紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草菌素產(chǎn)量的方法
專利匯可以提供紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草菌素產(chǎn)量的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 公開了紅曲協(xié)同 發(fā)酵 提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草素產(chǎn)量的方法，事前，需要進(jìn)行菌種活化和拮抗試驗(yàn)，嗣后需要進(jìn)行蟲草菌素的檢測(cè)；該方法包括4個(gè)階段：(1)紅曲培養(yǎng)；(2)蛹蟲草培養(yǎng)；(3)雙菌混合協(xié)同發(fā)酵；(4)子實(shí)體管理。本方法不僅能明顯提高蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量，提高達(dá)30％多；而且還能提高蛹蟲草子實(shí)體的 質(zhì)量 ，使子實(shí)體里蟲草菌素含量提高20％，達(dá)到20.2mg/g以上。這對(duì)提高蛹蟲草固體發(fā)酵的產(chǎn)量和效率，以及提高藥物蛹蟲草菌粉和膠囊中有效成分的含量具有重要意義，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。，下面是紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草菌素產(chǎn)量的方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草素產(chǎn)量的方法，其特征在于該方法包括：
(1)紅曲培養(yǎng)：
在容積為300ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶中裝入25g大米，按1∶1.6的料水比加入40ml蒸餾水；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的紅曲菌種，置30℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；
(2)蛹蟲草培養(yǎng)：
罐頭瓶中裝入25g大米，麥麩1.2g，玉米粉0.4g，豆粉0.4g，按1∶1.6的料水比加入43.2ml營(yíng)養(yǎng)液；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃下高壓滅菌30min，冷卻后，接種蛹蟲草菌株的孢子懸液，置26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；所述營(yíng)養(yǎng)液配方為葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO4·7H2O?1g，KH2PO4?2g，檸檬酸銨1g，水1000ml；
(3)雙菌混合：
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲草都封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲草的大米培養(yǎng)物按1∶9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，5～7d后進(jìn)入蛹蟲草子實(shí)體管理階段；
(4)子實(shí)體管理：
為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天散射光光照不少于10h，溫度每天18℃，10h/25℃，14h的光照交替，相對(duì)濕度提高至80％左右，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣；蛹蟲草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX，溫度保持22℃左右，空氣濕度85％左右；每天通風(fēng)換氣3次，每次10min；待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲橙黃色的子實(shí)體；
所述紅曲為紫紅曲M.purpureus菌株ATCC?16365；蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)為無(wú)性型蛹草擬青霉(paecilomyces?militaris)PM-71菌株，此菌株已于2008年4月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為：CGMCCNo.2459。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵工程，具體而言涉及蛹蟲草的固體培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)
《新華本草綱要》記載蛹蟲草功效為：“全草味甘，性平，有益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰”。蛹蟲草可用于肺結(jié)核、老人虛弱、貧血等，是具有滋補(bǔ)功能的珍貴中藥材。于2003年被批準(zhǔn)為國(guó)家一類新藥(中藥)。人們對(duì)蛹蟲草的藥理作用進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)其具有廣泛的藥理學(xué)活性及臨床作用。比如：抗腫瘤作用，提高免疫功能的作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，對(duì)肺虛咳嗽，急慢性支氣管炎，哮喘等有較好的療效。對(duì)腎虛所致的陽(yáng)痿早泄有良好的治療及保健作用，對(duì)腎虛腰痛，糖尿病，蛋白尿等腎功能障礙患者也有較好的治療效果。具有明顯的抗氧化、抗衰老作用。
蟲草菌素即3′-脫氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，又稱蛹蟲草菌素，由Cunningham等于1951年從蛹蟲草的培養(yǎng)濾液中分離得到。蟲草菌素是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類抗菌素。蟲草菌素的分子式為C10H13N5O3，分子量251，堿性，針狀或片狀結(jié)晶，熔點(diǎn)230～231℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反應(yīng)陽(yáng)性，紫外光最大吸收波長(zhǎng)為259nm。蟲草菌素具有多種生物學(xué)活性，比如：抑菌作用，抗腫瘤作用，抑制人體免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用，免疫調(diào)節(jié)作用和明顯降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤為明顯，與市售的法國(guó)力博福尼制藥公司生產(chǎn)的非諾貝特(力平之)效果相當(dāng)或優(yōu)于非諾貝特；在治療白血病方面在美國(guó)進(jìn)入了臨床研究。蟲草菌素的結(jié)構(gòu)式為：
近年來(lái)，蟲草的生產(chǎn)與應(yīng)用受到了人們的關(guān)注，涉及蟲草的專利申請(qǐng)上百件。例如94115054.2號(hào)“冬蟲夏草的深層發(fā)酵工藝”、03117400.0號(hào)“一種誘發(fā)蛹蟲草子實(shí)體原基的化學(xué)方法”、200410059964.X號(hào)“蛹蟲草食品和蛹蟲草基質(zhì)及其制備方法”、200610028671.4號(hào)“一種發(fā)酵蟲草菌粉的水溶性活性組分及其應(yīng)用”等。然而迄今為止，尚無(wú)利用紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草菌素產(chǎn)量技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所使用的菌株為：紅曲為紫紅曲M.purpureus菌株ATCC?16365；蛹蟲草(Cordyceps?militaris)為無(wú)性型蛹草擬青霉(paecilomycesmilitaris)PM-71菌株，此菌株已于2008年4月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為：CGMCCNo.2459。
發(fā)明人指出，在實(shí)現(xiàn)紅曲協(xié)同發(fā)酵之前，需要進(jìn)行菌種活化和拮抗試驗(yàn)，具體方法是：
1、菌種活化分6步進(jìn)行
(1)配PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，水煮30min，用4層紗布過(guò)濾，取濾液，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，加水至1000ml；
(2)將配好的PDA培養(yǎng)基分裝到試管，包扎，121℃滅菌30min；
(3)滅好菌的試管培養(yǎng)基凝固前擺斜面，冷卻；
(4)將原始菌種從4℃冰箱中取出，室溫下在超凈操作臺(tái)上無(wú)菌接種；
(5)接種紅曲(ATCC?16365)的試管置30℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459)的試管置26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)。
(6)3～5天后，等菌種長(zhǎng)滿斜面，用無(wú)菌水洗斜面制成孢子懸液(在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作)。
2、拮抗實(shí)驗(yàn)
用點(diǎn)種法，在沙氏平板上同時(shí)接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459)和紅曲(ATCC16365)，并使二者相距2cm，另在沙氏平板上分別接種單一的蛹蟲草、紅曲，作對(duì)照。2個(gè)單一的只接種蛹蟲草和紅曲的平板和3個(gè)接種雙菌的平板作為一組，共接5組，根據(jù)蛹蟲草和紅曲各自最適生長(zhǎng)溫度設(shè)置協(xié)同發(fā)酵的培養(yǎng)溫度梯度，將5組平板分別放在26℃，27℃，28℃，30℃及26℃，6h/30℃，6h交替的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，篩選出使二者生長(zhǎng)良好且均衡的培養(yǎng)溫度為26℃。
本發(fā)明的紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草素產(chǎn)量的方法包括：
1、紅曲培養(yǎng)：
在容積為350ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶(內(nèi)徑6.2cm，高度15cm)中裝入25g大米，按1∶1.6的料水比加入40ml蒸餾水；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的紅曲(ATCC?16365)菌株的孢子懸液，置30℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；
2、蛹蟲草培養(yǎng)：
在容積為350ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶中裝入25g大米，麥麩1.2g，玉米粉0.4g，豆粉0.4g，按1∶1.6的料水比加入43.2ml營(yíng)養(yǎng)液；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃下高壓滅菌30min，冷卻后，接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459)菌株的孢子懸液，置26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；
3、雙菌混合：
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲草都封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲草的大米培養(yǎng)物按1∶9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，5～7d后進(jìn)入蛹蟲草子實(shí)體管理階段；
4、子實(shí)體管理：
為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天散射光光照不少于10h，溫度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相對(duì)濕度提高至80％左右，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣；蛹蟲草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX，溫度保持22℃左右，空氣濕度85％左右；每天通風(fēng)換氣3次，每次10min；待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲橙黃色的子實(shí)體。
上述方法的蛹蟲草培養(yǎng)階段中，所述的營(yíng)養(yǎng)液配方為葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO4·7H2O?1g，KH2PO4?2g，檸檬酸銨1g，水1000ml。
蟲草菌素的檢測(cè)方法如下：通過(guò)HPLC分析蟲草菌素的含量，HPLC測(cè)定用PC2000型HPLC分析儀(Scientific?systems?Inc.，PA，USA)；檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm；柱溫30℃；流動(dòng)相為10mM?KH2PO4溶于甲醇/雙蒸水(15∶85)，流速為1ml/min；進(jìn)樣量為20μ1。先精密稱取干菌絲粉0.2g置于具塞試管中，加入雙蒸水10ml，超聲處理30min，然后在5000g下離心15min，最后經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾除去固體雜質(zhì)后檢測(cè)其中蟲草菌素的含量；若測(cè)定前樣品經(jīng)過(guò)稀釋，則乘以稀釋倍數(shù)。無(wú)紅曲協(xié)同發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)組蛹蟲草子實(shí)體平均產(chǎn)量為2.87g/瓶(干重)，與紅曲協(xié)同發(fā)酵的蛹蟲草子實(shí)體平均產(chǎn)量為3.74g/瓶，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量提高30％多。子實(shí)體里蟲草菌素平均含量提高20％，達(dá)到20.2mg/g。
表1??紅曲和蛹蟲草協(xié)同發(fā)酵時(shí)紅曲加入量對(duì)其子實(shí)體和蟲草菌素產(chǎn)量的影響。
本發(fā)明的紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實(shí)體和蟲草素產(chǎn)量的方法不僅能明顯提高蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量(提高達(dá)30％多)，而且還能提高蛹蟲草子實(shí)體的質(zhì)量，使子實(shí)體里蟲草菌素含量提高20％(達(dá)到20.2mg/g以上)，這對(duì)提高蛹蟲草固體發(fā)酵的產(chǎn)量和效率，以及提高藥物蛹蟲草菌粉和膠囊中有效成分的含量具有重要意義。
具體實(shí)施方式
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲草封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲草的大米培養(yǎng)物按1∶9比例混合，混合后攪拌均勻，置于26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，5～7d后增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相對(duì)濕度提高至80％左右，蛹蟲草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX，溫度保持22℃左右，空氣濕度85％左右，待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲子實(shí)體并烘干。
實(shí)施例2：在洗凈的20個(gè)無(wú)色玻璃瓶中分別裝入20g大米，按1∶1.6的料水比加入32ml蒸餾水，封口后在121℃，30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的紅曲(ATCC?16365)菌株的孢子懸液，置30℃下，黑暗恒溫培養(yǎng)。在180個(gè)罐頭瓶中分別裝入20g大米，麥麩1g，玉米粉0.3g，豆粉0.3g按1∶1.6的料水比加入34.6ml營(yíng)養(yǎng)液(配制方法為葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO4·7H2O?1g，KH2PO4?2g，檸檬酸銨1g，水1000ml)；高壓滅菌，冷卻后，接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459)菌株的孢子懸液，置26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)。
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲草封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲草的大米培養(yǎng)物按1∶9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，5～7d后增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相對(duì)濕度提高至80％左右，蛹蟲草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX，溫度保持22℃左右，空氣濕度85％左右，待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲子實(shí)體并烘干。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
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