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半衰期延長的人因子Ⅸ變體

閱讀：371發(fā)布：2020-05-12

專利匯可以提供半衰期延長的人因子Ⅸ變體專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且說明了糖基化位點數(shù)目增加的因子IX變體。所述因子IX變體的 半衰期 延長和/或回收提高。，下面是半衰期延長的人因子Ⅸ變體專利的具體信息內(nèi)容。

1.分離的因子IX（FIX）蛋白變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其中，在其成熟多肽的第167位增加了一個新的糖基化位點。
2.載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的FIX變體的核苷酸序列。
3.轉(zhuǎn)化的細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體。

說明書全文

半衰期延長的人因子Ⅸ變體

[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本專利申請要求2007年10月15日提交的美國臨時專利申請No.60/999035的權(quán)益，該申請的全部內(nèi)容以其全部形式作為參考并入本文。

背景技術

[0003] 本發(fā)明涉及包含附加的糖基化位點的因子IX變體，以及編碼該因子IX變體的核酸構(gòu)建體。
[0004] 相關技術的說明
[0005] 可商購的因子IX有血漿來源的產(chǎn)品(Mononine )和重組蛋白(Benefix)。Mononine 的缺點在于傳播通過由純化步驟所帶有的細菌和病毒(例如HIV，肝炎病
毒)污染而造成的疾病的可能。重組蛋白(例如Benefix )的使用避免了這些問題。
然而，在實驗動物模型系統(tǒng)和人的靜脈內(nèi)(i.v.)彈丸注入后，重組因子IX(r因子IX，例
如Benefix )的藥物動力學性質(zhì)比人血漿來源的因子IX(pd因子IX，例如Mononine
)的性質(zhì)差。由于r因子IX不夠良好的藥物動力學性質(zhì)，因此一般r因子IX的劑量需要
高20-30％以達到與pd因子IX相同的促凝血活性水平(White等，(April1998)，Seminars
in Hematology，vol.35，no.2 SuppI.2：33-38；Roth 等，(December 15，2001)Blood
vol.98(13)：3600-3606)。
[0006] 已證實向蛋白中添加糖基化位點是延長它們半衰期的重要工具。例如，達貝泊汀-α(Darbepoetin-a)是紅細胞生成素的重組形式，其中添加了兩個附加的N-連接
糖基化位點(Elliott等，Enhancement of therapeutic protein invivo activities
through glycoengineering，Nat Biotechnol.(2003)21：414-421)。 為了產(chǎn)生達貝
泊汀，將殘基30和32突變產(chǎn)生一個糖基化位點，并且將殘基87、88和90突變產(chǎn)生第
二糖基化位點。具有這兩個附加糖基化位點的達貝泊汀的半衰期是正常紅細胞生成素
的三倍；此外，它的安全性與紅細胞生成素沒有差別。盡管達貝泊汀分子具有5個氨
基酸的變化，但是自2004年以來，未鑒別出對達貝泊汀的抗體發(fā)展的病例(Smalling
等，“Drug-induced andantibody-mediated pure red cell aplasia：a review of
literature and currentknowledge”，Biotechnol Annu Rev.(2004)10：237-250；
Sinclair等，“Glycoengineering：the effect of glycosylation on the properties of therapeuticprotein”，J Pharm Sci.(2005)94：1626-1635)。添加neo-糖基化位點也延長
了瘦素(leptin)和MpI配體的半衰期。
[0007] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有附加的糖基化位點的因子IX(FIX)變體。該重組因子IX變體的回收值更高和/或半衰期更長從而使得可以向?qū)ο笫┯幂^低劑量和/或較低頻次的因
子IX。
[0008] 發(fā)明簡述
[0009] 本發(fā)明提供了與野生型因子IX相比，包含一個或多于一個附加的糖基化位點的分離的因子IX(FIX)變體。可以通過以下方式的任意組合來引入所述一個或多個附加的糖
基化位點：附加的氨基酸的插入、氨基酸的缺失、氨基酸的取代和/或氨基酸的重排。也可
以通過定點突變和/或FIX變體的化學合成引入所述一個或多個附加的糖基化位點。
[0010] 在一些實施方式中，該附加的糖基化位點中的至少一個位于激活肽(activationpeptide)之內(nèi)。該FIX變體可以包含插入至SEQ ID NO：33所示的人FIX氨基酸序列的
N157和N167位置之間的肽片段，并且所述肽片段可以包含約3至約100個氨基酸殘基。所
述肽片段可以包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分(例如，圖1，第4行)并且可以修飾所
述小鼠激活肽以增加糖基化位點數(shù)目(例如圖1，第2和3行)。本發(fā)明所述的FIX蛋白變
體可以是人FIX蛋白。
[0011] 本發(fā)明所述變體FIX的一個或多個附加的糖基化位點可以是N-連接糖基化位點、O-連接糖基化位點以及N-連接糖基化位點和O-連接糖基化位點的組合。
[0012] 在一些實施方式中，糖基化位點可以包括N-連接糖基化位點，所述N-連接糖基化位點包含共有序列NXT/S，條件是X不是脯氨酸。在其他實施方式中，該糖基化位點包括
O-連接糖基化位點，所述O-連接糖基化位點包含選自以下的共有序列：CXXGGT/S-C(SEQ
ID NO：9)、NSTE/DA(SEQID NO：10)、NITQS(SEQ ID NO：11)、QSTQS(SEQ ID NO：12)、D/
E-FT-R/K-V(SEQ ID NO：13)、C-E/D-SN(SEQ ID NO：14)、GGSC-K/R(SEQ ID NO：15)以及它們的任意組合。此外，本發(fā)明所述的FIX變體可以包含約1至約5個附加的糖基化位點。
[0013] 本發(fā)明還提供了包含編碼本發(fā)明所述FIX變體的核苷酸序列的載體，包含本發(fā)明所述載體的轉(zhuǎn)化的細胞以及包含本發(fā)明所述FIX變體的轉(zhuǎn)基因動物。
[0014] 在一些實施方式中，本發(fā)明所述FIX變體的至少一個附加的糖基化位點可以位于激活肽之外。
[0015] 此外，本發(fā)明所述FIX變體的至少一個附加的糖基化位點可以對應于在FIX的非人同源物的天然形式中被糖基化的位點，其中非人同源物可以是，例如，狗、豬、牛或小鼠。 [0016] 本發(fā)明還提供了增加因子IX蛋白中糖基化位點數(shù)目的方法，包括：a)將第一FIX
氨基酸序列與第二FIX氨基酸序列比對；b)鑒別存在于所述第一FIX氨基酸序列而不存在
于所述第二氨基酸序列中的糖基化位點；c)修飾所述第二FIX氨基酸序列以引入糖基化位
點，該糖基化位點對應于步驟(b)中在第一FIX氨基酸序列中鑒別出的糖基化位點，其中修
飾所述第二FIX氨基酸序列增加了FIX蛋白中的糖基化位點數(shù)目。
[0017] 在本發(fā)明的方法中，第一FIX氨基酸序列可以來自非人類物種，而第二氨基酸序列可以是人FIX。在這些方法的進一步實施方式中，第一FIX氨基酸序列中的糖基化位點可
以位于激活肽之內(nèi)或激活肽之外。這些方法還包括在所述激活肽之內(nèi)和所述激活肽之外均
添加一個或多個糖基化位點。
[0018] 本發(fā)明還提供分離的FIX變體，與野生型FIX相比，該變體包含一個或多個附加的糖鏈。在一些實施方式中，通過化學和/或酶方法將所述一個或多個附加的糖鏈添加到FIX
蛋白上。
[0019] 通過以下附圖，本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。

附圖說明

[0020] 現(xiàn)在將參考下列附圖對本發(fā)明的這些和其他特征進行說明，這些附圖旨在說明而并非限制本發(fā)明。
[0021] 圖1顯示了人因子IX變體。第1行：人因子IX(SEQ ID NO：5)；第2行：具有小鼠激活肽(AP)片段的人因子IX，其中未修飾小鼠AP片段(SEQID NO：2)；第3行：具有添
加了一個糖基化位點的小鼠AP的人FIX(SEQID NO：3)；第4行：具有小鼠AP和添加的兩個
糖基化位點的人FIX(SEQID NO：4)。小箭頭表示成熟FIX的第一氨基酸(SEQ ID NO：33)。
兩個大箭頭表示激活肽切割位點。黑色星號表示人FIX蛋白中兩個存在的糖基化位點?；?br>色星號表示提議的附加的糖基化位點。
[0022] 圖2顯示了人因子IX(SEQ ID NO：5)與來自狗(SEQ ID NO：16)、豬(SEQ ID NO：17)、牛(SEQ ID NO：18)和小鼠(SEQ ID NO：19)(分別為第2、3、4和5行)的同源氨基酸
序列的比對。兩個箭頭表示激活肽切割位點。星號表示在所示五個物種的至少一個中存在
的糖基化位點。
[0023] 圖3顯示了幾種哺乳動物物種激活肽(牛(SEQ ID NO：20)、綿羊(SEQID NO：21)、馬(SEQ ID NO：22)、狗(SEQ ID NO：23)、貓(SEQ ID NO：24)、大鼠(SEQ ID NO：25)、小鼠(SEQ ID NO：26)、人(SEQ ID NO：27)、豬(SEQ ID NO：28)、兔(SEQ ID NO：29和30)以及
豚鼠(SEQ IDNO：31))的比對。用黑背景和白體字顯示高度可變區(qū)。所顯示的共有序列對
應于SEQ ID NO：32。
[0024] 圖4顯示了與野生型重組人因子IX相比，含有一個額外糖基化位點的人FIX變體的半衰期箱形圖(box plot)。該FIX變體的半衰期延長了約1.5小時。每個箱形圖的結(jié)果
代表對八只小鼠半衰期的測定；用實水平線表示每個箱形圖的中位數(shù)，并用該圖上的誤差
線顯示每組小鼠的極限值。
[0025] 圖5顯示牛、狗、人、小鼠、鴨嘴獸和負鼠的完整FIX氨基酸序列比對。
[0026] 圖6顯示了本發(fā)明FIX變體的168個其他實例，其中已將O-連接糖基化位點連接序列插入到激活肽之外的區(qū)域。
[0027] 根據(jù)隨后對實施方式的詳細說明，本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義相同。在本發(fā)明說明中所使用的術語的目的僅在于說明特定的
實施方式而不意欲限制本發(fā)明。
[0030] 定義
[0031] 如本文所使用的，“一個”或“該”可以表示一個或多于一個。例如，“一個”細胞可以表示單個細胞或多個細胞。
[0032] 還如本文所使用的，“和/或”是指并且涵蓋一個或多個相關的所列項目的任意或全部可能組合，當解釋為擇一時(“或”)是指不包括組合。
[0033] 如本文所使用的，當表示如數(shù)量(例如，甲基化的量)等的可測量值時，術語“約”意在涵蓋該指明量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的變化。
[0034] 如本文所使用的，過渡短語“基本由…組成”表示應將主張的范圍理解為包含在該主張中引用的明確的材料或步驟，“以及實質(zhì)上不會影響所主張發(fā)明的基本和新穎特性的
那些”。參見，In re Herz，537 F.2d 549，551-52，190U.S.P.Q.461，463(CCPA 1976)(原文強調(diào))；還參見，MPEP§2111.03。因此，當在本發(fā)明的權(quán)利要求中使用時，術語“基本由…組成”不意在理解為等同于“包含”。
[0035] 術語“藥物動力學性質(zhì)”具有其常用和習慣的含義并且表示因子IX蛋白的吸收、分布、代謝和排出。
[0036] “生物利用度”的常用和習慣含義是所施用的生物活性藥物進入體循環(huán)的分數(shù)或數(shù)量。在本發(fā)明實施方式的上下文中，術語“生物利用度”包括常用和習慣的含義，但是另
外還認為其具有更廣泛的含義以包括因子IX蛋白的生物活性程度。就因子IX而言，例如，
“生物利用度”的一種測量為輸液后在循環(huán)中所獲得的因子IX蛋白的促凝血活性。
[0037] “翻譯后修飾”具有其常用和習慣的含義并包括，但不限于，前導序列的去除、谷氨酸殘基的γ-羧基化、天門冬氨酸殘基的β-羥基化、天門冬酰胺殘基的N-連接糖基化、絲氨酸和/或蘇氨酸殘基的O-連接糖基化、酪氨酸殘基的硫酸化、絲氨酸殘基的磷酸化以及
它們的任意組合。
[0038] 如本文所使用的，參考來源于人血漿的標準物確定了“生物活性”。對于因子IX，該標準物為MONONINE (ZLB Behring)。將該標準物的生物活性視為100％。
[0039] 術語“加工因子”為廣義術語，其包括促進功能性因子IX形成的任何蛋白、肽、非肽輔因子、底物和/或核酸。這些加工因子的實例包括，但不限于，成對堿性氨基酸轉(zhuǎn)換(或
切割)酶(PACE)、維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)和維生素K依賴的γ-谷氨?；然?br>(VKGC)。
[0040] 如本文所使用的，術語“因子IX蛋白”包括野生型因子IX蛋白和天然發(fā)生的或人工的變體(例如，在人FIX激活肽的位置148處(根據(jù)SEQ ID NO：33所示的成熟人FIX
氨基酸序列進行編號，其顯示在位置148為T)的T/A二態(tài)性(dimorphism))，如Graham
等所 述的 (“The Malmo polymorphismof coagulation factor IX，an immunologic
polymorphism due to dimorphism ofresidue 148 that is in linkage disequilibrium
with two other F.IXpolymorphisms)”，Am.J.Hum.Genet.42：573-580(1988))。因此，本
發(fā)明的FIX蛋白包括具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的成熟人FIX蛋白，其中位置148
處生物氨基酸可以是T或A，而對象在該位點對于T或A可以是雜合的或純合的。本發(fā)
明的FIX蛋白還可以包括文獻中已知的FIX突變形式(參見，例如，Chang等，“Changing
residue 338 in human factor IX fromarginine to alanine causes an increase in
catalytic activity”，J.Biol.Chem.273：12089-94(1998)；Cheung 等，“Identification of the endothelial cell bindingsite for factor IX”，PNAS USA 93：11068-73(1996)；
Horst，“MolecularPathology”，第361頁(458頁)，CRC出版社，1991，以上每篇文獻以全部內(nèi)容作為參考并入本文)。如本領域已知的，本發(fā)明的FIX蛋白還包括目前已知的或以后鑒
別的任何其他天然發(fā)生的人FIX變體或人工的人FIX變體、它們的衍生物和活性片段/活
性結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的因子IX蛋白還包括FIX的藥理學活性形式，它是一種分子，其中已在
蛋白酶的作用下從所述蛋白中切割出激活肽(或通過在核酸水平將其移除而通過工程化
將其從所述蛋白中移出)，從而產(chǎn)生了FIX的兩條不相連的(non-contiguous)多肽鏈(輕
鏈和重鏈)，它們折疊成功能性FIX凝血因子。具體地，具有修飾以提高糖基化程度(例如，
N-連接和/O-連接糖基化)的因子IX變體明確地包含在該廣 義術語內(nèi)。
[0041] 術語“半衰期”為廣義術語，其包括常用和習慣的含義以及在因子IX科學文獻中出現(xiàn)的常用和習慣的含義。該定義具體地包含了與因子IX有關的參數(shù)的測量，其定義了從
輸注時所測量的初始值降低至該初始值一半的輸注后的時間。在一些實施方式中，可以在
如本領域熟知的和如本發(fā)明所述的多種免疫測定中使用因子IX的抗體在血液和/或血液
組分中測量FIX的半衰期。作為另外一種選擇，如本領域熟知的和如本發(fā)明所述的，可以使
用包括標準凝血測定在內(nèi)的功能性測定來檢測因子IX活性的降低，將其作為對半衰期的
測量。
[0042] 如本文所使用的，術語“回收”包括通過任何可接受的方法所測量的FIX的量，其包括，但不限于，出于測量輸注、注射、或遞送或施用后FIX水平的目的，在取出生物樣本
(例如，血液或血液產(chǎn)品樣本)的最早實施時間在受者動物或人對象的循環(huán)中所檢測到的
FIX抗原水平或FIX蛋白酶活性水平或凝血活性水平。使用當前的方法，測量FIX回收的
最早生物采樣時間通常在輸注、注射或遞送或施用FIX后的頭15分鐘內(nèi)，但是隨著科學和
/或臨床技術的改善，有理由期待更快的采樣時間。本質(zhì)上，此處FIX的回收值意為表示輸
注、注射或遞送/施用的FIX的最大分數(shù)，其可以在對受者動物或患者輸注、注射或遞送后
的盡可能早的時間點在受者的循環(huán)中測量到。
[0043] 術語“糖基化位點”為廣義術語，其具有常用和習慣的含義。在本申請的文中，該術語適用于可能可以接受糖部分(carbohydrate moiety)的位點，以及其上已確實連接了
糖部分的蛋白(具體為FIX)內(nèi)位點，并且包括可以作為寡糖和/或糖的受體的任何氨基酸
序列。
[0044] 術語“分離的”可以指核酸或多肽，其基本不合細胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)和/或培養(yǎng)基(當通過重組DNA技術產(chǎn)生時)或化學前體或其他化學品(當化學合成時)。此外，“分離
的片段”為核酸或多肽的片段，其天然狀態(tài)下不是片段并且不會在自然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)。
[0045] “分離的細胞”指從通常與其在自然狀態(tài)下相關的其他細胞和/或組織組分中分離出的細胞。例如，分離的細胞是細胞培養(yǎng)物的一部分的細胞。分離的細胞也可以是，例如，
為了提供治療性或其他有益作用而施用于或引入對象的細胞。
[0046] 本發(fā)明的一些實施方式涉及具有一個或多個附加的糖基化位點的因子IX變體。“附加的(additional)”或“新”糖基化位點表示該FIX變體中的糖基化位點數(shù)目大于“野
生型”形式的因子FIX中通常所存在的糖基化位點數(shù)目。本發(fā)明的因子IX蛋白可以包括血
漿來源的FIX以及FIX的重組形式。通常，本發(fā)明的實施方式涉及增加本發(fā)明FIX分子中
的糖基化位點數(shù)目。然而，應理解，由于天然發(fā)生的或人工的FIX變體也可以根據(jù)本發(fā)明方
法進行修飾以增加糖基化位點的數(shù)目和/或增加糖鏈的數(shù)目，因此可以通過修飾以增加糖
基化位點數(shù)目和/或增加糖鏈數(shù)目的本發(fā)明的因子IX蛋白不局限于特定的“野生型”FIX
氨基酸序列。
[0047] 本發(fā)明還涉及含有附加的糖鏈的FIX變體。這些附加的糖側(cè)鏈可以存在于通過本文所述方法引入本發(fā)明FIX變體的一個或多個附加的糖基化位點。作為另外一種選擇，如
本領域所熟知的，由于化學和/或酶方法將這些糖鏈引入至FIX分子，因此其他糖側(cè)鏈可以
存在于FIX蛋白的位點上?！案郊拥摹被颉靶隆碧擎湵硎綟IX變體中的糖鏈數(shù)目大于“野生
型”形式因子IX中通常存在的糖鏈數(shù)目。在多種實施方式中，可以添加約1至約500個附
加的糖側(cè)鏈(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)。
[0048] 在一些實施方式中，至少一個附加的糖基化位點位于因子IX的激活肽中(例如，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的人FIX激活肽)。在特定實施方式中，該FIX變體具
有肽片段的插入，其在SEQ ID NO：33所示的人因子IX氨基酸序列的位置N157和N167之
間引入一個或多個糖基化位點。
[0049] 可以將插入引入至本發(fā)明的FIX變體以增加糖基化位點數(shù)目，并且該插入可以包含從約1個至約100個氨基酸殘基，其包括從1至100的任意數(shù)目的氨基酸殘基(例如，1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、
55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、
80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100)。 [0050] 在特定實施方式中，該插入包括來源于如小鼠(例如，如圖1中第4行和SEQ ID
NO：2所示)的非人物種的全部或至少部分(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15或更多個氨基酸殘基)因子IX激活肽。在其他實施方式中，修飾人FIX序列以包含所述
非人(例如，小鼠)FIX激活肽，修飾該激活肽以增加糖基化位點數(shù)目(例如，如圖1中第2
行和第3行以及SEQ ID NO：3和4所示)。在其他實施方式中，可以通過插入包括鴨嘴獸
(圖5)的任何非人FIX蛋白的激活肽的氨基酸片段來修飾人FIX氨基酸序列。SEQ ID NO：
305提供了14個氨基酸的片段，其可被引入至人FIX的激活肽，例如，對于來自小鼠激活肽
的插入的肽片段，引入至在如圖1所示的氨基酸殘基166和167之間或在該激活肽中的任
何其他位點。SEQ IDNO：306提供了成熟人FIX變體，其具有插入至氨基酸殘基166和167
之間的鴨嘴獸的14個氨基酸的序列。根據(jù)本文所教導的，還可以修飾該插入的肽序列以引
入附加的糖基化位點。如圖5中所提供的，鴨嘴獸FIX的氨基酸序列還表明可以在FIX蛋
白的激活肽中插入至少14個氨基酸而預期的該蛋白的活性和/或功能將不會受到不利的
影響。
[0051] 所述糖基化位點可以選自N-連接糖基化位點、O-連接糖基化位點和/或N-連接糖基化位點和O-連接糖基化位點的組合。在一些實施方式中，所添加的糖基化位點包括
N-連接糖基化位點，并且共有序列為NXT/S，條件是X不是脯氨酸。
[0052] 在一些實施方式中，F(xiàn)IX氨基酸序列中可以添加約1至約5個糖基化位點。在多種實施方式中，可以添加約1至約50個糖基化位點(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)。本發(fā)明的實施方式包括FIX變體，其中已通過特定氨基酸的插入、缺失或者取代產(chǎn)生了N-連接或O-連接糖基化位點。在特定實施
方式中，所述插入、缺失和/或取代位于圖1中箭頭所示的激活肽區(qū)域內(nèi)。如SEQ ID NO：1
所示，本文提供了人FIX激活肽的氨基酸序列。
[0053] 在一些實施方式中，所添加的糖基化位點包括O-連接糖基化位點，并且共有序列可以是，但不限于，CXXGGT/S-C(SEQ ID NO：9)、NSTE/DA(SEQ ID NO：10)、NITQS(SEQ ID NO：
11)、QSTQS(SEQ ID NO：12)、D/E-FT-R/K-V(SEQ ID NO：13)、C-E/D-SN(SEQ ID NO：14)和GGSC-K/R(SEQ ID NO：15)。
[0054] 考慮可以將引入至FIX氨基酸序列的附加的糖基化位點引入至FIX蛋白的整個氨基酸序列的任何位置。因此，在一些實施方式中，將所述附加的一個或多個糖基化位點引
入至激活肽(圖1中用箭頭表示；SEQ ID NO：33所示的成熟人FIX氨基酸序列的氨基酸
146-180)，引入至激活肽之外(例如，該激活肽之前和/或之后)或引入至該激活肽之內(nèi)
和該激活肽之外。因此，根據(jù)對SEQ ID NO：33所示的成熟人FIX蛋白的氨基酸序列的415
個氨基酸的編號，可以通過在任意氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、
133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、
152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、
190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、
209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、
228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、
247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、
266、 267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、
285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、
304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、
323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、
342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、
361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、
380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、
399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415或它們的任意組合之間插入附加氨基酸殘基以引入糖基化連接位點。如本文所使用的，“糖基化連接位
點”或“糖基化位點”可以表示糖連接共有序列(即，一系列氨基酸，它們作為將糖(單糖、
寡糖或多糖)連接到氨基酸序列的共有序列；或者它可以表示共價連接糖部分的實際的氨
基酸殘基。該糖部分可以是單糖(簡單的糖分子)、或寡糖或多糖。
[0055] 在特定實施方式中，可以將附加的氨基酸插入至和/或取代入構(gòu)成激活肽的任意氨基酸殘基，如在任意氨基酸145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、
158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182和它們的任意組合之間。此外，可以將本發(fā)明的相同插入(物)在FIX蛋白氨基酸序列中相同和/或不同位置(包括在激活肽之內(nèi))引入多次。另外，可
以在FIX蛋白整個氨基酸序列上的氨基酸殘基之間的相同和/或不同的位置，包括在激活
肽之內(nèi)，一次或多次引入不同插入(物)和/或相同插入(物)。
[0056] 據(jù)本領域所熟知的，一些蛋白可以支持很多個糖側(cè)鏈并且O-連接糖基化位點之間的距離可以少至每隔一個氨基酸(參見，例如，Kolset和Tveit，“Serglycin-structure
and biology”，Cell.Mol.Life Sci 65：1073-1085(2008)和 Kiani等，“Structure and
function of aggrecan”，Cell Research 12(1)：19-32 (2002))。對于N-連接糖基化位點，位點之間的距離可以少至3、4、5或6個氨基酸(參見，例如，Lundin等，“Membrane topology of the DrosophilaOR83b odorant receptor”，F(xiàn)EBS Letters 581：5601-5604(2007)；
Apweiler等，“On the frequency of protein glycosylation，as deduced from analysis of theSWISS-PROT database”，Biochimica et Biophysica Acta 1473：4-8(19991)，以上每篇文獻的全部內(nèi)容作為參考并入本文)。
[0057] 此外，可以通過突變(例如，氨基酸的取代、添加和/或缺失)修飾本發(fā)明的FIX蛋白以引入N-連接糖基化位點、O-連接糖基化位點或N-連接和O-連接糖基化位點。例
如，可以根據(jù)本領域標準的分子模型方法鑒別功能性FIX蛋白表面上適于修飾(例如，突
變)以引入一個或多個糖基化位點的氨基酸殘基。表2中提供了該方法的一個特定實例，
其顯示了用于確定成熟人FIX蛋白中每個氨基酸的相對表面可及性的分子模型計算結(jié)果。
溶劑可及性的計算是基于該FIX蛋白真實三維結(jié)構(gòu)的晶體結(jié)構(gòu)確定。第一列列出了氨基酸
名稱，第二列列出了相應氨基酸的序列位置，而名為“總計”的列顯示了對每個氨基酸的計
算的溶劑可及性值(以相對單位)?？傆嬃兄休^高的值表示所計算的特定氨基酸明顯暴露
于溶劑(即，在折疊蛋白質(zhì)的表面上)。對于本發(fā)明，任意地選擇了大于或等于60的截止值
以鑒別FIX分子表面上的氨基酸殘基，可以根據(jù)本發(fā)明的方法修飾這些氨基酸殘基以增加
糖基化位點的數(shù)目。
[0058] 例如，在一些實施方式中，可以考慮對總計值大于或等于60的三個連續(xù)氨基酸殘基進行修飾以引入附加的糖基化位點，而這些區(qū)域在表2的總計列中用陰影表示。(在表
2中，構(gòu)成激活肽的氨基酸殘基也用陰影表示)。然而，60是用作實例的任意截斷值，可以
選擇任何其他截斷值以選擇用于修飾的候選氨基酸以摻入附加的糖基化位點。此外，該方
法僅是如何選擇FIX蛋白中氨基酸殘基進行修飾的一個實例，因此可以經(jīng)過修飾以將附加
的糖基化位點摻入成熟人FIX蛋白的氨基酸殘基不局限于表2總計列中具有任何特定值的
那些。根據(jù)本領域中熟知的以及本文所教導的方法修飾成熟FIX氨基酸序列中任何一個或
多個氨基酸殘基以及根據(jù)熟知的方法和本文所述方法測試任何得到的FIX變體的活性、穩(wěn)
定性、回收、半衰期等在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且在本領域普通技術人員的能力范圍內(nèi)(參見，
例如，Elliott等， “Structural requirements for additional N-linked carbohydrate on recombinanthuman erythropoietin”，J.Biol.Chem.279：16854-62(2004)，其全部內(nèi)容作為參考并入本文)。
[0059] 本發(fā)明的實施方式涉及重組因子IX變體，其中已添加了糖基化位點以改善因子IX的回收和/或半衰期和/或穩(wěn)定性。所述糖基化位點可以是N-連接和/或O-連接糖基
化位點。在具體的實施方式中，添加了至少一個N-連接糖基化位點。本文提供了如SEQ ID
NO：34-91所示的在激活肽中具有一個或多個附加的N-連接糖基化位點的人FIX變體的多
個實例。
[0060] 本文提供了如SEQ ID NO：92-132所表示的在激活肽中具有一個或多個附加的O-連接糖基化位點的人FIX變體的多個其他實例。此外，通過將引入如SEQ ID NO：34-91所
示的N-連接糖基化位點的修飾與引入如SEQ IDNO：92-132所示的O-連接糖基化位點的修
飾以任意組合和任意順序進行組合，本文提供了在激活肽中具有一個或多個附加的N-連
接糖基化位點和一個或多個附加的O-連接糖基化位點的人FIX變體的多個實例。這些組
合還可以包括引入更多糖基化位點的激活肽之內(nèi)和/或激活肽之外的任何其他修飾。本領
域的普通技術人員能夠容易地鑒別如對本文中SEQ ID NO：34-132所示的氨基酸序列所說
明的這些組合的修飾，并且這些組合的修飾包含在本發(fā)明的實施方式中，如同本文清楚地
提供了說明所有這些組合的每個氨基酸序列一樣。
[0061] 如本文所提到的，在一些實施方式中，將至少一個附加的糖基化位點引入至FIX氨基酸序列中在激活肽之外的位點。優(yōu)選地，所述至少一個附加的糖基化位點對應于因子
IX非人類同源物的天然形式中被糖基化的位點，例如，如圖2所示，其中在圖中所示的所有
非人物種中的氨基酸260-262處鑒別出糖基化位點，但該糖基化位點不在人FIX蛋白中天
然存在。修飾人FIX氨基酸序列以在SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列(人FIX的成熟(即
分泌的)形式)的氨基酸262處引入絲氨酸或蘇氨酸，這將在人蛋白中引入附加的N-連接
糖基化位點。優(yōu)選地，所述非人同源物來自于狗、豬、?；蛐∈蟆?br>
[0062] 本文提供了以SEQ ID NO：135-304表示的在激活肽之外具有一個或多個附加的N-連接糖基化位點的人FIX變體或具有附加的N-連接和O-連接糖基化位點組合的人FIX
變體的多個實例。本文在圖6中提供了在激活肽之外 具有一個或多個附加的O-連接糖基
化位點的人FIX變體的多個其他實例。容易理解的是，圖6所示的和序列表中所列的修飾
可以與本文所提供的任何其他實例中所示的修飾組合，并且圖6所示的和序列表中所列的
修飾不局限于所示的特定N-連接或O-連接糖基化位點共有序列。本發(fā)明的任何N-連接
和/或O-連接糖基化位點共有序列以及本領域中已知的任何其他序列均包含于本發(fā)明的
實施方式中并且可以單獨引入本發(fā)明的FIX中，以與其他O-連接糖基化位點共有序列任意
組合的方式和/或以與任何N-連接糖基化位點共有序列任意組合的方式引入本發(fā)明的FIX
以增加FIX蛋白上糖基化位點的數(shù)目。
[0063] 本發(fā)明的其他實施方式涉及增加因子IX蛋白中糖基化位點數(shù)目的方法，其包括一個或多個下列步驟：a)比對第一和第二因子IX氨基酸序列；b)鑒別在第一FIX氨基酸序
列中存在而在第二FIX氨基酸序列中不存在的一個或多個糖基化位點；和c)改變第二FIX
氨基酸序列以在第二FIX氨基酸中引入一個或多個新的或附加的糖基化位點，所述一個或
多個新的或附加的糖基化位點對應于步驟(b)中在第一氨基酸序列中所鑒別的一個或多
個糖基化位點。在特定實施方式中，所述第一氨基酸序列為來自非人物種的因子IX而所述
第二氨基酸序列為人因子IX。在某些實施方式中，將所述一個或多個新的或附加的糖基化
位點引入至第二FIX氨基酸序列的激活肽中。在其他實施方式中，將所述一個或多個新的
或附加的糖基化位點引入至第二FIX氨基酸序列的激活肽之外，而在其他實施方式中，以
任意組合并且在任意位置將所述一個或多個新的或附加的糖基化位點引入至第二FIX氨
基酸序列的激活肽之內(nèi)和第二FIX氨基酸序列的激活肽之外。在本發(fā)明的方法中，所述新
的或附加的糖基化位點可以是任意組合的N-連接和/或O-連接糖基化位點。
[0064] 本發(fā)明的方法包括在第一FIX氨基酸序列中含有糖基化位點的相應區(qū)域附近修飾第二FIX氨基酸序列(例如，在1、2、3、4、5或6個氨基酸之內(nèi))，以及在如第一FIX氨基
酸序列的相應區(qū)域中的那些的準確氨基酸位置處修飾第二FIX氨基酸序列。
[0065] 本文還提供了核酸，其包含編碼本發(fā)明的FIX氨基酸序列的核苷酸序列，或基本由和/或由編碼本發(fā)明的FIX氨基酸序列的核苷酸序列組成。這 些核酸可以存在于載體
中，如表達框。因此，本發(fā)明的其他實施方式涉及表達框，其設計用于表達編碼本發(fā)明任何
因子IX變體的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸和/或載體可以存在于細胞中。因此，本發(fā)明的
各種實施方式涉及含有載體(例如，表達框)的重組宿主細胞。該細胞可以是分離的和/
或存在于轉(zhuǎn)基因動物中。因此，本發(fā)明的某些實施方式還涉及包含核酸的轉(zhuǎn)基因動物，所述
核酸包含編碼本發(fā)明任何因子IX變體的核苷酸序列。
[0066] 人、小鼠、豚鼠和鴨嘴獸FIX的激活肽氨基酸序列的比較顯示，小鼠FIX氨基酸序列具有存在于其激活肽中的其他(additional)9個氨基酸，豚鼠FIX氨基酸序列具有存在
于其激活肽中的其他10個氨基酸殘基，而鴨嘴獸具有存在于其激活肽中的其他14個氨基
酸(圖5)。這些額外的氨基酸位于人因子IX的兩個天然發(fā)生的糖基化位點(N157和N167)
之間。
[0067] 人和小鼠FIX具有基本相同的結(jié)構(gòu)并且人的酶可以在小鼠中起作用。由于人FIX在不具有小鼠中存在的其他9個氨基酸片段的情況下也起作用，因此因子IX分子的這一區(qū)
域可以耐受在其序列內(nèi)的修飾(包括插入、取代和/或缺失)而該分子在結(jié)構(gòu)、生物化學或
功能完整性上沒有嚴重損失。小鼠中插入的9個氨基酸最可能是表面殘基(由結(jié)構(gòu)研究
所支持)，并因此被糖基化酶獲得而修飾。在天然人因子IX中，兩個N-連接糖基化位點分
別距激活肽的氨基和羧基切割位點12個和14個氨基酸。因此，在本發(fā)明的一些實施方式
中，為了添加糖基化位點以改善半衰期和/或生物利用度，可以在人因子IX蛋白的N157和
N167之間添加附加的氨基酸殘基。在多個實施方式中，通過天然序列的插入、缺失和/或修
飾添加糖基化位點以包含用于O-連接糖基化的連接序列和/或用于N-連接糖基化的共有
序列。
[0068] 激活肽的人序列起始于成熟蛋白的殘基146。天然糖基化位點位于N157和N167(SEQ ID NO：33)。在一些實施方式中，可以將附加的氨基酸殘基插入到兩個正常糖基
化位點(人序列中的N157和N167之間)之間以提供附加的糖基化位點。在一些實施方式
中，添加了約3至約100個附加的氨基酸殘基。在其他實施方式中，添加了約5至約50個
氨基酸殘基。在其他實施方式中，添加了約5至約20個氨基酸殘基。在其他實施方式中，
添加了約7至約15個氨基酸殘基。通常，所述氨基酸殘基選自20種生物氨基酸，條件是脯
氨酸不用作糖基化位點NXT/S(N-連接糖基化的共有序列)中的 “X”。表1示出了20種普
通生物氨基酸和它們的縮寫。
[0069] 可以添加N-糖基化位點和/或O-糖基化位點。用于添加糖基化位點的共有序列在本領域中是已知的，并且所述共有序列包括N-糖基化的共有序列“NXT/S”，其中X不是脯
氨酸。O-糖基化位點的變化更大并且通常不具有用于連接的“共有序列”。在優(yōu)選的實施方
式中，通過天然序列的插入、缺失和/或修飾引入了因子IX的附加的O-連接糖基化位點以
包含在諸如因子II、因子VII、因子VIII、因子X、蛋白質(zhì)C和蛋白質(zhì)S的其他凝血蛋白中存
在的O-連接糖基化的共有序列。例如，發(fā)現(xiàn)序列CXXGGT/S-C(SEQ ID NO：9)在幾種凝血因
子和止血蛋白中作為連接O-連接寡糖的共有序列(van denSteen等，“Critical Reviews
in Biochemistry and Molecular Biology”，MichaelCox主編，33(3)：151-208(1998))。在一些實施方式中，糖基化位點包括O-連接糖基化位點，其包括但不限于：
[0070] CXXGGT/S-C(SEQ ID NO：9)
[0071] NSTE/DA(SEQ ID NO：10)
[0072] NITQS(SEQ ID NO：11)
[0073] QSTQS(SEQ ID NO：12)
[0074] D/E-FT-R/K-V(SEQ ID NO：13)
[0075] C-E/D-SN(SEQ ID NO：14)
[0076] GGSC-K/R(SEQ ID NO：15)。
[0077] 在以上序列中，用下劃線表示糖基化的連接點。在一些實施方式中，通過插入用于O-連接糖基化的S/T殘基制備FIX變體，其中殘基分別位于任一側(cè)(either side)，如下列
的三聚體：G-T/S-C、ST-E/D、ITQ、STQ、FT-R/K，E/D-SN和GSC。其他變化包括對于實際糖基化位點的S和T的可交換性。S可以取代T，T可以取代S。本發(fā)明的實施方式涉及通過插
入、缺失和/或取代以添加認為是N-連接或者O-連接糖基化信號的任何序列。
[0078] 在一些實施方式中，將來自小鼠、人及其他哺乳動物因子IX序列的內(nèi)源N-連接和O-連接的連接序列插入至激活肽?？梢詥为毑迦脒@些序列或組合插入。在某些實施方
式中，插入的片段包含糖基化位點之間的間隔區(qū)，其可以單個存在、或串聯(lián)重復存在或以多
個存在等。本發(fā)明的間隔區(qū)的長度可以從1個至約100個氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、
84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100)。在一些實施方式中，例如，該間隔區(qū)可以從1至約20個氨基酸。在其他實施方式中，該間隔區(qū)可以從1至約10個氨
基酸。在其他實施方式中，該間隔區(qū)可以從1至約5個氨基酸殘基。
[0079] 本發(fā)明的間隔區(qū)包含在所添加的糖連接位點之間和/或包含在天然發(fā)生的糖基化位點和所添加的糖基化位點之間，以減少或消除位阻并提供被糖基轉(zhuǎn)移酶的有效識別。
本發(fā)明的間隔區(qū)可以由氨基酸殘基的任意組合組成，但前提條件是所述氨基酸殘基不是半
胱氨酸或脯氨酸并且該間隔區(qū)的氨基酸序列所具有的疏水性殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、
苯丙氨酸和纈氨酸)不超過約10％。
[0080] 在一些實施方式中，將NXT/S摻入至所插入的氨基酸序列中以添加一個或多個附加的糖基化位點。除脯氨酸不可取外，“X”可以是任何生物氨基酸。在一些實施方式中，向因子IX變體中添加了至少一個附加的糖基化位點。在其他實施方式中，添加了兩個附加的
糖基化位點。在其他實施方式中，添加了3個附加的糖基化位點。在其他實施方式中，添加
了4個附加的糖基化位點。在其他實施方式中，添加了5個附加的糖基化位點。在一些實
施方式中，添加了6個附加的糖基化位點。在其他實施方式中，添加了多于6個附加的糖基
化位點。
[0081] 在一個實施方式中，將成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO：33)位置161處的Ala替換為Asn以提供1個附加的糖基化位點。在另一個實施方式中，將來自小鼠激活肽的肽
片段插入至人FIX激活肽中并修飾小鼠序列以產(chǎn)生1個附加的糖基化位點(圖1，第3行；
SEQ ID NO：3)或2個附加的糖基化位點(SEQ ID NO：4；圖1，第2行)。在其他實施方式
中，將序列VFIQDNITD(SEQ ID NO：6)插入到SEQ ID NO：33所示的成熟人FIX氨基酸序
列的殘基161和162之間從而在人FIX序列中引入N-連接糖基化位點。在另一實施方式
中，通過在VFIQDNITD插入中用Asn代替Asp添加另 一新糖基化位點。插入的序列將為
VFIQDNITN(SEQ ID NO：7)。可以組合以上所討論的實施方式以在人因子IX蛋白中提供1
至4個附加的糖基化位點。
[0082] 在另一種實施方式中，添加了以下序列，其提供了5個附加的糖基化位點。用加粗或下劃線示出了糖基化位點。
[0083] AETVFPDVDYVNSTENETIQDNITDNETILDNITQSTQSFNDFTR(SEQID NO：8)
[0084] 在一些實施方式中，在激活肽之外的位點添加糖基化位點。可以通過，例如，將來自人的因子IX的氨基酸序列與來自其他物種的因子IX的氨基酸序列比對并確定非人物種
中的糖基化位點的位置來選擇這些附加位點。然后，修飾人FIX氨基酸序列中同源或等同
位置以提供糖基化位點。該方法可以用于鑒別潛在的N-糖基化和O-糖基化位點。
[0085] 圖2中提供了該方法的實例，其中將人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO：1)分別與來自狗、豬、牛和小鼠的FIX氨基酸序列比對。在第5顆星的位置處，在除人之外的所有所示
物種中均具有糖基化位點，表明在該位置對糖基化具有很好的耐受性。狗、豬、牛和小鼠FIX氨基酸序列在該位點(NXT/S)具有N-糖基化的共有序列，但是人FIX氨基酸序列不具有該
共有序列。相反，人FIX氨基酸序列為NAA。人FIX氨基酸序列在氨基酸262處突變產(chǎn)生了
共有序列NAT/S，這將在人FIX蛋白的該位置處引入附加的糖基化位點。
[0086] 通過本領域中熟知的方法和在本文所提供的實施例部分中所述的方法產(chǎn)生了根據(jù)本發(fā)明的FIX變體并對其進行鑒定。這些方法包括凝血時間的測定(部分促凝血酶原激
酶時間(PPT)測定)和向測試動物施用FIX變體以通過本領域中熟知的適當?shù)拿庖邷y定和
/或活性測定來確定回收、半衰期和生物利用度。
[0087] 在一些實施方式中，通過本文所述的一種或多種方法步驟生產(chǎn)重組因子IX蛋白。通過所述方法產(chǎn)生的重組因子IX蛋白可以包含在藥物組合物中。一些實施方式涉及包含
根據(jù)本文所述方法生產(chǎn)的重組因子IX蛋白的試劑盒。通過向有需要的對象(例如，人類患
者)施用有效量的重組因子IX蛋白，可以將重組因子IX蛋白用于治療出血紊亂的方法。
[0088] 可以使用多種表達載體以產(chǎn)生基因工程細胞。一些表達載體設計用于在 利于所選的高表達細胞的多種條件下擴增轉(zhuǎn)染的細胞后表達大量重組蛋白。一些表達載體設計用
于在不需要在選擇壓力下進行擴增的情況下表達大量重組蛋白。本發(fā)明包括根據(jù)本領域中
的標準方法產(chǎn)生基因工程細胞并且不依賴于任何特定表達載體或表達系統(tǒng)的使用。
[0089] 為了產(chǎn)生基因工程細胞以產(chǎn)生大量因子IX蛋白，用含有編碼所述蛋白的cDNA的表達載體轉(zhuǎn)染細胞。在一些實施方式中，目標蛋白質(zhì)與所選的共轉(zhuǎn)染酶一起表達，所述共轉(zhuǎn)
染酶導致在給定細胞系統(tǒng)中該目標蛋白發(fā)生適當?shù)姆g后修飾。
[0090] 所述細胞可以選自多種來源，但是所述細胞另外是可以用含有核酸(優(yōu)選編碼因子IX蛋白的cDNA)的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞。
[0091] 除非另外指明，本發(fā)明實踐采用了本領域技術范圍內(nèi)的分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術。文獻中全面地解釋了這些技術。參見，例如，
Sambrook等，“分子克隆：實驗室指南(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)”，
第2版(1989);“DNA克 隆(DNA Cloning)”，第 I和II卷(D.N Glover主 編，1985)；
“寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)”，(M.J.Gait主編，1984)；“核酸雜交
(Nucleic AcidHybridization)”，(B.D.Hames 和S.J.Higgins 主 編，1984)；“轉(zhuǎn) 錄 和
翻 譯 (Transcription and Translation)”，(B.D.Hames 和S.J.Higgins 主 編，1984)；
“動物細胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)”，(R.I.Freshney主編，1986)；“固定化細胞
和 酶(Immobilized Cells and Enzymes)”，(IRL出 版 社，1986)；B.Perbal，“分 子 克隆實用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”(1984)；叢書，“酶學方法
(Methods in Enzymology)”，(Academic Press，Inc)，特別是第154卷和155卷(分別
為Wu和Grossman編著和Wu編著)；“哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer
Vectors for MammalianCells)”，(J.H.Miller和 M.P.Calos 編 著，1987，Cold Spring
HarborLaboratory)；“細胞和分子生物學中的免疫化學方法(ImmunochemicalMethods in
Cell and Molecular Biology)”，Mayer和Walker編著(AcademicPress，London，1987)；
Scodes，“蛋白質(zhì)純化：原理與實踐(Protein Purification：Principles and Practice)”，第二版，1987(Springer-Verlag，N.Y.)；和“實驗免疫學手冊(Handbook of Experimental Immunology)”，第I-IV卷(D.M.Weir 和C.C.Blackwell編著，1986)。說明書中引用的所有
專利、專利申請和出版物以它們的整體作為參考引入本文。
[0092] 基因工程技術
[0093] 通過基因工程產(chǎn)生克隆的基因、重組DNA、載體、轉(zhuǎn)化的宿主細胞、蛋白和蛋白片段是熟知的。參見，例如，授予Bell等的美國專利No.4761371的第6欄，第3行至第9欄，第65行；授予Clark等的美國專利No.4877729的第4欄，第38行至第7欄，第6行；授予
Schilling的美國專利No.4912038的第3欄，第26行至第14欄，第12行；和授予Wallner
的美國專利No.4879224的第6欄，第8行至第8欄，第59行。
[0094] 載體為可復制的DNA構(gòu)建體。載體在本文中用于擴增編碼因子IX蛋白的核酸和/或表達編碼因子IX蛋白的核酸。表達載體為可復制的核酸構(gòu)建體，其中編碼因子IX蛋白
的核苷酸序列可操作地與適合的控制序列連接，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)核苷酸序列在適合
的宿主中表達以產(chǎn)生因子IX蛋白。對這些控制序列的需要將根據(jù)所選的宿主和所選的轉(zhuǎn)
化方法而改變。通常，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱子序列、編碼適合的
mRNA核醣體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
[0095] 載體包括質(zhì)粒、病毒(例如，腺病毒、巨細胞病毒)、噬菌體和可整合的DNA片段(即，通過重組可整合到宿主基因組的片段)。所述載體獨立于宿主基因組復制和起作用，
或者在一些情況下，可以整合至基因組本身。表達載體可以含有啟動子和RNA結(jié)合位點，其
可操作地與待表達的基因連接并在宿主生物中可操作。
[0096] 當功能上彼此相關時，DNA區(qū)域或核苷酸序列可操作地連接或可操作地關聯(lián)。例如，如果啟動子控制序列轉(zhuǎn)錄時，則該啟動子可操作地與編碼序列連接；如果核糖體結(jié)合位
點所處的位置使得序列能夠翻譯時，則該核糖體結(jié)合位點可操作地與編碼序列連接。
[0097] 轉(zhuǎn)化的宿主細胞是已經(jīng)用因子IX蛋白載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和/或轉(zhuǎn)染的細胞，所述因子IX蛋白載體是使用重組DNA技術構(gòu)建的。
[0098] 適合的宿主細胞包括原核生物、酵母或高等真核細胞，如哺乳動物細胞和昆蟲細胞。來源于多細胞生物的細胞是重組因子IX蛋白合成特別適合的宿主，并且哺乳動物細胞
是特別優(yōu)選的細胞。細胞培養(yǎng)中，這些細胞的增殖 已成為常規(guī)的方法(“組織培養(yǎng)(Tissue
Culture)”，Academic Press，kruse和patterson主編(1973))。有用的宿主細胞系的實
例為VERO和HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系和WI138、HEK 293、BHK、COS-7、CV和
MDCK細胞系。這些細胞的表達載體通常包括(必要時)復制起點、位于編碼待表達因子IX
蛋白的核苷酸序列上游并且與其關聯(lián)的啟動子，以及核糖體結(jié)合位點、RNA拼接位點(如果
使用含有內(nèi)含子的基因組DNA)、多腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。在優(yōu)選的實施方式中，使
用美國專利No.5888809中的表達系統(tǒng)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中進行表達，該專利以其
整體作為參考并入本文。
[0099] 通常通過病毒源提供用于轉(zhuǎn)化脊椎動物細胞的表達載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。例如，常用的啟動子來源于多形瘤、腺病毒2和猿猴病毒40(SV40)。參見，例如，美國專利No.4599308。
[0100] 可以通過構(gòu)建載體以包含外源起點，如可以來源于SV 40或其他病毒(例如，多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)以提供復制起點，或可以通過宿主細胞染色體復制機制提供。如果
將載體整合至宿主細胞染色體，則后者通常就足夠了。
[0101] 可以通過與可選擇標志物和編碼因子IX蛋白的核酸共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞，而不使用含有病毒復制起點的載體。合適的可選擇標志物的實例為二氫葉酸還原酶
(DHFR)或胸苷激酶。在美國專利No.4399216中還說明了該方法，該專利以整體作為參考并
入本文。
[0102] 適于在重組脊椎動物細胞培養(yǎng)中適應因子IX蛋白合成的其他方法包括Gething等，Nature 293：620(1981)；Mantei等，Nature 281：40；和Levinson等，EPO專利申請
No.117060A和117058A，以上每篇文獻的全部內(nèi)容作為參考并入本文。
[0103] 諸如昆蟲細胞(例如，培養(yǎng)的草地夜蛾(諸如桿狀病毒表達載體(例如，來源于苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)MNPV、蛾(Rachiplusia ou)MNPV或Galleria
ou MNPV的載體)的表達載體可以在實施本發(fā)明中使用，如授予Smith等的美國專利
No.4745051和4879236中所說明的。一般說來，桿狀病毒表達載體包含含有待表達的核
苷酸序列的桿狀病毒基因組，所述核苷酸序列在從多角體蛋白翻譯的起始信號到ATG起始
位點的位置范圍內(nèi)并 且在桿狀病毒多角體蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下插入至多角體蛋白基
因。
[0104] 原核生物宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌(E.coli)或芽孢桿菌屬(bacilli)。高等真核細胞包括如下所述的哺乳動物源的已建立的細胞系。
示例性宿主細胞為E.coli W3110(ATCC 27325)、E.coliB、E.coli X1776(ATCC 31537)和
E.coli 294(ATCC 31446)。多種適合的原核和微生物載體是可用的。通常使用pBR322轉(zhuǎn)化
E.coli。重組微生物表達載體中最常用的啟動子包括β內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟
動子系統(tǒng)(Chang等，Nature 275：615(1978)；和Goeddel等，Nature 281：544(1979))、色
氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，Nucleic Acids Res.8：4057(1980)和EPO App.Publ.
No.36776)以及tac啟動子(De Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21(1983))。啟動
子和Shine-Dalgarno序列(用于原核宿主表達)可操作地與編碼因子IX蛋白的核酸連接，
即它們所處的位置使得能夠促進因子IX信使RNA從DNA轉(zhuǎn)錄。
[0105] 如酵母培養(yǎng)物的真核微生物也可以用編碼蛋白的載體轉(zhuǎn)化(參見，例如、美國專利No.4745057)。盡管通?？捎枚喾N其他菌株，但是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
是低等真核宿主微生物中最常使用的。酵母載體可以包含來自2微米酵母質(zhì)粒的復制起點
或自主復制序列(ARS)、啟動子、編碼因子IX蛋白的核酸、多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列以
及選擇基因。示例性質(zhì)粒為YRp7，(Stinchcomb等，Nature 282：39(1979)；Kingsman等，
Gene 7：141(1979)；Tschemper等，Gene 10：157(1980))。酵母載體中適合的啟動序列包
括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255：2073(1980))
或其他糖酵解酶的啟動子(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；和Holland等，
Biochemistry 17：4900(1978))。在R.Hitzeman等，EPO專利No.73657中還說明了在酵母
表達中使用的合適載體和啟動子。
[0106] 本發(fā)明的克隆的編碼序列可以編碼任何物種來源的FIX，包括小鼠、大鼠、狗、負鼠、兔、貓、豬、馬、綿羊、牛、豚鼠、負鼠、鴨嘴獸和人，但是優(yōu)選地編碼人源的因子IX蛋白。
還涵蓋了編碼因子IX的核酸，所述核酸可與編碼本文所公開的蛋白的核酸雜交?？梢栽?br>低嚴謹條件或甚至嚴謹條件下(例如，如以0.3M NaCl、0.03M檸檬酸鈉、0.1％SDS在60℃
或甚至70℃ 嚴謹洗膜為代表的嚴謹條件)實施這些序列與編碼本文所公開的因子IX蛋
白的核酸在標準原位雜交測定中的雜交。參見，例如，Sambrook等，“分子克隆：實驗室指
南(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)”，(第二版，1989)，Cold Spring Harbor Laboratory)。
[0107] 可以通過已知方法在轉(zhuǎn)基因動物中表達根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的FIX變體。參見，例如，美國專利NO.6344596，其以整體作為參考并入本文。簡言之，轉(zhuǎn)基因動物可以包括，但不限
于，家畜(例如，豬、山羊、綿羊、牛、馬、兔等)、嚙齒動物(如小鼠、大鼠和豚鼠)和家養(yǎng)寵物(例如，貓和狗)。在一些實施方式中，如豬、綿羊、山羊和牛的家畜動物是特別優(yōu)選的。
[0108] 通過以將多核苷酸穩(wěn)定地整合到成熟動物種系細胞DNA并且以正常孟德爾方式遺傳的方式將編碼本發(fā)明人因子IX變體的適當多核苷酸引入單細胞胚中產(chǎn)生了本發(fā)明的
轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物將具有在體液和/或組織中產(chǎn)生FIX變體的表型。例
如，出于治療性使用，將所述FIX變體從這些體液和/或組織中移出并處理。(參見，例如，
Clark等“，Expression ofhuman anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep”，Bio/Technology 7：487-492(1989)；Van Cott 等，“Haemophilic factors
producedby transgenic livestock：abundance can enable alternative therapies
worldwide”，Haemophilia 10(4)：70-77(2004)，其全部內(nèi)容作為參考并入本文)。
[0109] 可以通過多種方式將DNA分子引入胚胎，所述方式包括，但不限于，微量注射、磷酸鈣介導的沉淀、脂質(zhì)體融合或全能或多能干細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒感染。然后，可以將轉(zhuǎn)化的
細胞能引入胚胎并摻入其中以形式轉(zhuǎn)基因動物。例如，在L.M.Houdebine編寫的“轉(zhuǎn)基因動
物的產(chǎn)生和使用(TransgenicAnimal Generation and Use)”，Harwood Academic Press，
(1997)中說明了制備轉(zhuǎn)基因動物的方法。也可以使用核轉(zhuǎn)移方法或使用胚胎細胞系或成
體細胞系進行克隆的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，如在Campbell等，Nature 380：64-66(1996)和
Wilmut等，Nature 385：810-813(1997)中所述的。也可以使用利用DNA細胞質(zhì)注射的技
術，如美國專利No.5523222中所述的。
[0110] 可以通過引入包含編碼因子IX的序列的嵌合構(gòu)建體獲得產(chǎn)生因子IX的轉(zhuǎn)基因動物。獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法是熟知的。參見，例如，Hogan等，“操縱小鼠胚胎(MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO)”，(Cold Spring Harbor Press 1986)；Krimpenfort 等，Bio/
Technology 9：88(1991)；Palmiter等，Cell 41：343(1985)；Kraemer等，“早期哺乳動物胚胎的基因操控(GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIANEMBRYO)”，(Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1985)；Hammer等，Nature 315：680(1985)；Wagner等，美國專
利No.5175385；Krimpenfort等，美國專利No.5175384；Janne等，Ann.Med.24：273(1992)；
Brem等，Chim.Oggi.11：21(1993)；Clark等，美國專利No.5476995，所有文獻以其整體作為參考并入本文。
[0111] 在一些實施方式中，可以使用在乳腺組織中有“活性”的順式調(diào)控區(qū)，其中在乳汁合成的生理條件下啟動子在乳腺組織中比在其他組織中更有活性。這些啟動子包括，但不
限于，短或長乳清酸性蛋白(WAP)、短或長α、β和κ酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋
白(“BLG”)啟動子。根據(jù)本發(fā)明，也可以使用指導表達的蛋白向其他體液(特別是血液和
尿液)分泌的信號序列。這些序列的實例包括分泌的凝血因子的信號肽，其包括因子IX、蛋
白C和組織型纖維蛋白溶酶原活化因子的信號肽。
[0112] 除以上所討論的啟動子外，增強子、拼接信號、轉(zhuǎn)錄終止信號、多腺苷酸化位點、緩沖序列、RNA加工序列以及調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達的其他序列均屬于調(diào)控轉(zhuǎn)錄的有用序列。
[0113] 優(yōu)選地，所述表達系統(tǒng)或構(gòu)建體包括位于編碼所需重組蛋白的核苷酸序列下游的3’非翻譯區(qū)。該區(qū)域可以提高轉(zhuǎn)基因的表達。提供多聚腺苷酸信號的序列屬于對此有用的
3’非翻譯區(qū)。
[0114] 適合的異源3’非翻譯序列可以來源于，例如，SV40小t抗原、酪蛋白3’非翻譯區(qū)或本領域中熟知的其他3’非翻譯序列。核糖體結(jié)合位點對提高FIX表達效率也是重要的。
同樣地，調(diào)控FIX翻譯后修飾的序列在本發(fā)明中也是有用的。
[0115] 在歐洲專利申請373012、歐洲專利申請251874、PCT專利申請8505376、PCT專利申請8505125、歐洲專利申請162782和PCT專利申請8400560中公開了因子IX編碼序列，
以及表達該序列的載體和宿主細胞，以上所有專利申請以其整體作為參考并入本文。
[0116] 可以通過重組方法(如使用PCR的定點誘變)產(chǎn)生具有附加的糖基化 位點的FIX蛋白變體。作為另外一種選擇，可以化學合成該因子IX變體以制備具有一個或多個附加的
糖基化位點的因子IX蛋白。
[0117] 實施例
[0118] 實施例1、向人FIX氨基酸序列中添加一個糖基化位點。
[0119] 在CHO細胞中產(chǎn)生了在激活肽中具有一個附加的糖基化位點的人FIX變體。該變體是穩(wěn)定的，并且與野生型重組人FIX相比具有正常的活性和延長的半衰期。
[0120] 載體。使用來自ICOS的含有FIX-pDEF38CHEF-1啟動子的載體表達編碼野生型重組人FIX或重組人FIX變體的核酸。
[0121] 變體FIX。制備用于這些實驗的變體人FIX包含9個額外的氨基酸，其含有插入激活肽中的一個額外糖基化位點(SEQ ID NO：3；圖1，第3行)。該變體的激活肽序列為AETV
FPDVDYVNSTEAETILDNITDGAILNNITQSTQSFNDFTR(SEQ IDNO：133)，其中用加粗表示9個添加
的氨基酸，該序列顯示氨基酸146在N末端而氨基酸181在C末端，該編號基于SEQ ID NO：
33所示的成熟人FIX氨基酸序列。
[0122] CHO DG44細胞的轉(zhuǎn)染。以3×105個細胞/毫升的密度將細胞接種于含有15mL生6
長培養(yǎng)基的125mL震蕩三角瓶中并在37℃培育。第3天，細胞密度應為～1×10 個細胞/
毫升。通過將20μg的DNA稀釋于650μl的OPTIPROSFM，輕輕混合并在室溫(RT)下培育5
分鐘制備了DNA-LIPOFECTAMINE2000CD復合物。使用前，將LIPOFECTAMINE 2000CD輕輕混
合，通過將45μl所述溶液置于650μl的OPTIPRO SFM，輕輕混合并在RT培育5分鐘進行稀
釋。培育后，合并稀釋的DNA和稀釋的LIPOFECTAMINE 2000CD，輕輕混合并在RT培育30-45
分鐘以使得能夠形成DNA-LIPOFECTAMINE2000CD復合物。培育后，將DNA-LIPOFECTAMINE
2000CD復合物加入到震蕩三角瓶中。48小時后，將細胞旋轉(zhuǎn)沉降并將培養(yǎng)基改變?yōu)?0ml
TM
的CD OptiCHO 培養(yǎng)基(Invitrogen，產(chǎn)品目錄號：12681-011)。每2-3天更換培養(yǎng)基以獲
得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。
[0123] FIX表達細胞的選擇。由于在DG44細胞中dhfr基因是失活的，因此使 用dhfr 基 因 (Egrie JC 和 Browne JK，“Development and characterization ofnovel
erythropoiesis stimulating protein(NESP)”，Nephrol Dial Transplant.2001；16
Suppl 3：3-13)作為選擇標志物。穩(wěn)定表達dhfr的陽性DG44細胞在細胞生長時不需要HT
并且可以在CD CHO培養(yǎng)基中生長。
[0124] 從混合的CHO DG44細胞轉(zhuǎn)染子和293細胞克隆1中采集的培養(yǎng)基中純化hFIX變體蛋白。rhFIX變體蛋白的純化如下所述。向原始培養(yǎng)基中加入乙二胺四乙酸(200mM，pH
7.4)和苯甲脒(1M溶液)至最終濃度分別為4mM和5mM。將含有rhFIX變體蛋白的培養(yǎng)基
在4℃與Q sepharose陰離子交換樹脂混合。用20mM Tris(pH 7.4)、0.15M NaCl、2mM EDTA
和2mM苯甲脒預平衡Q sepharose樹脂。用1L平衡緩沖液清洗該柱，然后再用200mL不含
EDTA的平衡緩沖液清洗。用20mM Tris(pH 7.4)、0.15M NaCl和10mM CaCl2洗脫rhFIX變
體蛋白。
[0125] FIX活性。通過將100μl缺乏FIX的人血漿與100μl的自動活化部分凝血活酶時間(aPTT)試劑(Trinity biotech USA)以及用80μl的Owren-Koller緩沖液稀釋的
20μl測試樣本在37℃培育3分鐘確定了變體重組人FIX的功能性活性。為了開始反應，加
入了100μl 25mM的CaCl2，并通過肉眼觀察測量凝血形成時間。將正?；旌系娜搜獫{的凝
血活性視為100％。通過用凝血活性除以由免疫測定所確定的FIX蛋白的總量計算FIX-特
異的活性并用單位/毫克表示。野生型FIX的特異活性為116單位/毫克，而具有1個額
外糖基化位點的FIX的活性為104單位/毫克。
[0126] FIX大小。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到與純化的血漿FIX和CHO細胞中產(chǎn)生的純化的野生型重組FIX相比，具有一個額外糖基化位點的純化的FIX的大小明顯增加。一
旦通過酶催化去除糖之后，變體FIX大致隨著經(jīng)過類似處理的野生型重組FIX遷移。
[0127] 半衰期。通過用具有一個額外糖基化位點的變體FIX注射8只血友病B小鼠以及用野生型重組FIX注射8只不同的血友病B小鼠進行半衰期測量。向每組中的血友病B
小鼠注射100單位的FIX/kg。注射后，在15分鐘、4小時、12小時、24小時和48小時確定
保留在循環(huán)中的FIX的量。使用野生型FIX作為標準品，通過ELISA測量保留在循環(huán)中的
FIX的量。從AffinityBiologicals公司獲得了用于ELISA的抗體(產(chǎn)品號碼SAFIX-AP
SAFIX-APHRP)。將曲線用單指數(shù)衰變擬合。
[0128] 如圖4所示，具有一個額外糖基化位點的變體FIX表現(xiàn)出更長的半衰期2
(約1.5小時)。如Griffith 所報道的，由于不完全唾液酸化作用可以導致更短的
半衰期，因此將對該變體進行進一步分析以確定是否存在該FIX蛋白的完全唾液酸
化。確定唾液酸化程度的測定在本領域中是熟知的(參見，例如，Anumula和Dhume，
“High resolution and high sensitivity methods foroligosaccharide mapping
and characterization by normal phase highperformance liquid chromatography
following derivatization with highlyfluorescent anthranilic acid)，Glycobiology
8：685-694(1998)；Liu等，“Humanplasma N-glycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction，hydrazidechemistry，and mass spectrometry)，J.Proteome Res.4(6)：
2070-2080(2005)，以上每篇文獻的全部內(nèi)容均作為參考并入本文)。
[0129] 蛋白的半衰期可以受到多種因素的影響。單純的大小對循環(huán)蛋白質(zhì)是保留在循環(huán)中還是分布到全身各處具有主要的影響。另外，特異結(jié)合位點可以將蛋白從循環(huán)中除去。眾
所周知，唾液酸化不足的血漿蛋白質(zhì)具有暴露的GlcNAc和Gal殘基，其可以通過去唾液酸
3-5
糖蛋白肝受體從循環(huán)中移除 。存在在哺乳動物組織中差異表達的18個不同唾液酰轉(zhuǎn)移
6
酶的家族 。在人中，N-糖基化N-末端半乳糖通常通過α(2，6)唾液酸終止。CHO或BHK
細胞產(chǎn)生FIX，其中N-糖基化末端半乳糖通過α(2，3)-唾液酸化的半乳糖封端。然而，在
293細胞中產(chǎn)生的FIX由α(2，6)-半乳糖上的唾液酸封端。唾液酸化不足可以容易地導致
循環(huán)中清除率的提高，并掩蓋由額外糖基化所導致的預期半衰期的延長?？梢泽w外(通過
3
酶催化添加唾液酸 )改善唾液酸化不足，或在細胞培養(yǎng)中通過向表達重組FIX的細胞中添
7-10
加唾液酸化酶或通過操作培養(yǎng)條件以提高唾液酸化 從而改善唾液酸化不足。還根據(jù)所
示出的，用Gal(β1-4)GlcNAc-Rα(2，6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因轉(zhuǎn)染CHO細胞勝過了內(nèi)源唾
11
液酸化酶并導致以末端α-(2，6)-唾液酰-半乳糖為主要修飾的重組蛋白的產(chǎn)生 。
[0130] 該研究表明氨基酸殘基可以插入人因子IX的激活肽中而不會實質(zhì)上影響其凝血時間，并且這些插入對人因子IX的產(chǎn)生沒有有害作用。這些研究還表明如本領域中一般技
術人員使用熟知技術所能容易地鑒別出的，只要不 含能夠環(huán)回到FIX蛋白本身并破壞結(jié)
構(gòu)的任何序列，則任何氨基酸序列均可以摻入到因子IX的激活肽中。此外，可以摻入氨基
酸序列，其允許化學添加用于添加化合物(如聚乙二醇)以進一步延長半衰期的特異位點。
可以根據(jù)使用常規(guī)實驗方法的標準規(guī)程產(chǎn)生并測試這些序列。
[0131] 實施例2.不具有引入的新糖基化位點的變體人FIX
[0132] 作為示范，差異很大的序列也可以插入至人FIX的激活肽中而不會不利地影響FIX分子，將以下氨基酸序列FLNCCPGCCMEP(SEQ ID NO：134)插入至激活肽的氨基酸161和
162(基于如SEQ ID NO：33所示的成熟FIX氨基酸序列進行編號)之間。根據(jù)以上實施例
1中所述的方法，分析該重組蛋白，并且其表現(xiàn)出與野生型重組人FIX相同的功能性。
[0133] 本領域的技術人員將理解在不背離本發(fā)明精神的前提下，可以進行多種和各種修改。因此、應清楚地理解本發(fā)明的形式僅是說明性的而不意欲限制本發(fā)明的范圍。
[0134] 所有出版物、專利申請、專利、專利公開、GenBank 數(shù)據(jù)庫登記號所鑒別的序列以及其他本文引用的參考文獻以其整體作為參考并入以用于對與參考文獻所在的句子和/
或段落相關的內(nèi)容進行教導。
[0135] 本發(fā)明由下列權(quán)利要求所限定，并且其中包含了權(quán)利要求的等價形式。
[0136] 實施例1的參考文獻
[0137] 1.Yan SC，Razzano P，Chao YB，et al.Characterization and novelpurification ofrecombinant human protein C from three mammalian cell lines.
Biotechnology(N Y).1990；8：655-661.
[0138] 2.Griffith MJ，Monroe DM，van Cott DE，et al.N-GLYCAN SIALYLATIONISIMPORTANT FOR IN VIVO RECOVERY OF RECOMBINANT FACTOR IX.J ThrombHaemost.2007；
5：P-M-043.
[0139] 3.Raju TS，Briggs JB，Chamow SM，Winkler ME，Jones AJ.Glycoengineeringoftherapeutic glycoproteins：in vitro galactosylation and sialylation of
glycoproteins withterminal N-acetylglucosamine and galactose residues.
Biochemistry.2001；40：8868-8876.
[0140] 4.Joziasse DH，Lee RT，Lee YC，et al.alpha3-galactosylated glycoproteins can bind to the hepatic asialoglycoprotein receptor.Eur J Biochem.2000；267：6501-6508.
[0141] 5.Van den Nieuwenhof IM，Koistinen H，Easton RL，et al.Recombinantglycodelincarrying the same type of glycan structures as contraceptive
glycodelin-A can be produced inhuman kidney 293 cells but not in Chinese
hamster ovary cells.Eur J Biochem.2000；267：4753-4762.
[0142] 6.Takashima S，Kurosawa N，Tachida Y，Inoue M，Tsuji S.Comparativeanalysis ofthe genomic structures and promoter activities of mouse Siaalpha2，
3Galbeta1，3GalNAcGalNAcalpha2，6-sialyltransferase genes (ST6GalNAc III and
IV)：characterization of theirSp1 binding sites.J Biochem (Tokyo).2000；127：
399-409.
[0143] 7.Chee Furng Wong D，Tin Kam Wong K，Tang Goh L，Kiat Heng C，Gek Sim Yap M.Impact of dynamic online fed-batch strategies on metabolism，productivityandN-glycosylation quality in CHO cell cultures.Biotechnol Bioeng.2005；89：
164-177.
[0144] 8.Chen P，Harcum SW.Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHOcells.J Biotechnol.2005；117：277-286.
[0145] 9.Chen P，Harcum SW.Effects of elevated ammonium on glycosylationgeneexpression in CHO cells.Metab Eng.2006；8：123-132.
[0146] 10.Nam JH，Zhang F，Ermonval M，Linhardt RJ，Sharfstein ST.The effects of cultureconditions on the glycosylation of secreted human placental alkalinephosphatase producedin Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2008；100：
1178-1192.
[0147] 11.Grabenhorst E，Hoffmann A，Nimtz M，Zettlmeissl G，ConradtHS.Construction ofstable BHK-21 cells coexpressing human secretory
glycoproteins and human Gal(beta1-4)GlcNAc-R alpha 2，6-sialyltransferase alpha
2，6-linked NeuAc is preferentially attachedto the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta
1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharidesfrom secreted
recombinant beta-trace protein.Eur J Biochem.1995；232：718-725.
[0148] 表1
[0149]
[0150] 表2
[0151] 溶劑可及表面積(ASA)計算參數(shù)：
[0152] 球形半徑：1.4
[0153] 埋藏閾值：0.25
[0154] Bck S.Chn 總計 SC Ref. 百分比 SC分類
[0155] TYR 1 0.27 125.59 125.86 232.25 54.08 E
[0156] ASN 2 7.49 64.20 71.70 152.56 42.08 E
[0157] SER 3 31.85 35.49 67.34 104.76 33.88 E
[0158] GLY 4 35.78 13.41 49.18 30.80 43.53 E
[0159] LYS 5 16.74 158.41 175.15 217.63 72.79 E
[0160] LEU 6 8.28 135.99 144.28 185.25 73.41 E
[0161] GLU 7 8.50 21.04 29.54 168.29 12.50 B
[0162] GLU 8 30.76 44.77 75.53 168.29 26.60 E
[0163] PHE 9 24.15 164.83 188.98 220.07 74.90 E
[0164] VAL 10 13.07 51.73 64.80 157.34 32.88 E
[0165] GLN 11 31.24 149.22 180.46 183.52 81.31 E
[0166] GLY 12 24.92 3.98 28.90 30.80 12.91 B
[0167] ASN 13 6.63 59.16 65.79 152.56 38.78 E
[0168] LEU 14 11.27 83.39 94.66 185.25 45.02 E
[0169] GLU 15 2.60 116.90 119.50 168.29 69.47 E
[0170] ARG 16 0.86 88.62 89.49 249.57 35.51 E
[0171] GLU 17 0.00 18.71 18.71 168.29 11.12 B
[0172] CYS 18 8.83 5.31 14.14 129.22 4.11 B
[0173] MET 19 18.21 138.84 157.06 195.71 70.94 E
[0174] GLU 20 39.22 46.20 85.41 168.29 27.45 E
[0175] GLU 21 13.25 19.74 32.98 168.29 11.73 B
[0176] LYS 22 14.47 176.83 191.30 217.63 81.25 E
[0177] CYS 23 16.54 4.14 20.68 129.22 3.20 B
[0178] SER 24 7.99 31.53 39.52 104.76 30.10 E
[0179] PHE 25 5.59 64.06 69.65 220.07 29.11 E
[0180] GLU 26 5.05 82.90 87.96 168.29 49.26 E
[0181] GLU 27 1.52 7.49 9.00 168.29 4.45 B
[0182] ALA 28 4.70 3.15 7.85 86.68 3.63 B
[0183] ARG 29 4.39 118.91 123.30 249.57 47.64 E
[0184] GLU 30 32.80 52.38 85.18 168.29 31.13 E
[0185] VAL 31 26.79 57.63 84.42 157.34 36.63 E
[0186] PHE 32 15.66 55.53 71.18 220.07 25.23 E
[0187] GLU 33 38.84 97.20 136.05 168.29 57.76 E
[0188] ASN 34 8.70 57.51 66.21 152.56 37.70 E
[0189] THR 35 6.61 62.61 69.22 141.80 44.15 E
[0190] GLU 36 4.28 98.00 102.28 168.29 58.23 E
[0191] ARG 37 2.80 119.95 122.76 249.57 48.06 E
[0192] THR 38 0.00 0.00 0.00 141.80 0.00 B
[0193] THR 39 0.00 54.41 54.41 141.80 38.37 E
[0194] GLU 40 10.13 57.40 67.54 168.29 34.11 E
[0195] PHE 41 8.14 42.37 50.50 220.07 19.25 B
[0196] TRP 42 0.00 61.69 61.69 267.74 23.04 B
[0197] LYS 43 10.33 119.92 130.25 217.63 55.10 E
[0198] GLN 44 4.98 133.39 138.37 183.52 72.69 E
[0199] TYR 45 25.77 75.81 101.58 232.25 32.64 E
[0200] VAL 46 8.23 65.11 73.35 157.34 41.38 E
[0201] ASP 47 20.51 55.77 76.27 135.82 41.06 E
[0202] GLY 48 10.54 2.70 13.24 30.80 8.77 B
[0203] ASP 49 0.58 35.16 35.73 135.82 25.89 E
[0204] GLN 50 6.81 104.99 111.80 183.52 57.21 E
[0205] CYS 51 3.97 22.00 25.97 129.22 17.03 B
[0206] GLU 52 31.64 139.49 171.12 168.29 82.89 E
[0207] SER 53 37.04 48.46 85.50 104.76 46.26 E
[0208] ASN 54 16.68 102.95 119.64 152.56 67.48 E
[0209] PRO 55 19.36 7.93 27.29 158.05 5.02 B
[0210] CYS 56 12.01 2.30 14.30 129.22 1.78 B
[0211] LEU 57 6.35 89.67 96.02 185.25 48.40 E
[0212] ASN 58 49.16 42.59 91.75 152.56 27.92 E
[0213] GLY 59 48.82 13.15 61.97 30.80 42.69 E
[0214] GLY 60 3.57 0.40 3.97 30.80 1.30 B
[0215] SER 61 11.00 85.41 96.41 104.76 81.53 E
[0216] CYS 62 17.13 1.83 18.96 129.22 1.42 B
[0217] LYS 63 7.94 139.66 147.60 217.63 64.17 E
[0218] ASP 64 15.09 57.49 72.58 135.82 42.32 E
[0219] ASP 65 7.60 43.64 51.24 135.82 32.13 E
[0220] ILE 66 30.84 144.89 175.73 187.72 77.18 E
[0221] ASN 67 13.32 122.54 135.85 152.56 80.32 E
[0222] SER 68 3.81 36.41 40.23 104.76 34.76 E
[0223] TYR 69 14.11 26.83 40.93 232.25 11.55 B
[0224] GLU 70 5.59 73.21 78.80 168.29 43.50 E
[0225] CYS 71 6.68 0.67 7.35 129.22 0.52 B
[0226] TRP 72 7.49 115.47 122.97 267.74 43.13 E
[0227] CYS 73 1.76 7.99 9.75 129.22 6.19 B
[0228] PRO 74 6.36 67.68 74.04 158.05 42.82 E
[0229] PHE 75 7.24 67.64 74.88 220.07 30.73 E
[0230] GLY 76 5.84 8.63 14.47 30.80 28.03 E
[0231] PHE 77 1.57 60.84 62.41 220.07 27.65 E
[0232] GLU 78 4.54 42.38 46.92 168.29 25.18 E
[0233] GLY 79 33.91 4.27 38.18 30.80 13.86 B
[0234] LYS 80 28.88 148.45 177.33 217.63 68.21 E
[0235] ASN 81 0.00 33.47 33.47 152.56 21.94 B
[0236] CYS 82 0.00 0.23 0.23 129.22 0.18 B
[0237] GLU 83 19.73 71.03 90.77 168.29 42.21 E
[0238] LEU 84 1.61 106.59 108.20 185.25 57.54 E
[0239] ASP 85 5.18 78.25 83.43 135.82 57.61 E
[0240] VAL 86 0.61 0.52 1.13 157.34 0.33 B
[0241] THR 87 0.56 59.85 60.41 141.80 42.21 E
[0242] CYS 88 12.82 25.94 38.77 129.22 20.08 B
[0243] ASN 89 32.29 109.18 141.47 152.56 71.56 E
[0244] ILE 90 9.42 71.41 80.83 187.72 38.04 E
[0245] LYS 91 31.54 47.20 78.74 217.63 21.69 B
[0246] ASN 92 14.48 28.84 43.32 152.56 18.90 B
[0247] GLY 93 0.00 0.00 0.00 30.80 0.00 B
[0248] ARG 94 4.85 114.06 118.90 249.57 45.70 E
[0249] CYS 95 0.00 0.00 0.00 129.22 0.00 B
[0250] GLU 96 0.10 40.37 40.48 168.29 23.99 B
[0251] GLN 97 0.00 0.00 0.00 183.52 0.00 B
[0252] PHE 98 0.00 38.92 38.92 220.07 17.68 B
[0253] CYS 99 0.93 1.21 2.13 129.22 0.93 B
[0254] LYS 100 1.98 161.78 163.76 217.63 74.34 E
[0255] ASN 101 26.90 32.19 59.09 152.56 21.10 B
[0256] SER 102 17.07 15.09 32.17 104.76 14.41 B
[0257] ALA 103 53.92 73.38 127.30 86.68 84.65 E
[0258] ASP 104 29.80 71.30 101.10 135.82 52.49 E
[0259] ASN 105 5.98 116.68 122.66 152.56 76.48 E
[0260] LYS 106 6.97 78.17 85.14 217.63 35.92 E
[0261] VAL 107 2.15 2.48 4.63 157.34 1.57 B
[0262] VAL 108 4.70 79.48 84.18 157.34 50.52 E
[0263] CYS 109 6.11 0.74 6.84 129.22 0.57 B
[0264] SER 110 3.10 48.75 51.85 104.76 46.53 E
[0265] CYS 111 19.48 3.24 22.72 129.22 2.51 B
[0266] THR 112 1.32 1.85 3.17 141.80 1.31 B
[0267] GLU 113 16.54 86.13 102.67 168.29 51.18 E
[0268] GLY 114 27.26 2.40 29.66 30.80 7.79 B
[0269] TYR 115 19.30 0.93 20.23 232.25 0.40 B
[0270] ARG 116 7.93 125.32 133.25 249.57 50.22 E
[0271] LEU 117 24.16 36.08 60.24 185.25 19.48 B
[0272] ALA 118 6.67 13.31 19.98 86.68 15.36 B
[0273] GLU 119 24.69 145.15 169.84 168.29 86.25 E
[0274] ASN 120 31.18 62.55 93.73 152.56 41.00 E
[0275] GLN 121 3.07 82.40 85.46 183.52 44.90 E
[0276] LYS 122 0.00 38.14 38.14 217.63 17.53 B
[0277] SER 123 0.12 38.91 39.03 104.76 37.14 E
[0278] CYS 124 1.30 0.00 1.30 129.22 0.00 B
[0279] GLU 125 5.57 83.86 89.42 168.29 49.83 E
[0280] PRO 126 10.45 60.74 71.18 158.05 38.43 E
[0281] ALA 127 27.45 24.33 51.79 86.68 28.07 E
[0282]
[0283]
[0284] ILE 216 0.00 0.00 0.00 187.72 0.00 B
[0285] VAL 217 0.00 0.00 0.00 157.34 0.00 B
[0286] THR 218 0.00 0.00 0.00 141.80 0.00 B
[0287] ALA 219 0.00 0.00 0.00 86.68 0.00 B
[0288] ALA 220 0.72 0.00 0.72 86.68 0.00 B
[0289] CYS 222 0.15 0.00 0.15 129.22 0.00 B
[0290] VAL 223 3.08 0.33 3.40 157.34 0.21 B
[0291] GLU 224 5.42 62.67 68.09 168.29 37.24 E
[0292] THR 225 55.43 85.50 140.93 141.80 60.30 E
[0293] GLY 226 23.22 15.40 38.62 30.80 49.99 E
[0294] VAL 227 14.36 32.05 46.41 157.34 20.37 B
[0295] LYS 228 21.74 169.93 191.67 217.63 78.08 E
[0296] ILE 229 1.70 0.00 1.70 187.72 0.00 B
[0297] THR 230 0.00 43.99 43.99 141.80 31.02 E
[0298] VAL 231 1.40 0.00 1.40 157.34 0.00 B
[0299] VAL 232 0.00 22.26 22.26 157.34 14.15 B
[0300] ALA 233 0.00 0.00 0.00 86.68 0.00 B
[0301] GLY 234 5.58 0.00 5.58 30.80 0.00 B
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[0402] LYS 341 43.24 145.22 188.46 217.63 66.73 E
[0403] PHE 342 14.62 24.42 39.04 220.07 11.10 B
[0404] THR 343 9.93 93.74 103.68 141.80 66.11 E
[0405] ILE 344 19.59 6.66 26.25 187.72 3.55 B
[0406] TYR 345 9.63 83.94 93.56 232.25 36.14 E
[0407] ASN 346 8.78 116.51 125.29 152.56 76.37 E
[0408] ASN 347 1.44 17.46 18.90 152.56 11.44 B
[0409] MET 348 5.65 1.01 6.66 195.71 0.52 B
[0410] PHE 349 2.97 5.49 8.46 220.07 2.50 B
[0411] CYS 350 0.34 0.00 0.34 129.22 0.00 B
[0412] ALA 351 2.12 0.15 2.27 86.68 0.17 B
[0413] GLY 352 2.51 0.00 2.51 30.80 0.00 B
[0414] PHE 353 1.64 19.67 21.31 220.07 8.94 B
[0415] GLU 355 13.85 62.67 76.51 168.29 37.24 E
[0416] GLY 356 20.68 0.00 20.69 30.80 0.01 B
[0417] GLY 357 22.76 4.81 27.58 30.80 15.63 B
[0418] ARG 358 1.89 66.71 68.60 249.57 26.73 E
[0419] ASP 359 9.52 11.56 21.07 135.82 8.51 B
[0420] SER 360 13.75 11.98 25.73 104.76 11.43 B
[0421] CYS 361 14.62 38.52 53.15 129.22 29.81 E
[0422] GLN 362 1.88 39.36 41.24 183.52 21.45 B
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[0440] GLY 381 0.00 0.00 0.00 30.80 0.00 B
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[0443] SER 384 1.95 0.00 1.95 104.76 0.00 B
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[0467] ILE 408 0.00 0.08 0.08 187.72 0.04 B
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[0469] GLU 410 4.61 86.16 90.77 168.29 51.20 E
[0470] LYS 411 5.92 54.20 60.12 217.63 24.90 B
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[0472] LYS 413 18.60 112.34 130.93 217.63 51.62 E
[0473] LEU 414 33.54 129.02 162.55 185.25 69.65 E
[0474] THR 415 42.16 44.61 86.77 141.80 31.46 E
[0475] 總面積：26818.00
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