技術領域
[0001] 本
發(fā)明涉及一種提高
釀酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，屬于
生物工程技術領域。
背景技術
[0002] 葡糖二酸(Glucaric?acid)，是葡萄糖的
醛基和C6位羥基皆被
氧化為羧基而形成的二元酸。自然界中即存在葡糖二酸，如十字花科的素菜(花椰菜等)、
水果(如柑橘等)以及
哺乳動物的
代謝物中均發(fā)現(xiàn)葡糖二酸。葡糖二酸及其衍生物在醫(yī)藥方面有重要的應用，由于葡糖二酸及其內酯可以有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，因此成為良好的抗癌物質。而且，葡糖二酸還具有降低膽固醇的作用；葡糖二酸-1,4-內酯具有抗氧化作用，能夠抑制糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)，葡糖二酸可以通過縮聚反應形成聚酰胺，該
聚合物具有
生物可降解性，開拓了可降解尼龍材料的發(fā)展前景。
[0003] 釀酒酵母相較于大腸桿菌，具有更高的工業(yè)應用價值，一方面釀酒酵母的耐酸能
力強于大腸桿菌，另一方面釀酒酵母本身可以作為單細胞蛋白用于
飼料、食品等。釀酒酵母還具有其它優(yōu)點，如耐低溫、可低pH
發(fā)酵、沒有
噬菌體感染、適合大規(guī)模發(fā)酵、易分離和高抗逆性等特點。因而釀酒酵母已經廣泛用于產
有機酸的研究，如ρ-羥基苯
甲酸、ρ-
氨基
苯甲酸、ρ-羥基苯
丙烯酸和青蒿酸等。通過釀酒酵母代謝工程制備葡萄糖二酸具有2個優(yōu)勢，一是細胞本身含有葡糖糖二酸合成途徑中的肌醇-1-
磷酸合成酶Ino1，二是酵母能夠利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇。目前對于通過釀酒酵母代謝工程制備葡萄糖二酸研究的相關報道比較少，Prather課題組將外源MIOX和UDH基因引入釀酒酵母細胞進行異源表達實現(xiàn)了通過葡萄糖和外加肌醇在釀酒酵母細胞中產葡萄糖二酸，但是其產量在上罐培養(yǎng)條件下只有1.6g/L。我們前期釀酒酵母工程菌Bga-001在分批補料發(fā)酵條件下能夠產6g/L的葡萄糖二酸。
[0004] 通過代謝工程策略構建的途徑含有異源酶時，由于異源蛋白缺少宿主細胞天然代謝調控機制，因此，宿主細胞流量存在
不平衡的問題。
腳手架蛋白被用來募集代謝途徑酶進行融合表達，該方法可以減少底物流失和中間代謝物的積累，提高途徑合成效率，因此近年來成為研究的熱點。在大腸桿菌中，通過構建腳手架蛋白葡糖二酸的產量可以提高3倍。在釀酒酵母中，通過親合體和腳手架構建融合蛋白將法尼基二磷酸合成酶和法尼烯合成酶進行共
定位，法尼烯的產量提高了135％；將這種方法應用于大腸桿菌聚羥基丁酸酯(PHB)的合成后，PHB的產量提高了7倍。本發(fā)明擬通過構建親合體腳手架將擬南芥(Arabidopsis?thaliana)來源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假單胞菌來源的糖醛酸脫氫酶udh通過不同的linker連接，提高MIOX1和udh的途徑效率，在此
基礎上進一步提高葡糖二酸合成途徑的效率，從而為進一步的代謝改造奠定基礎。
發(fā)明內容
[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種提高提高釀酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法。本發(fā)明通過以下方案來實現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提高一種合成D-葡萄糖二酸的釀酒酵母基因工程菌，是以釀酒酵母BY4741的opi1缺失株為出發(fā)菌株，將擬南芥(Arabidopsis?thaliana)來源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假單胞菌來源的糖醛酸脫氫酶udh通過linker連接，然后整合至釀酒酵母opi1缺失株的基因組上。
[0007] 在一種實施方式中，所述肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述糖醛酸脫氫酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
[0008] 在一種實施方式中，所述linker包括GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN。
[0009] 在一種實施方式中，所述肌醇加氧酶和糖醛酸脫氫酶通過linker融合后整合至opi1缺失株的OPI1基因啟動子上。
[0010] 在一種實施方式中，所述OPI1基因啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述
片段MIOX4來自擬南芥，udh片段來自丁香假單胞菌(Pseudomonas?putida)，分別由引物從Bga-001基因組擴增獲得。Bga-001菌株來源于
專利：一種提高釀酒酵母工程菌株發(fā)酵生產葡萄糖二酸的方法(
申請號：201810091278.2)[0012] 本發(fā)明的第二個目的是篩選出一種利用上述工程菌提高提高釀酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，利用葡萄糖為底物高產高附加值葡糖二酸。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，28～30℃，200～250rpm，培養(yǎng)20～24h，獲得
種子液。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的
碳源為葡萄糖，初始濃度為15～25g/L。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵是將種子液按照1～2％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃、200～250rpm，培養(yǎng)160～240小時。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，在發(fā)酵24小時和36小時補加葡萄糖，使發(fā)酵體系中的葡萄糖濃度為5g/L。
[0017] 本發(fā)明還要求保護所述釀酒酵母基因工程菌或所述方法在制備葡萄糖二酸或其衍生產品方面的應用。
[0018] 有益效果：葡萄糖二酸合成途徑效率低且MIOX4
穩(wěn)定性差的問題，本方法將MIOX4和udh通過不同的linker進行融合表達，通過發(fā)酵培養(yǎng)后篩選出能夠提高葡萄糖二酸合成途徑效率的葡萄糖二酸高產菌株，實現(xiàn)了外源基因在釀酒酵母細胞中的穩(wěn)定表達。本實驗室構建的分別表達MIOX4和udh的釀酒酵母工程菌，其途徑效率低，相同發(fā)酵條件下其葡萄糖二酸產量只有0.25g/L，而經過融合表達后，在相同的發(fā)酵條件下產量最高達1.45g/L，提高了近5倍。
附圖說明
[0019] 圖1為工程菌構建策略圖；
[0020] 圖2為MIOX4-linker-udh整合片段瓊脂糖凝膠
電泳檢測圖；其中，泳道0為不融合linker的對照，泳道1～12分別表示通過GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；
[0021] 圖3為MIOX4-linker-udh整合菌株基因型瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；其中，泳道0為不融合linker的對照，泳道1～12分別表示通過GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；
[0022] 圖4為不同釀酒酵母工程菌的葡萄糖二酸產量；其中Bga-L1～Bga-L13分別表示：不融合linker的對照，分別通過GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；Bga-2表示單獨表達2個基因的菌株。
具體實施方式
[0023] 下面結合附圖和具體
實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0024] YPD培養(yǎng)基組成：每升YPD培養(yǎng)基含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物，定容后1×105Pa滅菌20min。固體培養(yǎng)基每升加入20g的瓊脂粉。
[0025] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成：YPD培養(yǎng)基組成外加10.8g/L的肌醇。
[0026] 表1為實施例1、2用到的引物
[0027]
[0028] 實施例1：MIOX4-linker-udh整合片段的獲得
[0029] 以Bga-001(公開于公開號為CN108220176A的專利申請專利：一種提高釀酒酵母工程菌株發(fā)酵生產葡萄糖二酸的方法)的基因組為模板，先以MIOX4-LF/MIOX4-LR為引物，擴增PTEF1-MIOX4片段；再分別以UDH-F(0-12)和UDH-R擴增不含linker，及分別含有如下12個不同linker：GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK和SSSNNNNNNNNNN的UDH-TCYC1片段，然后以MIOX4-LF和UDH-R將上述兩個片段進行融合PCR，獲得通過12個不同linker連接的PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1的DNA片段(圖1和圖2)。
[0030] 然后以Bga-001的基因組為模板，通過引物HIS3-(opi1)F/HIS3-(opi1)R擴增SEQ?ID?NO.5所示的HIS3片段(含有OPI1啟動子上游同源序列，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示)，以上述獲得的通過12個不同linker連接的DNA片段PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1為模板，通過引物MIOX4-LF/TCYC1-(opi1)R擴增獲得PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1片段(含有OPI1啟動子下游同源序列)，最后通過
醋酸鋰轉化法將上述2個片段整合到opi1缺失株的啟動子上。
[0031] 實施例2：MIOX4-linker-udh整合菌株的檢測
[0032] 提取通過上述方法獲得的酵母轉化子的基因組，以MD-Check-(opi1)F/MD-Check-(opi1)R為引物擴增提取的基因組，驗證MIOX-UDH1融合蛋白是否整合到BY4741opi1Δ菌株的基因組上，圖3可以說明所驗證的菌株基因組上有MIOX與UDH融合蛋白，最終獲得正確的整合菌株，分別命名為Bga-L1～Bga-L13。
[0033] 實施例3：融合表達工程菌發(fā)酵合成葡萄糖二酸
[0034] 1、種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于10mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，搖床培養(yǎng)24h即為種子液。
[0035] 2、發(fā)酵條件：將種子液按照5％的接種量接種到含有50mL液體培養(yǎng)基的250mL的錐形瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為20g/L，并加入10.8g/L的肌醇。30℃、搖床轉速250rpm，培養(yǎng)240小時。
[0036] 3、產物檢測：取發(fā)酵液1mL，高速離心10min，保留上清液并用0.22μm規(guī)格的濾
膜過濾，濾液即為樣品。即可通過液相色譜-質譜連用(LC-MS)檢測，或通過高效液相色譜(HPLC)檢測，以5mM
硫酸為流動相，色譜柱為有機酸柱(Aninex?Hpx-87H?ion?exchange?column)，柱溫55℃，示差折光檢測器，進樣量30μL，流速0.6mL/min。
[0037] 每linker篩選出兩個融合片段整合成功的菌株進行搖瓶發(fā)酵，同時以BY4741opi1Δ上單獨表達MIOX4和udh的菌株(Bga-2)作為對照，對比葡萄糖二酸產量是否有所提高。發(fā)酵結果(圖4)表明，相同發(fā)酵條件下，沒有進行MIOX4和udh融合表達的釀酒酵母工程菌，其途徑效率低，葡萄糖二酸產量只有0.25g/L，而經過融合表達后，在相同的發(fā)酵條件下，Bga-L12工程菌產量最高達1.45g/L，提高了近5倍；Bga-L5、Bga-L9的葡萄糖二酸產量分別為1.20g/L和1.41g/L。
[0038] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以
權利要求書所界定的為準。
