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篩選方法

閱讀：736發(fā)布：2020-06-26

專利匯可以提供篩選方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 提供篩選神經(jīng) 精神病 發(fā)作或傾向于發(fā)作之 哺乳動(dòng)物 的方法。更特別地，本發(fā)明提供通過篩選蛋白14-3-3ζ之功能性 水 平的降低來篩選 精神分裂癥 發(fā)作或傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法。在一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明還提供了通過篩選蛋白14-3-3ζ功能性水平的變化來監(jiān)測經(jīng)診斷患有神經(jīng)精神病(如精神分裂癥)之患者的裝置/手段。本發(fā)明可能在例如評(píng)價(jià) 預(yù)防 性或 治療 性處理方案的效 力 或者另外監(jiān)測可能發(fā)生于患者的生理或代謝變化之影響的情形下有用。本發(fā)明的方法在廣泛的應(yīng)用中有用，包括尤其是，提供了鑒定易感于神經(jīng)精神病癥(如以一種或更多種精神分裂癥癥狀為特征的病癥)發(fā)作的哺乳動(dòng)物的裝置/手段，因此使得能夠?qū)嵤╊A(yù)防性或者早期治療性干預(yù)以努力減少或者防止病癥的發(fā)作。本發(fā)明還提供了確認(rèn)診斷的裝置/手段，否則其將僅僅基于陽性和 陰性癥狀 的評(píng)估。，下面是篩選方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種篩選發(fā)作或傾向于發(fā)作神經(jīng)精神病癥之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平以及將蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低相對(duì)于對(duì)照水平相關(guān)聯(lián)，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
2.一種在經(jīng)診斷患有神經(jīng)精神病癥發(fā)作的哺乳動(dòng)物中監(jiān)測所述病癥進(jìn)展的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平以及將蛋白14-3-3ζ功能性水平的改變相對(duì)于之前針對(duì)該哺乳動(dòng)物所獲得的水平相關(guān)聯(lián)，其中與之前針對(duì)該哺乳動(dòng)物所獲得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平相等或較低是不良預(yù)后的指示，而與之前針對(duì)該哺乳動(dòng)物所獲得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平較高是改善預(yù)后的指示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中所述神經(jīng)精神病癥以一種或者更多種精神分裂癥的癥狀為特征。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述病癥為精神分裂癥、分裂型人格障礙、精神病、兩極性障礙、躁狂抑郁癥、情感障礙、精神分裂癥樣疾病、分裂情感障礙、精神病性抑郁癥、孤獨(dú)癥、藥物引起的精神病、譫妄、酒精戒斷綜合征或者癡呆引起的精神病。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中作為測試對(duì)象的哺乳動(dòng)物已經(jīng)呈現(xiàn)一種或者更多種陽性或陰性癥狀或思維障礙。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平為蛋白
14-3-3ζ功能的水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平為蛋白
14-3-3ζ的絕對(duì)水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平通過選自下述的方法確定：
(i)篩選蛋白14-3-3ζ翻譯產(chǎn)物的水平；
(ii)篩選蛋白14-3-3ζRNA的水平；
(iii)篩選與蛋白14-3-3ζ基因相關(guān)之染色質(zhì)蛋白的變化；
(iv)篩選蛋白14-3-3ζDNA甲基化的變化；以及
(v)篩選蛋白14-3-3ζ與DISC1形成復(fù)合體之能力的變化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述RNA為mRNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述甲基化變化為超甲基化。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體為蛋白14-3-3ζ和
75kDa DISC1同工型間的復(fù)合體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品為腦脊液、外周血或者成體來源神經(jīng)干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述成體來源神經(jīng)干細(xì)胞分離自牙髓、毛囊或者鼻窩。
15.功能性蛋白14-3-3ζ缺陷的非人哺乳動(dòng)物，其中編碼蛋白14-3-3ζ的基因已經(jīng)缺失。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的哺乳動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物為小鼠。
17.篩選模擬蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成或者以其他方式改善精神分裂癥表型癥狀之物質(zhì)的方法，所述方法包括向權(quán)利要求15或者16的非人哺乳動(dòng)物施用推定的調(diào)節(jié)性物質(zhì)和篩選表達(dá)改變的表型。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述表達(dá)改變的表型為使用下面任一種或更多種來評(píng)估的行為：
(i)運(yùn)動(dòng)功能測試；
(ii)物體識(shí)別測試；
(iii)高架十字桿測試；
(iv)PPI測試；
(v)逃脫水迷宮測試。

說明書全文

篩選方法

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明提供篩選神經(jīng)精神病(neuropsychiatric disorder)發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法。更特別的，本發(fā)明提供通過篩選蛋白14-3-3ζ之功能性水平的降低篩選精神分裂癥(schizophrenia)發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法。在相關(guān)的方面中，本發(fā)明還提供了通過篩選蛋白14-3-3ζ功能性水平的變化監(jiān)測經(jīng)診斷患有神經(jīng)精神病(如精神分裂癥)患者的手段/裝置(means)。本發(fā)明可能在例如評(píng)價(jià)預(yù)防性或者治療性處理方案的效力或者另外監(jiān)測可能發(fā)生于患者的生理或代謝變化之影響的情形下有用。本發(fā)明的方法在廣泛的應(yīng)用中有用，包括尤其是，提供了鑒定易感于神經(jīng)精神病癥(如以一種或更多種精神分裂癥癥狀為特征的病癥)發(fā)作的哺乳動(dòng)物的手段/裝置，因此使得預(yù)防性或者早期治療性干預(yù)能夠?qū)嵤┮耘p少或者防止病癥的發(fā)作。本發(fā)明還提供了確認(rèn)診斷的手段/裝置，否則其將僅僅基于陽性和陰性癥狀的評(píng)估。
[0002] 在相關(guān)的方面中，本發(fā)明還提供了動(dòng)物模型，其可用于篩選或者評(píng)價(jià)在治療神經(jīng)精神病癥中有用的物質(zhì)，等等。

背景技術(shù)

[0003] 本說明書中通過作者提到的出版物之詳細(xì)書目在本說明書結(jié)尾按字母順序集中。
[0004] 本說明書中對(duì)任何現(xiàn)有技術(shù)的參考不是也不應(yīng)該作為對(duì)所述現(xiàn)有技術(shù)形成在澳大利亞公知常識(shí)之部分的承認(rèn)或者任何形式的暗示。
[0005] 精神分裂癥是對(duì)于人類已知的最能致殘和情緒上最有破壞性的疾病之一。不幸地是，因?yàn)殚L久以來一直對(duì)精神分裂癥存在誤解，所以使得其受到相對(duì)小的關(guān)注且其受害者受到不應(yīng)有的污蔑。事實(shí)上，精神分裂癥是非常普遍的病癥。其對(duì)兩種性別的影響是相當(dāng)?shù)牟⑶仪忠u了全世界約1％的人群。另外的2-3％具有分裂型人格障礙(schizotypal personality disorder)，其為所述疾病的溫和形式。因?yàn)槠淞餍行院蛧?yán)重性，已經(jīng)對(duì)精神分裂癥進(jìn)行了廣泛的研究以努力開發(fā)出用于診斷該疾病更好的標(biāo)準(zhǔn)。
[0006] 精神分裂癥的特征是一系列獨(dú)特和可預(yù)測的癥狀。將最普遍與疾病相關(guān)的所述癥狀稱為陽性癥狀，其表示非常異常行為的存在。所述異常行為包括思維障礙(thought disorder)(難以跟上講話或者從一個(gè)主題跳到另一個(gè)而沒有邏輯聯(lián)系)、妄想(delusion)(迫害、罪行、夸大或者被外部控制的錯(cuò)誤信念)和幻覺(hallucination)(視覺的或者聽覺的)。思維障礙是清晰且有邏輯的進(jìn)行思考之能力的降低。其經(jīng)常表現(xiàn)為無聯(lián)系和無意義的語言，這致使患有精神分裂癥的人不能參與交談，使得其與家庭、朋友和社會(huì)疏遠(yuǎn)。妄想在患有精神分裂癥的個(gè)體中間非常普遍。受影響的人可能相信其被陰謀地對(duì)待了(稱為“偏執(zhí)型妄想(paranoid delusion)”)?！安ド?Broadcasting)”描述了妄想的一種，其中患有所述疾病的個(gè)體相信其他人可以聽見他的想法?；糜X可以是聽到、看到或者甚至感覺到的。其最經(jīng)常的是僅被受折磨的人以聲音的形式聽到。所述聲音可以描述所述人的行為、警告他有危險(xiǎn)或者告訴他做什么。有時(shí)個(gè)體可以聽到許多聲音進(jìn)行交談。比上述“陽性癥狀”和“思維障礙”更不明顯但是同樣嚴(yán)重的是缺陷或者陰性癥狀，其代表正常行為的不存在。所述行為包括淡漠或者遲鈍的情感(affect)(即缺少情緒表達(dá))、冷漠、社會(huì)戒斷和缺乏自知力(insight)。
[0007] 精神分裂癥的發(fā)作通常發(fā)生在青春期或者成年早期，雖然已知在老人中出現(xiàn)。發(fā)作可以伴隨急性癥狀是快速的在幾周內(nèi)產(chǎn)生，或者其可以是緩慢的在幾個(gè)月或幾年形成。雖然精神分裂癥可以在生命中的任何點(diǎn)影響任何人，然而在遺傳上易患該病的人群中其在一定程度上更普遍，一般在青春期晚期或者成年早期發(fā)生第一次精神病情節(jié)(?rst psychotic episode)。作為都無該疾病父母之后代發(fā)展成精神分裂癥的可能性為1％。作為父母之一患有該疾病之后代發(fā)展成精神分裂癥的可能性大約為13％。作為父母二者都患有該疾病之后代發(fā)展成精神分裂癥的可能性大約為35％。這表明了遺傳聯(lián)系的存在。
[0008] 患有精神分裂癥人中有四分之三在16和25歲間發(fā)展成疾病。發(fā)作在30歲后不普遍且在40歲后很少。在16-25歲年齡組中，精神分裂癥影響更多的男性，而不是女性。在25-30歲組中，在女性中的事件多于男性。
[0009] 通常，任何疾病的研究需要有用于診斷的良好標(biāo)準(zhǔn)。事實(shí)上，診斷應(yīng)該最終基于病因，即基于疾病是由遺傳缺陷、病毒或細(xì)菌感染、毒素還是脅迫所導(dǎo)致。不幸地是，大多數(shù)精神疾病的病因是未知的，因此這些病癥仍然根據(jù)下面受影響的4種主要精神力(mental faculty)進(jìn)行分類：
[0010] (i)思維和認(rèn)知障礙
[0011] (ii)情緒障礙
[0012] (iii)社會(huì)行為障礙；以及
[0013] (iv)學(xué)習(xí)、記憶和智力障礙。
[0014] 因此，由于對(duì)所述病癥的生物學(xué)原因知之甚少，所以仍然需要闡明導(dǎo)致并發(fā)展所述疾病的機(jī)制。
[0015] 14-3-3蛋白構(gòu)成了高度保守的調(diào)節(jié)分子家族，其在整個(gè)發(fā)育過程中和在成體組織中大量表達(dá)。這些蛋白質(zhì)包括7種不同同工型(β、ζ、ε、γ、η、τ、σ)，其結(jié)合多種功能不同的信號(hào)分子以控制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、增殖、遷移、分化和凋亡(Berg et al.Nat Rev Neurosci2003；4(9)：752-762；Fu et al.Annu Rev Pharmacol Toxicol2000；40：617-647；Toyo-oka et al.Nat Genet2003Jul；34(3)：274-285；Aitken A.，Semin Cancer Biol2006；
16(3)：162-172；Rosner et al.Amino Acids2006；30(1)：105-109)。
[0016] 至今，蛋白14-3-3家族分子在精神分裂癥中的作用(如果有的話)依然是難以描述的。盡管到目前為止尚未得出結(jié)論，一些研究已經(jīng)關(guān)注于鑒定與傾向于發(fā)展成神經(jīng)精神病癥(如精神分裂癥)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。研究旨在調(diào)查蛋白14-3-3同工型水平的變化，不考慮那些分子是否突變，已經(jīng)趨向聚焦于η和θ同工型水平的變化，雖然至今還沒有任何其為神經(jīng)精神病癥發(fā)作之可靠標(biāo)記物的結(jié)論性證據(jù)。關(guān)于蛋白質(zhì)14-3-3其他同工型(如β和ζ)，Wong等人(2005)發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥和兩極性障礙(bipolar disorder)中的表達(dá)水平無變化。Middleton等人(2005)進(jìn)行的更加深入并陳述這些特別的同工型似乎不直接與發(fā)展成精神分裂癥的遺傳風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且沒有標(biāo)記物提供了與精神分裂癥強(qiáng)烈的關(guān)系。
[0017] 然而，與所述發(fā)現(xiàn)相反，在作為本發(fā)明先導(dǎo)的工作中，已經(jīng)確定了蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低與神經(jīng)精神病(例如以一種或者更多種精神分裂癥癥狀為特征的病癥)發(fā)作或者傾向于發(fā)作相關(guān)。更進(jìn)一步，還已經(jīng)確定14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成水平的降低具有類似的診斷作用。這些發(fā)現(xiàn)目前已經(jīng)促進(jìn)了方法的設(shè)計(jì)從而常規(guī)地和準(zhǔn)確地篩選個(gè)體來確認(rèn)神經(jīng)精神病發(fā)作或者傾向于發(fā)作。

發(fā)明內(nèi)容

[0018] 下面整個(gè)說明書和權(quán)利要求，除非上下文另有要求，詞“包括”和變化(如“包含”和“含有”)將理解為指包含所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但是并不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。
[0019] 如本文所使用，術(shù)語“來源于”用來表示特定的整體或者整體的組已源自特定的物類，但是并不一定直接從所述特定的來源獲得。而且，如本文使用的沒有數(shù)詞限定的表述包括復(fù)數(shù)，除非上下文清楚地另有規(guī)定。
[0020] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明歸屬的領(lǐng)域之普通技術(shù)人員之一所通常理解的具有同樣的意義。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到除了那些特別描述的，本文描述的本發(fā)明可進(jìn)行變化和修改。應(yīng)了解本文描述的本發(fā)明包括所有所述的變化和修改。本發(fā)明還包括所有這樣的步驟、特征、在本說明書中個(gè)別地或全體地提到或者表明的組合物和化合物，以及任何和所有任何兩種或多種所述步驟或特征的組合。
[0022] 本說明書含有使用程序PatentIn3.5版準(zhǔn)備的核苷酸序列信息，本文在書目后呈現(xiàn)所述信息。每條核苷酸序列在序列表中通過數(shù)字指示符(numeric indicator)<210>來識(shí)別，隨后為序列標(biāo)識(shí)(sequence identi?er)(例如<210>1、<210>2等)。序列的長度、類型(DNA、RNA等)和每條核苷酸序列的來源生物分別以數(shù)字指示域<211>、<212>和<213>提供的信息表明。說明書中提到的核苷酸序列通過指示符SEQ ID NO：來確定，然后為序列標(biāo)識(shí)(例如：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等)。說明書中提到的序列標(biāo)識(shí)與序列表中的數(shù)字指示域<400>提供的信息相關(guān)聯(lián)，所述數(shù)字指示域后跟著序列標(biāo)識(shí)(例如<400>1、<400>2等)。就是說，說明書中詳述的SEQ ID NO：1與序列表中指明的<400>1序列相關(guān)聯(lián)。
[0023] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0025] 因此在另一方面中提供篩選以一種或更多種精神分裂癥癥狀為特征的病癥的發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0026] 在另一方面中提供篩選精神分裂癥的發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是精神分裂癥發(fā)作或傾向于發(fā)作的指示。
[0027] 因此，本發(fā)明提供在呈現(xiàn)一種或者更多種陽性或陰性癥狀或思維障礙之人中診斷神經(jīng)精神病癥發(fā)作的方法，所述方法包括在來自所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作的指示。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定編碼蛋白14-3-3ζ基因的表達(dá)水平，其中與對(duì)照水平相比所述表達(dá)水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0029] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成的水平，其中與對(duì)照水平相比所述復(fù)合體形成水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0030] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)測在經(jīng)診斷患有神經(jīng)精神病癥發(fā)作的哺乳動(dòng)物中所述病癥進(jìn)展的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或較低是不良預(yù)后的指示，而與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平較高是改善預(yù)后的指示。
[0031] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)測已確定神經(jīng)精神病癥傾向于發(fā)作之患者的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或較低是改善預(yù)后的指示。
[0032] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及功能性蛋白14-3-3ζ缺陷的非人哺乳動(dòng)物，其中已檢測了編碼蛋白14-3-3ζ的基因。
[0033] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及篩選模擬蛋白14-3-3ζ功能(functionality)或者14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成或者以其他方式改善精神分裂癥表型癥狀之物質(zhì)的方法，所述方法包括向14-3-3ζ敲除之非人動(dòng)物施用推定的調(diào)節(jié)性物質(zhì)和針對(duì)改變的表型進(jìn)行篩選。
附圖說明
[0034] 圖1：14-3-3ζ缺陷小鼠證明異常認(rèn)知和行為特性。(a)在曠場試驗(yàn)(open ?eld062-/- 062+/+
test)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11)比14-3-3ζ 同窩幼畜(littermate)(實(shí)心柱；n＝11)在5-30周齡時(shí)具有更多的探索行為。(b)在高架十字迷宮(elevated plus
062-/- 062+/+
maze)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝12)比14-3-3ζ 小鼠(實(shí)心柱；n＝12)在
062-/-
開放臂花費(fèi)更長時(shí)間。(c)在十字迷宮逃脫任務(wù)測試中，14-3-3ζ 小鼠(空心圓；n＝
062+/+
12)比14-3-3ζ 小鼠(封閉方形；n＝12)具有更低的空間學(xué)習(xí)(1-6天)和記憶(M1
062+/+ 062-/-
和M2)能力。(d)相比14-3-3ζ 小鼠(實(shí)心柱；n＝11)，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；
n＝11)具有減少的PPI，具有在70dB基準(zhǔn)線上2、4、8和16dB的前脈沖(PP)和100毫秒(msec)的刺激間時(shí)間間隔。還顯示了來自所有PP強(qiáng)度的數(shù)據(jù)平均值(Avg)。來自雄性和雌性小鼠的數(shù)據(jù)在所有圖中匯集。誤差柱以平均+SEM呈現(xiàn)。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
[0035] 圖2：14-3-3ζ在阿蒙氏角(Ammon's horn)的錐體細(xì)胞和齒狀回的顆粒神經(jīng)元中的表達(dá)。(a)(i)通過14.5dpc小鼠胚胎腦的冠狀切面的圖示，描繪了海馬(hippocampus)的不同區(qū)域。V，腦室(ventricle)；IZ，中間區(qū)(intermediate zone)；VZ，腦室區(qū)(ventricular zone)。(ii)通過P0小鼠海馬的冠狀切面的圖示。來自起源于腦室神經(jīng)上皮(淡藍(lán))和接近傘部(?mbria)的神經(jīng)上皮(深藍(lán))之海馬原基的神經(jīng)元。所述三個(gè)亞區(qū)包含組成阿蒙氏角和其層的海馬角(CA1-3)的錐體神經(jīng)元(s0，始層(stratum oriens)；sp，錐體層(stratum pyramidale)；sl，透明層(stratum lucidum)；sr，輻射層(stratum radiatum))，其以涉及在齒狀回(DG)中的顆粒神經(jīng)元的位置描繪。(b)(i-ii)在14.5dpc發(fā)育海馬的中間區(qū)中檢測到的14-3-3ζ免疫反應(yīng)性。(iii-iv)在P0，14-3-3ζ陽性神經(jīng)元位于錐體細(xì)胞層。(v)錐體神經(jīng)元(星號(hào))的更高放大倍數(shù)顯示了14-3-3ζ具有點(diǎn)狀胞質(zhì)定位(punctate cytoplasmic localisation)。(c)X-gal染色顯示14-3-3ζ在P0、
062+/-
P7和成體14-3-3ζ 海馬中的內(nèi)源表達(dá)。14-3-3ζ-lacZ的高水平表達(dá)在錐體和顆粒神經(jīng)元中明顯。(d)海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物。(i)用EB1染色的14-3-3ζ(紅)。(ii)MAP2陽性(綠)海馬神經(jīng)元。(iii)14-3-3ζ和MAP2的重疊突出在MAP2陽性神經(jīng)突中的共表達(dá)(箭頭)。(e)14-3-3ζ蛋白(27kDa)在WT小鼠阿蒙氏角和齒狀回中表達(dá)。來自成體WT
062-/-
和14-3-3ζ 小鼠裂解物的蛋白質(zhì)印跡與針對(duì)14-3-3ζ的抗體(EB1)進(jìn)行免疫印跡和探針探測。使用抗(3-肌動(dòng)蛋白(42kDa)抗體作為加樣對(duì)照。比例尺＝100μm(bi-iv；c；
di-iii)，25μm(bv)。
[0036] 圖3：14-3-3ζ缺陷小鼠顯示海馬分層(lamination)的缺陷。(a)尼氏染色顯062-/-
示W(wǎng)T和14-3-3ζ 小鼠從14.5dpc直至出生后56天(P56)海馬的發(fā)育。海馬細(xì)胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的錐體層中(sp)分散(iv、vi、viii)。楔形突出了在輻射層(stratum radiatum，sr)中海馬錐體神經(jīng)元重復(fù)的層。星號(hào)突出了在始層(stratum oriens，s0)中異位定位的錐體細(xì)胞。箭頭標(biāo)明了在齒狀回中松散排列的顆粒神經(jīng)元。(b)將Thy1-YFP轉(zhuǎn)
062 062-/-
基因表達(dá)引入14-3-3ζ 背景揭示了在14-3-3ζ 小鼠中海馬錐體神經(jīng)元的嚴(yán)重解體。
藍(lán)，DAPI；綠，Thy1表達(dá)。(c)從所示基因型的P0(i-iv)和P56(v-vi)小鼠中獲得的海馬的冠狀切面。更深層的錐體層由WT海馬中的NeuN陽性錐體細(xì)胞組裝(iii，黃楔形)形成
062-/-
從CA1至CA3的一致成熟區(qū)(uniform mature zone)。在14-3-3ζ 海馬中，具有一些在CA3錐體區(qū)更深區(qū)(黃楔形)和表面區(qū)(白楔形)異位定位的NeuN陽性成熟錐體細(xì)胞的成
062-/-
熟區(qū)更不一致。在P5614-3-3ζ 小鼠中，對(duì)在重復(fù)CA3亞區(qū)中NeuN突出的錐體細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，表明異位細(xì)胞達(dá)到了成熟(vi)。比例尺：100μum。
[0037] 圖4：BrdU脈沖追逐分析(BrdU-pulse-chase analysis)表明在14-3-3ζ缺陷小鼠中的神經(jīng)元遷移缺陷。在14.5dpc：P7(i-v)和16.5dpc：P7(vi-x)的BrdU脈沖追逐分析證明BrdU陽性細(xì)胞(黑)位于WT海馬CA3亞區(qū)中的錐體層(stratum pyramidale，sp)(ii&vii)。(v)圖總結(jié)了在14.5dpc：P7的異位海馬神經(jīng)元的百分比。帶BrdU標(biāo)記的062-/-
14-3-3ζ 小鼠細(xì)胞為異位定位的。神經(jīng)元在始層(s0)中停止，或者遷移越過錐體層并進(jìn)入透明層(stratum lucidum，sl)(iv&ix中的楔形)。(x)圖總結(jié)了在16.5dpc：P7的異位海馬神經(jīng)元的百分比。比例尺：100μm
[0038] 圖5：14-3-3ζ缺陷小鼠中的異常苔蘚纖維通路(mossy ?bre pathway)。062+/+ 062-/-
14-3-3ζ (i、iii、v和vii)和14-3-3ζ (ii、iv、vi和viii)小鼠中下錐體(IPMF，黃楔形)和上錐體(SPMF，白楔形)苔蘚纖維軌道(trajectory)的鈣結(jié)合蛋白免疫染色。
062-/-
與WT對(duì)照相似，14-3-3ζ 缺陷神經(jīng)突最初在從齒狀回(DG)導(dǎo)向離開后分支為SPMF和
062-/-
IPMF分枝。然而，14-3-3ζ 小鼠的IPMF分枝在錐體細(xì)胞胞體間異常的導(dǎo)向(sp，白箭
062-/
頭)。此外，14-3-3ζ -小鼠SPMF分枝的擴(kuò)散侵入CA3中重復(fù)的錐體細(xì)胞層。比例尺：
100μm。
[0039] 圖6：異位CA3錐體細(xì)胞和錯(cuò)誤路線(misrouted)的苔蘚纖維之間功能性突觸連062+/+
接。(a)(i-iv)用針對(duì)突觸泡蛋白(Syp)的抗體染色來自P5614-3-3ζ 小鼠的海馬切片，顯示在IPMF(白楔形)和SPMF(黃楔形)二者中的免疫反應(yīng)性。Syp染色位于圍繞在
062
CA3之錐體胞體的始層(s0)和透明層(sl)中。(v-viii)Syp染色的來自14-3-3ζ -/-小鼠的海馬切片揭示了苔蘚纖維在CA3錐體層中異常的導(dǎo)向(星號(hào)，V，Vii)，形成功能性突觸。(ix-xii)異位成熟的CA3錐體細(xì)胞(通過NeuN染色；用星號(hào)描繪)與來自錯(cuò)誤路線的苔蘚纖維之突觸蛋白(Syp，綠)聯(lián)系。比例尺：100μm。(b)高爾基染色揭示W(wǎng)T或者
062-/
14-3-3ζ -成體小鼠(P35)之錐體細(xì)胞的樹突分支。表明與錯(cuò)誤路線的苔蘚纖維突觸結(jié)(MFB，斜線)之連接點(diǎn)的一組刺樣膨大(thorny excrescence)位于WT神經(jīng)元中CA3錐體細(xì)
062-/-
胞的近頂端樹突上。兩組刺樣膨大位于14-3-3ζ 小鼠中的頂端樹突樹上，一組在近頂端樹突而另一組在末梢樹突分枝中(＊)。(c)示意圖描繪了錯(cuò)誤路線的苔蘚纖維軌道和
062-/-
與WT海馬相比，14-3-3ζ 小鼠中苔蘚纖維結(jié)與異位CA3錐體細(xì)胞聯(lián)系的異常突觸點(diǎn)。
[0040] 圖7：14-3-3ζ與DISC1相互作用以控制神經(jīng)元發(fā)育。(a-b).來自P7小鼠腦的等量裂解物與抗DISC1抗體或者抗14-3-3抗體免疫沉淀，并用DISC1(a)或者EB1純化的抗血清(b)進(jìn)行免疫印跡以識(shí)別14-3-3ζ。還通過直接免疫印跡確定用于免疫共沉淀的DISC1同工型和來自5％總細(xì)胞裂解物(輸入(input))的14-3-3ζ的相對(duì)表達(dá)水平。箭頭標(biāo)明了DISC1的主要100kDa帶和75kDa帶(a)和代表14-3-3ζ的27kDa帶(b)。星號(hào)代表來自免疫沉淀的背景IgG帶。(c)14-3-3ζ在神經(jīng)元遷移和軸突生長中作用的圖示。(i)14-3-3ζ結(jié)合CDK5磷酸化的Ndel1以促進(jìn)與LIS1的相互作用，因此促進(jìn)神經(jīng)元遷移。
(ii)14-3-3ζ也在LIS1/Ndel1/DISC1復(fù)合體中存在以控制軸突生長動(dòng)力學(xué)。
[0041] 圖8：14-3-3ζ基因的基因陷阱(trap)突變。(a)示意性地顯示小鼠系Gt(OST062)Lex Gt(OST390)Lex14-3-3ζ 和(b)小鼠系14-3-3ζ 的插入點(diǎn)。基因陷阱載體包含融合到
選擇性標(biāo)記物基因(0半乳糖苷酶/新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶融合基因的BGEO)的剪接受體序列(splice acceptor sequence SA)，因此所述基因在內(nèi)源14-3-3ζ啟動(dòng)子下表達(dá)。當(dāng)整合入
14-3-3ζ的上游外顯子時(shí)，BGEO產(chǎn)生了干擾mRNA轉(zhuǎn)錄的融合轉(zhuǎn)錄。所述載體還包含PGK啟動(dòng)子，其后跟著剪接供體(SD)信號(hào)上游的Bruton's絡(luò)氨酸激酶基因(BTK)的第一外顯子。在所有閱讀框中BTK包含終止密碼子以防止下游融合轉(zhuǎn)錄的翻譯。所述基因陷阱載體以在兩個(gè)長末端重復(fù)(LTR)之間的逆轉(zhuǎn)錄病毒形式描述。在兩幅圖中，箭頭表示用于基因分型的引物。紅盒表示非編碼的未翻譯序列，而綠盒表示編碼序列。
[0042] 圖9：蛋白質(zhì)印跡分析證明14-3-3ζ表達(dá)在突變體小鼠的所有組織中降低：從062-/- 062+/+
(a)雄性和雌性二者的14-3-3ζ 和年齡匹配的14-3-3ζ 小鼠中以及(b)雄性和
390-/- 390+/+
雌性二者的14-3-3ζ 和年齡匹配的14-3-3ζ 小鼠中收獲組織。所有樣品在包含如材料和方法中所述之蛋白酶抑制劑的NP40裂解緩沖液中勻漿。使用Pierce BCA蛋白測定試劑盒(Pierce BCA Protain Assay Kit)確定蛋白質(zhì)濃度，且每道加入10μg蛋白質(zhì)。印跡用EB-1抗體探針探測以檢測14-3-3ζ，且使用抗β肌動(dòng)蛋白(1：5000)作為加樣對(duì)照。
用HRP綴合的次級(jí)抗體(1：20000，Pierce-Thermo Scienti?c)檢測結(jié)合的抗體。通過ECL可視化免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。注意，EB1抗體也可檢測除了14-3-3ζ之外的14-3-3同工型。
[0043] 圖10：14-3-3同工型的mRNA水平在14-3-3ζ缺陷小鼠腦中保持恒定：在來自062-/-
14-3-3ζ 小鼠的腦組織中，響應(yīng)于14-3-3ζ同工型缺失的所有14-3-3同工型的轉(zhuǎn)錄
062-/- 062+/+
水平無變化。從3只14-3-3ζ 小鼠和3只年齡匹配的14-3-3ζ 對(duì)照的全腦中分離出RNA。使用Quantitect試劑盒(Qiagen)從1μgRNA中生成互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用Sybr Green(Qiagen)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR并使用Rotor Gene機(jī)(Corbett)以確定相比所有14-3-3同工型樣品中之GAPDH的mRNA水平。引物細(xì)節(jié)參見表1。
[0044] 圖11：14-3-3ζ缺陷小鼠顯示在學(xué)習(xí)和記憶中的認(rèn)知功能紊亂(cognitive062-/-
dysfunction)。在十字迷宮逃脫任務(wù)測試中，14-3-3ζ 小鼠(空心圓；n＝12)比
062+/+
14-3-3ζ 小鼠(封閉方形；n＝12)具有更低的空間學(xué)習(xí)(1-6天)和記憶能力。在整
062-/-
個(gè)訓(xùn)練時(shí)期和在記憶測試期(M1和M2)中，14-3-3ζ 小鼠花費(fèi)更久到達(dá)逃脫平臺(tái)。匯集來自雄性和雌性小鼠的數(shù)據(jù)。誤差柱以平均±SEM呈現(xiàn)。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
[0045] 圖12：14-3-3ζ缺陷小鼠顯示減少的驚嚇反射(startle reflex)。在4個(gè)115dB062-/-
的單獨(dú)脈沖塊(pulse-alone block)期間14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝13)的驚嚇幅
062+/+
度低于14-3-3ζ 小鼠(實(shí)心柱；n＝14)。還顯示了來自所有塊的平均(Avg)驚嚇。＊＊，<0.05。
[0046] 圖13：14-3-3ζ表達(dá)在海馬神經(jīng)元中的維持。X-gal染色顯示14-3-3ζ在P0以062+/-
及P714-3-3ζ 海馬和小腦中的內(nèi)源表達(dá)。海馬中14-3-3ζ-lacZ的高水平表達(dá)在阿蒙氏角的錐體神經(jīng)元和成熟齒狀神經(jīng)元中明顯，但在出生后小腦中不明顯。比例尺：25μm。
[0047] 圖14：14-3-3ζ缺陷小鼠中海馬分層的缺陷。尼氏染色顯示W(wǎng)T(i、iii、v)062-/-
和14-3-3ζ (ii、iv、vi)小鼠從14.5dpc直至出生(P0)海馬的發(fā)育。海馬細(xì)胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的錐體層(sp)中分散。楔形突出了在輻射層(sr)中海馬錐體神經(jīng)元復(fù)制的層。星號(hào)突出了在始層(s0)中異位定位的錐體細(xì)胞。比例尺：25μm。
[0048] 圖15：14-3-3ζ缺陷小鼠中誤定位的神經(jīng)元生存進(jìn)入成年期。在海馬原基(a-f)-/-和成熟海馬(g-h)中的凋亡細(xì)胞。在14-3-3ζ 海馬未檢測到片段化、凋亡細(xì)胞核(如aii和bii中綠色TUNEL陽性細(xì)胞所示)的增加。比例尺：100μm。
[0049] 圖16：14-3-3ζ控制谷氨酸能通路以介導(dǎo)感覺運(yùn)動(dòng)門控(sensorimotor gating)。062+/+ 062-/-
與14-3-3ζ 小鼠相比(灰柱；n＝11；5雄性和6雌性)，14-3-3ζ 小鼠(灰色
斜條柱；n＝11；5雄性和6雌性)具有減少的PPI，具有在70dB基準(zhǔn)線上16dB的前脈沖(PP)和100毫秒的刺激間時(shí)間間隔。MK801(MK)和阿撲嗎啡(Apomorphine)(APO)引起
062+/+ 062-/-
14-3-3ζ 小鼠中的PPI缺陷。相反地，僅APO引起14-3-3ζ 小鼠中的PPI進(jìn)一步缺陷。
[0050] 圖17：14-3-3ζ控制多巴胺能通路以介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)行為(locomotor activity)。在曠062-/-
場試驗(yàn)中，當(dāng)用D-安非他明(Amphetamine)處理時(shí)，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11；
062+/+
6雄和5雌)比14-3-3ζ 同窩幼畜在30周齡時(shí)具有更多的探索行為。Sal，鹽水。來自雄性和雌性小鼠的數(shù)據(jù)在所有圖中匯集。誤差柱以平均±SEM呈現(xiàn)。＊，p<0.05。
[0051] 圖18：14-3-3ζ缺陷小鼠具有降低的棘密度。
[0052] (A)與14-3-3ζ062+/+小鼠(n+4，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)20個(gè)樹突)相比，樹突棘在062-/-
14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)20個(gè)樹突)齒狀回(DG)的顆粒神經(jīng)元中減少。
062+/+ 062-/-
(B)與14-3-3ζ 小鼠(n+4，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)20個(gè)樹突)相比，樹突棘在14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)20個(gè)樹突)海馬角(CA)的錐體神經(jīng)元中也減少。左側(cè)圖顯示了
062-/- 062+/+
在14-3-3ζ 和14-3-3ζ DG樹突或者CA樹突中棘的代表性圖像。右側(cè)圖表明了有相應(yīng)p值的定量。注意，對(duì)于所有動(dòng)物棘數(shù)量的打分是完全盲性(blind)的。

具體實(shí)施方式

[0053] 本發(fā)明部分地基于蛋白14-3-3ζ功能性水平降低的確定(如在蛋白14-3-3ζ絕對(duì)水平或者蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成水平的情形下)指示神經(jīng)精神病癥(如精神分裂癥或者相關(guān)病癥)發(fā)作或傾向于發(fā)作。因此所述發(fā)現(xiàn)已促進(jìn)用于評(píng)估對(duì)神經(jīng)精神病癥易感性或者診斷神經(jīng)精神病癥發(fā)作的簡單但非常有用之測試的開發(fā)。也促進(jìn)了不表達(dá)蛋白14-3-3ζ的經(jīng)遺傳修飾動(dòng)物的產(chǎn)生及其使用方法(如在開發(fā)或者測試已知或新的治療性或預(yù)防性處理方案或者篩選可用于所述方案之調(diào)節(jié)性物質(zhì)的情形下)。
[0054] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0055] 不將本發(fā)明限于任何一種理論或者作用模式，14-3-3蛋白為保守的二聚磷酸絲氨酸結(jié)合蛋白家族，所述家族與多種細(xì)胞蛋白相互作用并調(diào)控其功能，從而調(diào)節(jié)許多信號(hào)通路(Tzivion and Avruch2002，J.Biol.Chem.277：3061-64；Fu et al.2000，Ann.Rev.Pharma.Tox.40：617-47)。14-3-3蛋白由兩個(gè)30kDa的單體單元構(gòu)成，所述單元每個(gè)都能夠通過兩親性溝(amphipathic groove)結(jié)合磷酸絲氨酸基序。14-3-3的二聚物通過N-末端α螺旋形成，其中一個(gè)單體的螺旋1與另一個(gè)的螺旋3和4相互作用。功能上，14-3-3蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白活性中扮演多個(gè)角色，且重要的是，14-3-3的所述功能依賴于其二聚化結(jié)構(gòu)(Xing et al.2000，supra；Yaffe2002，F(xiàn)EBS Letts.513：53-57)。14-3-3蛋白為7種磷酸絲氨酸結(jié)合蛋白的高度保守家族。所述7種同工型為β、ε、γ、η、σ、τ和ζ(NCBI參考序列號(hào)NM_003406.3；SEQ ID NO：1)型。
[0056] 提到“蛋白14-3-3ζ”應(yīng)理解為包括涉及蛋白14-3-3ζ的所有形式，其包括功能性等位基因或者多態(tài)變體(polymorphic variant)。提到“變體”應(yīng)理解為擴(kuò)展至功能性突變體。提到“同源物(homologue)”應(yīng)理解為指代來自除人以外其他物種的14-3-3蛋白。提到“功能性”14-3-3蛋白應(yīng)理解為涉及可經(jīng)歷DISC1復(fù)合體形成并因此促進(jìn)通過DISC1調(diào)節(jié)之網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。應(yīng)了解在本說明書中“蛋白14-3-3ζ”也可互換的稱為“14-3-3ζ”。兩個(gè)術(shù)語應(yīng)理解為指代相同的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白14-3-3ζ為人14-3-3ζ。
[0057] 根據(jù)所述實(shí)施方案，提供了篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0058] 提到“神經(jīng)精神病癥”應(yīng)理解為指代以基于神經(jīng)生物學(xué)的認(rèn)知、情緒和行為擾動(dòng)為特征的病癥。所述病癥的實(shí)例包括尤其以下列為特征的病癥：精神分裂癥的一種或更多種癥狀、精神分裂癥、分裂型人格障礙、精神病、兩極性障礙、躁狂抑郁癥(manic depression)、情感障礙(affective disorder)、或者精神分裂癥樣疾病(schizophreniform)或分裂情感障礙(schizoaffective disorder)、精神病性抑郁癥、孤獨(dú)癥、藥物引起的精神病、譫妄(delirium)、酒精戒斷綜合征或者癡呆引起的精神病。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)精神病癥為以精神分裂癥的一種或者更多種癥狀為特征的病癥。
[0060] 根據(jù)所述實(shí)施方案，因此提供了篩選以一種或者更多種精神分裂癥的癥狀特性為特征的病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0061] 提到“精神分裂癥的癥狀特性”應(yīng)理解為指代可以發(fā)生在遭受精神分裂癥個(gè)體中的任何一種或更多種癥狀。所述癥狀可以在整個(gè)病程(disease course)中顯現(xiàn)或者其可以僅僅瞬時(shí)的或周期性的顯現(xiàn)。例如，與精神分裂癥相關(guān)的幻覺通常周期性發(fā)作，而典型的社會(huì)戒斷可展現(xiàn)為持續(xù)顯現(xiàn)。還應(yīng)了解對(duì)象癥狀不一定由遭受精神分裂癥的所有個(gè)體展現(xiàn)。例如，一些個(gè)體可以僅遭受聽覺幻覺而其他可僅遭受視覺幻覺。然而，就本發(fā)明的目的而言，所述定義涵蓋任何這樣的癥狀，而不考慮有多少精神分裂癥患者曾經(jīng)確實(shí)展現(xiàn)出特定的癥狀。不將本發(fā)明限于任何理論或者作用模式，與疾病最通常相關(guān)的癥狀稱為陽性癥狀(其表明存在非常異常的行為)、思維障礙和陰性癥狀。思維障礙和陽性癥狀包括難以跟上講話或者從一個(gè)主題跳到另一個(gè)而沒有邏輯聯(lián)系，妄想(迫害、罪行、夸大或者被外部控制的錯(cuò)誤信念)和幻覺(視覺的或者聽覺的)。思維障礙為清晰且有邏輯思考之能力的降低。其經(jīng)常通過無聯(lián)系和無意義的語言表現(xiàn)，所述語言致使患有精神分裂癥的人不能參與交談，使得所述人與家庭、朋友和社會(huì)疏遠(yuǎn)。妄想在患有精神分裂癥的個(gè)體中間普遍。受影響的人可能相信其被陰謀地對(duì)待了(稱為“偏執(zhí)型妄想”)。“播散”描述了妄想的一種類型，其中患有所述疾病的個(gè)體相信其他人可以聽見其想法。幻覺可以為聽到、看見或者甚至感覺到。其最經(jīng)常的是僅被受折磨的人以聲音的形式聽到。所述聲音可以描述所述人的行為，警告危險(xiǎn)或者告訴他做什么。有時(shí)個(gè)體可以聽到許多聲音進(jìn)行交談。相比于上述“陽性癥狀”較不明顯但是同樣嚴(yán)重的是缺陷或者陰性癥狀，其代表正常行為的不存在。所述行為包括淡漠或者遲鈍的情感(即缺少情緒表達(dá))、冷漠、社會(huì)戒斷和缺乏自知力。陽性癥狀和陰性癥狀二者應(yīng)理解為落入“精神分裂癥的癥狀特性”定義中。
[0062] 除了精神分裂癥患者間所展現(xiàn)出來的癥狀方面可能有顯著變化的事實(shí)，還應(yīng)了解還有以一種或者更多種所述癥狀為特征的其他神經(jīng)精神病癥。例如，在患有如兩極性障礙、精神病性抑郁癥、譫妄和癡呆引起的精神病之患者中也普遍觀察到幻覺。因此，提到以一種或者更多種精神分裂癥的癥狀特性為特征的病癥，應(yīng)理解為指代任何以一種或者更多種所述癥狀存在為特征的神經(jīng)精神病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥為精神分裂癥。
[0063] 根據(jù)所述實(shí)施方案，提供了篩選精神分裂癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之人的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述發(fā)作或傾向于發(fā)作精神分裂癥的指示。
[0064] 本文使用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”包括人、靈長類、牲畜動(dòng)物(如馬、牛、羊、豬、驢)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侶動(dòng)物(如狗、貓)和圈養(yǎng)野生動(dòng)物(如袋鼠、鹿、狐貍)。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人或者實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人。
[0065] 一般認(rèn)為展現(xiàn)蛋白14-3-3ζ水平低于正常范圍的個(gè)體相對(duì)于其發(fā)作的易感體質(zhì)已經(jīng)經(jīng)受了對(duì)象病癥的發(fā)作，其中也有一種或更多種如上文所描述的陽性或陰性癥狀發(fā)作的跡象。應(yīng)該了解診斷神經(jīng)精神病癥(如精神分裂癥)的限制之一是在所述病癥的早期，觀察到的癥狀為非特異性的且經(jīng)?？蓺w結(jié)于非神經(jīng)精神原因。這使得診斷非常困難，特別是當(dāng)與患有如精神分裂癥的病癥相關(guān)的病恥感(stigma)可以導(dǎo)致在此診斷不存在絕對(duì)確定性下健康專業(yè)人員或者患者家屬不情愿承認(rèn)這樣的診斷時(shí)。當(dāng)作出了不正確的診斷時(shí)，結(jié)果可以很嚴(yán)重，因?yàn)橹委熖幚矸桨缚赡苁聦?shí)上設(shè)計(jì)的將不會(huì)起效或者可能甚至是有害的。因此，因?yàn)楝F(xiàn)在可以對(duì)神經(jīng)精神病癥特征性癥狀之發(fā)作的觀察結(jié)果與生物化學(xué)讀出(readout)一起進(jìn)行評(píng)估以提供堅(jiān)實(shí)的診斷，所以本發(fā)明的方法現(xiàn)提供在這些類型情況下獲得確實(shí)診斷的裝置/手段。
[0066] 因此，本發(fā)明提供診斷呈現(xiàn)一種或者更多種陽性或陰性癥狀或思維障礙之人中神經(jīng)精神病癥發(fā)作的方法，所述方法包括在來源于所述人之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與對(duì)照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平較低是所述病癥發(fā)作的指示。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是以一種或者更多種精神分裂癥癥狀為特征的病癥。
[0068] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥為精神分裂癥。
[0069] 如上文詳述，本發(fā)明還提供了確定患者是否有發(fā)展出神經(jīng)精神病癥傾向的裝置/手段。這種情況下，所述個(gè)體通常尚未展現(xiàn)出神經(jīng)精神病癥的任何癥狀。然而，由于許多因素中的任何一個(gè)(例如家族史)，可能需要確定個(gè)體是否有易患所述病癥發(fā)作的傾向。這可以提供有價(jià)值的信息，所述信息可以使得能夠進(jìn)行生活方式的改變或者執(zhí)行預(yù)防性藥物治療方案。因此在這點(diǎn)上提到“傾向于”應(yīng)理解為表示，相對(duì)于正常個(gè)體，對(duì)所述病癥發(fā)作的趨向或易感性增加。其并不意味著個(gè)體將必須發(fā)展出病癥，例如如果個(gè)體沒有暴露于所述病癥發(fā)作的觸發(fā)物，而僅僅在可以觸發(fā)所述病癥發(fā)作的環(huán)境下，有易患所述病癥傾向的人將比無傾向的人更可能形成所述病癥。提到對(duì)所述病癥發(fā)作“無傾向”的個(gè)體應(yīng)理解為具有相反的意義。提到“傾向于”也期望為描述展現(xiàn)出相對(duì)于普通群體發(fā)展出神經(jīng)精神病癥風(fēng)險(xiǎn)增加的個(gè)體。
[0070] 本發(fā)明基于確定蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低作為神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者發(fā)作之敏感體質(zhì)的指示。提到“功能性水平”應(yīng)理解為指代除了蛋白14-3-3ζ本身絕對(duì)水平以外的生物有效水平。就是說，蛋白14-3-3ζ影響下文描述的生物通路的能力是關(guān)鍵問題，其被除了僅僅蛋白14-3-3ζ的絕對(duì)水平之外的可測量因素所影響。
[0071] 不將本發(fā)明限于任何理論或者作用模式，14-3-3ζ結(jié)合磷酸化的Ndel1，維持Ndel1的磷酸化并因此促進(jìn)了Ndel1結(jié)合LIS1和調(diào)節(jié)核運(yùn)動(dòng)的胞質(zhì)動(dòng)力蛋白重鏈。然而，現(xiàn)也已確定蛋白14-3-3ζ與三聯(lián)DISC1/Ndel1/LIS1復(fù)合體相互作用以促進(jìn)驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)結(jié)合和Ndel1/LIS1的移位(relocation)以生長軸突。進(jìn)一步，其優(yōu)先地以同工型特異方式發(fā)生，伴隨14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成且信號(hào)優(yōu)先地發(fā)生于DISC175kDa同工型情形下而非100kDa同工型。這些發(fā)現(xiàn)與之前的發(fā)現(xiàn)相反，之前的發(fā)現(xiàn)曾證明Ndel1事實(shí)上與DISC1的100kDa同工型相互作用。
[0072] DISC1蛋白在人中由DISC1基因編碼(Millar et al.2000，Hum.Mol.Genet.9(9)：1415-23)。與廣泛的相互作用伴侶配合，DISC1已經(jīng)顯示參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、神經(jīng)元軸突和樹突長出(outgrowth)、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)、分裂和/或融合以及細(xì)胞間粘附的調(diào)節(jié)。DISC1位于染色體1q42.1并與DISC2開放閱讀框重疊。已經(jīng)在RNA水平(包括TSNAX-DISC1轉(zhuǎn)基因剪接變體)和蛋白質(zhì)水平鑒定了多種DISC1同工型(Nakata et al.(2009).Proc Natl Acad Sci U S A.106(37)：15873-8)。分離的RNA同工型中，4種已經(jīng)確認(rèn)被翻譯，即長型(L)、長變體同工型(Lv)、短同工型(S)和特別短同工型(Es)。人DISC1轉(zhuǎn)錄為兩個(gè)主要的剪接變體，L型和Lv同工型。L和Lv轉(zhuǎn)錄分別利用外顯子11中的近端和遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn)在。已經(jīng)表征編碼不同同工型的替代轉(zhuǎn)錄剪接變體。DISC1同源物已經(jīng)在普通黑猩猩、獼猴、家鼠、棕色大鼠、斑馬魚、河豚、牛和狗中被鑒定(Taylor et al.(2003)Genomics81(1)：67-77)。
[0073] 由所述基因編碼的蛋白質(zhì)預(yù)計(jì)含有富集卷曲螺旋基序的C-末端結(jié)構(gòu)域和N-末端球狀結(jié)構(gòu)域(Taylor et al.2003supra)。所述N-末端包含兩個(gè)推定核定位信號(hào)(putative nuclear localization signal)和未知意義的絲氨酸-苯丙氨酸富集的基序。所述C-末端包含有卷曲螺旋形成潛力的多個(gè)區(qū)域和兩個(gè)可介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用的亮氨酸拉鏈。DISC1蛋白不具有已知的酶促活性；相反地，其通過相互作用施加其影響至多種蛋白質(zhì)以在時(shí)間和空間上調(diào)控所述蛋白質(zhì)功能性狀態(tài)和生物活性(Bradshaw and Porteous(2010-12-31).“DISC1-binding proteins in neural development，signalling and schizophrenia.”.Neuropharmacology)。
[0074] 提到“DISC1”應(yīng)理解為具有關(guān)于“蛋白14-3-3ζ”提供的相應(yīng)的意義。
[0075] 仍然不以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在精神分裂癥小鼠模型情形下蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低引起了行為和認(rèn)知缺陷特性的精神分裂癥。所述缺陷以運(yùn)動(dòng)功能增加、不能識(shí)別新物體、對(duì)空曠環(huán)境焦慮的減少、學(xué)習(xí)或記憶能力的嚴(yán)重降低和異常感覺運(yùn)動(dòng)門控的形式被注意。還鑒定到海馬中神經(jīng)元的解剖學(xué)失調(diào)(anatomical disturbance)并推測其來自異常的神經(jīng)元遷移。還鑒定到特異性軸突導(dǎo)向缺陷和海馬苔蘚纖維的異常突觸連接，這作為突觸病癥的精神分裂癥是一致的。更特別的，在14-3-3ζ功能性不利影響處破壞了海馬的分層性組織。所述缺陷主要來自海馬神經(jīng)元從腦室下區(qū)(subventricular zone)至其在錐體層中通常停留處的異常遷移。因此，14-3-3ζ/DISC1軸在精神分裂癥的病理生理學(xué)中是居中心地位的生物通路，且觀察到的解剖學(xué)缺陷與以下事實(shí)一致：與精神分裂癥相關(guān)的認(rèn)知缺陷來自神經(jīng)發(fā)育缺陷和突觸失調(diào)二者。
[0076] 在評(píng)估蛋白14-3-3ζ功能(functionality)的“生物有效水平”方面，應(yīng)了解其不僅僅可以評(píng)估蛋白14-3-3ζ絕對(duì)水平方面，還可評(píng)估蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成的水平，因?yàn)閷?shí)際上所述復(fù)合體的形成支持了必須的神經(jīng)發(fā)育。蛋白14-3-3ζ絕對(duì)水平的缺陷將影響所述復(fù)合體的形成但是蛋白14-3-3ζ分子或DISC1分子中其他結(jié)構(gòu)或功能性缺陷也會(huì)如此，這是因?yàn)槠鋵?dǎo)致有效復(fù)合體形成不能發(fā)生。沒有復(fù)合體形成，通過所述復(fù)合體引起的下游信號(hào)發(fā)出事件不能發(fā)生。因此，可以篩選在蛋白14-3-3ζ表達(dá)中的缺陷和其他可能不一定影響蛋白14-3-3ζ水平但是其對(duì)14-3-3ζ與DISC1形成功能性復(fù)合體能力有不利影響的類型中的缺陷。例如，可以篩選：
[0077] (i)；蛋白14-3-3ζ翻譯產(chǎn)物水平的降低；
[0078] (ii)；蛋白14-3-3ζ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的降低(例如初級(jí)RNA或者mRNA)；
[0079] (iii)與14-3-3基因相關(guān)聯(lián)的染色質(zhì)蛋白的變化，例如在氨基酸位置9或27位賴氨酸甲基化的組蛋白H3(抑制性修飾)或者起下調(diào)表達(dá)作用的DNA自身的變化(如DNA甲基化的變化)；
[0080] (iv)蛋白14-3-3ζ與DISC1形成復(fù)合體之能力的降低。
[0081] 根據(jù)所述實(shí)施方案，本發(fā)明涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定編碼蛋白14-3-3ζ基因的表達(dá)水平，其中與對(duì)照水平相比所述表達(dá)水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0082] 應(yīng)了解提到蛋白14-3-3ζ基因的“表達(dá)”意在評(píng)估編碼所述特定蛋白14-3-3同工型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如mRNA)或者翻譯蛋白質(zhì)(即蛋白質(zhì))自身的水平。
[0083] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平為mRNA表達(dá)。
[0084] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平為蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0085] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平通過篩選基因組DNA的變化(如DNA甲基化特別是超甲基化的變化)來評(píng)估。
[0086] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平通過篩選所述基因相關(guān)聯(lián)的染色質(zhì)蛋白的變化來評(píng)估。
[0087] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及篩選神經(jīng)精神病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作之哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成的水平，其中與對(duì)照水平相比所述復(fù)合體形成水平較低是所述病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作的指示。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述復(fù)合體為蛋白14-3-3ζ和75kDa DISC1同工型的復(fù)合體。
[0089] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解提到“蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體”為表示包含蛋白14-3-3ζ和DISC1二者但不一定只包含這兩種分子的復(fù)合體。就是說，所述復(fù)合體可包含其他分子，如Ndel1和LIS1。還應(yīng)了解14-3-3ζ蛋白不一定直接或者僅僅與DISC1相互作用。就是說，所述蛋白也可以與Ndel1和/或LIS1相互作用。
[0090] 本發(fā)明的方法基于相對(duì)蛋白14-3-3ζ標(biāo)記物對(duì)照水平的生物樣品中蛋白14-3-3ζ表達(dá)水平的分析。所述“對(duì)照水平”可以為“正常水平”，所述正常水平為在取自沒有遭受對(duì)象神經(jīng)精神病癥個(gè)體的相應(yīng)樣品中蛋白14-3-3ζ表達(dá)的水平，或者為在患病患者之前時(shí)間點(diǎn)收獲的樣品。后者的情況有關(guān)于使用本發(fā)明的方法監(jiān)測患者一段時(shí)間，例如評(píng)估治療性或者預(yù)防性處理方案的效力。這將在下文更詳細(xì)的討論。還應(yīng)了解對(duì)象蛋白
14-3-3ζ可以通過定量或者定性讀出評(píng)估或者監(jiān)測。
[0091] 可使用符合用于分析但是已經(jīng)從沒有形成病癥也沒有形成病癥傾向的個(gè)體分離之樣品的生物樣品確定正常水平。然而，應(yīng)了解可能最方便的是分析相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的試驗(yàn)結(jié)果，所述標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果反映了個(gè)體或者從健康個(gè)體獲得的匯集結(jié)果。后一種形式的分析事實(shí)上是分析的優(yōu)選方法，因?yàn)槠涫沟眯枰占头治鰡蝹€(gè)生物樣品試劑盒的設(shè)計(jì)成為感興趣的試驗(yàn)樣品。提供正常水平的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適手段計(jì)算。例如，正常組織的群體可以按照14-3-3ζ的水平評(píng)估，因此提供了標(biāo)準(zhǔn)值或者值的范圍，依靠所述值分析所有將來的試驗(yàn)樣品。應(yīng)了解正常水平可以從特定群體的對(duì)象確定并針對(duì)來源于所述群體之試驗(yàn)樣品來使用。因此，可能有確定的許多相應(yīng)不同特性(如年齡、性別、種族或健康狀態(tài))群體的標(biāo)準(zhǔn)值或者范圍。所述“正常水平”可以為離散的水平或者水平的范圍。
[0092] 雖然優(yōu)選的方法為檢測蛋白14-3-3ζ水平的降低以診斷對(duì)象病癥發(fā)作或者傾向于發(fā)作，在某些情況下可能期望蛋白14-3-3ζ水平升高的檢測。例如，可能尋求監(jiān)測個(gè)體疾病狀態(tài)的變化或者關(guān)于精神病形成或急性發(fā)作的預(yù)兆，如在患者預(yù)防性或者治療性處理期間。作為替代地，例如，可監(jiān)測呈現(xiàn)精神分裂癥癥狀或者形成所述病癥之遺傳或環(huán)境易感體質(zhì)的患者。應(yīng)了解根據(jù)本發(fā)明的所述方面，14-3-3ζ功能性蛋白水平將可能相對(duì)于一個(gè)或者更多個(gè)之前獲得的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，如上文所描述。
[0093] 因此，本發(fā)明的方法可用作一次性試驗(yàn)(one off test)，用作對(duì)那些被認(rèn)為有形成所述病癥風(fēng)險(xiǎn)之個(gè)體的持續(xù)監(jiān)測或者用作涉及抑制或者以其他方式減緩所述病癥發(fā)作或進(jìn)程的治療或預(yù)防處理方案之效力的監(jiān)測。因此，本發(fā)明的方法應(yīng)理解為擴(kuò)展至監(jiān)測個(gè)體中與正常水平(如上文所定義)相比或與從所述個(gè)體確定的一種或更多種較早期水平相比蛋白14-3-3ζ水平的升高或降低。
[0094] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在經(jīng)診斷有神經(jīng)精神病發(fā)作的哺乳動(dòng)物中監(jiān)測所述病癥進(jìn)程的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或較低是不良預(yù)后的指示，而與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平較高是改善預(yù)后的指示。
[0095] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)測已確定為傾向于神經(jīng)精神病癥發(fā)作之患者的方法，所述方法包括在來源于所述哺乳動(dòng)物之生物樣品中確定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中與之前從所述哺乳動(dòng)物獲得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或較低是改善預(yù)后的指示。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥以精神分裂癥的一種或者更多種癥狀為特征。
[0097] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥為精神分裂癥。
[0098] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物為人。
[0099] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平為mRNA表達(dá)。
[0100] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平為蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0101] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平通過篩選基因組DNA的變化(如DNA甲基化特別是超甲基化的變化)評(píng)估。
[0102] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平通過篩選所述基因相關(guān)聯(lián)的染色質(zhì)蛋白的變化評(píng)估。
[0103] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述功能性水平為蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成的水平，更特別的為14-3-3ζ/75kDa DISC1同工型復(fù)合體形成。
[0104] 不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明的方法特別有用，因?yàn)榈鞍?4-3-3ζ表達(dá)在腦外可檢測。多數(shù)之前鑒定的精神分裂癥標(biāo)記物以突變的形式存在于僅在腦中表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中。從診斷觀點(diǎn)看，這不是期望的，因?yàn)槭斋@腦組織用于試驗(yàn)(特別是常規(guī)試驗(yàn))的前景對(duì)于患者是難以接受的，且由于其高度創(chuàng)傷性，潛在地易引起嚴(yán)重并發(fā)癥的形成(如感染)。然而，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)已使得能夠使用其他生物來源，包括腦脊液、外周血和來自組織(如牙髓、毛囊或者鼻窩)的成體來源的神經(jīng)干細(xì)胞。這一試驗(yàn)的開發(fā)已使得能夠顯著地更加簡單和常規(guī)的針對(duì)精神分裂癥對(duì)個(gè)體進(jìn)行測定。
[0105] 因此，提到“生物樣品”應(yīng)理解為任何來源于動(dòng)物的生物材料，比如但不限于細(xì)胞材料、組織活檢標(biāo)本(tissue biopsy specimen)或者體液(如腦脊液或血液)。根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行試驗(yàn)的生物樣品可直接試驗(yàn)或者在試驗(yàn)前可能需要一些形式的處理。例如，活檢樣品在檢測前可能需要?jiǎng)驖{或者其可能需要切片以用于原位試驗(yàn)。而且，就生物樣品不為液體形式來說，(如果試驗(yàn)需要所述形式)可能需要添加試劑(比如緩沖液)以活動(dòng)化(mobilise)所述樣品。優(yōu)選地，所述生物樣品為外周血淋巴細(xì)胞或者成體來源神經(jīng)干細(xì)胞樣品。
[0106] 就存在于生物樣品中的目標(biāo)分子來說，生物樣品可以直接進(jìn)行試驗(yàn)或者可以在試驗(yàn)前分離生物樣品中存在的所有或者一些核酸材料或蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)例中，樣品可以部分純化或者另外在分析前富集。例如，就包含非常多樣的細(xì)胞群的生物樣品來說，如果mRNA為分析的對(duì)象，可能期望選出特定感興趣的亞群(例如CNS細(xì)胞)。在試驗(yàn)前對(duì)目標(biāo)核酸或者蛋白質(zhì)分子的預(yù)處理是在本發(fā)明范圍內(nèi)的，例如活病毒的失活或者跑膠(run0n a gel)。還應(yīng)了解生物樣品可以新鮮地收獲或者其可在試驗(yàn)前儲(chǔ)藏(例如通過冷凍)或者另外在試驗(yàn)前處理(如通過進(jìn)行培養(yǎng))。
[0107] 根據(jù)本文公開的方法選擇什么類型的樣品最合適進(jìn)行試驗(yàn)將依賴于所面臨情況的性質(zhì)。
[0108] 如上文詳細(xì)提到的“表達(dá)”應(yīng)理解為指代核酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。提到“RNA”應(yīng)理解為包括任何形式的RNA(如初級(jí)RNA或者mRNA)。不以任何方式限制本發(fā)明，導(dǎo)致RNA合成增加或減少的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控也會(huì)與所述RNA轉(zhuǎn)錄本(如mRNA)翻譯為蛋白質(zhì)產(chǎn)物相關(guān)。因此，本發(fā)明還擴(kuò)展至檢測方法學(xué)，所述方法學(xué)涉及篩選蛋白14-3-3ζ產(chǎn)物的調(diào)控水平或模式作為細(xì)胞或者細(xì)胞群瘤狀態(tài)的指示物。雖然方法用來篩選mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但是應(yīng)了解本發(fā)明并不限于此并擴(kuò)展至篩選任何其他形式的表達(dá)產(chǎn)物(比如，例如初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本)。
[0109] 在篩選蛋白14-3-3ζ表達(dá)下調(diào)的方面也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其在DNA水平上可檢測的變化是基因表達(dá)活性變化的指示，因此是表達(dá)產(chǎn)物水平的指示。所述變化包括但不限于DNA甲基化的變化。因此，本文提到的“篩選表達(dá)水平”和將這些“表達(dá)水平”與對(duì)照的“表達(dá)水平”相比較應(yīng)理解為用于評(píng)估關(guān)于轉(zhuǎn)錄的DNA因子(如基因/DNA甲基化模式)。
[0110] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知的是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化是基因表達(dá)變化的指示?；虮磉_(dá)的沉默經(jīng)常與染色質(zhì)蛋白的修飾相關(guān)，組蛋白H3的9和27位之一或者二者的賴氨酸的甲基化是經(jīng)過充分研究的實(shí)例，而活性染色質(zhì)的標(biāo)志在于組蛋白H3之9位賴氨酸的乙酰化。因此，基因序列與帶有抑制性或者活性修飾之染色質(zhì)的關(guān)聯(lián)可用于進(jìn)行基因表達(dá)水平的評(píng)估。
[0111] 提到“核酸分子”應(yīng)理解為指代脫氧核糖核酸分子和核糖核酸分子二者以及其片段。因此，本發(fā)明擴(kuò)展至在生物樣品中直接篩選mRNA水平或者篩選已經(jīng)從感興趣的mRNA群體逆轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)eDNA。在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)中已經(jīng)很好的設(shè)計(jì)了針對(duì)篩選DNA或者RNA的方法。如上所述，本發(fā)明的方法也擴(kuò)展至篩選由對(duì)象mRNA或者基因組DNA自身翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過參考mRNA或者蛋白質(zhì)產(chǎn)物來測量蛋白14-3-3ζ表達(dá)水平。
[0113] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過分析基因組DNA甲基化評(píng)估所述基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過DNA與帶有抑制性修飾的染色質(zhì)蛋白的關(guān)聯(lián)(例如組蛋白H3的9或27位賴氨酸的甲基化)來評(píng)估表達(dá)。
[0114] 術(shù)語“蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為包括肽、多肽和蛋白質(zhì)(包括蛋白質(zhì)片段)。蛋白質(zhì)可以是糖基化或非糖基化的和/或可以包括各種其他與蛋白質(zhì)融合、連接、結(jié)合或以其他方式相關(guān)聯(lián)的分子(如氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物或者其他肽、多肽或蛋白質(zhì))。本文提到“蛋白質(zhì)”包括含有氨基酸序列的蛋白質(zhì)以及與其他分子(如氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物或者其他肽、多肽或蛋白質(zhì))相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。
[0115] 提到“片段”應(yīng)理解為指代對(duì)象核酸分子或者蛋白質(zhì)的一部分。這與篩選調(diào)控的RNA水平特別相關(guān)，因?yàn)樗銎螢楣逃胁环€(wěn)定的分子，且可在表達(dá)高水平酶的樣品中篩選。在此情況下，對(duì)象RNA可能已經(jīng)降解或者以其他形式被片段化。因此，可事實(shí)上檢測對(duì)象RNA分子的片段，所述片段依靠使用合適的特異性探針來鑒定。
[0116] 在生物樣品中評(píng)估蛋白14-3-3ζ的手段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的方法來實(shí)現(xiàn)。為此，應(yīng)了解就檢測同源細(xì)胞群或者組織切片來說，可利用廣泛的技術(shù)(如原位雜交、通過微測定評(píng)估表達(dá)譜、免疫測定等等，下文更詳細(xì)描述)以檢測感興趣的一種或者更多種標(biāo)記物表達(dá)水平的不存在或者下調(diào)。然而，就篩選異源細(xì)胞群或者其中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異源群的體液(如血液樣品)來說，由于也存在于所述樣品中其他細(xì)胞亞群的蛋白14-3-3ζ的固有表達(dá)，特定細(xì)胞亞群的蛋白14-3-3ζ表達(dá)水平的不存在或者降低可能更難以檢測。就是說，細(xì)胞亞組表達(dá)水平的降低可能無法檢測。在此情況下，經(jīng)由間接手段(例如表觀遺傳學(xué)變化的檢測)是檢測蛋白14-3-3ζ表達(dá)水平降低的更適當(dāng)機(jī)制。
[0117] 如上文詳述，在發(fā)育期間，基因表達(dá)受到以下過程的調(diào)節(jié)：所述過程改變不同細(xì)胞譜系中進(jìn)行表達(dá)的基因的可用性而沒有改變基因序列，并且這些狀態(tài)可以通過細(xì)胞分裂而遺傳，該過程稱為表觀遺傳(epigenetic inheritance)。通過DNA甲基化(修飾胞嘧啶以形成5-甲基胞嘧啶，5meC)的組合和包裝DNA之組蛋白染色體蛋白的修飾來確定表觀遺傳。因此，DNA在CpG位點(diǎn)的甲基化和修飾(如組蛋白H3在9位賴氨酸的脫乙酰作用和在9或
27位賴氨酸的甲基化)與失活染色質(zhì)相關(guān)，而DNA甲基化、組蛋白H3的9位賴氨酸乙?；娜鄙俚南喾礌顟B(tài)則與開放染色質(zhì)和活化的基因表達(dá)相關(guān)。
[0118] 可用多種方法檢測特定基因的異常甲基化DNA，甚至在大量正常DNA存在下(Clark2007)。因此，除了通過免疫組織化學(xué)外，難以在蛋白質(zhì)或RNA水平檢測的基因表達(dá)的喪失經(jīng)?？梢酝ㄟ^基因啟動(dòng)子的超甲基化DNA的存在來檢測。表觀遺傳學(xué)改變和染色質(zhì)變化在經(jīng)修飾的組蛋白與特定基因之發(fā)生改變的關(guān)聯(lián)中也是明顯(Esteller，2007)；例如阻遏基因經(jīng)常與組蛋白H3相關(guān)聯(lián)地被發(fā)現(xiàn)，所述組蛋白在9位賴氨酸是脫乙?；图谆摹Ｊ褂每贵w靶向改變的組蛋白允許分離與特定染色質(zhì)狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的DNA和其在癌癥診斷中的潛在使用。
[0119] 檢測基因表達(dá)水平變化的其他方法包括但不限于：
[0120] (i)體內(nèi)檢測
[0121] 在施用能夠揭示蛋白14-3-3ζ表達(dá)改變的成像探針或試劑后可以使用分子成像。分子成像(Moore et al.，BBA，1402：239-249，1988；Weissleder et al.，Nature Medicine6：351-355，2000)是分子表達(dá)的體內(nèi)成像，所述成像與目前可視化使用“經(jīng)典”診斷成像技術(shù)(如X射線、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、MRI、正電子發(fā)射斷層(PET)或內(nèi)窺鏡術(shù))的宏觀特征相關(guān)。
[0122] (ii)RNA篩選
[0123] 通過熒光原位雜交(FISH)在細(xì)胞中或者通過技術(shù)(如定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRTPCR)或競爭RT-PCR產(chǎn)物的流式細(xì)胞術(shù)定性)在來自細(xì)胞的提取物中檢測RNA表達(dá)的下調(diào)(Wedemeyer et al.，Clinical Chemistry48：91398-1405，2002)。
[0124] (iii)RNA表達(dá)譜的評(píng)估，例如通過陣列技術(shù)(array technology)(Alon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：96，6745-6750，6月1999)。
[0125] “微陣列”是在固體支持物表面上形成的，各自具有限定面積的，優(yōu)選離散區(qū)域的線性或者多維陣列。在微陣列上所述離散區(qū)域的密度由單個(gè)固相支持物表面上待檢測的目標(biāo)多核苷酸的總數(shù)量來確定。如本文所使用的，DNA微陣列是置于芯片或者其他表面上的寡核苷酸探針的陣列，以用于擴(kuò)增或克隆目標(biāo)多核苷酸。因?yàn)殛嚵兄忻總€(gè)探針特定組的位置是已知的，所以可以基于目標(biāo)多核苷酸結(jié)合微陣列中特定位置確定其身份。
[0126] DNA微陣列技術(shù)最近的發(fā)展使得其可能在單個(gè)固相支持物上操作多個(gè)目標(biāo)核酸分子的大尺度陣列。美國專利號(hào)5,837,832(Chee et al.)和相關(guān)的專利申請(qǐng)描述了固定寡核苷酸探針陣列以雜交并檢測樣品中的特定核酸序列。從感興趣的組織分離的感興趣的目標(biāo)多核苷酸向DNA芯片雜交，并基于目標(biāo)多核苷酸在離散探針位置雜交的優(yōu)先性和程度來檢測特定序列。陣列的一個(gè)重要用途是在差異化基因表達(dá)分析中，其中將不同細(xì)胞或組織(經(jīng)常是感興趣的組織和對(duì)照組織)中的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，并鑒定在各自組織間基因表達(dá)的任何差異。所述信息可用于在特定組織類型中基因表達(dá)類型的鑒定和基于表達(dá)譜進(jìn)行病癥的診斷。
[0127] 所述陣列可根據(jù)任何方便的方法學(xué)產(chǎn)生，如預(yù)成型多核苷酸微陣列元件，然后穩(wěn)定地將其與表面相關(guān)聯(lián)。作為替代地，寡核苷酸可以在表面上合成，其為本領(lǐng)域已知。許多不同的陣列構(gòu)造和其產(chǎn)生方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并在WO95/25116和WO95/35505(光版印刷技術(shù))、美國專利號(hào)5,445,934(通過光版印刷術(shù)原位合成)、美國專利號(hào)5,384,261(通過機(jī)械指引流程(mechanically directed flow path)原位合成)；和美國專利號(hào)5,700,637(通過點(diǎn)樣、印刷或偶聯(lián)合成)中公開；所述的公開全部通過參考并入本文。另一個(gè)偶聯(lián)DNA至珠的方法使用特異附著至DNA末端的配體以連接至附著珠的配體結(jié)合分子?？赡艿呐潴w結(jié)合伴侶對(duì)包括生物素-抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白，或者各種抗體/抗原對(duì)(如digoxygenin-抗digoxygenin抗體)(Smith et al.，Science258：
1122-1126(1992))。DNA的共價(jià)化學(xué)附著至支持物可通過使用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)劑完成，通過磷酰胺鍵將DNA上的5’磷酸鹽連接至包被的微球。很好地建立了固定寡核苷酸至固態(tài)基底的方法。參見Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)：5022-5026(1994)。附著寡核苷酸至固態(tài)基底的優(yōu)選方法由Guo等人描述(Guo et al.，Nucleic Acids Res.22：
5456-5465(1994))。固定可通過原位DNA合成(Maskos and Southern，Nuc.Acids Res.20：
1679-84，1992)或者通過化學(xué)合成的寡核苷酸的共價(jià)附著(Guo et al.，supra)與自動(dòng)陣列技術(shù)組合來完成。
[0128] 除了以生物芯片陣列為代表的固相技術(shù)，也可使用液相陣列來對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量。一個(gè)這樣的系統(tǒng)為動(dòng)力學(xué)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。動(dòng)力學(xué)PCR允許同時(shí)擴(kuò)增和定量特異性核酸序列。所述特異性來源于設(shè)計(jì)成優(yōu)先粘附包含目標(biāo)位點(diǎn)之單鏈核酸序列的合成寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物對(duì)在目標(biāo)序列的每條鏈上形成特異非共價(jià)結(jié)合復(fù)合體。這些復(fù)合體促進(jìn)雙鏈DNA在相反方向的體外轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)混合物的溫度循環(huán)產(chǎn)生了引物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和核酸至各個(gè)鏈重熔解的連續(xù)循環(huán)。結(jié)果是目標(biāo)dsDNA的指數(shù)增加。所述產(chǎn)物可以通過使用插入染料或者序列特異性探針來進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。SYBR(r)Green1是插入染料的實(shí)例，其優(yōu)先地結(jié)合dsDNA造成伴隨的熒光信號(hào)升高。序列特異性探針(如TaqMan技術(shù)所使用的)由熒光染料和共價(jià)結(jié)合寡核苷酸相反末端的淬滅分子(quenching molecule)組成。所述探針設(shè)計(jì)來選擇地結(jié)合兩個(gè)引物間的目標(biāo)DNA序列。當(dāng)在PCR反應(yīng)期間合成了DNA鏈，通過聚合酶的核酸外切酶活性從探針切割熒光染料，造成信號(hào)去淬滅。所述探針信號(hào)方法可以比插入染料方法更加特異，但是在各個(gè)情況下，信號(hào)強(qiáng)度與所產(chǎn)生的dsDNA產(chǎn)物成比例。每種類型的定量方法可以在多孔液相陣列中使用，所述陣列中的每個(gè)孔代表對(duì)于感興趣的核酸序列特異的引物和/或探針。當(dāng)與組織或者細(xì)胞系的信使RNA制備物一起使用時(shí)，探針/引物反應(yīng)的陣列可同時(shí)定量多個(gè)感興趣基因產(chǎn)物的表達(dá)。參見Germer et al.，Genome Res.10：258-266(2000)；Heid et al.，Genome Res.6：986-994(1996)。
[0129] (iv)通過例如免疫測定對(duì)細(xì)胞提取物中改變的蛋白14-3-3ζ水平的測量。
[0130] 在生物樣品中檢測蛋白質(zhì)瘤標(biāo)志物表達(dá)產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多合適方法中的任意一種進(jìn)行。合適方法的實(shí)例包括但不限于組織切片、活檢標(biāo)本或者體液樣品的抗體篩選。就使用基于抗體的診斷方法來說，以許多方式(如通過蛋白質(zhì)印跡、ELISA或流式細(xì)胞術(shù)過程)可確定蛋白質(zhì)的存在。當(dāng)然，所述方式包括單個(gè)位點(diǎn)和兩個(gè)位點(diǎn)或者非競爭類型的“夾心法”測定(sandwich assay)以及傳統(tǒng)的競爭性結(jié)合測定。所述測定還包括直接將帶標(biāo)簽的抗體結(jié)合至目標(biāo)。
[0131] 夾心法測定是有用和常用的測定。存在許多夾心法測定技術(shù)的變化，且本發(fā)明包括所有變化。簡要地，在典型的正向測定中，未加標(biāo)簽的抗體固定于固體基底上，且使待測樣品與結(jié)合分子接觸。在一段合適的孵育期后，所述時(shí)期的時(shí)間足以允許形成抗體-抗原復(fù)合體，然后加入對(duì)抗原特異、有能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)簽的第二抗體并孵育，允許充足的時(shí)間來形成另一個(gè)抗體-抗原-加標(biāo)簽抗體的復(fù)合體。洗掉任何未反應(yīng)的材料，通過觀察報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)確定抗原的存在。結(jié)果可以通過可見信號(hào)的簡單觀察是定性的，或者可以通過與對(duì)照樣品比較是定量的。正向測定的變化包括同時(shí)測定，其中同時(shí)添加樣品和加標(biāo)簽的抗體至結(jié)合抗體。所述技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，包括任何小的變化同樣容易明顯。
[0132] 在典型的正向夾心法測定中，具有對(duì)標(biāo)志物或者其抗原性部分特異性的第一抗體共價(jià)或者被動(dòng)結(jié)合至固體表面。所述固體表面通常為玻璃或者聚合物，最常使用的聚合物為纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以有管、珠、微板的盤或者任何其他適合于進(jìn)行免疫測定的表面的形式。結(jié)合過程在本領(lǐng)域是公知的，通常由交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成，聚合物-抗體復(fù)合體在制備試驗(yàn)樣品中洗滌。然后，添加要試驗(yàn)的樣品的等分試樣至固相復(fù)合體并在合適的條件下(例如25℃)孵育充足的時(shí)間段(例如2-40分鐘)，以允許抗體內(nèi)存在的任何亞基的結(jié)合。在所述孵育期后，洗滌抗體亞基固相并干燥，與對(duì)所述抗原的一部分特異的第二抗體孵育。所述第二抗體連接至用于指示第二抗體與抗原結(jié)合的報(bào)道分子。
[0133] 作為替代的方法包括在生物樣品中固定目標(biāo)分子，然后將固定的目標(biāo)暴露于特異性抗體，所述抗體可以或可以不帶有報(bào)道分子標(biāo)簽。依賴于目標(biāo)的量和報(bào)道分子信號(hào)的強(qiáng)度，可通過直接給抗體加標(biāo)簽來檢測結(jié)合的目標(biāo)。作為替代地，特異于第一抗體的帶標(biāo)簽第二抗體暴露于目標(biāo)-第一抗體復(fù)合體以形成目標(biāo)-第一抗體-第二抗體的三級(jí)復(fù)合體。所述復(fù)合體通過報(bào)道分子發(fā)出的信號(hào)檢測。
[0134] 本說明書中使用的“報(bào)道分子”，意指這樣的分子，其通過自身的化學(xué)性質(zhì)提供了允許檢測抗原結(jié)合抗體的分析性可鑒定信號(hào)。所述檢測可以是定性或定量的。在此類型的測定中最常使用的報(bào)道分子是酶、熒光團(tuán)或者含有放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。
[0135] 在酶免疫測定的情況下，酶通常通過戊二醛或者高碘酸鹽綴合到第二抗體。然而，因?yàn)闀?huì)容易的識(shí)別，存在多種不同的綴合技術(shù)，所述技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是容易得到的。普遍使用的酶包括辣根過氧化酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶，以及其他。與特異性酶一起使用的底物通常選擇用于產(chǎn)生、通過相應(yīng)酶水解、有可檢測的顏色變化。合適酶的實(shí)例包括堿性磷酸酶和過氧化酶。也可能使用熒光底物，其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而非上面提到的顯色底物。在所有情況下，添加酶標(biāo)簽的抗體至第一抗體半抗原復(fù)合體，使之結(jié)合，然后洗掉多余的試劑。然后添加含有合適底物的溶液至抗體-抗原-抗體復(fù)合體。所述底物將與連接到第二抗體的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可見信號(hào)，所述信號(hào)可進(jìn)一步定量(通常通過分光光度法)以產(chǎn)生在樣品中存在的抗原量的指示?！皥?bào)道分子”還擴(kuò)展至細(xì)胞黏著或者黏著之抑制(如乳膠珠(latex bead)上的紅細(xì)胞等等)的使用。
[0136] 作為替代地，熒光化合物(如熒光素和羅丹明)可以化學(xué)偶聯(lián)至抗體而不改變其結(jié)合能力。當(dāng)通過特定波長的光照射活化時(shí)，帶熒光染料標(biāo)簽的抗體吸收光能，引起分子中的激發(fā)態(tài)，其后發(fā)射用光學(xué)顯微鏡視覺上可檢測特定顏色的光。當(dāng)在EIA中時(shí)，允許所述帶熒光標(biāo)簽的抗體結(jié)合至第一抗體-半抗原復(fù)合體。在洗掉未結(jié)合的試劑后，然后將剩下的三級(jí)復(fù)合體暴露于合適波長的光，觀察到的熒光表明感興趣的半抗原的存在。免疫熒光和EIA技術(shù)都在本領(lǐng)域很好的建立，且對(duì)于本方法是特別優(yōu)選的。然而，也可以使用其他報(bào)道分子(如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子)。
[0137] (v)基于任何合適的功能性試驗(yàn)、酶促試驗(yàn)或者除了在上面的點(diǎn)(iv)中詳述的那些之外的免疫試驗(yàn)確定改變的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0138] (vi)就篩選蛋白14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成來說，可以使用多種方法，所述方法包括在固體支持物上固定一個(gè)或其他分子，然后將固定的目標(biāo)暴露于生物樣品并篩選復(fù)合體形成。所述篩選技術(shù)在上文中一般地描述。也可方便地利用免疫共沉淀技術(shù)。作為替代地，可使用biocore蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)(biocore protein interaction system)。
[0139] 如上文所詳述，技術(shù)人員應(yīng)理解設(shè)計(jì)檢測復(fù)合體形成的測定可能需要包含除了僅DISC1和蛋白14-3-3ζ外的分子，因?yàn)镹edl1和LIS1也涉及功能性復(fù)合體的形成。所述測定的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知。
[0140] 在這些類型篩選方法的情形下，應(yīng)了解所述方法的益處為不一定需要知道可能存在于蛋白14-3-3ζ分子或DISC1分子之一或二者中缺陷的性質(zhì)。而是，因?yàn)閮H僅是篩選復(fù)合體形成的發(fā)生或者免疫共沉淀與否，所以缺陷的特征變得不相關(guān)。
[0141] 本發(fā)明相關(guān)的一個(gè)方面提供其中已經(jīng)敲除了蛋白14-3-3ζ基因表達(dá)的非人哺乳動(dòng)物。所述動(dòng)物的開發(fā)促進(jìn)了篩選和分析可調(diào)控神經(jīng)精神病癥發(fā)作和進(jìn)程(如精神分裂癥表型)之治療性和/或預(yù)防性有效蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子。所述開發(fā)現(xiàn)提供了尤其對(duì)于研究蛋白14-3-3ζ涉及精神分裂癥發(fā)作和理性地設(shè)計(jì)預(yù)防和/或治療處理方案之功能性作用極其有價(jià)值的裝置/手段。
[0142] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在功能性蛋白14-3-3ζ中有缺陷的非人哺乳動(dòng)物，其中編碼蛋白14-3-3ζ的基因已經(jīng)缺失。
[0143] 術(shù)語“表型”應(yīng)理解為指代通過生物體基因型與其存在的環(huán)境相互作用確定的動(dòng)物的功能性和結(jié)構(gòu)性特性的全體，或者任何特別特性或者特性集合。在本發(fā)明的情形下，對(duì)象表型為精神分裂癥的發(fā)作、傾向于精神分裂癥發(fā)作或者與精神分裂癥相關(guān)的一種或更多種癥狀的發(fā)作/傾向于發(fā)作。本文提到的表型為“精神分裂癥表型”。
[0144] 優(yōu)選地，所述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。
[0145] 應(yīng)了解本發(fā)明還提供包括上述14-3-3ζ敲除的細(xì)胞和細(xì)胞系。所述細(xì)胞/細(xì)胞系可來源于任何合適的來源或者可通過任何合適的手段產(chǎn)生。
[0146] 現(xiàn)在，本發(fā)明哺乳動(dòng)物(本文提到的“14-3-3ζ敲除”)的開發(fā)促進(jìn)了廣泛的非常有用的應(yīng)用，包括但不限于鑒定模擬蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成或者以其他方式改善所述哺乳動(dòng)物精神分裂癥表型癥狀之物質(zhì)的篩選方法。
[0147] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及篩選模擬蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1復(fù)合體形成或者以其他方式改善精神分裂癥表型癥狀之物質(zhì)的方法，所述方法包括向14-3-3ζ敲除之非人動(dòng)物施用推定的調(diào)節(jié)性物質(zhì)和針對(duì)改變的表型進(jìn)行篩選。
[0148] 提到“物質(zhì)”應(yīng)理解為來源于天然、重組或者合成來源的任何蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子，所述來源包括融合蛋白質(zhì)或下列的例如天然產(chǎn)物篩選和達(dá)到本發(fā)明目的的來源。所述物質(zhì)的合成來源包括例如化學(xué)合成的分子。在其他實(shí)例中，可以針對(duì)肽篩選噬菌體展示文庫，而可以針對(duì)現(xiàn)有小分子篩選化學(xué)文庫。
[0149] 例如，可以篩選多樣性文庫(如隨機(jī)組合肽或者非肽文庫)?？梢允褂迷S多公開或者商業(yè)可用的文庫，如化學(xué)合成文庫、重組(例如噬菌體展示文庫)和基于體外翻譯的文庫。
[0150] 化學(xué)合成文庫的實(shí)例在Fodor et al.PNAS USA91：11422-26(1991)；Houghten et al.Nature354：84-88(1991)；Lam et al.Nature354：82-84(1991)；Medynski，Bio/Technology12：709-710(1994)；Gallop et al.J.Medicinal Chemistry37(9)：1233-1251(1994)；Ohlmeyer etal.PNAS USA91：9022-9026(1993)；Erb etal.PNAS USA91：
11422-26(1994)；Houghten et al.Biotechniques13(3)：412-421(1992)；Jayawickreme et al.PNAS USA91：1614-1618(1994)；Salmon et al.PNAS USA90：11708-11712(1993)；國際專利公開號(hào)WO93/20242；和Brenner and Lerner，PNAS USA89：5381-3(1992)中描述。
[0151] 噬菌體展示文庫的實(shí)例由Scott and Smith，Science249：386-390(1990)；Devlin et al.Science249：404-406(1990)；Christian et al.J.Mol.Biol.227：711-718(1992)；Lenstra，J.Immun.Methods152：149-157(1992)；Kay et al.Gene128：59-65(1993)和國際專利公開號(hào)WO94/18318描述。
[0152] 基于體外翻譯的文庫包括但不限于在Mattheakis et al.PNAS USA91：9022-9026(1994)中描述的。
[0153] 不以任何方式限制本發(fā)明，試驗(yàn)的化合物可以為大分子(如生物聚合物)，包括多肽、多糖和核酸?？捎米鳚撛谥委焺┑幕衔锟梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生，例如生產(chǎn)多種化合物(包括化學(xué)或者生物分子如簡單或復(fù)雜有機(jī)分子、含金屬化合物、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)、肽模擬物(peptidomimetic)、糖蛋白、脂蛋白、核酸、抗體等等)的公知方法在本領(lǐng)域公知并在例如Huse，美國專利號(hào)5,264,563；Francis et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：422-428(1998)；Tietze etal.，Curr.Biol.，2：363-381(1998)；So?a，Molecule.Divers.，3：75-94(1998)；Eichler et al.，Med.Res.Rev.15：481-496(1995) 等等中描述。也可從商業(yè)來源獲得含有大量天然和合成化合物的文庫。分子的組合文庫可以使用公知的組合化學(xué)方法制備(Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1233-1251(1994)；Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1385-1401(1994)；Gordon et al.，Acc.Chem.Res.29：
144-154(1996)；Wilson and Czarnik，eds.，Combinatorial Chemistry：Synthesis andApplication，John Wiley&Sons，New York(1997))。
[0154] 提到檢測“表達(dá)改變的表型”應(yīng)理解為檢測與14-3-3ζ功能調(diào)控相關(guān)之任何形式的變化。這些可以是可檢測的，例如，作為細(xì)胞內(nèi)變化、細(xì)胞外觀察到的變化(例如，檢測下游產(chǎn)物水平或活性的變化)或者在非人哺乳動(dòng)物對(duì)象之表型/病癥中的變化。例如，接下來向本發(fā)明的14-3-3ζ敲除小鼠施用所述物質(zhì)，可以進(jìn)行如實(shí)施例1描述的一種或者更多種行為測定，如：
[0155] (i)運(yùn)動(dòng)功能測試(locomotor function test)；
[0156] (ii)物體識(shí)別測試(object recognition test)；
[0157] (iii)高架十字桿測試(elevated cross bar test)；
[0158] (iv)逃脫水迷宮測試(escape water maze test)；或者
[0159] (v)PPI測試。
[0160] 如果需要進(jìn)行更詳細(xì)的分子試驗(yàn)來驗(yàn)證或另外進(jìn)一步研究在行為水平觀察到的表型變化，那么然后可以從對(duì)象敲除動(dòng)物收獲細(xì)胞或者組織以使得在細(xì)胞或者分子水平能夠進(jìn)行更詳細(xì)的分析。作為替代地，可以試驗(yàn)產(chǎn)生自所述動(dòng)物的細(xì)胞系。
[0161] 應(yīng)理解本方面的這些方面不僅提供篩選新型物質(zhì)的手段，所述新型物質(zhì)調(diào)控展現(xiàn)受損的14-3-3ζ功能之個(gè)體的精神分裂癥表型，而且提供評(píng)估在所述患者組情形下現(xiàn)有治療方案之益處/副作用的方法。
[0162] 本發(fā)明通過參考下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述。
[0163] 實(shí)施例1
[0164] 材料和方法
[0165] 小鼠。攜帶含有Geo報(bào)道基因之基因陷阱構(gòu)建體的14-3-3ζGt(OST062)Lex和Gt(OST390)Lex14-3-3ζ 突變體小鼠分別來源于Lexicon Genetics ES細(xì)胞系OST062和
Gt(OST062)Lex
OST390。在14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱載體插入14-3-3ζ的第一內(nèi)含子，而
Gt(OST390)Lex
14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱載體插入14-3-3ζ的第二內(nèi)含子。擴(kuò)增ES細(xì)胞系并將其注射入SV129胚泡。產(chǎn)生的生殖系傳遞雄性(germ line transmitting male)在SV129背景中維持或者經(jīng)6代回交至C57/B16和BA1.BC背景。使用全組織樣品的qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡來確認(rèn)所述小鼠品系中基因的完全敲除(KO)。使用附表1詳述的引物通過基因組Gt(OST062)Lex
尾DNA的PCR擴(kuò)增確定14-3-3C基因型。WT等位基因擴(kuò)增288bp(14-3-3ζ )或者Gt(OST390)Lex Gt(OST062)
445bp(14-3-3ζ )的帶，而突變體基因陷阱等位基因擴(kuò)增165bp(14-3-3ζ
Lex Gt(OST390)Lex
)或者203bp(14-3-3ζ )的帶。小鼠以對(duì)WT同窩幼畜表型不能區(qū)別的雜合育種對(duì)(breeding pairs)形式維持。根據(jù)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)科學(xué)研究所(Institute of Medical and Veterinary Sciences)以及阿德萊德大學(xué)(University of Adelaide)的動(dòng)物倫理委員會(huì)(Animal Ethics Committee)的指南進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
[0166] 行為測定。所有的過程在8.00am至12.00pm的正常光條件下進(jìn)行。行為 表 型 分 析 如 之 前 描 述 的 進(jìn) 行 (Coyle et al.Behav Brain Res2009，197(1)：210-218；Summers et al.Pediatr Res2006；59(1)：66-71；van denBuuse et al.Int J Neuropsychopharmacol2009；12(10)：1383-1393)。使用5、10、20和40周齡時(shí)間點(diǎn)的一群小鼠進(jìn)行曠場試驗(yàn)。使用12周齡的一群小鼠進(jìn)行空間工作記憶(spatial working memory)，然后進(jìn)行高架十字迷宮和物體識(shí)別任務(wù)。使用12周齡的另一群不同小鼠進(jìn)行PPI。
[0167] 運(yùn)動(dòng)功能測試。在曠場中測量小鼠的探索行為和焦慮水平，所述曠場由一個(gè)將基底分為15個(gè)方格(square)(9cm x10cm)的盒子(50cm x27cm)制成。將每只小鼠引入到盒子面向右側(cè)頂角的相同位置。觀察小鼠行為3分鐘，以越線(line crossing)度量(即，當(dāng)小鼠將所有4個(gè)爪子從一個(gè)方格移入另一個(gè)時(shí))的形式對(duì)運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行打分。當(dāng)小鼠將兩只前爪均離開基底時(shí)，對(duì)暴跳(rear up)的數(shù)量打分。在測試段(session)之間移除尿和糞便材料并用80％乙醇徹底清潔盒子以除去任何留存的氣味。
[0168] 物體識(shí)別測試。物體識(shí)別任務(wù)利用了新事物對(duì)小鼠的天然吸引力；識(shí)別出之前見過(熟悉)物體的小鼠將花費(fèi)更長時(shí)間探索新物體(Dere et al.Neurosci Biobehav Rev2006；30(8)：1206-1224；Sik etal.Behav Brain Res2003；147(1-2)：49-54)。簡要地，裝置由填充墊料的塑料場地組成(長；50cm，寬；35cm，深；20cm)。使用兩組不同的物體；帶黃蓋的塑料罐(高，6cm；底部直徑，4.3cm)和紅色塑料球(bulb)(長：8cm，寬：4cm)。當(dāng)所述物體兩者都提供時(shí)，小鼠花費(fèi)相等量的時(shí)間，不管它們處于場地中的什么位置(未顯示數(shù)據(jù))。評(píng)估用于空間學(xué)習(xí)和記憶測試的12周齡同群小鼠的物體識(shí)別記憶。在沒有任何物體提供的情況下給每只小鼠5分鐘來探索所述測試盒以使所述小鼠適應(yīng)測試場地。小鼠進(jìn)行包含兩個(gè)嘗試(trial)的測試段。每個(gè)嘗試持續(xù)3分鐘。在第一嘗試期間(樣品階段)，盒子含有兩個(gè)同樣的放置于盒子西北(左)和東北(右)角(離墻5cm遠(yuǎn))的物體(a，樣品)。總是將小鼠面向南邊墻壁放置于裝置中。在第一探索期后，將小鼠放回其住籠(homecage)。在15分鐘保持間隔后，將所述小鼠放置于裝置中進(jìn)行第二嘗試(選擇階段)，但是現(xiàn)在有一個(gè)熟悉的物體(a，樣品)和一個(gè)新物體(b)。用乙醇在測試段間徹底清潔物體以去除任何存留的氣味。記錄在嘗試1和嘗試2期間探索每個(gè)物體花費(fèi)的時(shí)間。探索定義為用鼻子觸碰物體或者在物體2cm內(nèi)。在物體識(shí)別任務(wù)中基礎(chǔ)的度量是在嘗試1和嘗試2期間探索物體花費(fèi)的時(shí)間。在所述測試期間測量許多變量：e1(a+a)和e2(a+b)分別為嘗試1和嘗試2期間兩個(gè)物體總探索時(shí)間的度量。h1是通過由嘗試1至嘗試2總探索時(shí)間的差異(e1-e2)測量的適應(yīng)指數(shù)。認(rèn)為d1(b-a)和d2(d1/e2)是新的和熟悉物體間辨別(discrimination)的指數(shù)度量。因此，d2為校正對(duì)探索行為(e2)d1辨別的相對(duì)度量。0以上的辨別指數(shù)描述了相比熟悉物體對(duì)新物體更多的探索。對(duì)于任一物體沒有偏好的動(dòng)物將具有近于0的指數(shù)。將嘗試期間在樣品或者選擇階段少于7s總探索時(shí)間的小鼠從分析中排除，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)探索時(shí)間的度量在所述閾值之下不可靠(van den Buuse et al.supra；de Bruin et al.Pharmacol Biochem Behav2006；85(1)：253-260)。
[0169] 高架十字桿測試。使用之前描述的高架十字迷宮評(píng)估基于小鼠對(duì)空曠和高架區(qū)之天然厭惡的焦慮行為(Komada et al.J Vis Exp2008；(22)；Walf et al.NatProtoc2007；2(2)：322-328)。簡要地，裝置以十字的形狀由黑樹脂玻璃制成，并由兩條開放臂(25cm x5cm)和兩條封閉臂(25cmx5cm x16cm)組成，所述臂在互相垂直的中間交叉。臂的中間有中央平臺(tái)(5cm x5cm)。所述迷宮從地面升起1m。將個(gè)體小鼠面向開放臂在實(shí)驗(yàn)者對(duì)面引入所述裝置中央，并用錄像觀察記錄5分鐘。對(duì)在探索兩種類型臂中進(jìn)入開放和封閉臂的次數(shù)打分。測量小鼠的天然行為(如探頭(head dipping)次數(shù)、站起(rear)次數(shù)和伸展姿勢(stretch attended posture)的次數(shù))。在每個(gè)嘗試后，用乙醇徹底清潔所有的臂和中央?yún)^(qū)域以除去任何存留的氣味。
[0170] 逃脫水迷宮測試。使用之前描述的十字迷宮逃脫任務(wù)評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶(Coyle et al.2009，supra)。用透明塑料制成十字迷宮(長，72cm；臂維度，長26cm x寬20cm)，且放置于維持在23℃的圓形水池中(1m直徑)。將奶粉混入水中以隱藏淹沒的(水面下0.5cm)位于迷宮北側(cè)臂遠(yuǎn)端的逃脫平臺(tái)。所述池通過黑色塑料壁圍起來(高，90cm)。在迷宮的每條臂上且通過在訓(xùn)練和測試過程期間總是站在南端的實(shí)驗(yàn)者安排了持續(xù)的空間提示。通過將12周大的小鼠放置于沒有逃脫平臺(tái)的水池中并允許其游60s以單獨(dú)適應(yīng)迷宮環(huán)境。在6天的訓(xùn)練期進(jìn)行學(xué)習(xí)嘗試，其中要求小鼠從其他三個(gè)(東、南、西)不含有逃脫平臺(tái)的臂中學(xué)習(xí)到淹沒的逃脫平臺(tái)的位置。給每只小鼠6天每天嘗試(通過30分鐘休息間隔分開的兩塊的3個(gè)嘗試)，其中選擇三條臂中的每一條以隨機(jī)方式作為開始點(diǎn)(每天2次)。對(duì)于每一個(gè)嘗試，將小鼠面向壁放置在臂的遠(yuǎn)端，并允許60s到達(dá)逃脫平臺(tái)，小鼠在那里保持
10s。將沒有在給定時(shí)間爬上逃脫平臺(tái)的小鼠放置于平臺(tái)上10s。然后將所述小鼠放于籠子
10s，繼續(xù)接下來的嘗試。評(píng)估小鼠逃脫平臺(tái)地點(diǎn)的長期保持力，所述地點(diǎn)在學(xué)習(xí)階段期間位于相同的位置。在學(xué)習(xí)的最終日后，測試記憶14(M1)和28(M2)天，且所述天由如學(xué)習(xí)期描述之6個(gè)嘗試的單日組成。記錄每只小鼠每個(gè)嘗試中其逃脫潛伏期(latency)(即，游至平臺(tái)花費(fèi)的時(shí)間)、正確嘗試次數(shù)(即，如果小鼠找到了在第一臂入口的平臺(tái))和不正確進(jìn)入/再進(jìn)入次數(shù)(即，小鼠進(jìn)入不含逃脫平臺(tái)臂的次數(shù))的數(shù)據(jù)。
[0171] PPI測試。使用如之前所述的8單元自動(dòng)系統(tǒng)(SR-LAB，San Diego Instruments，USA)評(píng)估驚嚇、驚嚇適應(yīng)和驚嚇的PPI(van den Buuse et al.2009supra)。簡要地，將小鼠放置于透性樹脂玻璃筒中，所述筒的每一面都是封閉的，且通過盒天花板的揚(yáng)聲器遞送超70-dB背景噪音的聲音刺激。每個(gè)測試段由平均嘗試間間隔25s的104個(gè)嘗試組成。最初和最后的8個(gè)嘗試僅由單個(gè)40-ms、115dB脈沖驚嚇刺激組成。中間的88個(gè)嘗試由偽隨機(jī)遞送的16個(gè)僅有115dB脈沖刺激，期間遞送的8個(gè)無刺激嘗試和64個(gè)前脈沖嘗試組成。
僅有115-dB脈沖的總共32個(gè)嘗試表現(xiàn)為四塊的8個(gè)，并用來確定驚嚇適應(yīng)。前脈沖嘗試由單個(gè)115-dB脈沖組成，所述脈沖通過30ms或者100ms的刺激間時(shí)間間隔(ISI)與20ms在70-dB基準(zhǔn)線上2、4、8或16bB的非驚嚇刺激先導(dǎo)(precede)。通過附在平臺(tái)下的壓電式加速計(jì)單元(piezo-electric accelerometer unit)將全體驚嚇反應(yīng)(wholy-body startle response)轉(zhuǎn)化為定量值。前脈沖抑制百分比(％PPI)計(jì)算為單脈沖驚嚇反應(yīng)-前脈沖+脈沖驚嚇反應(yīng)/單脈沖驚嚇反應(yīng)x100。
[0172] 統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算以平均±SEM呈現(xiàn)，并使用SAS9.2版(SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA)進(jìn)行。對(duì)于曠場數(shù)據(jù)，使用線性混合效應(yīng)模型比較WT和突變組間隨時(shí)間的越線次數(shù)。隨機(jī)小鼠效應(yīng)包含于所述模型中以說明在對(duì)同一只小鼠重復(fù)觀察中的依賴性。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)在WT和突變體之間比較來自高架十字桿的數(shù)據(jù)。對(duì)于水十字迷宮測試，使用Cox比例危害模型(Cox proportional hazards model)比較兩個(gè)處理組間隨時(shí)間變化的逃脫潛伏期。在所述模型中使用穩(wěn)健方差估計(jì)(robust variance estimation)以調(diào)節(jié)由于對(duì)同一只小鼠重復(fù)測量造成的依賴性。在模型組(WT或KO)中，時(shí)間(1至6天)以及組和時(shí)間間相互作用作為預(yù)測變量進(jìn)入。當(dāng)小鼠未找到出口時(shí)，認(rèn)為逃脫潛伏期在30秒正確的檢查。在我們的研究中，有太多在30秒檢查到逃脫潛伏期的動(dòng)物能夠以正常分布處理結(jié)果。因此，使用線性混合效應(yīng)模型是不可行的。使用負(fù)二項(xiàng)式回歸模型在WT和突變體組之間隨時(shí)間比較不正確的進(jìn)入。在模型組(WT或KO)中，時(shí)間(1至6天)以及組和時(shí)間間相互作用作為預(yù)測變量進(jìn)入。使用廣義估計(jì)方程說明由于對(duì)同一只小鼠重復(fù)測量造成的依賴性。使用雙因素方法分析(ANOVA)將PPI測試的數(shù)據(jù)與重復(fù)測量比較(Systat，第9.0版，SPSS軟件；SPSS Inc.，US)。對(duì)于此分析，組間因素為基因型，而組內(nèi)，重復(fù)的測量因素為前脈沖強(qiáng)度和驚嚇塊(startle block)。在所有研究中，認(rèn)為<0.05的p值是統(tǒng)計(jì)上顯著的。
[0173] 免疫組織化學(xué)。于室溫(RT)下在10％非免疫馬血清的PBST(0.1MPBS，0.3％Triton X-100，1％BSA)中封閉切片1h，接下來與初級(jí)抗體在室溫下孵育過夜。初級(jí)抗體和稀釋：針對(duì)14-3-3ζ的兔多克隆(1：200)(Guthridge et al.Blood2004；103(3)：820-827)、針對(duì)0-微管蛋白的兔多克隆(1：250，Sigma)、針對(duì)鈣結(jié)合蛋白-D28K的兔多克隆(1：1000，Chemicon)、針對(duì)NeuN的小鼠單克隆(1：500，Chemicon)、針對(duì)突觸泡蛋白的兔多克隆(1：100，Cell Signaling)。第二天，切片與次級(jí)抗體在室溫下孵育1h。在0.1M PBS洗滌3次后，切片用具有DAPI的 Gold抗衰減試劑封片(Molecular Probes)。
[0174] BrdU脈沖追逐分析和TUNEL加標(biāo)簽。在14.5dpc或者16.5dpc向懷孕的小鼠以每g體重100μg注射BrdU，且對(duì)幼畜在出生后第7天進(jìn)行安樂死。通過在冷凍腦切片上的BrdU免疫組織化學(xué)揭示在所述時(shí)間點(diǎn)生成的增殖海馬神經(jīng)元的最終目的地。用2M HCl在37℃下變性組織20分鐘，在0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)中中和10分鐘，用有
10％馬血清的PBST阻斷并在4℃下與大鼠單克隆抗BrdU(1：250；Abcam)和小鼠單克隆抗NeuN(1：500；Chemicon)抗體以探針探測過夜。使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)(TMR Red；Roche Applied Science)根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書在用DAPI(Molecular Probes)對(duì)比染色后通過TUNEL測定確定細(xì)胞凋亡。
[0175] 免疫沉淀。所有的蛋白質(zhì)提取物通過NP40裂解緩沖液中的裂解制備，所述緩沖液由150mM NaCL、10mM Tris-HCL(pH7.4)、10％甘油、1％乙基苯基聚乙二醇(NP40)以及蛋白酶和磷酸酶抑制劑(每ml10mg牛胰蛋白酶抑制劑、每ml10mg抑蛋白酶醛肽、2mM苯甲基磺酰氟和2mM釩酸鈉)構(gòu)成。樣品在4C下裂解60分鐘，然后在10,000g下離心15分鐘。上清液在4℃下與小鼠Ig-偶聯(lián)的瓊脂糖(Sepharose)珠預(yù)清除30分鐘。預(yù)清除的裂解物在4C下與2μg/ml吸收至蛋白A-瓊脂糖(Amersham Biosciences)的抗DISC1抗體(C末端)(Invitrogen)或者抗14-3-3抗體(3F7Abcam)孵育2h。在于SDS-PAGE樣品緩沖液中蒸煮5分鐘前，用裂解緩沖液洗滌瓊脂糖珠3次。通過SDS-PAGE將免疫沉淀的蛋白質(zhì)和裂解物分離，并電泳轉(zhuǎn)移至消化纖維膜通過免疫印跡分析。
[0176] 免疫印跡。膜與抗14-3-3ζEBI pAb以1：1000(Guthridge et al.2004supra)或者抗DISC1(C末端)(Invitrogen)以1μg/ml進(jìn)行探針探測。對(duì)于來自腦組織14-3-3ζ的分析，使用兔抗3-肌動(dòng)蛋白(1：5000，Millipore)多克隆作為加樣對(duì)照。用HRP綴合的次級(jí)抗體檢測結(jié)合抗體(1：20,000，Pierce-Thermo Scienti?c)。免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)可通過ECL可視化(發(fā)光圖像分析儀Luminescent Image Analyzer LAS-4000，F(xiàn)uj i?lm，Japan)。使用Multi Gauge3.0版分析圖像(Fuji?lm，Japan)。
[0177] 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。如(Kaech et al.Nat Protoc2006，1(5)：2406-2415)所述制備P7海馬神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)共培養(yǎng)物。37℃下，使用100μg/ml的多L-溶素/PLL(Sigma)在硼酸鹽緩沖液中過夜包被硝酸處理的蓋玻片(直徑13mm)，然后用無菌水洗滌3×1h。在Hank's5
平衡鹽溶液(HBSS)中解剖和分離齒狀回和CA樣品，并將神經(jīng)元以每個(gè)培養(yǎng)皿1×10 個(gè)細(xì)胞的密度涂布(用4-PPL包被的蓋玻片)。培養(yǎng)物在體外孵育7天和14天進(jìn)行神經(jīng)突長出測定。細(xì)胞在4％PFA中固定1h，在室溫(RT)下于10％非免疫馬血清的PBST(0.1M PBS，0.1％Triton X-100，1％BSA)中預(yù)孵育1h，并在4℃下與針對(duì)小鼠單克隆MAP2(1：200，Millipore)和14-3-3ζ(1：1000)的初級(jí)抗體孵育過夜。然后，蓋玻片與相應(yīng)的次級(jí)抗體在室溫下孵育1h。用抗衰減DAPI(Molecular Probes)對(duì)蓋玻片封片。
[0178] 結(jié)果
[0179] 14-3-3ζ突變體小鼠顯示行為和認(rèn)知缺陷
[0180] 14-3-3蛋白在發(fā)育中的和成體腦中大量的表達(dá)(Berg et al.Nat Rev Neurosci2003；4(9)：752-762；Baxter et al.Neuroscience2002；109(1)：5-14)。 為 了確定14-3-3ζ在神經(jīng)發(fā)育和腦功能中的作用，產(chǎn)生兩個(gè)敲除小鼠品系，所述品系從在內(nèi)含子1或2中含有的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因陷阱插入物的胚胎干細(xì)胞克隆形成(圖8；Lexicon Gt(OST390)LexGenetics)，其分別稱為14-3-3和14-3-3ζ 。對(duì)來自雜合雜交(heterozygous intercross)的胚胎和成體腦組織的定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)基因陷阱載體破
062+/-
壞了基因轉(zhuǎn)錄并造成無效等位基因(圖9)。這些突變體品系稱為14-3-3ζ 和
390+/-
14-3-3ζ 。不同于其他14-3-3同工型的缺陷(Su et al.Proc Natl Acad Sci U SA2011；
108(4)：1555-1560)，表達(dá)分析進(jìn)一步確定了14-3-3C的移除沒有被突變體小鼠中其他
14-3-3家族成員表達(dá)的增加所補(bǔ)償(圖10)。來自兩個(gè)品系14-3-3ζ雜合小鼠的互交導(dǎo)致預(yù)計(jì)的孟德爾式比例的純合突變體(WT23％，Het56％，Mut21％；n＝494，p<0.001)，表明基因的移除不是胚胎致死的。突變體胚胎和新生小鼠的初步檢查表明發(fā)育正常進(jìn)行，因?yàn)閺钠渫C幼畜形態(tài)上不能區(qū)別。然而，通過來自兩個(gè)品系的P14突變體小鼠，顯示了生長遲緩而通過P21大約20％的突變體小鼠已死亡(WT29％，Het54％，Mut17％；n＝1619)。
剩余的突變體小鼠小與WT同窩幼畜，但是具有相似的壽命期望(P100；WT24.55±1.7g，Mut19.73g±2.5g)。突變體小鼠顯示表面上的正常和健康，在嗅覺測試、視覺測試和電線懸掛測試(wire-hang test)中沒有差異。
[0181] 為了確定的分析14-3-3ζ與神經(jīng)障礙和腦功能的關(guān)聯(lián)，完成了一系列對(duì)突變體062-/-
和對(duì)照小鼠的行為測試。首先評(píng)價(jià)14-3-3ζ 小鼠對(duì)曠場環(huán)境的反應(yīng)。突變體顯示了在整個(gè)測試期行進(jìn)距離(distance travelled)的顯著增加，所述增加在所有測試年齡(5、10、
20和30周)保持，表明突變體小鼠極度活躍(圖1A)。所述效應(yīng)在雄性和雌性二者中相似沒有性別偏差(p>0.05)。
[0182] 利用小鼠天然地對(duì)新物體而非熟悉物體的探索偏好以測試識(shí)別記憶。中葉(medial lobe)中鼻周皮層的正確功能對(duì)于所述任務(wù)是關(guān)鍵的(Dere et al.2006supra；Sik et al.2003supra；Forwood et al.Hippocampus2005；15(3)：347-355；Winters et al.J Neurosci2005；25(17)：4243-4251)。在樣品階段，小鼠花費(fèi)同樣的時(shí)間探索每個(gè)
062+/+ 062-/-
相同的物體(14-3-3ζ ，50.82±1.2％；14-3-3ζ 49.18+1.2％)。當(dāng)呈現(xiàn)熟悉
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的和新物體時(shí)，與對(duì)照相比，在整個(gè)測試期14-3-3ζ 小鼠展現(xiàn)出顯著受損的新事物
062-/-
識(shí)別。與在熟悉和新物體間偏好的缺乏相一致，14-3-3ζ 小鼠具有減少的辨別指數(shù)(探索新物體時(shí)間-探索熟悉物體時(shí)間/探索新物體時(shí)間+探索熟悉物體時(shí)間)，表明
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其沒能保留新信息(14-3-3ζ ，0.1667±0.086s；14-3-3ζ ，-0.0569±0.047s；
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p<0.05)。再一次，在測試的任一階段無性別差異(p>0.5)。尤其，14-3-3ζ 突變體還證明了在嘗試的兩個(gè)階段中都有更長探索時(shí)間之物體識(shí)別測試中的極度活躍(樣
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品階 段，14-3-3ζ ，27.33±2.7s；14-3-3ζ ，38.62±4.1s；p<0.05：測 試 階 段，
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14-3-3ζ ，24.58±3.1s；14-3-3ζ ，50.77±4.7s；p<0.0001)。
[0183] 廣泛使用高架十字迷宮來測試嚙齒類的焦慮行為(Komada et al.2008supra；Walf et al.2007supra；Lister RG，Psych oph armacology(Berl)1987；92(2)：180-185)。
062-/-
當(dāng)放置于所述測試中時(shí)，14-3-3ζ 小鼠還證明了相比野生型對(duì)照增加的活動(dòng)。
062-/-
14-3-3ζ 小鼠在5分鐘的測試期中于交叉臂間有25.23±1.76的轉(zhuǎn)移(transition)，
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而14-3-3ζ 有12.29±1.21(p<0.0001)。此外，相比14-3-3ζ 小鼠(31.4±6.0s，
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p<0.0001)，14-3-3ζ 小鼠顯著地花費(fèi)更多時(shí)間在開放臂中(圖1B：114.8±11.5s)，更
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經(jīng)常的進(jìn)入其中(14-3-3ζ ，4.6±0，6；14-3-3ζ ，15.5±1.7，p<0.0001)并更多的
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探頭(14-3-3ζ 19.6±1.5；14-3-3ζ ，33.4±2.4p＝0.0041)，表明其具有更低水平的焦慮。
[0184] 使用十字迷宮逃脫任務(wù)檢驗(yàn)空間工作記憶依賴性學(xué)習(xí)(Summers etal.2006supra)。海馬和前額皮質(zhì)間合適的信號(hào)發(fā)出是所述任務(wù)獲得的先決條件。訓(xùn)練小鼠6天以識(shí)別十字迷宮含有淹沒之逃脫平臺(tái)的正確臂。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過新的可視提示
062-/-
表示十字迷宮的每個(gè)臂。雖然一些14-3-3ζ 小鼠學(xué)會(huì)識(shí)別正確臂，但是其顯示出在整
2
個(gè)獲得期的過程中到達(dá)平臺(tái)潛伏期的增加(圖11；χ(5)＝29.8808；p<0.0001)以及臂選擇準(zhǔn)確性顯著的降低(圖1C：IRR＝0.52；p<0.0001)。然后通過在獲得后測試所述小鼠
14天或者28天，隨后在逃脫平臺(tái)水迷宮中再測試其記憶正確交叉臂的能力(分別為M1和
062+/+
M2)。與學(xué)習(xí)階段相比，14-3-3ζ 小鼠沒有顯示出逃脫潛伏期的變化(HR＝1.18，p＝
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0.383)，而14-3-3ζ 證明了逃脫潛伏期顯著的增加(HR＝2.98，p<0.0001)。與海馬依賴性記憶的功能紊亂相一致，突變體小鼠還在臂選擇的準(zhǔn)確性上有顯著的降低(圖1C：IRR＝0.231；p<0.0001)。所有的識(shí)別缺陷不依賴于性別。
[0185] 感覺運(yùn)動(dòng)門控中的缺陷為神經(jīng)精神病(如精神分裂癥和相關(guān)病癥)的內(nèi)表型。在海馬和其他腦區(qū)域的合適信號(hào)發(fā)出對(duì)于此過濾機(jī)制(?ltering mechanism)是必不可少的。為了確定14-3-3ζ突變體小鼠是否具有異常的感覺運(yùn)動(dòng)門控，評(píng)估聲音驚嚇反射的前脈
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沖抑制(PPI)。發(fā)現(xiàn)相比于14-3-3ζ 小鼠，14-3-3ζ 小鼠具有顯著較低的PPI(圖
1D：基因型的主要效應(yīng)F(1，20)＝5.89，p＝0.025)和驚嚇(圖12：F(1，20)＝5.87，p＝
0.023)。前脈沖強(qiáng)度水平的增加引起在WT和突變體小鼠中PPI相似的增加(圖1D)?？偟膩碚f，在突變體小鼠中驚嚇幅度減少了而驚嚇適應(yīng)正常(圖12)。
[0186] 14-3-3ζ在海馬神經(jīng)元中表達(dá)以控制分層
[0187] 為了確定認(rèn)知和行為缺陷是否起因于海馬的神經(jīng)發(fā)育缺陷，分析14-3-3ζ在神經(jīng)元發(fā)育中的作用。海馬神經(jīng)元來源于沿著腦室區(qū)(NEv)神經(jīng)上皮和鄰近傘部(NEf)神經(jīng)上皮的限制區(qū)(Nakahira et al.J Comp Neurol2005；483(3)：329-340)(圖2A)。在14.5dpc，在中間區(qū)遷移海馬神經(jīng)元中檢測到14-3-3ζ免疫染色，而并不在其神經(jīng)上皮前體中(圖2Bi)。至P0，還在海馬本部/海馬角(CA)的錐體細(xì)胞中檢測到14-3-3ζ免疫染色(圖
2Biii)。利用14-3-3ζ小鼠品系之基因陷阱載體中的β-geo轉(zhuǎn)基因，用B半乳糖苷酶染色監(jiān)測14-3-3ζ內(nèi)源表達(dá)。與免疫染色一致，鑒定到在遷移CA神經(jīng)元中14-3-3ζ的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。此外，檢測到在CA和DG神經(jīng)元中的表達(dá)進(jìn)入成年晚期(圖2C)。然而，意外地，出生后早期階段之后，在腦的其他區(qū)域(如小腦)未檢測到14-3-3ζ(圖13)。通過從顯微解剖的成體海馬提取的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)了CA和DG神經(jīng)元中的表達(dá)(圖2D)。其還
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確認(rèn)了蛋白質(zhì)從14-3-3ζ 小鼠的這些腦區(qū)域完全被去除。最后，體外10天(DIV)后，海馬MAP2陽性神經(jīng)元培養(yǎng)物也顯示在細(xì)胞體和軸突/樹突中14-3-3ζ的點(diǎn)狀(punctate)免疫細(xì)胞染色(圖2E)。
[0188] 由于14-3-3ζ在海馬神經(jīng)元中表達(dá)，我們接著檢驗(yàn)了CA和DG神經(jīng)元來確定是否062-/-
其在成體和胚胎突變體中正確定位。14-3-3ζ 小鼠的尼氏染色揭示了在海馬成熟前首次明顯的發(fā)育缺陷(5/5在P0、4/4在P7、2/2在P28和2/2在P56；圖3A和圖14)。特別地，除了錐體層的通常停留處，錐體神經(jīng)元異位定位于輻射層和始層。在CA3亞區(qū)中，錐體
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神經(jīng)元分裂成兩層而不是單個(gè)細(xì)胞層。與14-3-3ζ 同窩幼畜相比，齒狀回神經(jīng)元也在
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14-3-3ζ 小鼠中呈彌散型包裝。與尼氏染色一致，在thy1-YEP小鼠中海馬結(jié)構(gòu)的分析也揭示了被破壞的分層(圖3B)。
[0189] 然后考慮涉及異位定位的錐體細(xì)胞是否發(fā)育成成熟神經(jīng)元。在所有的062-/-
14-3-3ζ 海馬(4/4幼獸)中，異位細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN為陽性(圖3C)。與自身定位在深分子層不同，神經(jīng)元也在CA3的淺層中成熟。同時(shí)，所述數(shù)據(jù)推斷海馬體中誤定位的細(xì)胞形成功能性錐體和顆粒神經(jīng)元。此外，對(duì)來自胚胎、出生后早期和成體小鼠的海馬體的TUNEL染色未顯示基因型間明顯的不同(圖15)，表明14-3-3ζ的缺乏不影響神經(jīng)元生存。
[0190] 14-3-3ζ缺陷小鼠表現(xiàn)海馬神經(jīng)元遷移缺陷
[0191] 在14.5dpc，14-3-3ζ在中間區(qū)的表達(dá)和在P0淺層中成熟神經(jīng)元的存在升高了異常分層可起因于錯(cuò)誤遷移的可能性。為了可視化海馬神經(jīng)元遷移，通過向14.5dpc和062
16.5dpc的雜合14-3-3ζ 雜交懷孕母獸注射BrdU來完成出生日期確定(birthdating)。
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在P7收集14-3-3ζ 和14-3-3ζ 幼獸，在冠狀切面中鑒定保留BrdU的細(xì)胞。用DAPI復(fù)染色切片以鑒定海馬分開的層。使用每個(gè)基因型的5只小鼠從10μm切片計(jì)數(shù)保留BrdU的細(xì)胞并定量每層中相對(duì)的百分比。兩個(gè)注射時(shí)間點(diǎn)都顯示在對(duì)照小鼠中幾乎所有在腦室區(qū)于14.5dpc或16.5dpc生成的神經(jīng)元遷移至CA的錐體層(圖4)。然而，引入注
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目地，在14-3-3ζ 小鼠錐體層的外面鑒定到保留BrdU細(xì)胞顯著的百分比。神經(jīng)元未能
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從其出生地遷移或者停在其正確的層，因此造成在14-3-3ζ 海馬中重復(fù)的錐體層。
[0192] 在14-3-3ζ062-/-缺陷小鼠錐體細(xì)胞中功能性破壞的苔蘚纖維環(huán)路和異常突觸末梢
[0193] CA3錐體神經(jīng)元和DG顆粒細(xì)胞間的聯(lián)系通過精確的軸突導(dǎo)向和突觸靶向達(dá)到。通過在P0、P7和P56海馬用抗鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評(píng)估錯(cuò)排的錐體神經(jīng)元是否影響海馬環(huán)路(hippocampal circuit)的問題。在對(duì)照小鼠中，苔蘚纖維發(fā)芽自顆粒細(xì)胞胞體并分支為下錐體苔蘚纖維(IPMF)和上錐體苔蘚纖維(SPMF)神經(jīng)束跨越CA3的錐體層062-/-
(圖5)。在14-3-3ζ 小鼠中，所述IPMF神經(jīng)束沿著CA3錐體神經(jīng)元的頂表面導(dǎo)向，然而，所述SPMF神經(jīng)束在CA3神經(jīng)元當(dāng)中為錯(cuò)誤路線。
[0194] 為確定DG顆粒細(xì)胞是否突觸連接其CA靶細(xì)胞，使用抗突觸泡蛋白以鑒定在對(duì)照062-/-
動(dòng)物CA3亞區(qū)的IPMF和SPMF二者中的前突觸(presynapse)。在14-3-3ζ 小鼠中，錯(cuò)誤路線的軸突也在錐體層形成異常突觸(圖6)。通過高爾基染色的突觸結(jié)可視化進(jìn)一步揭示了CA3中突觸形成的明顯差異。在對(duì)照動(dòng)物中，頂端樹突(apical dendrite)近端區(qū)上的
062-/-
大棘突跟隨著細(xì)徑樹突分支(?ne-calibre dendritic branches)。在14-3-3ζ 小鼠的錐體神經(jīng)元中，樹突樹似乎具有相似數(shù)量的分支點(diǎn)但是具有來自所有檢測小鼠近端和遠(yuǎn)端頂端樹突二者上錯(cuò)誤路線之苔蘚纖維神經(jīng)束的刺樣膨大。
[0195] 為了鑒定14-3-3ζ協(xié)調(diào)神經(jīng)元遷移和軸突尋找通路使用的分子通路，對(duì)來自P7小鼠全腦提取物進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ可以與針對(duì)DISC1C末端產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫共沉淀。反之亦然，還發(fā)現(xiàn)DISC1可以與識(shí)別14-3-3ζ的抗體免疫共沉淀(圖7)。出人意料地，所述數(shù)據(jù)表明14-3-3ζ與DISC1的75kDa形式而非100kDa全長蛋白質(zhì)特異地相互作用，表明DISC1功能在神經(jīng)發(fā)育中以同工型特異方式。
[0196] 實(shí)施例2
[0197] 合并的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明精神分裂癥和相關(guān)病癥起因于多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)通路中的互相連接缺陷。海馬已被確定為該模型中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，因?yàn)楹ｑR錐體神-/-經(jīng)元整合了谷氨酸能和多巴胺能系統(tǒng)。為確定任一神經(jīng)遞質(zhì)通路是否是14-3-3ζ 小鼠中神經(jīng)精神病樣行為缺陷的支撐，進(jìn)行了特異性拮抗每個(gè)通路的精神藥物誘導(dǎo)行為的研究-/-
(圖16)。發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗物MK801破壞了野生型對(duì)照而非14-3-3ζ 小鼠中的PPI。
-/-
相反地，多巴胺釋放物阿撲嗎啡在14-3-3ζ 小鼠和野生型對(duì)照中對(duì)PPI具有相似的效-/-
應(yīng)。這表明14-3-3ζ 小鼠的基線PPI缺陷由谷氨酸能通路中的缺陷造成。還在運(yùn)動(dòng)功能測試中使用另一個(gè)多巴胺釋放物安非他明研究了超多巴胺能假說(hyperdopaminergic -/-
hypothesis)。發(fā)現(xiàn)與野生型對(duì)照相比，在14-3-3ζ 小鼠中發(fā)生增強(qiáng)效應(yīng)(即，時(shí)間減-/-
少以變得極度活躍且行進(jìn)距離的增加)，表明14-3-3ζ 小鼠基線極度活躍由多巴胺能-/-
通路中的缺陷造成(圖17)。因此，14-3-3ζ 小鼠在多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)通路中具有缺陷。考慮到所述藥物在精神分裂癥患者中引起相似效應(yīng)的能力，所述發(fā)現(xiàn)對(duì)-/-
14-3-3ζ 小鼠作為精神分裂癥和相關(guān)病癥的模型提供了堅(jiān)實(shí)的支持。
[0198] 實(shí)施例3
[0199] 減少的樹突分枝和棘突觸是精神分裂癥和相關(guān)病癥的解剖學(xué)特點(diǎn)。使用免費(fèi)的技術(shù)(如高爾基浸漬、錐體神經(jīng)元的體外培養(yǎng)和生物射彈加標(biāo)簽)，已經(jīng)進(jìn)行了海馬顆粒和錐體神經(jīng)元中樹突棘數(shù)量和棘尺寸的分析(圖18)。發(fā)現(xiàn)了海馬中顯著減少的棘，強(qiáng)烈支持了-/-14-3-3ζ 小鼠作為精神分裂癥和相關(guān)病癥的穩(wěn)健模型。
[0200] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解本文描述的本發(fā)明對(duì)除了那些特別描述的，對(duì)變化和修改也適合。應(yīng)了解本發(fā)明包括所有所述的變化和修改。本發(fā)明還包括所有的步驟、特征、本發(fā)明中個(gè)別地或者全體地提到或表明的組合物和化合物、以及任何和所有任何兩種或者更多種所述步驟和特征的組合。
[0201] 表1用于14-3-3同工型之定量RT-PCR以及用于對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型的引物[0202]
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