在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法
閱讀：414發(fā)布：2020-05-11
專利匯可以提供在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 屬于缺 氧 性血睪屏障通透作用機(jī)制技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，建立低氧誘導(dǎo)C57BL/6和睪丸mTOR單基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型，分離并收集mTOR基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株，體外運(yùn)用western?blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR等技術(shù)佐證mTOR對(duì)JAM-B調(diào)節(jié)作用的潛在分子機(jī)制。本發(fā)明明確缺氧抑制性活化的代謝平衡標(biāo)記分子mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用及其對(duì)活化JAM-B的表達(dá)的分子機(jī)制，為 治療 缺氧性血睪屏障通透提供理論依據(jù)和治療策略。，下面是在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
步驟一，使用睪丸特異性mTOR單基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠為對(duì)象；通過(guò)低氧誘導(dǎo)構(gòu)建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況和JAM-B表達(dá)水平；
步驟二，運(yùn)用mTOR阻斷劑作為手段，將C57BL/6小鼠分為兩組；一組行mTOR阻斷劑處理；
另一組以生理鹽水作為對(duì)照；比較兩處理組小鼠在低氧誘導(dǎo)后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達(dá)水平；
步驟三，分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細(xì)胞作為研究對(duì)象；體外低氧暴露下，運(yùn)用westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR技術(shù)，比較刺激后兩組支持細(xì)胞分泌JAM-B的能力，體外佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR抑制支持細(xì)胞表達(dá)JAM-B的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制；
步驟四，體外低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代培養(yǎng)細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株TM4；比較兩刺激組間JAM-B的表達(dá)水平；
步驟五，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對(duì)JAM-B的活化作用；
步驟六，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR作用后，運(yùn)用野生型小鼠作為研究對(duì)象，使用mTOR重組蛋白體內(nèi)促進(jìn)mTOR表達(dá)，分析比較mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透潛在的效果。
2.如權(quán)利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，步驟五中，所述探尋mTOR對(duì)JAM-B的活化機(jī)制的方法為：
①qPCR和WB明確小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB表達(dá)水平，通過(guò)激活HBTBP小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB來(lái)檢測(cè)JAM-B表達(dá)，佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B是否依賴TFEB失活予以實(shí)現(xiàn)；
②通過(guò)WB提示mTOR激活后支持細(xì)胞HIF-1α活化程度顯著高于對(duì)照組支持細(xì)胞，并且HIF-1α結(jié)合JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B表達(dá)是否依賴HIF-1α激活予以完成。
3.如權(quán)利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的作用的方法包括：
(1)建立低氧誘導(dǎo)的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型：
20至25g雄性小鼠采用11.5％氧含量低氧處理，每組共20只小鼠；分別于0、15、30、60天后分析小鼠的血睪屏障及曲精小管病損指標(biāo)，根據(jù)指標(biāo)初步斷定模型的建立是否成功；
(2)觀察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧誘導(dǎo)之后的生理變化：
低氧誘導(dǎo)mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后開(kāi)始觀察小鼠的活動(dòng)狀況，并于0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)將兩組小鼠處死，分別收集兩組小鼠低氧誘導(dǎo)不同時(shí)間的小鼠附睪曲精小管組織和性腺組織，ELISA檢測(cè)兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PI3K/Akt/mTOR途徑指標(biāo)Akt、RagA、Rhe?B和mTORC1，觀察兩組小鼠曲精小管和性腺大體形態(tài)變化及HE染色、透射電鏡下曲精小管、性腺病理改變和血睪屏障結(jié)構(gòu)改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡；
(3)分析mTOR阻斷劑在低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透中的作用：
將野生型小鼠分為兩組，一組體內(nèi)注射mTOR阻斷劑，另一組體內(nèi)注射生理鹽水后同時(shí)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)，比較兩組小鼠刺激0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)曲精小管和血睪屏障病損程度。
4.如權(quán)利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述體外明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用的方法包括：
(1)分離野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持細(xì)胞：小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠曲精小管支持細(xì)胞上mTOR的表達(dá)、體外檢測(cè)低氧誘導(dǎo)野生型及mTOR基因敲除小鼠原代細(xì)胞JAM-B的表達(dá)水平；
(2)體外檢測(cè)低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系后JAM-B表達(dá)水平：分別用單獨(dú)低氧和低氧+重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系，比較兩刺激組細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述體外檢測(cè)低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系后JAM-B表達(dá)水平：分別用單獨(dú)低氧和低氧+重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系，比較兩刺激組細(xì)胞包括：
1)ELISA檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞上清JAM-B表達(dá)水平；
2)qPCR檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-B?mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；
3)WB檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-B蛋白表達(dá)水平。
6.如權(quán)利要求4所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，所述小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法為：將10只8周齡體重為
20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血處死，分別附睪注射不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液5ml-8ml，輕柔小鼠睪丸部2-3min，無(wú)菌條件下，剪碎睪丸，用注射器抽取睪丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)并用顯微鏡觀察細(xì)胞生存狀態(tài)，6h貼壁細(xì)胞即為支持細(xì)胞并換液。
7.如權(quán)利要求5所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，所述流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠曲精小管支持細(xì)胞上mTOR的表達(dá)的方法為：
收集小鼠曲精小管支持細(xì)胞，將得到的細(xì)胞用anti-FcγR處理，4℃30分鐘，封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，按照抗體使用說(shuō)明書(shū)要求，加入適量的ATP與Trx熒光抗體于細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗滌兩遍，洗去多余抗體，最后用100ulPBS重懸，標(biāo)記好的細(xì)胞用FACSCanto?II流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行分析。
8.如權(quán)利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述體外佐證mTOR對(duì)JAM-B調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)理具體包括：
(1)比較低氧誘導(dǎo)mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)小鼠睪丸曲精小管組織中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)活化程度：用低氧分別對(duì)mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，在0h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠后分離小鼠睪丸曲精小管組織，WB檢測(cè)比較兩組小鼠誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化程度，篩選出缺氧性血睪屏障通透發(fā)病中mTOR下游信號(hào)通路具體活化的信號(hào)途徑，進(jìn)而從體內(nèi)明確mTOR下游效應(yīng)分子TFEB和P70S6K1對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用；
(2)檢測(cè)低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持細(xì)胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)活化程度：分離mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代細(xì)胞，并用低氧對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，比較低氧曝露兩組細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化水平；
(3)比較低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)表達(dá)水平：分別用單獨(dú)低氧或聯(lián)合重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系，比較兩刺激組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑的活化情況；
(4)評(píng)價(jià)低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路阻斷劑對(duì)JAM-B產(chǎn)生的影響：選取精母細(xì)胞系作為研究對(duì)象，ELISA、WB實(shí)驗(yàn)比較低氧、mTOR單抗、低氧+mTOR單抗、低氧+mTOR單抗+TFEB、低氧+mTOR單抗+HIF-1α刺激組刺激細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生JAM-B的能力。
9.如權(quán)利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述體內(nèi)分析重組mTOR蛋白激活JAM-B表達(dá)對(duì)缺氧性血睪屏障通透可能的治療效果包括：在明確mTOR激活JAM-B表達(dá)的分子基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步采用野生型小鼠作為對(duì)象，將其分為兩組，一組通過(guò)尾靜脈注射的方式注射重組mTOR蛋白，另一組用IgG作為對(duì)照，而后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)。
10.如權(quán)利要求9所述在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，其特征在于，進(jìn)一步包括：
(1)比較兩組小鼠在低氧誘導(dǎo)后睪丸曲精小管和血睪屏障病損狀況：
分別在兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后的0h，24h，48h處死小鼠，分離其睪丸組織，石蠟包埋并切片，H/E染色顯示兩組小鼠附睪組織壞死程度，免疫組化染色顯示其生殖細(xì)胞凋亡程度及透射電鏡下睪丸曲精小管和血睪屏障病理改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡；
(2)觀察兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后JAM-B表達(dá)情況：
在低氧誘導(dǎo)兩組小鼠的0h，24h，48h處死小鼠，分別收集性腺、睪丸組織，qPCR及免疫組化分析兩組小鼠睪丸組織中JAM-B的表達(dá)情況，比較其曲精小管中JAM-B的水平，明確重組單抗mTOR是否存在治療作用，進(jìn)一步佐證mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用。
在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于缺氧性血睪屏障通透作用機(jī)制技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法。
背景技術(shù)
[0002] 目前，最接近的現(xiàn)有技術(shù)：近年來(lái)移居青藏鐵路沿線的人口越來(lái)越多，高原缺氧(乏氧性缺氧)環(huán)境對(duì)男性移居者生殖功能有顯著負(fù)面影響，大量關(guān)于人類與大鼠精子生成數(shù)量減少現(xiàn)象已有報(bào)道。以上資料只是表明缺氧引起缺氧性精子生成減少(hypoxic?spermatogenesis?reduction,HSR)，但具體機(jī)制并不清楚。支持細(xì)胞之間血睪屏障(Blood-Testis-Barrier,BTB)是精子生成的重要屏障，其中緊密連接(Tight?junction,TJ)分子通過(guò)及時(shí)的拆卸和重組，確保精母細(xì)胞通過(guò)BTB進(jìn)入曲精小管腔，所以，如何維持血睪屏障TJ完整是精子生成順利進(jìn)行的關(guān)鍵。在前期我們模擬海拔5000米低氧曝露小鼠60天，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸曲精小管中支持細(xì)胞BTB通透性顯著增加(hypoxic?blood-testis-barrier?permeability,HBTBP)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血睪屏障TJ分子mRNA與蛋白表達(dá)顯著下降，1％氧含量培養(yǎng)小鼠支持細(xì)胞48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠支持細(xì)胞電阻顯著降低，TJ分子轉(zhuǎn)移至胞漿，且蛋白表達(dá)明顯降低。因此，低氧通過(guò)抑制小鼠TJ分子進(jìn)而誘導(dǎo)血睪屏障通透，但是低氧抑制緊密連接分子的確切機(jī)制尚不清楚。
[0003] 缺氧抑制緊密連接的機(jī)制在炎性腸病、酒精性脂肪肝、食管炎和缺血性腦卒中廣泛報(bào)道，其機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)吞和降解緊密連接蛋白、緊密連接蛋白表達(dá)減少。但是缺氧抑制支持細(xì)胞緊密連接的機(jī)制尚不明確，查閱文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧抑制睪丸和支持細(xì)胞mTORC1(mechanistic?Target?Of?Rapamycin?complex?1)表達(dá)。mTORC1是細(xì)胞對(duì)外環(huán)境應(yīng)激(如饑餓)作出反應(yīng)并控制合成與分解代謝平衡的關(guān)鍵分子。在營(yíng)養(yǎng)充足條件下，氨基酸激活Rheb-GTP，然后活化mTORC1。同時(shí)，氨基酸激活的RagA/B招募mTORC1聚集于溶酶體膜上。因此，以上兩個(gè)途徑共同激活mTORC1。激活后的mTORC1磷酸化TFEB(Transcription?factor?EB,堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄家族成員)，磷酸化的TFEB不能結(jié)合CLEAR(Coordinated?lysosomal?expression?and?regulation,溶酶體合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū))元件。因此，溶酶體合成受限，最終導(dǎo)致內(nèi)吞的胞外蛋白和胞膜上的緊密連接蛋白一起不能被溶酶體降解。饑餓條件下，mTOR從溶酶體膜上易位至胞漿并處于失活狀態(tài)。去磷酸化的TFEB結(jié)合CLEAR元件并誘導(dǎo)溶酶體合成，充足的溶酶體降解內(nèi)吞的緊密連接蛋白并產(chǎn)生細(xì)胞所需的氨基酸。以上資料只是表明mTORC1從溶酶體膜上解離，酶活性降低，而非mTORC1表達(dá)減少。
[0004] 眾所周知，HIF-1α(Hypoxia?inducible?factor)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵介質(zhì)，在缺氧細(xì)胞中普遍表達(dá)，以芳基烴受體(Aryl?hydrocarbon?receptor,AHR)異二聚體形式存在；在正常氧含量下，脯氨酰羥化酶(Prolyl-hydroxylases,PHD)使用分子氧作為底物使HIF-1α的脯氨酸殘基羥基化，羥基化的HIF-1α被范希佩爾林腫瘤抑制物(Von?Hippel-Lindau?tumor?suppressor,VHL)識(shí)別和降解。大多數(shù)條件下，缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)。但是在一些特殊細(xì)胞類型和缺氧程度較重的細(xì)胞中，HIF-1α表達(dá)是降低的；例如1％氧含量曝露食管上皮細(xì)胞48小時(shí)后HIF-1α顯著減少；0.5％氧含量曝露星形膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后HIF-1α降低；本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)1％氧含量暴露支持細(xì)胞48小時(shí)后HIF-1α表達(dá)顯著下降；提示HIF-1α上游可能存在調(diào)控分子。相對(duì)于mTOR/HIF-1α途徑參與腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性病變、肺動(dòng)脈高壓和慢性腎衰竭疾病發(fā)生的廣泛報(bào)道，有關(guān)其在血睪屏障中的功能報(bào)道還很少。一是缺氧特別是高原低氧引起的血睪屏障通透報(bào)道很少，大家關(guān)注的也少；二是疾病模型特殊，相比缺血性腦卒中、炎性腸病、食管炎等疾病中血腦屏障通透和血管上皮細(xì)胞緊密連接缺失，高原低氧引起的血睪屏障通透很少報(bào)道。
[0005] mTOR/HIF-1α途徑調(diào)控的靶基因涉及血管生成、糖酵解、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞生長(zhǎng)。近年來(lái)，有關(guān)HIF-1α調(diào)控Claudin、Occludin和ZO-1(均為緊密連接分子)的研究均已報(bào)道。連接黏附分子(junctional?adhesion?molecule,JAM)屬于免疫球蛋白超家族成員，JAM家族成員包括了JAM-A和JAM-B，其中JAM-A與精子尾形成有關(guān)，JAM-A缺失會(huì)引起精子運(yùn)動(dòng)能力下降；JAM-B是精母細(xì)胞通過(guò)BTB-支持細(xì)胞頂端特化區(qū)域(Apical?ectoplasmic?specialization,AES)進(jìn)入曲精小管腔的關(guān)鍵緊密連接分子，JAM-B缺失會(huì)出現(xiàn)大量精母細(xì)胞凋亡，JAM-B的及時(shí)拆卸/重組對(duì)于精母細(xì)胞順利遷移至關(guān)重要。
[0006] 綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)缺氧能夠引起缺氧性精子生成減少(hypoxic?spermatogenesis?reduction,HSR)的具體機(jī)制并不清楚，缺氧性精子生成減少的發(fā)病原因不明，mTOR在其中作用的相關(guān)文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道。
[0007] 解決上述技術(shù)問(wèn)題的難度：mTOR基因敲除小鼠繁殖力低，需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培育才能達(dá)到足夠數(shù)量的mTOR敲除小鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
[0008] 解決上述技術(shù)問(wèn)題的意義：將給高原居住以及急進(jìn)高原的男性人群提供生殖保障。從支持細(xì)胞的角度來(lái)改善低氧引起的精子生成減少，是低氧引起精子生成減少發(fā)病機(jī)制的延續(xù)。
發(fā)明內(nèi)容
[0009] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法。
[0010] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟：
[0011] 步驟一，結(jié)合臨床缺氧曝露下睪丸mTOR下調(diào)的結(jié)果，使用睪丸特異性mTOR單基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象。通過(guò)低氧誘導(dǎo)構(gòu)建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況和JAM-B表達(dá)水平，初步了解mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透模型的影響。
[0012] 步驟二，運(yùn)用mTOR阻斷劑作為研究手段，將C57BL/6小鼠分為兩組。一組行mTOR阻斷劑處理；另一組以生理鹽水作為對(duì)照；比較兩處理組小鼠在低氧誘導(dǎo)后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用。
[0013] 步驟三，分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細(xì)胞作為研究對(duì)象。體外低氧暴露下，運(yùn)用westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR技術(shù)，比較刺激后兩組支持細(xì)胞分泌JAM-B的能力，體外佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR抑制支持細(xì)胞表達(dá)JAM-B的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制。
[0014] 步驟四，體外低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代培養(yǎng)細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株TM4；比較兩刺激組間JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步深入明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用。
[0015] 步驟五，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對(duì)JAM-B的活化作用后，進(jìn)一步探尋其可能活化機(jī)制。
[0016] 步驟六，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR作用后，運(yùn)用野生型小鼠作為研究對(duì)象，使用mTOR重組蛋白體內(nèi)促進(jìn)mTOR表達(dá)，分析比較mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透潛在的治療意義和可能的治療效果。
[0017] 進(jìn)一步，步驟五中，所述探尋mTOR對(duì)JAM-B的活化機(jī)制的方法為：
[0018] 一方面，qPCR和WB明確小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB表達(dá)水平，進(jìn)一步通過(guò)激活HBTBP小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB來(lái)檢測(cè)JAM-B表達(dá)，從而佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B是否依賴TFEB失活予以實(shí)現(xiàn)；另一方面，通過(guò)WB提示mTOR激活后支持細(xì)胞HIF-1α活化程度顯著高于對(duì)照組支持細(xì)胞，并且HIF-1α結(jié)合JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B表達(dá)是否依賴HIF-1α激活予以完成。
[0019] 進(jìn)一步，所述明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的作用的方法包括：
[0020] (1)建立低氧誘導(dǎo)的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型：
[0021] mTOR基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小組從南方模式生物科技有限公司定制。野生型對(duì)照(WT)小鼠(C57BL/6)購(gòu)買(mǎi)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。20至25g(6至8周齡)雄性小鼠低氧處理(采用11.5％氧含量)，每組共20只小鼠。分別于0、15、30、60天后分析小鼠的血睪屏障及曲精小管病損指標(biāo)，根據(jù)這些指標(biāo)初步斷定模型的建立是否成功。
[0022] (2)觀察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧誘導(dǎo)之后的生理變化：
[0023] 低氧誘導(dǎo)mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后開(kāi)始觀察小鼠的活動(dòng)狀況，并于0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)將兩組小鼠處死，分別收集兩組小鼠低氧誘導(dǎo)不同時(shí)間的小鼠附睪曲精小管組織和性腺組織，ELISA檢測(cè)兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PI3K/Akt/mTOR途徑指標(biāo)(Akt、RagA、RheB和mTORC1)，觀察兩組小鼠曲精小管和性腺大體形態(tài)變化及HE染色、透射電鏡下曲精小管、性腺病理改變和血睪屏障結(jié)構(gòu)改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡等。
[0024] (3)分析mTOR阻斷劑在低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透中的作用：
[0025] 將野生型小鼠分為兩組，一組體內(nèi)注射mTOR阻斷劑，另一組體內(nèi)注射生理鹽水后同時(shí)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)，比較兩組小鼠刺激0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)曲精小管和血睪屏障病損程度。
[0026] 進(jìn)一步，所述體外明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用的方法包括：
[0027] (Ⅰ)分離野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持細(xì)胞：小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠曲精小管支持細(xì)胞上mTOR的表達(dá)、體外檢測(cè)低氧誘導(dǎo)野生型及mTOR基因敲除小鼠原代細(xì)胞JAM-B的表達(dá)水平。
[0028] (Ⅱ)體外檢測(cè)低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系(支持細(xì)胞)后JAM-B表達(dá)水平：分別用單獨(dú)低氧和低氧+重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系(支持細(xì)胞)，比較兩刺激組細(xì)胞：
[0029] 1)ELISA檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞上清JAM-B表達(dá)水平；
[0030] 2)qPCR檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-BmRNA的轉(zhuǎn)錄水平；
[0031] 3)WB檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-B蛋白表達(dá)水平。
[0032] 進(jìn)一步，步驟(Ⅰ)中，所述小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法為：
[0033] 將10只8周齡體重約為20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血處死，分別附睪注射不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液5ml-8ml，輕柔小鼠睪丸部2-3min，無(wú)菌條件下，剪碎睪丸，用注射器抽取睪丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)并用顯微鏡觀察細(xì)胞生存狀態(tài)，6h貼壁細(xì)胞即為支持細(xì)胞并換液。
[0034] 進(jìn)一步，步驟(Ⅰ)中，所述流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠曲精小管支持細(xì)胞上mTOR的表達(dá)的方法為：
[0035] 收集小鼠曲精小管支持細(xì)胞，將得到的細(xì)胞用anti-FcγR處理，4℃30分鐘，封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，按照抗體使用說(shuō)明書(shū)要求，加入適量的ATP與Trx(支持細(xì)胞標(biāo)志)熒光抗體于細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗滌兩遍，洗去多余抗體，最后用100ulPBS重懸，標(biāo)記好的細(xì)胞用FACSCantoII流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行分析。
[0036] 進(jìn)一步，所述體外佐證mTOR對(duì)JAM-B調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)理具體包括：
[0038] 用低氧分別對(duì)mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，在0h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠后分離小鼠睪丸曲精小管組織，WB檢測(cè)比較兩組小鼠誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化程度，篩選出缺氧性血睪屏障通透發(fā)病中mTOR下游信號(hào)通路具體活化的信號(hào)途徑，進(jìn)而從體內(nèi)明確mTOR下游效應(yīng)分子TFEB和P70S6K1對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用。
[0039] (2)檢測(cè)低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持細(xì)胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)活化程度
[0040] 參照實(shí)驗(yàn)方法中第二部分第1節(jié)中的曲精小管支持細(xì)胞的分離方法分離mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代細(xì)胞，并用低氧對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，比較低氧曝露兩組細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化水平。
[0041] (3)比較低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系(精母細(xì)胞)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)表達(dá)水平
[0042] 分別用單獨(dú)低氧或聯(lián)合重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系(支持細(xì)胞)，比較兩刺激組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑的活化情況。
[0043] (4)評(píng)價(jià)低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路阻斷劑對(duì)JAM-B產(chǎn)生的影響
[0044] 選取精母細(xì)胞系作為研究對(duì)象，ELISA、WB實(shí)驗(yàn)比較低氧、mTOR單抗、低氧+mTOR單抗、低氧+mTOR單抗+TFEB(各信號(hào)通路阻斷劑)、低氧+mTOR單抗+HIF-1α(各信號(hào)通路阻斷劑)刺激組刺激細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生JAM-B的能力
[0045] 進(jìn)一步，所述體內(nèi)分析重組mTOR蛋白激活JAM-B表達(dá)對(duì)缺氧性血睪屏障通透可能的治療效果具體包括：在明確mTOR激活JAM-B表達(dá)的分子基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步采用野生型小鼠作為研究對(duì)象，將其分為兩組，一組通過(guò)尾靜脈注射的方式注射重組mTOR蛋白，另一組用IgG作為對(duì)照，而后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)：
[0046] (1)比較兩組小鼠在低氧誘導(dǎo)后睪丸曲精小管和血睪屏障病損狀況：
[0047] 分別在兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后的0h，24h，48h處死小鼠，分離其睪丸組織，石蠟包埋并切片，H/E染色顯示兩組小鼠附睪組織壞死程度，免疫組化染色顯示其生殖細(xì)胞凋亡程度及透射電鏡下睪丸曲精小管和血睪屏障病理改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡等。
[0048] (2)觀察兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后JAM-B表達(dá)情況：
[0049] 在低氧誘導(dǎo)兩組小鼠的0h，24h，48h處死小鼠，分別收集性腺、睪丸組織，qPCR及免疫組化分析兩組小鼠睪丸組織中JAM-B的表達(dá)情況，比較其曲精小管中JAM-B的水平，明確重組單抗mTOR是否存在治療作用，進(jìn)一步佐證mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用。
[0050] 綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：本發(fā)明預(yù)實(shí)驗(yàn)證明缺氧暴露下，小鼠睪丸mTOR表達(dá)降低，且血睪屏障通透性增加，表明缺氧抑制mTORC1的表達(dá)在HBTBP發(fā)生中起著十分關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)了巨胞飲-溶酶體系統(tǒng)。所以研究將焦點(diǎn)匯聚在mTORC1對(duì)巨胞飲調(diào)控研究上。綜上，缺氧抑制的m?TOR表達(dá)可能也通過(guò)TFEB介導(dǎo)的溶酶體合成來(lái)激活巨胞飲-溶酶體系統(tǒng)，繼而降解溶酶體包裹的緊密連接蛋白。
[0051] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)MHY1485(mTOR特異性激動(dòng)劑)處理支持細(xì)胞能激活HIF-1α，上述結(jié)果提示支持細(xì)胞可能出現(xiàn)m?TOR/HIF-1α途徑，但是m?TOR/HIF-1α途徑并未在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證。
[0052] 與此同時(shí)，本發(fā)明利用CHIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以結(jié)合到JAM-B基因啟動(dòng)子上，提示在缺氧性血睪屏障通透中，HIF-1α與JAM-B可能存在調(diào)控機(jī)制。課題組前期已報(bào)道精母細(xì)胞是缺氧性精子生成減少過(guò)程中最敏感的生精細(xì)胞，那么JAM-B內(nèi)吞增加或者表達(dá)減少均會(huì)導(dǎo)致精母細(xì)胞凋亡。因此擬假設(shè)，低氧抑制m?TORC1表達(dá)后；一方面，m?TORC1表達(dá)減少激活巨胞飲-溶酶體系統(tǒng)降解JAM-B；另一方面，m?TORC1表達(dá)減少后，HIF-1α/JAM-B途徑受限，因此，JAM-B表達(dá)降低；兩方面共同作用促進(jìn)了支持細(xì)胞緊密連接缺失，加重缺氧性血睪屏障通透疾病的程度。
[0053] 本發(fā)明提供的一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，明確了缺氧抑制性活化的代謝平衡標(biāo)記分子mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用及其對(duì)活化JAM-B的表達(dá)的分子機(jī)制，為治療缺氧性血睪屏障通透提供必要的理論依據(jù)和新的治療策略。
[0054] 迄今為止，缺氧性精子生成減少的發(fā)病原因不明，mTOR在其中作用的相關(guān)文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)低氧誘導(dǎo)的mTOR基因敲除小鼠及野生型小鼠這一缺氧性血睪屏障通透模型，將有助于進(jìn)一步研究其在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。
[0055] 目前睪丸扭轉(zhuǎn)和自身免疫性睪丸炎的研究中，JAM-B作為緊密連接蛋白參與發(fā)病已經(jīng)清楚，但在缺氧性血睪屏障通透中沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具體作用，也不知曉其具體調(diào)節(jié)機(jī)制。在本發(fā)明的預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)佐證：在低氧誘導(dǎo)的缺氧性血睪屏障通透小鼠模型中，mTOR基因敲除小鼠血睪屏障病損程度較對(duì)照組嚴(yán)重，提示mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用。了解明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的作用及機(jī)制有助于對(duì)此疾病深入的了解，并為未來(lái)治療此疾病提供更安全更有效的治療途徑和手段。附圖說(shuō)明
[0057] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)路線示意圖。
[0058] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧誘導(dǎo)血睪屏障通透示意圖；
[0059] 圖中：A.伊文斯藍(lán)滲出；B.透射電鏡觀察睪丸曲精小管支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)(放大倍數(shù)×3700)。
[0060] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧抑制緊密連接相關(guān)分子m?RNA和蛋白表達(dá)示意圖；
[0061] 圖中：A.Western?blot檢測(cè)對(duì)照組與11.5％氧含量+60d組睪丸組織Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白水平；B.qPCR檢測(cè)對(duì)照組與11.5％氧含量+60d組睪丸組織Claudin-5、Occludin、JAM-BmRNA水平。
[0062] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的TM4細(xì)胞曝露于21％氧含量和1％氧含量48h后的跨細(xì)胞電阻變化示意圖，＊p<0.05vs.21％O2.n＝6per?group。
[0063] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的免疫熒光染色并分別觀察21％氧含量+48h組與1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞緊密連接分子Claudin-5、Occludin、JAM-B分布及熒光強(qiáng)度示意圖。
[0064] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧抑制TM4細(xì)胞緊密連接相關(guān)分子Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白表達(dá)示意圖。
[0065] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧抑制睪丸和支持細(xì)胞mTORC1表達(dá)示意圖；
[0066] 圖中：A.WB法檢測(cè)海拔5000米曝露60天組小鼠睪丸mTOR；B.WB法檢測(cè)21％氧含量+48h組和1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞mTOR、RagA、RheB、AMPK和TSC2；C.平原對(duì)照組和海拔5000米曝露60天的mTORKO組小鼠睪丸伊文斯藍(lán)滲出。
[0067] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧誘導(dǎo)支持細(xì)胞巨胞飲介導(dǎo)的胞吞示意圖；
[0068] 圖中：A.WB法檢測(cè)21％氧含量+48h組和1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞Caveolin-1和α-adaptin；B.酶標(biāo)法檢測(cè)TM4細(xì)胞中Fdx70攝??；C.1μg/μl吖啶橙檢測(cè)21％氧含量+48h組和1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞溶酶體；D.21％氧含量+48h組和1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞溶酶體占比。
[0069] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例提供的低氧抑制TM4細(xì)胞m?TOR/HIF-1α途徑示意圖；
[0070] 圖中：A.WB檢測(cè)21％氧含量+6h、21％氧含量+12h、21％氧含量+24h、21％氧含量+48h、1％氧含量+6h、1％氧含量+12h、1％氧含量+24h、1％氧含量+48h組支持細(xì)胞HIF-1α；
B.WB檢測(cè)21％氧含量+48h和1％氧含量+48h組支持細(xì)胞m?TOR效應(yīng)分子p-m?TOR、p-4EBP1和p-P70S6K1；C.WB檢測(cè)1％氧含量+48h和1％氧含量曝露48h+MHY1485(mTOR特異性激動(dòng)劑)組支持細(xì)胞p-mTOR和HIF-1α表達(dá)。
B.WB檢測(cè)21％氧含量+48h和1％氧含量+48h組支持細(xì)胞m?TOR效應(yīng)分子p-m?TOR、p-4EBP1和p-P70S6K1；C.WB檢測(cè)1％氧含量+48h和1％氧含量曝露48h+MHY1485(mTOR特異性激動(dòng)劑)組支持細(xì)胞p-mTOR和HIF-1α表達(dá)。
[0071] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例提供的JAM-B是缺氧下支持細(xì)胞中HIF-1α的靶基因示意圖；
[0072] 圖中：A.Chip技術(shù)檢測(cè)21％O2+48h組和1％O2+48h組TM4細(xì)胞中HIF-1α和JAM-B啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia?responsive?element,HRE)結(jié)合能力；B.JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)HIF-1α與JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
具體實(shí)施方式
[0073] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0074] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的描述。
[0075] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的一種在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0076] S101：結(jié)合臨床缺氧曝露下睪丸mTOR下調(diào)的結(jié)果，使用睪丸特異性mTOR單基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象。通過(guò)低氧誘導(dǎo)構(gòu)建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況和JAM-B表達(dá)水平，初步了解mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透模型的影響。
[0077] S102：運(yùn)用mTOR阻斷劑作為研究手段，將C57BL/6小鼠分為兩組。一組行mTOR阻斷劑處理；另一組以生理鹽水作為對(duì)照；比較兩處理組小鼠在低氧誘導(dǎo)后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用。
[0078] S103：分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細(xì)胞作為研究對(duì)象。體外低氧暴露下，運(yùn)用western?blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR技術(shù)，比較刺激后兩組支持細(xì)胞分泌JAM-B的能力，體外佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR抑制支持細(xì)胞表達(dá)JAM-B的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制。
[0079] S104：體外低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代培養(yǎng)細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株TM4；比較兩刺激組間JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步深入明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用。
[0080] S105：在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對(duì)JAM-B的活化作用后，進(jìn)一步探尋其可能活化機(jī)制。
[0081] S106：在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR作用后，運(yùn)用野生型小鼠作為研究對(duì)象，使用mTOR重組蛋白體內(nèi)促進(jìn)mTOR表達(dá)，分析比較mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透潛在的治療意義和可能的治療效果。
[0082] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0083] 缺氧性血睪屏障通透(HBTBP)是以支持細(xì)胞緊密連接缺失、曲精小管結(jié)構(gòu)破損、生精上皮脫落為特征的綜合病癥。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)吞和緊密連接分子表達(dá)減少是緊密連接缺失的兩個(gè)重要機(jī)制。對(duì)其研究時(shí)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)HBTBP小鼠睪丸中，mTOR表達(dá)較對(duì)照組降低，且mTOR敲除小鼠血睪屏障通透性較對(duì)照組增加，表明阻斷mTOR致使更高程度緊密連接缺失及JAM-B(連接黏附分子2)減少。WB結(jié)果提示特異性激活支持細(xì)胞mTOR能夠激活HIF-1α，但還未在HBTBP模型中得到驗(yàn)證。所以本研究擬推測(cè)：缺氧抑制mTOR表達(dá)后，一方面激活巨胞飲并內(nèi)吞降解掉JAM-B；另一方面，通過(guò)HIF-1α/JAM-B途徑抑制JAM-B表達(dá)，以上兩方面促使緊密連接缺失，導(dǎo)致血睪屏障通透。
[0084] 為了驗(yàn)證此假設(shè)，本研究擬通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行：(1)結(jié)合缺氧曝露下睪丸mTOR下調(diào)的結(jié)果，使用睪丸特異性mTOR單基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象。通過(guò)低氧誘導(dǎo)構(gòu)建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況和JAM-B表達(dá)水平，初步了解mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透模型的影響。(2)運(yùn)用mTOR阻斷劑作為研究手段，將C57BL/6小鼠分為兩組。一組行mTOR阻斷劑處理；另一組以生理鹽水作為對(duì)照；比較兩處理組小鼠在低氧誘導(dǎo)后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用。(3)分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細(xì)胞作為研究對(duì)象。體外低氧暴露下，運(yùn)用western?blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、q?PCR技術(shù)，比較刺激后兩組支持細(xì)胞分泌JAM-B的能力。體外佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR抑制支持細(xì)胞表達(dá)JAM-B的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制。(4)體外低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代培養(yǎng)細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株TM4；比較兩刺激組間JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步深入明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用。(5)在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對(duì)JAM-B的活化作用后，進(jìn)一步探尋其可能活化機(jī)制。一方面，qPCR和WB明確小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB表達(dá)水平，進(jìn)一步通過(guò)激活HBTBP小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB來(lái)檢測(cè)JAM-B表達(dá)，從而佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B是否依賴TFEB失活予以實(shí)現(xiàn)；另一方面，通過(guò)WB提示mTOR激活后支持細(xì)胞HIF-1α活化程度顯著高于對(duì)照組支持細(xì)胞，并且HIF-1α結(jié)合JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B表達(dá)是否依賴HIF-1α激活予以完成。(6)運(yùn)用野生型小鼠作為研究對(duì)象，mTOR重組蛋白作為研究手段，體內(nèi)促進(jìn)mTOR表達(dá)；分析比較mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透潛在的治療意義和可能的治療效果。
[0085] 綜上，本研究將明確缺氧抑制性活化的代謝平衡標(biāo)記分子mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用及其對(duì)活化JAM-B的表達(dá)的分子機(jī)制，為治療缺氧性血睪屏障通透提供必要的理論依據(jù)和新的治療策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：
[0086] (一)研究方案
[0087] 1、研究目標(biāo)、內(nèi)容及問(wèn)題
[0088] 1.1研究目標(biāo)
[0089] 1)結(jié)合臨床缺氧曝露下睪丸mTOR下調(diào)的結(jié)果，使用mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)低氧的誘導(dǎo)構(gòu)建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況，JAM-B表達(dá)水平，初步了解mTOR在缺氧性血睪屏障通透模型中的作用；
[0090] 2)運(yùn)用mTOR阻斷劑作為研究手段，將C57BL/6小鼠分為兩組，一組行mTOR阻斷劑處理，另一組以生理鹽水作為對(duì)照，比較兩處理組小鼠在低氧誘導(dǎo)后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用；
[0091] 3)分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細(xì)胞作為研究對(duì)象，低氧體外刺激，運(yùn)用western?blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR技術(shù)，比較刺激后兩組支持細(xì)胞分泌JAM-B的能力，體外佐證缺氧性精子生成減少模型中，mTOR誘導(dǎo)支持細(xì)胞表達(dá)JAM-B的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制；
[0092] 4)體外低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代精母細(xì)胞系和小鼠精母細(xì)胞株，比較兩刺激組間JAM-B的表達(dá)水平，進(jìn)一步深入明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用；
[0093] 5)在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對(duì)JAM-B的活化作用后，進(jìn)一步探尋其可能活化機(jī)制。一方面，qPCR和WB明確小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB表達(dá)水平，進(jìn)一步通過(guò)激活HBTBP小鼠睪丸和支持細(xì)胞TFEB來(lái)檢測(cè)JAM-B表達(dá)，從而佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B是否依賴TFEB失活予以實(shí)現(xiàn)；另一方面，通過(guò)WB提示mTOR激活后支持細(xì)胞HIF-1α活化程度顯著高于對(duì)照組支持細(xì)胞，并且HIF-1α結(jié)合JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)佐證mTOR調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)JAM-B表達(dá)是依賴HIF-1α活化予以完成；
[0094] 6)在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR作用后，使用mTOR重組蛋白體內(nèi)促進(jìn)mTOR表達(dá)，分析比較mTOR對(duì)缺氧性血睪屏障通透的治療意義和可能的治療效果。
[0095] 1.2研究?jī)?nèi)容
[0096] 1)現(xiàn)象研究
[0097] 建立低氧誘導(dǎo)C57BL/6和睪丸mTOR單基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型，觀察野生型小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧誘導(dǎo)之后的生理變化及mTOR阻斷劑在缺氧性血睪屏障通透中的作用；
[0098] 2)機(jī)制研究
[0099] 分離并收集mTOR基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株，低氧體外刺激，分析并比較培養(yǎng)上清的JAM-B水平；低氧單獨(dú)或聯(lián)合mTOR刺激小鼠曲精小管原代支持細(xì)胞系和小鼠支持細(xì)胞株，比較不同刺激組細(xì)胞上清JAM-B的表達(dá)水平；結(jié)合CHIP結(jié)果，體外運(yùn)用westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR等技術(shù)佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR對(duì)JAM-B調(diào)節(jié)作用的潛在分子機(jī)制；
[0100] 3)治療研究
[0101] 在明確缺氧性血睪屏障通透中mTOR調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，運(yùn)用mTOR重組蛋白，體內(nèi)佐證mTOR在缺氧性血睪屏障通透中可能的治療效應(yīng)。
[0102] 1.3擬解決關(guān)鍵問(wèn)題
[0103] 1.3.1關(guān)鍵理論問(wèn)題：
[0104] 1)mTOR在缺氧性血睪屏障通透中誘導(dǎo)JAM-B表達(dá)，減輕疾病發(fā)生進(jìn)展的作用及機(jī)制；
[0105] 2)佐證缺氧性血睪屏障通透中mTOR的重要作用，明確mTOR重組蛋白的治療意義。
[0106] 1.3.2關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題：
[0107] 1)mTOR單基因敲除小鼠及缺氧性血睪屏障通透模型的建立；
[0108] 2)mTOR單基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)；
[0109] 3)westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR等技術(shù)的應(yīng)用。
[0110] 2、擬采取的研究方案及可行性分析
[0111] 2.1技術(shù)路線(如圖2所示)
[0112] 2.2實(shí)驗(yàn)方案
[0113] 聲明：以下實(shí)驗(yàn)中所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)內(nèi)容中，所有使用動(dòng)物均遵循我國(guó)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的相關(guān)規(guī)定。
[0114] 第一部分：明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用
[0115] 1.1建立低氧誘導(dǎo)的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型mTOR基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小組從南方模式生物科技有限公司定制。野生型對(duì)照(WT)小鼠(C57BL/6)購(gòu)買(mǎi)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。20至25g(6至8周齡)
[0116] 雄性小鼠低氧處理(采用11.5％氧含量)，每組共20只小鼠。分別于0、15、30、60天后分析小鼠的血睪屏障及曲精小管病損指標(biāo)，根據(jù)這些指標(biāo)初步斷定模型的建立是否成功。
[0117] 1.3觀察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧誘導(dǎo)之后的生理變化
[0118] 低氧誘導(dǎo)mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后開(kāi)始觀察小鼠的活動(dòng)狀況，并于0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)將兩組小鼠處死，分別收集兩組小鼠低氧誘導(dǎo)不同時(shí)間的小鼠附睪曲精小管組織和性腺組織，ELISA檢測(cè)兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PI3K/Akt/mTOR途徑指標(biāo)(Akt、RagA、RheB和mTORC1)，觀察兩組小鼠曲精小管和性腺大體形態(tài)變化及HE染色、透射電鏡下曲精小管、性腺病理改變和血睪屏障結(jié)構(gòu)改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡等。
[0119] 1.4分析mTOR阻斷劑在低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透中的作用
[0120] 將野生型小鼠分為兩組，一組體內(nèi)注射mTOR阻斷劑，另一組體內(nèi)注射生理鹽水后同時(shí)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)，比較兩組小鼠刺激0、15、30、60天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)曲精小管和血睪屏障病損程度。
[0121] 第二部分：體外明確mTOR對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)作用
[0122] 2.1分離野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持細(xì)胞：
[0123] 2.1.1小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
[0124] 將10只8周齡體重約為20-25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血處死，分別附睪注射不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液5ml-8ml，輕柔小鼠睪丸部2-3min，無(wú)菌條件下，剪碎睪丸，用注射器抽取睪丸液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)并用顯微鏡觀察細(xì)胞生存狀態(tài)，6h貼壁細(xì)胞即為支持細(xì)胞并換液。
[0125] 2.1.2流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠曲精小管支持細(xì)胞上mTOR的表達(dá)
[0126] 按照上述方法收集小鼠曲精小管支持細(xì)胞，將得到的細(xì)胞用anti-FcγR處理，4℃30分鐘，封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，按照抗體使用說(shuō)明書(shū)要求，加入適量的ATP與Trx(支持細(xì)胞標(biāo)志)熒光抗體于細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗滌兩遍，洗去多余抗體，最后用100ulPBS重懸，標(biāo)記好的細(xì)胞用FACSCanto?II流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行分析。
[0127] 2.1.3體外檢測(cè)低氧誘導(dǎo)野生型及mTOR基因敲除小鼠原代細(xì)胞JAM-B的表達(dá)水平[0128] 用低氧刺激兩組小鼠的曲精小管支持細(xì)胞，分別于0h，24h，48h：
[0129] (1)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中JAM-B的表達(dá)水平；
[0130] (2)qPCR檢測(cè)低氧刺激細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)JAM-BmRNA的轉(zhuǎn)錄水平；
[0131] (3)WB檢測(cè)刺激后細(xì)胞JAM-B蛋白表達(dá)水平
[0132] 2.2.體外檢測(cè)低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系(支持細(xì)胞)后JAM-B表達(dá)水平[0133] 分別用單獨(dú)低氧和低氧+重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系(支持細(xì)胞)，比較兩刺激組細(xì)胞：
[0134] (1)ELISA檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞上清JAM-B表達(dá)水平
[0135] (2)qPCR檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-B?mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；
[0136] (3)WB檢測(cè)兩刺激組細(xì)胞內(nèi)JAM-B蛋白表達(dá)水平
[0137] 第三部分：體外佐證mTOR對(duì)JAM-B調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)理
[0138] 3.1比較低氧誘導(dǎo)mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)小鼠睪丸曲精小管組織中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)活化程度
[0139] 用低氧分別對(duì)mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，在0h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠后分離小鼠睪丸曲精小管組織，WB檢測(cè)比較兩組小鼠誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化程度，篩選出缺氧性血睪屏障通透發(fā)病中mTOR下游信號(hào)通路具體活化的信號(hào)途徑，進(jìn)而從體內(nèi)明確mTOR下游效應(yīng)分子TFEB和P70S6K1對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用。
[0140] 3.2.檢測(cè)低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持細(xì)胞的TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)活化程度
[0141] 參照實(shí)驗(yàn)方法中第二部分第1節(jié)中的曲精小管支持細(xì)胞的分離方法分離mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代細(xì)胞，并用低氧對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，比較低氧曝露兩組細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化水平。
[0142] 3.3.比較低氧和重組mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞系(精母細(xì)胞)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)表達(dá)水平
[0143] 分別用單獨(dú)低氧或聯(lián)合重組mTOR蛋白刺激細(xì)胞系(支持細(xì)胞)，比較兩刺激組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑的活化情況。
[0144] 3.4評(píng)價(jià)低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透模型中，TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路阻斷劑對(duì)JAM-B產(chǎn)生的影響
[0145] 選取精母細(xì)胞系作為研究對(duì)象，ELISA、WB實(shí)驗(yàn)比較低氧、mTOR單抗、低氧+mTOR單抗、低氧+mTOR單抗+TFEB(各信號(hào)通路阻斷劑)、低氧+mTOR單抗+HIF-1α(各信號(hào)通路阻斷劑)刺激組刺激細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生JAM-B的能力
[0146] 第四部分：體內(nèi)分析重組mTOR蛋白激活JAM-B表達(dá)對(duì)缺氧性血睪屏障通透可能的治療效果
[0147] 在明確mTOR激活JAM-B表達(dá)的分子基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步采用野生型小鼠作為研究對(duì)象，將其分為兩組，一組通過(guò)尾靜脈注射的方式注射重組mTOR蛋白，另一組用IgG作為對(duì)照，而后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行低氧誘導(dǎo)：
[0148] 4.1比較兩組小鼠在低氧誘導(dǎo)后睪丸曲精小管和血睪屏障病損狀況
[0149] 分別在兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后的0h，24h，48h處死小鼠，分離其睪丸組織，石蠟包埋并切片，H/E染色顯示兩組小鼠附睪組織壞死程度，免疫組化染色顯示其生殖細(xì)胞凋亡程度及透射電鏡下睪丸曲精小管和血睪屏障病理改變，包括組織壞死程度，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞凋亡等。
[0150] 4.2觀察兩組小鼠低氧誘導(dǎo)后JAM-B表達(dá)情況
[0151] 在低氧誘導(dǎo)兩組小鼠的0h，24h，48h處死小鼠，分別收集性腺、睪丸組織，qPCR及免疫組化分析兩組小鼠睪丸組織中JAM-B的表達(dá)情況，比較其曲精小管中JAM-B的水平，明確重組單抗mTOR是否存在治療作用，進(jìn)一步佐證mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用。
[0152] 3、可行性分析
[0153] 3.1理論上的可行性：
[0154] 缺氧性血睪屏障通透(如睪丸扭轉(zhuǎn)和自身免疫性睪丸炎)是一種伴隨緊密連接缺失的疾病，大量文獻(xiàn)報(bào)道并佐證新型緊密連接蛋白JAM-B的突變與此疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，體內(nèi)激活或活化JAM-B后能夠明顯維持小鼠缺氧性血睪屏障完整，降低附睪曲精小管病損程度，提示JAM-B在睪丸扭轉(zhuǎn)和自身免疫性睪丸炎的重要地位，mTOR為絲氨酸/蘇氨酸激酶，它極有可能也參與缺氧性血睪屏障通透的發(fā)生。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧性血睪屏障通透小鼠睪丸mTOR較正常對(duì)照組顯著降低，mTOR基因敲除小鼠曲精小管組織損傷程度顯著高于野生型小鼠，提示mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用，因此運(yùn)用重組的mTOR單抗有可能延緩HBTBP的病理進(jìn)程；同時(shí)，WB結(jié)果提示低氧曝露小鼠睪丸P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑的活化程度明顯低于對(duì)照組小鼠，提示mTOR對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，而在之前我們的研究中發(fā)現(xiàn)在缺氧性血睪屏障通透中，HIF-1α結(jié)合JAM-B轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件，所以我們有理由相信缺氧性血睪屏障通透中抑制性活化mTOR可能通過(guò)阻抑P70S6K1/HIF-1α信號(hào)通路的活化減少JAM-B表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到惡化生殖的作用，這一設(shè)想在理論層面上可行，理應(yīng)獲得預(yù)期結(jié)果。
[0155] 3.2技術(shù)上的可行性：
[0156] 1、我們前期在低氧誘導(dǎo)的小鼠血睪屏障通透模型中已經(jīng)證實(shí)抑制性激活的P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑能結(jié)合下游緊密連接蛋白JAM-B啟動(dòng)子并減少其表達(dá)，影響疾病進(jìn)程，那么在同為缺氧性血睪屏障通透病人中或許也存在此調(diào)控機(jī)制，此外我們前期的結(jié)果也證實(shí)低氧誘導(dǎo)缺氧性血睪屏障通透小鼠睪丸mTOR顯著低于對(duì)照組小鼠，mTOR基因敲除小鼠血睪屏障通透性顯
[0157] 2、項(xiàng)目申請(qǐng)者熟悉缺氧性血睪屏障通透中TFEB和P70S6K1/HIF-1α信號(hào)途徑的活化和對(duì)JAM-B的調(diào)節(jié)機(jī)制，課題所需的病理生理學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)又是本研究所常用的技術(shù)及方法，尤其在小鼠曲精小管支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)上較為熟練，與此同時(shí)本項(xiàng)目立足現(xiàn)有的工作基礎(chǔ)，立題依據(jù)充分，課題組人員組成既有從事生殖低下研究的人員，又有長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室研究及技術(shù)人員，還有長(zhǎng)期從事病理研究的技術(shù)人員。既有博士、碩士，又有各種技術(shù)人員，人員搭配合理，能保證研究順利完成。
[0158] 4、本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處；
[0159] 1)迄今為止，缺氧性精子生成減少的發(fā)病原因不明，mTOR在其中作用的相關(guān)文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)低氧誘導(dǎo)的mTOR基因敲除小鼠及野生型小鼠這一缺氧性血睪屏障通透模型，將有助于我們進(jìn)一步研究其在缺氧性血睪屏障通透中的重要作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。
[0160] 2)目前睪丸扭轉(zhuǎn)和自身免疫性睪丸炎的研究中，JAM-B作為緊密連接蛋白參與發(fā)病已經(jīng)清楚，但在缺氧性血睪屏障通透中沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具體作用，也不知曉其具體調(diào)節(jié)機(jī)制。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)佐證：在低氧誘導(dǎo)的缺氧性血睪屏障通透小鼠模型中，mTOR基因敲除小鼠血睪屏障病損程度較對(duì)照組嚴(yán)重，提示mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護(hù)作用。了解明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的作用及機(jī)制有助于我們對(duì)此疾病深入的了解，并為未來(lái)治療此疾病提供更安全更有效的治療途徑和手段。
[0161] (二)研究基礎(chǔ)與工作條件
[0162] 1、研究基礎(chǔ)
[0163] 1.1課題組工作積累
[0164] 1.1.1缺氧病理生理學(xué)研究
[0165] 課題組單位為第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系病理生理學(xué)與高原病理學(xué)教研室，是教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、軍隊(duì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)60余年的缺氧(高原)病理生理學(xué)研究，對(duì)缺氧病理生理學(xué)有較深入的了解，承擔(dān)并圓滿完成了國(guó)家、軍隊(duì)、重慶市多項(xiàng)缺氧方面的課題。獲得“高原病發(fā)病機(jī)制和防治措施研究”國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎(jiǎng)在內(nèi)的各種獎(jiǎng)項(xiàng)。
[0166] 1.1.2低氧誘導(dǎo)精母細(xì)胞凋亡的研究
[0167] 本課題組2000年以來(lái)，一直從事缺氧生殖方面的研究，在缺氧對(duì)男性生殖功能的影響，特別是生精上皮細(xì)胞脫落、精母細(xì)胞凋亡方面進(jìn)行了研究。并發(fā)表“Hypobaric?hypoxia?causes?deleterious?effects?on?spermatogenesis?in?rats”，并提出高原低氧對(duì)生精細(xì)胞的影響主要集中在精母細(xì)胞上，為理解高原男性生殖功能低下的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。自噬在缺氧誘導(dǎo)精母細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制一直是申請(qǐng)者所重點(diǎn)關(guān)注的研究領(lǐng)域，部分文獻(xiàn)綜述已以第一作者身份被本領(lǐng)域知名期刊Biology?of?reproduction(IF＝3.47)發(fā)表，申請(qǐng)者圍繞低氧誘導(dǎo)精母細(xì)胞凋亡的機(jī)制和凋亡與自噬的串?dāng)_先后發(fā)表兩篇論著，先后發(fā)表于Journal?of?cellular?physiology(IF＝4.1)和Reproduction(IF＝
3.06)，本項(xiàng)目是本課題組前期研究工作的繼續(xù)深入。
3.06)，本項(xiàng)目是本課題組前期研究工作的繼續(xù)深入。
[0168] 1.2本項(xiàng)目前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0169] ①低氧誘導(dǎo)血睪屏障(Blood-testis-barrier,BTB)通透性增加
[0170] 以伊文斯藍(lán)滲出作為白蛋白滲出的標(biāo)志物，定量測(cè)定BTB的通透性，與對(duì)照組比較，海拔5000米低氧曝露15天組小鼠睪丸血睪屏障中伊文斯藍(lán)標(biāo)記物明顯增多，且血睪屏障通透程度呈時(shí)間依賴性；與對(duì)照組比較，海拔5000米低氧曝露30天組小鼠血睪屏障緊密連接結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞間隙增大；與對(duì)照組比較，海拔5000米低氧曝露60天組小鼠支持細(xì)胞緊密連接相關(guān)分子Claudin-5、Occludin、JAM-B的mRNA水平和蛋白表達(dá)均顯著降低(p<0.05)(Yinetal.未發(fā)表)。低氧誘導(dǎo)血睪屏障通透如圖3所示，低氧抑制緊密連接相關(guān)分子m?RNA和蛋白表達(dá)如圖4所示。
[0171] ②低氧抑制小鼠支持細(xì)胞系TM4緊密連接分子表達(dá)
[0172] 與21％氧含量+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞電阻顯著降低(p<0.05)，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞膜上的緊密連接相關(guān)分子Claudin-5、Occludin、JAM-B熒光強(qiáng)度下降，且分布位置轉(zhuǎn)移至胞漿；與21％氧含量+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞緊密連接相關(guān)分子Claudin-5、Occludin、JAM-B的m?RNA水平和蛋白表達(dá)均顯著降低(p<0.05)(Yinetal.未發(fā)表)。TM4細(xì)胞曝露于21％氧含量和1％氧含量48h后的跨細(xì)胞電阻變化如圖5所示，免疫熒光染色并分別觀察21％氧含量+48h組與1％氧含量+48h組TM4細(xì)胞緊密連接分子Claudin-5、Occludin、JAM-B分布及熒光強(qiáng)度如圖6所示，低氧抑制TM4細(xì)胞緊密連接相關(guān)分子Claudin-5、Occludin、JAM-B蛋白表達(dá)如圖7所示。
[0173] ③低氧抑制睪丸和支持細(xì)胞m?TORC1表達(dá)(如圖8所示)
[0174] 與對(duì)照組比較，海拔5000米低氧曝露60天組小鼠睪丸m?TOR表達(dá)顯著減少(p<0.05)；與21％氧含量+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞m?TOR、Rag?A和Rhe?B表達(dá)顯著下降(p<0.05)，AMPK和TSC2表達(dá)顯著上調(diào)(p<0.05)；與平原對(duì)照組小鼠比較，m?TOR?KO組小鼠睪丸血睪屏障中伊文斯藍(lán)標(biāo)記物明顯增多(p<0.05)(Yin?et?al.未發(fā)表)。
[0175] ④低氧誘導(dǎo)支持細(xì)胞巨胞飲-溶酶體系統(tǒng)
[0176] 與21％氧含量+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞70kDa?Texas?Red?Dextran(Fdx70，巨胞飲標(biāo)記物)攝取顯著增加(p<0.05)，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞標(biāo)記分子α-adaptin和Caveolar介導(dǎo)的內(nèi)吞標(biāo)記分子caveolin-1表達(dá)無(wú)變化；與21％氧含量+48h組支持細(xì)胞相比，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞溶酶體顯著上升(p<0.05)(Yinetal.未發(fā)表)。低氧誘導(dǎo)支持細(xì)胞巨胞飲介導(dǎo)的胞吞如圖9所示。
[0177] ⑤低氧抑制支持細(xì)胞m?TOR/HIF-1α途徑
[0178] 與21％氧濃度+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量+48h組小鼠TM4細(xì)胞HIF-1α表達(dá)顯著減少(p<0.05)，mTOR效應(yīng)分子p-4EBP1和p-P70S6K1表達(dá)顯著下降；與1％氧含量+48h組支持細(xì)胞比較，1％氧含量曝露48h+MHY1485(m?TOR特異性激動(dòng)劑)組TM4細(xì)胞p-mTOR和HIF-1α表達(dá)均顯著上升(p<0.05)(Yin?et?al.未發(fā)表)。低氧抑制TM4細(xì)胞m?TOR/HIF-1α途徑如圖10所示。
[0179] ⑥JAM-B是缺氧下支持細(xì)胞中HIF-1α的靶基因(如圖11所示)
[0180] 與IgG組比較，21％O2+48h組支持細(xì)胞中HIF-1α明顯富集到JAM-B啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件上(p<0.05)(Yinetal.未發(fā)表)。
[0181] 2、實(shí)驗(yàn)條件
[0182] 1.試劑及細(xì)胞：所需試劑、VHA基因敲除小鼠及小鼠精母細(xì)胞均有市售。
[0183] 2.已具備本實(shí)驗(yàn)研究所需的所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)
[0184] 1)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已為本室所熟悉。
[0185] 2)本室長(zhǎng)期從事缺氧對(duì)男性生殖功能的影響，特別是生精上皮細(xì)胞脫落、精母細(xì)胞凋亡方面的研究，熟悉高原缺氧的研究現(xiàn)狀，對(duì)低氧環(huán)境的模擬等有豐富的經(jīng)驗(yàn)。
[0186] 3)本室擁有設(shè)備完善的常氧及低氧細(xì)胞培養(yǎng)室、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，具備完成所需的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，本實(shí)驗(yàn)所需的部分實(shí)驗(yàn)設(shè)備還可由本校中心儀器室和友鄰科室提供。
[0187] 3.主要儀器及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：
[0188] 1)本研究室一直致力于高原醫(yī)學(xué)研究，為教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。擁有總面積約2000m2的實(shí)驗(yàn)室，完善的細(xì)胞培養(yǎng)室，操作方便的缺氧操作小室。擁有多種先進(jìn)儀器；CO2培養(yǎng)箱、低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫高速離心機(jī)、-80oC冰箱、熒光顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)、冰凍切片機(jī)、低溫高速離心機(jī)、超聲細(xì)胞破碎儀、實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀、紫外透射觀察儀及照相裝置、雜交爐、電泳儀、紫外分光光度計(jì)、核酸蛋白檢測(cè)儀、萬(wàn)分之一電子天平及高精度pH計(jì)等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備，擁有先進(jìn)的全天候不間斷低氧缺氧艙群。
[0189] 2)我校中心實(shí)驗(yàn)室可提供使用的儀器有：激光共聚焦、FACSart?plus流式細(xì)胞儀，TECBUSA-6803型真彩色微機(jī)圖像分析系統(tǒng)等。
[0190] 3)目前我校有全軍分子免疫學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室及防原醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，其儀器設(shè)備先進(jìn)、技術(shù)力量強(qiáng)，可供使用。本課題所需儀器均可得到保證。
[0191] 4)本實(shí)驗(yàn)室有國(guó)外多名留學(xué)人員和實(shí)驗(yàn)室建立密切聯(lián)系，對(duì)于國(guó)內(nèi)難以獲得的實(shí)驗(yàn)材料，同意給予幫助。
[0192] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
| 標(biāo)題 | 發(fā)布/更新時(shí)間 | 閱讀量 |
|---|---|---|
| 使用相對(duì)積分參數(shù)的拉曼信號(hào)位置校正 | 2020-05-08 | 300 |
| 一種變量程氣相分子吸收池系統(tǒng)及吸收光譜儀 | 2020-05-08 | 211 |
| 三維仿生自愈水凝膠纖維支架組合物及其制備方法與應(yīng)用 | 2020-05-11 | 113 |
| 在低氧性血睪屏障通透中作用機(jī)制的小鼠模型構(gòu)建方法 | 2020-05-11 | 414 |
| 一種超靈敏檢測(cè)磺胺噻唑的電化學(xué)傳感器及其檢測(cè)方法 | 2020-05-11 | 295 |
| 特異性結(jié)合銅綠假單胞菌六型分泌系統(tǒng)免疫蛋白的多肽的設(shè)計(jì)及其抗菌活性的驗(yàn)證 | 2020-05-11 | 124 |
| 一種可提高準(zhǔn)確率的COVID-19新型冠狀病毒核酸檢測(cè)方法 | 2020-05-08 | 608 |
| 阻斷CCL28趨化通路的胃癌治療方法 | 2020-05-08 | 928 |
| 治療或預(yù)防肥胖或其相關(guān)疾病的化合物及其應(yīng)用 | 2020-05-11 | 564 |
| 一種輔助奶瓶盛水容量讀數(shù)的裝置及方法 | 2020-05-11 | 206 |
高效檢索全球?qū)＠?/div>專利匯是專利免費(fèi)檢索,專利查詢,專利分析-國(guó)家發(fā)明專利查詢檢索分析平臺(tái)，是提供專利分析，專利查詢，專利檢索等數(shù)據(jù)服務(wù)功能的知識(shí)產(chǎn)權(quán)數(shù)據(jù)服務(wù)商。
我們的產(chǎn)品包含105個(gè)國(guó)家的1.26億組數(shù)據(jù)，免費(fèi)查、免費(fèi)專利分析。
分析報(bào)告專利匯分析報(bào)告產(chǎn)品可以對(duì)行業(yè)情報(bào)數(shù)據(jù)進(jìn)行梳理分析，涉及維度包括行業(yè)專利基本狀況分析、地域分析、技術(shù)分析、發(fā)明人分析、申請(qǐng)人分析、專利權(quán)人分析、失效分析、核心專利分析、法律分析、研發(fā)重點(diǎn)分析、企業(yè)專利處境分析、技術(shù)處境分析、專利壽命分析、企業(yè)定位分析、引證分析等超過(guò)60個(gè)分析角度，系統(tǒng)通過(guò)AI智能系統(tǒng)對(duì)圖表進(jìn)行解讀，只需1分鐘，一鍵生成行業(yè)專利分析報(bào)告。
信號(hào)分子熱門(mén)專利
QQ群二維碼
意見(jiàn)反饋
意見(jiàn)反饋
使用該功能遇到問(wèn)題
該功能需要專業(yè)版企業(yè)版VIP權(quán)限，您可以：
您也可以聯(lián)系官方QQ: 2157717237 電話: 13264338900