技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本
發(fā)明涉及生物技術(shù)，
疾病診斷和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及精神障礙的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
[0002] 精神障礙(mental?disorders)是一種重要的認(rèn)知、情感、行為等心理障礙的綜合癥，可引起個(gè)體的紊亂、痛苦、甚至致殘。常見的精神障礙主要表現(xiàn)為癡呆、抑郁、焦慮、躁狂、妄想、幻覺(jué)、情感障礙、行為怪異、人格分裂等。據(jù)估計(jì)，約有四分之一的人一年內(nèi)會(huì)經(jīng)歷至少一種精神障礙，全球約有4.5億人遭受精神健康方面的影響。據(jù)2009年的統(tǒng)計(jì)，全球在精神障礙方面每年的花費(fèi)超過(guò)2.5萬(wàn)億美元，到2030年將超過(guò)6萬(wàn)億美元。已經(jīng)成為個(gè)人，家庭和社會(huì)的重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 精神障礙的病因比較復(fù)雜，仍缺乏清楚的病因?qū)W
基礎(chǔ)。大多數(shù)研究認(rèn)為精神障礙是由生物，心理和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的。隨著研究的深入，近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道
微生物通過(guò)腦-腸軸或菌-腸-腦軸(brain–gut?axis或microbiota–gut–brain?axis)能夠影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在精神障礙的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
[0004] 已有研究表明腸道菌群可能能夠影響壓
力反應(yīng)(stress?reactivity)，焦慮(anxiety)，抑郁(depression)，
自閉癥(autism)，精神分裂(schizophrenia)，帕金森氏病(Parkinson's?disease)等精神疾病。然而，大多研究結(jié)果都是針對(duì)嚙齒動(dòng)物模型的，針對(duì)人類的較少。目前，對(duì)人體腸道微生物與精神障礙的相關(guān)研究還很少，腸道微生物的組成和功能與精神障礙之間的具體關(guān)系仍不清楚。有研究認(rèn)為，腸道菌群某些菌的過(guò)度增殖可能引起宿主腸道菌群失衡，以及一些病源菌的代謝產(chǎn)物影響了正常的腦部活動(dòng)。另有研究認(rèn)為，腸道中一些菌的相對(duì)比例的變化引起了腸道菌群的紊亂，導(dǎo)致有益菌減少，有害菌增多，過(guò)多的有害菌引起宿主的代謝異常，其產(chǎn)生的多種毒害物質(zhì)可破壞腸粘膜的完整性，導(dǎo)致通透性改變，引起腸漏，大分子物質(zhì)及毒素變得容易透過(guò)腸壁進(jìn)入血液系統(tǒng)進(jìn)而改變血腦屏障的通過(guò)性，可直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而引起大腦出現(xiàn)免疫或
炎癥反應(yīng)，阻礙大腦的正常工作，最終使人出現(xiàn)精神錯(cuò)亂。現(xiàn)代社會(huì)人們生活壓力大，生存環(huán)境一日變差，一些心理異常，如女性的產(chǎn)前焦慮、產(chǎn)后抑郁，兒童自閉癥、多動(dòng)癥，成年人的焦慮、抑郁、躁狂癥、
精神分裂癥、老年人的帕金森氏癥、阿爾茲海默癥等開始困擾人類健康，通過(guò)檢測(cè)腸道微生物有望用于對(duì)心理疾患的篩查，監(jiān)測(cè)和干預(yù)。然而，到目前為止，具體的影響機(jī)制并不是很清楚，腸道菌群的代謝產(chǎn)物和功能基因影響宿主的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
[0005] 檢測(cè)心理疾病的腸道微生物相關(guān)的生物標(biāo)記物具有重要意義。一方面，通過(guò)將獲得的生物標(biāo)志物中的某些保護(hù)性微生物進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)和加工制成
益生菌，可以用于改善并恢復(fù)腸道微生物平衡；另一方面，通過(guò)直接補(bǔ)充或通過(guò)促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌或潛在致病菌的增殖可以減少毒害物質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)腸粘膜的完整性，進(jìn)而保護(hù)血腦屏障的正常通透性，對(duì)于降低有害微生物，減少毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕精神障礙的身體和心理癥狀具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
[0006] 本發(fā)明的目的是提供特異性的針對(duì)精神障礙的生物標(biāo)志物(或稱為功能基因標(biāo)志物)，為早期精神障礙狀態(tài)的檢測(cè)和評(píng)估提供一種非侵入式的，無(wú)創(chuàng)的方法。通過(guò)對(duì)腸道中的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)能夠間接評(píng)價(jià)精神障礙狀態(tài)。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種精神障礙的生物標(biāo)志物，其選自腸道微生物產(chǎn)生的，編碼以下的功能蛋白：methionyl-tRNA?synthetase(甲硫
氨酰-tRNA合成酶)、dihydrodipicolinate?synthase(二氫吡啶二
羧酸合酶)、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine?D-glutamate?ligase(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸D-谷氨酸連接酶)、L-glutamine?synthase(L-谷氨酰胺合成酶)、chorismate?mutase(分支酸變位酶)、homoserine?kinase(高絲氨酸激酶)、MFS_antibiotic、Glycerol?Kinase(甘油激酶)、riboflavin?synthaseαsubunit(核黃素合酶α亞基)、Pyridoxal?Kinase(吡哆
醛激酶)、agamintase(胍基丁胺酶)、Folylpolyglutamate?Synthase(葉酰聚谷氨酸合成酶)、carbon?monoxide?dehydrogenase(一
氧化
碳脫氫酶)、branched-chain-amino-acid?transaminase(支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶)、carbamoyl?phosphate?synthetase?small?subunit?glutamine?amidotransferase(氨甲酰
磷酸合成酶小亞基谷氨酰胺?；D(zhuǎn)移酶)的基因；所述基因同源或互補(bǔ)序列或所述基因的翻譯產(chǎn)物的中的一種或多種的組合；
[0008] 其中，methionyl-tRNA?synthetase基因如
序列表中序列1所示；dihydrodipicolinate?synthase基因如序列表中序列2所示，UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine?D-glutamate?ligase基因如序列3所示，L-glutamine?synthase基因如序列表中序列4所示，chorismate?mutase基因如序列表中序列5所示，homoserine?kinase基因如序列表中序列6所示，MFS_antibiotic基因如序列表中序列7所示，Glycerol?Kinase基因如序列表中序列8所示，riboflavin?synthaseαsubunit基因如序列表中序列9所示，Pyridoxal?Kinase基因如序列表中序列10所示，agamintase基因如序列表中序列11所示，F(xiàn)olylpolyglutamate?Synthase基因如序列表中序列12所示，carbon?monoxide?dehydrogenase基因如序列表中序列13所示，branched-chain-amino-acid?transaminase基因如序列表中序列14所示，carbamoyl?phosphate?synthetase?small?subunit?glutamine?amidotransferase基因如序列表中序列15所示。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供上述精神障礙的生物標(biāo)志物在制備診斷精神障礙的
試劑中的用途，所述生物標(biāo)志物選自腸道微生物產(chǎn)生的，編碼以下的功能蛋白：methionyl-tRNA?synthetase、dihydrodipicolinate?synthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine?D-glutamate?ligase、L-glutamine?synthase、chorismate?mutase、homoserine?kinase、MFS_antibiotic、Glycerol?Kinase、riboflavin?synthaseαsubunit、Pyridoxal?Kinase、agamintase、Folylpolyglutamate?Synthase、carbon?monoxide?dehydrogenase、branched-chain-amino-acid?transaminase、carbamoyl?phosphate?synthetase?small?subunit?glutamine?amidotransferase的基因；所述基因同源或互補(bǔ)序列或所述基因的翻譯產(chǎn)物的中的一種或多種的組合。
[0010] 上述生物標(biāo)志物來(lái)源于以下種/菌株
水平的微生物中的一種或多種：Desulfovibrio?desulfuricans(
脫硫弧菌)、Desulfovibrio?vulgaris、Prevotella?stercorea?DSM?18206、Prevotella?oulorum?F0390、Propionibacterium?acnes?SK182B-JCVI、Ruminococcaceae?bacterium?D16、Ruminococcus?gnavus?ATCC?29149、Bacteroides?capillosus、Clostridium?spiroforme?DSM?1552和Enterococcus?faecalis?TX0012。
[0011] 本發(fā)明另外提供了供檢測(cè)
糞便樣本中精神障礙的生物標(biāo)志物的方法，所述所述生物標(biāo)志物選自腸道微生物產(chǎn)生的，編碼以下的功能蛋白：methionyl-tRNA?synthetase、dihydrodipicolinate?synthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine?D-glutamate?ligase、L-glutamine?synthase、chorismate?mutase、homoserine?kinase、MFS_antibiotic、Glycerol?Kinase、riboflavin?synthaseαsubunit、Pyridoxal?Kinase、agamintase、Folylpolyglutamate?Synthase、carbon?monoxide?dehydrogenase、branched-chain-amino-acid?transaminase、carbamoyl?phosphate?synthetase?small?subunit和glutamine?amidotransferase的基因；所述基因同源或互補(bǔ)序列或所述基因的翻譯產(chǎn)物的中的一種或多種的組合；
[0012] 所述方法包括：比較待測(cè)糞便樣本和健康對(duì)照組糞便樣本中上述基因或其表達(dá)產(chǎn)物的量。
[0013] 本發(fā)明另外提供了干預(yù)精神障礙的食物、益生菌或藥物，所述食物、益生菌或藥物能夠改變上述功能基因的數(shù)量或者表達(dá)量，例如減少上述功能基因的數(shù)量或表達(dá)量。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選干預(yù)精神障礙的食物、益生菌或藥物的方法，所述方法包括：包括比較給予該食物、益生菌或藥物
治療或干預(yù)之前和之后的糞便樣本中的上述基因或其表達(dá)產(chǎn)物的量。
[0015] 具體地，所述篩選過(guò)程包括：
[0016] a，采集個(gè)體糞便樣本并妥善保存；
[0017] b，從個(gè)體糞便中提取DNA；
[0018] c，采用功能基因檢測(cè)芯片對(duì)糞便DNA進(jìn)行檢測(cè)；
[0019] d，對(duì)高通量芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行
信號(hào)處理，獲得檢測(cè)結(jié)果；
[0020] e，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定所述個(gè)體的糞便中所述生物標(biāo)志物的量。
[0021] f，將檢測(cè)的生物標(biāo)志物的量輸入判別模型進(jìn)行判別。
[0022] 根據(jù)所述的檢測(cè)流程，其特征在于，所述的步驟f中還包括：針對(duì)腸道菌群中的生物標(biāo)志物的相對(duì)豐度進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)所得到的相對(duì)豐度值與預(yù)定的相應(yīng)
閾值進(jìn)行比較。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)或篩查精神障礙的
試劑盒，所述試劑盒包括提取上述基因的DNA提取試劑和檢測(cè)所提取的DNA的
基因芯片。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：提供了診斷或治療精神障礙類疾病的方法，可通過(guò)檢測(cè)腸道微生物的生物標(biāo)志物用于對(duì)精神障礙類易感或高發(fā)人群進(jìn)行篩查，有利于早期發(fā)現(xiàn)，為心理疾患的早期診斷提供了重要的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)；可以監(jiān)測(cè)精神障礙類疾病的干預(yù)效果，能夠通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物對(duì)病情進(jìn)行判斷，掌握疾病的恢復(fù)情況；將發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物用作開發(fā)或篩選針對(duì)精神障礙類疾病的食物/益生菌/藥物的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并制作成檢測(cè)試劑盒；提供了利用發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物的翻譯產(chǎn)物用作藥品或功能食品。
附圖說(shuō)明
[0025] 圖1為實(shí)驗(yàn)流程示意圖。
[0026] 圖2為兩組之間在功能基因組成上的PCA分析結(jié)果。
具體實(shí)施方式
[0027] 下面將結(jié)合附圖和
實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。除另外定義，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)一般具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義。一般地，本文所用的命名和實(shí)驗(yàn)方法是公知的，并且在本領(lǐng)域中常規(guī)使用。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的所有操作通常是根據(jù)儀器耗材生產(chǎn)商的產(chǎn)品
說(shuō)明書和常規(guī)技術(shù)要求以及本文中提供的參考資料進(jìn)行的。需要注意的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的目的和由此帶來(lái)的有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。
[0028] 實(shí)施例中，我們共招募到31個(gè)精神障礙個(gè)體以及32個(gè)健康對(duì)照。我們將62個(gè)精神障礙個(gè)體以及健康對(duì)照作為模型的訓(xùn)練樣本集，采集精神障礙組的10人以及健康對(duì)照組的10人作為驗(yàn)證樣本集。通過(guò)對(duì)模型學(xué)習(xí)樣本集中的糞便樣品中腸道微生物的功能基因組成特征進(jìn)行對(duì)比分析找到兩組之間的顯著差異的潛在生物標(biāo)志物。隨后，通過(guò)驗(yàn)證樣本集對(duì)上述潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證，從而篩選出最終的生物標(biāo)志物。通過(guò)高通量芯片檢測(cè)和生物信息學(xué)分析表明兩組之間在檢測(cè)到的基因數(shù)量，多樣性和不同代謝通路上存在不同種類的代表功能基因。實(shí)施例1：樣本收集檢測(cè)和DNA提取
[0029] 實(shí)驗(yàn)共采集了63例糞便樣品，其中包括31個(gè)精神障礙人群及32個(gè)年齡和地域匹配健康志愿者的糞便和
血液樣本。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組人群在背景信息方面沒(méi)有顯著差異(表1)。所有個(gè)體的納入標(biāo)準(zhǔn)為：50歲以內(nèi)；身體健康；過(guò)去六個(gè)月內(nèi)沒(méi)有使用過(guò)抗生素、益生菌、
益生元、合生元等。每個(gè)個(gè)體的新鮮糞便樣品分成5份，每份約1g，樣本放入冷藏保溫箱中立即運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室中-80℃
冰箱冷凍保存。分別從糞便樣品中提取總DNA。采用TIANamp?Stool?DNA?kit(天根生化科技(北京)有限公司)試劑盒提取DNA，方法按照試劑盒說(shuō)明實(shí)施。DNA的
質(zhì)量和數(shù)量檢測(cè)分別采用NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)熱電科技)測(cè)定在
260nm和280nm的吸光率以及1％瓊脂糖凝膠
電泳進(jìn)行檢測(cè)。血液樣本為5ml加入肝素鈉和
乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的靜脈血，采集完成后立即送入實(shí)驗(yàn)室，3000rpm常溫離心15分鐘后分離
血漿到滅菌的離心管中-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)血液樣本中兩種主要神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺和多巴胺的含量。
[0030] 表1，所有參與實(shí)驗(yàn)人員的背景信息
[0031]
[0032] 實(shí)施例2：采用功能基因檢測(cè)芯片對(duì)糞便DNA進(jìn)行檢測(cè)
[0033] 檢測(cè)合格的DNA樣本經(jīng)過(guò)
真空冷凍干燥后送至AG公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。采用AG公司的微生物基因芯片進(jìn)行檢測(cè)。其中，樣品的準(zhǔn)備、雜交、讀數(shù)等參照芯片說(shuō)明書進(jìn)行。該微生物基因芯片包含36802條探針，對(duì)應(yīng)139個(gè)關(guān)鍵代謝通路功能基因家族的50007個(gè)蛋白編碼序列，可以檢測(cè)人體微生物在物種/菌株水平的功能基因(Tu,Q.,Z.He,Y.Li,Y.Chen,Y.Deng,L.Lin,et?al.(2014):Development?of?HuMiChip?for?Functional?Profiling?of?Human?Microbiomes.PLOS?ONE.9(3):e90546.)。雜交結(jié)果使用NimbleScan(NimbleGen,Madison,WI,USA)進(jìn)行掃描分析，原始數(shù)據(jù)輸入在線分析平臺(tái)(http://ieg.ou.edu/microarray/)，按照
數(shù)據(jù)處理說(shuō)明進(jìn)行處理。
[0034] 實(shí)施例3：芯片數(shù)據(jù)的基本處理
[0035] 獲得63個(gè)樣品的芯片數(shù)據(jù)以后，原始數(shù)據(jù)需要進(jìn)行歸一化處理，將檢測(cè)到的每個(gè)信號(hào)值除以芯片平均信號(hào)輕度。再對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：最小信號(hào)強(qiáng)度設(shè)置為1000，
信噪比(SNR，Signal?to?Noise?Ratio)設(shè)置為2。對(duì)原始數(shù)據(jù)處理后獲取Clean?data，利用在線分析工具(http://ieg2.ou.edu/NimbleGen)進(jìn)行去冗余等操作，篩選高質(zhì)量數(shù)據(jù)。平均每個(gè)樣本檢測(cè)到27968個(gè)基因信號(hào)，平均每個(gè)樣本獲得高質(zhì)量的基因信號(hào)20532個(gè)。
[0036] 實(shí)施例4：生物標(biāo)志物的篩選
[0037] 參照?qǐng)D1的實(shí)驗(yàn)流程，篩選精神障礙相關(guān)生物標(biāo)志物，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的實(shí)驗(yàn)步驟或者操作細(xì)節(jié)未標(biāo)注，主要的實(shí)驗(yàn)步驟如以下幾個(gè)實(shí)施例所述。
[0038] 4.1腸道微生物功能基因的差異檢驗(yàn)
[0039] 經(jīng)過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，精神障礙人群和健康對(duì)照組之間在焦慮(STAI，State-Trait?Anxiety?Inventory-State)和抑郁(SDS，Self-rating?depression?scale)兩項(xiàng)指標(biāo)間存在顯著差異(p<0.01)。此外，通過(guò)檢測(cè)血液中的五羥色胺和多巴胺的含量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組血液中五羥色胺的含量(2.126±0.211ng/mL)要顯著高于對(duì)照組(1.812±0.397ng/mL)的含量(p<0.01)，并且實(shí)驗(yàn)組血液中多巴胺的含量(0.116±0.023ng/mL)要顯著高于對(duì)照組(0.087±0.025ng/mL)的含量(p<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)組人群兩種神經(jīng)遞質(zhì)與對(duì)照組相比明顯異常。此外，實(shí)驗(yàn)組血液中的氨含量(44.84±10.96pg/mL)顯著高于對(duì)照組(34.91±13.19，p<0.05)。
[0040] 由于各被試樣本中腸道微生物的數(shù)據(jù)存在較多的空白，因此需借助非參數(shù)檢驗(yàn)的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)Mann-Whitney?U檢驗(yàn)兩組之間腸道微生物的功能基因的差異。經(jīng)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到的平均基因數(shù)量(9438.67±1424.32)顯著少于對(duì)照組(11384.46±2493.42)，并且兩組之間在氨基酸代謝、碳水化合物代謝、多糖生物合成和代謝、其它氨基酸代謝、抗生素抗性、輔酶和維生素代謝、核酸代謝、
能量代謝、脂代謝、萜類和多
酮類化合物代謝以及翻譯代謝等代謝通路方面存在顯著差異(表2)。
[0041] 表2，兩組之間存在顯著差異的主要代謝途徑
[0042]
[0043] 進(jìn)一步，我們分析了兩組之間在氨基酸代謝和合成相關(guān)的代謝通路之間的差異，發(fā)現(xiàn)兩組之間有20個(gè)功能基因存在顯著差異(表3)。其中，有15個(gè)功能基因?qū)儆诎被岽x，12個(gè)功能基因在實(shí)驗(yàn)組中的數(shù)量低于對(duì)照組，另外8個(gè)基因的數(shù)量則高于對(duì)照組。此外，參與
色氨酸生物合成的anthranilate?synthase,prephenate?dehydrogenase和3-deoxy-7-phosphoheptulonate?synthase等基因的數(shù)量在實(shí)驗(yàn)組中明顯高于對(duì)照組，而3-dehydroquinate?dehydratase和chorismate?mutase等基因的數(shù)量則明顯低于對(duì)照組。色氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，一般需要從食物中攝入。色氨酸是重要的神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺的前體。色氨酸生物合成相關(guān)的基因的差異可能導(dǎo)致色氨酸的合成，進(jìn)而影響五羥色胺的含量，可能影響神經(jīng)正常的功能。
[0044] 表3，兩組之間在氨基酸代謝和合成相關(guān)代謝通路中的功能基因差異[0045]
[0046] 除此之外，腸道微生物特有的功能基因在兩組之間也存在顯著差異，在人類和動(dòng)物體內(nèi)缺乏的功能基因如莽
草酸激酶(shikimate?kinase)、丙氨酸消旋酶(alanine?racemase)和蘇氨酸氨裂解酶(threonine?ammonia?lyase)在實(shí)驗(yàn)組中顯著升高，而生物合成精氨酸脫羧酶(biosynthetic?arginine?decarboxylase)、高絲氨酸脫氫酶(homoserine?dehydrogenase)和3-脫氫
奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinate?dehydratase)在實(shí)驗(yàn)組中則顯著降低(表3)。
[0047] 還有一些參與神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺和多巴胺代謝的功能基因在兩組之間存在顯著差異，如鄰氨基苯
甲酸合酶(anthranilate?synthase)、預(yù)苯酸脫氫酶(prephenate?dehydrogenase)和3-脫氧-7-磷酸苯丙氨酸合成酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonate?synthase)基因在實(shí)驗(yàn)組中顯著升高，而3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinate?dehydratase和分支酸變位酶(chorismate?mutase)則在實(shí)驗(yàn)組中顯著降低(表3)。
[0048] 蘇氨酸氨裂解酶可以代謝氨基酸產(chǎn)生氨，而天冬氨酸氨連接酶(aspartate-ammonia?ligase)和精氨
琥珀酸裂解酶(argininosuccinate?lyase)可以清除氨。實(shí)驗(yàn)組中蘇氨酸氨裂解酶基因顯著多于對(duì)照組，天冬氨酸氨連接酶和精氨琥珀酸裂解酶基因顯著少于對(duì)照組，因此，可能導(dǎo)致具有神經(jīng)毒性的氨的升高。通過(guò)檢測(cè)兩組血液中的氨含量，確實(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的血氨含量明顯高于對(duì)照組(p<0.05)。
[0049] 多樣性指數(shù)是反映
生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。alpha多樣性指數(shù)結(jié)果表明，在Shannon，Simpson和InverseSimpson指數(shù)方面，實(shí)驗(yàn)組的多樣性指數(shù)均顯著低于對(duì)照組的多樣性指數(shù)(p<0.01)(表4)。表明實(shí)驗(yàn)組腸道菌群的功能基因多樣性低于對(duì)照組。
[0050] 表4，兩組之間多樣性指數(shù)差異比較
[0051]
[0052] 主成分分析(PCA，Principal?component?analysis)結(jié)果表明，兩組之間在功能基因組成上大部分能夠較為明顯的區(qū)分開(圖2)，表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在顯著差異。
[0053] 由于微生物基因芯片上涉及的功能基因都是基于微生物在種/菌株水平的，我們進(jìn)一步分析了兩組之間與功能基因?qū)?yīng)的微生物的種/菌株水平的差異，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的主要差異在Desulfovibrio?desulfuricans、Desulfovibrio?vulgaris、Prevotella?stercorea?DSM?18206、Prevotella?oulorum?F0390、Propionibacterium?acnes?SK182B-JCVI、Ruminococcaceae?bacterium?D16、Ruminococcus?gnavus?ATCC?29149、Bacteroides?capillosus、Clostridium?spiroforme?DSM?1552和Enterococcus?faecalis?TX0012等微生物。上述微生物種或菌株具有作為生物標(biāo)志物的潛力。
[0054] 4.3建模樣本集中生物標(biāo)志物的篩選
[0055] 采用White.J.R.，Nagarajan.N.和Pop.M.開發(fā)的Metastats程序(White,J.R.,N.Nagarajan,and?M.Pop(2009):Statistical?Methods?for?Detecting?Differentially?Abundant?Features?in?Clinical?Metagenomic?Samples.PLoS?Computational?Biology.5(4):e1000352.以及Paulson,J.N.,M.Pop,and?H.C.Bravo(2011):Metastats:an?improved?statistical?method?for?analysis?of?metagenomic?data.Genome?Biology.12:P17(1):12-12.)Metastats統(tǒng)計(jì)方法用來(lái)檢測(cè)組間宏基因組樣本的差異豐度特征。對(duì)于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，其檢測(cè)結(jié)果中p值和Q值(錯(cuò)誤發(fā)生率FDR)分別達(dá)到顯著的變量則表明該變量是特征變量。進(jìn)一步的，我們將芯片數(shù)據(jù)中相對(duì)豐度大于1％的功能基因相對(duì)含量結(jié)果上傳至在線分析
網(wǎng)站(http://metastats.cbcb.umd.edu/detection.html)，經(jīng)過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)高絲氨酸激酶(homoserine?kinase)和核黃素合成酶α亞基(riboflavin?synthaseαsubunit)這兩種功能基因在實(shí)驗(yàn)組顯著富集，而胍基丁胺酶(agamintase)、
一氧化碳去氫酶(CO?dehydrogenase)和分支酸變位酶(chorismate?mutase)則顯著減少。
[0056] 此外，我們還用線性判別分析LEfSe(linear?discriminant?analysis(LDA)effect?size)
算法分析了兩組的代表功能基因。這種方法同時(shí)使用了Kruskal-Wallis?rank?sum?test來(lái)計(jì)算差異顯著性，用LDA方法來(lái)估計(jì)每個(gè)變量的效應(yīng)量，不僅能夠給出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性結(jié)果還能夠給出生物學(xué)相關(guān)性結(jié)果(Segata,N.,J.Izard,and?L.Waldron(2011):Metagenomic?biomarker?discovery?and?explanation.Genome?Biology.12:R60(6):81-89.)。將歸一化的功能基因相對(duì)含量數(shù)據(jù)上傳至在線分析平臺(tái)(http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)，將alpha顯著性定為<0.05，效應(yīng)量大于2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α甘露糖苷酶(alpha-mannosidase)和一氧化碳去氫酶基因?yàn)閷?duì)照組的代表功能基因，而高絲氨酸激酶和核黃素合成酶α亞基是實(shí)驗(yàn)組的代表功能基因。
[0057] 上述結(jié)果表明，α甘露糖苷酶、胍基丁胺酶、一氧化碳去氫酶和分支酸變位酶可能為對(duì)照組的代表功能基因，而高絲氨酸激酶和核黃素合成酶α亞基可能為實(shí)驗(yàn)組的代表功能基因。特別是高絲氨酸激酶和核黃素合成酶α亞基基因可以作為精神障礙組的特征生物標(biāo)志物。其中，高絲氨酸激酶基因在實(shí)驗(yàn)組中更多，可能會(huì)升高甘氨酸和絲氨酸這兩種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。而一氧化碳去氫酶和分支酸變位酶基因在實(shí)驗(yàn)組中較少，可能會(huì)減少一氧化碳，酪氨酸和色氨酸這幾種神經(jīng)遞質(zhì)的含量。核黃素合成酶α亞基作為神經(jīng)遞質(zhì)代謝的輔酶在實(shí)驗(yàn)組中更多，可能會(huì)引起相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝異常。上述功能基因大多參與了神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，雖然它們反應(yīng)的腸道中微生物的功能基因，但根據(jù)已有研究，腸道里的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比脊髓里的還多，與大腦的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，并且細(xì)胞類型、神經(jīng)遞質(zhì)及
感受器都與大腦極其相似。腸道也被稱為人的“第二大腦”或“腸腦”，腸腦與大腦之間通過(guò)腦腸軸(Brain-gut-axis)雙向互通(Grenham?S,Clarke?G,Cryan?JF,Dinan?TG.Brain?gut?microbe?communication?in?health?and?disease.Frontiers?in?physiology.2011；2:1-15.)。腸腦能夠影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響人的情感，認(rèn)知和行為(Forsythe?P,Sudo?N,Dinan?T,Taylor?VH,Bienenstock?J.Mood?and?gut?feelings.Brain,Behavior,and?Immunity.2010；24:9-16.)。因此，腸道微生物是可以通過(guò)其代謝產(chǎn)物影響宿主的情感，認(rèn)知和行為的。
[0058] 為了便于所選取的生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用，我們進(jìn)一步采用
機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，構(gòu)建生物標(biāo)志物模型。為了篩選腸道微生物的標(biāo)志物，我們將全部數(shù)據(jù)用于構(gòu)建模型，我們?cè)俨杉瘜?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10位個(gè)體的數(shù)據(jù)用于驗(yàn)證模型。
[0059]
隨機(jī)森林(Random?Forest)是一種基于分類樹(classification?tree)的算法，需要模擬和
迭代，被歸類為機(jī)器學(xué)習(xí)的一種算法(Breiman?L.2001.Random?forests.Machine?Learning,45,5-32)。在機(jī)器學(xué)習(xí)的諸多算法中，隨機(jī)森林因高效而準(zhǔn)確被譽(yù)為當(dāng)前最好的算法之一(Iverson?LR,Prasad?AM,Matthews?SN,Peters?M.2008.Estimatingpotential?habitat?for?134?eastern?US?tree?species?under?six?climate?scenarios.Forest?Ecology?and?Management,254,390-406；Genuer?R,Poggi?JM,Tuleau-Malot?C.2010.Variable?selection?usingrandom?forests.Pattern?Recognition?Letters,31,2225-2236)。隨機(jī)森林算法包含多個(gè)
決策樹的分類器，可以產(chǎn)生高準(zhǔn)確度的分類器，作為有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法不容易出現(xiàn)過(guò)擬合，能夠平衡數(shù)據(jù)帶來(lái)的平衡誤差，并能夠處理大量的輸入變量，能夠在決定類別時(shí)評(píng)估變量的重要性。隨機(jī)森林算法已經(jīng)成為重要的數(shù)據(jù)分析工具，被廣泛應(yīng)用于眾多科學(xué)研究，如微陣列數(shù)據(jù)處理，
圖像處理，
人臉識(shí)別，運(yùn)動(dòng)識(shí)別等。我們利用隨機(jī)森林的特點(diǎn)來(lái)發(fā)現(xiàn)影響精神障礙的特征腸道微生物。我們采用R語(yǔ)言中的randomForest
軟件包進(jìn)行隨機(jī)森林運(yùn)算(Liaw?A.2012.Package"randomForest")。通過(guò)特征重要性排序分析(MeanDecreaseAccuracy和Mean?Decrease?Gini)，我們發(fā)現(xiàn)methionyl-tRNA?synthetase,dihydrodipicolinate?synthase,UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamate?ligase,L-glutamine?synthase,chorismate?mutase和homoserine?kinase等是最重要的幾個(gè)特征變量(表5)。MFS_antibiotic、Glycerol?Kinase、riboflavin?synthaseαsubunit、Pyridoxal?Kinase、agamintase、Folylpolyglutamate?Synthase、carbon?monoxide?dehydrogenase、branched-chain-amino-acid?transaminase、carbamoyl?phosphate?synthetase?small?subunit和glutamine?amidotransferase。
[0060] 表5，十五個(gè)功能基因特征重要性排序
[0061]
[0062] 基于上述十五個(gè)功能基因作為輸入特征，構(gòu)建判別隨機(jī)森林模型的
訓(xùn)練數(shù)據(jù)集。將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集輸入隨機(jī)森林進(jìn)行訓(xùn)練，獲得判別隨機(jī)森林模型。模型包括不同的分類器個(gè)數(shù)和各分離點(diǎn)輸入特征的隨機(jī)
抽取變量個(gè)數(shù)，通過(guò)選擇不同的分類器個(gè)數(shù)和各分離點(diǎn)隨機(jī)抽取變量個(gè)數(shù)可構(gòu)建不同參數(shù)組合的判別隨機(jī)森林模型。在采用默認(rèn)設(shè)置的情況下進(jìn)行模型訓(xùn)練，再依據(jù)運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，依據(jù)不同判別隨機(jī)森林模型的ROC曲線，將ROC曲線的AUC面積值作為優(yōu)選指標(biāo)，將AUC面積最大的模型作為訓(xùn)練模型，最終優(yōu)選的分類器個(gè)數(shù)為ntree＝300，變量個(gè)數(shù)為3。隨機(jī)森林算法采用R語(yǔ)言的randomForest
軟件包實(shí)現(xiàn)，ROC曲線采用R語(yǔ)言的qROC軟件包實(shí)現(xiàn)。上述訓(xùn)練模型可用于測(cè)試集的測(cè)試，進(jìn)而將精神障礙者與正常對(duì)照加以區(qū)分。
[0063] 實(shí)施例5：腸道微生物志物的篩選模型的驗(yàn)證與預(yù)測(cè)
[0064] 為了證實(shí)實(shí)施例4中的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步比較驗(yàn)證模型中的10個(gè)健康人及10個(gè)精神障礙人群的特征菌群豐度。將測(cè)試數(shù)據(jù)集輸入上述步驟4獲得的隨機(jī)森林分類模型中，即可得到最終識(shí)別結(jié)果。將微生物基因芯片數(shù)據(jù)按照上述步驟3和4進(jìn)行處理，得到待檢測(cè)
特征向量，再將上述特征向量輸入上述步驟4獲得的隨機(jī)森林分類模型中，即可得到最終識(shí)別結(jié)果。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，此隨機(jī)森林判別模型的AUC對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率可分別達(dá)到0.913和0.817。
[0065] 利用上述生物標(biāo)記物以及隨機(jī)森林分類模型來(lái)篩選、診斷或治療精神障礙者，監(jiān)測(cè)治療
進(jìn)程，或者生產(chǎn)篩選藥物、
功能性食品、益生菌，生產(chǎn)檢測(cè)上述生物標(biāo)記物的試劑盒以及裝置等為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉，皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0066] 生物標(biāo)志物可以選自精神障礙者富集的生物標(biāo)記物或者健康人群中富集的生物標(biāo)記物中的一種或者多種。
