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含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法

閱讀：317發(fā)布：2020-05-08

專利匯可以提供含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 公開了一種含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法，包括如下步驟：制成脂肪干細胞懸液；初步擴增的脂肪干細胞；激活的脂肪干細胞；在脂肪干細胞長到80％～90％融合后傳三到六代培養(yǎng)；得到上清液；低溫冷藏裝置中冷藏儲存12-15小時；除去上清液，從而獲得脂肪干細胞外泌體；制備含有脂肪干細胞外泌體的面膜。本發(fā)明具有加工成本低的優(yōu)點。，下面是含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
利用緩沖液清洗脂肪組織去除殘留的血液和組織碎片，將清洗后的脂肪組織剪成小塊，在震蕩箱中消化20min～60min，然后靜置待其分層后，吸取上層脂肪細胞液，將脂肪細胞液置于0-5攝氏度的箱體內(nèi)培養(yǎng)1-2小時，密封離心分離，去除上清液，制成脂肪干細胞懸液；
將脂肪干細胞懸液置于細胞激活培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)10-20小時，以便得到初步擴增的脂肪干細胞；
將脂肪干細胞置于至少一種細胞培養(yǎng)基中加激活試劑進行脂肪干細胞懸液培養(yǎng)12-15小時，以便得到激活的脂肪干細胞；
將激活的脂肪干細胞從培養(yǎng)基中取出，加入生理鹽水清洗干凈，然后加入酶液消化處理，在脂肪干細胞長到80％～90％融合后傳三到六代培養(yǎng)；
將傳代后的培養(yǎng)液離心除去細胞和細胞碎片，得到上清液；
將上清液、D-Hanks緩沖液、低溫保護劑三者的體積百分比2～4:2～4:1進行混合，先緩慢降至0℃后放入低溫冷藏裝置中冷藏儲存12-15小時；
將冷藏后的混合物離心，除去上清液，從而獲得脂肪干細胞外泌體；
在潔凈無菌的環(huán)境下，用全自動面膜灌裝封口一體機，向裝有折疊膜布的面膜包裝袋內(nèi)，定量灌裝獲得的脂肪干細胞外泌體，并封口，得含有脂肪干細胞外泌體的面膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述細胞激活培養(yǎng)基為添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細胞培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述細胞激活培養(yǎng)基中添加了哺乳動物血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述哺乳動物血清為哺乳動物胎血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述激活試劑為鈣離子載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述鈣離子載體選自A23187或離子霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述激活試劑為腺病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述脂肪組織包括人體脂肪組織或動物脂肪組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述膜布包括納米纖維層。
10.如權(quán)利要求1所述的一種用于美容保養(yǎng)的脂肪干細胞液的制備方法，其特征在于：
所述低溫保護劑為甘油。

說明書全文

含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及化妝品領(lǐng)域，尤其是涉及一種加工成本低的含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法。

背景技術(shù)

[0002] 脂肪干細胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞；具有易獲取、來源充足、免疫排斥性低等特點。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞主要是通過旁分泌而發(fā)揮修復(fù)作用的，其分泌的主要物質(zhì)之一為外泌體。脂肪干細胞外泌體是一種直徑介于50～150nm的亞細胞雙層膜囊泡，其形成于內(nèi)涵體小室，在與細胞質(zhì)膜融合過程中釋放到細胞外環(huán)境參與細胞間信息交流。脂肪干細胞外泌體不僅為皮膚修復(fù)提供了豐富的細胞來源，脂肪干細胞外泌體也被證實是促進創(chuàng)面愈合的重要物質(zhì)之一。脂肪干細胞外泌體可以被成纖維細胞攝取，促進其遷移、增殖；并通過促進Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原合并，可以增加神經(jīng)-鈣黏素，增殖細胞核抗原和細胞周期蛋白D1的基因表達，以加速皮膚的修復(fù)和再生。脂肪干細胞外泌體還能通過調(diào)節(jié)成纖維細胞的分化程度來減輕皮膚瘢痕的形成。近年國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞外泌體在促進人成纖維細胞增值遷移及膠原沉積的過程中起到了至關(guān)重要的作用。現(xiàn)有分離的脂肪干細胞外泌體純度不高、脂肪干細胞外泌體體外培養(yǎng)分泌量少的問題，脂肪干細胞外泌體加工價格高昂，極大地限制了脂肪干細胞外泌體在美容行業(yè)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種外泌體加工成本低的含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0005] 一種含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法，包括如下步驟：
[0006] 利用緩沖液清洗脂肪組織去除殘留的血液和組織碎片，將清洗后的脂肪組織剪成小塊，在震蕩箱中消化20min～60min，然后靜置待其分層后，吸取上層脂肪細胞液，將脂肪細胞液置于0-5攝氏度的箱體內(nèi)培養(yǎng)1-2小時，密封離心分離，去除上清液，制成脂肪干細胞懸液；
[0007] 將脂肪干細胞懸液置于細胞激活培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)10-20小時，以便得到初步擴增的脂肪干細胞；
[0008] 將脂肪干細胞置于至少一種細胞培養(yǎng)基中加激活試劑進行脂肪干細胞懸液培養(yǎng)12-15小時，以便得到激活的脂肪干細胞；
[0009] 將激活的脂肪干細胞從培養(yǎng)基中取出，加生理鹽水清洗干凈，然后加入酶液消化處理，在脂肪干細胞長到80％～90％融合后傳三到六代培養(yǎng)；
[0010] 將傳代后的培養(yǎng)液離心除去細胞和細胞碎片，得到上清液；
[0011] 將上清液、D-Hanks緩沖液、低溫保護劑三者的體積百分比2～4:2～4:1進行混合，先緩慢降至0℃后放入低溫冷藏裝置中冷藏儲存12-15小時；
[0012] 將冷藏后的混合物離心，除去上清液，從而獲得脂肪干細胞外泌體；
[0013] 在潔凈無菌的環(huán)境下，用全自動面膜灌裝封口一體機，向裝有折疊膜布的面膜包裝袋內(nèi)，定量灌裝獲得的脂肪干細胞外泌體，并封口，得含有脂肪干細胞外泌體的面膜。
[0014] 可選的，所述細胞激活培養(yǎng)基為添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細胞培養(yǎng)基。
[0015] 可選的，所述細胞激活培養(yǎng)基中添加了哺乳動物血清。
[0016] 可選的，所述哺乳動物血清為哺乳動物胎血清。
[0017] 可選的，所述激活試劑為鈣離子載體。
[0018] 可選的，所述鈣離子載體選自A23187或離子霉素。
[0019] 可選的，所述激活試劑為腺病毒。
[0020] 可選的，所述脂肪組織包括人體脂肪組織或動物脂肪組織。
[0021] 可選的，所述膜布包括納米纖維層。
[0022] 可選的，所述低溫保護劑為甘油。
[0023] 可選的，所述細胞激活培養(yǎng)基為添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細胞培養(yǎng)基。
[0024] 本發(fā)明提供的含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法中的外泌體分泌量大，從而使產(chǎn)品加工成本低。

具體實施方式

[0025] 應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0026] 一種含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法，根據(jù)本發(fā)明待處理的脂肪組織可以是自體或其它動物上可接受的供體獲得，首先利用緩沖液清洗脂肪組織去除殘留的血液和組織碎片，在本實施例中使用D-Hanks緩沖液清洗，將清洗后的脂肪組織剪成小塊，在震蕩箱中消化20min～60min，然后靜置待其分層后，吸取上層脂肪細胞液；并將脂肪細胞液置于0-5攝氏度的箱體內(nèi)培養(yǎng)1-2小時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用前期在0-5攝氏度的箱體內(nèi)培養(yǎng)1-2小時能增加脂肪細胞液的活性，再密封離心分離，去除上清液，制成脂肪干細胞懸液；將脂肪干細胞懸液置于細胞激活培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)10-20小時，以便得到初步擴增的脂肪干細胞；盡管可以在本發(fā)明的方法中可使用任何細胞激活培養(yǎng)基，但優(yōu)選使用添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)10-20小時，以便得到初步擴增的脂肪干細胞；在另一實施例中細胞激活培養(yǎng)基還可以添加哺乳動物血清，其中的哺乳動物血清優(yōu)選為哺乳動物胎血清，例如胎牛血清，添加量為10％和15％左右。體外激活細胞最基本的營養(yǎng)物質(zhì)是合適的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般由生理鹽水、氨基酸、維生素和其他化合物組成，它們可以直接地被細胞利用，優(yōu)選RPMI1640培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基AIM-V。培養(yǎng)基可以補充哺乳動物免疫血清，如胚胎牛免疫血清將脂肪干細胞置于至少一種細胞培養(yǎng)基中加入激活試劑進行脂肪干細胞培養(yǎng)12-15小時，以便得到激活的脂肪干細胞；在本發(fā)明的方法中可使用任何細胞培養(yǎng)基，但優(yōu)選使用添加了鈣離子載體的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15小時，其中的鈣離子載體選自A23187或離子霉素；在另一實施例中激活試劑也可以選擇腺病毒。將激活的血細胞經(jīng)過至少一次的生理鹽水清洗，在本發(fā)明實施例中優(yōu)選經(jīng)過二次的生理鹽水清洗，然后加入酶液消化處理，在脂肪干細胞長到80％～90％融合后傳三到六代培養(yǎng)，優(yōu)選六代；將傳代后的培養(yǎng)液離心除去細胞和細胞碎片，得到上清液；將上清液、D-Hanks緩沖液、低溫保護劑三者的體積百分比2～4:2～4:1進行混合，在本實施例中，低溫保護劑選用甘油，先緩慢降至0℃后放入低溫冷藏裝置中冷藏儲存12-15小時；將冷藏后的混合物離心，除去上清液，從而獲得脂肪干細胞外泌體；在潔凈無菌的環(huán)境下，用全自動面膜灌裝封口一體機，向裝有折疊膜布的面膜包裝袋內(nèi)，為了提高膜布的吸附量，本實施例膜布包括有納米纖維層。
[0027] 培養(yǎng)溫度例如在30和42℃之間。在其他實施方案中，在32和40℃之間，或在37和38℃之間，或其中包含的任何范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，在這些明確范圍內(nèi)的其他范圍的時期和溫度是預(yù)期的，并且在本公開內(nèi)?；蚱渲邪娜魏畏秶?。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，在這些明確范圍內(nèi)的其他范圍的時期和溫度是預(yù)期的，并且在本公開內(nèi)?；蚱渲邪娜魏畏秶１绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，在這些明確范圍內(nèi)的其他范圍的時期和溫度是預(yù)期的，并且在本公開內(nèi)。
[0028] 本發(fā)明涉及的含有脂肪干細胞外泌體的面膜的制備方法的制備方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當在其中加入鈣離子載體或腺病毒后，被激活的脂肪干細胞進入人體后可以激發(fā)外泌體的分泌量，是其它培養(yǎng)方式分泌量的2-3倍。通過使脂肪干細胞與有激活試劑接觸，可以激活這些脂肪干細胞，被激活的脂肪干細胞具有可以激發(fā)分泌的功能水平，并通過進一步傳代培養(yǎng)使其外泌體的分泌量進一步增多。
[0029] 鈣離子載體是一種特殊金屬離子物質(zhì)，它可以自由通過脂質(zhì)雙分子層和可溶性脂質(zhì)。有兩種離子載體：載體或通道形成的離子，像腺病毒為載體，在特殊的離子周圍形成一個像籠狀般的結(jié)構(gòu)，可以在疏水性雙分子層疏水區(qū)進行自由擴散；通道形成的離子，如革蘭氏陽性菌，在雙層分子膜中形成連續(xù)的液體的極面，允許離子擴散通過。另外，除了上述所述的載體外，本發(fā)明適合的離子載體包括鈣離子載體A23187(鈣霉素)、鈉鹽、鎂鹽等。如鈣離子載體A23187，這些載體能夠?qū)H梯度的變化作出反應(yīng)，以聚集鈣離子。鈣離子載體A23187具有一個酸性羧基團，它可以在整個生物膜中與其他陽離子進行交換，當離子交換完成之后，則回到膜的另一端。離子載體的有效濃度在0.05-0.5ug/毫升，離子載體的有效濃度是脂肪干細胞激活的有效濃度。
[0030] 上面對本發(fā)明的實施例進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式，上述的具體實施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護之內(nèi)。
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