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一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法

閱讀：623發(fā)布：2020-05-13

專利匯可以提供一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及一種利用DDIT3 熒光 探針制備的熒光原位雜交檢測的 試劑 盒 ，還涉及其DDIT3熒光探針的制備方法，本發(fā)明的DDIT3熒光探針及相應(yīng)的試劑盒可用于脂肪肉瘤的 鑒別 診斷 。，下面是一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種輔助脂肪肉瘤鑒別診斷及治療選擇的DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒，包括：1)雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物、未標(biāo)記的競爭性DNA、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標(biāo)記探針混合物包含DDIT3跨斷裂點(diǎn)探針，每人份熒光標(biāo)記探針混合物中DDIT3探針的使用量為1.0μl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于未標(biāo)記的競爭性DNA為Human COT-1DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50％～70％，硫酸葡聚糖濃度為0.1g／ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于DAPI復(fù)染劑配制方法為50～250ng DAPI溶于由10mg／1ml對(duì)苯二胺／PBS和甘油混合組成的1ml抗褪色液。
5.一種制備權(quán)利要求1試劑盒所述DDIT3基因重排檢測基因探針的方法：
(1)片段篩選：通過NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端的克隆，并對(duì)這些克隆進(jìn)行篩選，選擇含有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端區(qū)域的最優(yōu)克隆，編號(hào)為RP11-1077C21和CTD-2554O15；
(2)培養(yǎng)鑒定：按照DDIT3篩選確定的克隆編號(hào)購買克隆，常規(guī)培養(yǎng)，使用針對(duì)DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端區(qū)域的STS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，從而完成待選DDIT3克隆的鑒定；
(3)探針制備：對(duì)鑒定陽性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取；通過OD值的測定對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量；然后，通過切口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化；
(4)探針驗(yàn)證：使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于含DDIT3基因3基因斷
裂點(diǎn)兩端的克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對(duì)序列分別為：上游引物
5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’，及上游引物
5'-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’和下游引物5'-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μl切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U間，DNase I使用量在0.001U～0.01U間。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的Spectrum dUTP。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用1～2μl滅菌純化水或1μg/μl的Human Cot-1DNA溶解沉淀。

說明書全文

一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及一種利用DDIT3熒光探針制備的熒光原位雜交檢測的試劑盒，還涉及其DDIT3熒光探針的制備方法，本發(fā)明的DDIT3熒光探針及相應(yīng)的試劑盒可用于脂肪肉瘤的鑒別診斷。

背景技術(shù)

[0002] 脂肪肉瘤(liposarcomas)是一種常見的惡性軟組織腫瘤，起源于脂肪母細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的間葉細(xì)胞，故表現(xiàn)為不同分化程度的異型脂肪母細(xì)胞，均含有脂質(zhì)。根據(jù)細(xì)胞成分的不同，脂肪肉瘤又可分為：①高分化脂肪肉瘤，也稱脂肪瘤樣脂肪肉瘤；②粘液型脂肪肉瘤；③圓細(xì)胞型脂肪肉瘤；④多形型脂肪肉瘤；⑤未分化型脂肪肉瘤，但腫瘤中通常是多型細(xì)胞混合存在。本病多見于30～70歲患者，以50歲左右發(fā)病最多。男性多于女性。四肢特別是大腿、臀部好發(fā)，上肢、腹膜后、頭、頸塊，直徑3～10cm多見，后腹膜巨大者直徑可達(dá)20cm以上，腫瘤常為結(jié)節(jié)狀，或分葉狀，質(zhì)軟或稍硬。本病進(jìn)展相對(duì)緩慢，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除可延長病人生命。分化型及粘液型脂肪肉瘤預(yù)后較好，5年生存率可達(dá)80％左右，多形型、圓細(xì)胞型、去分化型脂肪肉瘤預(yù)后差，5年生存率20％～50％。轉(zhuǎn)移以血行轉(zhuǎn)移為主，多轉(zhuǎn)移到肺。
[0003] 肉瘤分類與臨床預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)，對(duì)于患者的治療非常重要。尤因肉瘤(Ewing sarcoma)和橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)對(duì)長春新堿/放線菌素D/環(huán)磷酰胺加異環(huán)磷酰胺/依托泊苷反應(yīng)效果好?；と饬鰧?duì)阿霉素和異環(huán)磷酰胺反應(yīng)效果好，而黏液樣脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)優(yōu)先與trabectedine(ET-743，Yondelis，PharmaMar與Johnson&Johnson藥廠研發(fā))反應(yīng)。臨床需要將脂肪肉瘤與惡性纖維組織細(xì)胞瘤中的普通型和粘液型以及橫紋肌肉瘤中的多形型進(jìn)行鑒別。一般認(rèn)為惡性纖維組織細(xì)胞瘤，來源于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，并分化為纖維細(xì)胞和組織細(xì)胞，是最常見的軟組織惡性腫瘤之一。橫紋肌肉瘤是軟組織肉瘤中惡性程度較高的，按多形性、胚胎性和腺泡性的順序惡性程度依次增高。橫紋肌肉瘤是小兒軟組織肉瘤中最多見的一種，占小兒惡性實(shí)體瘤的10％。橫紋肌肉瘤是20歲以下病人軟組織中最常見的肉瘤。目前進(jìn)行脂肪肉瘤鑒別診斷主要依靠病理學(xué)診斷。但因大約10％的肉瘤處于低分化，依靠傳統(tǒng)的組織和免疫學(xué)方法無法分類，結(jié)果使患者很難得到最佳的治療。如，惡性纖維組織細(xì)胞瘤與多形性脂肪肉瘤的鑒別診斷，后者無分層改變，但有成脂細(xì)胞和脂細(xì)胞的分化。在惡性纖維組織細(xì)胞瘤中也可能存在胞漿內(nèi)空泡，但在成脂細(xì)胞中，空泡能向細(xì)胞核和周圍轉(zhuǎn)移，并使核變平，另外，在惡性纖維組織細(xì)胞瘤細(xì)胞形成的空泡中含有粘多糖物質(zhì)。由于兩種腫瘤(前者和多形性脂肪肉瘤)的脂質(zhì)染色均為陽性，故對(duì)鑒別診斷無任何意義。手術(shù)中橫紋肌肉瘤的形態(tài)無明顯特征，很像高度軟組織肉瘤。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，在軟組織腫瘤中已經(jīng)鑒別出許多遺傳改變，這成為了腫瘤輔助診斷和分類的新的生物標(biāo)志物，對(duì)于靶向治療也產(chǎn)生積極意義。[AD Singhi，EA Montgomery.Liposarcomas.Surgical Pathology Clinics，Volume 4，Issue 3，Pages 963-994；Aatur D.Singhi，Elizabeth A.MontgomeryKrikelis D，Judson I.Role of chemotherapy in the management of soft tissue sarcoma.Expert Rev Anticancer Ther.2010；10：249-60.PMID：20132000.doi：10.1586/era.09.176；Grier HE，Krailo MD，Tarbell NJ et al.Addition of ifosfamide and etoposide to standard chemotherapy for Ewing ′s sarcoma and primitive neuroectodermal tumor of bone.N Engl J Med.2003；348：694-701；Ruymann FB，Grovas AC.Progress in the diagnosis and treatment of rhabdomyosarcoma and related soft tissue sarcomas.Cancer Invest.2000；18：223-41；Sleijfer S，Ouali M，van Glabbeke M et al.Prognostic and predictive factors for outcome to first-line ifosfamide-containing chemotherapy for adult patients with advanced soft tissue sarcomas：An exploratory，retrospective analysis on large series from the European Organization for Research and Treatment of Cancer-Soft Tissue and Bone Sarcoma Group(EORTC-STBSG).Eur J Cancer.2010；46：72-83；Alfredo L.Valente，Jamie Tull，Shengle Zhang.Utility of fluorescence in situ hybridization in sub-classifying unclassified high-grade sarcomas：A study of 40 cases using break-apart probes of EWSR1，F(xiàn)OXO1A，SS18 and DDIT3 genes.Journal of Solid Tumors，April 2012，Vol.2，No.2：4-9]
[0004] DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(DNA damage inducible transcript 3，DDIT3，也叫CHOP)位于12號(hào)染色體長臂1區(qū)3帶，與其相關(guān)的染色體重排在黏液樣脂肪肉瘤(MLS)、圓細(xì)胞脂肪肉瘤(round cell liposarcomas，RCLS)和混合型脂肪肉瘤(mixed liposarcomas)中常見。而其中的一種易位t(12；16)(q13；p11)被認(rèn)為是上述類型脂肪肉瘤的核型標(biāo)志，出現(xiàn)在超過95％的病例中。這個(gè)易位形成FUS/DDIT3融合蛋白；在少數(shù)病例中也發(fā)現(xiàn)t(12；22)(q13；q12)染色體易位，形成EWS/DDIT3融合蛋白。FUS/DDIT3融合基因的出現(xiàn)對(duì)于MLS是敏感和特異的指標(biāo)。在其他形態(tài)學(xué)上相似的腫瘤中不出現(xiàn)，如腹膜后粘液變?yōu)橹鞯母叻只救饬龊驼骋豪w維肉瘤。[Downs-Kelly，Erinn DO，Goldblum，John R.et，al.The Utility of Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)in the Diagnosis of Myxoid Soft Tissue Neoplasms.American Journal of Surgical Pathology.2008.32(1)：8-13；][0005] 綜上，DDIT3重排作為MLS、RCLS及混合型脂肪肉瘤的特異標(biāo)志，有望成為腫瘤鑒別診斷的生物標(biāo)志物。但該基因的檢測方法目前僅停留在試驗(yàn)室階段，國內(nèi)市場無靈敏度高、特異性好的檢測試劑。
[0006] 熒光原位雜交技術(shù)基于堿基互補(bǔ)原則，用已知序列標(biāo)記DNA探針與載玻片上的待測DNA/RNA互補(bǔ)雜交，在熒光顯微鏡下檢測雜交信號(hào)判斷結(jié)果。FISH技術(shù)將細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)改變聯(lián)系起來，讓微小的基因改變顯現(xiàn)于肉眼之下，拓展了細(xì)胞遺傳學(xué)檢測的范圍，顯著提高了其識(shí)別異常染色體的能力。目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、易位重排及缺失等檢測。
[0007] 本發(fā)明利用熒光原位雜交技術(shù)，以DDIT3基因斷裂區(qū)兩端為靶標(biāo)，分別設(shè)計(jì)并制備跨斷裂點(diǎn)熒光探針。利用探針實(shí)現(xiàn)對(duì)DDIT3基因重排的檢測，有助于脂肪肉瘤的鑒別診斷，通過準(zhǔn)確診斷，達(dá)到及時(shí)準(zhǔn)確治療的目的。
[0008] 本發(fā)明提供了一種脂肪肉瘤分子標(biāo)志物DDIT3探針的制備方法，并在此基礎(chǔ)上利用探針自主研制了DDIT3基因斷裂檢測試劑盒，填補(bǔ)了國內(nèi)該檢測領(lǐng)域的空白，具有十分重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供DDIT3基因探針(GSP DDIT3)的制備方法。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，GSP DDIT3的制備步驟包括：
[0011] (1)克隆篩選：通過NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有DDIT3(12q13)基因斷裂區(qū)兩側(cè)的克隆，并對(duì)這些克隆進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)的克隆。
[0012] (2)克隆培養(yǎng)和鑒定：按照篩選確定的克隆編號(hào)購買相應(yīng)的克隆(Invitrogen RPCI11.C)，取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37℃搖床中搖菌培養(yǎng)8～12小時(shí)；針對(duì)DDIT3基因探針使用相應(yīng)的STS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，從而完成待選克隆的鑒定。
[0013] (3)基因探針制備：對(duì)鑒定陽性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提??；通過OD值的測定對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量；然后，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化；獲得探針，避光、-20±5℃儲(chǔ)存。
[0014] (4)基因探針驗(yàn)證：使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，克隆篩選步驟中含有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端最優(yōu)選的克隆，編號(hào)為RP11-1077C21(chr12：57658810..57865820)和CTD-2554O15(chr12：57939268..58154978)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，RP11-1077C21克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對(duì)序列為：上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO：2)；PCR擴(kuò)增條件為：94℃5分鐘；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。CTD-2554O15克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對(duì)序列為：上游引物5’-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’(SEQ ID NO：4)；PCR擴(kuò)增條件為：94℃5分鐘；
(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA提取可使用市售的質(zhì)粒提取試劑盒，優(yōu)選Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA的定量是將質(zhì)粒DNA稀釋后分別測定260nm和280nm下的吸光度，計(jì)算產(chǎn)物濃度。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記可以使用切口平移方法標(biāo)記，利用DNaseI和DNA聚合酶I實(shí)現(xiàn)基因探針的熒光標(biāo)記。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，50μl切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U間，DNase I使用量在0.001U～0.01U間，標(biāo)記條件為16℃2小時(shí)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的dUTP，并優(yōu)選Spectrum dUTP。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用1～2μl滅菌純化水或Human Cot-1 DNA(1μg/μl)溶解沉淀。
[0023] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用DDIT3基因探針制備一種用于輔助脂肪肉瘤鑒別及治療選擇的DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒。
[0024] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案：
[0025] (1)樣本處理和制片：按照原位雜交方法對(duì)各類型樣本進(jìn)行處理。
[0026] (2)雜交：配制雜交液，主要包括標(biāo)記探針和雜交緩沖液。合適溫度下進(jìn)行8～16小時(shí)的雜交，然后以合適的洗液洗去未結(jié)合上的和非特異結(jié)合的探針；DAPI復(fù)染劑復(fù)染。
[0027] (3)通過熒光顯微鏡相應(yīng)濾塊觀察熒光信號(hào)，對(duì)不同信號(hào)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。
[0028] 基于以上技術(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括：1)雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物、未標(biāo)記的競爭性DNA，DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50％～70％，硫酸葡聚糖濃度為0.1g/ml。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，熒光標(biāo)記探針混合物包括GSP DDIT3跨斷裂點(diǎn)探針，每人份熒光標(biāo)記探針混合物中探針的使用量為1.0μl。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物和未標(biāo)記的競爭性DNA配制雜交液，其中未標(biāo)記的競爭性DNA選擇Human COT-1DNA。每人份雜交液中加入7μl雜交緩沖液，1μl熒光標(biāo)記探針混合物，Human COT-1DNA使用量為1μg，并用H2O補(bǔ)至10μl。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中DAPI復(fù)染劑配制方法為50～250ng DAPI溶于lml抗褪色液(10mg/ml對(duì)苯二胺/PBS，甘油混合液)。
[0033] 利用本發(fā)明的試劑盒，依照常規(guī)的熒光原位雜交方法對(duì)人的中期和間期細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)。
[0034] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：
[0035] (1)實(shí)現(xiàn)了對(duì)子肉瘤樣本中分子標(biāo)志物DDIT3基因狀態(tài)的檢測；
[0036] (2)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的信號(hào)計(jì)數(shù)、且結(jié)果重復(fù)性好；
[0037] (3)無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和制備高質(zhì)量的中期染色體片，可用于中期或間期細(xì)胞信號(hào)計(jì)數(shù)，操作相對(duì)簡單；
[0038] (4)通過制備成試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，有助綜合評(píng)價(jià)各分子標(biāo)志物，了解其與腫瘤發(fā)生等的聯(lián)系。附圖說明
[0039] 圖1顯示GSP DDIT3近著絲粒端克隆鑒定的電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物138bps。其中1道為marker，2道為樣本；箭頭標(biāo)示代表100bp。
[0040] 圖2顯示GSP DDIT3近端粒端克隆鑒定的電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物312bps。其中1道為marker，2道為樣本；箭頭標(biāo)示代表300bp。
[0041] 圖3顯示人類外周血淋巴細(xì)胞中期染色體上GSP DDIT3(紅色/綠色)檢測結(jié)果。
[0042] 圖4顯示人類外周血淋巴細(xì)胞間期細(xì)胞核上GSP DDIT3(紅色/綠色)檢測結(jié)果。
[0043] 圖5顯示脂肪肉瘤組織樣本中GSP DDIT3(紅色/綠色)的檢測結(jié)果。其中箭頭分別指示出兩色探針的熒光信號(hào)。
[0044] 圖6顯示DDIT3基因所在12q13區(qū)域。

具體實(shí)施方式

[0045] 下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0046] 實(shí)施例1：GSP DDIT3探針的制備
[0047] (1)引物設(shè)計(jì)克隆篩選：DDIT3基因位于人染色體12q13區(qū)段，NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有DDIT3基因的克隆，篩選出基因斷裂端兩邊的克隆，編號(hào)為RP11-1077C21和CTD-2554O15。(參見附圖6)
[0048] (2)克隆培養(yǎng)和鑒定：購買克隆，分別取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37℃搖床中搖菌培養(yǎng)8～12小時(shí)；RP11-1077C21菌液使用上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃5分鐘；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，結(jié)果在138bps具有明亮的條帶(參見附圖1)。CTD-2554O15菌液使用上游引物5’-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’和下游引物5’-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94℃5分鐘；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循環(huán)；72℃7分鐘。
[0049] (3)基因探針制備：鑒定陽性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照說明書要求的操作方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對(duì)質(zhì)粒DNA定量；按照公式：雙鏈DNA濃度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)計(jì)算質(zhì)粒DNA濃度。
[0050] 通過切口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，探針標(biāo)記的熒光素為Spectrum dUTP，分別選擇orange-dUTP和green-dUTP標(biāo)記DDIT3基因兩端探針。按如下方案，嚴(yán)格避光條件下在冰上配制PCR反應(yīng)體系。
[0051]
[0052] 配完后震蕩混勻，16℃標(biāo)記2小時(shí)，再80℃孵育10分鐘滅活酶。
[0053] 對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1.5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制：
[0054]
[0055] 混勻后置于-80℃冰箱中2小時(shí)，4℃12000rpm離心20分鐘，小心去上清，勿攪動(dòng)沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，小心去上清，勿攪動(dòng)沉淀，避光干燥。使用1μl滅菌純化水溶解沉淀，獲得DDIT3基因探針，避光、-20℃儲(chǔ)存。
[0056] (4)DDIT3基因探針驗(yàn)證：使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細(xì)胞或中期染色體上均可見熒光信號(hào)。
[0057] 實(shí)施例2：DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒制備
[0058] 以10人份/盒為例。
[0059] (1)雜交液配制
[0060] 將標(biāo)記好的探針依次放好，按下表方案配制熒光標(biāo)記探針混合物：
[0061]
[0062] 按下表方案配制雜交液：
[0063]
[0064] (2)DAPI復(fù)染劑配制
[0065] 抗褪色液：全程操作必須避光，10mg的對(duì)苯二胺溶于1ml的PBS中，調(diào)節(jié)pH為9.0，加入9ml甘油，反復(fù)震蕩混勻，-20℃儲(chǔ)存。終溶液應(yīng)該為無色或者略帶淡黃色，假如呈現(xiàn)黃色或者橙色則需廢棄并重新配制。
[0066] 用去離子水配制1mg/ml DAPI儲(chǔ)存液。
[0067] 取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光條件下反復(fù)震蕩混勻，-20℃避光密閉保存。
[0068] (3)成品組裝
[0069]組分名稱 規(guī)格 數(shù)量
雜交液 100μl/管 1管
DAPI復(fù)染劑 100μl/管 1管
說明書 1份
[0070] 實(shí)施例3：DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒在福爾馬林固定石蠟包埋的肉瘤組織樣本中的使用方法
[0071] (1)玻片預(yù)處理
[0072] 玻片放入65±5℃恒溫箱中烤片過夜；取出玻片，放入室溫二甲苯中30分鐘，再將其放入室溫1∶1(V∶V)的二甲苯：無水乙醇中10分鐘，放入室溫?zé)o水乙醇中10分鐘，再依次放入室溫100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分鐘；室溫去離子水中靜置3分鐘，吸取多余水分；100±5℃的去離子水中煮片25分鐘(切片水平放置于容器中，樣本面朝上)。在樣本區(qū)域滴加200ul的胃蛋白酶反應(yīng)液，消化20分鐘。甩去多余液體，放入2×SSC中室溫洗滌5分鐘；取出，再放入另一缸室溫2×SSC中5分鐘；取出，再放入70％、90％、100％梯度乙醇脫水各2分鐘；取出玻片，室溫晾干玻片；繼續(xù)雜交過程。
[0073] (2)樣品和探針同時(shí)變性
[0074] 從試劑盒中取出雜交液，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；加10μl的雜交液到雜交區(qū)域，迅速蓋上蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡；橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片與載玻片接觸的邊緣；將玻片放入雜交儀中，濕潤原位雜交儀濕度條，插入濕條，蓋上雜交儀上蓋，設(shè)置“Denat&Hyb”程序，變性85℃2分鐘，雜交37℃10～18小時(shí)。繼續(xù)雜交后洗滌步驟。
[0075] (3)雜交后洗滌及復(fù)染
[0076] 取出，小心去除橡皮膠水和蓋玻片；將玻片放入37±1℃2×SSC中10分鐘；再將其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗滌2分鐘；室溫70％乙醇3分鐘；暗處晾干。
[0077] 復(fù)染：滴加10μlDAPI到載玻片目標(biāo)區(qū)域，蓋上蓋玻片，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，待觀察。
[0078] (4)結(jié)果分析
[0079] 在Olympus BX53熒光顯微鏡下，用濾鏡組分別觀察DAPI復(fù)染的雜交熒光信號(hào)，用CCD照相記錄。在40×物鏡下尋找，在100×物鏡下計(jì)數(shù)；調(diào)整合適的焦距，對(duì)信號(hào)和背景有明確的概念；信號(hào)點(diǎn)因位于細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)細(xì)胞外存在熒光信號(hào)點(diǎn)時(shí)，要注意與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)點(diǎn)區(qū)分，最好能避開該區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)；調(diào)整焦距，在核的不同層次找到信號(hào)點(diǎn)；記錄觀察每個(gè)細(xì)胞中的各探針的數(shù)目。
[0080] (5)結(jié)果判定
[0081] 按處理方法要求進(jìn)行操作，記錄GSP DDIT3信號(hào)類型。熒光原位雜交結(jié)果顯示：在人外周血淋巴細(xì)胞中，中期染色體上的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)可見融合信號(hào)(或距離小于一個(gè)信號(hào)直徑的紅/綠信號(hào))(參見附圖3)，其它染色體區(qū)域未見熒光信號(hào)；間期細(xì)胞核中見融合信號(hào)(或距離小于一個(gè)信號(hào)直徑的紅/綠信號(hào))(參見附圖4)，未見其它熒光信號(hào)。在組織樣本中，核內(nèi)可見雙色探針熒光信號(hào)(參見附圖5)。
[0082] 實(shí)施例4：DDIT3基因重排檢測試劑盒的臨床使用評(píng)價(jià)
[0083] 收集11例臨床樣本，包括粘液脂肪肉瘤和其它肉瘤類型樣本為研究對(duì)象，利用本發(fā)明實(shí)施例3中所述的DDIT3基因檢測試劑盒進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如表1示。
[0084] 表1檢測結(jié)果
[0085]
[0086] 從結(jié)果可知，1例粘液性脂肪肉瘤檢測結(jié)果為FISH陽性，1例臨床病理判斷疑似粘液脂肪肉瘤的樣本檢測結(jié)果為FISH陰性，其它9例樣本均為陰性。提示在臨床檢測中應(yīng)用DDIT3檢測可輔助臨床診斷。
[0087] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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