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一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器及其制備方法和檢測方法

閱讀：525發(fā)布：2020-05-11

專利匯可以提供一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器及其制備方法和檢測方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 揭示了一種基于磁分離技術(shù)和 微 流體 技術(shù) 的快速檢測微流體反應(yīng)器，包括 磁性 蛋白和探針蛋白，所述磁性蛋白為以磁性微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，所述探針蛋白為以探針微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，且所述磁性蛋白和探針蛋白根據(jù)所述待測物的性質(zhì) 配對 組合使用。本發(fā)明實現(xiàn)了磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的組合使用，達(dá)到降低干擾，提高檢測結(jié)果的精確度，準(zhǔn)確性和靈敏度的作用，提高了反應(yīng)效率，反應(yīng)與分離同時進(jìn)行，操作簡單、快速，可適用于多種領(lǐng)域的 生物 樣品的定性定量檢測。，下面是一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器及其制備方法和檢測方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其特征在于：包括磁性蛋白和探針蛋白，所述磁性蛋白為以磁性微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，所述探針蛋白為以探針微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，且所述磁性蛋白和探針蛋白根據(jù)所述待測物的性質(zhì)配對組合使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其特征在于：所述磁性微球的材料包括順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料和變磁性材料，且其比飽和磁化強(qiáng)度大于等于0.1 emu/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其特征在于：所述磁性微球的粒徑為50納米~500納米，所述探針微球的粒徑為50納米~500納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其特征在于：所述磁性蛋白和探針蛋白之間的配對組合使用方式包括捕獲法、雙抗原夾心法、雙抗體夾心法、間接法和競爭法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其特征在于：還包括至少一個的加樣孔、反應(yīng)及檢測通道和廢液收集池，所述磁性蛋白和探針蛋白經(jīng)干燥固定在所述加樣孔的底部。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
（1）采用在磁性納米粒子的內(nèi)核表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料的方法或向表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料聚合微球中包埋磁性納米粒子的方法制備得到所述磁性微球；
（2）采用向表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料聚合微球中包埋探針物質(zhì)的方法制備得到所述探針微球；
（3）將步驟（1）制備得到的磁性微球和與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白通過采用偶聯(lián)或疏水作用方式實現(xiàn)固定，制備得到所述磁性蛋白；
（4）將步驟（2）制備得到的探針微球和與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白通過采用偶聯(lián)或吸附方式實現(xiàn)固定，制備得到所述探針蛋白；
（5）將步驟（3）制備得到的磁性蛋白和步驟（4）制備得到的探針蛋白加入到加樣孔中，并真空烘干；
（6）將加樣孔通過反應(yīng)及檢測通道與廢液收集池連通，加樣孔和廢液收集池的端部進(jìn)行密封。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其特征在于：所述探針物質(zhì)具有熒光激發(fā)特性，包括羅丹明及其衍生物、香豆素極其衍生物、熒光素及其衍生物和鑭系稀土元素及其螯合物中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其特征在于：所述探針物質(zhì)的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長之間的斯托克位移大于20納米，其熒光壽命半衰期大于1納秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其特征在于：所述官能團(tuán)為-COOH、-NH2、-OH或-CHO。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的檢測方法，其特征在于包括如下操作步驟：
(1)將待測液體樣品加入至加樣孔中，使加樣孔內(nèi)的所述磁性蛋白和所述探針蛋白得以釋放，并與待測液體樣品混合均勻；
(2)通過毛細(xì)管虹吸力或空氣壓力驅(qū)動使加樣孔中的混合液體在反應(yīng)及檢測通道中向前推進(jìn)；
(3)在反應(yīng)及檢測通道的中段設(shè)置電磁富集模塊，在混合液體通過時，利用電磁吸引原理通過對磁性微球進(jìn)行截留，使磁性蛋白以及反應(yīng)形成的磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物或磁性蛋白-待測物-探針蛋白復(fù)合物得以截留，而混合液體中的惰性雜質(zhì)和剩余的探針蛋白跟隨混合液體向前繼續(xù)流動，并最終流至廢液收集池；
(4)在全部混合液體流過反應(yīng)及檢測通道后，用光電檢測模塊檢測反應(yīng)及檢測通道的中段的熒光信號強(qiáng)度，并根據(jù)熒光信號-濃度的比例關(guān)系計算得到待測液體樣品中的待測物的濃度值。

說明書全文

一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)

器及其制備方法和檢測方法

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于生物樣品的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器及其制備方法和檢測方法。

背景技術(shù)

[0002] 微流體技術(shù)是指在微觀尺寸下控制、操作和檢測復(fù)雜流體的技術(shù)，是在微電子、微機(jī)械、生物工程和納米技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門全新交叉學(xué)科。微流體技術(shù)采用生物學(xué)技術(shù)原理，利用半導(dǎo)體集成技術(shù)制作新型固體元件或“芯片實驗室”，可對微量流體（包括液體和氣體）進(jìn)行復(fù)雜、精確的操作，如：混合和分離微量流體、化學(xué)反應(yīng)、微量分析，等等。由于微流體器件體積小，可調(diào)控參數(shù)多，調(diào)控精確度高，自動化程度高，可以集成和大量生產(chǎn)，在分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、診斷及藥物學(xué)研究中有很大的應(yīng)用前景。由于微流體技術(shù)使傳統(tǒng)檢測技術(shù)實現(xiàn)微量集成，具有操作便捷、檢測快速等特點，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。伴隨相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)磿r、快速定量檢測需求的逐步提高，相關(guān)的微流體檢測技術(shù)也應(yīng)運而生。
[0003] 磁分離技術(shù)是將物質(zhì)進(jìn)行磁場處理的一種技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)滲透到各個領(lǐng)域，該技術(shù)是利用元素或組分磁敏感性的差異，借助外磁場將物質(zhì)進(jìn)行磁場處理，從而達(dá)到強(qiáng)化分離過程的一種新興技術(shù)。隨著強(qiáng)磁場、高梯度磁分離技術(shù)的問世，磁分離技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從分離強(qiáng)磁性大顆粒到去除弱磁性及反磁性的細(xì)小顆粒，從最初的礦物分選、煤脫硫發(fā)展到工業(yè)水處理，從磁性與非磁性元素的分離發(fā)展到抗磁性流體均相混合物組分間的分離。作為潔凈、節(jié)能的新興技術(shù)，磁分離將顯示出誘人的開發(fā)前景。
[0004] 發(fā)明名稱為“一種興奮劑快速檢測生物芯片及其檢測方法”（申請號為03137051.9）的專利文獻(xiàn)中記載道：在固體載體表面固定有被檢測興奮劑分子的受體蛋白質(zhì)，在同一芯片板上具有一系列微反應(yīng)點，而這些微反應(yīng)點通過微溝槽通道連結(jié)成一封閉的具有微流體流入和流出端口的分析板或普通板芯片。將樣品中的興奮劑分子與受體芯片作用，再將標(biāo)記后的興奮劑與受體芯片作用，并最終通過檢測芯片上受體點陣上的標(biāo)記物強(qiáng)度，或者樣品中興奮劑的量。但是上述專利文獻(xiàn)中的技術(shù)存在以下缺點：（1）采用固體載體表面固定蛋白包被，造成試劑檢測范圍局限于某一較小的范圍（一般為10~25倍濃度范圍），同時反應(yīng)體系采取固相包被物與待測物被動接觸反應(yīng)模式，由于處于非均相條件下，其反應(yīng)效率低于均相條件下親和反應(yīng)效率；（2）為實現(xiàn)反應(yīng)物質(zhì)與雜質(zhì)的分離，反應(yīng)步驟采取多步操作形式，操作復(fù)雜，操作時間較長。

發(fā)明內(nèi)容

[0005] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器及其制備方法和檢測方法，可以在均相（液相）條件下對生物樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。
[0006] 本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，包括磁性蛋白和探針蛋白，所述磁性蛋白為以磁性微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，所述探針蛋白為以探針微球為載體固定有與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白，且所述磁性蛋白和探針蛋白根據(jù)所述待測物的性質(zhì)配對組合使用。
[0007] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其中：所述磁性微球的材料包括順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料和變磁性材料，且其比飽和磁化強(qiáng)度大于等于0.1 emu/g。所選材料受施加磁場的影響被吸引/被排斥，或具有可檢測的磁易感性或誘導(dǎo)。
[0008] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其中：所述磁性微球的粒徑為50納米~500納米，所述探針微球的粒徑為50納米~500納米。
[0009] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其中：所述磁性蛋白和探針蛋白之間的配對組合使用方式包括捕獲法、雙抗原夾心法、雙抗體夾心法、間接法和競爭法。
[0010] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器，其中：還包括至少一個的加樣孔、反應(yīng)及檢測通道和廢液收集池，所述磁性蛋白和探針蛋白經(jīng)干燥固定在所述加樣孔的底部。
[0011] 上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，包括如下步驟：（1）采用在磁性納米粒子的內(nèi)核表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料的方法或向表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料聚合微球中包埋磁性納米粒子的方法制備得到所述磁性微球；
（2）采用向表面覆蓋有官能團(tuán)的高分子材料聚合微球中包埋探針物質(zhì)的方法制備得到所述探針微球，探針物質(zhì)的光學(xué)特性包括濁度分析、光吸收分析、熒光激發(fā)等，探針微球的檢測方式是采用一定波長入射光進(jìn)行照射，并利用探針微球?qū)θ肷涔獾纳⑸?透射率分析、吸收率分析及入射光激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)射光分析等方式實現(xiàn)信號檢測；
（3）將步驟（1）制備得到的磁性微球和與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白通過采用偶聯(lián)或疏水作用方式實現(xiàn)固定，制備得到所述磁性蛋白；
（4）將步驟（2）制備得到的探針微球和與待測物相應(yīng)位點發(fā)生特異性結(jié)合或者與待測物結(jié)構(gòu)相同的特異性蛋白通過采用偶聯(lián)或吸附方式實現(xiàn)固定，制備得到所述探針蛋白；
（5）將步驟（3）制備得到的磁性蛋白和步驟（4）制備得到的探針蛋白加入到加樣孔中，并真空烘干；
（6）將加樣孔通過反應(yīng)及檢測通道與廢液收集池連通，加樣孔和廢液收集池的端部進(jìn)行密封。
[0012] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其中：所述探針物質(zhì)具有熒光激發(fā)特性，利用低波長入射光照射，激發(fā)后產(chǎn)生高波長發(fā)射熒光信號，包括羅丹明及其衍生物、香豆素極其衍生物、熒光素及其衍生物和鑭系稀土元素及其螯合物中的一種或多種。
[0013] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其中：所述探針物質(zhì)的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長之間的斯托克位移大于20納米，其熒光壽命半衰期大于1納秒。
[0014] 優(yōu)選的，上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的制備方法，其中：所述官能團(tuán)為-COOH、-NH2、-OH或-CHO。
[0015] 上述的一種基于磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的快速檢測微流體反應(yīng)器的檢測方法，包括如下操作步驟：(1)將待測液體樣品加入至加樣孔中，使加樣孔內(nèi)的所述磁性蛋白和所述探針蛋白得以釋放，并與待測液體樣品混合均勻；
(2)通過毛細(xì)管虹吸力或空氣壓力驅(qū)動使加樣孔中的混合液體在反應(yīng)及檢測通道中向前推進(jìn)；
(3)在反應(yīng)及檢測通道的中段設(shè)置電磁富集模塊，在混合液體通過時，利用電磁吸引原理通過對磁性微球進(jìn)行截留，使磁性蛋白以及反應(yīng)形成的磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物或磁性蛋白-待測物-探針蛋白復(fù)合物得以截留，而混合液體中的惰性雜質(zhì)和剩余的探針蛋白跟隨混合液體向前繼續(xù)流動，并最終流至廢液收集池；
(4)在全部混合液體流過反應(yīng)及檢測通道后，用光電檢測模塊檢測反應(yīng)及檢測通道的中段的熒光信號強(qiáng)度，并根據(jù)熒光信號-濃度的比例關(guān)系計算得到待測液體樣品中的待測物的濃度值。
[0016] 本發(fā)明的突出效果為：本發(fā)明實現(xiàn)了磁分離技術(shù)和微流體技術(shù)的組合使用，在待測液體樣品中含有待測物時，待測物與磁性蛋白及探針蛋白作用后反應(yīng)形成磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物或磁性蛋白-待測物-探針蛋白復(fù)合物，利用微流體推動作用前進(jìn)，然后利用磁場作用將含有磁性微球的磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物或磁性蛋白-待測物-探針蛋白復(fù)合物截留，最終通過檢測截留區(qū)域上探針蛋白中探針物質(zhì)的信號強(qiáng)度，計算得到待測液體樣品中待測物的含量。磁性蛋白一方面作為與待測物及探針蛋白的反應(yīng)載體，另一方面在微流體推進(jìn)過程中，利用磁極性吸引作用實現(xiàn)磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物或磁性蛋白-待測物-探針蛋白復(fù)合物與待測液體樣品中其他物質(zhì)的分離，以達(dá)到降低干擾，提高檢測結(jié)果的精確度，準(zhǔn)確性和靈敏度的作用，避免了應(yīng)用膜層析快速檢測方法時層析反應(yīng)過程中因膜孔徑差異導(dǎo)致的反應(yīng)差異；采用磁性微球作為反應(yīng)載體，提高了蛋白的包被量，從而提高了反應(yīng)效率；反應(yīng)與分離同時進(jìn)行，操作簡單、快速，可適用于多種領(lǐng)域的生物樣品的定性定量檢測。
[0017] 以下便結(jié)合實施例附圖，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。

附圖說明

[0018] 圖1是本發(fā)明實施例1的微流體反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實施例1的反應(yīng)示意圖；
圖3是本發(fā)明實施例1中肌鈣蛋白I的熒光信號-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
圖4是本發(fā)明實施例2中氯霉素的熒光信號-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

[0019] 下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0020] 實施例1：本實施例采用肌鈣蛋白I抗體為常規(guī)單克隆抗體技術(shù)制備的單抗，利用雙抗體夾心法檢測肌鈣蛋白I抗原的原理檢測待測液體樣品中的肌鈣蛋白I的含量。
[0021] 如圖l～圖2所示，本實施例中檢測肌鈣蛋白I的微流體反應(yīng)器由加樣孔、反應(yīng)及檢測通道和廢液收集池組成。加樣孔底部干燥固定有探針蛋白和磁性蛋白，在加入樣品后，探針蛋白及磁性蛋白復(fù)溶至樣品溶液中。加樣孔側(cè)壁開孔并與反應(yīng)及檢測通道連接；反應(yīng)及檢測通道采用玻璃毛細(xì)管材料，在加樣孔加樣及混合操作完成后，提供正壓壓力，促使加樣孔內(nèi)溶液向反應(yīng)及檢測通道遷移。本實施例中，使用特定的激發(fā)光(580nm)／發(fā)射光(615nm)波長的熒光膠乳(直徑約300nm)標(biāo)記l株肌鈣蛋白I的單克隆抗體(0.5mg/ml～7mg/ml)；同時采用肌鈣蛋白I的另一株單克隆抗體(0.5mg/ml～7mg/ml)與磁性微球(直徑約300nm)進(jìn)行偶聯(lián)。
[0022] 本實施例中，全程定量檢測肌鈣蛋白I的微流體反應(yīng)器的制備方法包括以下步驟：1）熒光乳膠微球/磁性乳膠微球的共價活化
超聲波處理熒光乳膠微球/磁性乳膠微球30秒后，調(diào)節(jié)熒光乳膠微球/磁性乳膠微球濃度為1%（w/v），10000rpm～16000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用l00mM，pH6.0的 Hepes緩沖液溶解，并超聲波200W處理30秒，完成緩沖液的置換并得到清洗待用的熒光乳膠微球/磁性乳膠微球；然后加入100 μl的100mg/ml EDC，使用漩渦混勻器渦漩振蕩混勻，再加入50 μl的50mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，使用漩渦混勻器渦漩振蕩混勻；室溫孵育30分鐘后10000rpm～15000rpm離心5分鐘～15分鐘，沉淀用100mM，pH5.0～6.0的MES緩沖液溶解，放置在2℃～8℃條件下備用，得到羧基（-COOH）官能團(tuán)活化后的探針微球/磁性微球。
[0023] 2）探針蛋白/磁性蛋白的制備將活化后的探針微球/磁性微球超聲波200W處理30秒后，按照50μg標(biāo)記抗體/100μ l微球的比例加入對應(yīng)的肌鈣蛋白I單克隆抗體，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時；向偶聯(lián)后的探針微球/磁性微球超聲波200W處理30秒后，按照50 μg乙醇胺/100μl微球的比例加入乙醇胺進(jìn)行位點封閉，混勻后室溫攪拌反應(yīng)1小時。離心洗滌3次，每次10000rpm～
15000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波200W處理30秒，用PBS-TBN緩沖液恢復(fù)離心前體積，得到探針蛋白/磁性蛋白（即熒光膠乳微粒標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體及磁性微球標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體）。
[0024] 3）肌鈣蛋白I的微流體反應(yīng)器的制備將偶聯(lián)及封閉完成的熒光膠乳微粒標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體及磁性微球標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體按1∶20～1∶500的稀釋度，5μl/管的用量，加入到加樣孔中，并真空烘干。使用熱熔封口膜將微流體反應(yīng)器加樣孔及廢液收集池杯口頂部進(jìn)行密封。 [0025] 本實施例采用的肌鈣蛋白I抗體為常規(guī)單克隆抗體技術(shù)制備的單抗，利用雙抗體夾心法檢測肌鈣蛋白I抗原的原理檢測待測液體樣品中肌鈣蛋白I的含量，其檢測方法包括如下步驟：
1) 撕開微流體反應(yīng)器加樣孔杯口頂部熱熔封口膜，使用移液器吸取100微升血清標(biāo)本加入到加樣孔中，使用移液器反復(fù)吹吸加樣孔中的液體，使加樣孔內(nèi)預(yù)先加入并干燥的熒光膠乳微粒標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體及磁性微球標(biāo)記的肌鈣蛋白I單克隆抗體得以釋放，并在液體中混勻；
2) 將微流體反應(yīng)器放入到微流體檢測儀中，儀器啟動氣動推進(jìn)閥將反應(yīng)液體推進(jìn)至反應(yīng)及檢測通道；
3) 在反應(yīng)及檢測通道的中段，設(shè)置電磁富集模塊及光電檢測模塊，在混合液體通過時，利用電磁吸引原理通過對磁性微球進(jìn)行截留，使磁性蛋白以及反應(yīng)形成的磁性蛋白-肌鈣蛋白I-探針蛋白復(fù)合物得以截留，而混合液體中的惰性雜質(zhì)和剩余的探針蛋白跟隨混合液體向前繼續(xù)流動，并最終流至廢液收集池；
4) 在全部混合液體流過反應(yīng)及檢測通道后，用光電檢測模塊檢測反應(yīng)及檢測通道的中段的熒光信號強(qiáng)度，并根據(jù)熒光信號-濃度的比例關(guān)系（如圖3所示）計算得到血清標(biāo)本中的待測物的濃度值。
[0026] 對本實施例的肌鈣蛋白I檢測微流體反應(yīng)器進(jìn)行了性能測定，利用本實施例所述的微流體反應(yīng)器對肌鈣蛋白I進(jìn)行檢測，測定線性范圍為0.01 ng/ml～2.4 ng/ml，線性范2
圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R 達(dá)到0.999，線性范圍內(nèi)試劑檢測精密度CV % < 5%；結(jié)果如下表1所示。
[0027] 表1：肌鈣蛋白I精密度實驗數(shù)據(jù)
[0028] 實施例2：本實施例采用氯霉素抗體為常規(guī)單克隆抗體技術(shù)制備的單抗，利用競爭法原理檢測待測液體樣品中的氯霉素含量。
[0029] 如圖l～圖2所示，本實施例中檢測氯霉素的微流體反應(yīng)器由加樣孔、反應(yīng)及檢測通道和廢液收集池組成。加樣孔底部干燥固定有探針蛋白和磁性蛋白，在加入樣品后，探針蛋白及磁性蛋白復(fù)溶至樣品溶液中。加樣孔側(cè)壁開孔并與反應(yīng)及檢測通道連接；反應(yīng)及檢測通道采用玻璃毛細(xì)管材料，在加樣孔加樣及混合操作完成后，提供正壓壓力，促使加樣孔內(nèi)溶液向反應(yīng)及檢測通道遷移。本實施例中，使用特定的激發(fā)光(580nm)／發(fā)射光(615nm)波長的熒光膠乳(直徑約300nm)標(biāo)記l株氯霉素的單克隆抗體(0.5mg/ml～7mg/ml)；同時采用牛血清白蛋白-氯霉素 (0.5mg/ml～10mg/ml)與磁性微球(直徑約300nm)進(jìn)行偶聯(lián)。
[0030] 本實施例中，定量檢測氯霉素的微流體反應(yīng)器的制備方法包括以下步驟：1）熒光乳膠微球/磁性乳膠微球的共價活化
超聲波處理熒光乳膠微球/磁性乳膠微球30秒后，調(diào)節(jié)熒光乳膠微球/磁性乳膠微球濃度為1%（w/v），10000rpm～16000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用l00mM，pH6.0的 Hepes緩沖液溶解，并超聲波200W處理30秒，完成緩沖液的置換并得到清洗待用的熒光乳膠微球/磁性乳膠微球；然后加入100μl的100mg/ml EDC，使用漩渦混勻器渦漩振蕩混勻，再加入50 μl的50mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，使用漩渦混勻器渦漩振蕩混勻；室溫孵育30分鐘后10000rpm～15000rpm離心5分鐘～15分鐘，沉淀用100mM，pH5.0～6.0的MES緩沖液溶解，放置在2℃～8℃條件下備用，得到羧基（-COOH）官能團(tuán)活化后的探針微球/磁性微球。
[0031] 2）探針蛋白的制備將活化后的探針微球超聲波200W處理30秒后，按照50μg標(biāo)記抗體/100μ l微球的比例加入對應(yīng)的氯霉素單克隆抗體，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時；向偶聯(lián)后的探針微球超聲波200W處理30秒后，按照50 μg乙醇胺/100μl微球的比例加入乙醇胺進(jìn)行位點封閉，混勻后室溫攪拌反應(yīng)1小時。離心洗滌3次，每次10000rpm～15000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波200W處理30秒，用PBS-TBN緩沖液恢復(fù)離心前體積得到探針蛋白（即熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體）。
[0032] 3）磁性蛋白的制備將活化后的磁性微球超聲波200W處理30秒后，按照50μg標(biāo)記蛋白/100μ l微球的比例加入對應(yīng)的牛血清白蛋白-氯霉素復(fù)合物原料，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時；向偶聯(lián)后的磁性微球超聲波200W處理30秒后，按照50 μg乙醇胺/100μl微球的比例加入乙醇胺進(jìn)行位點封閉，混勻后室溫攪拌反應(yīng)1小時。離心洗滌3次，每次10000rpm～15000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波200W處理30秒，用PBS-TBN緩沖液恢復(fù)離心前體積得到磁性蛋白（即磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原）。
[0033] 4）氯霉素的微流體反應(yīng)器的制備將偶聯(lián)及封閉完成的熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體及磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原按1∶20～1∶500的稀釋度，5μl/管的用量，加入到加樣孔中，并真空烘干。使用熱熔封口膜將微流體反應(yīng)器加樣孔及廢液收集池杯口頂部進(jìn)行密封。
[0034] 本實施例采用的氯霉素抗體為常規(guī)單克隆抗體技術(shù)制備的單抗，牛血清白蛋白-氯霉素抗原復(fù)合物采用常規(guī)小分子半抗原載體偶聯(lián)技術(shù)制備，利用競爭法檢測氯霉素抗原的原理檢測待測液體樣品，其檢測方法包括如下步驟：1) 撕開微流體反應(yīng)器加樣孔杯口頂部熱熔封口膜，使用移液器吸取100微升血清標(biāo)本加入到加樣孔中，使用移液器反復(fù)吹吸加樣孔中的液體，使加樣孔內(nèi)預(yù)先加入并干燥的熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體及磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原得以釋放，并在液體中混勻；在標(biāo)本中不含有氯霉素抗原的情況下，磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原與熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體形成復(fù)合物；而在標(biāo)本中含有氯霉素抗原的情況下，氯霉素抗原與磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原競爭結(jié)合熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體，標(biāo)本中氯霉素抗原含量越高，則磁性微球標(biāo)記的氯霉素抗原與熒光膠乳微粒標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體形成的復(fù)合物量越少；
2) 將微流體反應(yīng)器放入到微流體檢測儀中，儀器啟動氣動推進(jìn)閥將反應(yīng)液體推進(jìn)至反應(yīng)及檢測通道；
3) 在反應(yīng)及檢測通道的中段，設(shè)置電磁富集模塊及光電檢測模塊，在混合液體通過時，利用電磁吸引原理通過對磁性微球進(jìn)行截留，使磁性蛋白以及反應(yīng)形成的磁性蛋白-探針蛋白復(fù)合物得以截留，而混合液體中的惰性雜質(zhì)、氯霉素抗原-探針蛋白復(fù)合物跟隨液體向前繼續(xù)流動，并最終流至廢液收集池；
4) 在全部混合液體流過反應(yīng)及檢測通道后，用光電檢測模塊檢測反應(yīng)及檢測通道的中段的熒光信號強(qiáng)度，并根據(jù)熒光信號-濃度的比例關(guān)系（如圖4所示）計算得到血清樣本中的待測物的濃度值。
[0035] 對本實施例的氯霉素檢測微流體反應(yīng)器進(jìn)行了性能測定，利用本實施例所述的微流體反應(yīng)器對氯霉素進(jìn)行檢測，測定線性范圍為0.1ng/ml～20ng/ml，線性范圍內(nèi)相關(guān)系2
數(shù)R 達(dá)到0.991，線性范圍內(nèi)試劑檢測精密度CV % < 7%；結(jié)果如下表2所示。
[0036] 表2：氯霉素精密度實驗數(shù)據(jù)
[0037] 本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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