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非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途

閱讀：693發(fā)布：2020-06-21

專利匯可以提供非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且本 發(fā)明 涉及一種非人 哺乳動物 的神經(jīng)精神 疾病 動物模型及其制備方法和用途。本發(fā)明的小鼠模型與人類的神經(jīng)精神疾病高度相似?；谠撃Ｐ蛣游锏纳窠?jīng)精神疾病藥物篩選平臺，可用于篩選新藥以及開發(fā)其他 治療 方法。，下面是非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
(1)提供非人哺乳動物的細胞，將所述細胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活的細胞；
(2)利用步驟(1)中得到的CRMP2基因失活的細胞，制備得到CRMP2基因失活的神經(jīng)精神疾病動物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中斷或基因插入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳動物為嚙齒動物或靈長目動物，較佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)利用DNA同源重組技術(shù)，將所述CRMP2基因中的外顯子1至外顯子14中一個或多個外顯子剔除或中斷，并任選地用篩選標記替換，得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞；
(2)利用步驟(1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞制備得到嵌合非人哺乳動物；
(3)將步驟(2)中得到的嵌合非人哺乳動物和正常野生型非人哺乳動物交配繁育，在后代中篩選獲得CRMP2基因失活的雜合子非人哺乳動物；
(4)通過將步驟(3)中得到的雜合子非人哺乳動物相互交配獲得CRMP2基因失活的純合子非人哺乳動物，從而得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述篩選標記為neo基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型中，與野生型對照動物相比，具有以下一個或或多個特征：
自發(fā)活動水平增加；
抑郁樣的行為增加；
空間學習和記憶能力受損；
表現(xiàn)出孤獨癥樣和精神分裂癥樣行為；
海馬區(qū)突觸后致密組分中部分受體亞基的含量減少；
長時程增強受損；和/或
成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在于，將該模型用作研究神經(jīng)精神疾病的動物模型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在于，將該模型用于篩選或鑒定可減輕或治療神經(jīng)精神疾病的物質(zhì)(治療劑)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在于，所述的神經(jīng)精神疾病是成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關疾病。
10.一種篩選或鑒定治療或緩解神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑的方法，其特征在于，包括以下步驟：
a.將候選物質(zhì)施用于權(quán)利要求1所述方法制備的非人哺乳動物模型；和
b.對所述動物模型的行為進行行為學分析，并與對照組進行比較；
其中，與對照相比，如果施用了候選物質(zhì)的動物模型中表征神經(jīng)精神疾病行為得到改善，則表明該候選物質(zhì)是神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑；
更佳地，所述的行為學分析包括：開放場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、蔗糖偏好實驗、水迷宮實驗、關聯(lián)/暗示條件恐懼實驗、驚反射前脈沖抑制實驗、筑巢實驗、或其組合。

說明書全文

非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途

技術(shù)領域

[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

[0002] 精神分裂癥(Schizophrenia)是一類最常見精神疾病，影響全世界人口的0.5%-1%，以基本個性改變，思維、情感和行為的分裂，精神活動與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征。
該病在男性中多發(fā)生于青春期晚期至25歲，在女性中25-35歲是高發(fā)期，自然病程多遷延，多數(shù)呈復發(fā)和加重，慢性化和衰退的過程，且與其他精神疾病遺傳關聯(lián)性強，重疊率高，最終結(jié)局約一半左右患者出現(xiàn)精神殘疾并伴隨高自殺率。
[0003] 精神分裂癥是一種人類復雜疾病，盡管目前對其病因的認識尚不很明確，但個體的易感素質(zhì)和外部環(huán)境的不良因素對疾病的發(fā)生發(fā)展的作用已被大家所共識。多項研究表明，精神分裂癥是在基因與環(huán)境相互作用的基礎上發(fā)生的，但遺傳因素在精神分裂癥的發(fā)生中具有重要作用，其遺傳度高達0.70～0.85(Picchioni,M.M.,and Murray,R.M.(2007).Schizophrenia.Bmj335,91-95.)。但其遺傳方式不符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，具有多基因高異質(zhì)性遺傳特征(McGuffin,P.,and Owen,M.(1991).The molecular genetics of schizophrenia:an overview and forward view.European archives of psychiatry and clinical neuroscience240,169-173.)。精神分裂癥的發(fā)生還與環(huán)境因素有關，通常認為在個體具有遺傳易感性背景的基礎上，環(huán)境有害因素作用于機體可導致疾病的發(fā)生。
[0004] 精神分裂癥的發(fā)病機制沒有統(tǒng)一定論，各種假說一直處于爭論與變化之中。目前有4種學說：神經(jīng)遞質(zhì)紊亂學說、神經(jīng)發(fā)育障礙學說、神經(jīng)細胞膜學說和免疫系統(tǒng)障礙學說，但是，迄今為止并無任何一種假說能夠十分恰當?shù)仃U明精神分裂癥的發(fā)病機制并被精神醫(yī)學界廣泛接受(Keshavan,M.S.,Tandon,R.,Boutros,N.N.,and Nasrallah,H.A.(2008).Schizophrenia,"just the facts":what we know in2008Part3:neurobiology.Schizophrenia research106,89-107.)。
[0005] 人類行為的基因控制和小鼠或其他動物模型的行為基因控制有相似性。比如，大多數(shù)嚙齒類動物焦慮的形式和人類的突發(fā)焦慮癥類似；人類抑郁癥與嚙齒類動物行為表現(xiàn)是壓力誘導的逃避減弱；模擬精神分裂癥嚙齒類動物模型可以表現(xiàn)為運動活動性增加、精神興奮、緊張性刺激、社交退縮、及對多巴胺拮抗劑的應答的抑制和驚反射中弱刺激的抑制作用減弱。所以人類疾病的動物模型為人類深入了解和認識疾病提供了有力的工具。
[0006] 目前建立精神分裂癥的動物模型主要有四種方式，第一種發(fā)育造模，包括營養(yǎng)缺乏、隔離飼養(yǎng)和免疫刺激等；第二種藥物誘導，包括各種類型的受體激動劑和拮抗劑，常用的有苯環(huán)己哌啶(PCP)、MK801和可他命；第三種是基因修飾，包括基因敲除、基因敲入、轉(zhuǎn)基因和突變；第四種是損毀造模，主要是損毀腹側(cè)海馬和前額葉(Jones,C.A.,Watson,D.J.,and Fone,K.C.(2011).Animal models of schizophrenia.British journal of pharmacology164,1162-1194.)。
[0007] 目前已提出的精神分裂癥的重要候選基因包括G蛋白信號調(diào)節(jié)子4(RGS4)，dysbindin(DTNBP1)，神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(neuregulin-1，NRG1)，G72，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)，精神分裂癥斷裂基因1(DISC1)和代謝型谷氨酸受體3(GRM3，也被稱為mGluR3)等。然而，由于精神分裂癥等疾病的成因復雜，因此迄今為止，對所謂的“精神分裂癥的重要候選基因”進行導入或敲除等操作，尚未獲得令人滿意的神經(jīng)精神疾病動物模型。
[0008] 因此，本領域迫切需要開發(fā)非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型。

發(fā)明內(nèi)容

[0009] 本發(fā)明的目的就是提供一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型，及其制備方法和用途。
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0011] (1)提供非人哺乳動物的細胞，將所述細胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活的細胞；
[0012] (2)利用步驟(1)中得到的CRMP2基因失活的細胞，制備得到CRMP2基因失活的神經(jīng)精神疾病動物模型。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述將CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中斷或基因插入。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述基因失活包括CRMP2基因不表達，或表達沒有活性的CRMP2蛋白。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物為嚙齒動物或靈長目動物，較佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：
[0017] (1)利用DNA同源重組技術(shù)，將所述CRMP2基因中的外顯子1至外顯子14中一個或多個外顯子剔除或中斷，并任選地用篩選標記替換，得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞；
[0018] (2)利用步驟(1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞制備得到嵌合非人哺乳動物；
[0019] (3)將步驟(2)中得到的嵌合非人哺乳動物和正常野生型非人哺乳動物交配繁育，在后代中篩選獲得CRMP2基因失活的雜合子非人哺乳動物；
[0020] (4)通過將步驟(3)中得到的雜合子非人哺乳動物相互交配獲得CRMP2基因失活的純合子非人哺乳動物，從而得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述CRMP2基因失活是通過缺失或敲除CRMP2的外顯子3而失活。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的CRMP2基因失活是大腦特異性的CRMP2基因失活或全身的CRMP2基因失活。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(5)：將CRMP2基因失活的純合子非人哺乳動物與同一物種的神經(jīng)特異性敲除工具非人哺乳動物進行雜交，從而獲得大腦特異性的CRMP2基因失活的非人哺乳動物動物模型。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物是小鼠，并且在步驟(5)中把CRMP2flox/flox小鼠與工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠。再把CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠與CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神經(jīng)前體細胞特異性CRMP2基因的敲除小鼠簡稱cKO小鼠(即大腦特異性CRMP2失活小鼠)。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述篩選標記為neo基因。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型中，與野生型對照動物相比，具有以下一個或或多個特征：
[0027] 自發(fā)活動水平增加；
[0028] 抑郁樣的行為增加；
[0029] 空間學習和記憶能力受損；
[0030] 表現(xiàn)出孤獨癥樣和精神分裂癥樣行為；
[0031] 海馬區(qū)突觸后致密組分中部分受體亞基的含量減少；
[0032] 長時程增強受損；和/或
[0033] 成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少。
[0034] 在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，將該模型用作研究神經(jīng)精神疾病的動物模型。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述神經(jīng)精神疾病包括：精神分裂癥、躁郁癥、重度抑郁癥、孤獨癥、和/或老年癡呆癥。
[0036] 在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其中，將該模型用于篩選或鑒定可減輕或治療神經(jīng)精神疾病的物質(zhì)(治療劑)。
[0037] 在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，所述的神經(jīng)精神疾病是成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關疾病。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關疾病是精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥、和/或老年癡呆癥。
[0039] 在本發(fā)明的第五方面，提供了用本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，對于CRMP2基因失活而言，所述的非人哺乳動物模型是雜合的或純合的。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的CRMP2基因失活是大腦特異性的CRMP2基因失活或全身的CRMP2基因失活。
[0042] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選或鑒定治療或緩解神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑的方法，包括以下步驟：
[0043] a.將候選物質(zhì)施用于本發(fā)明第五方面所述的非人哺乳動物模型；和[0044] b.對所述動物模型的行為進行行為學分析，并與對照組進行比較；
[0045] 其中，與對照相比，如果施用了候選物質(zhì)的動物模型中表征神經(jīng)精神疾病行為得到改善，則表明該候選物質(zhì)是神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的行為學分析包括：開放場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、蔗糖偏好實驗、水迷宮實驗、關聯(lián)/暗示條件恐懼實驗、驚反射前脈沖抑制實驗、筑巢實驗、或其組合。
[0047] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明
[0048] 圖1顯示了本發(fā)明一個實施例中的CRMP2基因打靶載體構(gòu)建策略。
[0049] 圖2顯示了Pop Out載體的示意圖
[0050] 圖3顯示了CRMP2基因打靶載體及多酶切鑒定。
[0051] 圖4顯示了ES細胞篩選loxP位點、3'端和5'端PCR鑒定結(jié)果示意圖。
[0052] 圖5顯示了.CRMP2嵌合體小鼠。
[0053] 圖6顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠繁殖策略。
[0054] 圖7顯示了大腦特異性CRMP2敲除效率驗證結(jié)果。其中，(A)CRMP2基因敲除小鼠基因型鑒定圖示；(B)CRMP2基因敲除小鼠海馬中CRMP2的mRNA的表達水平有顯著下調(diào)，CRMPs家族的其他成員mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化；(C)免疫印跡法檢測顯示CRMP2cKO小鼠各個腦區(qū)的CRMP2及p-CRMP2蛋白表達水平明顯降低；(D)免疫熒光染色檢測CRMP2在cKO小鼠腦片上明顯降低。注：OB，嗅球；Cor，皮層；Cere,小腦；Hip,海馬；Med,髓質(zhì)；標尺：200μm。
[0055] 圖8顯示了敲除CRMP2可使小鼠體重下降，但皮層分層基本正常。其中，(A)P56小鼠體重的定量分析(雌鼠：對照組n=13，cKO n=8雄鼠：對照組n=13，cKO n=8)；(B)出生56天的對照小鼠和CRMP2cKO小鼠(nestin-cre)的大腦形態(tài)(比例尺2mm)；(C)尼氏染色示出生56天的對照小鼠和CRMP2cKO小鼠大腦結(jié)構(gòu)沒有明顯異常；(D)NeuN染色顯示CRMP2特異敲除小鼠出生56天后皮層各層分布未見明顯異常。注：所有數(shù)據(jù)均為平均值±平均值的標準差(±SEM)；t檢驗，**p<0.01，*p<0.05
[0056] 圖9 顯 示 了 CRMP2 敲 除 小 鼠 神 經(jīng) 元 遷 移 正 常。 其 中，圖 A-D：TBR1,SATB2,FoxP1,CTIP2染色顯示E18.5的CRMP2，表明cKO鼠腦中皮層各層并未出現(xiàn)明顯的缺陷及異常。
[0057] 圖10顯示了CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠自發(fā)活動增加但是焦慮樣行為正常。其中，(A)曠場實驗中小鼠在30分鐘內(nèi)的活動總距離；(B)曠場實驗中小鼠在30分鐘內(nèi)停留在中央?yún)^(qū)域的時間比例；(C)高架十字迷宮實驗中小鼠在5分鐘的測試時間內(nèi)停留在開臂區(qū)域的時間占總時間的比例。
[0058] 圖11顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠抑郁樣行為增加。其中，(A)強迫游泳實驗，每6分鐘為一測試時段，累計小鼠不活動的時間；(B)懸尾實驗，每6分鐘為一測試時段，累計小鼠不活動時間；(C)蔗糖偏好實驗。比較小鼠對蔗糖溶液和水的偏好程度。
[0059] 圖12顯示了與孤獨癥非常類似的CRMP2敲除小鼠。
[0060] 圖13顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠學習和空間記憶能力受損。其中，(A)場景恐懼實驗中小鼠在5分鐘的測試時段內(nèi)小鼠因恐懼而僵直的時間比例；(B)Morris水迷宮實驗，計算5天的訓練周期中小鼠到達隱藏平臺所需的平均時間；(C)空間探索實驗第六天小鼠停留在目標象限內(nèi)的時間比例。
[0061] 圖14顯示了CRMP2基因敲除小鼠表現(xiàn)出類精神分裂癥行為。其中，(A)不同脈沖強度下對照小鼠和CRMP2基因敲除小鼠的驚嚇反應幅度；(B)CRMP2基因敲除小鼠前脈沖抑制效應明顯減弱；(C)對照組和CRMP2敲除小鼠做窩的圖示；(D)CRMP2敲除小鼠在做窩評分明顯低于對照小鼠。
[0062] 圖15顯示了CRMP2神經(jīng)細胞特異敲除小鼠海馬區(qū)突觸后致密區(qū)受體量選擇性下降。其中，(A)免疫印跡顯示分離的突觸后致密區(qū)組分純，同時表明突觸后致密區(qū)組分中存在CRMP2；(B)免疫印跡顯示敲除小鼠突觸后致密區(qū)組分中NMDA受體NR1和NR2B的量減少。
[0063] 圖16顯示了CRMP2神經(jīng)細胞特異敲除小鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)觀察。其中，(A)電子顯微例圖顯示對照小鼠和敲除典型的突觸結(jié)構(gòu)突觸前囊泡(箭狀標記)、突觸后致密組分(箭頭)及樹突棘(星號)；(B)CRMP2敲除小鼠的突觸間隙與對照組沒有差異；(C)CRMP2敲除小鼠在突觸致密組分長度與對照組沒有差異；(D)CRMP2敲除小鼠突觸致密組分面積較對照組??；(E)CRMP2敲除小鼠突觸致密組分厚度比明顯變?。?F)通過累積頻率圖及直方圖分布和高斯曲線擬合的方式測繪突觸后膜致密組分厚度。注：圖B-E均為平均值±SEM。雙尾T檢驗。
[0064] 圖17顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠LTP受損。其中，(A)輸入-輸出曲線顯示CRMP2cKO小鼠的基礎突觸傳導正常；(B)當間隔為60ms和500ms，對照和cKO小鼠雙脈沖易化比例相似；(C)CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠TBS誘導的LTP明顯減弱。
[0065] 圖18顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠成年神經(jīng)前體細胞增殖減少。其中，(A)Brdu免疫染色腦切片的共聚焦圖示，比例尺：50μm；(B)齒狀回區(qū)BrdU陽性細胞的體式學定量分析；(C)活化的半胱天冬酶-3免疫染色腦切片的共聚焦圖示，比例尺：50μm；(D)齒狀回顆粒下層及顆粒細胞層內(nèi)活化的半胱天冬酶-3細胞密度的定量分析。

具體實施方式

[0066] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，建立了一種遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的神經(jīng)精神疾病模型，它是CRMP2基因被剔除或失活的小鼠或其他非人哺乳動物。本發(fā)明的動物模型是一種有效的神經(jīng)精神疾病動物模型，可用于研究精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥和老年癡呆癥等神經(jīng)精神疾病，并可以用于特定藥物的篩選和測試試驗。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0067] 具體地，在本發(fā)明中，對大腦特異性CRMP2和全身敲除的小鼠模型的行為學檢測證實，該神經(jīng)精神疾病模型動物的自發(fā)活動水平增加，抑郁樣行為增加和精神分裂癥樣的行為學表型，部分小鼠表現(xiàn)出典型的孤獨癥表型。對海馬組織突觸后膜致密組分中AMPA受體亞基和NMDA受體亞基的免疫印跡分析表明敲除小鼠中海馬PSD組分中NR1和NR2B的量顯著降低；通過透射電鏡對海馬CA1區(qū)放射層非對稱突觸的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠在該區(qū)的PSD面積明顯變小，厚度變薄；通過電生理技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲除小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1區(qū)突觸的基礎傳遞和突觸前膜的遞質(zhì)釋放正常，但是TBS誘導產(chǎn)生的長時程增強卻明顯受損。同時該基因敲除小鼠齒狀回中成年神經(jīng)干細胞增殖明顯減少。
[0068] CRMP家族和CRMP2
[0069] CRMPs家族(CRMP1-5)的各個成員在不同的物種被獨立發(fā)現(xiàn)，其中日本科學家最早發(fā)現(xiàn)CRMP2在雞胚的背根神經(jīng)節(jié)中介導胞外信號Sema3A轉(zhuǎn)導過程具有重要作用(Goshima et al.,1995;Minturn et al.,1995)。在結(jié)構(gòu)上，CRMP1-4相互之間大約75%氨基酸序列同源，但是CRMP5與其他成員只有50%-51%的氨基酸序列同源。CRMP1-4也與肝臟中的二氫尿嘧啶脫氫酶序列高度同源而且結(jié)構(gòu)與金屬依賴的氨基水解酶高度相似，都能形成穩(wěn)定的四聚體(Hamajima et al.,1996)。但是CRMPs家族中沒有一個成員具有酶活性，可能是由于缺少氨基水解酶活化位點結(jié)合金屬原子所必需關鍵氨基酸殘基組氨酸(Wang and Strittmatter,1996)。
[0070] CRMP2(collapsin response mediator protein-2， 也 被 稱 為 DPYSL2/DRP2,Unc-33,Ulip或TUC2)是CRMPs家族的一員。CRMP2在神經(jīng)元的極性建立上具有重要作用，研究表明體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中過表達CRMP2促進多軸突形成，過表達功能缺失突變體導致軸突變短(Inagaki et al.,2001)。CRMP2通過促進與微管蛋白異源二聚體結(jié)合從而促進軸突的外向生長，而在神經(jīng)突起的生長錐是通過調(diào)節(jié)極性蛋白Numb介導的內(nèi)吞作用來調(diào)控的神經(jīng)元極性(Yoshimura et al.,2005)。CRMP2參與極性建立是通過磷酸化與去磷酸化的方式調(diào)節(jié)與微管蛋白和Numb的親和力來實現(xiàn)的。
[0071] CRMP2基因位于人類基因組8p22-p21上，全長150985bp(Genebank登錄號：NG_030020.1)。CRMP2的基因組序列包括13個內(nèi)含子和14個外顯子，有8個不同的轉(zhuǎn)錄本，其中有三個轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白。這些序列信息可參見文獻或Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。
[0072] 小鼠等其他物種的CRMP2基因也可參見文獻或Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。
[0073] 應理解，術(shù)語“CRMP2”還包括各種天然存在的CRMP2基因的變異形式。代表性的例子包括：因密碼子的簡并性而編碼與野生型相同的CRMP2蛋白的核苷酸序列，編碼野生型CRMP2蛋白的保守性變異多肽的核苷酸序列。此外，對于小鼠之外的其他哺乳動物時，該術(shù)語指CRMP2基因在該哺乳動物中的同系物。例如對于人而言，該術(shù)語指人的CRMP2(已知小鼠CRMP2基因與人類CRMP2的cDNA同源度為86%，氨基酸序列的同源度為99%)。
[0074] 神經(jīng)精神疾病及成年新生神經(jīng)元發(fā)生(adult neurogenesis)減少相關疾病[0075] 神經(jīng)精神疾病是以表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)病變、行為、心理活動紊亂的一組疾病，主要分為神經(jīng)疾病與精神疾病。近年的研究表明，海馬是與學習和記憶密切相關的腦區(qū)，從功能上看，海馬齒狀回成年新生神經(jīng)元發(fā)生對神經(jīng)網(wǎng)絡的可塑性和維持上具有重要的作用，也是老年癡呆病早期階段最容易受損的腦區(qū)，在精神分裂癥與抑郁癥等精神疾病病人中也常伴有海馬功能的異常。越來越多的證據(jù)提示海馬齒狀回區(qū)成年新生神經(jīng)元發(fā)生(adult neurogenesis)的減少可能是精神分裂癥與抑郁癥等精神疾病及老年癡呆發(fā)病發(fā)病的重要原因之一(Ming and Song,2011；Winner et al.,2011；Mu and Gage,2011)。
[0076] 在本發(fā)明中，成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關疾病包括但不限于情緒類疾病如精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥，神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病等，優(yōu)選地，包括精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥、和/或老年癡呆癥。
[0077] 基因失活
[0078] 對于功能未知基因的研究可采用許多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遺傳修飾的表型變化，進而獲得該基因的功能信息。這一研究方法的另一優(yōu)點是可以將基因功能和疾病進行關聯(lián)，從而在獲得基因功能的同時也能獲得該基因作為潛在藥物或者藥物靶點所能治療的疾病信息和疾病動物模型?；蚴Щ畹姆椒赏ㄟ^基因剔除、基因中斷或基因插入的方式來完成。其中，基因剔除技術(shù)是研究人類基因在整體中的功能的非常強有力的手段。
[0079] 動物模型
[0080] 在本發(fā)明中，提供了一種非常有效的神經(jīng)精神疾病的非人哺乳動物模型。
[0081] 在本發(fā)明中，非人哺乳動物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。
[0082] 如本文所用，術(shù)語“CRMP2基因失活”包括一個或兩個CRMP2基因被失活的情況，即包括CRMP2基因雜合地和純合地失活。例如，CRMP2基因失活的小鼠可以是雜合或純合的小鼠。
[0083] 在本發(fā)明中，可基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基因(或片段)而使CRMP2基因失活等方法制備CRMP2基因失活的非人哺乳動物(如小鼠)。在本領域中，通過基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基因而使靶基因失活的技術(shù)是已知的，這些常規(guī)技術(shù)都可用于本發(fā)明。
[0084] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，CRMP2基因的失活是通過基因剔除實現(xiàn)的。
[0085] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，CRMP2基因的失活是通過CRMP2基因中插入外源基因(或片段)而實現(xiàn)的。
[0086] 在本發(fā)明的一具體實例中，可構(gòu)建一含有外源插入片段的構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有與靶基因(CRMP2)的插入位點的兩側(cè)的側(cè)翼序列同源的同源臂，從而可以通過同源重組高頻地將外源插入片段(或基因)插入至CRMP2基因組序列(尤其是外顯子區(qū)域)，造成小鼠CRMP2基因的移碼、提前終止、或敲除，從而導致CRMP2缺失或失活。
[0087] 用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的小鼠可育，發(fā)育正常。失活的CRMP2基因可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。
[0088] 在一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種缺失CRMP2基因的純合小鼠模型動物。
[0089] 候選藥物或治療劑
[0090] 在本發(fā)明中，還提供了一種利用本發(fā)明的動物模型，篩選治療神經(jīng)精神疾病的候選藥物或治療劑的方法。
[0091] 在本發(fā)明中，候選藥物或治療劑是指已知具有某種藥理學活性或正在被檢測的可能具有某種藥理學活性的物質(zhì)，包括但不限于核酸、蛋白、化學合成的小分子或大分子化合物、細胞等。候選藥物或治療劑的給藥方式可以是口服、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、椎管給藥或直接腦內(nèi)注射。
[0092] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0093] (a)本發(fā)明神經(jīng)精神疾病模型的遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定。
[0094] (b)用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的動物模型可育，發(fā)育正常。轉(zhuǎn)基因雜合雄性小鼠具有生殖能力，失活的CRMP2基因可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。
[0095] (c)所述神經(jīng)精神疾病動物模型表現(xiàn)出多種神經(jīng)和精神疾病樣的癥狀，因此可以廣泛用于神經(jīng)精神類疾病的藥物篩選和測試，包括精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥和老年癡呆等。
[0096] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0097] 材料
[0098] 1實驗材料、主要試劑與實驗儀器
[0099] 1.1小鼠、細胞株、菌株和質(zhì)粒
[0100] C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；ICR小鼠為中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所動物中心繁殖；工具鼠Nestin-Cre(品系名：B6.Cg(SJL)-TgN(Nes-cre)1Kln)/J)購自南京大學模式動物研究所；Thy1-GFP-M由清華大學左毅教授贈送。
[0101] ES細胞株(MPI-2,衍生自129SvJ品系)購自北京百奧賽圖生物技術(shù)有限公司。
[0102] G418抗性小鼠原代成纖維細胞(MEF)購自National Cancer Institute at Frederic。
[0103] 大腸桿菌TOP10菌株(購自北京康為世紀生物技術(shù)有限公司)和工程菌EL350(購自National Cancer Institute at Frederic)。
[0104] 質(zhì)粒pBluescript II KS+購自Stratagen公司；打靶載體構(gòu)建過程中使用的質(zhì)粒PL253，PL451，PL452購自National Cancer Institute at Frederic。含CRMP2基因全長的BAC克隆(RPCI23-414A17)購自Invitrogen公司。
[0105] 1.2酶、培養(yǎng)基、試劑盒和生化藥品
[0106] 所用的各種內(nèi)切酶、Taq DNA Polymerase、T4DNA ligase、DNA Marker購自New England Biolab或Takara公司；基因型鑒定用的PCR mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司；DMEM，Trypsin，Pen-Strep為Hyclone產(chǎn)品；胰蛋白胨(LP0042)，酵母抽提粉(LP0021)為OXOID產(chǎn)品；DMSO購自Sigma公司；DNA回收純化試劑盒購自索萊寶公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自OMEGA公司；質(zhì)粒中提，大提試劑盒購自Qiagen公司；寡核苷酸引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
[0107] 1.3實驗中使用的引物序列
[0108] 1.3.1擴增同源臂所用引物序列：
[0109]
[0110] 1.3.2ES細胞篩選所用引物序列：
[0111]
[0112] 1.3.3小鼠基因型鑒定引物序列：
[0113]
[0114] 1.3.4CRMPs熒光定量PCR引物序列：
[0115]
[0116] 1.4實驗中使用的抗體列表
[0117]
[0118]
[0119] 通用方法
[0120] 1、小鼠行為學分析方法
[0121] 1.1開放場實驗(open-field test)
[0122] 開放場實驗是評價動物自發(fā)活動能力、探索行為以及焦慮水平的實驗。實驗所用操作箱規(guī)格為40cm×40cm×49cm(長×寬×高)，里面的場地根據(jù)面積劃分為12個象限，頂蓋裝有燈、攝像頭，及連接裝有小鼠行為記錄分析系統(tǒng)的電腦。每只小鼠放在開放場的中間，在箱內(nèi)自由活動30分鐘，攝像頭全程拍攝。所拍視頻用小動物行為記錄分析系統(tǒng)分析小鼠活動軌跡，小鼠的焦慮水平由小鼠在中間區(qū)域所呆的時間和靠近曠場壁的相對時間來衡量。由兩個定量的指標組成：在中間象限時間占總時間的百分比；小鼠在開放場內(nèi)運動的總距離。定義小鼠在某個象限的標準是小鼠的四肢都進入該象限。
[0123] 1.2高架十字迷宮實驗(Elevate Plus Maze Test)
[0124] 高架十字迷宮由黑色的樹脂玻璃制作，離地高70cm，由兩個成十字排列的長坂組成，四個臂組成，每個臂長30cm，寬5cm，其中的兩個臂被兩個高14cm的黑色樹脂玻璃隔開，形成兩個閉合臂；另外的兩個臂稱之為開臂。在十字迷宮運動的小鼠由紅外感應的追蹤系統(tǒng)記錄小鼠的運動軌跡。在開始實驗時，小鼠放在暗室十字迷宮的中間，頭朝開臂方向，每個測試環(huán)節(jié)中記錄小鼠的運動軌跡10min。分析小鼠進入開臂和閉合臂的次數(shù)；分別在開臂和閉合臂的總時間；穿過中間區(qū)域的頻率。小鼠進入開臂和閉合臂的標準是小鼠的四肢都進入該區(qū)域。反應焦慮水平的指標：小鼠處在開臂時間占總時間的百分比。
[0125] 1.3強迫游泳實驗(Forced Swim Test)
[0126] 強迫游泳實驗是一種經(jīng)典的反應嚙齒類動物抑郁相關行為的實驗，本實驗中用于測試小鼠抑郁樣的行為。把小鼠放入裝有22℃水的玻璃量筒中(高25cm，直徑10cm)，水深18cm。每個測試周期為6min，記錄6min中小鼠不動所占時間比例。不動的定義標準是小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面。游泳的定義標準是小鼠積極利用前肢在水中向前運動，這個行為不包括小鼠把爪子舉出水面，小鼠的身體通常朝向量筒壁的一側(cè)。攀爬定義為小鼠積極利用爪子趴在量筒壁上，同時把爪子舉出水面，頭朝著量筒壁，身體與量筒側(cè)邊垂直。反應抑郁水平的指標：小鼠在水中保持不動的時間。
[0127] 1.4懸尾實驗(Tail Suspension Test)
[0128] 懸尾實驗是反應嚙齒類動物抑郁相關行為的實驗，本實驗中用于測試小鼠抑郁樣行為。把小鼠的尾巴固定在懸尾測試儀上，使其頭部向下懸掛，記錄處于該環(huán)境中小鼠產(chǎn)生絕望不動狀態(tài)的時間。反應抑郁水平的指標：小鼠在懸尾時不動的時間。
[0129] 1.5蔗糖偏好實驗(Sucrose Preference Test)
[0130] 蔗糖偏好實驗用于測試動物是否有快感缺乏的行為學現(xiàn)象，因為快感缺乏是抑郁行為的一個主要癥狀。實驗前三天小鼠喂以1%的蔗糖水代替日常飲用水，以使小鼠習慣于蔗糖水；然后在給小鼠23h禁水之后，喂予小鼠可以自由的飲用兩個水瓶，其中一個為日常飲用水，另一個為1%的蔗糖水；1h后稱取每個水瓶的重量，計算液體的消耗量；蔗糖偏好實驗連續(xù)2天，為了避免水瓶的位置效應對結(jié)果的影響，第2天變更蔗糖水和日常飲用水瓶放置的位置；蔗糖偏好的計算公式是：蔗糖偏好性(%)=飲用蔗糖水量/(飲用蔗糖水量+飲用日常飲用水量)×100%。
[0131] 1.6水迷宮實驗(Water Maze test)
[0132] 水迷宮實驗設備包括一個不銹鋼圓形水池(直徑120cm，高50cm)、一個平臺(直徑6cm)、水池上方固定一臺攝像機以及與攝像機相連的計算機。池內(nèi)盛水，深25cm，水溫22℃左右。平臺置于水下1cm。水面漂浮著一層無毒無味的白色塑料珠以防動物看清水下平臺。房間墻壁貼上色彩鮮艷的、形狀不同的紙板或塑料板，作為動物空間定位的標記。
[0133] 實驗包括兩個階段定位航行實驗(place navigation)和空間探索實驗(spatial probe)。其中定位航行試驗歷時5天；訓練期間，把平臺放在水池中的一個象限，每天固定時間將小鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間，如果小鼠在60s之內(nèi)沒有找到水下平臺則引導其到平臺上，小鼠到達平臺后讓其再呆上10s，然后迅速用毛巾弄干小鼠，放在37℃加熱燈下，以保持體溫；第6天進行空間探索試驗，在定位航行試驗后去除平臺，然后在之前平臺對側(cè)的象限將小鼠放入水池中，記錄其在60s內(nèi)的游泳軌跡，考察小鼠對原平臺的記憶。用視頻追蹤系統(tǒng)記錄每只小鼠在水池中的的游泳路徑，計算小鼠在60s跨原平臺所在象限時間與其它三象限的時間比。
[0134] 1.7關聯(lián)/暗示條件恐懼實驗(contextual/cued fear conditioning)[0135] 關聯(lián)/暗示條件恐懼包括訓練和測試兩個階段，具體步驟如下：
[0136] 訓練階段(第一天)，調(diào)試儀器，確保操作箱底部柵板有電流刺激(用備用小鼠測試)；將小鼠放入箱內(nèi)，適應2min；足電擊刺激(0.7mA，2s)；58s間歇期，無任何刺激；緊跟2s足電擊刺激(0.7mA，2s)；58s間歇期,無任何刺激；緊跟2s足電擊刺激(0.7mA，2s)；58s間歇期，無任何刺激；實驗終止；將小鼠放回飼養(yǎng)籠，70%乙醇擦拭操作箱。
[0137] 測試階段(第二天)，關聯(lián)測試，把動物放入跟第一天實驗使用的同一個測試箱，重力感應器記錄小鼠5min內(nèi)的活動狀態(tài)；記錄每分鐘小鼠凝滯時間，計算小鼠凝滯的比率。
[0138] 1.8驚反射的前脈沖抑制實驗(Prepulse inhibition，PPI)
[0139] PPI的測試過程，由于小鼠需從北京送到蘇州大學進行行為學實驗，至少實驗前一周把小鼠送到蘇州大學實驗室。根據(jù)文獻和預實驗，確定實驗參數(shù)和測試方案，實驗當天，將小鼠放入驚反射測試箱。實驗步驟如下：
[0140] 1)將小鼠置于單純的背景聲音中，適應5min(69dB)；
[0141] 2)連續(xù)5次單獨驚反射刺激(120dB，持續(xù)40ms)，并記錄數(shù)據(jù)；
[0142] 3)共48個trials，4種類型刺激，分別是單獨的驚反射刺激(120dB，持續(xù)時間40ms，12trials)，3種聯(lián)合刺激(其中前刺激強度分別為背景+4dB，+8dB和+12dB)前刺激持續(xù)20ms，驚反射刺激強度120dB，持續(xù)40ms，二者間隔100ms，各12trials，所有的trial按假隨機的順序進行，并記錄數(shù)據(jù)；
[0143] 4)最后給小鼠4種類型的單獨驚反射刺激共20個trial，強度分別為90dB，100dB，110dB和120dB，各個刺激按假隨機順序進行并記錄數(shù)據(jù)。
[0144] 所有試驗共73個trial，每個刺激間隔15-20s，每個刺激內(nèi)含空白期100ms，前刺激或空白刺激持續(xù)20ms，間隔100ms，驚反射刺激持續(xù)40ms，延遲140ms。
[0145] 行為學評價指標：1)驚反射幅度=最后5次單獨驚反射刺激反應幅度的均值。用于評價動物的情緒狀態(tài)。2)PPI=(1-前脈沖聯(lián)合驚反射刺激的反應幅度/單獨驚反射刺激的反應幅度×100%，數(shù)值為0表示無前脈沖抑制，數(shù)值越大代表抑制程度越強。
[0146] 1.9筑巢實驗(Nest building test)
[0147] 熄燈前1h將小鼠分籠，單籠單只飼養(yǎng)。將正方形(10cm×10cm)的脫脂棉3.0g放于鼠籠內(nèi)。12h后觀察小鼠的筑巢情況，拍照屏蔽基因型并按照評分標準對其評分。評分標準0-1分：90%脫脂棉保持完好；1-2分：小部分脫脂棉被撕開，大部分保持完好(50%-90%)；2-3分：大部分脫脂棉被撕成碎片(50%-90%)，但是無窩狀；3-4分：90%以上的脫脂棉被撕成碎片，成扁平狀鼠窩(高度小于身高的50%)；4-5分：90%以上的脫脂棉被撕成碎片，成高質(zhì)量鼠窩(高度大于身高的50%)；鑒于動物實驗的復雜性，評分可以用小數(shù)，如小鼠的窩做的非常完美，但是還殘留10%的脫脂棉沒有被撕碎，可以評為4.5分。
[0148] 2.蛋白水平研究實驗方法
[0149] 小鼠海馬組織突觸后致密區(qū)組分分離：取小鼠引頸或者斷頭處死，取出整個大腦組織，預冷的PBS中浸洗一次；然后迅速在冰上取出兩側(cè)海馬，放入預冷的玻璃勻漿器，加入800μL組織勻漿緩沖液(320mM sucrose,2mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH8.0),1mM PMSF)勻漿，單側(cè)海馬加400μL H緩沖液，使用勻漿器勻漿；4℃離心,1000g，10min，取上清，作為組分S1；從S1組分中取出45μL，加入5μL10%SDS，混勻，用作全蛋白檢測；剩余的S1離心，4℃離心，10000g，20min，棄上清，留沉淀P2作為突觸小體組分；加入400μL TET緩沖液(1%TritonX-100,2mM EDTA,20mM Tris-HCl pH7.4,1mM PMSF)重懸P2，4℃，旋轉(zhuǎn)混勻1hr；超速離心，Beckman離心機，Sw41轉(zhuǎn)子，4℃，100000g，1hr；單側(cè)海馬的最后沉淀用40μL TET緩沖液和5μLSET緩沖液(1%SDS,2mM EDTA，20mM Tris-HCl pH7.4)重懸，吹打溶解；
Bradford法定量蛋白濃度；.取15μg蛋白，8%SDS-PAGE電泳。
[0150] 3.形態(tài)學研究實驗方法
[0151] 3.1Nissl染色
[0152] 挑取相應的腦片到經(jīng)鉻釩明膠包被過的載玻片上，室溫晾干8-12h；把貼有腦片的載玻片于PBS中浸洗1min；后入0.5%的Nissl染色液5-10min；取出流水沖去染色液，入梯度酒精脫水，30%1min，50%1min，70%1min，80%1min，95%1min，100%5min；入100%二甲苯透明3次，每次5min；取出后迅速加上中性樹膠，確保片子不干；蓋上蓋玻片封片，擠出氣泡；后置于通風櫥中晾干8-12h。
[0153] 3.2小鼠腦切片免疫熒光染色
[0154] 組織切片用PBS洗3次，每次5min；用封閉液室溫封閉1h；吸去封閉液，加入封閉液稀釋的一抗4℃過夜(8-12h)；收集一抗，PBST洗3次，每次5min；加入相應的熒光二抗避光室溫作用1h；PBST洗3次，每次5min；貼片后加入一滴抗淬滅劑，蓋上蓋玻片，指甲油封片；避光晾干。
[0155] 3.3小鼠腦Brdu標記方法及免疫熒光染色
[0156] 8周齡成年小鼠腹腔注射Brdu，200mg/Kg，檢測增殖情況于2h后灌流取腦，4%PFA固定過夜；后置于30%蔗糖溶液至沉淀；后TFM包埋組織于-80℃速凍；切片之前2h，取出放到切片機的冷凍臺；滑動切片，切片厚度50μm，用毛筆將切片挑入到盛有0.01M PBS的培養(yǎng)皿中。也可挑入到防凍液中-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
[0157] 組織切片用PBS洗3次，每次5min；后用2N鹽酸變性DNA，37℃20min，迅速用0.1M硼酸鈉(pH8.5)中和，室溫12min；切片用PBS洗3次，每次5min；后用封閉液室溫封閉1h；吸去封閉液，加入封閉液稀釋的Brdu一抗4℃(24-48h)；收集一抗，PBST洗3次，每次10min；加入相應的熒光二抗，避光室溫作用2h；PBST洗3次，每次10min；貼片后加入一滴抗淬滅劑，蓋上蓋玻片，指甲油封片；避光晾干。
[0158] 3.4小鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)電鏡標本的制備及各指標的測量
[0159] 取8周齡雄性CRMP2Ctrl和cKO小鼠各4只，用數(shù)字編號以保證對基因型保密，到所有的測量和計算結(jié)束之后，才核對編號對應的基因型，以避免實驗人員偏見對結(jié)果的客觀性造成損害；戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，用預冷的0.1M PB沖血，后用冰上預冷的2%多聚甲醛/2.5%戊二醛混合灌流液灌流固定；斷頭剝離全腦置于小鼠腦模上，在距視交叉后緣1mm處向尾側(cè)切取2mm厚的組織切片；在體體視鏡載物臺上放上冰袋，滴兩滴灌流液在冰袋上，將組織浸入灌流液，在解剖鏡下去掉皮層，切取含海馬CA1區(qū)的組織塊約1mm3，整個過程保證組織塊被灌注液浸潤；將組織塊放入盛放有2mL2.5%戊二醛的EP管內(nèi)，4℃過夜前固定；0.1M PB洗三次，每次10min；1%OsO4，避光后固定1h，MilliQ H2O洗三次，每次15min；2%醋酸雙氧鈾組織塊染1h，MilliQ H2O洗三次，每次15min；梯度丙酮脫水，30%5min，50%5min，
70%5min，90%10min，100%5min，100%5min，100%10min；環(huán)氧樹脂Epon-812包埋，丙酮：樹脂Epon-812=2：11h，丙酮：樹脂Epon-812=2：21h，丙酮：樹脂Epon-812=1：21h，100%樹脂Epon-8124h，100%樹脂Epon-8124-12h，100%樹脂Epon-8124h；100%樹脂Epon-812包埋，
60℃聚合48小時；光學顯微鏡下修塊；2μm厚半超薄切片,甲苯胺蘭染色定位；切65nm超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色；在JEM-1400透射電子顯微鏡下觀察，以CA1區(qū)GrayⅠ型不對稱突觸為觀察對象，分別用CCD采集放大30K的圖像。形態(tài)計量學分析：用ImageJ軟件測量PSD的面積和寬度及厚度，用distance-between Polylines插件突觸間隙的距離。
[0160] 實施例1打靶載體的構(gòu)建
[0161] 1.1小鼠BAC DNA的提取
[0162] 將含有CRMP2基因組全長的BAC(RPCI23-414A17)DH10B的菌劃線在含有氯霉素的平板上，37℃培養(yǎng)10h，挑取5個單克隆，分別搖5mL菌，12h。13000rpm，1min收菌，加300μL P1(Tris50mM，EDTA10mM，pH8.0)懸菌，然后加300μL P2(0.2M NaOH，1%SDS)，混勻，室溫放置5min，然后加300μL P3(3M KAC，pH5.5)，輕搖放置2-5min，10000rpm，4℃，離心
10min。將上清轉(zhuǎn)移到新EP管中，然后加800μL預冷的異丙醇，顛倒混勻冰上放5min，4℃，
10000rpm，15min，去上清，沉淀用600μL70%乙醇洗滌兩次，晾干，加40μL雙蒸水，及1μL RNaseA，37℃溶解30min。
[0163] 1.2電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化
[0164] 從-80℃冰箱取出保存的工程菌EL350，在沒有抗生素的LB固體平板上劃線，32℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，接入10mL LB液體培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，過夜培養(yǎng)。按1：10-20的比例，將菌液轉(zhuǎn)接到50mL LB培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，培養(yǎng)2-4h，直至OD600達0.5左右。冰浴10min，收菌至1.5mL EP管中，4℃，4000rpm，1min。用預冷的雙蒸水洗菌三次，去除LB中的離子。最后用20-50μL雙蒸水懸起菌體。操作過程中保持低溫時是關鍵。可以加15%甘油將菌于液氮中速凍后保存于-80℃。也可直接電轉(zhuǎn)。
[0165] 將制備好的感受態(tài)和待轉(zhuǎn)質(zhì)?；蛘逥NA片段混勻，冰上放置10min，加入預冷電轉(zhuǎn)杯(0.1cm，Bio-Rad)中，1.75kV，25μF，200Ω，電擊完，迅速加入1mL無抗生素LB懸起菌體，吸至EP管中，32℃孵育1h，后涂于相應抗性的平板上。
[0166] 1.3熱擊電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化
[0167] 從-80℃冰箱取出保存的工程菌El350，在沒有抗生素的LB固體平板上劃線，32℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，接入10mL LB液體培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，過夜培養(yǎng)。按1：10-20的比例，將菌液轉(zhuǎn)接到50mL LB培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，培養(yǎng)2-4h，直至OD600到達0.5之間。將菌放于42℃水浴鍋中搖動15min，然后放冰上搖動3min，再置于冰上5min。收菌至1.5mL EP管中，4℃，4000rpm，1min。用預冷的雙蒸水洗菌三次，去除LB中的離子。最后用
20-50μL雙蒸水懸起菌體?？梢约?5%甘油將菌于液氮中速凍后，保存于-80℃。也可直接用于電轉(zhuǎn)。
[0168] 1.4打靶載體構(gòu)建過程
[0169] 1.4.1CRMP2基因打靶載體的構(gòu)建策略
[0170] 小鼠的CRMP2基因全長65825bp，一共有14個外顯子。在本實施例中，計劃敲除Exon3，該外顯子長185bp，敲除之后會導致移碼突變，從而導致CRMP2基因失活。
[0171] 首先利用同源重組方式套取一段10Kb左右包含Exon3的CRMP2基因組片段，然后利用同源重組和位點特異性重組，在這段序列的Exon3兩側(cè)各加上一個loxP位點和相應的篩選標記。利用Exon3兩側(cè)的同源序列做為重組臂，其中5'端重組臂長為3.8Kb，3'端重組臂長為2.1Kb。電轉(zhuǎn)打靶載體到ES細胞中，使得打靶載體和染色體上的CRMP2基因重組，從而完成對ES細胞基因的改造。具體打靶策略設計如圖1。
[0172] 1.4.2CRMP2基因打靶Mini-Targeting載體的構(gòu)建
[0173] 打靶載體的構(gòu)建需要先構(gòu)建三個中間載體(Liu et al.,2003)，分別命名為Pl253-Retriveval，Mini-Targeting-1，Mini-Targeting-2。以CRMP2-A，CRMP2-B，CRMP2-C，CRMP2-D，CRMP2-E，CRMP2-F，CRMP2-G，CRMP2-H，CRMP2-I，CRMP2-J，CRMP2-Y和CRMP2-Z為引物，以BAC RPCI23-414A17為模板擴增200-500bp的同源臂，分別命名為AB，CD，EF，GH，IJ，YZ。以質(zhì)粒PL253、PL451、PL452(購自National Cancer Institute at Frederic)及pBluescript(購自Stratagene公司)為基本骨架，利用酶切和連接的方法，分別構(gòu)建了含AB和YZ同源臂5888bp的PL253-Retrieval，含有CD和EF同源臂5420bp的Mini-Targeting-1及含有GH和IJ同源臂5520bp Mini-Targeting-2中間載體。
[0174] 1.4.3CRMP2基因打靶Retrieval載體的構(gòu)建
[0175] 首先從購自Invitrogen公司含BAC RPCI23-414A17的大腸桿菌DH10B中提取BAC質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)入工程菌EL350(E.coli)中，挑取轉(zhuǎn)入成功的克隆做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。同時利用Hind III酶切線性化PL253-Retrieval，電泳回收切開的片段，將該片段10-100ng電轉(zhuǎn)入含有RPCI23-414A17的EL350中，將電轉(zhuǎn)后的菌涂于含Amp抗性的平板上，挑選出發(fā)生位點特異性重組的克隆，同時提取質(zhì)粒進一步酶切鑒定。正確的陽性克隆命名為PL253-Retrieval-CRMP2。
[0176] 1.4.4CRMP2基因打靶First-Targeting載體的構(gòu)建
[0177] 將已得到的PL253-Retrieval-CRMP2電轉(zhuǎn)到普通EL350菌中，然后將其做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。同時用NotⅠ和SalⅠ切Mini-Targeting-1，回收含有Neo基因的片段，將100ng該片段電轉(zhuǎn)入含有PL253-Retrieval-CRMP2的EL350中，利用含Kana和Amp抗性平板篩選st同源重組的克隆，經(jīng)酶切鑒定確認。陽性克隆稱為PL253-CRMP2-1 targeting。
[0178] 1.4.5CRMP2基因打靶Pop Out載體的構(gòu)建
[0179] 將PL253-CRMP2-1stTargeting轉(zhuǎn)入阿拉伯糖誘導的EL350感受態(tài)中，誘導兩個loxp位點重組，得到PL253-CRMP2-Pop Out，酶切鑒定確認，兩個loxP已重組為一個。此時載體上只有一個loxP位點，Neo基因已移除，經(jīng)鑒定正確的克隆命名為PL253-CRMP2-Pop Out。其圖譜如圖2所示。
[0180] 1.4.6CRMP2基因打靶Second-Targeting載體的構(gòu)建
[0181] 將PL253-CRMP2-Pop Out轉(zhuǎn)入EL350中，做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，然后利用NotⅠ和SalⅠ切Mini-targeting-2，回收含有GH-Neo-IJ的片段。取100ng轉(zhuǎn)入含有PL253-CRMP2-Pop Out的EL350中，利用Kana和Amp雙抗性平板篩選陽性克隆。
[0182] 多酶切鑒定正確和相應片段測序正確的克隆命名為PL253-CRMP2-2ndTargeting，其圖譜和多酶切鑒定結(jié)果如圖3A和3B所示。
[0183] 1.4.7打靶載體PL253-CRMP2-2ndtargeting重組能力檢驗
[0184] 將構(gòu)建好的PL253-CRMP2-2ndtargeting載體轉(zhuǎn)入阿拉伯糖誘導的感受態(tài)，誘導重組酶產(chǎn)生，引發(fā)兩個loxP位點重組，切除中間的Exon3。經(jīng)PCR和測序鑒定與預期結(jié)果一致。
[0185] 1.4.8打靶載體PL253-CRMP2-2ndtargeting操作片段全測序
[0186] 為了確保在各個操作過程中沒有引物突變，對操作過的片段AB、CD、EF、GH、IJ、YZ、兩個loxP位點和Exon3進行測序驗證。測序結(jié)果與預期的一致。
[0187] 實施例2CRMP2基因敲除
[0188] 2.1基因打靶
[0189] 第1天：準備打靶載體，準備100mm滋養(yǎng)層細胞
[0190] 打靶載體準備：
[0191] 用NotI線性化打靶載體200μg(質(zhì)粒提取方式按照QiaGen EndoFree Plasmid Maxi Kit)，加兩倍體積無水乙醇，-80℃放置30min，12000rpm，30min，離心回收，70%乙醇洗滌兩次，晾干，50μL Milli-Q水溶解。
[0192] 小鼠原代成纖維(MEF)細胞復蘇培養(yǎng)：
[0193] 液氮中取出凍存的MEF細胞，37℃快速融化MEF滋養(yǎng)層細胞，加MEF培養(yǎng)基至總體積10mL，1000rpm離心，5min收集細胞。用10mL MEF培養(yǎng)基重懸細胞，種到100mm培養(yǎng)皿上。
[0194] 第2天：檢查滋養(yǎng)層細胞，復蘇ES細胞
[0195] 將前一日復蘇的滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)基換為ES培養(yǎng)基，3小時后復蘇ES細胞。融化ES細胞，直接加到含有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿上，不必離心收集細胞。ES細胞需要每天換新鮮的培養(yǎng)液。
[0196] 第3天：培養(yǎng)ES細胞，換液
[0197] 第4天：培養(yǎng)ES細胞，換液，如果生長密度大了，需要將ES細胞傳代[0198] ES細胞傳代：傳代前3個小時換液，之后用PBS洗ES細胞兩次，加Trypsin至覆蓋過ES細胞，放于37℃，消化8min。之后用Pipette吹打35-40次，將克隆吹打開。加等體積的ES培養(yǎng)基，中和Trypsin，1000rpm，離心3min，收集細胞，ES培養(yǎng)基重懸，加到新的含有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿上。
[0199] 第5天：培養(yǎng)ES細胞，換液
[0200] 第6天：電轉(zhuǎn)
[0201] 檢查ES細胞是否分化，保證電轉(zhuǎn)所用的ES細胞是沒有分化的。對于一次電轉(zhuǎn)，需7
要1×10 細胞，質(zhì)粒需要50-100μg。
[0202] 電轉(zhuǎn)方法：
[0203] 電轉(zhuǎn)之前3小時換ES培養(yǎng)基；PBS洗細胞兩次；Trypsin消化，37℃，8min；Pipette吹打細胞，使得細胞成為單細胞懸液；加等體積ES培養(yǎng)液中和trypsin；1000rpm，離心，7
5min；去除培養(yǎng)基，用ES培養(yǎng)基重懸ES細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度；取0.9mL含有1×10 細胞的培養(yǎng)液，加入質(zhì)粒，混勻，加入到0.4mmBio-Rad電擊杯中，室溫放置5min；電擊，500μF點亮，240V，電擊常數(shù)正常時約為6.9-7.9，7.2最好；將電擊后的細胞放到冰上2min，然后分到4個100mm含有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿。
[0204] 第7～14天：加藥篩選克隆
[0205] 36小時之后，將ES細胞培養(yǎng)基中加入G418和2μM Ganciclovir，前兩天用400μg/mL G418，后3-5天加200μg/mL G418，總共約篩選5-7天。
[0206] 第14天：準備96孔板的滋養(yǎng)層細胞
[0207] 種G418抗性的滋養(yǎng)層細胞到96孔板上，用于挑取克隆。
[0208] 第15～16天：挑取克隆
[0209] 挑克?。?/div>
[0210] 吸除96孔板中的滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)基，加入100μL的ES培養(yǎng)基;準備圓底的96孔板，加入30μL trypsin，一次準備一個;用5mL PBS洗長有ES細胞的培養(yǎng)皿兩次;ES培養(yǎng)皿中加入10mL PBS，用200μL的Pipette吸取15μL PBS，然后用此黃色tip挑取ES克隆到含有trypsin的96孔板上;將挑入圓底96孔板的ES克隆放于37℃，消化8min;加70μL ES培養(yǎng)基到消化的ES細胞中，吹打40次，至單細胞;將打散后的ES細胞放入含有滋養(yǎng)層細胞的96孔板中，不加G418;培養(yǎng)96孔板上的ES細胞，每天換液，等細胞長到90%覆蓋率。
[0211] 第17～19天：培養(yǎng)細胞
[0212] 培養(yǎng)挑取的96孔板的細胞，48小時后加150μg/mLG418。
[0213] 第20天：凍存以及擴增細胞
[0214] 凍存以及擴增細胞：
[0215] 凍存細胞之前3小時為ES細胞換新鮮培養(yǎng)液；將2×凍存液放到冰上;PBS洗細胞兩次;96孔板中每孔加50μL trypsin，37℃消化8min；加50μL ES細胞培養(yǎng)基中和trypsin，吹打40次；轉(zhuǎn)移50μL消化下來的細胞到含有50μL預冷的2×ES細胞凍存液的96孔板上,用封口膜包起來，放冰上20min，然后轉(zhuǎn)移到-80℃；96孔板中剩余的細胞加150μL ES培養(yǎng)液，培養(yǎng)3-4天，不需要滋養(yǎng)層細胞;細胞傳代時準備鋪Gelatin的平板；
加100μL明膠到96孔板的每個孔中,室溫放置30min，然后換為ES培養(yǎng)基；將96孔板上的細胞1:2傳代到含有明膠的96孔板上，用于基因組DNA的提取。
[0216] 第21～25天：培養(yǎng)細胞
[0217] 第26天：提取DNA
[0218] 2.2ES細胞基因組DNA的提取
[0219] 劃線標記96孔板蓋子和板子，吸出培養(yǎng)液，PBS洗細胞兩次。每孔加50μL DNA裂解液(50mL裂解液配方：Milli-Q Water32.72mL；1M Tris HCl(pH7.5)0.4mL；0.5M EDTA(pH8.0)0.8mL；10%SDS2mL；5M NaCl80μL；10mg/mL proteinase K4mL),放濕盒中，密封，保持內(nèi)部濕潤，56℃，過夜(12-16h)。每孔加100μL無水乙醇，用封口膜封住，室溫搖2小時，可見DNA沉淀于皿底，1500rpm，離心15min，輕輕倒去無水乙醇。每孔加200μL70%乙醇，洗滌三次。室溫晾干，約15-30min；每孔加40μL雙蒸水，濕盒中密封，56℃2小時，后放于4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
[0220] 2.3ES陽性細胞鑒定體系與條件
[0221] PCR擴增體系：
[0222]
[0223]
[0224] PCR擴增條件：
[0225]
[0226] 2.4ES細胞囊胚顯微注射
[0227] 2.4.1ES細胞的準備
[0228] 自凍存的96孔板上復蘇正確同源重組陽性的克隆，挑至含有滋養(yǎng)層細胞的24孔板上擴大培養(yǎng)，并凍存一部分細胞。同時將另一部分ES細胞同MEF cell一起用trypsin消化起來，鋪到含有明膠的培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)30min后，輕輕吹打ES細胞，此時滋養(yǎng)層基本已經(jīng)貼壁，所收集的細胞大多為ES細胞。
[0229] 2.4.2注射囊胚準備
[0230] 第1天，注射PMSG:
[0231] 準備8周大的C57BL/6J小鼠，雌性，20-30只，每只腹腔注射10U PMSG(16：00左右)。
[0232] 第3天，注射HCG，合籠:
[0233] 48小時后腹腔注射HCG，10U每只，注射完即合籠。每籠放1只雌鼠，1只8周以上可交配的C57BL/6J雄鼠。
[0234] 第4天，檢栓:
[0235] 早上8:00-10:00，檢栓，可借用彎頭鑷子，小鼠陰道口處的白色固體樣物質(zhì)為栓，將見栓小鼠挑出，標記。
[0236] 第6天，準備M2胚胎操作液，準備假孕母鼠
[0237] 將M2操作液分裝于1.5ml EP管中，開管口，放到37℃0.5%的CO2培養(yǎng)箱中，過夜。16:00，選發(fā)情的ICR雌鼠10只，與結(jié)扎的ICR雄鼠合籠。
[0238] 第七天，取E3.5的胚胎
[0239] 早9點以后，取見栓后的小鼠，斷頸，酒精噴洗腹部，剪開腹腔，將兩側(cè)的子宮連同輸卵管的膨大的腹部一起剪下，放到35mm培養(yǎng)皿中，1mL注射器吸取1mLM2胚胎，自子宮下角插針，將胚胎沖出。M2洗兩次。待注射ES細胞。
[0240] 2.4.3.干細胞囊胚顯微注射及胚胎植入
[0241] 顯微操作，用機械手臂操作毛細玻璃吸管，吸取形態(tài)圓潤的干細胞，注射到胚胎的囊胚腔中，每個胚胎植入干細胞15個左右。注射阿佛丁麻醉代育ICR假孕雌鼠(0.2mL/10g)，將注射干細胞后的胚胎植入假孕鼠的子宮中，自小鼠腰部剪開皮膚，用鑷子夾出子宮，用1mL注射器刺破一個開口，然后將胚胎放到子宮里。然后將拉出的子宮送回小鼠體內(nèi)，針線縫合皮膚。小鼠放白熾燈下(利用白熾燈溫度，不直接接觸)半小時左右蘇醒，然后放回鼠房培養(yǎng)，待產(chǎn)仔
[0242] 2.5反轉(zhuǎn)錄及Real-Time PCR
[0243] 25μL反轉(zhuǎn)錄體系，取3μL所提取的RNA(500ng/μL)，1μL Oligo(dT)15(50μM)，13.15μL DEPC處理雙蒸水，70℃熱擊5min，然后立即放冰上；加入下一組分，5μL5×MMLV Buffer，1.25μLdNTP(10mM)，0.6μL RNase inhibitor，1μL MMLV，冰上混勻，37℃，1h。結(jié)束后，在反應體系中加入75μL DEPC處理雙蒸水；之后取2μLcDNA作為Real-Time-PCR模板。
[0244] 熒光定量PCR反應體系：20μL
[0245]
[0246] 反應條件：
[0247]
[0248] 2.6數(shù)據(jù)處理：
[0249] 通過分析產(chǎn)物的溶解曲線確定擴增的特異性，靶基因相對表達量由以下公式算-△△Ct出：2 。Ct值反映了目的片段擴增到一定量拷貝數(shù)是所需反應循環(huán)數(shù)的大小。Ct值越-△△Ct
大表明參與反應的起始模板量就越小。所以用2 可以反應基因的相對表達量。
[0250] 結(jié)果
[0251] CRMP2打靶ES細胞的篩選與鑒定
[0252] 將經(jīng)NotⅠ線性化后的打靶載體電轉(zhuǎn)ES細胞，經(jīng)G418和Ganciclovir正負篩選之后，一共挑取了288個ES細胞克隆。用位于第一個loxP位點左右兩側(cè)的引物CRMP2-loxP-F和CRMP2-loxP-R檢測loxP位點是否整合進入ES細胞基因組，經(jīng)PCR確定有60個ES細胞克隆中含有l(wèi)oxP位點。為了進一步排除隨機插入用位于打靶載體同源臂3'端外側(cè)的引物CRMP2-3'-F與位于打靶載體Neo上的引物CRMP2-3'-R，組成引物對檢測含loxP位點的ES細胞克隆3'是否發(fā)生正確的同源重組，經(jīng)檢測有5個ES細胞克隆3'端是正確同源重組。為了確定這5個ES細胞克隆的5'端是否發(fā)生正確同源重組，用位于打靶載體同源臂5'端外側(cè)的引物CRMP2-5'-F與位于打靶載體Neo上的引物CRMP2-5'-R，組成引物對檢測確定有2個ES細胞克隆5'端同時正確同源重組，即確定篩選出兩個正確同源重組的ES細胞克隆。用于后續(xù)的囊胚顯微注射(圖4)。
[0253] 實施例3動物模型的制備
[0254] 3.1CRMP2嵌合小鼠與F1代小鼠的獲得
[0255] 將鑒定為陽性的ES細胞克隆復蘇進行囊胚顯微注射共注射90個囊胚，每個胚胎注入15個ES細胞，然后將90個胚胎移植入8只ICR假孕母鼠子宮中。19天后產(chǎn)出18只子鼠，存活10只嵌合體，其中6只為雄鼠，如圖2-6所示，只有1只的嵌合度為30%左右，其余5只為全身灰。用獲得的6只雄鼠分別與C57BL/6J的雌鼠交配。其中有2只全身灰的小鼠不育，另外4只小鼠可育(圖5)。
[0256] 3.2CRMP2條件基因敲除小鼠的繁殖策略
[0257] 嵌合體雄性小鼠與C57BL/6J雌鼠交配后生下的陽性CRMP2flox/+，定義為F1代。F1的CRMP2flox/+雌鼠與雄性CRMP2flox/+交配得到純合的CRMP2flox/flox，出生比例符合孟德爾分離比例，CRMP2flox/flox小鼠形態(tài)體重都與同窩的野生型小鼠沒有差異。為了特異地在神經(jīng)細胞中敲除CRMP2基因，把CRMP2flox/flox小鼠與工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠。再把CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠與CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神經(jīng)細胞中特異敲除CRMP2基因的小鼠簡稱cKO小鼠(即神經(jīng)特異性的CRMP2失活小鼠)，取同窩出生同性別的CRMP2flox/+；Nestin-Cre和CRMP2flox/flox基因型小鼠作為對照小鼠，用于確定CRMP2基因的生理功能(圖6)。
[0258] 3.3CRMP2基因敲除小鼠的鑒定
[0259] CRMP2cKO小鼠與Ctrl小鼠的出生比例符合孟德爾分離比例，說明CRMP2cKO小鼠能出生并且存活。為了證明確實在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中把CRMP2敲除，在基因組水平，用CRMP2-269-F和CRMP2-269-R引物檢測CRMP2flox/flox小鼠的基因組DNA可得到一條269bp的條帶，檢測CRMP2flox/+小鼠的基因組DNA可得到一條269bp和一條171bp的條帶，而檢測CRMP2+/+的基因組DNA則可得到一條171bp條帶，如果是條件基因敲除的小鼠的在基因組水平還應該帶有Cre基因，用Cre-531和Cre-819這一對引物檢測，含有Cre基因的小鼠可以檢測到一條288bp的條帶(圖7A)。為了進一步確認我們確實是只敲除了CRMP2基因，我們用熒光定量PCR方法檢測了CRMPs家族的各個基因mRNA的表達情況，結(jié)果表明我們確實是特異敲了CRMP2，在轉(zhuǎn)錄水平上家族的其他成員并沒有受到影響(圖7B)。為了確認用nestin-Cre確實可以在蛋白水平上把CRMP2基因的敲除了，分離了小鼠各個腦區(qū)的蛋白，通過蛋白免疫印跡方法和免疫熒光的方法檢測表達水平，實驗結(jié)果表明在各個腦區(qū)CRMP2都被敲除了(圖7C和7D)。
[0260] 以上結(jié)果說明，在制備的動物模型體內(nèi)，CRMP2被敲除了。
[0261] 實施例4對大腦特異性CRMP2敲除小鼠的形態(tài)學和行為學分析
[0262] 按通用方法中所述的方法，進行常規(guī)體重分析，Nissl染色、免疫熒光染色、行為學分析、海馬區(qū)突觸后致密組分分離檢測和突觸超微結(jié)構(gòu)觀察和定量分析。結(jié)果如下：
[0263] 結(jié)果
[0264] 1.大腦特異性CRMP2敲除小鼠形態(tài)學分析
[0265] 1.1大腦特異性CRMP2敲除小鼠體重減輕
[0266] CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠的出生比例符合孟德爾定律，形態(tài)未見明顯異常，通過檢測小鼠的體重，結(jié)果表明出生后8周cKO小鼠的體重相對于Ctrl大約有10%的減輕(圖8A)。為了進一步確認體重的減輕是否會導致腦發(fā)育的異常，我們對8周齡的cKO和Ctrl小鼠的大腦形態(tài)進行分析，結(jié)果表明大腦的重量和周長大小都沒有明顯差別(圖8B)。為了確認小鼠腦的精細結(jié)構(gòu)是否有異常，我們進行了Nissl染色，實驗結(jié)果表明小鼠的各個腦區(qū)未見明顯異常(圖8C)，為了進一步確認小鼠皮層神經(jīng)元的分層是否異常，我們進行了成熟神經(jīng)元特異的標志物NeuN染色，結(jié)果表明皮層成熟神經(jīng)元的分布正常(圖8D)。綜合以上結(jié)果表明大腦特異性CRMP2敲除并沒有影響成年小鼠大腦皮層的基本形態(tài)。
[0267] 1.2大腦特異性CRMP2敲除小鼠胚胎期的皮層神經(jīng)元分層基本正常
[0268] 因為之前的顱內(nèi)電轉(zhuǎn)實驗表明在胚胎期敲減CRMP2會導致神經(jīng)元的遷移異常。為了檢驗在我們的基因敲除系統(tǒng)中是否有同樣的表型，我們用各層神經(jīng)元特異的標記物標記各層的神經(jīng)元，比較胚胎期E18.5天Ctrl和cKO小鼠皮層的分層情況，其中Tbr1第6層神經(jīng)元的標記物，免疫熒光染色結(jié)果表明其厚度和分布都沒有明顯異常(圖9A)，SATB2第2層和第4層的標記物，免疫熒光染色結(jié)果表明其厚度和分布都沒有明顯異常(圖9B)，F(xiàn)oxP1和CTIP2都為第5層的標記物，染色結(jié)果表明第5層神經(jīng)元的厚度和分布正常(圖9C和9D)。綜合以上結(jié)果表明大腦特異性CRMP2敲除小鼠胚胎期的皮層神經(jīng)元分布基本正常。
[0269] 2、大腦特異性CRMP2敲除小鼠行為學分析
[0270] 2.1大腦特異性CRMP2敲除小鼠自發(fā)活動水平增加
[0271] 運動行為是動物最基本的行為表現(xiàn)，廣泛用于評價基因變化或藥物對動物一般性活動的影響。這種活動既不需要學習記憶的參與，也不存在條件或非條件反射，只是在沒有外界環(huán)境干擾情況下測定到的動物的自主運動。因此也叫自發(fā)活動(spontaneous locomotor activity)。開放場實驗是評價動物自發(fā)活動廣泛使用的方法，評價指標包括動物運動的總路程和在中間區(qū)域所占時間比例。
[0272] 開放場儀器包括4個活動箱，每次每個箱內(nèi)放入一只小鼠進行測試，測試時間5分鐘。箱子頂部的攝像頭全程錄像，所有實驗完畢后用軟件分析每只小鼠的運動路徑，計算總的運動距離。結(jié)果顯示，CRMP2Ctrl小鼠運動的總路程為32.38±2.49m，CRMP2cKO小鼠運動的總路程為41.92±2.71m。在運動的中距離上cKO小鼠明顯高于Ctrl小鼠，經(jīng)獨立樣本t-檢驗P=0.0163，表明Ctrl小鼠和cKO小鼠間在運動的總路程上差異顯著(圖10A)。我們還分析實驗過程中小鼠處在開放場中間區(qū)域所占時間的比例，結(jié)果顯示Ctrl小鼠處在中間區(qū)域所占時間比例為14.03±2.421%，cKO小鼠處在中間區(qū)域所占時間的比例為15.18±2.203%，經(jīng)獨立樣本t-檢驗P=0.7283，表明Ctrl小鼠和cKO處在中間區(qū)域所占時間比例沒有顯著性差異(圖10B)。根據(jù)以上的結(jié)果說明cKO小鼠在自發(fā)活動顯著增強，焦慮樣行為并沒有異常。
[0273] 2.2大腦特異性CRMP2敲除小鼠焦慮樣行為正常
[0274] 高架十字迷宮是利用動物對新特異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮水平。高架十字迷宮具有一對開臂和一對閉臂，小鼠由于有嗜暗性傾向于在閉臂中活動，但是出于好奇心和探究性又會在開臂中活動，在面對新奇刺激時小鼠同時產(chǎn)生探究的沖動和恐懼，造成了探究與回避的沖突行為，從而產(chǎn)生類似于人類的焦慮樣心理。評價的主要指標是在開臂和閉臂的活動時間，計算出在開臂活動的活動時間占觀察總時間的比例，在開臂活動的時間比例越低說明小鼠的焦慮情緒越嚴重。為了考察CRMP2cKO小鼠是否有更嚴重的焦慮樣行為，我們進行了高架十字迷宮實驗。實驗結(jié)果顯示cKO小鼠在開臂活動時間的比例為35.25±5.208%，Ctrl小鼠在開臂的活動時間比例為29.24±3.817%，統(tǒng)計分析顯示兩組小鼠在統(tǒng)計學上沒有顯著差異(圖10C)。在開放場實驗中cKO小鼠在中間區(qū)域所占時間比例與Ctrl小鼠在中間區(qū)域所占時間比例也沒有顯著差異，綜合這兩個結(jié)果說明cKO小鼠在焦慮樣行為上沒有異常。
[0275] 2.3大腦特異性CRMP2敲除小鼠抑郁樣行為增加
[0276] 強迫游泳實驗中小鼠放入盛水的玻璃缸內(nèi)強迫游泳。小鼠最初在水中拼命游動掙扎試圖逃脫，當感到無法逃脫時便放棄掙扎和游動，僅僅將頭露出水面，肢體漂浮，維持一種不動的狀態(tài)，稱之為絕望行為。反應絕望行為的指標是小鼠在單位時間內(nèi)維持絕望行為所占的時間。在我們的實驗結(jié)果顯示在記錄的6min中，Ctrl小鼠在水中保持不動的時間為224.1±11.19sec(n=10)，而cKO小鼠在水中保持不動的時間為279.1±8.561sec(n=14)，統(tǒng)計分析顯示兩組小鼠在統(tǒng)計學上存在顯著差異(P=0.001)(圖11A)。同樣，反映小鼠抑郁樣行為的懸尾實驗，結(jié)果顯示Ctrl小鼠保持不動的時間為128.7±14.84sec(n=9)，而cKO小鼠保持不動的時間為232.5±12.19sec(n=12)，統(tǒng)計分析顯示兩組小鼠在統(tǒng)計學上存在顯著差異(P<0.0001)(圖11B)。又因為正常的嚙齒類動物都會偏愛蔗糖水，而具有抑郁樣行為的小鼠對蔗糖水的偏好性會降低。蔗糖水的偏好實驗結(jié)果表明Ctrl小鼠對蔗糖水的偏好率為61.34±5.312%(n=8)，而cKO小鼠對蔗糖歲的偏好率為44.08±4.152%(n=12)，統(tǒng)計結(jié)果顯示兩組小鼠在這糖水偏好性上存在顯著差異(P=0.0227)(圖11C)。綜合上面的三個實驗結(jié)果說明cKO小鼠抑郁樣的行為增加。
[0277] 2.4大腦特異性CRMP2敲除小鼠具有孤獨癥樣行為學表型
[0278] 我們觀察了同一窩小鼠(包括父母和不同基因型的后代)的社交行為。一些大腦特異性CRMP2敲除小鼠，如圖12右上角的小鼠所示，極力避開與其他家庭成員的接觸包括父母在內(nèi)，與孤獨癥非常類似。
[0279] 2.5大腦特異性CRMP2敲除小鼠空間學習和記憶能力降低
[0280] 暗示與關聯(lián)條件恐懼也叫場景恐懼實驗，是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學習、記憶不悅經(jīng)歷和環(huán)境暗示之間關聯(lián)的能力。在本實驗中以厭惡刺激(足點擊)作為非條件刺激，通過訓練目的使小鼠建立電擊與周圍環(huán)境之間的聯(lián)系，即所謂的關聯(lián)條件恐懼。恐懼作為非靈長類動物少有的幾種情感反應之一，動物經(jīng)歷條件恐懼后，當再次接觸條件刺激時，會產(chǎn)生一系列的生理反應，包括自主神經(jīng)緊張，應激激素分泌增加以及防御行為增多等等。凝滯即是動物防御行為的一種，是指動物除呼吸之外沒有其他的活動。它被認為是評價嚙齒動物恐懼的可靠指標。參與條件關聯(lián)學習過程的腦區(qū)主要為杏仁核和海馬。前者調(diào)節(jié)恐懼，后者調(diào)節(jié)與恐懼事物相關聯(lián)的學習認知。所以，這一模型主要用于檢測杏仁核和海馬依賴的學習記憶。
[0281] 實驗的第一階段，即訓練期，目的是讓動物建立起環(huán)境和厭惡性刺激(足電擊)之間的關聯(lián)。第二階段，即測試期，目的是觀察環(huán)境是否能引起動物對足部電擊的記憶，以及這種記憶的牢固程度。
[0282] 從訓練期的結(jié)果看，隨著時間和足電擊次數(shù)的增加，小鼠的凝滯比率逐漸增加。從訓練24小時后測試期結(jié)果看Ctrl小鼠的凝滯比率為Ctrl79.29±2.184%(n=14)明顯高于cKO小鼠67.93±4.097%(n=14)，統(tǒng)計學上具有顯著差異(P=0.0127)(圖13A)。以上結(jié)果提示，cKO小鼠恐懼相關的長時程記憶受損。
[0283] 在水迷宮實驗定位航行訓練階段，隨著訓練天數(shù)的增多，野生型小鼠尋找站臺的潛伏期逐漸縮短，但是敲除小鼠在第三天之后尋找站臺的潛伏期卻未 見 明 顯 縮 短，第 一 天 Ctrl52.806±2.366Vs cKO56.399±1.672sec(P>0.05)，第 二 天 Ctrl33.5±6.233sec Vs cKO42.7222±3.348sec(P>0.05)， 從 第三 天 Ctrl25.778±2.337sec Vs cKO47.333±4.92sec(P<0.001), 第 四 天Ctrl24.194±1.654sec Vs cKO39.056±4.49sec(P<0.05)，第五天Ctrl22.139±2.638Vs cKO39.861±4.978sec(P<0.01)，(圖13B)。
[0284] 在水迷宮空間探索實驗階段，移去平臺，小鼠從原平臺所在目標象限的對側(cè)入水，記錄小鼠在原平臺所在目標象限的停留時間，觀察時間為60秒。Ctrl小鼠在原平臺象限停留的時間比例為55.48±4.422%(n=9)，而cKO小鼠為31.59±6.998%(n=9)，統(tǒng)計分析顯示存在顯著差異(P=0.0108)(圖13C)。以上結(jié)果說明cKO小鼠空間學習記憶能力受損[0285] 2.6大腦特異性CRMP2敲除導致精神分裂癥樣行為
[0286] 前脈沖抑制(Prepulse inhibition，PPI)是一種神經(jīng)學上的現(xiàn)象，是指在強的驚反射刺激之前一定時間內(nèi)的弱刺激會對強刺激的驚反射幅度產(chǎn)生抑制的現(xiàn)象。它是衡量感覺運動門控功能的重要指標。因為精神分裂癥的病人存在前脈沖抑制受損的現(xiàn)象，而且前脈沖抑制還是哺乳動物中共有的一種現(xiàn)象，人類和嚙齒類動物測量前脈沖抑制時所采用的刺激參數(shù)非常相似，所以前脈沖抑制常常作為評判精神分裂癥動物模型的重要指標。
[0287] 在單獨的驚反射刺激下，Ctrl和cKO小鼠隨著驚反射刺激強度的增加，驚反射幅度都逐漸增加，但是兩組小鼠在給予相同強度的驚反射刺激時驚反射的幅度并沒有顯著差異(圖14A)。當給予不同強度的前刺激時，cKO小鼠對強刺激的驚反射幅度的抑制作用明顯弱于Ctrl小鼠。兩兩相比結(jié)果顯示，當前刺激強度分別高于北京4、8和12dB時，cKO小鼠前脈沖抑制率分別為均低于Ctrl小鼠，統(tǒng)計學顯示差異顯著(+4dB：Ctrl45.746±2.737%Vs cKO24.384±4.785%,P<0.01;+8dB Ctrl47.171±3.657%Vs cKO24.933±8.491%,P<0.01;+12dBCtrl48.318±3.439%Vs cKO32.927±5.267%,P<0.05;Ctrl n=13,cKO n=13)(圖14B)，以上結(jié)果表明大腦特異性CRMP2敲除小鼠前脈沖抑制明顯受損。
[0288] 筑窩能力是動物為了防止熱量喪失和保護自己所需的基本技能，是小鼠社會性行為的表現(xiàn)。當分別給Ctrl和cKO小鼠相等量的棉花和同樣的時間，然后對這兩組的筑窩能力評分(圖14C&14D)，結(jié)果表明cKO小鼠的筑窩能力明顯低于Ctrl小鼠(Ctrl3.829±0.4612n=7Vs cKO2.138±0.4758n=8,P=0.0249)，提示cKO小鼠的社會性行為異常。
[0289] 綜合以上兩個結(jié)果，提示我們大腦特異性CRMP2敲除小鼠可能存在精神分裂癥樣的行為。
[0290] 3大腦特異性CRMP2敲除小鼠海馬突觸后致密區(qū)中NR2B和NR1量減少[0291] cKO小鼠學習和記憶能力的下降提示海馬的突觸可塑性可能發(fā)生變化，而突觸可塑性的變化往往伴隨突觸后致密區(qū)上受體量的變化。AMPA受體介導短時程的可塑性，AMPA受體是由多種亞基組成的四聚體，有4種亞基可以組裝成AMPA受體：GluR1、GluR2、GluR3和GluR4，而海馬中絕大多數(shù)AMPA受體是而海馬中絕大多數(shù)的AMPA受體是GluR1-GluR1-GluR2-GluR2組合，另有少量的GluR3-GluR3-GluR4-GluR4組合。NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一個亞型，功能性的NMDA受體必須含有NR1亞基，多個NR2亞基和NR1共同形成四聚體或五聚體，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、軸突、樹突發(fā)育及突觸可塑性的形成。我們通過超速離心方式分離了海馬區(qū)突觸后致密區(qū)組分和免疫印跡的方式，首先檢測了分離組分的純度和確定了CRMP2在該組分中被敲除，其次檢測了突觸后致密區(qū)AMPA受體和NMDA受體各個亞基的含量，結(jié)果表明分離的突觸后致密區(qū)組分是純的而且CMRP2在敲除小鼠海馬的突觸后致密區(qū)確實被敲除了(圖15A)，結(jié)果還表明NMDA受體的NR1亞基和NR2B亞基在突觸后致密區(qū)的量明顯減少(圖15B)。
[0292] 4大腦特異性CRMP2敲除小鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)觀察
[0293] CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠學習和記憶能力下降提示海馬突觸的可塑性發(fā)生異常，而可塑性的變化與突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關。我們通過透射電鏡觀察CA1區(qū)放射層的不對稱突觸即興奮性突觸(圖16A)，該突觸的特點是由CA1錐體細胞的樹突干或樹突棘形成突觸后膜，突觸前成分主要來自CA3椎體細胞的軸突。我們對CA1區(qū)放射層興奮性突觸的各個指標進行量化分析結(jié)果表明，CRMP2敲除小鼠突觸間隙的寬度沒 有 明 顯 區(qū) 別 (Ctrl:23.10±0.2379nm,n=200vs CRMP2cKO:23.48±0.25nm,n=170)(圖16B)，突觸后致密組分的長度沒有明顯變化(Ctrl:231.3±3.562nm,n=282vs CRMP2cKO:235.3±4.235nm,n=269)(圖16C)，突 觸 后 致 密 組 分 的 面 積 明 顯 變小 (Ctrl:7723±193.9nm2,n=282vs CRMP2cKO:7076±193.2nm2,n=269,P=0.0187)(圖16D)及突觸后致密組分 厚度明顯變薄(Ctrl:33.07±0.5637nm,n=282vs CRMP2cKO:29.89±0.5116nm,n=269，P<0.0001)(圖16E&16F)。
[0294] 5CRMP2神經(jīng)細胞特異敲除小鼠電生理上特性分析
[0295] 5．1cKO小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1區(qū)突觸的基礎突觸傳遞正常
[0296] 突觸基本的屬性包括突觸對神經(jīng)沖動的傳導和反應，可以通過繪制反映fEPSP和刺激強度或突觸前纖維群峰(fiber volley)對應關系的刺激-反應曲線(input-output curve)來表征。比較同一刺激強度引發(fā)的EPSP slope大小，結(jié)果表明cKO小鼠與Ctrl小鼠腦片在不同刺激強度下EPSP slope沒有顯著差異(圖17A)。說明cKO小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1區(qū)突觸的基礎突觸傳遞是正常的。
[0297] 5.2cKO小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1突觸的雙脈沖易化效應正常
[0298] 雙脈沖易化(paired-pulse facilitation，PPF)被定義為間隔一定時間的前后兩個刺激所引發(fā)的兩個反應(EPSP1和EPSP2)中，第二個反應(EPSP2)比第一個反應(EPSP1)增加的程度，被認為是一個表征突觸前釋放能力變化的電生理指標。比較同一間隔下Ctrl和cKO小鼠EPSP2/EPSP1值，發(fā)現(xiàn)兩組之間沒有顯著差異(圖17B)。以上結(jié)果說明大腦特異性CRMP2敲除并沒有影響小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1突觸的突觸前短時程可塑性。
[0299] 5.3cKO小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1突觸的長時程增強受損
[0300] 長時程增強是指給突觸前纖維一個短暫的高頻刺激后，突觸傳遞效率和強度增加幾倍且能持續(xù)數(shù)小時甚至幾天保持這種增強的現(xiàn)象，它是突觸可塑性的一種模式，NMDA受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后，導致細胞內(nèi)級聯(lián)反應，觸發(fā)神經(jīng)元內(nèi)一系列生化反應，最終改變突觸后膜的性質(zhì)，建立LTP。使用TBS在海馬謝弗側(cè)支CA1誘發(fā)LTP，可以明顯看出敲除小鼠刺激后的EPSP遠低于對照(P<0.001)(圖17C)。
[0301] 6大腦特異性CRMP2敲除小鼠海馬齒狀回成年新生神經(jīng)元的發(fā)生減少[0302] 越來越多的證據(jù)提示海馬齒狀回區(qū)成年新生神經(jīng)元發(fā)生(adult neurogenesis)的減少可能與多種神經(jīng)精神疾病密切相關(Ming and Song,2011；Winner et al.,2011；Mu and Gage,2011)，為此我們用Brdu標記的方法檢測了大腦特異性CRMP2敲除小鼠成年神經(jīng)前體細胞的增殖情況，結(jié)果表明敲除小鼠齒狀回區(qū)神經(jīng)前體細胞的增殖減少，但是凋亡并沒有顯著增加(圖18A-D)。
[0303] 實施例4
[0304] 用治療精神分裂癥的藥物驗證藥物篩選平臺
[0305] 在本實施例中，給實驗小鼠注射當前臨床治療精神分裂癥的藥物利司培酮或奧氮平，隨即進行驚反射前脈沖抑制行為學測試和分析。
[0306] 結(jié)果表明，利司培酮對模型小鼠驚反射前脈沖抑制作用有不同程度的恢復。
[0307] 藥物奧氮平(Olanzapine)能精神分裂癥的癥狀起到緩解甚至消除的作用。這進一步證明已建立的小鼠模型與人類的精神分裂癥確實存在著相關性。
[0308] 實施例5
[0309] 利用精神分裂癥藥物篩選平臺篩選候選藥物
[0310] 在本實施例中，計劃通過給實驗小鼠注射藥物候選神經(jīng)精神疾病的治療藥物，隨即進行驚反射前脈沖抑制等行為學測試和分析。通過與給安慰劑的實驗小鼠比較驚反射前脈沖抑制作用等行為學指標的差異，能夠改善行為學指標的候選藥物，即為該神經(jīng)精神疾病的潛在治療藥物。
[0311] 其它神經(jīng)精神類疾病也可以參照上述方法，采用相應的行為學指標進行候選藥物篩選。
[0312] 討論
[0313] 人類的精神行為是異常復雜的，受許多因素影響，有外因和內(nèi)因的作用，在人類的基礎上直接研究精神疾病，受到倫理、統(tǒng)計和不可操作性等許多因素的影響。用實驗動物來建立精神疾病動物模型，將現(xiàn)實疾病的復雜性簡化成具體的、可控制的影響因素，對于了解和闡明精神疾病發(fā)病機制，量化精神疾病的診斷指標具有重要意義；同時在藥物篩選或新藥鑒定中也將發(fā)揮作用，成為新藥開發(fā)的重要工具。
[0314] 實驗小鼠因其基因組成研究基礎好以及與人類遺傳的同源性，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)指導的行為與人類的大量神經(jīng)活動具有高度的可比性，成為這一研究中具有其他實驗材料無可比擬優(yōu)越性的首選實驗動物。
[0315] 本發(fā)明中通過敲除等手段使得CRMP2基因失活后，小鼠都出現(xiàn)了類似精神分裂癥癥狀，得到了類似的實驗結(jié)果，從而進一步證明了該動物模型的有效性和可重復性。
[0316] 蛋白質(zhì)組學的研究表明，在精神分裂癥病人的腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)中許多蛋白的表達水平存在變化，然而不同研究者報道的情況也不盡相同。Edgar通過比較蛋白質(zhì)組分析研究在精神分裂癥病人的海馬中CRMP2的表達上調(diào)(Edgar,P.F.(2000).Comparative proteome analysis.Tissue homogenate from normal human hippocampus subjected to two-dimensional gel electrophoresis and Coomassie blue protein staining.Mol Psychiatry5,8,85-90.)，在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇病人的海馬組織中CMRP2的表達量下調(diào)(Czech,T.,Yang,J.W.,Csaszar,E.,Kappler,J.,Baumgartner,C.,and Lubec,G.(2004).Reduction of hippocampal collapsin response mediated protein-2in patients with mesial temporal lobe epilepsy.Neurochem Res29,2189-2196.)。
[0317] CRMP2的表達水平在一些神經(jīng)退行性疾病(譬如老年癡呆、帕金森氏病和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病)中發(fā)生改變，提示這些蛋白可能在這些疾病病理發(fā)生過程中具有重要作用(Johnston-Wilson,N.L.,Sims,C.D.,Hofmann,J.P.,Anderson,L.,Shore,A.D.,Torrey,E.F.,and Yolken,R.H.(2000).Disease-specific alterations in frontal cortex brain proteins in schizophrenia,bipolar disorder,and major depressive disorder.The Stanley Neuropathology Consortium.Mol Psychiatry5,142-149)。
[0318] 本發(fā)明動物模型與其他一些現(xiàn)有的精神分裂癥候選基因被敲除后的動物模型的比較見下表：
[0319]
[0320] +指受損或表現(xiàn)出神經(jīng)精神相關表型
[0321] -指無表型或未檢測
[0322] 綜上所述，本研究通過基因敲除技術(shù)建立了大腦特異性CRMP2和全身敲除的小鼠模型。通過小鼠行為學檢測，發(fā)現(xiàn)大腦特異性CRMP2敲除小鼠自發(fā)活動水平增加，抑郁樣行為增加和精神分裂癥樣的行為學表型，部分小鼠表現(xiàn)出典型的孤獨癥表型。對海馬組織突觸后膜致密組分中AMPA受體亞基和NMDA受體亞基的免疫印跡分析表明敲除小鼠中海馬PSD組分中NR1和NR2B的量顯著降低；通過透射電鏡對海馬CA1區(qū)放射層非對稱突觸的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠在該區(qū)的PSD面積明顯變小，厚度變薄；通過電生理技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲除小鼠海馬謝弗側(cè)支CA1區(qū)突觸的基礎傳遞和突觸前膜的遞質(zhì)釋放正常，但是TBS誘導產(chǎn)生的長時程增強卻明顯受損。同時該基因敲除小鼠齒狀回中成年神經(jīng)干細胞增殖明顯減少。
[0323] 本發(fā)明人在全身CRMP2敲除中發(fā)現(xiàn)與一些與大腦特異性CRMP2敲除類似的表型。因此，不同的CRMP2基因敲除小鼠模型可作為一種有效的神經(jīng)精神疾病動物模型包括精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥和老年癡呆，可以廣泛用于特定藥物的篩選和測試試驗。相對于上表中的其它動物模型，CRMP2基因敲除小鼠模型表現(xiàn)出更多的與神經(jīng)精神疾病相關的表型，更有利于上述疾病的機制研究和篩選相關疾病的分子標記和治療藥物。
[0324] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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專利匯分析報告產(chǎn)品可以對行業(yè)情報數(shù)據(jù)進行梳理分析，涉及維度包括行業(yè)專利基本狀況分析、地域分析、技術(shù)分析、發(fā)明人分析、申請人分析、專利權(quán)人分析、失效分析、核心專利分析、法律分析、研發(fā)重點分析、企業(yè)專利處境分析、技術(shù)處境分析、專利壽命分析、企業(yè)定位分析、引證分析等超過60個分析角度，系統(tǒng)通過AI智能系統(tǒng)對圖表進行解讀，只需1分鐘，一鍵生成行業(yè)專利分析報告。

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