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快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物及制備方法和試劑盒

閱讀：1032發(fā)布：2020-10-14

專利匯可以提供快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物及制備方法和試劑盒專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 公開了本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)非洲 豬瘟 病毒核酸的RPA引物及制備方法和 試劑 盒 ，屬 生物 技術(shù)領(lǐng)域，篩選出1對(duì)特異性高、敏感性強(qiáng)的RPA引物，即上游引物 2和下游引物 3，通過(guò)所述的引物進(jìn)一步建立了快速檢測(cè)ASFV核酸的RPA檢測(cè)系統(tǒng)。與普通PCR方法相比，RPA-LFA具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，RPA-LFA屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)儀器設(shè)備要求低，僅需要恒溫 水 浴鍋即可完成反應(yīng)。其次，RPA-LFA檢測(cè)速度快，反應(yīng)時(shí)間在40min，比常規(guī)PCR反應(yīng)時(shí)間要短。第三，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的 可視化 ，這些特點(diǎn)使得本發(fā)明建立的RPA-LFA方法可以用于 基層 單位普通實(shí)驗(yàn)室ASFV快速檢測(cè)和 鑒別 診斷 。，下面是快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物及制備方法和試劑盒專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，其上游引物核苷酸序列為<210>2，其下游引物核苷酸序列為210(3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，主要通過(guò)下列步驟制備：
ASFV?P72基因的合成及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
確定P72基因序列進(jìn)行P72全長(zhǎng)cDNA的體外合成，并克隆至pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72，將pT-ASFV-P72質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將含有重組質(zhì)粒的重組陽(yáng)性菌過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度；
ASFV?P72基因重組質(zhì)?？截悢?shù)的確定：
將pT-ASFV-P72質(zhì)?？截悢?shù)稀釋在1×108～100拷貝/μL之間，
RPA引物的設(shè)計(jì)
利用BioEdit分子生物學(xué)軟件對(duì)若干個(gè)ASFV不同毒株的P72基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出高度保守的區(qū)域作為RPA引物設(shè)計(jì)的靶序列，根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則，引物長(zhǎng)度30～35bp，設(shè)計(jì)若干對(duì)特異性引物，用地高辛標(biāo)記上游引物5'端，用生物素標(biāo)記下游引物5'端，擴(kuò)增片段大小約為220bp，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、敏感性和產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)和篩選引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物；
RPA反應(yīng)體系的配制及操作程序
配制RPA反應(yīng)體系，包含RPA-F、RPA-R、Rehydration?Buffer?29.5μL、dd?H2O、模板和醋酸鎂，將模板DNA和MgAc之外的所有試劑預(yù)混后，加入含有凍干酶制劑的PCR反應(yīng)管中，并充分混勻，將模板加入反應(yīng)管中，并將MgAc加入反應(yīng)管蓋中，蓋緊后瞬時(shí)離心并渦旋，置于35-
45℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行RPA反應(yīng)35-45min；
RPA最佳引物的篩選：
配制RPA反應(yīng)體系，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板，分別用所選出的若干對(duì)ASFV?RPA引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，隨后用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，評(píng)價(jià)引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，通過(guò)下列步驟制備：采用檸檬酸三鈉還原法制備制備平均顆粒直徑為40nm的膠體金溶液，將膠體金溶液加入試管中，向其中加入兔抗地高辛抗體IgG，恒溫緩慢振蕩25-35min，3-5℃、
12500-13500r/min離心35-45min，棄去上清液，沉淀溶解于Tris-HCL緩沖溶液中，低溫密封保存，得膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG。
4.一種快速檢測(cè)快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的試劑，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物制備。
5.一種快速檢測(cè)快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的試劑盒，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求3所述的膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG制備，
所述試劑盒分至少包含以下5個(gè)部分：
加樣墊、結(jié)合墊、NC膜、吸收墊和PVC塑料墊，所述的NC膜上設(shè)有檢測(cè)線，即T線和質(zhì)控線即C線，將所述的膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG用移液槍均勻滴加噴到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中干燥后取出，作為結(jié)合墊，在NC膜上，檢測(cè)線上包被經(jīng)PBS緩沖液稀釋的鏈霉親和素，質(zhì)控線上包被豬抗兔IgG，干燥，組裝的順序依次為：在PVC板的中間區(qū)域貼上NC膜，結(jié)合墊貼在NC膜的前方區(qū)域；結(jié)合墊壓NC膜1.5-2.5mm，再在結(jié)合墊的前方貼上樣品墊，樣品墊壓結(jié)合墊1.5-2.5mm，最后將吸水墊在NC膜的后方，吸水墊壓NC膜1.5-2.5mm，用試紙條切割刀切為3.5-4.5mm的試紙條，將制備好的試紙條包裝。
6.一種快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，主要包含下列步驟：
ASFV?P72基因的合成及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建：確定P72基因序列進(jìn)行P72全長(zhǎng)cDNA的體外合成，并克隆至pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72，將pT-ASFV-P72質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將含有重組質(zhì)粒的重組陽(yáng)性菌過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度；
ASFV?P72基因重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的確定：將pT-ASFV-P72質(zhì)?？截悢?shù)稀釋在1×108～100拷貝/μL之間，
RPA引物的設(shè)計(jì)：利用BioEdit分子生物學(xué)軟件對(duì)若干個(gè)ASFV不同毒株的P72基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出高度保守的區(qū)域作為RPA引物設(shè)計(jì)的靶序列，根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則，引物長(zhǎng)度30～35bp，設(shè)計(jì)若干對(duì)特異性引物，用地高辛標(biāo)記上游引物5'端，用生物素標(biāo)記下游引物5'端，擴(kuò)增片段大小約為220bp，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、敏感性和產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)和篩選引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物；
RPA反應(yīng)：配制RPA反應(yīng)體系，包含RPA-F、RPA-R、Rehydration?Buffer?29.5μL、dd?H2O、模板和醋酸鎂，將模板DNA和MgAc之外的所有試劑預(yù)混后，加入含有凍干酶制劑的PCR反應(yīng)管中，并充分混勻，將模板加入反應(yīng)管中，并將MgAc加入反應(yīng)管蓋中，蓋緊后瞬時(shí)離心并渦旋，置于35-45℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行RPA反應(yīng)35-45min；
RPA最佳引物的篩選：配制RPA反應(yīng)體系，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板，分別用所選出的若干對(duì)ASFV?RPA引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，隨后用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，評(píng)價(jià)引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。

說(shuō)明書全文

快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物及制備方法和試劑盒

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的RPA引物及制備方法和試劑盒，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

[0002] 非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)又稱非洲豬瘟疫，是由非洲豬瘟病毒(African?swine?fever?virus，ASFV)感染引起的一種嚴(yán)重危害豬及野豬的急性、高度接觸性傳染病，其病程短，死亡率高達(dá)100％，是目前對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的烈性傳染病之一。該病屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)要求報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國(guó)動(dòng)物病原微生物名錄中ASFV被列為一類動(dòng)物病原微生物。我國(guó)是以農(nóng)業(yè)為主的養(yǎng)豬大國(guó)之一，目前雖然沒(méi)有發(fā)生本病的報(bào)道，但與我國(guó)接壤的俄羅斯多次發(fā)生該病，中俄之間頻繁的畜產(chǎn)品貿(mào)易往來(lái)導(dǎo)致該病輸入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加。同時(shí)，由于ASF在臨床上和豬瘟(CSF)難以鑒別診斷，目前我國(guó)對(duì)ASF防控只能依賴于嚴(yán)格的疫病檢疫和監(jiān)測(cè)措施。因此，研發(fā)ASFV快速檢測(cè)方法對(duì)于防止ASF傳入我國(guó)具有十分重要的意義。
[0003] ASFV屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)成員，也是目前已知唯一的蟲媒DNA病毒。ASFV基因組為線性雙鏈DNA，大小約為170～193kb，編碼151～167個(gè)病毒蛋白。
[0004] ASFV快速檢測(cè)方法對(duì)于防控ASF具有重要的意義，但國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有商品化ASFV快速檢測(cè)試劑盒。目前，ASFV的檢測(cè)主要通過(guò)病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等方法。然而，ASFV的分離需要在三級(jí)生物安全(BSL-3)以上的高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，不適合于基層單位普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。在血清學(xué)檢測(cè)上，熒光抗體試驗(yàn)(FAT)是檢測(cè)ASFV感染的常用方法，通過(guò)利用熒光素標(biāo)記的抗ASFV特異性抗體檢測(cè)病料中的ASFV抗原，可用于可疑豬或?qū)嶒?yàn)室接種豬病變組織的ASFV抗原檢測(cè)。雖然該方法具有快速、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn)，但是需要昂貴的熒光顯微鏡、高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)員，目前該方法僅作為診斷ASF的輔助檢測(cè)方法。雙抗體夾心阻斷ELISA也是檢測(cè)ASFV感染的一種血清學(xué)檢測(cè)方法，該方法利用特異性的ASFV單克隆抗體包被酶標(biāo)板，加入待檢樣本后，如果樣本中含有ASFV抗原，則ASFV抗原與單抗特異性結(jié)合，再加入ASFV抗原另一表位的酶標(biāo)單抗，形成雙抗體夾心復(fù)合物，加入底物顯色后指示樣本中是否含有ASFV抗原。Vidal等以抗ASFV?P72蛋白的單克隆抗體建立了夾心ELISA方法。西班牙生產(chǎn)了INGENASA夾心ELISA試劑盒，以包被的P72單抗檢測(cè)病死豬血液及組織中的樣本中的ASFV抗原，具有良好的特異性和敏感性，被OIE指定為ASFV檢測(cè)的參考試劑盒。然而，該試進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，限制了該試劑盒在我國(guó)的廣泛使用。
[0005] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了檢測(cè)ASFV核酸的常規(guī)RT-PCR、real-time?RT-PCR和巢式RT-PCR等多種分子生物學(xué)方法。常規(guī)RT-PCR方法具有商度的特異性和靈敏度、操作過(guò)程較為簡(jiǎn)單，并且其生物安全性較高，散毒危險(xiǎn)小，且不需要對(duì)病原進(jìn)行分離培養(yǎng)，廣泛運(yùn)用于ASFV的檢測(cè)，被OIE列為ASFV的PCR標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。real-time?RT-PCR比常規(guī)PCR的檢測(cè)更見(jiàn)快速和敏感，并且該檢測(cè)在封閉體系中進(jìn)行，不需進(jìn)行電泳試驗(yàn)，避免了因電泳引起的交叉污染而造成假陽(yáng)性，同時(shí)，也減少了EB的污染。巢式PCR方法涉及兩次對(duì)PCR的擴(kuò)増。先用外引物對(duì)其DNA模板進(jìn)行特異性擴(kuò)増，擴(kuò)増產(chǎn)物為第二次擴(kuò)増的模板，在進(jìn)行內(nèi)引物的PCR擴(kuò)増。兩次連續(xù)特異性擴(kuò)増降低了因?yàn)榘形稽c(diǎn)過(guò)多而發(fā)生錯(cuò)配出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增的可能，因此在靈敏度及特異化上，都較常規(guī)的PCR高，檢測(cè)結(jié)果具有更好的準(zhǔn)確性。然而，上述方法或需要昂貴的儀器設(shè)備，或需要技術(shù)嫻熟的技術(shù)人員，或需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物和探針，或反應(yīng)試劑需要冷鏈運(yùn)輸和保存，不適合普通實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。2006年，一種新等溫基因擴(kuò)增技術(shù)--重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase? polymerase?amplification，RPA)被發(fā)明。該技術(shù)可在37～42℃條件下、10～30min內(nèi)等溫體外大量擴(kuò)增目的基因片段。隨后，英國(guó)TwistDx公司開發(fā)出了RPA商品化試劑盒，加快了RPA技術(shù)的研發(fā)、推廣和應(yīng)用。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相比，PRA具有擴(kuò)增速度快、反應(yīng)溫度恒定、所需儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于DNA或RNA的快速檢測(cè)。目前，RPA已經(jīng)在病毒、衣原體、支原體、細(xì)菌、寄生蟲等病原檢測(cè)方面得到了開發(fā)與應(yīng)用。該技術(shù)通過(guò)利用重組酶結(jié)合引物形成蛋白-DNA混合物，啟動(dòng)尋找模板DNA上的同源序列；當(dāng)同源序列定位后，則會(huì)引發(fā)鏈置換反應(yīng)。引物結(jié)合到對(duì)應(yīng)模板上，聚合酶進(jìn)而從引物3’末端開始啟動(dòng)DNA合成，實(shí)現(xiàn)了在常溫下兩條引物對(duì)靶基因的幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。同時(shí)，在RPA反應(yīng)體系中，對(duì)引物堿基突變具有較強(qiáng)的耐受性，在引物個(gè)別堿基突變后，RPA反應(yīng)依然可以順利進(jìn)行。
[0006] 免疫側(cè)流層析技術(shù)(Lateral?flow?assay，LFA)是當(dāng)將含有待測(cè)抗原(或抗體)的樣品滴在加樣區(qū)，待測(cè)樣品中的抗原(或抗體)與結(jié)合墊中的膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)結(jié)合并通過(guò)毛細(xì)作用向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測(cè)區(qū)后，與檢測(cè)線上固定的抗體(或抗原)結(jié)合，形成膠體金微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測(cè)線(T線)上，而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線(C線)二抗結(jié)合。若將RPA和LFA技術(shù)相結(jié)合，既可以實(shí)現(xiàn)ASFV核酸的等溫體外快速擴(kuò)增，又可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可視化，在無(wú)需特殊儀器設(shè)備下即可實(shí)現(xiàn)ASFV的分子生物學(xué)快速檢測(cè)，為ASF的臨床快速診斷提供了一種新的手段，對(duì)預(yù)防和控制ASF在我國(guó)的流行具有十分重要的意義。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)利用重組酶聚合酶擴(kuò)增-免疫側(cè)流層析(RPA-LFA)技術(shù)實(shí)現(xiàn)ASFV核酸的快速、可視化檢測(cè)。針對(duì)ASFV基因組中髙保守的特異性序列P72基因?yàn)閿U(kuò)增的靶基因序列，根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了3對(duì)RPA特異性引物，上游引物5'端用地高辛標(biāo)記，下游引物5'端用生物素標(biāo)記，通過(guò)對(duì)含有ASFV?P72基因的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行RPA擴(kuò)增試驗(yàn)，從中篩選出1對(duì)特異性高、敏感性強(qiáng)的RPA引物，建立了檢測(cè)ASFV核酸的RPA檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，將膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體鋪在結(jié)合墊上，NC膜上檢測(cè)線包被鏈霉親和素，質(zhì)控線上包被豬抗兔IgG，配合加樣墊和吸收墊組裝LFA層析試紙條。將RPA擴(kuò)增產(chǎn)物滴加于LFA試紙條上樣墊上，建立了檢測(cè)ASFV特異性核酸的RPA-LFA可視化檢測(cè)方法。利用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬流感病毒(SIV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬偽狂犬病毒(PRV)等多種病毒進(jìn)行擴(kuò)增，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA可視化檢測(cè)方法具有很高的特異性和敏感性，為基層單位普通實(shí)驗(yàn)室ASFV感染的診斷提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

[0008] 本發(fā)明的目的是利用重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)(RPA-LFA)建立檢測(cè)ASFV核酸的可視化快速檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)其他病毒核酸樣本的檢測(cè)證實(shí)建立的ASFVRPA-LFA可視化檢測(cè)方法具有很高的特異性和敏感性，為ASFV感染的診斷提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)利用重組酶聚合酶擴(kuò)增-免疫側(cè)流層析(RPA-LFA)技術(shù)實(shí)現(xiàn)ASFV核酸的快速、可視化檢測(cè)。針對(duì)ASFV基因組中髙保守的特異性序列P72基因?yàn)閿U(kuò)增的靶基因序列，根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)若干對(duì)RPA特異性引物，上游引物5'端用地高辛標(biāo)記，下游引物5'端用生物素標(biāo)記，通過(guò)對(duì)含有ASFV?P72基因的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行RPA擴(kuò)增試驗(yàn)，從中篩選出1對(duì)特異性高、敏感性強(qiáng)的RPA引物，即上游引物<210>2和下游引物<210>3，通過(guò)所述的引物進(jìn)一步建立了快速檢測(cè)ASFV核酸的RPA檢測(cè)系統(tǒng)。
[0010] 在此基礎(chǔ)上，將膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體鋪在結(jié)合墊上，NC膜上檢測(cè)線包被鏈霉親和素，質(zhì)控線上包被豬抗兔IgG，配合加樣墊和吸收墊組裝LFA層析試紙條。將RPA擴(kuò)增產(chǎn)物滴加于LFA試紙條上樣墊上，建立了檢測(cè)ASFV特異性核酸的RPA-LFA可視化檢測(cè)方法。利用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬流感病毒(SIV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬偽狂犬病毒(PRV)等多種病毒進(jìn)行擴(kuò)增，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA可視化檢測(cè)方法具有很高的特異性和敏感性，為基層單位普通實(shí)驗(yàn)室ASFV感染的診斷提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。
[0011] 將重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)和免疫側(cè)流層析(LFA)技術(shù)有效結(jié)合，建立了可快速檢測(cè)ASFV核酸可視化方法。首先利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)對(duì)ASFV核酸進(jìn)行擴(kuò)增，由于RPA的上游引物5'端用地高辛標(biāo)記，下游引物5'端用生物素標(biāo)記，因此RPA擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物可與和膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體IgG結(jié)合，繼續(xù)擴(kuò)散后又與親和素發(fā)生結(jié)合，因此在NC膜的檢測(cè)線(T線)上會(huì)出現(xiàn)特異性的膠體金條帶；隨著膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG的遷移，會(huì)與羊抗兔IgG結(jié)合，在質(zhì)控線(C線)也會(huì)出現(xiàn)條帶。當(dāng)RPA擴(kuò)增結(jié)果為陰性時(shí)，上游引物會(huì)被膠體金標(biāo)記抗地高辛抗體所吸收，下游引物雖然能與親和素發(fā)生結(jié)合，但沒(méi)有攜帶膠體金顆粒，因此在NC膜的檢測(cè)線(T線)上不出現(xiàn)特異性的條帶；同時(shí)隨著膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體復(fù)合物的遷移，會(huì)與豬抗兔IgG結(jié)合，因此在NC膜的質(zhì)控線(C線)上會(huì)出現(xiàn)膠體金條帶。
[0012] 本發(fā)明主要涉及以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：
[0013] 1、ASFV?P72基因的合成及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0014] 2、ASFV?P72基因重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的確定
[0015] 3、ASFV?RPA引物的設(shè)計(jì)
[0016] 4、ASFV?RPA反應(yīng)體系的配制及操作程序
[0017] 5、ASFV?RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0018] 6、RPA-LFA可視化檢測(cè)方法的建立、操作步驟及結(jié)果判定
[0019] 7、RPA-LFA可視化檢測(cè)方法特異性的評(píng)價(jià)
[0020] 8、RPA-LFA可視化檢測(cè)方法敏感性的評(píng)價(jià)
[0021] 本發(fā)明具體過(guò)程如下：
[0022] 1、ASFV?P72基因的合成及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023] 根據(jù)GenBank中登錄的ASFV基因組參考序列(登錄號(hào)：AY578706)，確定P72基因序列(1941bp)，進(jìn)行P72全長(zhǎng)cDNA(1941bp)的體外合成，并克隆至pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72。將pT-ASFV-P72質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，通過(guò)PCR和測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果可得到出現(xiàn)一條特異性條帶；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，該序列與ASFV?P72基因(AY578706)的同源性為100％。將含有重組質(zhì)粒的重組陽(yáng)性菌過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度。經(jīng)測(cè)定，重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72濃度為52ng/μL。
[0024] 2、ASFV?P72基因重組質(zhì)?？截悢?shù)的確定
[0025] 根據(jù)下列公式，計(jì)算重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL＝6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)。
[0026] 對(duì)合成的質(zhì)粒進(jìn)行用OIE推薦的引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性條帶，大小約257bp。測(cè)序結(jié)果表明序列與ASFV?P72基因(AY578706)的同源性為100％。提取重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72的濃度為52ng/μL，重組質(zhì)粒的堿基數(shù)為4633bp，經(jīng)計(jì)算得知提取質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.02×1010拷貝/μL。經(jīng)系列倍比稀釋，將pT-ASFV-P72質(zhì)粒拷貝數(shù)稀釋在1×1080
～10拷貝/μL之間。
[0027] 3、RPA引物的設(shè)計(jì)
[0028] 下載GenBank中登錄的ASFV?P72基因序列，利用BioEdit分子生物學(xué)軟件對(duì)31個(gè)ASFV不同毒株的P72基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出高度保守的區(qū)域作為RPA引物設(shè)計(jì)的靶序列。根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則，引物長(zhǎng)度30～35bp，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物(表1)，用地高辛標(biāo)記上游引物5'端，用生物素標(biāo)記下游引物5'端，擴(kuò)增片段大小約為220bp。以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、敏感性和產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)和篩選引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。同時(shí)，合成OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光PCR方法使用的引物(表1)。
[0029] 4、RPA反應(yīng)體系的配制及操作程序
[0030] 配制50μL?RPA反應(yīng)體系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，Rehydration?Buffer?29.5μL，dd?H2O?12.2μL，模板1μL，280mM醋酸鎂(MgAc)2.5μL。將模板DNA和MgAc之外的所有試劑預(yù)混后，加入含有凍干酶制劑的0.2mL?PCR反應(yīng)管中，并充分混勻。將1μL模板加入反應(yīng)管中，并將2.5μL?MgAc加入反應(yīng)管蓋中，蓋緊后瞬時(shí)離心并渦旋，置于40℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行RPA反應(yīng)。
[0031] 5、RPA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0032] 5.1RPA最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
[0033] 為確定RPA最佳反應(yīng)時(shí)間，以1×103拷貝/μL的重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板，分別以10min、20min、30min和40min為不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行RPA擴(kuò)增。RPA反應(yīng)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40℃下RPA反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí)，電泳即可獲得一條大小約為220bp的特異性條帶。對(duì)RPA產(chǎn)物條帶用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，RPA反應(yīng)30min后，條帶約為20min時(shí)條帶的6.9倍，而反應(yīng)40min后擴(kuò)增的條帶沒(méi)有顯著增加，因此將ASFV?RPA最佳反應(yīng)時(shí)間確定為30min。
[0034] 5.2RPA最佳反應(yīng)溫度的確定
[0035] 為準(zhǔn)確比對(duì)不同溫度下RPA-LFA反應(yīng)的擴(kuò)增效率，配制50μL?RPA反應(yīng)體系，充分混勻后，分別放入20、25、30、35、40和45℃水浴箱內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，30min后分別從各管中取10μL擴(kuò)增液。結(jié)果該檢測(cè)體系在25～45℃的溫度范圍內(nèi)均可有效進(jìn)行，其中40℃時(shí)擴(kuò)增效率最佳，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析時(shí)條帶最深，因此最佳反應(yīng)溫度確定為40℃。
[0036] 5.3RPA最佳引物的篩選
[0037] 配制50μL?RPA反應(yīng)體系，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72?DNA為模板，分別用3對(duì)ASFV?RPA引物(RPA?FP1-RP1、RPA?FP2-RP2、RPA?FP3-RP3)進(jìn)行RPA擴(kuò)增，隨后用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，評(píng)價(jià)引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。結(jié)果引物(RPA?FP2-RP2)的引物擴(kuò)增效率及特異性最高，成功篩選出檢測(cè)ASFV的最佳RPA引物RPA?FP2-RP2。
[0038] 6、RPA-LFA檢測(cè)方法的建立及結(jié)果判定
[0039] 6.1金標(biāo)抗體的制備
[0040] 采用檸檬酸三鈉還原法制備制備平均顆粒直徑為40nm的膠體金溶液。吸取1mL膠體金溶液加入試管中，向其中加入5μg兔抗地高辛抗體IgG，恒溫緩慢振蕩30min。4℃、13?000r/min離心40min。棄去上清液，沉淀溶解于0.1moL/L的Tris-HCL緩沖溶液中(pH＝8.0)。
制備好的溶液4℃密封保存，備用。
[0041] 6.2RPA-LFA試紙條的制備
[0042] RPA-LFA試紙條由加樣墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC膜)[檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)]、吸收墊和PVC塑料墊5個(gè)部分組成(圖1)。將制備的膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG用移液槍均勻滴加噴到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出，作為結(jié)合墊(金標(biāo)墊)。在NC膜上，檢測(cè)線(T線)上包被經(jīng)PBS(0.01moL/L，pH＝7.4)緩沖液稀釋至2mg/mL的鏈霉親和素(Streptavidin，SA)，質(zhì)控線(C線)上包被2mg/mL的豬抗兔IgG，室溫下干燥30min。組裝的順序依次為：在PVC板的中間區(qū)域貼上NC膜，結(jié)合墊貼在NC膜的前方區(qū)域；為保證良好的接觸，結(jié)合墊壓NC膜2mm，再在結(jié)合墊的前方貼上樣品墊，樣品墊壓結(jié)合墊2mm，最后將吸水墊在NC膜的后方，吸水墊壓NC膜2mm。用試紙條切割刀切為4mm的試紙條。將制備好的試紙條置于放有干燥劑的錫箱袋內(nèi)，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>
[0043] 6.3RPA-LFA檢測(cè)方法操作步驟及結(jié)果判定
[0044] 在RPA擴(kuò)增結(jié)束后，用微量移液器取5μL?RPA產(chǎn)物，稀釋至80μL，滴加于RPA-LFA試紙條加樣墊。為了分析RPA-LFA體系的最適反應(yīng)時(shí)間，將加樣完畢的裝置放入37℃孵育0、1、5、10、15min，取出RPA-LFA試紙條，用肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在反應(yīng)5min時(shí)，試紙條上開始出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，但條帶顏色較淺；當(dāng)反應(yīng)10min時(shí)，條帶變得深且清晰。因此，以反應(yīng)10min作為結(jié)果判讀時(shí)間。若質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)均顯色，則判讀結(jié)果為陽(yáng)性；若僅質(zhì)控線顯色，則為陰性；若質(zhì)控線不顯色，表明試紙條失效。
[0045] 7、RPA-LFA檢測(cè)方法的特異性的評(píng)價(jià)
[0046] 用病毒RNA提取試劑盒提取CSFV、PRRSV、FMDV、SIV的總RNA,并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime?Script?RT-PCR?Kit，TaKaRa)的操作，將提取的RNA制備成cDNA，–20℃保存?zhèn)溆?。用病毒DNA提取試劑盒提取PRV和PCV-2的病毒基因組DNA,–20℃保存?zhèn)溆?。分別以上述病毒的cDNA、DNA及pT-ASFV-P72為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。結(jié)果只有pT-ASFV-P72為模板的DNA樣品在檢測(cè)線上出現(xiàn)了特異性的膠體金條帶，其他病毒的cDNA或DNA為模板的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明沒(méi)有與其他病毒的DNA樣品發(fā)生交叉反應(yīng)，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA檢測(cè)方法具有良好的特異性。
[0047] 8、RPA-LFA檢測(cè)方法的敏感性的評(píng)價(jià)
[0048] 將重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其濃度在1×108～1×100拷貝/μL之間，并將其作為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定該方法的最低檢測(cè)濃度。同時(shí)比較與OIE推薦的常規(guī)PCR方法的敏感性。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RPA-LFA最低可以檢測(cè)到1×101拷貝/μL重組質(zhì)粒DNA，常規(guī)PCR檢測(cè)方法最低也可以檢測(cè)到1×101拷貝/μL重組質(zhì)粒DNA，表明RPA-LFA與常規(guī)PCR方法的敏感性相同，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA檢測(cè)方法具有良好的敏感性。
[0049] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0050] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)ASFV核酸的RPA-LFA新方法。與普通PCR方法相比，RPA-LFA具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，RPA-LFA屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)儀器設(shè)備要求低，僅需要恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)。其次，RPA-LFA檢測(cè)速度快，反應(yīng)時(shí)間在40min，比常規(guī)PCR反應(yīng)時(shí)間要短。第三，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可視化，這些特點(diǎn)使得本發(fā)明建立的RPA-LFA方法可以用于基層單位普通實(shí)驗(yàn)室ASFV快速檢測(cè)和鑒別診斷。附圖說(shuō)明
[0051] 圖1為ASFV?RPA-LFA檢測(cè)試紙條的組裝示意圖。
[0052] 圖2為RPA-LFA對(duì)pT-ASFV-P72基因重組質(zhì)粒DNA可視化RPA-LFA檢測(cè)結(jié)果。
[0053] 圖2中：1,3：以pT-ASFV-P72重組質(zhì)粒DNA為模板的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果；2：以CSFV?cDNA為模板的陰性檢測(cè)結(jié)果。
[0054] 圖3為表1，為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的ASFV特異性引物。

具體實(shí)施方式

[0055] 1、ASFV?P72基因的合成及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0056] 根據(jù)GenBank中登錄的ASFV基因組參考序列(登錄號(hào)：AY578706)，確定P72基因序列(1941bp)，進(jìn)行P72全長(zhǎng)cDNA(1941bp)的體外合成，并克隆至pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72。將pT-ASFV-P72質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，通過(guò)PCR和測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果可得到出現(xiàn)一條特異性條帶；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，該序列與ASFV?P72基因(AY578706)的同源性為100％。將含有重組質(zhì)粒的重組陽(yáng)性菌過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度。經(jīng)測(cè)定，重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72濃度為52ng/μL。
[0057] 2、ASFV?P72基因重組質(zhì)?？截悢?shù)的確定
[0058] 根據(jù)下列公式，計(jì)算重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL＝6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)。
[0059] 對(duì)合成的質(zhì)粒進(jìn)行用OIE推薦的引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性條帶，大小約257bp。測(cè)序結(jié)果表明序列與ASFV?P72基因(AY578706)的同源性為100％。提取重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72的濃度為52ng/μL，重組質(zhì)粒的堿基數(shù)為4633bp，經(jīng)計(jì)算得知提取質(zhì)粒10 8
的拷貝數(shù)為1.02×10 拷貝/μL。經(jīng)系列倍比稀釋，將pT-ASFV-P72質(zhì)粒拷貝數(shù)稀釋在1×10～100拷貝/μL之間。
[0060] 3、RPA引物的設(shè)計(jì)
[0061] 下載GenBank中登錄的ASFV?P72基因序列，利用BioEdit分子生物學(xué)軟件對(duì)31個(gè)ASFV不同毒株的P72基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出高度保守的區(qū)域作為RPA引物設(shè)計(jì)的靶序列。根據(jù)RPA引物的設(shè)計(jì)原則，引物長(zhǎng)度30～35bp，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物(表1)，用地高辛標(biāo)記上游引物5'端，用生物素標(biāo)記下游引物5'端，擴(kuò)增片段大小約為220bp。以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72DNA為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、敏感性和產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)和篩選引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。同時(shí)，合成OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光PCR方法使用的引物(表1)。
[0062] 4、RPA反應(yīng)體系的配制及操作程序
[0063] 配制50μL?RPA反應(yīng)體系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，Rehydration?Buffer?29.5μL，dd?H2O?12.2μL，模板1μL，280mM醋酸鎂(MgAc)2.5μL。將模板DNA和MgAc之外的所有試劑預(yù)混后，加入含有凍干酶制劑的0.2mL?PCR反應(yīng)管中，并充分混勻。將1μL模板加入反應(yīng)管中，并將2.5μL?MgAc加入反應(yīng)管蓋中，蓋緊后瞬時(shí)離心并渦旋，置于40℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行RPA反應(yīng)。
[0064] 5、RPA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0065] 5.1RPA最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
[0066] 為確定RPA最佳反應(yīng)時(shí)間，以1×103拷貝/μL的重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72?DNA為模板，分別以10min、20min、30min和40min為不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行RPA擴(kuò)增。RPA反應(yīng)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40℃下RPA反應(yīng)時(shí)間為20min時(shí)，電泳即可獲得一條大小約為220bp的特異性條帶。對(duì)RPA產(chǎn)物條帶用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，RPA反應(yīng)30min后，條帶約為20min時(shí)條帶的6.9倍，而反應(yīng)40min后擴(kuò)增的條帶沒(méi)有顯著增加，因此將ASFV?RPA最佳反應(yīng)時(shí)間確定為30min。
[0067] 5.2RPA最佳反應(yīng)溫度的確定
[0068] 為準(zhǔn)確比對(duì)不同溫度下RPA-LFA反應(yīng)的擴(kuò)增效率，配制50μL?RPA反應(yīng)體系，充分混勻后，分別放入20、25、30、35、40和45℃水浴箱內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，30min后分別從各管中取10μL擴(kuò)增液。結(jié)果該檢測(cè)體系在25～45℃的溫度范圍內(nèi)均可有效進(jìn)行，其中40℃時(shí)擴(kuò)增效率最佳，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析時(shí)條帶最深，因此最佳反應(yīng)溫度確定為40℃。
[0069] 5.3RPA最佳引物的篩選
[0070] 配制50μL?RPA反應(yīng)體系，以重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72?DNA為模板，分別用3對(duì)ASFV?RPA引物(RPA?FP1-RP1、RPA?FP2-RP2、RPA?FP3-RP3)進(jìn)行RPA擴(kuò)增，隨后用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，評(píng)價(jià)引物擴(kuò)增效率及特異性，以此選擇最佳引物。結(jié)果引物(RPA?FP2-RP2)的引物擴(kuò)增效率及特異性最高，成功篩選出檢測(cè)ASFV的最佳RPA引物RPA?FP2-RP2。
[0071] 6、RPA-LFA檢測(cè)方法的建立及結(jié)果判定
[0072] 6.1金標(biāo)抗體的制備
[0073] 采用檸檬酸三鈉還原法制備制備平均顆粒直徑為40nm的膠體金溶液。吸取1mL膠體金溶液加入試管中，向其中加入5μg兔抗地高辛抗體IgG，恒溫緩慢振蕩30min。4℃、13?000r/min離心40min。棄去上清液，沉淀溶解于0.1moL/L的Tris-HCL緩沖溶液中(pH＝8.0)。
制備好的溶液4℃密封保存，備用。
[0074] 6.2RPA-LFA試紙條的制備
[0075] RPA-LFA試紙條由加樣墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC膜)[檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)]、吸收墊和PVC塑料墊5個(gè)部分組成(圖1)。將制備的膠體金標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG用移液槍均勻滴加噴到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出，作為結(jié)合墊(金標(biāo)墊)。在NC膜上，檢測(cè)線(T線)上包被經(jīng)PBS(0.01moL/L，pH＝7.4)緩沖液稀釋至2mg/mL的鏈霉親和素(Streptavidin，SA)，質(zhì)控線(C線)上包被2mg/mL的豬抗兔IgG，室溫下干燥30min。組裝的順序依次為：在PVC板的中間區(qū)域貼上NC膜，結(jié)合墊貼在NC膜的前方區(qū)域；為保證良好的接觸，結(jié)合墊壓NC膜2mm，再在結(jié)合墊的前方貼上樣品墊，樣品墊壓結(jié)合墊2mm，最后將吸水墊在NC膜的后方，吸水墊壓NC膜2mm。用試紙條切割刀切為4mm的試紙條。將制備好的試紙條置于放有干燥劑的錫箱袋內(nèi)，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>
[0076] 6.3RPA-LFA檢測(cè)方法操作步驟及結(jié)果判定
[0077] 在RPA擴(kuò)增結(jié)束后，用微量移液器取5μL?RPA產(chǎn)物，稀釋至80μL，滴加于RPA-LFA試紙條加樣墊。為了分析RPA-LFA體系的最適反應(yīng)時(shí)間，將加樣完畢的裝置放入37℃孵育0、1、5、10、15min，取出RPA-LFA試紙條，用肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在反應(yīng)5min時(shí)，試紙條上開始出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，但條帶顏色較淺；當(dāng)反應(yīng)10min時(shí)，條帶變得深且清晰。因此，以反應(yīng)10min作為結(jié)果判讀時(shí)間。若質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)均顯色，則判讀結(jié)果為陽(yáng)性；若僅質(zhì)控線顯色，則為陰性；若質(zhì)控線不顯色，表明試紙條失效。
[0078] 7、RPA-LFA檢測(cè)方法的特異性的評(píng)價(jià)
[0079] 用病毒RNA提取試劑盒提取CSFV、PRRSV、FMDV、SIV的總RNA,并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime?Script?RT-PCR?Kit，TaKaRa)的操作，將提取的RNA制備成cDNA，–20℃保存?zhèn)溆?。用病毒DNA提取試劑盒提取PRV和PCV-2的病毒基因組DNA,–20℃保存?zhèn)溆?。分別以上述病毒的cDNA、DNA及pT-ASFV-P72為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。結(jié)果只有pT-ASFV-P72為模板的DNA樣品在檢測(cè)線上出現(xiàn)了特異性的膠體金條帶，其他病毒的cDNA或DNA為模板的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明沒(méi)有與其他病毒的DNA樣品發(fā)生交叉反應(yīng)，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA檢測(cè)方法具有良好的特異性。
[0080] 8、RPA-LFA檢測(cè)方法的敏感性的評(píng)價(jià)
[0081] 將重組質(zhì)粒pT-ASFV-P72進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其濃度在1×108～1×100拷貝/μL之間，并將其作為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定該方法的最低檢測(cè)濃度。同時(shí)比較與OIE推薦的常規(guī)PCR方法的敏感性。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RPA-LFA最低可以檢測(cè)到1×101拷貝/μL重組質(zhì)粒DNA，常規(guī)PCR檢測(cè)方法最低也可以檢測(cè)到1×101拷貝/μL重組質(zhì)粒DNA，表明RPA-LFA與常規(guī)PCR方法的敏感性相同，證實(shí)本發(fā)明所建立的ASFV?RPA-LFA檢測(cè)方法具有良好的敏感性。
[0082] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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