活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制備方法與用途
閱讀：1049發(fā)布：2020-05-30
專利匯可以提供活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制備方法與用途專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 公開了一種高糖基化的活化的人凝血因子VII(FVIIa)融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。該融合蛋白從N端到C端依次包含人FVIIa、柔性肽接頭、至少1個人絨毛膜促性腺 激素 β亞基羧基末端肽剛性單元和延長 半衰期 部分(優(yōu)選人IgG Fc變體)。該融合蛋白具有與天然人FVIIa類似的 生物 學(xué)活性，且具有更長的體內(nèi)活性半衰期，從而改善藥代動 力 學(xué)和藥效。，下面是活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制備方法與用途專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種活化的人凝血因子VII的融合蛋白，所述融合蛋白從N端至C端依次包含活化的人凝血因子VII、柔性肽接頭、至少1個人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽剛性單元和延長半衰期部分；其中，延長半衰期部分選自人免疫球蛋白Fc片段或其變體、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或PEG，
其中，所述柔性肽接頭具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循環(huán)單元組合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整數(shù)，且a+b+c+d≥1；且所述人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元包含以下氨基酸序列：
(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(iii)SSSSKAPPPS；
(iv)SRLPGPSDTPILPQ。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的。
3.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通過在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而糖基化的。
4.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通過在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)而糖基化的。
5.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人凝血因子VII的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
6.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接頭優(yōu)選自下組：
(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；
(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。
7.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5個人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元。
8.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc變體具有降低的ADCC效應(yīng)和/或CDC效應(yīng)，和/或與FcRn受體的結(jié)合親和力增強。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc變體選自：
(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；
(ii)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；
(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；
(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；
(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
10.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：16所示。
11.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的活性>15000IU/mg，和/或，所述融合蛋白在動物體內(nèi)循環(huán)半衰期至少延長1倍。
12.編碼如權(quán)利要求1-11中任一項所述的融合蛋白的DNA分子。
13.如權(quán)利要求12所述DNA分子，所述DNA分子的序列如SEQ?ID?NO：17所示。
14.一種載體，其特征在于，包含如權(quán)利要求12或13所述的DNA分子。
15.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含如權(quán)利要求14所述的載體，或者轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求
14所述的載體。
16.一種藥物組合物，其特征在于，包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效劑量的如權(quán)利要求1-11中任一項所述的融合蛋白。
17.一種制備如權(quán)利要求1-11中任一項所述的融合蛋白的方法，所述方法包括：
(a)將根據(jù)權(quán)利要求12或13所述編碼融合蛋白的DNA引入CHO細(xì)胞，生成CHO衍生的細(xì)胞系；
(b)篩選步驟(a)中在其生長培養(yǎng)基中每24小時期間內(nèi)，表達(dá)超過3μg/106個細(xì)胞的高產(chǎn)細(xì)胞株；
(c)培養(yǎng)步驟(b)篩選到的細(xì)胞株，表達(dá)融合蛋白；
(d)收獲步驟(c)中得到的發(fā)酵液，純化融合蛋白；
(e)激活步驟(d)中純化的融合蛋白。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中融合蛋白純化過程包含Protein?A親和層析、多維模式層析、陰離子交換層析和分子篩層析。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中Protein?A親和層析使用Mabselect層析介質(zhì)；和所述多維模式層析使用CHT陶瓷羥磷灰石II型層析介質(zhì)；和所述陰離子交換層析使用Q?Sepharose?High?Performance層析介質(zhì)；和所述分子篩層析使用Superdex?200層析介質(zhì)。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(e)中激活步驟采用凝血因子XII激活、柱上自激活或溶液自激活。
21.一種如權(quán)利要求1-11中任一項所述融合蛋白在制備預(yù)防或治療出血性疾病的藥物中應(yīng)用。
22.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，包括用于制備產(chǎn)生FVIII抗體的A型血友病患者或產(chǎn)生FIX抗體的B型血友病患者的自發(fā)性出血、手術(shù)中或手術(shù)后出血的治療或預(yù)防、先天性或后天獲得性FVII缺乏癥患者的出血性疾病的預(yù)防或治療、和/或血小板機能不全患者的治療的藥物中應(yīng)用。
活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制備方法與用途
技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)
[0002] FVII是一種維生素K依賴性的血漿糖蛋白，在肝臟中合成，并以分子量約為53KDa的單鏈蛋白酶原形式分泌到血液中(Broze等,J?Biol?Chem,1980,255:1242-1247)。FVII酶原在單一位點Arg152-Ile153處被蛋白酶水解，產(chǎn)生由一個二硫鍵連接的雙鏈，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问紽VIIa?；罨腇VIIa包含NH2-末端衍生的輕鏈(約20KDa)和COOH-末端衍生的經(jīng)由單一二硫鍵(Cys135至Cys262)連接的重鏈(約30KDa)。輕鏈含有細(xì)胞膜結(jié)合Gla結(jié)構(gòu)域和兩個“類表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域”，而重鏈含有絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。處于活化形式時，F(xiàn)VIIa作為絲氨酸蛋白酶，參與凝血級聯(lián)反應(yīng)的外源性途徑(extrinsic?pathway)。在血友病治療中使用FVIIa是基于FVIIa對于凝血酶活化的血小板表面低親和性結(jié)合，通過給予藥物學(xué)劑量的外源性FVIIa，使損傷位處血小板表面凝血酶產(chǎn)生被增強，這與FVIII/FIX存在無關(guān)，即繞開對于FVIIIa和FIXa的需求來起到止血作用。因此，F(xiàn)VIIa可用于產(chǎn)生抑制物的血友病患者出血性狀況的預(yù)防和治療。市售的重組凝血因子VIIa目前只有(Novo?Nordisk，丹麥)。該藥已在全世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療產(chǎn)生FVIII或FIX抗體(抑制物)的血友病A或B患者、先天性FVII缺陷的患者以及終止與外傷和/或手術(shù)相關(guān)的出血事件或預(yù)防出血。
[0003] 然而，治療性凝血蛋白藥物包括FVIIa在內(nèi)會被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗體中和，這導(dǎo)致其體內(nèi)循環(huán)半衰期大幅降低，由此限制了它們的療效。重組FVIIa在人體內(nèi)循環(huán)半衰期約為2.3小時，需要每隔2-3小時注射一次。
[0004] 為了提高FVIIa的體內(nèi)半衰期，由CSL?Behring公司開發(fā)的rFVIIa-FP(白蛋白與FVIIa的C端融合)已完成臨床I期研究，它在正常受試者中的血清半衰期與市售FVIIa相比提高了3-4倍(Golor?G等,J?Thromb?Haemost,2013,11(11):1977-85)，生物學(xué)活性為620-770IU/mg，相當(dāng)于69-75IU/nM(Weimer?T等，Thromb?Haemost,2008,99:659-667)。
[0005] FVIIa的聚乙二醇化脂質(zhì)體制劑PEGLip-FVIIa(Omri公司開發(fā))也處于臨床早期，并且其血清半衰期僅為天然FVIIa的2倍。此外，由諾和諾德公司開發(fā)的N-糖基定點PEG化修飾FVIIa(N7-GP)相對rFVIIa延長了約5倍，但由于臨床II期數(shù)據(jù)缺乏量-效線性關(guān)系且有受試者發(fā)生了過敏反應(yīng)，該項目已終止研究(Ljung?R等,J?Thromb?Haemost,2013,11(7):1260-8)。
[0006] 由Biogen公司開發(fā)的rFVIIaFc單體-二聚體雜合型(monomer/dimer?hybrid)融合蛋白仍處于早期研究階段，研究顯示Monomeric?rFVIIaFc在A型血友病小鼠體內(nèi)的終末半衰期為6.6小時，為對照組rFVIIa 的5.5倍。在靜脈注射rFVIIaFc?5分鐘時，小鼠凝血活性即恢復(fù)至正常值的40％，然而在起始階段其活性會急劇衰減，在給藥后30分鐘即下降到20％左右，給藥后1小時已下降至約10％，這與 在0～1小時的下降趨勢相似。雖然給藥1h后與rFVIIa相比，rFVIIaFc組活性下降趨勢有所變緩，但在靜注rFVIIaFc?8小時后，活性已降至1％左右，已低于凝血活性基線水平，無法有效止血。這暗示rFVIIaFc僅在短時間內(nèi)可有效控制急性出血癥狀，并不能長期、平穩(wěn)、有效地維持機體的正常凝血功能。體外凝血活性試驗顯示rFVIIaFc摩爾比活性為1115IU/nM，與(2511IU/nM)相比下降約60％，研究者認(rèn)為這種活性降低是由于融合配體Fc的空間位阻效應(yīng)引起的，這使得它與可溶性組織因子(sTF)的結(jié)合常數(shù)(Kd)下降(J.Salsa等,Thrombosis?Research,2015,135:970–976)。此外，本發(fā)明人之前構(gòu)建的一種同源二聚體型rFVIIa-Fc，雖然其半衰期大幅延長，但也存在活性降低的問題，體外活性也僅為208-240IU/nM(中國發(fā)明專利號：CN104774269B)。
[0007] 人絨毛膜促性腺激素(hCG)β鏈的羧基末端肽(以下稱其為CTP)也具有延長某些蛋白質(zhì)體內(nèi)半衰期的作用，因此有些專利文獻(xiàn)公開的融合蛋白中包含的延長半衰期部分可以選擇使用Fc、HSA、CTP或其他能延長半衰期的融合配體。例如，OPKO/Prolor公司開發(fā)的rFVIIa-CTP融合蛋白，rFVIIa分別串聯(lián)1～5個CTP分子會以與CTP成比例的方式顯著增加FVII的半衰期，當(dāng)添加3、4或5個CTP分別使FVII半衰期延長了0.67、2和3倍；但CTP的添加降低了rFVIIa比活性，如rFVIIa-CTP3相對于 的比活性(U/mg?FVIIa)降低了約4倍(中國發(fā)明專利申請號：CN201380019660.8)。另外，CTP也可以作為接頭序列，主要用于連接同一個蛋白質(zhì)的不同亞基。例如，中國專利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公開的融合蛋白中，CTP作為接頭，位于促卵泡激素的beta亞基和alpha亞基之間；專利WO2005058953A2公開的融合蛋白中，CTP作為接頭，用于連接糖蛋白激素的beta亞基和alpha亞基。
[0008] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)公開的長效rFVIIa都存在半衰期延長有限、生物活性顯著降低或免疫原性強的問題，其原因主要是因為FVIIa的C端含有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(153-406殘基)，因而C末端融合其他分子會影響FVIIa的催化活性及功能。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在FVIIa和延長半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)之間，僅通過一段較長的常規(guī)的柔性肽接頭(例如(GGGGS)n)連接，反而使得融合蛋白對蛋白酶更為敏感，更糟糕的是這樣長的肽接頭還使得大部分融合蛋白以聚合體形式表達(dá)，幾乎沒有生物學(xué)活性。本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，采用柔性肽和CTP共同組成的接頭分子連接FVIIa和延長半衰期部分(如，人IgG?Fc)，能夠最大程度地保留FVIIa的生物活性，并更顯著地延長其體內(nèi)活性半衰期。
發(fā)明內(nèi)容
[0009] 本發(fā)明目的是提供一種高糖基化的活化的人凝血因子VII融合蛋白，所述融合蛋白具有顯著延長的半衰期且保持與重組人凝血因子VIIa(FVIIa)類似的生物學(xué)活性；另一方面，本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的制備方法與用途。
[0010] 一方面，本發(fā)明提供了一種活化的人凝血因子VII融合蛋白(以下簡稱融合蛋白)，所述融合蛋白從N端至C端依次含有活化的人凝血因子VII(FVIIa)、柔性肽接頭(表示為L)、至少1個人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元(以下簡稱CTP剛性單元，表示為(CTP)n，較優(yōu)地，n為1,2,3,4,或5)和延長半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或PEG，優(yōu)選人IgG?Fc變體(表示為vFc))。本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，所述融合蛋白表示為FVIIa-L-CTPn-vFc。
[0011] 其中，所述人凝血因子VII的氨基酸序列與天然人凝血因子VII至少80％同源；更優(yōu)選地，所述人凝血因子VII的氨基酸序列與天然人凝血因子VII至少90％同源；最優(yōu)選地，所述人凝血因子VII包含如SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。
[0012] 其中，F(xiàn)VIIa還包括于施藥者體內(nèi)被激活或于施藥前被激活為FVIIa的以酶原形式存在的人凝血因子VII(簡寫為FVII)。
[0013] 其中，所述柔性肽接頭優(yōu)選是非免疫原性的，并且在FVII和Fc之間產(chǎn)生足夠的距離，使相互之間的位阻效應(yīng)降至最低。較佳地，使用含有2個或更多個氨基酸殘基組成的柔性肽接頭，且選自下列幾種氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。
[0014] 更優(yōu)選地，所述柔性肽接頭包含G和S殘基。連接肽的長度對融合蛋白的活性非常重要。對本發(fā)明而言，所述肽接頭可優(yōu)選地包含以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循環(huán)單元組合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整數(shù)，且a+b+c+d≥1。
[0015] 具體地，本發(fā)明的實施例中，所述肽接頭可優(yōu)選地包含如下序列：
[0016] (i)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ?ID?NO：2所示)；
[0017] (ii)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ?ID?NO：3所示)；
[0018] (iii)L3：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ?ID?NO：4所示)；
[0019] (iv)L4：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ?ID?NO：5所示)；
[0020] (v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(如SEQ?ID?NO：6所示)；
[0021] 其中，所述CTP剛性單元選自由人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端第113至145位氨基酸所組成的全長序列或其片段，具體地，所述剛性單元包含如SEQ?ID?NO：7所示氨基酸序列或其截短的序列。
[0022] 優(yōu)選地，所述CTP剛性單元包含至少2個糖基化位點；例如，本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述CTP剛性單元包含2個糖基化位點，示例性地，所述CTP剛性單元包含SEQ?ID?NO：7N端的10個氨基酸，即SSSS*KAPPPS*，或所述CTP剛性單元包含SEQ?ID?NO：7C端的14個氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一實施例中，所述CTP剛性單元包含3個糖基化位點，示例性地，所述CTP剛性單元包含SEQ?ID?NO：7N端的16個氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一些實施例中，所述CTP剛性單元包含4個糖基化位點，示例性地，所述CTP剛性單元包含28、29、30、31、32或33個氨基酸并開始于人絨毛膜促性腺激素β亞基的第113、114、115、116、117或118位，終止于第145位。具體地，所述CTP剛性單元包含SEQ?ID?NO：7N端的28個氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位點。每種可能性都代表本發(fā)明的獨立實施方式。
[0023] 在另一些實施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些實施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些實施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些實施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少95％同源。
[0024] 本發(fā)明的具體實施例中，所述CTP剛性單元可優(yōu)選地包含如下序列：
[0025] (i)CTP1：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ?ID?NO：7所示)；
[0026] (ii)CTP2：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ?ID?NO：8所示)；
[0027] (iii)CTP3：SSSSKAPPPS(如SEQ?ID?NO：9所示)；
[0028] (iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ(如SEQ?ID?NO：10所示)。
[0029] 本發(fā)明一些實施例中，所述融合蛋白包含1個上述CTP剛性單元。
[0030] 本發(fā)明另一些實施例中，所述融合蛋白包含1個以上的上述CTP剛性單元，優(yōu)選地，包含2，3，4或5個上述CTP剛性單元，如本發(fā)明的一實施例中，所述融合蛋白包含2個CTP3剛性單元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3，或表示為(CTP3)2)。
[0031] 其中，延長半衰期部分優(yōu)選自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA?Fc片段；更優(yōu)選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其變體的Fc片段；進(jìn)一步地，所述人IgG?Fc變體包含位于野生型人IgG?Fc中的至少一種氨基酸修飾，且變體具有降低的效應(yīng)子功能(ADCC和/或CDC效應(yīng))和/或與新生兒受體FcRn的結(jié)合親和力增強。進(jìn)一步地，人IgG?Fc變體可選自下組：
[0032] (i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ?ID?NO：11所示氨基酸序列)；
[0033] (ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ?ID?NO：12所示氨基酸序列)；
[0034] (iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ?ID?NO：13所示氨基酸序列)；
[0035] (iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ?ID?NO：14所示氨基酸序列)。
[0036] (v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ?ID?NO：15所示氨基酸序列)。
[0037] 本發(fā)明所提供的IgG?Fc變體包含但不限于(i)～(v)中所述5種變體，還可以是IgG同種亞型間兩類功能變體突變位點的組合或疊加，如上述(iv)中所述變體即是由(ii)和(iii)中的突變位點相疊加所獲得的新的IgG2Fc的組合變體。
[0038] 本發(fā)明所述融合蛋白中的Fc變體(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。這種CH2區(qū)域在228、234、235和331位(由EU計數(shù)系統(tǒng)確定)含有氨基酸突變。據(jù)信這些氨基酸突變能降低Fc的效應(yīng)子功能。人IgG2不結(jié)合FcγR，但顯示出極弱的補體活性。具有Pro331Ser突變的Fcγ2變體應(yīng)比天然Fcγ2的補體活性更低，而且依舊是FcγR非結(jié)合子。IgG4Fc在激活補體級聯(lián)中有缺陷，且它與FcγR的結(jié)合親和力比IgG1低約一個數(shù)量級。與天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突變的Fcγ4變體應(yīng)表現(xiàn)出最小的效應(yīng)子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1也表現(xiàn)出比天然Fcγ1降低的效應(yīng)子功能。這些Fc變體都比天然人IgG?Fc更適于制備FVIIa融合蛋白。而250和428位(由EU編號體系確定的位置)含有氨基酸突變，使得Fc區(qū)與新生兒受體FcRn的結(jié)合親和力增加，從而進(jìn)一步延長半衰期(Paul?R等,J?Biol?Chem,2004,279:6213–6216)；上述兩類功能變體的相互組合或疊加，獲得新的組合變體，使其效應(yīng)子功能降低的同時且延長了其體內(nèi)循環(huán)半衰期。本發(fā)明所述Fc變體包含卻不局限于上述幾個位點的突變，也可引入其它位點的替換使得Fc具有降低的效應(yīng)子功能和/或與FcRn受體的結(jié)合力增強，同時還不會致使Fc變體功能/活性降低或引起不良的構(gòu)象變化，常見的突變位點參見Shields?RL等,J?Biol?Chem,2001,276(9):6591-604。
[0039] 本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：16所示；
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種編碼上述融合蛋白的DNA。
[0041] 本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO：17所示。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種載體，該載體包含上述DNA。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含上述載體，或者轉(zhuǎn)染了上述的載體。
[0044] 在本發(fā)明的實施例中，所述宿主細(xì)胞是CHO的衍生細(xì)胞株DXB-11。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種藥物組合物。該藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效量的上述融合蛋白。
[0047] (a)將編碼融合蛋白的DNA引入CHO細(xì)胞，生成CHO衍生細(xì)胞系；
[0048] (b)篩選步驟(a)中每24小時期間內(nèi)，表達(dá)超過3μg/106個細(xì)胞的高產(chǎn)量細(xì)胞株；
[0049] (c)培養(yǎng)步驟(b)篩選到的細(xì)胞株，表達(dá)融合蛋白；
[0051] (e)激活步驟(d)中純化的融合蛋白。
[0052] 進(jìn)一步地，所述步驟(a)中CHO衍生細(xì)胞系為DXB-11。
[0053] 進(jìn)一步地，所述步驟(d)中采用四步層析法對融合蛋白進(jìn)行純化，分別為Protein?A親和層析、多維模式層析、陰離子交換層析和分子篩層析。
[0054] 第一步Protein? A親和層析步驟，優(yōu)選地使用市售的例如但不限于GE的MabselectTM、Mabselect?SuReTM，或TOSOH的Toyopearl?AF-rProteinA-650FTM，或博格隆的rProtein?A?BestaroseTM，或天地人和的rProtein?A?BeadTM，或賽分科技的MabPurixTM層析介質(zhì)。它是利用融合蛋白的Fc片段(人IgG)與單克隆抗體特異性的結(jié)合進(jìn)行捕獲，因為親和介質(zhì)上的protein?A配基對Fc段具有很高的親和力，可以與其可逆的特異性結(jié)合。X射線晶體衍射分析顯示，protein?A和Fc片段結(jié)合位點中心一個高度保守的組氨酸殘基六元環(huán)，在中性及堿性pH下這個組氨酸殘基不帶電，因為疏水作用緊緊的結(jié)合在一起。而當(dāng)pH降低或者疏水性減弱以后，組氨酸殘基帶電后相互排斥或者Fc融合蛋白在溶劑中的溶解性增強時，與親和介質(zhì)結(jié)合的蛋白能夠被洗脫下來。因此本發(fā)明第一步采用親和層析可以快速高效的從發(fā)酵液中捕獲并純化融合蛋白。
[0055] 第二步的多維模式層析步驟，優(yōu)選地使用市售的例如但不限于Bio-Rad公司的CHTTM(陶瓷羥磷灰石I型或II型)層析介質(zhì)(40μm或80μm)。融合蛋白N端存在10個可被羧基化的Glu殘基，經(jīng)羧基化后具有成對的負(fù)電荷。CHT介質(zhì)為五個鈣雙聯(lián)體和一對含羥基的磷三聯(lián)體組按一個重復(fù)的幾何圖形排列，其中PO43－離子能與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有離子交換特性，而Ca2+離子與融合蛋白的自由羧基上的成對的負(fù)電荷以金屬螯合方式結(jié)合，且該結(jié)合方式對NaCl不敏感，可由磷酸鈉濃度梯度競爭性洗脫。根據(jù)文獻(xiàn)報道，F(xiàn)VIIa的羧基化程度與其生物學(xué)活性具有相關(guān)性(Hagen?FS等，Proc?Natl?Acad?Sci?USA,1986,83(8):2412-2416；美國專利US8304224；美國專利US2009/0042784)。所以本發(fā)明中經(jīng)親和層析捕獲的融合蛋白使用CHT進(jìn)行第二步純化，以分離較高生物學(xué)活性的目標(biāo)組分。
[0056] 第三步的陰離子交換層析步驟，優(yōu)選地使用市售的例如但不限于GE的Q?Sepharose?HPTM、Q?Sepharose?FFTM層析介質(zhì)，或博格隆的Q?Bestarose?HPTM、Q?Bestarose?FFTM層析介質(zhì)，或天地人和的Q?Beads?6HPTM、Q?Beads?6FFTM層析介質(zhì)進(jìn)行分離純化，用于去除污染物。離子交換對分子的分離是基于它們表面凈電荷的差異。分子的電荷性質(zhì)差異較大，它們所帶的總電荷、電荷密度以及表面電荷分布的差異會導(dǎo)致它們與加載電荷后的離子交換層析填料的結(jié)合能力不同。通過逐漸提高緩沖液中的NaCl濃度進(jìn)行競爭性洗脫，可以將融合蛋白與污染物進(jìn)行分離。
[0057] 第四步的分子篩層析步驟，優(yōu)選地使用市售的例如但不限于GE的Superdex200TM，或博格隆的Chromdex?200?prep?gradeTM層析介質(zhì)進(jìn)行分離。分子篩層析主要是根據(jù)蛋白分子大小來進(jìn)行分離的一種層析方法。分子篩介質(zhì)是多孔的球狀顆粒，當(dāng)不同大小的蛋白(如同一種蛋白的單體和聚合體)通過裝好的分子篩柱時，不同大小的蛋白在柱中所走的路徑不同，大分子不能進(jìn)入介質(zhì)的小孔中，在柱中保留時間相對短，先洗脫出來；而小分子可以進(jìn)入介質(zhì)的小孔中，在層析柱中經(jīng)過的路徑要長，因此后洗脫出來。本發(fā)明中經(jīng)上述三步層析分離得到的融合蛋白仍具有一定的聚合體組分，可能會影響其激活過程及激活后的生物學(xué)活性，因此采用分子篩層除去其中的聚合體組分。
[0058] 進(jìn)一步地，所述步驟(e)中的激活步驟可以通過凝血因子XII(FXII)激活、柱上自激活或溶液孵育自激活法對融合蛋白進(jìn)行激活。FVII轉(zhuǎn)變成活性的FVIIa需要在FXII的作用下完成(Hedner等,J?Clin?Invest,1983,71:1836-1841)，或者其他具有胰蛋白酶樣活性的蛋白酶也可以激活FVII(Kisiel等,Behring?Inst?Mitt,1983,73:29-42)；FVII也可以不利用其他蛋白酶，僅靠FVII自身激活為FVIIa，即通過它的絲氨酸蛋白酶區(qū)域自激活。FVII還可以通過與帶正電荷表面或者填料結(jié)合完成自激活，如陰離子交換填料(Pedersen?AH等,Biochemistry,1989,28:9331-9336)。增加離子強度、降低PH，或者增加溶液中Ca2+的濃度可以使活化的FVIIa從正電荷表面或者填料上解離(Bjoern等,Research?Disclosures,1986,269:564-56)。溶液條件下自激活參照美國專利US2007/0129298。
[0059] 本發(fā)明一實施例中，采用溶液孵育自激活法對融合蛋白進(jìn)行激活，活化的融合蛋白的活性>15000IU/mg。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了所述融合蛋白在制備用于治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中應(yīng)用。優(yōu)選地，所述融合蛋白用于治療FVII先天性或獲得性缺乏癥患者的出血性疾病的預(yù)防或治療，血友病A或B患者的自發(fā)或手術(shù)性出血的預(yù)防或治療，或其它相關(guān)的出血性疾病藥物中應(yīng)用。
[0061] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。
[0062] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所公開和/或所記載的融合蛋白及其制備方法的優(yōu)點可以概括如下：
[0063] 1、本發(fā)明構(gòu)建的FVIIa融合蛋白，其Fc段是非裂解性的，即通過對Fc片段的補體、受體結(jié)合域進(jìn)行突變，調(diào)節(jié)Fc與相應(yīng)受體的結(jié)合親和力，降低或消除ADCC和CDC效應(yīng)，而只保留Fc段延長活性蛋白體內(nèi)半衰期的作用，卻不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。Biogen公司開發(fā)的FVIIa融合蛋白，其Fc段是天然來源的，可以預(yù)測由Fc介導(dǎo)的不良效應(yīng)子功能必將會增加患者的治療風(fēng)險。
[0064] 2、FVIIa融合蛋白在體內(nèi)活性半衰期延長了約3倍，單次注射FP-A?3h后血漿凝血活性約40％，而等活性給藥的諾其組3h后活性已降至3％；FP-A給藥12h后血漿凝血活性仍保持在7％以上，與Biogen公司開發(fā)的單體-二聚體雜合型(Monomeric)rFVIIaFc(參見J.Salsa等,Thrombosis?Research,2015,135:970–976)相比，具有更長的體內(nèi)活性半衰期。而血清中藥物濃度波動減少，安全性提高，可降低注射頻率而提高患者的生活質(zhì)量；
[0065] 3、本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白相對于Biogen公司構(gòu)建的單體-二聚體雜合型(Monomeric)FVII融合蛋白，其表達(dá)、純化步驟更加高效便捷、可大大降低生產(chǎn)成本。Biogen公司構(gòu)建了rFVIIIFc與Fc的雙表達(dá)載體，其中Fc分子以Flag標(biāo)記(歐洲專利，公開號：EP1624891B1)。其所表達(dá)的融合蛋白發(fā)酵液中預(yù)期應(yīng)含有三種形式的產(chǎn)物，分別是FVII-Fc:FVII-Fc同源二聚體型(Dimeric)融合蛋白、FVII-Fc:FLAG-Fc單體-二聚體雜合體(Monomeric)融合蛋白以及FLAG-Fc:FLAG-Fc二聚體三種產(chǎn)物。一方面，在融合蛋白表達(dá)過程中，因宿主細(xì)胞需同時表達(dá)FVII-Fc和Fc兩種單鏈分子，再分別兩兩聚合形成上述三種產(chǎn)物，因而使最終目的產(chǎn)物的表達(dá)效率大大減弱；再者，在純化過程中還必須去除另外兩種形式的雜質(zhì)，這使其純化過程也更為復(fù)雜、生產(chǎn)效率低下，其生產(chǎn)成本也大大增加。因此，本發(fā)明的制備方法相對于Biogen公司開發(fā)的Monomeric?rFVIIFc融合蛋白具有一定的技術(shù)優(yōu)勢和價格優(yōu)勢，其表達(dá)、純化工藝都更簡單、高效，生產(chǎn)成本也更低；
[0066] 4、各批次純化的融合蛋白的比活性至少可以達(dá)到15000IU/mg，約2949IU/nM(每個融合蛋白含有2個FVIIa，相當(dāng)于1474.4IU/nM?FVIIa)，還有一些批次的融合蛋白活性最高甚至超過22470IU/mg，換算為摩爾比活性約為4325IU/nM(每個融合蛋白含有2個FVIIa，相當(dāng)于2162IU/nM?FVIIa)，與已上市的重組FVIIa——諾其(2511IU/nM?FVIIa)的活性相當(dāng)，說明本發(fā)明提供的融合蛋白，其C端融合的Fc對FVIIa的活性影響極?。?/div>
[0067] 5、組成所述融合蛋白的CTP剛性單元，它含有多個O-糖基側(cè)鏈，能形成相對穩(wěn)定的立體構(gòu)象，可以有效地將FVIIa與Fc隔離開。另一方面，CTP剛性單元含有糖基，帶負(fù)電、高度唾液酸化的CTP剛性單元能夠抵抗腎臟的清除作用，進(jìn)一步延長融合蛋白的半衰期；再一方面，CTP剛性單元糖基側(cè)鏈的保護作用可以降低連接肽對蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在連接區(qū)被降解；
[0068] 6、本發(fā)明提供的所述融合蛋白的制備方法，具有產(chǎn)量高的優(yōu)點。本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，在300ml搖瓶中連續(xù)培養(yǎng)14天，累積產(chǎn)量達(dá)到310mg/L，可進(jìn)行工藝放大，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0069] 發(fā)明詳述：
[0070] 柔性連接肽
[0071] 連接肽長度對融合蛋白活性非常重要。WO2007090584A1專利中公開的一種FVII/FVIIa-白蛋白融合多肽，在FVII/FVIIa與白蛋白之間插入不同長度的連接肽，發(fā)現(xiàn)無連接肽的FVII/FVIIa融合蛋白的生物學(xué)活性顯著下降，而含有連接肽的FVII/FVIIa-FP融合蛋白，顯示其生物學(xué)活性的增加依賴于連接肽的長度，這可能解釋為融合蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能，有利于形成更高比活性的構(gòu)象。
[0072] 本發(fā)明人此前設(shè)計了3種不同長度的由甘氨酸和絲氨酸組成的柔性連接肽，F(xiàn)VII通過該連接肽與其C端融合的Fc連接組成融合蛋白(不含CTP剛性單元)，瞬時表達(dá)實驗表明，由2個氨基酸的短肽接頭GlySer連接的融合蛋白幾乎檢測不到活性，表明維持FVIIa生物活性的重要功能區(qū)域在三維結(jié)構(gòu)上受C端融合配體的影響較大。當(dāng)連接肽增加到16個氨基酸時，F(xiàn)VIIa融合蛋白的生物活性明顯提高，但仍遠(yuǎn)低于重組FVIIa。再當(dāng)連接肽進(jìn)一步延長至37個氨基酸時，CHO細(xì)胞所分泌的融合蛋白部分發(fā)生聚合，活性較低。這表明單純通過延長連接肽的長度并不能完全解決Fc片段對FVIIa活性影響的問題。
[0073] hCG-β羧基末端肽(CTP)
[0074] CTP是一段來自人絨毛膜促性腺激素(hCG)的β-亞基羧基末端的短肽。四種與生殖相關(guān)的多肽類激素促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH)和絨毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亞基和各自特異的β-亞基。與其它三種激素相比，hCG體內(nèi)半衰期明顯延長，這主要來源于其β-亞基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares?FA等,Proc?Natl?Acad?Sci?USA,1992,89:4304-4308)。天然的CTP含有37個氨基酸殘基，它具有4個O-糖基化位點，終端是唾液酸殘基。帶負(fù)電、高度唾液酸化的CTP能夠抵抗腎臟對其的清除作用，從而延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。然而，本發(fā)明人創(chuàng)造性地將至少一個CTP多肽與適當(dāng)長度的柔性連接肽連接，共同作為連接肽，用于連接FVII與延長半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)。
[0075] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VIIa的C端催化功能域?qū)ζ涔δ馨l(fā)揮極為關(guān)鍵，且FVIIa空間構(gòu)象復(fù)雜、脆弱，融合配體的位阻效應(yīng)極易對其正確折疊造成干擾。通過在FVIIa與Fc變體間增加CTP剛性單元，相當(dāng)于增加了一段剛性連接肽。這一方面保證了N-端融合的FVIIa不會影響Fc變體與FcRn的結(jié)合位點，從而影響半衰期；另外Fc的Protein?A結(jié)合位點對于制備工藝中純化步驟很重要，連接CTP剛性單元保證N-端融合的FVIIa也不會“罩住”它與protein?A的結(jié)合位點。另一方面，CTP剛性單元的添加也使得約25KD大小的Fc片段不會干擾N-端融合的FVIIa的正確折疊，造成其生物學(xué)活性/功能的下降或喪失。同時還證實單純延長柔性連接肽的長度并不能改善Fc段對FVIIa活性的影響，過長的連接肽還會造成多聚體的形成以及對蛋白酶敏感性增加而易被降解，而CTP剛性單元的加入使得融合蛋白的生物學(xué)活性顯著提高。這可能解釋為具有多個糖基側(cè)鏈的CTP剛性多肽，相對于(GGGGS)n這類柔性連接肽的無規(guī)則卷曲，它可以形成穩(wěn)定的立體構(gòu)象，這種“阻隔”作用促使FVIIa和Fc段獨立折疊形成正確的三維構(gòu)象而互不影響各自的生物活性。再一方面，CTP糖基側(cè)鏈的保護作用可以降低連接肽對蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在連接區(qū)被降解。
[0076] IgG?Fc變體
[0077] 非裂解性Fc變體
[0078] Fc元件來源于免疫球蛋白IgG的恒定區(qū)Fc片段，它在消滅病原體的免疫防御中起重要作用。Fc介導(dǎo)的IgG的效應(yīng)子功能發(fā)揮通過兩種機制：(1)與細(xì)胞表面Fc受體(FcγRs)結(jié)合，由吞噬作用或裂解作用或殺傷細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分C1的C1q結(jié)合，引發(fā)補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG亞型中，IgG1和IgG3能有效結(jié)合FcγRs，IgG4與FcγRs的結(jié)合親和力較低，而IgG2與FcγRs的結(jié)合低得難以測定，所以人IgG2幾乎沒有ADCC效應(yīng)。此外，人IgG1和IgG3還能有效結(jié)合C1q而激活補體級聯(lián)反應(yīng)。人IgG2與C1q結(jié)合相對弱，而IgG4不與C1q結(jié)合(Jefferis?R等,Immunol?Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2CDC效應(yīng)也較弱。顯然，沒有一種天然IgG亞型是非常適合構(gòu)建FVIIa/Fc融合蛋白的。為了得到不具效應(yīng)子功能的非裂解性Fc，最有效方法是對Fc片段上補體、受體結(jié)合域突變改造，調(diào)節(jié)Fc與相關(guān)受體的結(jié)合親和力，降低或消除ADCC和CDC效應(yīng)，只保留Fc的長循環(huán)半衰期特性，而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。更多的非裂解性Fc變體所包含突變位點可以參見Shields?RL等,J?Biol?Chem,2001,276(9):6591-604或中國發(fā)明專利CN?201280031137.2。
[0079] 與新生兒受體(FcRn)結(jié)合親和力增強的Fc變體
[0080] IgG的血漿半衰期取決于它與FcRn的結(jié)合，一般在pH6.0時結(jié)合，在pH7.4(血漿pH)時解離。通過對兩者結(jié)合位點的研究，改造IgG上與FcRn結(jié)合的位點，使之在pH6.0時結(jié)合能力增加。已經(jīng)證明對于結(jié)合FcRn重要的人Fcγ結(jié)構(gòu)域的一些殘基的突變可增加血清半衰期。已報道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突變可增加或降低FcRn結(jié)合親和力(Roopenian等,Nat.Rview?Immunology7:715-725,2007)。韓國專利號KR?10-1027427公開了具有增加的FcRn結(jié)合親和力的曲妥珠單抗(赫賽汀，Genentech)變體，并且這些變體包含選自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一個或更多個氨基酸修飾。韓國專利公開號KR?2010-0099179提供了貝伐單抗(阿瓦斯汀，Genentech)變體并且這些變體通過包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修飾顯示增加的體內(nèi)半衰期。此外，Hinton等也發(fā)現(xiàn)T250Q和M428L?2個突變體分別使與FcRn的結(jié)合增加3和7倍。同時突變2個位點，則結(jié)合增加28倍。在恒河猴體內(nèi)，M428L或T250QM/428L突變體顯示血漿半衰期增加2倍(Paul?R.Hinton等,J?Immunol,2006,176:346-356)。更多的與新生兒受體(FcRn)結(jié)合親和力增強的Fc變體所包含突變位點可以參見中國發(fā)明專利CN201280066663.2。此外，有研究對五種人源化抗體的Fc段進(jìn)行T250Q/M428L突變不僅改善了Fc與FcRn的相互作用，且在隨后的體內(nèi)藥代動力學(xué)試驗中，發(fā)現(xiàn)以皮下注射方式給藥，F(xiàn)c突變抗體與野生型抗體相比藥代動力學(xué)參數(shù)有所改善，如體內(nèi)暴露量增加，清除率降低，皮下生物利用度提高(Datta-Mannan?A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273.)。
[0081] 融合蛋白及其制備方法
[0082] 本發(fā)明融合蛋白基因是密碼子優(yōu)化過的由人工合成方法制備。根據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便的用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法不限于人工合成或傳統(tǒng)亞克隆等，具體方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發(fā)明的一種實施方式，通過分段合成核苷酸序列再進(jìn)行亞克隆的方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。
[0083] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白序列以及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0084] 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)宿主細(xì)胞來選擇合適的表達(dá)載體。
[0085] 根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列插入合適的限制性位點，制得本發(fā)明的重組表達(dá)載體。
[0086] 本發(fā)明還提供了表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是真核細(xì)胞，例如但不限于CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，RSF細(xì)胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞，其可較佳地表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，可獲得活性良好，穩(wěn)定性良好的融合蛋白。
[0087] 本發(fā)明還提供一種用重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明融合蛋白的方法，其步驟包含：
[0088] 1)提供編碼融合蛋白的核酸序列；
[0089] 2)將1)的核酸序列插入到合適的表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；
[0090] 3)將2)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞；
[0091] 4)在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；
[0092] 5)收集上清液，并純化融合蛋白產(chǎn)物；
[0093] 6)激活融合蛋白。
[0094] 將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于：磷酸鈣沉淀，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，病毒感染法，堿金屬離子法。
[0095] 有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見Olander?RM等，Dev?Biol?Stand?1996，86:338。可通過離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘渣，收集上清液。
[0096] 有關(guān)融合蛋白的激活方法，可以通過凝血因子XII(FXII)激活、柱上自激活或溶液孵育自激活法對融合蛋白進(jìn)行激活。
[0097] 可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。首先將表達(dá)上清濃縮，濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的介質(zhì)。Q-或SP-基團是較為理想的離子交換基團。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜等方法對上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。還可利用含有所述融合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。
[0098] 藥物組合物
[0099] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效劑量的(160～360μg/kg)本發(fā)明所述融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包含各種輔形劑和稀釋劑。
[0100] 藥學(xué)上可接受的載體包含(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0101] 本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包含但不限于：所述的融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者體重、患者免疫狀況、給藥途徑等。附圖說明
[0102] 圖1、根據(jù)本發(fā)明實施例在PCDNA3表達(dá)載體內(nèi)SpeI-EcoRI(酶切位點以下劃線標(biāo)注)片段的FP-A的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。人FVII由信號肽(1-38，以下劃線 標(biāo)注)和成熟FVII蛋白(39-444)構(gòu)成。成熟的融合蛋白含有hFVII(39-444)、柔性肽接頭(445-471，以下劃線 標(biāo)注)、CTP剛性單元(472-499，以下劃線 標(biāo)注)和Fc變異體(500-722)。
[0103] 圖2、FP-A經(jīng)MabSelect層析SEC檢測結(jié)果。
[0104] 圖3、FP-A經(jīng)CHT層析分離目的組分P3SEC檢測結(jié)果。
[0105] 圖4、FP-A經(jīng)MabSelect分離組分和經(jīng)CHT層析分離組分P1、P2和P3的SDS-PAGE電泳圖。
[0106] 圖5、FP-A經(jīng)Q-HP層析洗脫組分P3的SEC檢測結(jié)果。
[0107] 圖6、FP-A經(jīng)Superdex?200層析洗脫組分P3-3SEC檢測結(jié)果。
[0108] 圖7、P3-3組分激活40h的SEC檢測結(jié)果。
[0109] 圖8、P3-3組分激活16～40h后還原SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果。
[0110] 圖9、小鼠出血時間結(jié)果統(tǒng)計圖。注：*p<0.01，***p<0.001。
[0111] 圖10、小鼠出血量結(jié)果統(tǒng)計圖。注：**p<0.01，***p<0.001。
[0112] 圖11、HemA小鼠等活性給予FP-A和諾其1h和2h后出血時長比較。注：與HA-N-1h組相比，*P＜0.05，***P＜0.01；與C57-NS組相比，#P＜0.05，###P＜0.01。
[0113] 圖12、FP-A及諾其在華法林大鼠上的活性半衰期。
具體實施方式
[0114] 實施例1.構(gòu)建編碼FVII融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒
[0115] 編碼FVII前導(dǎo)肽、成熟蛋白、柔性肽接頭、CTP剛性單元和人IgG?vFc變體的基因序列是人工優(yōu)化過的CHO細(xì)胞偏愛密碼子，經(jīng)人工合成獲得。所合成融合蛋白全長DNA片段的5’和3’端各有一個限制性酶內(nèi)切位點，分別為SpeI和EcoRI，全長DNA片段插入至pUC57轉(zhuǎn)移載體相應(yīng)酶切位點間，并由DNA測序驗證序列。然后再將上述獲得的融合蛋白全長基因片段從中間載體轉(zhuǎn)移到以PCDNA3.1為模板并改造后的表達(dá)質(zhì)粒PTY1A1的SpeI(5’)和EcoRI(3’)位點間，得到融合蛋白高表達(dá)質(zhì)粒。PTY1A1質(zhì)粒包含但不限于以下重要表達(dá)元器件：1)人巨細(xì)胞病毒早期啟動子和哺乳動物細(xì)胞外源高表達(dá)所需增強子；2)雙重篩選標(biāo)記物，在細(xì)菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳動物細(xì)胞中具有G418抗性；3)鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因表達(dá)框，當(dāng)宿主細(xì)胞為DHFR基因缺陷型時，氨甲蝶呤(MTX)能共擴增融合基因和DHFR基因(參見美國專利US4,399,216)。再將融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物宿主細(xì)胞系，為了獲得穩(wěn)定高水平的表達(dá)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細(xì)胞(參見美國專利US?4,
818,679)。轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基換成含0.6mg/mL?G418的篩選培養(yǎng)基，細(xì)胞以一定濃度(5000-10000個活細(xì)胞/孔)種植在96孔培養(yǎng)板里，培養(yǎng)10-14天直至大的離散細(xì)胞克隆出現(xiàn)。用ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子。通過極限稀釋96孔培養(yǎng)板，亞克隆產(chǎn)生高水平融合蛋白的孔。
818,679)。轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基換成含0.6mg/mL?G418的篩選培養(yǎng)基，細(xì)胞以一定濃度(5000-10000個活細(xì)胞/孔)種植在96孔培養(yǎng)板里，培養(yǎng)10-14天直至大的離散細(xì)胞克隆出現(xiàn)。用ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子。通過極限稀釋96孔培養(yǎng)板，亞克隆產(chǎn)生高水平融合蛋白的孔。
[0116] 如下表所示，本發(fā)明構(gòu)建了一系列rhFVII融合蛋白，它含有不同長度的肽接頭(Linker)、不同組成的CTP剛性單元以及幾種不同亞型的IgG?Fc變體(vFc)元件組成。為了驗證含有至少1個，并且不同長度的CTP剛性單元均能顯著提高融合蛋白的活性，我們構(gòu)建了融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E；其中，F(xiàn)P-A的氨基酸及編碼核苷酸如圖1所示。為了驗證CTP剛性單元對融合蛋白活性的重要性，我們還同時構(gòu)建了不含CTP剛性單元的兩種Fc融合蛋白FP-G和FP-H，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方法同上。此外，我們還構(gòu)建了CTP位于Fc?C端的FP-F，以驗證CTP剛性單元位置的重要性。詳見表1。各組成元件的氨基酸序列見序列表。
[0117] 表1、各種FVII融合蛋白組成
[0118]
[0119] 實施例2.瞬時表達(dá)各融合蛋白和活性測定
[0120] 將實施例1得到的8種表達(dá)質(zhì)粒，在30ml的搖瓶里使用DNAFect?LT試劑TM(ATGCell公司)轉(zhuǎn)染3×107CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有1000ng/ml維生素K1的無血清生長培養(yǎng)基中生長5天，測定上清液中融合蛋白的濃度，并用實施例7或8中描述的方法測定其活性。ELISA結(jié)果顯示8種質(zhì)粒在該條件下的瞬時表達(dá)量(物質(zhì)的量)相似，但是它們凝血活性卻顯示出較大差別。其中，我們將FP-A的摩爾比活性定義為100％。FP-F、FP-G和FP-H質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白上清液活性較低，僅為FP-A的29.4％、26.3％和41.2％，純化蛋白用SDS電泳分析，顯示這三種融合蛋白部分呈不同程度的聚合現(xiàn)象；而FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的活性分別為FP-A的98.0％、89.2％、86.1％和92.9％。表明僅靠延長肽接頭并不能有效改善融合蛋白的活性，即彼此的空間位阻效應(yīng)并不能隨著柔性肽接頭的延伸而顯著削弱。甚至，過長的肽接頭不僅不能提高融合蛋白的活性，反而會使蛋白錯誤折疊，以無活性的多聚體形式分泌(FP-H發(fā)酵液中產(chǎn)物多為聚合體)。我們推測原因，過長的柔性肽接頭，給了FVIIa更高的靈活度，使其能相對Fc自由轉(zhuǎn)動，這可能使FVIIa的立體結(jié)構(gòu)更加靠近Fc區(qū)，而在二者之間加入CTP剛性單元，一方面相當(dāng)增加了一段剛性肽接頭，使彼此遠(yuǎn)離，更重要的是CTP剛性單元含多個糖基側(cè)鏈，相對于柔性肽接頭的無規(guī)則卷曲形態(tài)，CTP剛性單元可以形成固定的空間構(gòu)象，能夠有效地分開融合蛋白的不同功能區(qū)，這更有利于兩部分獨立折疊成正確的三維構(gòu)象，保持了較高的活性。我們通過FP-A和FP-F的活性比較驗證了這種推測的正確性，即CTP剛性單元置于Fc?C端的FP-F的活性僅為CTP剛性單元置于Fc?N端的FP-A的29.4％，F(xiàn)P-F的活性與不含CTP剛性單元的FP-G相似。以上結(jié)果，證實CTP剛性單元對融合蛋白的活性極為關(guān)鍵，并且CTP剛性單元置于Fc的N端能有效提高融合蛋白的活性。
[0121] 實施例3.篩選高表達(dá)融合蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
[0122] 將上述FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物宿主細(xì)胞系，以表達(dá)FVII融合蛋白。為了維持穩(wěn)定的高水平表達(dá)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是DHFR缺陷型的CHO細(xì)胞(美國專利No.4818679)。一種優(yōu)選轉(zhuǎn)染方法是電穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和微注射等。電穿孔方法應(yīng)用設(shè)置為300V電壓和1050μFd電容的Gene?Pulser?Electroporator(Bio-Rad?Laboratories公司)，放置在比色杯內(nèi)的2～3×107個細(xì)胞中加入50μg?PvuI線性化的表達(dá)質(zhì)粒，電穿孔后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含30ml生長培養(yǎng)基的搖瓶中。轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基換成含0.6mg/mL?G418的生長培養(yǎng)基，細(xì)胞以一定濃度種植在96孔培養(yǎng)板里，培養(yǎng)10-12天直至大的離散細(xì)胞克隆出現(xiàn)。用抗人IgG?Fc的ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子，也可用抗FVII的ELISA分析方法進(jìn)行融合蛋白表達(dá)的定量測定，然后通過極限稀釋法亞克隆產(chǎn)生高水平表達(dá)融合蛋白的孔。
[0123] 為了實現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達(dá)，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進(jìn)行共擴增。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴增轉(zhuǎn)染的融合蛋白基因。極限稀釋DHFR表達(dá)陽性的亞克隆，逐步加壓并篩選出能在高達(dá)6μM?MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子，測定
6
其分泌率，篩選出高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系。將分泌率超過約3(較佳地約5)IU/10 (即百萬)個細(xì)胞/24小時的細(xì)胞系使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性懸浮培養(yǎng)，然后再用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。
6
其分泌率，篩選出高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系。將分泌率超過約3(較佳地約5)IU/10 (即百萬)個細(xì)胞/24小時的細(xì)胞系使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性懸浮培養(yǎng)，然后再用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。
[0124] 實施例4.生產(chǎn)融合蛋白
[0125] 將實施例3優(yōu)選得到的高產(chǎn)量細(xì)胞株首先在培養(yǎng)皿中進(jìn)行無血清馴化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到搖瓶中進(jìn)行懸浮馴化培養(yǎng)。待細(xì)胞適應(yīng)這些培養(yǎng)條件后，然后在300ml搖瓶中進(jìn)行補料流加培養(yǎng)或通過每天更換培養(yǎng)基的辦法模擬灌流培養(yǎng)。由實施例3篩選得到的生產(chǎn)融合蛋白FP-A的CHO衍生的細(xì)胞株在300ml體積的搖瓶中補料流加培養(yǎng)14天，其表達(dá)的重組融合蛋白累積產(chǎn)量為310mg/L，活細(xì)胞密度最高可達(dá)到15×106個/mL。為了得到更多融合蛋白，也可以選用1000ml搖瓶培養(yǎng)。另一種培養(yǎng)方法，上述CHO衍生的細(xì)胞株在100ml體積的搖瓶中每天更換培養(yǎng)基，其表達(dá)的重組融合蛋白每天累積產(chǎn)量約為50mg/L，在搖瓶中活細(xì)胞密度最高可達(dá)到25×106個/mL。以上兩種方法生產(chǎn)的重組融合蛋白的生物學(xué)活性相當(dāng)。
[0126] 實施例5.純化與定性融合蛋白
[0127] 本實施例中以FP-A為例，具體描述上述實施例獲得的幾種融合蛋白純化步驟及方法，F(xiàn)P-B、FP-C、FP-D和FP-E方法相同，實施例中不再贅述。
[0128] 本發(fā)明主要采用四步層析法對融合蛋白進(jìn)行純化。分別為親和層析、多維模式層析、陰離子交換層析和分子篩層析。
[0129] 第一步，親和層析使用發(fā)明內(nèi)容部分所述的層析介質(zhì)進(jìn)行樣品捕獲。首先使用平衡buffer：20-50mM?Tris-HCl,150-500mM?NaCl,pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)；經(jīng)過澄清后的發(fā)酵液上樣，載量不高于30g/L；使用平衡buffer：20-50mM?Tris-HCl,150-
500mM?NaCl,pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)，沖洗未結(jié)合的組份；使用去污buffer：20mM?Tris，1.5-2M?NaCl，0.5-2M尿素，5-10mM(EDTA)2Na，pH6.5-7.0沖洗層析柱3-
5個柱體積，去除部分污染物；使用平衡buffer：20-50mM?Tris-HCl,150-500mM?NaCl,pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)后；使用洗脫buffer：100mM?Gly-HCl，150-300mM?NaCl，pH3.0-3.5洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，直接加入到1M?Tris，pH8.0中，中和pH值至中性。
500mM?NaCl,pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)，沖洗未結(jié)合的組份；使用去污buffer：20mM?Tris，1.5-2M?NaCl，0.5-2M尿素，5-10mM(EDTA)2Na，pH6.5-7.0沖洗層析柱3-
5個柱體積，去除部分污染物；使用平衡buffer：20-50mM?Tris-HCl,150-500mM?NaCl,pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)后；使用洗脫buffer：100mM?Gly-HCl，150-300mM?NaCl，pH3.0-3.5洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，直接加入到1M?Tris，pH8.0中，中和pH值至中性。
[0130] 融合蛋白經(jīng)第一步Mabselect親和層析純化后的SEC分析結(jié)果如圖2所示。
[0131] 第二步，多維模式層析使用發(fā)明內(nèi)容部分所述的Bio-Rad公司的CHT陶瓷羥磷灰石骨架的層析介質(zhì)進(jìn)行樣品捕獲。首先使用平衡buffer：20-50mM?PB，pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)；經(jīng)過親和層析捕獲的樣品上樣，載量不高于10g/L；使用平衡buffer：20-
50mM?PB，pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)，沖洗未結(jié)合的組份，命名為P1；使用洗脫buffer?1：120mM?PB，pH6.8-7.2沖洗層析柱3-5個柱體積，收集洗脫組分，命名為P2；使用洗脫buffer2：200mM?PB，pH6.8-7.2沖洗層析柱3-5個柱體積，收集洗脫組分，命名為P3。分離得到的P1、P2和P3組分分別激活后，體外測定其比活性分別為103.2、3026.7和5705.7IU/mg，說明不同洗脫組分之間存在差異，體現(xiàn)了羧基化程度的差異。
50mM?PB，pH6.8-7.2，平衡層析柱3-5個柱體積(CV)，沖洗未結(jié)合的組份，命名為P1；使用洗脫buffer?1：120mM?PB，pH6.8-7.2沖洗層析柱3-5個柱體積，收集洗脫組分，命名為P2；使用洗脫buffer2：200mM?PB，pH6.8-7.2沖洗層析柱3-5個柱體積，收集洗脫組分，命名為P3。分離得到的P1、P2和P3組分分別激活后，體外測定其比活性分別為103.2、3026.7和5705.7IU/mg，說明不同洗脫組分之間存在差異，體現(xiàn)了羧基化程度的差異。
[0132] 融合蛋白FP-A經(jīng)第二步CHT層析分離目的組分P3的SEC檢測結(jié)果如圖3所示。MabSelect分離組分和CHT層析分離組分P1、P2和P3的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖4。
[0133] 第三步，陰離子交換層析使用發(fā)明內(nèi)容部分所述的層析介質(zhì)進(jìn)一步分離純化。使用平衡Buffer：20-50mM?Tris-HCl，pH7.5-8.0平衡層析柱3-5個柱體積；CHT層析的P3洗脫組份上樣，載量不高于30g/L；使用平衡Buffer：20-50mM?Tris-HCl，pH7.5-8.0平衡層析柱3-5個柱體積；使用線性梯度洗脫方式洗脫目標(biāo)組份，洗脫buffer：20mM?Tris-HCl，500mM?NaCl,pH7.5-8.0，洗脫的流速為60cm/h，梯度為25-30個柱體積。結(jié)果顯示，色譜峰為單峰，我們收集的部分為最高紫外吸收的1/3以上的部分，這部分的SEC檢測結(jié)果見圖5。
[0134] 第四步，分子篩層析使用發(fā)明內(nèi)容部分所述的層析介質(zhì)進(jìn)行分離，首先用平衡buffer：100mM?Hepes,100mM?NaCl,pH8.0平衡層析柱1.5-2個柱體積；上樣量不高于柱體積的2％；使用平衡buffer：100mM?Hepes,100mM?NaCl,pH8.0，以30cm/h的流速洗脫，放棄前段的聚合體峰，收集單體峰的上升段、中段和下降段(以色譜峰的最高紫外吸收的1/2為限)，分別命名為P3-2、P3-3、P3-4。其中P3-3組分的SEC檢測結(jié)果見圖6。
[0135] 實施例6.融合蛋白體外激活
[0136] 本發(fā)明通過溶液孵育自激活法對融合蛋白進(jìn)行激活。將分子篩層析分離得到的融合蛋白單一組分P3-3加載于30kDa超濾濃縮管(Corning，貨號431489)，然后以臺式高速低溫離心機(Eppendorf，型號5810R)離心，更換緩沖液為20mM?PB，0.3M?NaCl，5mM?CaCl2，pH7.0-7.2，并濃縮至蛋白濃度為3-5mg/ml(采用消光系數(shù)法定量)，置于4℃進(jìn)行激活，激活時間16～40小時。激活結(jié)束利用G-25脫鹽柱，將其置換到buffer：20mM?PB，pH7.0中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/div>
[0137] 采用本發(fā)明實施例7或8所述生物學(xué)活性測定法和還原性SDS-PAGE檢測層析分離組分體外激活不同時間的激活程度。不同激活時間的生物學(xué)活性結(jié)果見表2；P3-3組分在激活過程中取樣，16～40h激活產(chǎn)物的還原型SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖8，及其激活40小時的SEC檢測結(jié)果見圖7?？芍琍3-3經(jīng)40小時激活的活化程度最高。SDS-PAGE還原膠電泳顯示FP-A經(jīng)實施例5中四步層析分離獲得的P3-3組分被激活后主要呈現(xiàn)兩條主帶，分別是約74.3KDa的HC-L-CTP-Fc(與FVIIa重鏈相連的柔性肽接頭、CTP剛性單元和IgG?Fc段部分)和約24.0KDa的LC(FVIIa的輕鏈部分)。
[0138] 表2、P3-3組分激活16-40h的生物學(xué)活性檢測結(jié)果
[0139]
[0140] 實施例7.生色底物法間接測定融合蛋白的生物學(xué)活性
[0141] 本發(fā)明采用HYPHEN?BioMed公司生產(chǎn)的BIOPHEN?FVII生色試劑盒(Ref:A221304)測定由實施例6所示方法激活的各融合蛋白的體外酶活性。該試劑盒測定原理為生色底物法，F(xiàn)VIIa是一種在外源性凝血途徑起作用的絲氨酸蛋白酶，當(dāng)FVIIa與組織因子結(jié)合后，在磷脂和Ca2+存在條件下，可激活凝血因子FX，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问紽Xa。待測定的融合蛋白首先與來源于兔的促凝血酶原激酶的組織因子形成酶復(fù)合物，然后激活反應(yīng)體系中一定濃度的(過量)凝血因子FX，使其轉(zhuǎn)化為活性形式FXa，F(xiàn)Xa作用于反應(yīng)體系中特異性顯色底物SXa-11，使底物裂解并產(chǎn)生pNA，所產(chǎn)生pNA量直接與FXa的活性成正相關(guān)性。在405nm處用比色計測定所釋放的pNA濃度，即可知測試樣本中FVIIa以及FXa活性之間的對應(yīng)關(guān)系，以此計算出FVIIa的活性大小，用正常人的血漿作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0142] 實施例8.凝血法直接測定融合蛋白的生物學(xué)活性
[0143] 凝血法測定FVIIa生物學(xué)活性是通過糾正FVIIa因子缺乏血漿所導(dǎo)致凝固時間延長的能力而獲得的。采用法國STAGO公司生產(chǎn)的試劑盒 FVII(Cat.No.00743)。檢測方法首先是將稀釋的已知FVII活性的正常人凍干血漿(Unicalibrator,Cat.No.00625)與乏VII基質(zhì)血漿混合，測定凝血酶原時間(PT)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將待測血漿適度稀釋后與乏FVII基質(zhì)血漿混合，進(jìn)行PT測定。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線所擬合的活性百分比C(％)與PT時間t(s)的對數(shù)方程，可測得待測樣本FVIIa的活性多少，其結(jié)果用正常血漿的百分比來表示(％)，試劑盒中所提供的標(biāo)準(zhǔn)品百分比活性(％)與國際酶活單位IU的對應(yīng)關(guān)系為100％＝1IU，據(jù)此可求算出待測樣品FVII的酶比活性大小，單位為IU/mg。
[0144] 各層析步驟分離組分體外激活24h的生物活性測定結(jié)果見表3。其中，四步層析最終獲得的目的組分P3-3激活16-40h的活性數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)純化獲得的FP-A有效單一組分P3-3激活40h的生物學(xué)活性為22470IU/mg，換算為摩爾比活性約為4417IU/nM(每個融合蛋白含有2個FVIIa，相當(dāng)于2208.7IU/nM?FVIIa)，與已上市的重組FVIIa——諾其(2511IU/nM?FVIIa)的活性相當(dāng)，說明本發(fā)明提供的融合蛋白，其C端融合的Fc對FVIIa的活性影響極小。
其活性同時也顯著高于其他已報道的重組FVIIa的活性，例如，CSL?Behring公司報道的HEK細(xì)胞生產(chǎn)的重組hFVII生物學(xué)活性為2874IU/mg，相當(dāng)于144IU/nM。而其用HEK或CHO細(xì)胞生產(chǎn)的融合蛋白hFVII-FP的生物學(xué)活性為620-770IU/mg，相當(dāng)于69-75IU/nM(Weimer?T等，Thromb?Haemost,2008,99:659-667)。
其活性同時也顯著高于其他已報道的重組FVIIa的活性，例如，CSL?Behring公司報道的HEK細(xì)胞生產(chǎn)的重組hFVII生物學(xué)活性為2874IU/mg，相當(dāng)于144IU/nM。而其用HEK或CHO細(xì)胞生產(chǎn)的融合蛋白hFVII-FP的生物學(xué)活性為620-770IU/mg，相當(dāng)于69-75IU/nM(Weimer?T等，Thromb?Haemost,2008,99:659-667)。
[0145] 表3、各層析步驟分離組分體外激活24h的生物活性測定結(jié)果
[0146]
[0147] 實施例9.FP-A對血友病A小鼠急性出血的止血作用
[0148] 我們以FVIII因子基因剔除純合子甲型血友病小鼠(hemophilia?A，HA,購自上海南方模式生物研究中心)斷尾出血模型(tail?vein?transection(TVT)bleeding?model)評估實施例5中所制備的活化的融合蛋白FP-A(單一組分P3-3)在HA小鼠體內(nèi)的止血活性。選取10-12周齡雄性HA小鼠(購自上海南方模式生物研究中心)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后將小鼠隨機分為5組，每組8只。以0.8％戊巴比妥鈉(Sigma公司)按照0.1ml/10g劑量腹腔注射麻醉小鼠，然后分別尾靜脈注射7,000(HA-F-0.7W組)、21,000(HA-F-2.1W組)、70,000(HA-F-7W組)和210,000IU/kg(HA-F-21W組)的FP-A和100,000IU/kg的諾其( Novo?Nordisk公司)(HA-N組)。給藥5分鐘后，在小鼠尾末梢處剪斷，切斷處直徑為3mm，迅速將尾端浸入裝有14mL、37℃，含0.1％BSA(Amresco公司)生理鹽水(0.9％NaCl，NS)的離心管中，并開始計時。如果出血在30分鐘內(nèi)停止，記錄出血時間。如果出血時間超過30分鐘，結(jié)扎鼠尾并用滾燙的金屬棒灼燒止血，出血時間記作1800秒。同時，計算失血量。失血量(ml)＝(采血后離心管重量(g)-采血前離心管重量(g))/1.05。另以10-12周齡，野生型雄性C57BL/6J(購自上海南方模式生物研究中心)小鼠(n＝8)靜注給予生理鹽水(購自湖南科倫制藥有限公司)作為正常對照組(C57-NS組)，操作方法同給藥組。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差 表示，各實驗組間比較采用t-test檢驗分析，分析軟件采用Graphpad?Prism?5.0，p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0149] 從圖9和圖10中各組動物的出血時間和出血量的統(tǒng)計結(jié)果分析，HA小鼠給予70,000IU/kg?FP-A?5分鐘后，其出血時間和出血量與C57-NS組接近，促凝效果明顯，說明FP-A可以作為血友病等凝血因子缺乏癥發(fā)生急性出血情況的有效凝血劑；小鼠給藥FP-A?210,
000IU/kg后，在出血時間和出血量上同樣與C57-NS組接近。與FP-A?7,000IU/kg給藥組比較，F(xiàn)P-A?70,000IU/kg組或FP-A210,000IU/kg組的出血時間顯著縮短(p<0.001；p<0.001)，出血量也顯著減少(p<0.001；p<0.01)，具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(詳細(xì)結(jié)果見表4和表5)。
000IU/kg后，在出血時間和出血量上同樣與C57-NS組接近。與FP-A?7,000IU/kg給藥組比較，F(xiàn)P-A?70,000IU/kg組或FP-A210,000IU/kg組的出血時間顯著縮短(p<0.001；p<0.001)，出血量也顯著減少(p<0.001；p<0.01)，具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(詳細(xì)結(jié)果見表4和表5)。
[0150] 表4、出血時間數(shù)據(jù)統(tǒng)計表(單位：秒)
[0151]
[0152] 注：組1(C57-NS)：C57BL/6J小鼠給予生理鹽水組；組2(HA-N)：HA小鼠給于10,000IU/kg諾其組；組3(HA-F-0.7W)：HA小鼠給于FP-A?7,000IU/kg組；組4(HA-F-2.1W)：HA小鼠給于FP-A?21,000IU/kg組；組5(HA-F-7W)：HA小鼠給于FP-A?70,000IU/kg組；組6(HA-F-
21W)：HA小鼠給于FP-A?210,000IU/kg組。
21W)：HA小鼠給于FP-A?210,000IU/kg組。
[0153] 表5、出血量數(shù)據(jù)統(tǒng)計表(單位：mL)
[0154]
[0155] 注：分組同表4。
[0156] 實施例10.FP-A在血友病A小鼠體內(nèi)凝血作用的長效性研究
[0157] 本實驗是為了考察FP-A(單一組分P3-3激活后樣品)對HA小鼠體內(nèi)凝血作用的長效性。16-20周齡雄性HA小鼠(購自上海南方模式生物研究中心)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為3組，每組6只。其中兩組給予300,000IU/kg的FP-A，另一組給予300,000IU/kg的諾其(Novo?Nordisk公司)。同時以16-20周齡，野生型雄性C57BL/6J小鼠(購自上海南方模式生物研究中心)尾靜脈注射給予生理鹽水，作為正常對照組(n＝6)。給予FP-A的兩組HA小鼠分別于給藥后1h和2h進(jìn)行斷尾試驗；給予諾其的HA小鼠于給藥后1h進(jìn)行斷尾試驗；C57BL/6J正常對照組(C57-NS組)小鼠于注射后2h進(jìn)行斷尾試驗。具體操作方法參照實施例9。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差 表示，各實驗組間比較采用t-test檢驗分析，分析軟件采用Graphpad?Prism?5.0，p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0158] 如圖11所示，諾其組給藥1h后，小鼠出血時間為30分鐘，說明它已無促凝止血效果(HA-N-1h組)，而給予FP-A?1h(HA-F-1h組)和2h后(HA-F-2h組)仍然能有效止血，出血時間均比諾其組顯著縮短(P<0.01；P<0.05)。這說明FP-A相對于諾其具有顯著延長的活性半衰期。具體數(shù)值參見表6。
[0159] 表6、出血時間數(shù)據(jù)統(tǒng)計表(單位：s)
[0160]
[0161] 實施例11.FP-A的體內(nèi)活性半衰期研究
[0162] 本實驗為考察FP-A(單一組分P3-3)在華法林致大鼠凝血障礙模型上的活性半衰期。依文獻(xiàn)報道的方法(Joe?Salas等,Thrombosis?Research,2015,135(5):970-976或Gerhard?Dickneite等,Thrombosis?Research,2007,119:643-651)進(jìn)行實驗，選取8-12周齡200-220g?SD大鼠16只(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001)，將大鼠隨機分為2組，每組8只。以2.5mg/kg華法林(Orion?Corporation，F(xiàn)inland，批號：1569755)灌胃，24h后分別靜脈給予10,000IU/kg的FP-A或諾其(Novo?Nordisk公司)。FP-A組于給藥后0.05、0.5、1、2、3、5、8、12h采血；諾其組于給藥后0.05、0.5、1、2、3、5h采血。血樣以終濃度0.013M的檸檬酸鈉為抗凝劑，3000rpm離心10min取上清，按實施例8進(jìn)行樣品活性測定并計算活性半衰期。
[0163] 如圖12所示，測得FP-A的活性半衰期為3.03±0.35h；諾其的活性半衰期為1.01±0.16h。相比等活性的諾其，F(xiàn)P-A在大鼠體內(nèi)活性半衰期延長了約3倍，單次注射FP-A?3h后血漿凝血活性約40％，而等活性給藥的諾其組3h后活性已降至3％；FP-A給藥12h后血漿凝血活性仍保持在7％以上。
[0164] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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