおよびスクリーニングプロセス中の物理的操作の間に課される力のために)微小液滴は非球形で、不規(guī)則な形狀を有してもよい。したがって、微小液滴は、(例えば、それらが周?chē)欷违蕙ぅ恁隶悭庭毪螏缀螌W(xué)的形狀に適合する狀況において)実質(zhì)的に円筒形、栓狀、および/または楕円形であり得る。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)微粒子とは、1000μm未満、例えば、500μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、100μm未満、50μm未満、40μm未満、30μm未満、20μm未満、10μm未満、5μm未満、または1μm未満の直徑を有する粒子を定義する。マイクロ粒子は、好ましくは、非平面であり、そして以下の(または直徑を有する実質(zhì)的に球形である)最大寸法を有し得る:(a)10μm?500μm;(b)10μm?200μm;(c)10μm?150μm;(d)10μm?100μm;(e)10μm?50μm;または(f)約100μm。したがって、微粒子は、本明細(xì)書(shū)で定義されるように微小液滴內(nèi)にカプセル化され得る。微粒子は、硬質(zhì)固體、軟質(zhì)ゲル、多孔質(zhì)固體、多孔質(zhì)ゲルまたは硬質(zhì)もしくは半硬質(zhì)のフィブリルもしくは細(xì)管の網(wǎng)狀組織もしくはマトリックスから形成され得る。

本明細(xì)書(shū)中で使用される場(chǎng)合、 用語(yǔ)ビーズとは、固體微粒子を定義するために使用される。好ましいビーズは、ゲル(アガロースなどのヒドロゲルを含む)から、例えばゲル化バルク組成物の斷片化またはプレゲル化狀態(tài)からの成形によって形成される。ビーズは、ストレプトアビジン、アミンまたは臭化シアンのような反応性基または部分で官能基化されていてもよい。あるいは、これらのビーズは、シリコン、ポリスチレン(PS)、 架橋ポリ(スチレン/ジビニルベンゼン)(P[S/DVB])、およびポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)から作られるもののような固體支持體であり得る。

用語(yǔ)微小小胞とは、リポソームのような內(nèi)部容積を取り囲む外壁または膜を含む中空微小粒子を定義するために、本明細(xì)書(shū)において使用される。

本発明の微小液滴、微小粒子および微小小胞は単分散性であり得る。用語(yǔ)単分散性とは、本発明による使用のため微小液滴および微小粒子に適用されると、1.0以下、0.5以下、および好ましくは0.3以下の液滴/粒子サイズ分散の係數(shù)εを有する微小液滴/微小粒子の集団を定義する。係數(shù)εは以下の式によって定義される: ε=(⁹⁰D_p?¹⁰D_p)/⁵⁰D_p(1) ここで、¹⁰D_p、⁵⁰D_p、および⁹⁰D_pは、エマルジョンの相対累積粒子サイズ分布曲線から推定される累積度數(shù)がそれぞれ10%、50%および90%であるときの粒子サイズである。ε=0の場(chǎng)合は、エマルジョン粒子の粒子サイズのばらつきが全くない理想的な狀態(tài)を意味する。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)コード化タグとは、化學(xué)構(gòu)造に関しては、化學(xué)構(gòu)造またはその反応履歴をユニークに同定する情報(bào)を含み、それによりその特定の化學(xué)構(gòu)造のユニークな識(shí)別子として機(jī)能する部分又は因子を定義するために使用される(すなわち、タグは、その構(gòu)造を「コード化」し、分子「バーコード」として機(jī)能する)。情報(bào)は任意の形態(tài)でコード化され得るが、好ましい実施形態(tài)では、タグは、情報(bào)が核酸の配列にコード化されている核酸(例えばDNA)タグである。しかし、他のタグを使用してもよく、非DNAタグ、非RNAタグ、修飾核酸タグ、ペプチドタグ、光ベースのバーコード(例えば量子ドット)およびRFIDタグを含む。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、化學(xué)構(gòu)造に関して用語(yǔ)クローンとは、それぞれが共通のタグによってコード化される化學(xué)構(gòu)造の集団を定義する?；瘜W(xué)構(gòu)造は、化學(xué)的に同一であってもよく、または化學(xué)構(gòu)造をその同族のコード化タグにカップリングする切斷可能なリンカーの性質(zhì)および/または位置に関して(またはそのようなリンカーの切斷後に殘る痕に関して)のみ異なってもよい。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、化學(xué)構(gòu)造に適用される場(chǎng)合の用語(yǔ)遊離とは、固相に結(jié)合していない化學(xué)構(gòu)造を定義するために使用される。いくつかの実施形態(tài)では、この用語(yǔ)は固相に共有結(jié)合していない化學(xué)構(gòu)造を定義する。したがって、遊離化學(xué)構(gòu)造は液相に入ってもよく、および/または溶液に入ってもよく、そしていくつかの実施形態(tài)では、アッセイシステムに存在する細(xì)胞によって結(jié)合および/または取り込まれてもよい。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)マイクロウェル(本明細(xì)書(shū)で用語(yǔ)ウェルと互換的に使用される)とは、1ml未満の容積を有するチャンバをいう。nm範(fàn)囲の寸法を有するマイクロウェルは、電子ビームリソグラフィーによって作製することができる(例えば、Odom et al. (2002) J. AM. CHEM. SOC. 124:12112-12113を參照のこと)。マイクロウェルは、典型的には、固體基板またはマイクロタイタープレート(マイクロプレート、マイクロウェルまたはマルチウォールプレートとも呼ばれる)上に配置され、これは、典型的には、小さな試験管として使用される複數(shù)の「ウェル」を有する平板の形をとる。マイクロプレートは、典型的には、2:3の矩形マトリックスにて配置された6、24、96、384または1536のサンプルのマイクロウェルを有する。

本明細(xì)書(shū)で使用される場(chǎng)合、用語(yǔ)自己犠牲リンカー(self-immolative linker)とは、自己犠牲化學(xué)基(本明細(xì)書(shū)では自己犠牲部分(self-immolative moiety)または「SIM」と呼ばれ得る)を含むリンカーを定義し、この自己犠牲化學(xué)基は、安定なタグ付き化學(xué)構(gòu)造を形成するように化學(xué)構(gòu)造およびそのコード化タグを直接的または間接的に(例えばペプチド部分を介して)共有結(jié)合することが可能であり、かつ化學(xué)構(gòu)造の自発的放出を包含する機(jī)構(gòu)により(例えば、脫離基の排除および遊離化學(xué)構(gòu)造の放出につながる酵素切斷により引き起こされる電子カスケードを介して)、化學(xué)構(gòu)造からコード化タグを放出することが可能である。

(微小區(qū)畫(huà)) 本発明は、遊離化學(xué)構(gòu)造とそのコード化タグとの間の空間的結(jié)び付けの維持を包含する。これは、好都合には、微小區(qū)畫(huà)化によって達(dá)成される。それは、化學(xué)構(gòu)造およびその対応するコード化タグを、それらが物理的に近接して維持される(すなわち、各化學(xué)構(gòu)造は、そのコード化タグの1000μm以內(nèi)(例えば、500μm、250μm、100μm、50μm、25μm、10μmまたは1μm以內(nèi))に配置される)ように、物理的に閉じ込めるプロセスである。以下に説明するように、物理的閉じ込めは、微小液滴、微小粒子、マイクロウェルおよび微小小胞を含む、種々の微小區(qū)畫(huà)の使用を通じて達(dá)成することができる。物理的閉じ込めは、空間的に結(jié)び付けられたタグを解読することによって、スクリーニングヒットの化學(xué)構(gòu)造の同定を可能にする。

(微小液滴) 本発明による微小區(qū)畫(huà)化での使用に適した微小液滴を調(diào)製および処理するための適切な材料および方法は、當(dāng)業(yè)者の常識(shí)の一部を形成し、例えば、WO2010/009365、WO2006/040551、WO2006/040554、WO2004/002627、WO2004/091763、WO2005/021151、WO2006/096571、WO2007/089541、WO2007/081385およびWO2008/063227(それらの內(nèi)容は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されている。

微小液滴のサイズは、カプセル化される化學(xué)構(gòu)造およびアッセイシステムの性質(zhì)を參照することによって選択される。微小液滴は、以下の直徑を有する実質(zhì)的に球狀であり得る:(a)1μm未満;(b)10μm未満;(c)0.1?10μm;(d)10μm?500μm;(b)10μm?200μm;(c)10μm?150μm;(d)10μm?100μm;(e)10μm?50μm;または(f)約100μm。

微小液滴は、好ましくは、サイズが均一であり、例えば、ライブラリ內(nèi)の任意の液滴の直徑が、同じライブラリ內(nèi)の他の液滴の直徑と比較した場(chǎng)合に5%、4%、3%、2%、1%または0.5%未満で変動(dòng)する。いくつかの実施形態(tài)では、微小液滴は単分散性である。しかしながら、多分散性微小液滴も本発明に従って使用され得る。

単一W/O型エマルジョンでは、キャリア液は、任意の水不混和性液體、例えば油であり得、必要に応じて以下から選択される:(a)炭化水素油;(b)フルオロカーボン油;(c)エステル油;(d)シリコーンオイル;(e)水相の生物學(xué)的成分に対する溶解度が低い油;(f)微小液滴間の分子拡散を抑制する油;(g)疎水性かつ疎油性の油;(h)気體に対して良好な溶解性を有する油;および/または(i)上記のうちの任意の2つ以上の組み合わせ。

したがって、微小液滴は、W/Oエマルジョン中に含まれていてもよく、ここで微小液滴は、水性分散相を構(gòu)成し、そしてキャリア液は連続油相を構(gòu)成する。

他の実施形態(tài)では、微小液滴はW/O/W二重エマルジョン中に含まれ、そしてキャリア液體は水性液體であり得る。そのような実施形態(tài)では、水性液體は、リン酸緩衝食塩水(PBS)であり得る。

したがって、微小液滴は、微小液滴が(a)分散相として外側(cè)油殻に包まれた水性増殖培地の內(nèi)側(cè)コアと(b)連続水相としてキャリア液とを含む、W/O/W二重エマルジョン中に含まれ得る。當(dāng)然のことながら、O/W/O液滴は、非生物學(xué)的実體をスクリーニングするのに特に有用であり得ることも理解される。

(界面活性剤) 微小液滴がエマルジョンに含まれる実施形態(tài)では、キャリア液が連続相を構(gòu)成し、そして微小液滴が分散相を構(gòu)成してもよく、そのような実施形態(tài)では、エマルジョンは界面活性剤および必要に応じて補(bǔ)助界面活性剤をさらに含んでもよい。

界面活性剤および/または補(bǔ)助界面活性剤は、分散相と連続相との界面に位置してもよく、微小液滴がW/O/W二重エマルジョンに含まれる場(chǎng)合、界面活性剤および/または補(bǔ)助界面活性剤は、水性コアと油殻との界面、ならびに油殻と外側(cè)の連続相との界面に配置され得る。

広範(fàn)囲の適切な界面活性剤が利用可能であり、そして當(dāng)業(yè)者は選択されたスクリーニングパラメーターに従って適切な界面活性剤(および必要ならば補(bǔ)助界面活性剤)を選択することができる。例えば、適切な界面活性剤は、Bernath et al. (2004) Analytical Biochemistry 325:151-157;Holtze and Weitz (2008) Lab Chip 8(10):1632-1639;およびHoltze et al. (2008) Lab Chip. 8(10):1632-1639に記載される。他の適切な界面活性剤(特にフッ素界面活性剤を含む)は、WO2010/009365およびWO2008/021123(それらの內(nèi)容は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されている。

界面活性剤(1つまたは複數(shù))および/または補(bǔ)助界面活性剤(1つまたは複數(shù))は、単一のW/O型エマルジョンが使用される実施形態(tài)において界面活性剤(1つまたは複數(shù))および/または補(bǔ)助界面活性剤(1つまたは複數(shù))が水性成長(zhǎng)媒體微小液滴と連続(例えば油)相との界面に存在し得るように、W/O界面に組み込まれることが好ましい。同様に、二重W/O/W型エマルジョンが本発明による共カプセル化に使用される場(chǎng)合、界面活性剤(1つまたは複數(shù))および/または補(bǔ)助界面活性剤(1つまたは複數(shù))は、水性コアと不混和性(例えば油)の殻との間の界面、および油殻と連続水相との間の界面の一方または両方に存在し得る。

界面活性剤(1つまたは複數(shù))は、好ましくは生體適合性である。例えば、界面活性剤(1つまたは複數(shù))は、スクリーンに使用される任意の細(xì)胞に対して非毒性であるように選択され得る。選択された界面活性剤(1つまたは複數(shù))はまた、気體に対して良好な溶解度を有し得、これは任意のカプセル化細(xì)胞の増殖および/または生存能力に必要であり得る。

生體適合性は、任意の適切なアッセイによって決定することができ、このようなアッセイは、細(xì)胞レベルでの生體適合性の代用としての役割を果たす、參照の感受性生化學(xué)的アッセイ(例えばインビトロ翻訳)との適合性についての試験に基づくアッセイを含む。例えば、蛍光性基質(zhì)(フルオレセインジ?β?D?ガラクトピラノシド(FDG))を有する酵素β?ガラクトシダーゼをコードするプラスミドDNAのインビトロ翻訳(IVT)が、生體適合性の指標(biāo)として使用され得る。これは、例えば、カプセル化されたDNA、転寫(xiě)および翻訳に関與する分子、ならびに翻訳されたタンパク質(zhì)が液滴界面に吸著せずにタンパク質(zhì)の高次構(gòu)造がなおインタクトである場(chǎng)合に、蛍光産物が形成されるためである。

生體適合性はまた、界面活性剤の存在下でアッセイに使用される細(xì)胞を増殖させ、抗體または生存細(xì)胞染料で細(xì)胞を染色し、そして界面活性剤の非存在下での対照と比較した細(xì)胞集団の全體的な生存率を決定することによって決定され得る。

界面活性剤(1つまたは複數(shù))はまた、微小液滴界面での生體分子の吸著を防止し得る。界面活性剤はまた、個(gè)々の微小液滴(および対応する微小培養(yǎng)物)を単離するように機(jī)能し得る。界面活性剤は、好ましくは、微小液滴を安定化する(すなわちその合體を防止する)。安定化性能は、例えば位相差顕微鏡、光散亂、集束ビーム反射率測(cè)定、遠(yuǎn)心分離および/またはレオロジーによってモニタリングすることができる。

界面活性剤はまた、アッセイシステムの機(jī)能的部分を形成し得、そして、例えば、反応物および/または分析物および/またはアッセイ中に存在する他の部分(放出タグなど)を他の構(gòu)成要素から分離または隔離するように作用し得る。例えば、官能基化界面活性剤の親水性頭部基中のニッケル錯(cuò)體は、表面にヒスチジンタグ付きタンパク質(zhì)を濃縮し得る(例えば、Kreutz et al. (2009) J Am Chem Soc. 131(17):6042-6043を參照のこと)。そのような官能基化界面活性剤は、小分子合成用の觸媒としても作用し得る(例えば、Theberge et al. (2009) Chem. Commun.:6225-6227を參照のこと)。それらは細(xì)胞溶解を引き起こすためにも使用され得る(例えば、Clausell-Tormos et al. (2008) Chem Biol. 15(5):427-37を參照のこと)。したがって、本発明はそのような官能基化界面活性剤の使用を企図する。

(エマルジョン共カプセル化に使用するための油) 不連続相と不混和性である任意の液體が本発明に従って使用するための微小液滴エマルジョンの形成に使用され得ることが理解されるが、この不混和性の流體は、典型的には油である。

好ましくは、水相の生物學(xué)的成分に対して低い溶解度を有する油が選択される。他の好ましい機(jī)能的特性は、気體に対する調(diào)整可能な(例えば、高いまたは低い)溶解度、微小液滴間の分子拡散を阻害する能力、および/または疎水性と疎油性の組み合わせを含む。油は炭化水素油、例えば、軽鉱油、フルオロカーボン油、シリコーン油、またはエステル油であり得る。上記油の2種またはそれ以上の混合物もまた好ましい。

適切な油の例は、WO2010/009365、WO2006/040551、WO2006/040554、WO2004/002627、WO2004/091763、WO2005/021151、WO2006/096571、WO2007/089541、WO2007/081385およびWO2008/063227(これは參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されている。

(微小液滴乳化プロセス) 広範(fàn)囲の異なる乳化方法が當(dāng)業(yè)者に知られており、それらのいずれも本発明の微小液滴を作製するために使用することができる。

多くの乳化技術(shù)は、液滴崩壊を促進(jìn)するためにしばしば亂流を使用して、バルクプロセスにおいて2つの液體を混合することを含む。そのような方法は、ボルテックス、超音波処理、均質(zhì)化またはそれらの組み合わせを含む。

乳化に対するこれらの「トップダウン」アプローチでは、個(gè)々の液滴の形成に対する制御はほとんど利用できず、典型的には広い範(fàn)囲の微小液滴サイズの分布が生じる。代替の「ボトムアップ」アプローチは個(gè)々の液滴のレベルで機(jī)能し、そしてマイクロ流體デバイスの使用を含み得る。例えば、エマルジョンは、T字形接合部で油流と水流とを衝突させることによってマイクロ流體裝置內(nèi)で形成することができ、得られる微小液滴は各流れの流速に応じて大きさが変化する。

本発明に従って使用するための微小液滴を製造するための好ましい方法は、フローフォーカシングを含む(例えば、Anna et al. (2003) Appl. Phys. Lett. 82(3):364-366に記載されているように)。ここでは、分散相(集束した流體またはコア流體)に隣接するまたはそれを取り囲む連続相流體(集束する流體またはシース流體)は、両方の流體が押し出されるオリフィスの近傍で液滴の破壊を引き起こす。フローフォーカシング裝置は、連続的な集束流體供給源で加圧された圧力チャンバからなる。內(nèi)側(cè)に、1つまたはそれ以上の集束した流體が、圧力チャンバを外部の周?chē)飙h(huán)境と連結(jié)する小さなオリフィスの前に、先端が開(kāi)いている毛細(xì)管供給チューブを通して注入される。集束する流體流は流體メニスカスを尖端に成形し、オリフィスを通ってチャンバを出る定常的なマイクロまたはナノジェットを生じさせる。噴流の大きさは出口オリフィスよりずっと小さい。毛細(xì)管不安定性は定常ジェットを均質(zhì)な液滴または気泡に分解する。

供給管は、2つまたはそれ以上の同心針から構(gòu)成されてもよく、そして異なる不混和性の液體または気體が注入されて化合物滴をもたらし得る。フローフォーカシングは、ジェットが分裂したときに毎秒最大數(shù)百萬(wàn)の液滴の極めて高速で制御された生成を確実とする。

他のマイクロ流體処理技術(shù)がピコインジェクションを含み、この技術(shù)では、試薬が電場(chǎng)を用いて水性液滴に注入される(例えば、Eastburn et al. (2013) Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLoS ONE 8(4):e62961. doi:10.1371/journal.pone.0062961を參照のこと)。微小液滴が、例えば電気融合によって能動(dòng)的に(例えば Tan and Takeuchi (2006) Lab Chip. 6(6):757-63を參照のこと)、または受動(dòng)的に(例えばSimon and Lee (2012) 「Microdroplet Technology」, in Integrated Analytical Systems pp 23-50, 10.1007/978-1-4614-3265-4_2に概説されるように)、融合されて2つの試薬を一緒にすることができる。

全ての場(chǎng)合において、選択された微小液滴形成プロセスの性能は、位相差顕微鏡、光散亂、集束ビーム反射率測(cè)定、遠(yuǎn)心分離および/またはレオロジーによってモニタリングすることができる。

(蛍光活性化液滴ソーティング) 本明細(xì)書(shū)で説明するように、本発明の方法は、スクリーニングアッセイを微量の媒體中に個(gè)別の微小液滴の形態(tài)で區(qū)畫(huà)化することを含むので、ハイスループットスクリーニングに適している。これにより、各微小液滴を別個(gè)の培養(yǎng)容器として扱うことが可能になり、確立された微小流體および/または細(xì)胞選別方法論を用いて多數(shù)の個(gè)々の液體共培養(yǎng)物を迅速にスクリーニングすることが可能になる。

したがって、同時(shí)カプセル化工程に続いて、得られた微小液滴は、十分に確立された蛍光活性化セルソーティング(細(xì)胞選別)(FACS)裝置およびプロトコルを適合させることによって選別することができる。この技術(shù)は、蛍光活性化液滴ソーティング(FADS)と呼ばれており、例えば、Baret et al. (2009) Lab Chip 9:1850-1858に記載されている。蛍光部分を使用することによって検出することができるあらゆる変化をスクリーニングすることができる。

標(biāo)的細(xì)胞はFADSを可能にするために蛍光標(biāo)識(shí)することができる。種々の蛍光タンパク質(zhì)をこの目的のための標(biāo)識(shí)として使用することができ、蛍光タンパク質(zhì)としては、例えば、オワンクラゲ(Aequorea victoria)の野生型緑色蛍光タンパク質(zhì)(GFP)(Chalfie et al. 1994, Science 263:802-805)、および修飾GFP(Heim et al. 1995, Nature 373:663-4;PCT公開(kāi)WO96/23810)が挙げられる。あるいは、DNA2.0のIP-Free(c)合成非Aequorea蛍光タンパク質(zhì)が、異なる蛍光タンパク質(zhì)コード配列の供給源として使用でき、これは、PCRによって増幅することができるかまたは隣接するBsaI制限部位を使用して容易に切り出して選択した任意の他の発現(xiàn)ベクターにクローニングすることができる。

このタイプのレポーター遺伝子の転寫(xiě)および翻訳は、細(xì)胞內(nèi)の蛍光タンパク質(zhì)の蓄積をもたらし、それによりそれらはFADSに適するようになる。

あるいは、細(xì)胞內(nèi)で特定のレベルおよび條件で蛍光を発する広範(fàn)囲の色素が利用可能である。例としては、Molecularプローブ(Thermo Scientific)から入手可能なものが挙げられる。あるいは、細(xì)胞成分は、抗體を用いて検出することができ、これらは、市販のキットを使用して、種々のフルオロフォアで染色することができる。同様に、DNA配列は、フルオロフォアで標(biāo)識(shí)して細(xì)胞に導(dǎo)入することができ、そして細(xì)胞中の相補(bǔ)的DNAおよびRNA配列へのハイブリダイゼーションによって付著し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)と呼ばれるプロセスにおける遺伝子発現(xiàn)の直接検出を可能とする。

現(xiàn)在のハイコンテントスクリーニングにおいて適用することができる任意の標(biāo)識(shí)化処理が、FADSに適用することができ、対照に対する蛍光シグナルの変化として検出され得る。

(タグテンプレート化合成) コード化タグは、DNAテンプレート化技術(shù)を利用することによってコード化化學(xué)構(gòu)造の合成を指向させるテンプレートとして機(jī)能し得る。適切な技術(shù)は當(dāng)業(yè)者に知られており、そして例えば Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47:12747-12753;Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12):5707-5717;およびMullard (2016) Nature 530:367-369(それらの開(kāi)示は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されている。したがって、任意の適切なテンプレート化技術(shù)を使用し得、この技術(shù)としては、David Liu教授およびその共同研究者(Harvard University、米國(guó))によって記載され、後にEnsemble Discovery(Cambridge、MA、米國(guó))によって商品化されているDNAテンプレート化合成(DTS)に基づくものが挙げられる。ここでは、化學(xué)反応は、ワトソン?クリック塩基対合を介してDNA結(jié)合試薬を近接させることによって促進(jìn)される。

Pehr Harbury教授とその共同研究者(Stanford University、米國(guó))によって開(kāi)発されたDNAルーティングアプローチ、およびVipergen(コペンハーゲン、デンマーク)によって開(kāi)発されたYoctoReactorシステムも適している。後者のアプローチでは、三方DNAヘアピンループ接合が、コアアクセプター部位上に適當(dāng)なドナー化學(xué)的部分を転移させることによって、ライブラリ合成を補(bǔ)助する(WO2006/048025を參照のこと。この開(kāi)示は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)。代替の構(gòu)造配置もまた利用可能であり、例えば、四方DNAホリデイジャンクションおよび六方晶構(gòu)造(Lundberg et al. (2008) Nucleic acids symposium (52):683-684に記載のような)、およびRothemund (2006) Nature 440:297-302によって概説される「スキャフォールドDNA折り紙」技術(shù)によって作出された複雑な形狀およびパターンがある。

近接トリガー反応は、例えば、クリックケミストリー(本明細(xì)書(shū)で定義されるような)の使用により促進(jìn)され得る。

(タグ配列決定) 任意の適切な配列決定技術(shù)を使用することができ、これは、サンガー配列決定を含むが、次世代配列決定(NGS)と呼ばれる配列決定の方法およびプラットフォーム(ハイスループット配列決定としても知られる)が好ましい。本発明の方法に使用するのに適した多くの市販のNGS配列決定プラットフォームがある。合成による配列決定(SBS)ベースの配列決定プラットフォームが特に適している。Illumina^TMシステム(數(shù)百萬(wàn)の比較的短い配列読み取り(54、75または100bp)を生じる)が特に好ましい。

他の適切な技術(shù)は、Illumina^TMにより販売されているものを含む、可逆的ダイターミネーターに基づく方法を含む。ここでは、DNA分子が最初にスライド上のプライマーに付著され、そして局所クローンコロニーが形成されるように増幅される(ブリッジ増幅)。4種類のddNTPが添加され、そして取り込まれなかったヌクレオチドが洗い流される。パイロシーケンシングとは異なり、DNAは一度に1ヌクレオチドのみ伸長(zhǎng)され得る。カメラが蛍光標(biāo)識(shí)されたヌクレオチドの畫(huà)像を撮り、次いで末端の3’ブロッカーと共に染料をDNAから化學(xué)的に除去し、次のサイクルを可能にする。

短い配列読み取りが可能な他のシステムには、SOLiD^TMおよびIon Torrent技術(shù)(どちらも Thermo Fisher Scientific Corporationによって販売されている)が含まれる。SOLiD^TM技術(shù)はライゲーションによる配列決定を採(cǎi)用している。ここでは、固定長(zhǎng)の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールが、配列決定された位置に従って標(biāo)識(shí)される。オリゴヌクレオチドはアニールされそしてライゲートされる。配列を一致させるためのDNAリガーゼによる優(yōu)先的ライゲーションは、その位置でヌクレオチドの情報(bào)となるシグナルをもたらす。配列決定の前に、DNAはエマルジョンPCRによって増幅される。得られたビーズは、それぞれ同じDNA分子のコピーのみを含み、ガラススライド上に置かれる。その結(jié)果、Illuminaのシーケンシングに匹敵する量と長(zhǎng)さの配列が得られる。

Ion Torrent Systems Inc.は、標(biāo)準(zhǔn)的な配列決定化學(xué)を使用することを基本としたシステムを開(kāi)発したが、新しい半導(dǎo)體ベースの検出システムを伴う。この配列決定方法は、他の配列決定システムで使用されている光學(xué)的方法とは対照的に、DNAの重合中に放出される水素イオンの検出に基づいている。配列決定されるべきテンプレートDNA鎖を含むマイクロウェルは、単一の種類のヌクレオチドであふれている。導(dǎo)入されたヌクレオチドが主要なテンプレートヌクレオチドと相補(bǔ)的である場(chǎng)合、それは成長(zhǎng)している相補(bǔ)鎖に組み込まれる。これは水素イオンの放出を引き起こし、それが過(guò)敏性イオンセンサーを誘発し、それは反応が起こったことを示す。ホモポリマー反復(fù)がテンプレート配列に存在する場(chǎng)合、複數(shù)のヌクレオチドが単一のサイクルに組み込まれる。これは、対応する數(shù)の放出される水素および比例して高くなる電子信號(hào)をもたらす。

核酸または他の高分子がナノスケールの細(xì)孔を通過(guò)し、特定のイオン電流の変化または電気信號(hào)が生じる場(chǎng)合、Oxford Nanopore Technologiesによって使用されるもののような方法または類似の方法がそれを同定するために用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドの個(gè)々の塩基は、連続した塩基がオリゴヌクレオチドの一部としてまたは連続した切斷工程後に単一のヌクレオチドとしてイオン孔を通過(guò)するかが同定され得る。

(切斷可能なリンカー) 以下の條件で、任意の切斷可能なリンカーが、化學(xué)構(gòu)造およびそのコード化タグを連結(jié)するために使用され得る:(a)その連結(jié)は、タグのコード情報(bào)を無(wú)傷のままとするように破壊されることができ、かつ(b)コード化された化學(xué)構(gòu)造は、スクリーンにおけるその活性がリンカー切斷後に殘る「痕」によって損なわれないように、それが完全にまたは実質(zhì)的にリンカー殘基を含まない形態(tài)で放出される。?OHおよび/または?SH基のようないくつかのリンカー「痕」は許容され得ることが理解される。切斷の方法は、アッセイシステムと適合性があることが好ましい。

広範(fàn)囲の適切な切斷可能なリンカーが當(dāng)業(yè)者に知られており、そして適切な例は、Leriche et al. (2012) Bioorganic & Medicinal Chemistry 20 (2):571-582によって記載されている。したがって適切なリンカーは以下を含む:酵素的に切斷可能なリンカー;求核性/塩基感受性リンカー;還元感受性リンカー;光切斷可能なリンカー;求電子性/酸感受性リンカー;金屬補(bǔ)助切斷感受性リンカー;酸化感受性リンカー;および前出の2つまたはそれ以上の組合せから選択されるリンカー。

酵素切斷可能なリンカーは、例えば、以下に記載されている:WO2017/089894;WO2016/146638;US2010273843;WO2005/112919;WO2017/089894;de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42:5277;de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43:3093 (2000);de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66:8815;WO02/083180;Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24:479;Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5):424-429;Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5):479-480およびDubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8:3347。これらは、以下から選択される酵素によって切斷可能なリンカーを含む:β?グルクロニダーゼ、リソソーム酵素、TEV、トリプシン、トロンビン、カテプシンB、BおよびK、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ配列、リン酸ジエステル、リン脂質(zhì)、エステルおよびβ?ガラクトース。求核性/塩基感受性リンカーは、以下を含む:ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、2?N?アクリルニトロベンゼンスルホンアミド、α?チオフェニルエステル、不飽和ビニルスルフィド、スルホンアミド、マロンジアルデヒドインドール誘導(dǎo)體、レブリノイルエステル、ヒドラジン、アシルヒドラゾン、アルキルチオエステル。還元切斷可能リンカーは、以下を含む:ジスルフィド架橋およびアゾ化合物。放射線切斷可能リンカーは、以下を含む:2?ニトロベンジル誘導(dǎo)體、フェナシルエステル、8?キノリニルベンゼンスルホネート、クマリン、ホスホトリエステル、ビス?アリールヒドラゾン、ビマンビチオプロピオン酸誘導(dǎo)體。求電子性/酸切斷可能リンカーは、以下を含む:パラメトキシベンジル誘導(dǎo)體、tert-ブチルカルバメートアナログ、ジアルキルまたはジアリールジアルコキシシラン、オルトエステル、アセタール、アコニチル、ヒドラジン、β?チオプロピオネート、ホスホロアミダイト、イミン、トリチル、ビニルエーテル、ポリケタール、アルキル2?(ジフェニルホスフィノ)安息香酸誘導(dǎo)體。有機(jī)金屬/金屬觸媒切斷可能リンカーは、以下を含む:アリルエステル、8?ヒドロキシキノリンエステルおよびピコリン酸エステル。酸化により切斷可能なリンカーは、以下を含む:ビシナルジオールおよびセレン化合物。

特定の実施形態(tài)において、切斷可能なリンカーは、共有結(jié)合および非共有結(jié)合(例えば、核酸ハイブリダイゼーションから生じる水素結(jié)合)の組み合わせを含む。

切斷可能な(例えば、酵素で切斷可能な)ペプチドリンカーは、1アミノ酸、またはアミノ酸のジペプチドもしくはトリペプチド配列からなるペプチド部分を含み得る。アミノ酸は、天然および非天然アミノ酸から選択され得、そして各場(chǎng)合において、側(cè)鎖の炭素原子がDまたはL(RまたはS)のいずれかの配置であり得る。例示的なアミノ酸は、以下を含む:アラニン、2?アミノ?2?シクロヘキシル酢酸、2?アミノ?2?フェニル酢酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ?アミノ酪酸、β,β?ジメチルγ?アミノ酪酸、α,α?ジメチルγ?アミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリン(Cit)。適當(dāng)なアミノ酸はまた、側(cè)鎖の反応性官能基が保護(hù)されている上記アミノ酸の保護(hù)形態(tài)を含む。そのような保護(hù)アミノ酸は、アセチル、ホルミル、トリフェニルメチル(トリチル)、およびモノメトキシトリチル(MMT)で保護(hù)されたリジンを含む。他の保護(hù)されたアミノ酸ユニットは、トシルまたはニトロ基で保護(hù)されたアルギニンおよびアセチルまたはホルミル基で保護(hù)されたオルニチンを含む。

(自己犠牲リンカー) 本発明における切斷可能なリンカーとしての使用に特に適しているのは、以下を含む自己犠牲リンカーである:(a)切斷部分;および(b)自己犠牲部分(「SIM」)。

そのようなリンカーは、図8(遊離化學(xué)構(gòu)造を放出させる切斷後のSIMの自発的除去を示す)に模式的に示されるように使用され得る。

以下を含む自己犠牲リンカーが、特に適している:(a)酵素的切斷部分;および(b)SIM。そのような実施形態(tài)では、酵素的切斷部分は、(プロテアーゼによる切斷可能な)ペプチド配列または非ペプチドの酵素的に切斷可能な基であり得、例えば、β?グルクロニダーゼにより切斷可能な親水性糖基を取り込むグルクロニド部分(McCombs and Owen (2015) Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry The AAPS Journal 17(2):339-351に説明するような)であり、以下に示す:

適切なβ?グルクロニド系リンカーは、WO2007/011968、US20170189542およびWO2017/089894(その內(nèi)容は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)に記載されている。したがって、そのようなリンカーは、以下の式を有し得る:

(式中、R₃は水素またはカルボキシル保護(hù)基であり、各R₄は獨(dú)立して水素またはヒドロキシル保護(hù)基である)。

本発明における使用のための自己犠牲リンカーのSIMは、以下から選択され得る:置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換および非置換のアリールまたは置換および非置換のヘテロアリール。したがって適切なSIMは、p?アミノベンジルアルコール(PAB)ユニットおよびPAB基と電子的に類似している芳香族化合物(例えば、Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237によって記載されている2?アミノイミダゾール?5?メタノール誘導(dǎo)體)およびオルト?またはパラ?アミノベンジルアセタールを含む。

他の適切なSIMは、アミド結(jié)合加水分解の際に環(huán)化を受けるもの、例えばRodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223によって記載されている置換および非置換の4?アミノ酪酸アミドである。さらに他の適切なSIMは、適切に置換されたビシクロ[2.2.1]およびビシクロ[2.2.2]環(huán)系(Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815によって記載されているような)および種々の2?アミノフェニルプロピオン酸アミド(例えば、Amsberry et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867を參照のこと)を含む。

切斷部分としてペプチドを含む自己犠牲ペプチドリンカーが、特に適している。図9および図10は、そのようなリンカーを用いたコード化化學(xué)ライブラリの構(gòu)築および使用を示す。ここで、切斷可能なペプチドは、ジペプチドのバリン?シトルリンであり、そしてSIMは、p?アミノベンジルアルコール(PAB)である。そのような実施形態(tài)では、アミド結(jié)合PABの酵素切斷は、二酸化炭素の1,6?脫離および遊離化學(xué)構(gòu)造の同時(shí)放出を引き起こす。図9にまた示されるように、コード化タグおよび化學(xué)構(gòu)造(1つまたは複數(shù))はビーズを介して連結(jié)され得、そして単一のビーズに複數(shù)(n>1)の化學(xué)構(gòu)造を裝填することができる(例えば、コード化タグ(1つまたは複數(shù))と連結(jié)される化學(xué)構(gòu)造との比が、1:10?1:1000である)。そのような実施形態(tài)では、ペプチドリンカーが比較的小さいサイズであることによって拡散速度の向上およびより高いビーズへの裝填が可能となり、化學(xué)構(gòu)造は官能基化のために単一のアミンを必要とするのみである。

本発明の自己犠牲リンカーとして使用するのに適した切斷部分およびSIMの非限定的な例は、例えば、以下に記載されている:WO2017/089894;WO2016/146638;US2010273843;WO2005/112919;WO2017/089894;de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42:5277;de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43:3093 (2000);de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66:8815;WO02/083180;Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24:479;Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5):424-429;Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5):479-480およびDubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8:3347(その內(nèi)容は參照により本明細(xì)書(shū)に援用される)。

(微粒子) 微粒子は、固體またはゲルから形成され得る。適切なゲルとしては、ポリマーゲル、例えば、ポリサッカライドまたはポリペプチドゲル(これらは、例えば、加熱、冷卻またはpH調(diào)整によって液體からゲルに固化することができる)が挙げられる。適切なゲルとしては、ヒドロゲルが挙げられ、これはアルギン酸塩、ゼラチンおよびアガロースゲルを含む。他の適切な微粒子材料としては、シリコン、ガラス、金屬およびセラミックのような無(wú)機(jī)材料が挙げられる。他の適切な材料としては、以下が挙げられる:プラスチック(例えば、ポリ(塩化ビニル、シクロオレフィンコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4?メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロンおよびポリビニルブチレート)。

(標(biāo)的細(xì)胞) 本発明のアッセイシステムは標(biāo)的細(xì)胞を含み得る。任意の適切な標(biāo)的細(xì)胞が使用され得、原核細(xì)胞および真核細(xì)胞を含む。

例えば、標(biāo)的細(xì)胞は古細(xì)菌であり得、例えば(a)クレン古細(xì)菌(Crenarchaeota);(b)ユーリ古細(xì)菌(Euryarchaeota);(c)コル古細(xì)菌(Korarchaeota);(d)ナノ古細(xì)菌(Nanoarchaeota)および(e)タウム古細(xì)菌(Thaumarchaeota)の門(mén)から選択され、例えばハロフェラックス?ウォルカニイ(Haloferax volcanii)またはスルフォロブス屬種(Sulfolobus spp.)である。

他の実施形態(tài)では、標(biāo)的細(xì)胞は細(xì)菌、例えば病原性細(xì)菌であり得る。このような場(chǎng)合において、細(xì)菌は、グラム陽(yáng)性細(xì)菌(例えば、エンテロコッカス?フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス?フェシウム(Enterococcus faecium)およびスタフィロコッカス?アウレウス(Staphylococcus aureus)から選択される)、グラム陰性細(xì)菌(例えば、クレブシエラ?ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、アシネトバクター?バウマニ(Acinetobacter baumanii)およびエシェリキア?コリ(Escherichia coli)、エシェリキア?コリST131株(E. coli ST131 strains)、シュードモナス?エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター?クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター?アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)およびナイセリア?ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)から選択される)、または不確定なグラム反応を示す細(xì)菌であり得る。

他の実施形態(tài)では、標(biāo)的細(xì)胞は、真核細(xì)胞であり得、例えば、以下から選択される:(a)真菌細(xì)胞;(b)哺乳類細(xì)胞;(c)高等植物細(xì)胞;(d)原蟲(chóng)細(xì)胞;(e)蠕蟲(chóng)細(xì)胞;(f)藻類細(xì)胞;または(h)無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞。そのような実施形態(tài)では、標(biāo)的細(xì)胞は、癌細(xì)胞、例えば、ヒト癌細(xì)胞、筋細(xì)胞、ヒト神経細(xì)胞および疾患関連表現(xiàn)型を示す生きているヒト患者に由來(lái)する他の細(xì)胞であり得る。

細(xì)胞が真核細(xì)胞(例えば、ヒト細(xì)胞)である場(chǎng)合、細(xì)胞は、以下から選択され得る:全能性細(xì)胞、多能性細(xì)胞、人工多能性細(xì)胞、多分化能細(xì)胞、オリゴ能細(xì)胞、幹細(xì)胞、胚性幹(ES)細(xì)胞、體細(xì)胞、生殖細(xì)胞系細(xì)胞、最終分化型細(xì)胞、非分裂(有糸分裂後)細(xì)胞、有糸分裂細(xì)胞、初代細(xì)胞、細(xì)胞株由來(lái)細(xì)胞および腫瘍細(xì)胞。

細(xì)胞は、好ましくは、単離されており(すなわち、その天然の細(xì)胞/組織環(huán)境に存在していない)、かつ/または代謝的に活性である(例えば、細(xì)胞生存率および/または活性を維持するかつ/または細(xì)胞成長(zhǎng)または増殖を支持するための培養(yǎng)培地または輸送培地とともにアッセイシステムに存在している)。

適切な真核細(xì)胞は、生物から単離され得、例えば、以下から選択される生物における:後生動(dòng)物、真菌(例えば、酵母)、哺乳動(dòng)物、非哺乳動(dòng)物、植物、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)、藻類、昆蟲(chóng)(例えば、ハエ)、魚(yú)(例えば、ゼブラフィッシュ)、両生類(例えばカエル)、鳥(niǎo)類、無(wú)脊椎動(dòng)物および脊椎動(dòng)物。

適切な真核細(xì)胞はまた、以下から選択される非ヒト動(dòng)物から単離され得る:哺乳動(dòng)物、げっ歯類、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラット、マウス、非ヒト霊長(zhǎng)類およびハムスター。他の実施形態(tài)では、細(xì)胞は、非ヒト疾患モデル、または異種遺伝子(例えば治療産物をコードする異種遺伝子)を発現(xiàn)するトランスジェニック非ヒト動(dòng)物から単離され得る。

(標(biāo)的細(xì)胞としての細(xì)菌) 本発明に従って使用するための標(biāo)的細(xì)胞は、細(xì)菌細(xì)胞であり得る。そのような実施形態(tài)では、細(xì)菌は、以下から選択され得る:(a)グラム陽(yáng)性細(xì)菌、グラム陰性細(xì)菌および/またはグラム可変細(xì)菌;(b)芽胞形成細(xì)菌;(c)非芽胞形成細(xì)菌;(d)糸狀菌;(e)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌;(f)偏性好気性菌;(g)偏性嫌気性菌;(h)通性嫌気性菌;(i)微好気性細(xì)菌および/または(f)日和見(jiàn)性細(xì)菌性病原體。

特定の実施形態(tài)では、本発明による使用のための標(biāo)的細(xì)胞は、以下の屬の細(xì)菌から選択され得る:アシネトバクター屬(Acinetobacter)(例えば、アシネトバクター?バウマニ(A. baumannii));エロモナス屬(Aeromonas)(例えば、エロモナス?ハイドロフィラ(A. hydrophila));バチルス屬(Bacillus)(例えば、バチルス?アントラシス(B. anthracis));バクテロイデス屬(Bacteroides)(例えば、バクテロイデス?フラギリス(B. fragilis));ボルデテラ屬(Bordetella)(例えば、ボルデテラ?パーツシス(B. pertussis));ボレリア屬(Borrelia)(例えば、ボレリア?ブルグドルフェリ(B. burgdorferi));ブルセラ屬(Brucella)(例えば、ブルセラ?アボルツス(B. abortus)、ブルセラ?カニス(B. canis)、ブルセラ?メリテンシス(B. melitensis)およびブルセラ?スイス(B. suis));バークホルデリア屬(Burkholderia)(例えば、バークホルデリア?セパシア?コンプレックス(B. cepacia complex));カンピロバクター屬(Campylobacter)(例えば、カンピロバクター?ジェジュニ(C. jejuni));クラミジア屬(Chlamydia)(例えば、クラミジア?トラコマチス(C. trachomatis)、クラミジア?スイス(C. suis)およびクラミジア?ムリダルム(C. muridarum));クラミドフィラ屬(Chlamydophila)(例えば、(例えば、クラミドフィラ?ニューモニエ(C. pneumoniae)、クラミドフィラ?ペコルム(C. pecorum)、クラミドフィラ?シッタシ(C. psittaci)、クラミドフィラ?アボルタス(C. abortus)、クラミドフィラ?フェリス(C. felis)およびクラミドフィラ?カビエ(C. caviae));シトロバクター屬(Citrobacter)(例えば、シトロバクター?フレンディ(C. freundii));クロストリジウム屬(Clostridium)(例えば、クロストリジウム?ボツリヌム(C. botulinum)、クロストリジウム?デフィシル(C. difficile)、クロストリジウム?パーフリンジェンス(C. perfringens)およびクロストリジウム?テタニ(C. tetani));コリネバクテリウム屬(Corynebacterium)(例えば、コリネバクテリウム?ジフテリア(C. diphteriae)およびコリネバクテリウム?グルタミカム(C. glutamicum));エンテロバクター屬(Enterobacter)(例えば、エンテロバクター?クロアカ(E. cloacae)およびエンテロバクター?アエロゲネス(E. aerogenes));エンテロコッカス屬(Enterococcus)(例えば、エンテロコッカス?フェカーリス(E. faecalis)およびエンテロコッカス?フェシウム(E. faecium));エシェリキア屬(Escherichia)(例えば、エシェリキア?コリ(E. coli));フラボバクテリウム屬(Flavobacterium);フランシセラ屬(Francisella)(例えば、フランシセラ?ツラレンシス(F. tularensis));フソバクテリウム屬(Fusobacterium)(例えば、フソバクテリウム?ネクロフォルム(F. necrophorum));ヘモフィルス屬(Haemophilus)(例えば、ヘモフィルス?ソムナス(H. somnus)、ヘモフィルス?インフルエンザ(H. influenzae)およびヘモフィルス?パラインフルエンザ(H. parainfluenzae));ヘリコバクター屬(Helicobacter)(例えば、ヘリコバクター?ピロリ(H. pylori));クレブシエラ屬(Klebsiella)(例えば、クレブシエラ?オキシトカ(K. oxytoca)およびクレブシエラ?ニューモニエ(K. pneumoniae))、レジオネラ屬(Legionella)(例えば、レジオネラ?ニューモフィラ(L. pneumophila));レプトスピラ屬(Leptospira)(例えば、レプトスピラ?インテロガンス(L. interrogans));リステリア屬(Listeria)(例えば、リステリア?モノサイトゲネス(L. monocytogenes));モラクセラ屬(Moraxella)(例えば、モラクセラ?カタラーリス(M. catarrhalis));モルガネラ屬(Morganella)(例えば、モルガネラ?モルガニイ(M. morganii));マイコバクテリウム屬(Mycobacterium)(例えば、マイコバクテリウム?レプラエ(M. leprae)およびマイコバクテリウム?ツベルクロシス(M. tuberculosis));マイコプラズマ屬(Mycoplasma)(例えば、マイコプラズマ?ニューモニエ(M. pneumoniae));ナイセリア屬(Neisseria)(例えば、ナイセリア?ゴノレア(N. gonorrhoeae)およびナイセリア?メニンジティディス(N. meningitidis));パスツレラ屬(Pasteurella)(例えば、パスツレラ?ムトルシダ(P. multocida));ペプトストレプトコッカス屬(Peptostreptococcus);プレボテーラ屬(Prevotella);プロテウス屬(Proteus)(例えば、プロテウス?ミラビリス(P. mirabilis)およびプロテウス?ブルガリス(P. vulgaris))、シュードモナス屬(Pseudomonas)(例えば、シュードモナス?エルギノーサ(P. aeruginosa));リケッチア屬(Rickettsia)(例えば、リケッチア?リケッチ(R. rickettsii));サルモネラ屬(Salmonella)(例えば、血清型チフス菌および非チフス型(serotypes . TyphiおよびTyphimurium));セラチア屬(Serratia)(例えば、セラチア?マルセッセンス(S. marcesens));シゲラ屬(Shigella)(例えば、シゲラ?フレクスナリア(S. flexnaria)、シゲラ?ディセンテリエ(S. dysenteriae)およびシゲラ?ソンネ(S. sonnei));スタフィロコッカス屬(Staphylococcus)(例えば、スタフィロコッカス?アウレウス(S. aureus)、スタフィロコッカス?ヘモリティカス(S. haemolyticus)、スタフィロコッカス?インターメディウス(S. intermedius)、スタフィロコッカス?エピデルミディス(S. epidermidis)およびスタフィロコッカス?サプロフィティカス(S. saprophyticus));ステノトロホモナス屬(Stenotrophomonas)(例えば、ステノトロホモナス?マルトフィリア(S.maltophila));ストレプトコッカス屬(Streptococcus)(例えば、ストレプトコッカス?アガラクティエ(S. agalactiae)、ストレプトコッカス?ミュータンス(S. mutans)、ストレプトコッカス?ニューモニエ(S. pneumoniae)およびストレプトコッカス?ピオゲネス(S. pyogenes);トレポネーマ屬(Treponema)(例えば、トレポネーマ?パリドム(T. pallidum);ビブリオ屬(Vibrio)(例えば、ビブリオ?コレラ(V. cholerae))ならびにエルシニア屬(Yersinia)(例えば、エルシニア?ペスティス(Y. pestis))。

本発明に従って使用するための標(biāo)的細(xì)胞は、高G+Cグラム陽(yáng)性細(xì)菌から、および低G+Cグラム陽(yáng)性細(xì)菌から選択することができる。

(標(biāo)的細(xì)胞としての病原菌) ヒトまたは動(dòng)物の細(xì)菌性病原體としては、以下のような細(xì)菌が挙げられる:レジオネラ屬種(Legionella spp.)、リステリア屬種(Listeria spp.)、シュードモナス屬種(Pseudomonas spp.)、サルモネラ屬種(Salmonella spp.)、クレブシエラ屬種(Klebsiella spp.)、ハフニア屬種(Hafnia spp)、ヘモフィルス屬種(Haemophilus spp.)、プロテウス屬種(Proteus spp.)、セラチア屬種(Serratia spp.)、シゲラ屬種(Shigella spp.)、ビブリオ屬種(Vibrio spp.)、バチルス屬種(Bacillus spp.)、カンピロバクター屬種(Campylobacter spp.)、エルシニア屬種(Yersinia spp.)、クロストリジウム屬種(Clostridium spp.)、エンテロコッカス屬種(Enterococcus spp.)、ナイセリア屬種(Neisseria spp.)、ストレプトコッカス屬種(Streptococcus spp.)、スタフィロコッカス屬種(Staphylococcus spp.)、マイコバクテリウム屬種(Mycobacterium spp.)、エンテロバクター屬種(Enterobacter spp.)。

(標(biāo)的細(xì)胞としての真菌) 本発明に従って使用するための標(biāo)的細(xì)胞は真菌細(xì)胞であり得る。これらとしては、酵母(例えば、カンジダ(Candida)種(カンジダ?アルビカンス(C. albicans)、カンジダ?クルセイ(C krusei)およびカンジダ?トロピカリス(C tropicalis)を含む)、ならびに糸狀菌(アスペルギルス屬種(Aspergillus spp.)およびペニシリウム屬種(Penicillium spp.)など)、および皮膚糸狀菌(白癬菌屬種(Trichophyton spp.)など)が挙げられる。

(標(biāo)的細(xì)胞としての植物病原體) 本発明に従って使用するための標(biāo)的細(xì)胞は、植物病原體であり得、例えば、シュードモナス屬種(Pseudomonas spp.)、キシレラ屬種(Xylella spp.)、ラルストニア屬種(Ralstonia spp.)、キサントモナス屬種(Xanthomonas spp.)、エルウィニア屬種(Erwinia spp.)、フザリウム屬種(Fusarium spp.)、フィトフトラ屬種(Phytophthora spp.)、ボトリチス屬種(Botrytis spp.)、レプトスフェリア屬種(Leptosphaeria spp.)、うどんこ病(子嚢菌門(mén)(Ascomycota))および錆(擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota))。

(標(biāo)的としての癌細(xì)胞) 癌細(xì)胞を標(biāo)的細(xì)胞として使用することができる。そのような細(xì)胞は、細(xì)胞株または原発腫瘍に由來(lái)し得る。癌細(xì)胞は哺乳動(dòng)物であり得、そして好ましくはヒトである。特定の実施形態(tài)では、癌細(xì)胞は、黒色腫、肺、腎臓、結(jié)腸、前立腺、卵巣、乳房、中樞神経系および白血病細(xì)胞株からなる群より選択される。

適切な癌細(xì)胞株としては、限定されないが、以下が挙げられる:卵巣癌細(xì)胞株(例えば、CaOV?3、OVCAR?3、ES?2、SK?OV?3、SW626、TOV?21G、TOV?112D、OV?90、MDA?H2774およびPA?1);乳癌細(xì)胞株(例えば、MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?468、MDA?MB?361、MDA?MD?453、BT?474、Hs578T、HCC1008、HCC1954、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1937、HCC2218、Hs574.T、Hs742.T、Hs605.TおよびHs606);肺癌細(xì)胞株(例えば、NCI?H2126、NCI?H1395、NCI?H1437、NCI?H2009、NCI?H1672、NCI?H2171、NCI?H2195、NCI?HI 184、NCI?H209、NCI?H2107およびNCI?H128);皮膚癌細(xì)胞株(例えば、COLO829、TE354.T、Hs925.T、WM?115およびHs688(A).T);骨癌細(xì)胞株(例えば、Hs919.T、Hs821.T、Hs820.T、Hs704.T、Hs707(A).T、Hs735.T、Hs860.T、Hs888.T、Hs889.T、Hs890.TおよびHs709.T);結(jié)腸癌細(xì)胞株(例えば、Caco?2、DLD?1、HCT?116、HT?29およびSW480);および胃癌細(xì)胞株(例えばRF?I)。本発明の方法において有用な癌細(xì)胞株は、任意の便利な供給源(アメリカン?タイプ?カルチャー?コレクション(ATCC)および國(guó)立がん研究所を含む)から得られ得る。

他の癌細(xì)胞株としては、新生細(xì)胞/新生物に罹患している被験體に由來(lái)するものが挙げられ、増殖性障害、良性、前癌および悪性新生物、過(guò)形成、化生、および異形成を含む。増殖性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:癌、癌転移、平滑筋細(xì)胞増殖、全身性硬化癥、肝硬変、成人呼吸窮迫癥候群、特発性心筋癥、紅斑性狼瘡、網(wǎng)膜癥(例えば糖尿病性網(wǎng)膜癥)、心臓過(guò)形成、良性前立腺肥大癥、卵巣嚢胞、肺線維癥、子宮內(nèi)膜癥、線維腫癥、腺腫、リンパ管腫癥、サルコイドーシスおよびデスモイド腫瘍。平滑筋細(xì)胞増殖を伴う新生物は、血管系における細(xì)胞の過(guò)剰増殖(例えば、內(nèi)膜平滑筋細(xì)胞過(guò)形成、再狹窄および血管閉塞(特に生物學(xué)的または機(jī)械的に媒介された血管損傷(例えば、血管形成術(shù))後の狹窄を含む))を含む。さらに、內(nèi)膜平滑筋細(xì)胞過(guò)形成は、血管系以外の平滑筋における過(guò)形成(例えば、膽管、気管支気道の閉塞、および腎間質(zhì)性線維癥患者の腎臓における過(guò)形成)を含み得る。非癌性増殖性障害としては、皮膚中の細(xì)胞の過(guò)剰増殖(乾癬およびその多様な臨床形態(tài)など)、ライター癥候群、毛孔性紅色粃糠疹、ならびに角化障害の過(guò)増殖性変形(日光角化癥、老人性角化癥および強(qiáng)皮癥を含む)も挙げられる。

(標(biāo)的としての細(xì)胞株) 細(xì)胞株に由來(lái)する他の細(xì)胞が、標(biāo)的細(xì)胞として使用され得る。そのような細(xì)胞(好ましくは、ヒトまたは哺乳動(dòng)物であり得る)は、検出可能な細(xì)胞表現(xiàn)型を有する希少疾患に罹患している患者からのものを含む。細(xì)胞は任意の種類のものであり得、血球、免疫細(xì)胞、骨髄細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、神経組織および筋肉細(xì)胞を含むがこれらに限定されない。

本発明の方法において有用な細(xì)胞株は、任意の便利な供給源(アメリカン?タイプ?カルチャー?コレクション(ATCC)と國(guó)立がん研究所を含む)から得られ得る。

細(xì)胞/細(xì)胞株は、例えば、リソソーム蓄積癥、筋ジストロフィー、嚢胞性線維癥、マルファン癥候群、鎌狀赤血球貧血、小人癥、フェニルケトン尿癥、神経線維腫癥、ハンチントン病、骨形成不全癥、サラセミアおよびヘモクロマトーシスに罹患している被験體に由來(lái)し得る。

細(xì)胞/細(xì)胞株は、例えば、他の疾患に罹患している被験體に由來(lái)し得、このような疾患として、以下の疾患および障害が挙げられる:血液、凝固、細(xì)胞増殖および調(diào)節(jié)不全、新生物(癌を含む)、炎癥過(guò)程、免疫系(自己免疫疾患を含む)、代謝、肝臓、腎臓、筋骨格系、神経系、神経および眼の組織。例示的な血液および凝固疾患および障害としては、以下が挙げられる:貧血、裸リンパ球癥候群、出血性障害、H因子欠乏癥、H因子様1因子、V因子、VIII因子、VII因子、X因子、XI因子、XII因子、XIIIA因子、XIIIB因子、ファンコニ貧血、血球貪食性リンパ組織球増加癥、血友病A、血友病B、出血性障害、白血球欠乏癥、鎌狀赤血球貧血およびサラセミア。

免疫関連疾患および障害の例としては、以下が挙げられる:AIDS;自己免疫性リンパ増殖性癥候群;複合免疫不全;HIV?1;HIVの感受性または感染;免疫不全および重癥複合免疫不全(SCID)。本発明に従って治療することができる自己免疫疾患としては、以下が挙げられる:グレーブ病、慢性関節(jié)リウマチ、橋本甲狀腺炎、尋常性白斑、I型(早期発癥)糖尿病、悪性貧血、多発性硬化癥、糸球體腎炎、全身性狼瘡E(SLE、狼瘡)およびシェーグレン癥候群。他の自己免疫疾患としては、以下が挙げられる:強(qiáng)皮癥、乾癬、強(qiáng)直性脊椎炎、重癥筋無(wú)力癥、天皰瘡、多発性筋炎、皮膚炎、ブドウ膜炎、ギランバレー癥候群、クローン病および潰瘍性大腸炎(しばしばまとめて炎癥性腸疾患(IBD)と呼ばれる)。

他の例示的な疾患としては、以下が挙げられる:アミロイドニュロパチー;アミロイドーシス;嚢胞性線維癥;リソソーム蓄積癥;肝腺腫;肝不全;神経障害;肝リパーゼ欠乏癥;肝芽腫、癌または癌腫;骨髄嚢胞性腎臓病;フェニルケトン尿癥;多嚢胞腎;または肝疾患。

例示的な筋骨格系疾患および障害としては、以下が挙げられる:筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌおよびベッカー筋ジストロフィー)、骨粗鬆癥および筋萎縮癥。

例示的な神経系および神経の疾患および障害としては、以下が挙げられる:ALS、アルツハイマー病;自閉癥;脆弱X癥候群、ハンチントン病、パーキンソン病、統(tǒng)合失調(diào)癥、セクレターゼ関連障害、トリヌクレオチドリピート障害、ケネディ病、フリードリヒ失調(diào)癥、マカド?ジョセフ病、脊髄小脳失調(diào)癥、筋緊張性ジストロフィーおよび歯狀尿管淡蒼球萎縮癥(DRPLA)。

例示的な眼疾患としては、以下が挙げられる:加齢黃斑変性癥、角膜混濁およびジストロフィー、先天性扁平角膜、緑內(nèi)障、レーバー先天性黒內(nèi)障および黃斑ジストロフィー。

細(xì)胞/細(xì)胞株は、例えば、少なくとも部分的には、タンパク質(zhì)恒常性の欠乏により仲介される疾患に罹患している被験體に由來(lái)し得、タンパク質(zhì)恒常性の欠乏は、集合性のおよびミスフォールディングのタンパク質(zhì)恒常性疾患を含み、特に神経変性疾患(例えばパーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病)、リソソーム蓄積癥、糖尿病、肺気腫、癌および嚢胞性線維癥を含む。

(標(biāo)的細(xì)胞としての古細(xì)菌) 標(biāo)的細(xì)胞は、古細(xì)菌であり得、例えば、(a)クレン古細(xì)菌(Crenarchaeota);(b)ユーリ古細(xì)菌(Euryarchaeota);(c)コル古細(xì)菌(Korarchaeota);(d)ナノ古細(xì)菌(Nanoarchaeota)および(e)タウム古細(xì)菌(Thaumarchaeota)の門(mén)から選択され、例えばハロフェラックス?ウォルカニイ(Haloferax volcanii)またはスルフォロブス屬種(Sulfolobus spp.)である。

典型的な古細(xì)菌屬としては、以下が挙げられる:アキディアヌス屬(Acidianus)、アキディロブス屬(Acidilobus)、アキドコックス屬(Acidococcus)、アキデュリプロファンダム屬(Aciduliprofundum)、アエロピュルム屬(Aeropyrum)、アルカエオグロブス屬(Archaeoglobus)、バキロビリダエ屬(Bacilloviridae)、カルディスパエラ屬(Caldisphaera)、カルディビルガ屬(Caldivirga)、カルドコックス屬(Caldococus)、ケナルカエウム屬(Cenarchaeum)、デスルフロコックス屬(Desulfurococcus)、フェログロブス屬(Ferroglobus)、フェロプラズマ屬(Ferroplasma)、ゲオーゲンマ屬(Geogemma)、ゲオグロブス屬(Geoglobus)、ハルアダプタトゥス屬(Haladaptaus)、ハルアルカリコックス屬(Halalkalicoccus)、ハロアルカロピリウム屬(Haloalcalophilium)、ハロアルクラ屬(Haloarcula)、ハロバクテリウム屬(Halobacterium)、ハロバクルム屬(Halobaculum)、ハロビフォルマ屬(Halobiforma)、ハロコックス屬(Halococcus)、ハロフェラックス屬(Haloferax)、ハロゲオメトリクム屬(Halogeometricum)、ハロミクロビウム屬(Halomicrobium)、ハロピゲル屬(Halopiger)、ハロプラヌス屬(Haloplanus)、ハロクアドラトゥム屬(Haloquadratum)、ハロラブダス屬(Halorhabdus)、ハロルブルム屬(Halorubrum)、ハロサルキナ屬(Halosarcina)、ハロシンプレクス屬(Halosimplex)、ハロスタグニコラ屬(Halostagnicola)、ハロテッリゲナ屬(Haloterrigena)、ハロウィウァックス屬(Halovivax)、ヒュペルテルムス屬(Hyperthermus)、イグニコックス屬(Ignicoccus)、イグニスパエラ屬(Ignisphaera)、メタッロスパエラ屬(Metallosphaera)、メタニミクロコックス屬(Methanimicrococcus)、メタノバクテリウム屬(Methanobacterium)、メタノブレヴィバクテル屬(Methanobrevibacter)、メタノカルクルス屬(Methanocalculus)、メタノカルドコックス屬(Methantxaldococcus)、メタノケッラ屬(Methanocella)、メタノコッコイデス屬(Methanococcoides)、メタノコックス屬(Methanococcus)、メタノコルプスクルム屬(Methanocorpusculum)、メタノクッレウス屬(Methanoculleus)、メタノフォッリス屬(Methanofollis)、メタノゲニウム屬(Methanogenium)、メタノハロビウム屬(Methanohalobium)、メタノハロピルス屬(Methanohalophilus)、メタノラキニア屬(Methanolacinia)、メタノロブス屬(Methanolobus)、メタノメチュロウォランス屬(Methanomethylovorans)、メタノミクロビウム屬(Methanomicrobium)、メタノプラナス屬(Methanoplanus)、メタノピュルス屬(Methanopyrus)、メタノレグラ屬(Methanoregula)、メタノサエタ屬(Methanosaeta)、メタノサルスム屬(Methanosalsum)、メタノサルキナ屬(Methanosarcina)、メタノスパエラ屬(Methanosphaera)、メタノスピリルム屬(Melthanospirillum)、メタノテルモバクター屬(Methanothermobacter)、メタノテルモコックス屬(Methanothermococcus)、メタノテルムス屬(Methanothermus)、メタノトリクス屬(Methanothrix)、メタノトッリス屬(Methanotorris)、ナノアーケウム屬(Nanoarchaeum)、ナトリアルバ屬(Natrialba)、ナトリネマ屬(Natrinema)、ナトロノバクテリウム屬(Natronobacterium)、ナトロノコックス屬(Natronococcus)、ナトロノリムノビウス屬(Natronolimnobius)、ナトロノモナス屬(Natronomonas)、ナトロノルブルム屬(Natronorubrum)、ニトロソプミルス屬(Nitracopumilus)、パレオコックス屬(Palaeococcus)、ピクロフィルス屬(Picrophilus)、ピュロバクルム屬(Pyrobaculum)、ピュロコックス屬(Pyrococcus)、ピュロディクティウム屬(Pyrodictium)、ピュロロブス屬(Pyrolobus)、スタピュロテルムス屬(Staphylothermus)、ステッテリア屬(Stetteria)、ステュギオロブス屬(Stygiolobus)、スルフォロブス屬(Sulfolobus)、スルフォポボコックス屬(Sulfophobococcus)、スルフリスパエラ屬(Sulfurisphaera)、テルモクラディウム屬(Thermocladium)、テルモコックス屬(Thermococcus)、テルモディスクス屬(Thermodiscus)、テルモフィルム屬(Thermofilum)、テルモプラズマ屬(Thermoplasma)、テルモプロテウス屬(Thermoproteus)、テルモスパエラ屬(Thermosphaera)およびウァルカニサエタ屬(Vulcanisaeta)。

典型的な古細(xì)菌種としては、以下が挙げられる:アエロピュルム?ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アルカエオグロブス?フルギドゥス(Archaeglobus fulgidus)、アルカエオグロブス?フルギドゥス(Archaeoglobus fulgidus)、デスルフロコックス屬種TOK(Desulforcoccus species TOK)、メタノバクテリウム?テルモオートロピクム(Methanobacterium thermoantorophicum)、メタノコックス?ヤンナスキイ(Methanococcus jannaschii)、ピュロバクルム?アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum)、ピュロバクルム?カリディフォンティス(Pyrobaculum calidifontis)、ピュロバクルム?イスランディクム(Pyrobaculum islandicum)、ピュロコックス?アビッシ(Pyrococcus abyssi)、ピュロコックスGB?D(Pyrococcus GB-D)、ピュロコックス?グリコウォランス(Pyrococcus glycovorans)、ピュロコックス?ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、ピュロコックス屬種GE23(Pyrococcus spp. GE23)、ピュロコックス屬種ST700(Pyrococcus spp. ST700)、ピュロコックス?ウォエセイ(Pyrococcus woesii)、ピュロディクティウム?オクルトゥム(Pyrodictium occultum)、スルフォロブス?アキドカルダリウム(Sulfolobus acidocaldarium)、スルフォロブス?ソラタリクス(Sulfolobus solataricus)、スルフォロブス?トコダリイ(Sulfolobus tokodalii)、テルモコックス?アグレガンス(Thermococcus aggregans)、テルモコックス?バロッシイ(Thermococcus barossii)、テルモコックス?ケレル(Thermococcus celer)、テルモコックス?フミコランス(Thermococcus fumicolans)、テルモコックス?ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)、テルモコックス?ヒュドロテルマリス(Thermococcus hydrothermalis)、テルモコックス?オニュリネウスNA1(Thermococcus onnurineus NA1)、テルモコックス?パシフィクス(Thermococcus pacificus)、テルモコックス?プロフンドゥス(Thermococcus profundus)、テルモコックス?シキュリ(Thermococcus siculi)、テルモコックス屬種GE8(Thermococcus spp. GE8)、テルモコックス屬種JDF?3(Thermococcus spp. JDF-3)、テルモコックス屬種TY(Thermococcus spp. TY)、テルモコックス?チオレデュケンス(Thermococcus thioreducens)、テルモコックス?ジリグチ(Thermococcus zilligti)、テルモプラズマ?アキドフィルム(Thermoplasma acidophilum)、テルモプラズマ?ヴォルカニウム(Thermoplasma volcanium)、アキディアヌス?ホスピタリス(Acidianus hospitalis)、アキディロブス?サカロボランス(Acidilobus sacharovorans)、アキドゥリプロフンドゥム?ブーネイ(Aciduliprofundum boonei)、アエロピュルム?ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アルカエオグロブス?フルギドゥス(Archaeoglobus fulgidus)、アルカエオグロブス?プロフンドゥス(Archaeoglobus profundus)、アルカエオグロブス?ベネフィクス(Archaeoglobus veneficus)、カルディビルガ?マキリンゲンシス(Caldivirga maquilingensis)、コラルカエウム?クリプトフィルム(暫定)(Candidatus Korarchaeum cryptofilum)、メタノレグラ?ブーネイ(暫定)(Candidatus Methanoregula boonei)、ニトロソアルカエウム?リムニア(暫定)(Candidatus Nitrosoarchaeum limnia)、ケナルカエウム?シュンビオスム(Cenarchaeum symbiosum)、デスルフロコックス?カンチャトケンシス(Desulfurococcus kamchatkensis)、フェログロブス?プラキドゥス(Ferroglobus placidus)、フェロプラズマ?アシダルマヌス(Ferroplasma acidarmanus)、ハルアルカリコックス?イェトガリ(Halalkalicoccus jeotgali)、ハロアルクラ?ヒスパニカ(Haloarcula hispanica)、ハロアルクラ?マリスモルツイ(Holaoarcula marismortui)、ハロバクテリウム?サリナルム(Halobacterium salinarum)、ハロバクテリウム屬種(Halobacterium species)、ハロビフォルマ?ラシサルシ(Halobiforma lucisalsi)、ハロフェラックス?ウォルカニイ(Haloferax volvanii)、ハロゲオメトリクム?ボリンクエンス(Halogeometricum borinquense)、ハロミクロビウム?ムコハタエイ(Halomicrobium mukohataei)、ハロピリック?アルカセオン種DL31(halophilic archaceon sp. DL31)、ハロピゲル?ザナデュエンシス(Halopiger xanaduensis)、ハロクアドラトゥム?ワルスビイ(Haloquadratum walsbyi)、ハロラブドゥス?ティアマテア(Halorhabdus tiamatea)、ハロラブドゥス?ウタヘンシス(Halorhabdus utahensis)、ハロルブルム?ラクスプロフンディ(Halorubrum lacusprofundi)、ハロテッリゲナ?ツルクメニカ(Haloterrigena turkmenica)、ヒュペルテルムス?ブチリクス(Hyperthermus butylicus)、イグニコックス?ホスピタリス(Igniococcus hospitalis)、イグニスパエラ?アグレガンス(Ignisphaera aggregans)、メタロスパエラ?クプリナ(Metallosphaera cuprina)、メタッロスパエラ?セドゥラ(Metallosphaera sedula)、メタノバクテリウム屬種AL?21(Methanobacterium sp. AL-21)、メタノバクテリウム屬種SWAN?1(Methanobacterium sp. SWAN-1)、メタノバクテリウム?テルモオートロピクム(Methanobacterium thermoautrophicum)、メタノブレヴィバクテル?ルミナンティクム(Methanobrevibacter ruminantium)、メタノブレヴィバクテル?スミティ(Methanobrevibacter smithii)、メタノカルドコックス?フェルヴェンス(Methanocaldococcus fervens)、メタノカルドコックス?インフェルヌス(Methanocaldococcus infernus)、メタノカルドコックス?ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノカルドコックス屬種FS406?22(Methanocaldococcus sp. FS406-22)、メタノカルドコックス?ヴルカニウス(Methanocaldococcus vulcanius)、メタノケッラ?コンラディ(Methanocella conradii)、メタノケッラ?パルディコラ(Methanocella paludicola)、メタノケッラ屬種Rice Cluster I(RC-I)(Methanocella sp. Rice Cluster I (RC-I))、メタノコッコイデス?ブルトニイ(Methanococcoides burtonii)、メタノコックス?アエオリクス(Methanococcus aeolicus)、メタノコックス?マリパルディス(Methanococcus maripaludis)、メタノコックス?ヴァニエリ(Methanococcus vannielii)、メタノコックス?ヴォルタエ(Methanococcus voltae)、メタノコルプスクルム?ラブレアントゥム(Methanocorpusculum labreantum)、メタノクッレウス?マリスニグリ(Methanoculleus marisnigri)、メタノハロビウム?エヴェスティガトゥム(Methanohalobium evestigatum)、メタノハロピルス?マヒイ(Methanohalophilus mahii)、メタノプラナス?ペトロレアリウス(Methanoplanus petrolearius)、メタノピュルス?カンドレリ(Methanopyrus kandleri)、メタノサエタ?コンキリイ(Methanosaeta concilii)、メタノサエタ?ハルンディナケア(Methanosaeta harundinacea)、メタノサエタ?テルモピラ(Methanosaeta thermophila)、メタノサルスム?チリナエ(Methanosalsum zhilinae)、メタノサルキナ?アケチヴォランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルキナ?バルケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルキナ?マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノスパエラ?スタドトマナエ(Methanosphaera stadtmanae)、メタノスパエラ?パルストリス(Methanosphaerula palustris)、メタノスピリルム?フンガテイ(Methanospiriullum hungatei)、メタノテルモバクター?マルブルゲンシス(Mathanothermobacter marburgensis)、メタノテルモコックス?オキナウェンシス(Methanothermococcus okinawensis)、メタノテルムス?フェルヴィドゥス(Methanothermus fervidus)、メタノトッリス?イグネウス(Methanotorris igneus)、ナノアーケウム?エキタンス(Nanoarchaeum equitans)、ナトリアルバ?アシアチカ(Natrialba asiatica)、ナトリアルバ?マガディ(Natrialba magadii)、ナトロノモナス?パラオニス(Natronomonas pharaonis)、ニトロソプミルス?マリティムス(Nitrosopumilus maritimus)、ピクロフィルス?トリドゥス(Picrophilus torridus)、ピュロバクルム?アエロピルム(Pyrobaculum aerophilum)、ピュロバクルム?アルセナティクム(Pyrobaculum arsenaticum)、ピュロバクルム?カリディフォンティス(Pyrobaculum calidifontis)、ピュロバクルム?イスランディクム(Pyrobaculum islandicum)、ピュロバクルム屬種1860(Pyrobaculum sp. 1860)、ピュロコックス?アビッシ(Pyrococcus abyssi)、ピュロコックス?フリオスス(Pyrococcus furiosus)、ピュロコックス?ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、ピュロコックス屬種NA42(Pyrococcus sp. NA42)、ピュロコックス?ヤヤノシイ(Pyrococcus yayanosii)、ピュロロブス?フマリイ(Pyrolobus fumarii)、スタピュロテルムス?ヘレニクス(Staphylothermus hellenicus)、スタピュロテルムス?マリヌス(Staphylothermus marinus)、スルフォロブス?アキドカルディリウス(Sulfolobus acidocaldirius)、スルフォロブス?イスランディクス(Sulfolobus islandicus)、スルフォロブス?ソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)、スルフォロブス?トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、テルモコックス?バロピルス(Thermococcus barophilus)、テルモコックス?ガンマトレランス(Thermococcus gammatolerans)、テルモコックス?コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)、テルモコックス?リトラリス(Thermococcus litoralis)、テルモコックス?オヌリネウス(Thermococcus onnurineus)、テルモコックス?シビリクス(Thermococcus sibiricus)、テルモコックス屬種4557(Thermococcus sp. 4557)、テルモコックス屬種AM4(Thermococcus sp. AM4)、テルモフィルム?ペンデンス(Thermofilum pendens)、テルモプラズマ?アキドピルム(Thermoplasma acidophilum)、テルモプラズマ?ヴォルカニウム(Thermoplasma volcanium)、テルモプロテウス?ネウトロピルス(Thermoproteus neutrophilus)、テルモプロテウス?テナクス(Thermoproteus tenax)、テルモプロテウス?ウゾニエンシス(Thermoproteus uzoniensis)、テルモスパエラ?アグレガンス(Thermosphaera aggregans)、ウァルカニサエタ?ジストリブタ(Vulcanisaeta distributa)、およびウァルカニサエタ?モウトノヴスキア(Vulcanisaeta moutnovskia)。

本発明によるプロデューサー細(xì)胞として有用な古細(xì)菌細(xì)胞の特定の例としては、ハロフェラックス?ウォルカニイ(Haloferax volcanii)およびスルフォロブス屬種(Sulfolobus spp.)が挙げられる。

(標(biāo)的タンパク質(zhì)) 本発明のアッセイシステムは標(biāo)的タンパク質(zhì)を含み得る。

任意の適切な標(biāo)的タンパク質(zhì)が使用され得、前のセクションで論じた標(biāo)的細(xì)胞のいずれか由來(lái)のタンパク質(zhì)を含む。したがって、本発明によるアッセイシステムでの使用に適した標(biāo)的タンパク質(zhì)は、真核生物、原核生物、真菌およびウイルスのタンパク質(zhì)から選択され得る。

したがって、適切な標(biāo)的タンパク質(zhì)としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:癌タンパク質(zhì)、輸送(核、キャリア、イオン、チャネル、電子、タンパク質(zhì))、行動(dòng)、受容體、細(xì)胞死、細(xì)胞分化、細(xì)胞表面、構(gòu)造タンパク質(zhì)、細(xì)胞接著、細(xì)胞コミュニケーション、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、酵素、細(xì)胞機(jī)能(ヘリカーゼ、生合成、モーター、抗酸化、觸媒作用、代謝作用、タンパク質(zhì)分解作用)、膜融合、発生、生物學(xué)的プロセスを調(diào)節(jié)するタンパク質(zhì)、以下の活性を有する各タンパク質(zhì):シグナルトランスデューサー活性、受容體活性、イソメラーゼ活性、酵素調(diào)節(jié)活性、シャペロン調(diào)節(jié)因子、結(jié)合活性、転寫(xiě)調(diào)節(jié)活性、翻訳調(diào)節(jié)活性、構(gòu)造分子活性、リガーゼ活性、細(xì)胞外組織化活性、キナーゼ活性、生合成活性、リガーゼ活性、および核酸結(jié)合活性。

標(biāo)的タンパク質(zhì)は、以下から選択され得るが、これらに限定されない:DNAメチルトランスフェラーゼ、AKT経路タンパク質(zhì)、MAPK/ERK経路タンパク質(zhì)、チロシンキナーゼ、上皮成長(zhǎng)因子受容體(EGFR)、線維芽細(xì)胞成長(zhǎng)因子受容體(FGFR)、血管內(nèi)皮成長(zhǎng)因子受容體(VEGFR)、エリスロポエチン産生ヒト肝細(xì)胞受容體(Eph)、トロポミオシン受容體キナーゼ、腫瘍壊死因子、アポトーシス制御因子Bcl?2ファミリータンパク質(zhì)、オーロラキナーゼ、クロマチン、Gタンパク質(zhì)共役型受容體(GPCR)、NF?κB経路、HCVタンパク質(zhì)、HIVタンパク質(zhì)、アスパルチルプロテアーゼ、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、グリコシダーゼ、リパーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、サイトカインおよびホルモン。

特定の標(biāo)的タンパク質(zhì)は、以下から選択され得る:ERK1/2、ERK5、A?Raf、B?Raf、C?Raf、c?Mos、Tpl2/Cot、MEK、MKK1、MKK2、MKK3、MKK4、MKK5、MKK6、MKK7、TYK2、JNK1、JNK2、JNK3、MEKK1、MEKK2、MEKK3、MEKK4、ASK1、ASK2、MLK1、MLK2、MLK3、P38α、p38β、P38γ、p38δ、BRD2、BRD3、BRD4、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)、AKT、プロテインキナーゼA(PKA)、プロテインキナーゼB(PKB)、プロテインキナーゼC(PKC)、PGC1α、SIRT1、PD?L1、mTOR、PDK?1、p70 S6キナーゼ、フォークヘッド転位因子、MELK、eIF4E、Hsp90、Hsp70、Hsp60、トポイソメラーゼI型、トポイソメラーゼII型、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、Cdk11、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk5、Cdk6、Cdk7、α?チューブリン、β?チューブリン、γ?チューブリン、δ?チューブリン、ε?チューブリン、ヤヌスキナーゼ(JAK1、JAK2、JAK3)、ABL1、ABL2、EGFR、EPH A1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB6、NEH2/neu、Her3、Her4、ALK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、INSR、INSRR、VEGFR?1、VEGFR?2、VEGFR?3、FLT?3、FLT4、PDGFRA、PDGFRB、CSF1R、Axl、IRAK4、SCFR、Fyn、MuSK、Btk、CSK、PLK4、Fes、MER、c?MET、LMTK2、FRK、ILK、Lck、TIE1、FAK、PTK6、TNNI3、ROSCCK4、ZAP?70、c?Src、Tec、Lyn、TrkA、TrkB、TrkC、RET、ROR1、ROR2、ACK1、Syk、MDM2、HRas、KRas、NRas、ROCK、PI3K、BACE1、BACE2、CTSD、CTSE、NAPSA、PGC、レニン、MMSET、Aurora Aキナーゼ、Aurora Bキナーゼ、Aurora Cキナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、テロメラーゼ、アデニリルシクラーゼ、cAMPホスホジエステラーゼ、PARP1、PARP2、PARP4、PARP?5a、PARP?5b、PKM2、Keap1、Nrf2、TNF、TRAIL、OX40Lリンホトキシン?α、IFNAR1、IFNAR2、IFN?α、IFN?β、IFN?γ、IFNLR1、CCL3、CCL4、CCL5、IL1α、IL1β、IL?2、IL?2、IL?4、IL?5、IL?6、IL?7、IL?9、IL?9、IL?10、IL?11、IL?12、IL?13、IL?15、IL?17、Bcl?2、Bcl?xL、Bax、HCVヘリカーゼ、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、NF?κB1、NF?κB2、RelA、RelB、c?Rel、RIP1、ACE、HIVプロテアーゼ、HIVインテグラーゼ、Gag、Pol、gp160、Tat、Rev Nef、Vpr、Vif、Vpu、RNAポリメラーゼ、GABAトランスアミナーゼ、逆転寫(xiě)酵素、DNAポリメラーゼ、プロラクチン、ACTH、ANP、インスリン、PDE、AMPK、iNOS、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、ラクターゼ、アミラーゼリゾチーム、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、マルターゼ、スクラーゼ、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、P、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、PTEN、ヒストンリジンデメチラーゼ(KDM)、GCN5、PCAF、Hat1、ATF?2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC?1、SRC?3、ACTR、TIF?2、TAF1、TFIIIC、プロテインO?マンノシルトランスフェラーゼ1(POMT1)、アミロイドβおよびタウ。

本発明を特定の実施例を參照して説明する。これらは単なる例示であり、説明の目的のためだけである:それらは決して特許請(qǐng)求の範(fàn)囲または記載された発明の範(fàn)囲を限定することを意図しない。

(実施例1:液滴中でのスクリーニングを伴うヒドロゲルマトリックスビーズを用いたタグなし化合物ライブラリの生成) (1:ガイド配列のアセンブリ) 1)アセンブリは、架橋のためにアミン基に対する12Cリンカーを含む5’タグオリゴヌクレオチドと、3’タグオリゴヌクレオチドとを包含する。ガイド配列は、ライブラリ中で使用するモノマーに対応するオリゴヌクレオチドのプールであり、この場(chǎng)合、200オリゴヌクレオチドが1.6×10⁹を超える個(gè)數(shù)のユニークな配列のアセンブリを可能とすることに留意されたい。

2)5’および3’タグを1μM最終濃度で添加する。

3)250個(gè)のバーコードオリゴヌクレオドを1.25μMの最終濃度でプールする。

反応混合物: 10μl NE緩衝液1(New England Biolabs) (1×反応ミックスは、10mM ビス?トリス?プロパン?HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT、pH7(25℃にて)である) 5μl 5’タグオリゴヌクレオチド(100μM) 5μl 3’タグオリゴヌクレオチド(100μM) 6.25μlのプールしたオリゴヌクレオチド(100μM) 2.5μl 熱安定性5’AppDNA/RNAリガーゼ(New England Biolabs) 70.25μlのヌクレアーゼフリー水

65℃にて4時(shí)間インキュベートする。

4)1×10mM トリス、1mM EDTA(pH7.0)緩衝液で300μlとし、そしてillustra S-200マイクロスピンHRカラム(GE Healthcare)を用いて反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドと試薬とを除去する。

5)40μlの酢酸ナトリウム(pH5.2)および2.5容量(1ml)の100%エタノールを添加する?；旌悉?、?20℃にて少なくとも1時(shí)間置き、次いで、4℃にて15,000rpmで15分間の遠(yuǎn)心分離によってDNAをペレット化する。

6)上清を除去し、1mlの70%エタノールで洗浄し、5分間遠(yuǎn)心分離し、洗浄を繰り返し、次いでこのペレットを風(fēng)乾する。

7)このペレットを25μlのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁する。

(2:PCR中に架橋させるための5’タグオリゴヌクレオチドのアガロースへの架橋) 1)25gの低融點(diǎn)アガロースを50mlの18.2ΩM水中に計(jì)量することによって架橋用のアガロースを調(diào)製し、そして4℃にて30分間混合して水和させる。濾過(guò)により乾燥させ、そして100mlの水で洗浄し、スラリーを回収してその容量を測(cè)定する(通常15?20ml)。

2)等容量の0.05M NaOHをスラリー化したアガロースに添加し、pHを確認(rèn)し、必要であれば10M NaOHを必要なだけ添加することによって、10.5と11との間に調(diào)整する。

3)スラリーをマグネチックスターラー上に置き、CNBrを添加しながら混合する。

4)100mg/mlスラリー 臭化シアン活性化セファロース(CNBr)(Sigma)を添加し(すなわち、40mlのスラリー中に4gのCNBrを添加する)、直ちにpHをチェックし、CNBrが完全に溶解するまでモニタリングする(1?2mlの10M NaOHの添加が、pHを10.5?11に保つために必要であり得る)。反応が15分間進(jìn)行するにつれてpHをモニタリングする。

5)15分後またはpHが安定したら、反応は完了する。等容量の200mM NaHCO₃(pH8.5)を添加することによって、殘存する活性CNBrをブロックする。

6)ブフナー漏斗を使用してスラリーを?yàn)V過(guò)し、100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)で3×50ml洗浄する。

7)100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)緩衝液全容量25ml中に再懸濁する。

8)5’末端にNH₂?リンカーを有する100μMの5’タグオリゴヌクレオチド250μlを取り、スラリー化アガロースと混合し、室溫にて2時(shí)間混合する。

9)等容量(25ml)の0.2Mグリシンを添加し、殘存する活性CNBr結(jié)合部位をブロックする。

10)スラリーを?yàn)V過(guò)し、100mlの100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)緩衝液で洗浄し、次いで100mlの水で洗浄し、風(fēng)乾させ、ゲルを集めて計(jì)量する(注:この物質(zhì)は0.1%アジ化ナトリウムを添加することによって保存用に保存できる。あるいは、これを凍結(jié)乾燥させて、長(zhǎng)期使用のために室溫で保存することができる。アジ化ナトリウムを添加する場(chǎng)合、スラリーを使用前に濾過(guò)して洗浄してアジドを除去しなければならない)。

11)これは約40%アガロースであり、この段階でアミンリンカーを介して架橋された5’タグオリゴヌクレオチドで飽和されており、後でヒドロゲルマトリックスを製造するために使用することができる。少量のアリコート(100μl)を採(cǎi)取して、約75℃ではなお融解し、20℃を下回ると固體となることをチェックするようにアッセイし、架橋がゲル化特性に悪影響を與えていないことをチェックする。

(3:ビーズにおけるPCR) この工程は、単一の液滴中で、単一の特異的DNAガイドを増幅し、これにより各ビーズ中にクローンDNA集団を生じる。架橋5’タグオリゴヌクレオチドがPCRに使用されるが、共有結(jié)合としてアガロースに結(jié)合したままであることに留意されたい。これはアガロースから失われることはない。これにより、ビーズの全表面およびビーズ內(nèi)にμM濃度のDNAガイドが付著したクローンビーズが得られる。

1)必要に応じて、乾燥アガロース?CBBr?オリゴヌクレオチドを溶解するか、または最終濃度0.5%までスラリーを添加する。

2)次のように水性反応混合物を作製し、それを保溫する。還元した3’Revタグは、非対稱PCRによる5’タグ産物の産生を促進(jìn)し、したがってテンプレートと比較してより多くの架橋ガイドが生成される。組み立てられたガイドDNAは1コピー/液滴である(一部の液滴は空である)。

反応は1ml容量/カプセル化を構(gòu)成する 200μl 5× Phusion HF緩衝液 20μl 10mM dNTPミックス(等ミックス) 2μlの3’Rev-compオリゴヌクレオチド(GGGTTAATGGCTAATATCGCG) 50μl Phusion HSIIポリメラーゼ(New England Biolabs) 0.015gのCNBr?5’タグアガロースを含むヌクレアーゼフリー水で1000μlにする(1.5%アガロースビーズ)。

3)連続相(20μL/分の水相、40μL/分の油相)としてPico-Surf1(2%界面活性剤、Dolomite、英國(guó))を使用して、14μmのエッチングされた液滴生成チップ(Dolomite、英國(guó))中にカプセル化する。

4)液滴混合物全體をまとめてPCRし、48ウェル間で等分(スプリット)する(50μl/ウェル)。

5)98℃にて2分、[98℃にて15秒、54℃にて15秒、72℃にて10秒]×30、72℃にて2分、次いで4℃にして20分で凝固させる(行う直前まで4℃に保つ)。

6)ビーズをプールし、5容量(5ml)のPBS+1%Tween80を添加し、転倒混和し、4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

7)上清を除去し、ビーズを5倍量(5ml)のPBS+1%Tween80で再度洗浄して油をすべて除去し、4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

8)ビーズにはオイルがなくなり、ハイブリダイズした、架橋していないDNA(またはガイドの逆相補(bǔ)鎖)を除去するために5mlの0.1M NaOHで洗浄し、室溫にて5分間混合し、次いで4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

9)0.1M NaOH洗浄を繰り返す。

10)ビーズに5mlの水を加え、4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

11)水洗を繰り返して、ビーズは化學(xué)反応をガイドする準(zhǔn)備が整う。

(4:ケミカルライブラリのガイド付きアセンブリ) モノマーのDNAガイドアセンブリを従來(lái)の化學(xué)を用いて合成し、RNAタグをIDTによって予め合成した。最後の3つのヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる切斷を防ぐためにホスホロチオエート結(jié)合を含む。次いで、個(gè)々の試薬に、ガイドオリゴヌクレオチドに組み込まれたユニークな配列に対して特異的である特定のRNAに対するガイドでタグ付けする(最大4つのガイド配列を100,000,000を超えるユニークな化合物にすると仮定して、100のユニークモノマーが組み立てられ得る)。ガイドおよびタグは18?25マーで、DNAに対するTmは>60℃であるが、RNA?DNA相互作用がより安定しているため、これらのオリゴヌクレオチドの実際の融解溫度は75?85℃であることが分かった。

1)ビーズをカラムに充填し(各ビーズはガイドアセンブリに対してユニークなDNA配列を持つクローンであるが、各ビーズ上のこのクローンガイドはμMの濃度である)、20μMでは、ビーズ容量1mlあたり20億が存在し得る。

2)次に、モノマーと適切な試薬とのプールをカラム上で洗浄し、反応を進(jìn)行させる。カラムを洗浄し、必要に応じて新しい反応化學(xué)を添加することができる(注:新鮮なモノマーも追加できる)。

3)化學(xué)合成は使用するモノマーによって異なる(実施例2、セクション4を參照)。

4)最後に、ビーズを100mM NaClを含む10カラム容量のTEで洗浄し、次いで表現(xiàn)型スクリーンにおける細(xì)胞の増殖のために2カラム容量の適切な培地(例えば、RPMI)で洗浄する。

5)次にビーズを増殖培地中に集め、標(biāo)的細(xì)胞をカプセル化する準(zhǔn)備をする。新たに合成された化合物は、DNAガイド?RNAタグ相互作用を介して結(jié)合したままである(pHが5?9、溫度が75℃以下に保たれている限り(新規(guī)化合物は2?4のガイドを介して結(jié)合されるので、それは非常に安定である))。

(5:指標(biāo)細(xì)胞による化學(xué)ビーズのカプセル化) ビーズ上の化學(xué)物質(zhì)はカプセル化されるまで結(jié)合したままである。ジャーカット細(xì)胞を2?8個(gè)/液滴を捕捉するように希釈する。

1)アガロースビーズ、RPMI培地中の2?8個(gè)のジャーカット細(xì)胞、および0.4%w/vのタイプIX?Aアガロースおよび0.1μg/mlのRNaseAを、100μmの接合部を有する液滴発生チップにおいて100μL/分の水性流速および200μL/分でPicosurf 1(Dolomite、英國(guó))でカプセル化する。クローン性を維持するために、液滴ごとに<1アガロースビーズをカプセル化する。

2)ハイブリダイズした化合物からの化學(xué)物質(zhì)の放出は、細(xì)胞混合物中に0.1μg/mlのRNaseAを含めたことによる。これは細(xì)胞の増殖には影響せず、試験した増殖培地で少なくとも48時(shí)間有効である。RNAガイドの切斷は、RPMI、溶原性ブロス、トリプシンソイブロスおよびDMEM中で15?20分以內(nèi)に起こる。RNaseAはRNAタグを切斷して遊離させ(DNAでは起こらない)、タグがつかなかった化合物はもはやガイドに結(jié)合せず、アガロースビーズから指標(biāo)小滴中に自由に拡散する。これは0.5?100μMの濃度で起こる。

(6:表現(xiàn)型スクリーン) 1)指標(biāo)細(xì)胞と共に化學(xué)ビーズを24時(shí)間インキュベートした後、液滴は破壊される。細(xì)胞をより長(zhǎng)期間インキュベートすることが可能である:例えば、ヒト細(xì)胞はアッセイにおいて10日間インキュベートすることができ、そして細(xì)菌細(xì)胞は28日後に回収される。しかし、通常のインキュベーション時(shí)間は24?144時(shí)間である。

2)氷上に置くことによってビーズを固化させ、次いで4容量のリン酸緩衝食塩水(PBS)+1%Tween80を添加することによって破壊し、転倒混和し、次いで4℃にて3500gで15分間遠(yuǎn)心分離する。

3)上清を除去し、ビーズペレットを4容量のPBS+1%Tween80で再度洗浄する。

4)次にビーズペレットを125μmから45μmの粒子フィルターを通してろ過(guò)し、これによって、より大きな液滴を除去し、より小さな破片および細(xì)胞を通して洗浄する。

5)フィルター上のビーズを5容量のPBSですすぎ、次いで遠(yuǎn)心分離管に集める。

6)PBSで混合液を100mlにする。

7)TMRMおよびHoescht 33342(Thermo Fisher Scientific)染料をそれぞれ200μMの最終濃度および1μg/mlで添加する。室溫で30分間インキュベートする。

8)4℃にて3500gで15分間遠(yuǎn)心分離してビーズをペレット化する。

9)50mlのPBSに再懸濁し、洗浄工程を繰り返し、染料を除去する。

10)蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用して、405nmレーザーを使用してHoeschおよび488nmレーザーを使用してTMRMを勵(lì)起し、既知の対照と比較してこれらのチャンネルの出力を検出する。

11)TMRM/Hoescht染色比の増加を示す液滴をチューブに選別する。

(7:ヒット化合物を同定するための標(biāo)的の配列決定) 1)「ヒット」ビーズをペレット化し、25μlの水に再懸濁する。

2)各ヒットのコピー數(shù)を増やすために第一ラウンドのPCRを設(shè)定する?長(zhǎng)いリンカーによってアガロースに液滴あたり數(shù)百萬(wàn)が付著した: 10μlのHF緩衝液(Thermo Fisher Scientific) 1μl 5’タグ(10μM)(リンカーなしバージョンATTATGACCGTAGGCCTTGGC) 1μl 3’Rev-compオリゴヌクレオチド(10μM)(GGGTTAATGGCTAATATCGCG) 0.25μl Phusion DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Sceintific) 25μlの水中ビーズ 2.75μlのヌクレアーゼフリー水で50μlにする

PCR 98℃にて2分、[98℃にて15秒、54℃にて15秒、72℃にて10秒]×15、72℃にて2分。

3)Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)でクリーンアップする ?1.8倍量(90μlのAmpure XPビーズ)を添加し、ピペッティングでよく混ぜる ?2分待ってからマグネットの上に置き、ビーズが2?5分で集まったら上清を取り除く ?200μlの80%エタノールで洗浄し、室溫で2分間インキュベートする ?2?5分間マグネットに戻してエタノールを除去する ?エタノール洗浄を繰り返し、ビーズが乾くまで5分間風(fēng)乾する ?20μlの10mM トリスHCL pH7.0に再懸濁し(これによりDNAが溶出する)、マグネット上に戻す ?上清を集めて保管する

4)プライマーを添加して第二ラウンドPCR。

5)5’タグおよび3’タグおよび修飾RC_INDEXおよびPS_I2インデックスプライマー(illuminaより)を使用して、プライマーの3’末端にタグ配列を用いてコード化する(12×ECおよび8×PS_I2)。これらのタグは変わらないが、インデックスは、以下の條件で96ウェルプレートPCRをコードするように変わる: ?10μl 2×NEBNext PCRマスターミックス(New England Biolabs) ?2.5μlのRC_INDEX(3.3μM)(1/30希釈のストック) ?2.5μlのPS_I2プライマー(3.3μM)(1/30希釈のストック) ?5μlのDNA(PCR(工程3)から溶出したもの) ?PCR 98℃にて2分、[98℃にて10秒、54℃にて60秒、72℃にて30秒]×30、72℃にて2分。

6)Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いてPCR産物セレクチン250?350bpのサイズ選択。

より大きなフラグメントを除去するには: ?15μlの水を加えて容量を65μlに増やす。 ?49μl(0.75×容量)のAmpureビーズを加えてよく混ぜ、5分間インキュベートする。 ?マグネット上に2分間置き、上清をきれいなウェルに移す。 ?目的のフラグメントをビンに入れる。 ?10μl(0.15×容量のAmpureビーズ)を加えてよく混ぜ、5分間インキュベートする。 ?マグネットの上に置き、今度は上清を捨てる。 ?80%エタノール200μlで洗浄し、室溫で2分間インキュベートする。 ?2?5分間マグネットに戻してエタノールを除去する。 ?エタノール洗浄を繰り返し、ビーズが乾くまで5分間風(fēng)乾する。 ?35μlの10mM トリス?HCL pH7.0に再懸濁し(これによりDNAが溶出する)、マグネット上に戻す。 ?25μlの上清を集めて保管する。

7)希釈液を1:100、1:10000および1:200000に設(shè)定する。Illumina定量キット用のKapa Fast qPCR(Kapabiosytems)を12μl反応液中で使用して、qPCRによりDNA濃度を決定する。

8)qPCR結(jié)果を使用して、NextSeq500システムガイド(15046563)およびNextSeq Denature and Dilute Libraries Guide(15048776)のIlluminaプロトコルに従って、すべてのサンプルの2nMライブラリミックスを作製し、シーケンサーにロードする。

9)2つのタグでフラグ付けしたガイド核酸の戻り配列は、容易に同定され、化合物組立の順序およびその構(gòu)造を決定するために使用される?ガイド(200ヌクレオチド未満である)は、必要であればIDTからのウルトラマーを用いて合成することができ、このようにして迅速にモノマーからより多くの化合物を作製し、活性を確認(rèn)する。あるいは、化合物は、DNA配列決定データから解読された構(gòu)造に基づいて直接合成される。

(実施例2?固體ビーズ上の固定化DNAガイドを用いたタグなし化合物ライブラリの生成) (1:ガイド配列のアセンブリ) 5’タグをアミンではなくビオチン化することを除き、実施例1のセクション1に記載の通り。

(2:ストレプトアビジンコートビーズへの単一ガイドの付著) 付著を可能にするためにストレプトアビジンでコーティングされた活性化ビーズに単一のDNA分子を付著させる。ビーズは、平均直徑4.95μmのBangs laboratories Cat No:CP01Nから購(gòu)入した。ビーズはストレプトアビジンでポリマーコーティングされている。

1)1000μl(5mgのビーズ)を採(cǎi)取し、室溫にて5000gで5分間の遠(yuǎn)心分離によりペレット化した。

2)上清を除去し、ビーズを1000μlの100mM トリス?HCl pH8、0.1%Tween 20で洗浄した。

3)殘存する緩衝液を除去するために洗浄をさらに2回繰り返した。

4)最終容量100μlの100mM トリス?HCl pH8、0.1%Tween20にビーズを再懸濁する。

5)ビーズは6×10⁷ビーズ/mgなので、1000μlの中に6×10⁸ビーズがあり、これはビーズあたり平均1つのガイドを得るのに同じ數(shù)のガイドが必要であることを意味する。このためには約3フェムトモルのDNAが必要である。平均的なガイドの長(zhǎng)さは123bpであるので、これは経験的に0.25ngのオリゴヌクレオチドDNAが必要であることを意味する。最良の結(jié)果を得るために、このほぼ2倍が必要であることを見(jiàn)出し、0.4ngのガイド構(gòu)築物を使用した?これを100μlの100mM トリス?HCl pH8、0.1%Tween20に希釈し、そしてビーズと混合する。

6)ビーズを室溫で1時(shí)間混合する。

7)工程1および2に記載のように、ビーズを遠(yuǎn)心分離によりペレット化し、そして500μlの100mM トリス?HCl pH8、0.5%Tween20で5回洗浄して未結(jié)合DNAを除去する。

8)最終再懸濁は500μlの10mM トリス?HCl pH8、1mM EDTA緩衝液中にあり、4℃にて數(shù)週間保存することができ、10μlを0.5%アガロースゲル上で泳動(dòng)し、そしてビーズ上のタンパク質(zhì)を染色するために1×sypro-rubyで、そしてDNAを染色するために1×Sybr Goldで染色し、両方ともの局在が見(jiàn)られるはずであるが、SybR goldはゲル上では非常に弱く、最大4つの異なるバンド(ガイド內(nèi)の1?4の可変領(lǐng)域)となり得、大部分はより大きな斷片で流れる。ビーズに付著すると、フラグメントはすべての場(chǎng)合において>10kbであるように見(jiàn)える。より多くのバンドが見(jiàn)える場(chǎng)合、バッチは均質(zhì)ではないので繰り返さなければならない。

9)液滴あたり1つのビーズを與えるよう液滴が作製されるようにサンプルを希釈する。

(3:機(jī)能性ビーズ上のガイドオリゴヌクレオチドの増幅) 1)以下の混合物中にオリゴヌクレオチド官能基化ビーズを70,000ビーズ/μLに希釈する: 反応は1ml容量/カプセル化を構(gòu)成する: 200μl 5×Phusion HF緩衝液(Thermo Fisher Scientific) 20μl 10mM dNTPミックス(等量ミックス) 2μlの3’Rev-compオリゴヌクレオチド(GGGTTAATGGCTAATATCGCG)(IDT) 50μl Phusion HSIIポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)。

2)連続相(20μL/分の水相、40μL/分の油相)としてPico-Surf 1(2%界面活性剤、Dolomite、英國(guó))を使用して、14μmのエッチングされた液滴生成チップ(Dolomite、UK)中にカプセル化する。ビーズ希釈は10滴ごとに1つのビーズとしてクローン性を保証し、そして全混合物をカプセル化するのに約1時(shí)間かかる。

3)得られた14μmの液滴(18pL)をエッペンドルフチューブに集める。

4)液滴混合物全體をまとめてPCRし、60ウェル間で等分(スプリット)する(50μl/ウェル)。

5)98℃にて2分、[98℃にて15秒、54℃にて15秒、72℃にて10秒]×30、72℃にて2分、次いで4℃にして20分で凝固させる(行う直前まで4℃に保つ)。

6)製造業(yè)者のプロトコルに従ってビーズをプールし、Pico-break 1(Dolomite、英國(guó))を使用して液滴を粉砕する。

7)ビーズを回収し、ビーズを5容量(5ml)のPBS+1%Tween80で再度洗浄してすべての油を除去し、4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

8)ビーズにはオイルがなくなり、ハイブリダイズした、架橋していないDNA(またはガイドの逆相補(bǔ)鎖)を除去するために5mlの0.1M NaOHで洗浄し、室溫で5分間混合し、次いで4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

9)0.1M NaOH洗浄を繰り返す。

10)ビーズに5mlの水を加え、4℃にて2500gで15分間遠(yuǎn)心してペレット化する。

11)水洗を繰り返し、ビーズの使用準(zhǔn)備を整える。

(4:ビーズ上でのDNAテンプレート化アシスト合成) DNA指向性アセンブリのためのタグ付きモノマーのアセンブリを、従來(lái)の化學(xué)を用いて合成した。RNAタグをIDTによって予め合成し、そして最後の3ヌクレオチドには、エキソヌクレアーゼによる切斷を防ぐためにホスホロチオエート結(jié)合を含ませた。次いで、個(gè)々の試薬を、ガイドオリゴヌクレオチドに組み込まれたユニークなガイド配列に対して特異的である特定のRNAに対するガイドでタグ付けする(最大4つのガイド配列を100,000,000を超えるユニークな化合物にすると仮定して、100のユニークなモノマーが組み立てられ得る)。設(shè)計(jì)したガイドおよびタグは18?25マーで、DNAに対するTmが>60℃であるが、RNA?DNA相互作用がより安定しているため、これらのオリゴヌクレオチドでは75?85℃にて安定性が見(jiàn)られた。交差反応性を最小限に抑えるために、モノマー濃度を0.5μM以下に保つ。ガイドオリゴヌクレオチドのプールに対応して、試薬を配列の5’末端に連結(jié)した。この例示的な実施例では、(a)アルデヒドまたは(b)アミンのいずれかを含有するビルディングブロックを使用してモノマーを互いに連結(jié)し、還元的アミノ化後に第二級(jí)アミン結(jié)合をもたらす。

1)250mM NaCl、10mM水素化ホウ素ナトリウムおよび0.5μM反応性オリゴヌクレオチド結(jié)合モノマーを有する50mM TAPS緩衝液、pH8.0中で官能基化ガイダンスビーズ(実施例2のセクションXから)を20,000ビーズ/μLに希釈する。

2)20μmのエッチング深さのマイクロフルイディックチップ(Dolomite、英國(guó))を使用して、50μL/分および100μL/分のPico-surf1(2%界面活性剤、Dolomite、英國(guó))の水性流速でこの混合物をカプセル化し、直徑20μmの液滴(42pL)を生じる。

3)液滴を50mL Falconチューブに集め、25℃にて24時(shí)間反応させる。

(5:組み立てられた化合物、ガイダンスビーズ、および指標(biāo)細(xì)胞の液滴融合) この工程は、小さな液滴生成部位、直徑100μmの液滴を生成するための別のより大きい液滴生成部位、液滴同期のためのY字型チャネル、および液滴合體のための一対のアドレス可能電極を含む特注のマイクロ流體チップを含む。これらのデバイスは、Dolomite(英國(guó))またはMicronit(オランダ)のような企業(yè)から容易に入手可能である。

1)指標(biāo)液滴のために以下を含む混合物を調(diào)製する: ジャーカット細(xì)胞(5細(xì)胞/液滴で21,000細(xì)胞/μL) RNase A、0.1μg/mL 0.5重量%IX?A型アガロース(Sigma) RPMI培地

2)カスタムメイドのチップに実施例2の工程4からの20μm液滴の再注入を開(kāi)始する。

3)Pico-surf1の流速200μL/分で、100μL/mLの流速で100μm液滴の作製を開(kāi)始する。

4)高速度カメラ(Pixellink、カナダ)を使用して、20μm液滴の再注入の速度を100μm液滴の生成速度に合わせて、Yチャネルで1:1の同期を確実にする。小さい方の液滴の方がチャネル內(nèi)での流體力學(xué)的抗力が小さく、より速く移動(dòng)し、100μm液滴に追い付き、自己同期させて対にする。

5)パルス発生器(Aim-TTi、RS components、英國(guó))および高電圧増幅器(Trek 2220、Trek、米國(guó))からの1KHzの方形波パルスで4kV/cmの電場(chǎng)を印加することによって、電極でのエレクトロフュージョンにより隣接する液滴対を融合させる。

6)チップから融合された液滴を収集し、5%CO₂、37℃にて組織培養(yǎng)フラスコ(Fisher、英國(guó))中にインキュベートする。

(6:表現(xiàn)型スクリーン) 実施例1のセクション6に記載の通り。

(7:ヒット化合物を同定するための標(biāo)的の配列決定) 実施例1のセクション7に記載の通り。

(実施例3?既存の化合物ライブラリを可逆的にタグ付け) (1:化合物ライブラリに追加するためのランダムオリゴヌクレオチドタグの生成) 1)ランダムタグをTwist Bioscienceから購(gòu)入する。これらは、Tm>55℃を有する18?25マーの100,000?1,000,000個(gè)のユニークな配列を含み、それぞれに5’RNA_アダプター1オリゴヌクレオチドおよび3’DNA_アダプター1オリゴヌクレオチドを付加し、それぞれ修飾して、特異的末端への付加を確実にする。

2)200μl反応用の反応混合物: 20μl 10×緩衝液(1×反応緩衝液(50mM トリス?HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、1mM DTT)) 100μl 50% PEG 8000(w/v)(1×25%(w/v)PEG 8000) 20μl 10mMヘキサミンコバルトクロリド(1×1mMヘキサミンコバルトクロリド) 20μl(100単位)T4 RNAリガーゼ 20μl 10mM ATP(1×1mM ATP)

20μlのオリゴヌクレオチドミックス(ランダムバーコードオリゴヌクレオチドならびにRNAおよびDNAアダプターの各々水中30μMの等量ミックス)。25℃にて16時(shí)間インキュベートする。40μlの10mM トリス?HCl pH8.0、2.5mM EDTAを添加して反応を停止させる。

3)10mM トリス、1mM EDTA緩衝液、pH7で300μlを調(diào)製し、そしてillustra S?200マイクロスピンHRカラム(GE Healthcare)を使用して反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドおよび試薬を除去する。

4)40μlの酢酸ナトリウムpH5.2および2.5容量(1ml)の100%エタノールを加える?；旌悉?、?20℃にて少なくとも1時(shí)間置き、次に4℃にて15,000rpmで15分間遠(yuǎn)心してDNAをペレット化する。

5)上清を除去し、1mlの70%エタノールで洗浄し、5分間回転させ、洗浄を繰り返し、次いでペレットを風(fēng)乾させる。

6)25μlのヌクレアーゼフリー水にペレットを再懸濁する。

(2:PCR中に架橋させるための5’タグオリゴヌクレオチドのアガロースへの架橋) 1)25gの低融點(diǎn)アガロース(Sigma)を50mlの18.2ΩM水中に計(jì)量して架橋するためのアガロースを調(diào)製し、そして4℃にて30分間混合して水和させる。濾過(guò)して乾燥させ、100mlの水で洗浄し、スラリーを回収しそして容量を測(cè)定する(通常15?20ml)。

2)スラリーアガロースに等容量の0.05M NaOHを添加し、pHを確認(rèn)し、必要ならば10M NaOHを必要なだけ添加することによって10.5?11に調(diào)整する。

3)スラリーをマグネチックスターラー上に置き、CNBr(Sigma)を添加しながら混合する。

4)100mg/mlのスラリーCNBrを加える。すなわち、40mlのスラリーに4gのCNBrを加える。直ちにpHを確認(rèn)し、CNBrが完全に溶解するまでモニタリングする。必要に応じて10.5?11の間にpHを保つために1?2mlの10M NaOHを加える。反応が15分間進(jìn)行するごとにpHをモニタリングする。

5)15分後またはpHが安定になった後、反応は完了する。等容量の200mM NaHCO₃(pH8.5)を加えることにより、殘存する活性CNBrをブロックする。

6)ブフナー漏斗を使用してスラリーを?yàn)V過(guò)し、100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)で3×50ml洗浄する。

7)全容量25mlの100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)緩衝液に再懸濁する。

8)5’末端にNH₂?リンカーを有する100μMの5’タグオリゴヌクレオチド250μlを取り、スラリー化アガロースと混合し、室溫で2時(shí)間混合する。

9)等容量(25ml)の0.2Mグリシンを加えて、殘存する活性CNBr結(jié)合部位をブロックする。

10)スラリーを?yàn)V過(guò)し、100mlの100mM NaHCO₃、500mM NaCl(pH8.5)緩衝液で洗浄し、次いで100mlの水で洗浄して風(fēng)乾させ、ゲルを集めて計(jì)量する(この物質(zhì)は0.1%アジ化ナトリウムを添加することによって保存用に保存できる。あるいは、それは凍結(jié)乾燥して長(zhǎng)期使用のために室溫で貯蔵することができる。アジドを添加する場(chǎng)合は、使用する前にスラリーを?yàn)V過(guò)して洗浄し、アジドを除去しなければならない。)

11)これは約40%のアガロースであり、この段階でアミンリンカーを介して架橋した5’タグオリゴヌクレオチドで飽和しており、後でヒドロゲルマトリックスを製造するために使用することができる。少量のアリコート(100μl)を採(cǎi)取し、それがまだ約75℃にて融解し、20℃未満で固化することを確認(rèn)するためにアッセイし、架橋がゲル化特性に悪影響を及ぼしていないことを確認(rèn)する。

(3)化合物ライブラリのタグ付け(化學(xué)法)) この反応の正確な性質(zhì)は、問(wèn)題のライブラリおよびその中に含まれる官能基に依存するが、本実施例においては、ライブラリはアミノ基で高度に官能基化する。次いで、バーコード化オリゴヌクレオチドの末端をスクシンイミジルエステルで官能基化する。液滴內(nèi)で化合物を放出させるために、バーコード化オリゴヌクレオチドを切斷可能な基で官能基化する。

(1)個(gè)々のライブラリメンバーを0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液、pH8.3に最終濃度1mMまで溶解する。

(2)1:1のモル比を達(dá)成するために、スクシンイミジルエステル官能基化ガイドオリゴヌクレオチドを個(gè)々のウェルに添加する。各ウェルに特定の配列が1つだけ付加されることを確実にする。

(3)室溫で1時(shí)間インキュベートする。

(4)溶液を40℃に溫める。

(5)工程3からビーズのストックを希釈し、ウェルにロードする。スクリーニングプロセス中にオーバーサンプリングを確実にするために少なくとも100ビーズ/ウェルをロードするよう目標(biāo)とする。

(6)40℃にてインキュベートしてタグ付き化合物をビーズにハイブリダイズさせる。

(7)スピンダウンして各ウェルから上清を除去する。1×PBS緩衝液で3回洗浄する。

(8)1×PBS緩衝液を用いてビーズをウェルから洗い流す。一緒にプールしてから、新しい1×PBSに再懸濁する。

(4)化合物のタグ付け(酵素法)) この反応および官能基の正確な性質(zhì)から、いくつか挙げるとグリコシラーゼ、非リボソームペプチドシンターゼ、ユビキチナーゼ、およびホスホリラーゼを含む、本質(zhì)的に任意の適切な酵素を使用することができる。この説明では、ホスホリラーゼ酵素を使用する。

化合物を水またはDMSOに溶解して0.5mMにする(DMSO中の場(chǎng)合は2.5μL以下): (1)5μlの10×反応緩衝液(最終は70mMトリス?HCl、10mM MgCl₂、5mM DTT、pH7.6(25℃にて)である) (2)10μl 50%(w/v)PEG?4000(最終濃度10%) (3)2.5μlの10mM ATP(最終濃度500μM) (4)5μ T4 PNK(New England Biolabs) (5)水で50μlにする

37℃にて4時(shí)間インキュベートする。

ランダムタグをTwist Bioscienceから購(gòu)入する。これらは、Tm>55℃を有する18?25マーの100,000?1000,000のユニークな配列を含み、それぞれに5’DNA_アダプター1オリゴヌクレオチドおよび3’RNA_アダプター1オリゴヌクレオチドを付加し、それぞれ修飾して、特異的末端への付加を確実にする。この反応はバーコードを一緒にライゲートする。

以下のミックスを200μLにする: (1)20μl 10×緩衝液(1×反応緩衝液(50mM トリス?HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、1mM DTT)) (2)100μl 50% PEG 8000(w/v)(1×25%(w/v)PEG 8000) (3)20μl 10mMヘキサミンコバルトクロリド(1×1mMヘキサミンコバルトクロリド) (4)20μl(100単位)T4 RNAリガーゼ(New England Biolabs) (5)20μl 10mM ATP(1×1mM ATP)(Sigma) (6)20μl オリゴヌクレオチドミックス(ランダムバーコードオリゴヌクレオチドならびにRNAおよびDNAアダプターの各々水中30μMの等量ミックス)

25℃にて16時(shí)間インキュベートする。

40μlの10mM トリス?HCl pH8.0、2.5mM EDTAを添加して反応を停止させる。

1)10mM トリス、1mM EDTA(pH7)緩衝液で300μlを調(diào)製し、そしてillustra S?200マイクロスピンHRカラム(GE Healthcare)を使用して反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドおよび試薬を除去する。

2)40μlの酢酸ナトリウムpH5.2および2.5容量(1ml)の100%エタノールを加える?；旌悉?、?20℃にて少なくとも1時(shí)間置き、次に4℃にて15,000rpmで15分間遠(yuǎn)心してDNAをペレットにする。

3)上清を除去し、1mlの70%エタノールで洗浄し、5分間回転させ、洗浄を繰り返し、次いでペレットを風(fēng)乾させる。

4)25μlのヌクレアーゼフリー水にペレットを再懸濁する。

(5)ビーズへの化合物の付著) 1)上記化合物に、NH?C₁₂?GGGTTAATGGCTAATATCGCGオリゴヌクレオチドを有する50μlのジェネリック付著ビーズを添加する(実施例3、セクション2に記載の通り)。

(6)表現(xiàn)型スクリーン) 実施例1、セクション6に記載の通り。

(7)ヒット化合物を同定するための標(biāo)的の配列決定) 実施例1、セクション7に記載の通り。

(実施例4?タグなしDECL合成のためのスプリット?プール法) 広く使用されているスプリット?アンド?プール戦略(例えば、Mannocci et al.(2011)Chem. Commun., 47:12747-12753;Mannocci et al.(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. 105:17670-17675を參照)が、下記の通り、反復(fù)化學(xué)合成およびDNAコード化工程が関與する複數(shù)セットの化學(xué)部分構(gòu)造および対応するDNAコードフラグメントの段階的スプリット?アンド?プールコンビナトリアルアセンブリに基づいて、本発明に従って使用する?yún)g一ファーマコフォアDECLを生成するために、使用することができる。

(1)概要) ここで図1を參照して、まずガイドオリゴヌクレオチドを官能基化アガロースビーズに付著させる。各ビーズは、オリゴヌクレオチド付著のために、少なくとも10¹¹個(gè)の官能基を含む。タグ付き部分構(gòu)造(本明細(xì)書(shū)では「ファーマコア(pharmacore)」と呼ぶことがある)を、切斷可能なリンカーを介してガイドオリゴヌクレオチドに相補(bǔ)的なオリゴヌクレオチドに連結(jié)し、次いでライゲーションによってガイドオリゴヌクレオチドに付著させる。これは、一次ファーマコアとして機(jī)能し、それからさらなるファーマコア(二次、三次などのファーマコア)で「裝飾」される(以下に説明する)。

次いで、連続したラウンドの合成を行い、さらなる部分構(gòu)造/ファーマコアとの反応により一次ファーマコア部分構(gòu)造を裝飾する。各反応およびビルディングブロック用のコードオリゴヌクレオチドもまた、ライゲーションによってガイドオリゴヌクレオチドに付加する。ライブラリを、代替ラウンドの化學(xué)合成およびコードライゲーションを伴うスプリット?アンド?プール技術(shù)を用いて構(gòu)築する。ライブラリ生成後、各ビーズを単一化合物の複數(shù)コピーで裝飾する。

ここで図2を參照して、次いで、ライブラリビーズを、指標(biāo)細(xì)胞を有する微小液滴の內(nèi)側(cè)にカプセル化する(タンパク質(zhì)標(biāo)的もまた使用され得る)?；衔铯?、液滴內(nèi)で切斷可能なリンカーを切斷する酵素の添加によって放出され、水性內(nèi)部に化合物を放出させる。次いで、液滴を所定の期間インキュベートし、化合物の表現(xiàn)型効果をFACSを用いて測(cè)定する。細(xì)胞が所望の表現(xiàn)型を示す液滴を選別して、収集する。したがって、ライブラリメンバー合成をコード化するオリゴヌクレオチドは、それが引き起こす表現(xiàn)型効果に物理的には連結(jié)していないが、空間的に連結(jié)している。

化合物の同定は、ガイドオリゴヌクレオチドをビーズからの制限消化によって切斷し、続いて配列決定することによって行われる。オリゴヌクレオチドのコード配列は、ファーマコアが曝された合成工程とFACSによって観察された表現(xiàn)型効果の原因となる化合物の構(gòu)造とを記述する。ガイドオリゴヌクレオチドのPCR増幅は、10¹⁰を超えるオリゴヌクレオチド分子が存在するので必要とされないが、必要ならばPCRを使用して増幅することができる。

このタグ付きライブラリ合成は、DNAコード化(バーコード化)および合成規(guī)模の重要な利點(diǎn)を保持しながら、少數(shù)の比較的高価なタグ付き化學(xué)部分構(gòu)造を使用する分子ライブラリの合成を可能にする。それはまた、いかなる痕も単一の切斷事象から生じる痕まで減少させる。したがって、スプリット?アンド?プール方法は、すべてのファーマコア部分構(gòu)造単位をタグ付けする必要がないので、既知の化學(xué)を利用する多様なファーマコア付加を可能にする。

(2)アガロースアミンビーズの官能基化) アミン官能基化アガロースビーズ(Cube Bioscience)の50%懸濁液の2mLアリコートを500×gで10分間遠(yuǎn)心し、そしてRO水で3回洗浄し、次いで5mLの100mM MES+150mM NaClカップリング緩衝液、pH5.5に懸濁した。別個(gè)の管中で、アジド官能基化ミックスを調(diào)製した。N?ヒドロキシスクシンイミド(NHS、Sigma Aldrich)の20mM溶液2.5mLおよびN?(3?ジメチルアミノプロピル)?N'?エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC、Sigma Aldrich)の20mM溶液2.5mL(両方ともカップリング緩衝液中)を混合した。2?アジド酢酸(5μL、Carbosynth)を加え、そしてこの混合物を室溫で20分間反応させた。20分後、アミンビーズをスピンダウンし、5mLのアジド官能基化混合物に再懸濁した。この管を室溫で1時(shí)間ローテーター上に置き、次に回転させ、そして5mLの新鮮なアジド官能基化混合物中に再懸濁した。これをローテーター上に置き、一晩反応させた。次にビーズを3×5mLの1×PBS(pH7.4)で洗浄し、次いで5mLの100mM炭酸水素ナトリウム(pH7.5)に再懸濁し、必要になるまで4℃にて保存した。

(3)官能基化アジド?アガロースビーズへの捕捉オリゴヌクレオチドの付著) 1mLのアジドビーズストックをスピンダウンし、1mLの100mM MOPS、pH7.0で3回洗浄した。次にビーズを785μLのMOPS緩衝液に懸濁した。100μLの捕捉オリゴヌクレオチド(5’?GAAGGGTCGACTAAG ATTATACTGCATAGCTAGGGGAATGGATCCCGCC TTTTTTT(Int 5-オクタジイニル(Octadiynyl) Du)TTTTTTTTT GGCGGGATCC?3’、ADTbio、48.92μM)を添加し、続いて10μLの50mMトリス(3?ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA、Sigma Aldrich)、5μLの20mM硫酸銅(II)溶液(Sigma Aldrich)および100μLの10mMアスコルビン酸ナトリウム(Sigma Aldrich)溶液を加えた。ビーズをローテーター上に置き、一晩反応させ、次いで混合物を遠(yuǎn)心沈降させ、1×mLの100mM MOPS緩衝液で洗浄し、次いで758μLのMOPS緩衝液、100μLの10mMプロパルギルアルコール(Sigma Aldrich)に再懸濁した。続いて10μLの50mM THPTA、5μLの20mM硫酸銅(II)溶液および100μLの10mMアスコルビン酸ナトリウム溶液。1時(shí)間後、ビーズを3×1mLのMOPS緩衝液で洗浄し、次いで100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH7.5に再懸濁した。

(4)切斷可能なオリゴヌクレオチドの一次ファーマコアとのライゲーション) 1mlのアジドアガロースビーズ+捕捉オリゴヌクレオチドを遠(yuǎn)心し、500μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)で3回洗浄した後、475μLのNFWおよび500μLの2×クイックリガーゼ緩衝液(Quick Ligase Buffer)(NEB)に再懸濁した。15μLのペイロードオリゴヌクレオチド(5’ATTCCCCTAGCTATGCAAGTrGrArGRrArArGrUX3’、ここでX=ヘキシニルヒドロキシプロリノール、ADTbio、81.53μM)を10μLのクイックリガーゼと共に加えた。ビーズを37℃にて回転させながらインキュベートし、次いで100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH7.5で3回洗浄しそして必要になるまで4℃にて貯蔵した。

(5)タグ付け) ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドへのコード化オリゴヌクレオチドのライゲーションによるタグ付けは、ビーズを水中で洗浄することにより行った(5000gで5分間ビーズを遠(yuǎn)心分離し、5×ビーズ容量のヌクレアーゼフリー水(NFW)に再懸濁し、合計(jì)2回洗浄を繰り返す)。次いで、ビーズを5×ビーズ容量のライゲーション混合物(これは、最終濃度1×クイックリガーゼ緩衝液(New England Biolabs)、250nM スプリント(Splint)オリゴヌクレオチド、250nMコード化オリゴヌクレオチド、20U/μl T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を有し、次いでヌクレアーゼフリー水で5×ビーズ容量にしたものである)中に再懸濁した。

ライゲーション効率を試験しそしてライゲーション効率を最大にするために、サンプルを2つに等分(スプリット)した。一方のサンプルを95℃に2分間加熱し、次いでサーマルサイクラー中で0.2℃/秒で4℃に冷卻した。他方のサンプルは熱処理せずに室溫で放置した。加熱工程の後にT4 DNAリガーゼ(20U/μl)を加えた。

両方の反応物を37℃にて1時(shí)間インキュベートしてライゲーションを進(jìn)行させた。一旦インキュベートしたら、95℃に20分間加熱することによりリガーゼを熱失活し、次いで20U/μlのBamHI(NEB)を用いてオリゴヌクレオチドをビーズから切り出し、さらに37℃にて1時(shí)間インキュベートした。ビーズを遠(yuǎn)心分離(5000g、5分)によってペレット化し、次いで上清を取り除いた。ビーズから切り出した(cute)このDNAを、0.1×容量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)および2.5×容量の100%エタノールを添加することによって試験のために沈殿させた。次にこれを氷上で1時(shí)間インキュベートし、沈殿した物質(zhì)を17,000gで20分間の遠(yuǎn)心分離によりペレット化し、上清をデカントし、500μlの70%エタノールで2回洗浄した。次いでペレットを風(fēng)乾し、100μlのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。次に、この25μlを変性ローディング染料(95%ホルムアミド、0.1%キシレンシアノール、0.1%ブロムフェノールブルー、20mMトリス?塩酸pH7.5)と1:1で混合し、サンプルを95℃にて2分間ボイルし、次いで4℃/秒の冷卻速度で4℃まで冷卻した。沈殿したサンプルを次に変性TBEゲル(12.5%ポリアクリルアミド、7MのUREA)にロードした。150Vで、室溫にて45分間泳動(dòng)させる。泳動(dòng)したら、ゲルをミリQグレードの水で2回洗浄して尿素を除去し、次いで1×TBE中で1×SyBr gold(thermoscientific)DNA染色液で20分間染色した後、染色液を除去するために再度2回水で洗浄した。

次いで、ゲルをSyngene InGenius 3ゲルドックシステムを使用して畫(huà)像化した(図3)。全ての試薬が存在する場(chǎng)合にライゲーションが起こるが、これは加熱工程を用いた場(chǎng)合により効率的であることが分かる?これは、合成小胞上に各DNAの多數(shù)のコピーがあるので、妥當(dāng)なレベルでライゲーションが生じるために必要とされるわけではない。

(6)コード化タグからの化學(xué)構(gòu)造の放出) コード化オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドからペイロードを切斷することによって除去される。

ここで図4を參照して、リンカーの切斷およびファーマコアの放出を示すために、切斷可能なオリゴヌクレオチドの配列內(nèi)の切斷可能なリンカーの5’側(cè)にフルオロフォア(FITC、図4ではFとして示す)を組み込むオリゴヌクレオチドを作製した。次に、クエンチング分子、BHQ?1を切斷可能なリンカーに付著させた。これは、ライブラリ作製において使用される任意の化學(xué)構(gòu)造と同じ様式での切斷によって放出され得る。クエンチング剤が切斷可能なリンカーから除去されると、オリゴヌクレオチドのライトアップが見(jiàn)られる。

それらの関連するリンカーを痕なしに切斷する3つの異なる酵素が同定されている(RNase A、RNase T1 AおよびRNase 1A;図4においてそれぞれ酵素A、BおよびCと表示)。3つ全部を同胞のリンカーを用いて試験した。それぞれの場(chǎng)合において、10μlの反応をセットした:10mM トリス?HCl、1mM EDTA、150nM 切斷可能オリゴヌクレオチド、0.1μlのストック酵素(RNase A=10mg/ml、RNase T1=10mg/ml、RNase 1=1.5mg/ml)、次いでヌクレアーゼフリー水で10μlにする。サンプルを37℃にて15分間インキュベートし、次いで10μLの変性ローディング染料(95%ホルムアミド、0.1%キシレンシアノール、0.1%ブロムフェノールブルー、20mM トリス?HCl pH7.5)を添加した。サンプルを95℃にて2分間ボイルし、次いで4℃/秒で4℃に急冷した。次にこれらのサンプルを変性TBEゲル(12.5%ポリアクリルアミド、7M尿素)にロードした。ゲルを150Vで75分間泳動(dòng)し、FITCを勵(lì)起するSyngene Ingenius 3システムを用いて畫(huà)像化した。クエンチング剤の放出は、フルオロフォアが「ライトアップ」として見(jiàn)られそして畫(huà)像化され得ることを意味する。これは酵素の存在下にて黃色のDNAバンドの出現(xiàn)として見(jiàn)られる。SyBr gold(Thermo)で染色することによりDNAを見(jiàn)ることができ、クエンチング剤が存在する場(chǎng)合にこれもまたクエンチされるが、質(zhì)量の変化に対応するサイズシフトならびにシグナルの増加が見(jiàn)られる(フルオロフォアの下のグレースケール畫(huà)像、図4)。両方の場(chǎng)合において、放出が酵素の存在下でのみ起こり、そして急速である(<15分)ことを見(jiàn)ることができる。さらに、酵素は非常に活性であり、酵素の10倍段階希釈を10mM トリス?HCl pH7.5、1mM EDTA中で行い、そして反応を同様にして行った。酵素を10^?2から10^?5に希釈した後、RNase Aが10^?4、RNase T1とRNase 1が10^?3で活性を見(jiàn)ることができる。これは、酵素活性の大きな窓があること、およびこのプロセスが複數(shù)の酵素に対して10^?4希釈で30分以內(nèi)に起こり得ることを意味する。

また、酵素が液滴環(huán)境で機(jī)能することを確認(rèn)した(図5を參照)。RNase Aについての結(jié)果を示す。1mlの水相を10mM トリス?HCl、1mM EDTA、150nM 切斷可能なオリゴヌクレオチド、10μlのストックRNase A(10mg/ml)を用いて、次いでヌクレアーゼフリー水で1mlにすることで調(diào)製した。100μmの平均直徑の液滴を、2%w/vのGransurf G67(Grant Industries Inc.)と共に上記のような水相とPSF?2 cST油(Clearco Products Inc.)で構(gòu)成される油相と、100μmエッチング深さチップを用いて作製した。液滴を酵素と共にまたは酵素なしで37℃にて15分間インキュベートし、それらを482/18nmで照射するFloid蛍光顕微鏡および532/59nmの発光フィルターの下で畫(huà)像化した。酵素の存在下にて液滴內(nèi)でライトアップが起こり、反応が液滴環(huán)境によって影響されないことが分かる。

(7)ヒュースゲン1,3?雙極子環(huán)化付加およびチオウレタン形成を用いた切斷可能な化學(xué)構(gòu)造ペイロードの官能基化) 切斷可能なリンカーおよびコアペイロード(ヘキシニルヒドロキシプロリノール(hexynyl hydrodroxyprolinol))で官能基化されたビーズの2つの100μL部分を100mMのMOPS pH7.0で3回洗浄し、そして100μLの同じものの中に再懸濁した。両方の部分に、DMSO中の5?FAM?アジド(Jena Bioscience)の10mMストック2μLを加えた。一方の部分を未反応の陰性コントロールとして保持し、他方の部分に5μLの50mMトリス(3?ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA、Sigma Aldrich)、2.5μLの20mM硫酸銅(II)(Sigma Aldrich)溶液および100μLの10mMアスコルビン酸ナトリウム(Sigma Aldrich)溶液を添加した。捕捉オリゴヌクレオチドのみで官能基化されたビーズ(切斷可能なリンカーまたは機(jī)能的コアを含まない)を含むさらなるサンプルも同様に処理した。ビーズをローテーター上に置き、一晩反応させた後、混合物をスピンダウンさせ、1×mLの100mM MOPS緩衝液pH7.0で洗浄した。

官能基化を確認(rèn)するために、30μLのNEB緩衝液3.1、10μLのBamHIを有する260μLのヌクレアーゼフリー水中に懸濁することにより、官能基化ペイロードをビーズサンプルから切り離した。37℃にて1時(shí)間インキュベートした後、サンプルを2×150μLずつに等分(スプリット)した。5μLのRNase Aを添加し、そしてサンプルを37℃にてさらに1時(shí)間インキュベートし、次いでビーズをペレット化した。上清を清潔なチューブに移し、15μLの3M酢酸ナトリウム(pH5.2)および375μLの100%エタノールを加えた。サンプルを?20℃にて一晩沈殿させ、次いでペレット化し、500μLの70%エタノールで洗浄し、そして20分間風(fēng)乾させた。ペレットを20μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、20μLの変性ローディング染料を加えた(95%ホルムアミド、0.1%キシレンシアノール、0.1%ブロムフェノールブルー、20mM トリス?HCl pH7.5)。サンプルを95℃にて5分間加熱し、次いで4℃に冷卻した。サンプルをTBE尿素ゲルにロードし、100Vで75分間泳動(dòng)した。

図6に示されるように、遊離する染色された成分は処理されたサンプル中に見(jiàn)られ、ともにライゲートされた切斷可能なリンカー、機(jī)能的なコアおよび染料を有し、未ライゲートサンプルに存在する遊離5?FAMアジドの存在よりも、官能基化され放出されたコアを示す。

別に、官能基化ビーズのさらに2つの100μL部分を乾燥アセトニトリル(MeCN、Sigma Aldrich)で3回洗浄した。一方の部分を、MeCN中の1mMフルオレセインイソチオシアネート異性體1(Sigma Aldrich)中に、MeCN中のトリエチレンジアミン(Sigma Aldrich)の10mg/mL溶液0.6μLと共に懸濁した。37℃にて一晩回転させた後、ビーズをMeCNで3回洗浄し、次いで100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH7.5で3回洗浄した。官能基化を確認(rèn)するために、サンプルを上記のように酵素的に切斷し、TBEゲル上で泳動(dòng)した。フルオロフォアを観察するために、Syngene InGenius3ゲルドックシステムを使用してゲルを畫(huà)像化し、次いで、TBE中の50μLの1×Sybr goldで染色した。次に第二の畫(huà)像を記録した。

図7に示すように、RNase Aで処理した消化サンプルにおいて、染料なしのコントロールと比較して強(qiáng)いシグナルが見(jiàn)られ、これは切斷された化合物の官能基化を示す。

(8)スプリット?アンド?プール法を用いたタグ付けを伴うビーズ上の100個(gè)のメンバーの機(jī)能的ライブラリの構(gòu)築) アジド官能基化ビーズのストックを、実施例4のセクション3に記載したように捕捉オリゴで官能基化した。次いで、このビーズストックを、切斷可能なペイロードを有する切斷可能なオリゴ(5’ATTCCCCTAGCTATGCAAGTrGrArGRrArArGrUX3’、ここでX=3’?(O?プロパルギル)?アデノシン(ADTBio))と、実施例4(セクション4)に記載されているのと同じ技術(shù)を使用してライゲートした。血球計(jì)により、ビーズの數(shù)は5.6×10⁶ビーズ/mLであると測(cè)定された。このストック200μLを、ディープ96ウェルプレート(Fisher)の10個(gè)の別個(gè)のウェルに添加した。以下の説明では、特記しない限り、全てのストック溶液は100mM MOPS pH7.0中で調(diào)製した。プレートを遠(yuǎn)心分離し、140μLの100mM MOPS pH7.0、100mMを各占有ウェルに添加し、続いて20μLの50mMストックのトリス(3?ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(Sigma-Aldrich)および10μLの20mMストックの20mM硫酸銅(II)(Sigma-Aldrich)を添加した。

10個(gè)の個(gè)々に選択されたアジド(10μLの50mM DMSO、Enamine)の1つをそれぞれの別個(gè)の占有されたウェルに加えた。20μLの100mMストックのアスコルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)を添加し、そして平らな密封キャップ(Fisher)を使用してプレートを密封した。プレートを振盪しながら室溫にて18時(shí)間インキュベートした。次いでプレートを遠(yuǎn)心分離し、各占有ウェルを3×1mLのヌクレアーゼフリー水(NFW、Fisher)で洗浄し、次いで250μLのクイックリガーゼ緩衝液2×(NEB)に再懸濁した。

200μLの50mMストックのコードオリゴ(配列GAAGGGTCGACTCCGXXXXXXXXXXGATGGGCATCATCCTを含み、ここでXXXXXXXXXは、20個(gè)のユニークなコードオリゴのセレクションから選ばれたヌクレオチド(A、C、GまたはT)のランダム配列を表し、それぞれIntegrated DNA Technologies(IDT)から入手)を各ウェルに加えた。50μLの100μMスプリンティングオリゴ(CTT AGT CGA CCC GGC AGG ATG ATG CCC AT/3ddC/,/3ddC=ジデオキシシチジン、IDT)を2.5μLのクイックリガーゼ(NEB)と共に加えた。プレートを密封し、そして振盪しながら37℃にてインキュベートした。

10個(gè)のウェルに渡るビーズの各個(gè)々の集団は、特定のアジドと結(jié)び付けられたユニークなDNA配列でコード化されており、用いたビルディングブロックをスクリーニング後に追跡して化合物の構(gòu)造を決定することを可能とした。2時(shí)間インキュベートした後、各ウェルを3×1mLのNFWで洗浄し、200μLの200mM酢酸ナトリウム、pH5.5に再懸濁した。次いで、各ウェルの內(nèi)容物を15mLの遠(yuǎn)心分離管內(nèi)に2mLの混合プールとして一緒に合わせ、ボルテックスによって完全に混合した後、新たなディープ96ウェルプレート上の10個(gè)の別個(gè)のウェルに200μLずつに等分(スプリット)した。プレートを遠(yuǎn)心分離し、ビーズを190μLの200mM酢酸ナトリウムpH5.5に再懸濁した。個(gè)々に選択された10個(gè)のアルデヒドのうちの1つのストック(83μLの50mM DMSOストック、Enamine)を個(gè)々のウェルに添加した。次いで、26μLの10mg/mLストックのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(200mM酢酸ナトリウムpH5.5(Sigma-Aldrich)中)を各占有ウェルに添加した。プレートを密封し、振盪しながら室溫で18時(shí)間インキュベートした。全てのウェルをヌクレアーゼフリー水で3×1mL洗浄し、次いで250μLのクイックリガーゼ緩衝液に再懸濁し、そしてアジドブロックについて前述したのと同じプロセスを用いて、各ウェルをユニークなコードオリゴとライゲートした。次いで、各ウェルを3×1mLのNFWで洗浄し、200μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した後、15mL遠(yuǎn)心チューブ中の2mLストックにプールした。ビーズをペレット化し、200μLの2×クイックリガーゼ緩衝液に再懸濁した。200μLの100μMストックのオリゴ(配列CGGGTCGACTTCGGTTAGACTTTCGGACCTGATGGGCATCATCCTを有する)を、10μLのクイックリガーゼ(New England Biolabs)と共に添加した。次いでビーズを回転させながら37℃にて2時(shí)間インキュベートし、次いで1mLの10mMトリスHCl+1mM EDTA pH7.5で3回洗浄した。ビーズを1mLのトリス緩衝液に再懸濁し、次いで必要になるまで4℃にて保存した。

(同等) 前述の説明は、本発明の現(xiàn)在好ましい実施形態(tài)を詳述している。これらの説明を考慮すれば、それらの実施における多數(shù)の改変および変形が當(dāng)業(yè)者には想起される。それらの改変および変形は、添付の特許請(qǐng)求の範(fàn)囲內(nèi)に包含されることが意図されている。