因子VIII-Fc嵌合多肽和雜交多肽及其使用方法
閱讀：128發(fā)布：2022-07-22
專利匯可以提供因子VIII-Fc嵌合多肽和雜交多肽及其使用方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 提供了施用因子VIII的方法；施用包含因子VIII的嵌合和雜交多肽的方法；包含因子VIII的嵌合和雜交多肽；編碼這類嵌合和雜交多肽的多核苷酸；包含這類多核苷酸的細(xì)胞；和使用這類細(xì)胞產(chǎn)生這類嵌合和雜交多肽的方法。，下面是因子VIII-Fc嵌合多肽和雜交多肽及其使用方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括：
以等量的由所述因子VIII部分組成的多肽所需的給藥間隔的至少約1.5倍的給藥間
隔給所述受試者施用治療劑量的包含因子VIII部分和第二部分的嵌合多肽。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述嵌合多肽包含F(xiàn)c部分。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述給藥間隔為等量的由所述因子VIII部分組成
的多肽所需的給藥間隔的至少約1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至
2倍。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述給藥間隔為等量的由所述因子VIII部分組成的多
肽所需的給藥間隔的至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述給藥間隔為約每5、6、
7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述受試者需要預(yù)防性治療。
7.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述受試者需要按需治療。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述受試者需要治療出血事件。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述受試者需要治療關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔流血、
出血、至肌肉內(nèi)的出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸道出血、顱內(nèi)出血、腹腔內(nèi)出血、胸腔內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述受試者需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期處理或手術(shù)治
療。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述手術(shù)為小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、
腹股溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷性手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)。
12.權(quán)利要求7-11中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述給藥間隔為約每
24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
13.權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述治療劑量為10-100IU/kg。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述治療劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、
60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
16.權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
17.權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述因子VIII為人因子VIII。
18.權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述因子VIII具有B結(jié)構(gòu)域的完全或部
分缺失。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的不具
有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基
酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12
的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的不具
有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基
酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12
的氨基酸1-684)具有同一性。
21.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的具有
信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6
的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序
列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的具有
信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨
基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ
ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
23.權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分與表2中顯示
的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；
SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸
685-924)具有至少90%或95%的同一性。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分與表2中顯示的Fc的
氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID
NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)
具有同一性。
25.權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽以包含與所述嵌合多肽結(jié)
合的第二多肽的雜交體的形式存在，其中所述第二多肽基本上由Fc組成。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信號
序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%
的同一性或與表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID
NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信
號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與
表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸-19-1665)具有同一性的序列。
28.權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)
中顯示的不具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或
95%的同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基
酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列組成。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)中顯示的不具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示
的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列組成。
30.權(quán)利要求1-29中任一項所述的方法，其中將所述嵌合多肽作為包含至少一種賦形
劑的藥物組合物的部分施用。
31.一種給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括
給所述受試者施用治療劑量的包含因子VIII部分和第二部分的嵌合多肽，以獲得為
通過等量的由所述因子VIII部分組成的多肽獲得的AUC的至少約1.25倍的血漿濃度-時
間曲線下面積(AUC)。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中以約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次的給藥間隔施用所述嵌合多肽。
33.權(quán)利要求31-32中任一項所述的方法，其中所述受試者需要預(yù)防性治療。
34.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者需要按需治療。
35.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述受試者需要治療出血事件。
36.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述受試者需要治療關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔流
血、出血、至肌肉內(nèi)的出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸道出血、顱內(nèi)出血、腹腔內(nèi)出血、胸腔內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述受試者需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期處理或手術(shù)治
療。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述手術(shù)為小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、
腹股溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷性手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)。
39.權(quán)利要求34-38中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述給藥間隔為約每
24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
40.權(quán)利要求31-39中任一項所述的方法，其中所述治療劑量為10-100IU/kg。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述治療劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、
60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
43.權(quán)利要求31-42中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
44.權(quán)利要求31-43中任一項所述的方法，其中所述因子VIII為人因子VIII。
45.權(quán)利要求31-44中任一項所述的方法，其中所述因子VIII具有B結(jié)構(gòu)域的完全或
部分缺失。
46.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的不
具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的
氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ I D NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID
NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的不具
有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基
酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12
的氨基酸1-684)具有同一性。
48.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的具有
信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6
的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序
列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。
49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分與表2中顯示的具有
信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨
基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ
ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
50.權(quán)利要求43或44所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分與表2中顯示
的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；
SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸
685-924)具有至少90%或95%的同一性。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分與表2中顯示的Fc的
氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID
NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)
具有同一性。
52.權(quán)利要求31-51中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽以包含與所述嵌合多肽
結(jié)合的第二多肽的雜交體的形式存在，其中所述第二多肽基本上由Fc組成。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信號
序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%
的同一性或與表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID
NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
54.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信
號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與
表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
55.權(quán)利要求52-54中任一項所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)
中顯示的不具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或
95%的同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基
酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列組成。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)中顯示的不具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示
的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同
一性的序列組成。
57.權(quán)利要求31-56中任一項所述的方法，其中將所述嵌合多肽作為包含至少一種賦
形劑的藥物組合物的部分施用。
58.一種給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括
以約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次的給藥間隔給所述受試者施用治療劑量的包含因子VIII和Fc的多肽。
59.權(quán)利要求58中任一項所述的方法，其中所述受試者需要預(yù)防性治療。
60.權(quán)利要求58-59中任一項所述的方法，其中所述治療劑量為10-100IU/kg。
61.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述治療劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、
60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。
62.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
63.權(quán)利要求58-62中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
64.權(quán)利要求58-63中任一項所述的方法，其中所述因子VIII為人因子VIII。
65.權(quán)利要求58-64中任一項所述的方法，其中所述因子VIII具有B結(jié)構(gòu)域的完全或
部分缺失。
66.權(quán)利要求64所述的方法，其中所述因子VIII與表2中顯示的不具有信號序列的
因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸
1-684)具有至少90%或95%的同一性。
67.權(quán)利要求66所述的方法，其中所述因子VIII與表2中顯示的不具有信號序列的
因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸
1-684)具有同一性。
68.權(quán)利要求64所述的方法，其中所述因子VIII與表2中顯示的具有信號序列的因
子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序
列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；
或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述因子VIII與表2中顯示的具有信號序列的因
子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基
酸-20-684)具有同一性。
70.權(quán)利要求64或65所述的方法，其中所述第二部分與表2中顯示的Fc的氨基酸序
列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的
氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有
至少90%或95%的同一性。
71.權(quán)利要求70所述的方法，其中所述第二部分與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ
ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸
741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。
72.權(quán)利要求58-71中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽為以包含與所述嵌合多
肽結(jié)合的第二多肽的雜交體的形式存在的因子VIII-Fc嵌合多肽，其中所述第二多肽基本
上由Fc組成。
73.權(quán)利要求72所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信號
序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%
的同一性或與表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID
NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
74.權(quán)利要求73所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A(i)中顯示的不具有信
號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與
表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
75.權(quán)利要求72-74中任一項所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)
中顯示的不具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或
95%的同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基
酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列組成。
76.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)中顯示的不具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示
的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同
一性的序列組成。
77.權(quán)利要求58-76中任一項所述的方法，其中將所述多肽作為包含至少一種賦形劑
的藥物組合物的部分施用。
78.一種包含因子VIII和Fc的多肽，所述因子VIII與表2中顯示的不具有信號序列
的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基1-1438；SEQ ID NO:6的氨基1-2332；SEQ
ID NO:8的氨基1-740；SEQ ID NO:10的氨基1-745；或SEQ ID NO:12的氨基1-684)具有
至少90%或95%的同一性。
79.權(quán)利要求78所述的多肽，其中所述因子VIII與表2中顯示的不具有信號序列的
因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸
1-684)具有同一性。
80.一種包含因子VIII和Fc的多肽，所述因子VIII與表2中顯示的具有信號序列的
因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序
列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；
或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。
81.權(quán)利要求80所述的多肽，其中所述因子VIII與表2中顯示的具有信號序列的因
子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基
酸-20-684)具有同一性。
82.權(quán)利要求78至81中任一項所述的多肽，其中所述Fc與表2中顯示的Fc的氨基酸
序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8
的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具
有至少90%或95%的同一性。
83.權(quán)利要求82所述的多肽，其中所述Fc與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ
ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸
741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。
84.權(quán)利要求78所述的多肽，其包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子VIII
和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或與
表2A(i)中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。
85.權(quán)利要求84所述的多肽，其包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子VIII
和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與表2A(i)中顯示的具
有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少
90%或95%的同一性的序列。
86.權(quán)利要求78-85中任一項所述的多肽，其以包含第二多肽的雜交體的形式存在，其
中所述第二多肽基本上由Fc組成。
87.權(quán)利要求85所述的多肽，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)中顯示的不具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或與
表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至
少90%或95%的同一性的序列組成。
88.權(quán)利要求86所述的多肽，其中所述第二多肽基本上由與表2A(ii)中顯示的不具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示
的具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同
一性的序列組成。
89.權(quán)利要求78-88中任一項所述的多肽，其具有為由所述因子VIII組成的多肽的至
少約1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍的半衰期。
90.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求78-85中任一項所述的多肽。
91.權(quán)利要求90所述的多核苷酸，其包含表1的因子VIII-Fc核苷酸序列(SEQ ID
NO:1、5、7、9或11)。
92.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求86-89中任一項所述的因子VIII-Fc多肽和所述的
第二肽。
93.權(quán)利要求90-92中任一項所述的多核苷酸，其為載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒。
94.權(quán)利要求90-93中任一項所述的多核苷酸，其為DNA或RNA。
95.一種培養(yǎng)的人胚胎細(xì)胞，其包含權(quán)利要求89-94中任一項所述的多核苷酸。
96.權(quán)利要求95所述的細(xì)胞，其為HEK293細(xì)胞。
97.一種產(chǎn)生因子VIII-Fc雜交蛋白的方法，其包括：
在允許編碼的因子VIII-Fc嵌合多肽和編碼的基本上由Fc組成的多肽表達(dá)的條件下
培養(yǎng)權(quán)利要求95或96所述的細(xì)胞；和
回收編碼的因子VIII-Fc雜交蛋白。
98.一種蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求97所述的方法產(chǎn)生。
99.權(quán)利要求1-57中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽具有一個或多個選自下列
特征的特征：
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與磷脂囊泡相互作用的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的形成激活因子X的Xase復(fù)合物
的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的在5分鐘內(nèi)被α-凝血酶激活
的能力；和
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與因子IXa相互作用的能力。
100.權(quán)利要求99所述的方法，其中所述嵌合多肽具有一個或多個選自下列特征的特
征：
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Km的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Km形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Km測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Kd的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Kd形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Kd測量為因子IXa濃度的函數(shù)；和
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子IXa濃度的函數(shù)。
101.權(quán)利要求58-77中任一項所述的方法，其中所述多肽具有一個或多個選自下列特
征的特征：
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與磷脂囊泡相互作用的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的形成激活因子X的Xase復(fù)合物
的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的在5分鐘內(nèi)被α-凝血酶激活
的能力；和
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與因子IXa相互作用的能力。
102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述多肽具有一個或多個選自下列特征的特征：
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Km的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Km形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Km測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Kd的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Kd形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Kd其中測量為因子IXa濃度的函數(shù)；和
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子IXa濃度的函數(shù)。
103.權(quán)利要求78-89和98中任一項所述的多肽，其具有1個、約1.5個或約2個或更
多個選自下列特征的特征：
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與磷脂囊泡相互作用的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的形成激活因子X的Xase復(fù)合物
的能力；
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的在5分鐘內(nèi)被α-凝血酶激活
的能力；和
可與由所述因子VIII部分組成的多肽的能力相比較的與因子IXa相互作用的能力。
104.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述多肽具有一個或多個選自下列特征的特征：
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Km的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Km形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Km測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子X濃度的函數(shù)；
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Kd的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)的
Kd形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Kd測量為因子IXa濃度的函數(shù)；和
以在由所述因子VIII部分組成的多肽的Vmax的約1個、約1.5個或約2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)
的Vmax形成激活因子X的Xase復(fù)合物，其中將Vmax測量為因子IXa濃度的函數(shù)。
105.權(quán)利要求1-77中任一項所述的方法，其中所述劑量具有大于1.38IU/dL每IU/kg
的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀察到的)。
106.權(quán)利要求1-77和104中任一項所述的方法，其中所述劑量具有至少約1.5、至少
約1.85或至少約2.46IU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀察到的)。
107.權(quán)利要求1-75和104-106中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽在所述患者群
體中或所述受試者中展示一個或多個藥代動力學(xué)參數(shù)，其選自：
約2.33±1.08mL/小時/kg或更少的所述患者群體中的平均清除率(CL)(活性)；
約1.8-2.69mL/小時/kg的所述患者群體中的平均清除率(CL)(活性)；
為由所述因子VIII部分組成的多肽的清除率的約65%的所述患者群體中的平均清除
率(CL)(活性)；
約1.22-5.19mL/小時/kg的所述受試者中的清除率(CL)(活性)
至少約26.3±8.33小時的所述患者群體中的平均停留時間(MRT)(活性)；
約25.9-26.5小時的所述患者群體中的平均MRT(活性)；
為由所述因子VIII部分組成的多肽的平均MRT的約1.5倍的所述患者群體中的平均
MRT(活性)；
約14-41.3小時的所述受試者中的平均停留時間(MRT)(活性)；
約18.3±5.79小時的所述患者群體中的平均t1/2β(活性)；
為約18-18.4小時的所述患者群體中的平均t1/2β(活性)；
為由所述因子VIII部分組成的多肽的平均t1/2β的約1.5倍的所述患者群體中的平
均t1/2β(活性)；
約11-26.4小時的所述受試者中的t1/2β(活性)；
約2.01±0.44IU/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察
到的)；
約1.85-2.46IU/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到
的)；
為由所述因子VIII部分組成的多肽的平均增量恢復(fù)的約90%的所述患者群體中的平
均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
約1.38-2.88IU/dL每IU/kg的所述受試者中的增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
約55.1±12.3mL/kg的所述患者群體中的平均Vss(活性)；
約45.3-56.1mL/kg的所述患者群體中的平均Vss(活性)；
約37.7-79.4mL/kg的所述受試者中的Vss(活性)；
約49.9±18.2IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均AUC/劑量(活性)；
約44.8-57.6IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均AUC/劑量(活性)；和
約19.2-81.7IU*h/dL每IU/kg的所述受試者中的AUC/劑量。
108.權(quán)利要求1-77和104-106中任一項所述的方法，其中所述第二部分為XTEN或白
蛋白。
109.權(quán)利要求1-77和104-106中任一項所述的方法，其中所述治療劑量為約10至約
150、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、110、115、120、125、130、135、140、145或
150IU/kg。
110.權(quán)利要求1-77和104-106中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為1.5至5、
1.5、2、3、4或5天或更長時間。
因子VIII-Fc嵌合多肽和雜交多肽及其使用方法
[0001] 發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般涉及凝血障礙的治療領(lǐng)域。
[0003] 背景領(lǐng)域
[0004] 血友病A是由因子VIII(FVIII)基因的突變和/或缺失(導(dǎo)致FVIII活性的缺乏)引起的X連鎖出血障礙(Peyvandi等人2006)。該疾病的特征在于創(chuàng)傷后自發(fā)性出血和過
量流血。隨著時間的過去，通常始于幼童時期的至肌肉和關(guān)節(jié)內(nèi)的反復(fù)出血產(chǎn)生血友病性
關(guān)節(jié)病和不可逆的關(guān)節(jié)損傷。該損傷是漸進(jìn)的并且可導(dǎo)致嚴(yán)重受限的關(guān)節(jié)活動性、肌肉萎
縮和慢性疼痛(Rodriguez-Merchan，E.G.，Semin.Thromb.Hemost.29:87-96(2003)(將其
通過引用整體并入本文)。
量流血。隨著時間的過去，通常始于幼童時期的至肌肉和關(guān)節(jié)內(nèi)的反復(fù)出血產(chǎn)生血友病性
關(guān)節(jié)病和不可逆的關(guān)節(jié)損傷。該損傷是漸進(jìn)的并且可導(dǎo)致嚴(yán)重受限的關(guān)節(jié)活動性、肌肉萎
縮和慢性疼痛(Rodriguez-Merchan，E.G.，Semin.Thromb.Hemost.29:87-96(2003)(將其
通過引用整體并入本文)。
[0005] A2結(jié)構(gòu)域是因子VIII分子的促凝活性所必需的。研究顯示豬因子VIII具 有為 人 因 子VIII 6倍 的 促凝 活 性(Lollar，P.和 E.T.Parker，J.Biol.
Chem.266:12481-12486(1991))以及人與豬因子VIII之間的促凝劑活性的差異似乎基于
人與豬A2結(jié)構(gòu)域的一個或多個殘基之間的氨基酸序列的差異(Lollar，P.等人，J.Biol.
Chem.267:23652-23657(1992))(將其通過引用整體并入本文)。
Chem.266:12481-12486(1991))以及人與豬因子VIII之間的促凝劑活性的差異似乎基于
人與豬A2結(jié)構(gòu)域的一個或多個殘基之間的氨基酸序列的差異(Lollar，P.等人，J.Biol.
Chem.267:23652-23657(1992))(將其通過引用整體并入本文)。
[0006] 血友病A的治療是通過靶向使FVIII活性恢復(fù)至1至5%的正常水平以防止自發(fā)性出血的替代療法(Mannucci，P.M.等人，N.Engl.J.Med.344:1773-1779(2001)，將其通過引用整體并入本文)。存在可用于按需治療出血事件或通過預(yù)防性治療預(yù)防出血事件發(fā)生
的血漿源性FVIII和重組FVIII產(chǎn)物?；谶@類制品的半衰期，治療方案需要頻繁的靜脈
內(nèi)施用。這樣的頻繁施用非常痛苦并且不方便。
的血漿源性FVIII和重組FVIII產(chǎn)物?；谶@類制品的半衰期，治療方案需要頻繁的靜脈
內(nèi)施用。這樣的頻繁施用非常痛苦并且不方便。
[0007] 由于血漿源性FVIII和重組FVIII的開發(fā)，死亡率的降低、關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防以及生活質(zhì)量的改善已取得重要成就。延長的出血保護(hù)作用代表血友病A患者的治療中的另一個
至關(guān)重要的成就。然而，迄今為止，還未開發(fā)出允許長期保護(hù)的產(chǎn)物。因此，仍然需要比目前療法更可耐受且更有效的治療因因子VIII缺乏而引起的血友病的改進(jìn)的方法。
至關(guān)重要的成就。然而，迄今為止，還未開發(fā)出允許長期保護(hù)的產(chǎn)物。因此，仍然需要比目前療法更可耐受且更有效的治療因因子VIII缺乏而引起的血友病的改進(jìn)的方法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供了施用因子VIII的方法；施用包含因子VIII的嵌合多肽和這類嵌合多肽的雜交體的方法；包含因子VIII的嵌合多肽和這類嵌合多肽的雜交體；編碼這類嵌合
多肽和雜交多肽的多核苷酸；包含這類多核苷酸的細(xì)胞；和使用這類細(xì)胞產(chǎn)生這類嵌合和
雜交多肽的方法。
多肽和雜交多肽的多核苷酸；包含這類多核苷酸的細(xì)胞；和使用這類細(xì)胞產(chǎn)生這類嵌合和
雜交多肽的方法。
[0010] 本發(fā)明提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括以等量的不具有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的部分)
所需的給藥間隔的至少約1.5倍的給藥間隔給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII多肽，
例如嵌合因子VIII-Fc多肽。
所需的給藥間隔的至少約1.5倍的給藥間隔給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII多肽，
例如嵌合因子VIII-Fc多肽。
[0011] 給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5至6倍、1.5至5
倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部
分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的
至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。給藥間隔可以為每5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天或更長時間一次。
倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部
分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的
至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。給藥間隔可以為每5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天或更長時間一次。
[0012] 給藥間隔可以為至少約1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更長時間。
[0013] 本發(fā)明還提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII多肽例如嵌合因子VIII-Fc多肽，以獲得為通過等量的不具
有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多
肽)獲得的AUC的至少約1.25倍的血漿濃度-時間曲線下面積(area under the plasma
concentration versus time curve)(AUC)。
有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多
肽)獲得的AUC的至少約1.25倍的血漿濃度-時間曲線下面積(area under the plasma
concentration versus time curve)(AUC)。
[0014] 本發(fā)明還提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括以約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次的給藥間隔給受試者施用治療劑量的包含因子VIII和Fc的多肽。
[0015] 可對需要預(yù)防性治療或按需治療的受試者實施本發(fā)明的方法。
[0016] 按需治療包括出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、出血、至肌肉內(nèi)的出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷(trauma capitis)(頭創(chuàng)傷)、胃腸道出血、顱內(nèi)出血、腹腔
內(nèi)出血、,胸腔內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂
腰肌鞘(illiopsoas sheath)出血的治療。受試者可能需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期處理
(perioperative management)或手術(shù)治療。此類手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷性手術(shù)(trauma surgery)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)。
內(nèi)出血、,胸腔內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂
腰肌鞘(illiopsoas sheath)出血的治療。受試者可能需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期處理
(perioperative management)或手術(shù)治療。此類手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷性手術(shù)(trauma surgery)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)。
[0017] 為了進(jìn)行按需治療，所述嵌合多肽的給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
[0018] 可用于本發(fā)明的方法的治療劑量為約10至約100IU/kg，更具體地，約10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg，更具體地約10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
[0019] 可用于本發(fā)明的方法的治療劑量為約10至約150IU/kg，更具體地約100-110、110-120、120-130、130-140、140-150IU/kg，更具體地，約110、115、120、125、130、135、140、
145或150IU/kg。
145或150IU/kg。
[0020] 本發(fā)明的方法的受試者可以是人受試者或可以是非人哺乳動物。非人哺乳動物包括例如小鼠、狗、靈長類動物、猴、貓、馬、牛、豬和其它家養(yǎng)動物和小動物。給藥間隔和AUC的確定可在單個受試者或受試者群體中進(jìn)行。
[0021] 因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可以是人因子VIII或非-人因子VIII，例如豬、小鼠或犬因子VIII。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可具有B結(jié)構(gòu)域的
完全或部分缺失。
完全或部分缺失。
[0022] 因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可以與表2中顯示的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸
1-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表
2中顯示的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ
ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；
或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。
SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸
1-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表
2中顯示的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ
ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；
或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。
[0023] 因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序
列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIM(或嵌合多
肽的因子VIII部分)可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID
NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；
SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIM(或嵌合多
肽的因子VIII部分)可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID
NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；
SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
[0024] Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸
741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%
或95%的同一性。Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列
(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨
基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同
一性。
741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%
或95%的同一性。Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列
(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨
基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同
一性。
[0025] 嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或與表2A(i)中顯示
的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有
至少90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的
因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與表2A(i)
中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)
具有同一性的序列。
的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有
至少90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的
因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與表2A(i)
中顯示的具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)
具有同一性的序列。
[0026] 嵌合多肽可以以包含與所述嵌合多肽結(jié)合的第二多肽的雜交體的形式存在，其中所述第二多肽包含F(xiàn)c或基本上由其組成。
[0027] 第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的氨基酸序列(SEQIDNO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列
的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列或基
本上由所述序列組成。第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的氨基酸序
列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨
基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序列組成。
的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列或基
本上由所述序列組成。第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的氨基酸序
列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號序列的氨
基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序列組成。
[0028] 可將嵌合多肽或雜交體作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的部分施用。
[0029] 本發(fā)明還提供了上述嵌合多肽和雜交多肽本身、編碼它們的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培養(yǎng)的人胚胎細(xì)胞以及產(chǎn)生這類嵌合和雜交多肽的方法和利用這類方法產(chǎn)生
的多肽。
的多肽。
[0031] 圖1.rFVIIIFc單體的示意圖。
[0032] 圖2.在50IU/kg的靜脈內(nèi)劑量后，血友病A小鼠中與 相比較的rFVIIIFc的WBCT(n=6只小鼠/組)。
[0033] 圖3.在50IU/kg的rFVIIIFc、 和 的單次IV劑量后血友病A小鼠的血漿中的生色活性。
[0034] 圖4.血友病A狗中rFVIIIFc和 的WBCT。(A)rFVIIIFc。(B)在交叉研究中，施用 然后施用rFVIIIFc。
[0035] 圖5.血友病A狗中靜脈內(nèi)rFVIIIIFc和 的藥代動力學(xué)(通過ELISA測量的)。
[0036] 圖6.血友病A狗中單次靜脈內(nèi)劑量后rFVIII和 的活性(通過FVIII-特異性生色活性測定測量的)。
[0037] 圖7.在食蟹猴中，在單次靜脈內(nèi)劑量(125IU/kg)后隨時間過去后rFVIIIFc和Xyntha的組平均血漿濃度(n=6，平均值±SD)。通過ELISA測量血漿濃度。
[0038] 圖8.在食蟹猴中，單次靜脈內(nèi)劑量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的個體血漿濃度對時間曲線(n=6，平均值±SD)。通過ELISA測量血漿濃度。(A)通過ELISA測量的
rFVIIIFc。(B)通過ELISA測量的Xyntha。
rFVIIIFc。(B)通過ELISA測量的Xyntha。
[0039] 圖9.在食蟹猴中，單次靜脈內(nèi)劑量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的組平均血漿生色活性(n=6，平均值±SD)。使用FVIII-特異性生色活性測定法測量的IVIII活性
活性。
活性。
[0040] 圖10.在食蟹猴中，單次靜脈內(nèi)劑量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的個體血漿生色活性對時間曲線(n=6，平均值±SD)。使用FVIII特異性生色活性測定法測量FVIII
活性。(A)rFVIIIFc生色活性。(B)Xyntha生色活性。
活性。(A)rFVIIIFc生色活性。(B)Xyntha生色活性。
[0041] 圖11.rFVIII-Fc的生物化學(xué)表征：作為因子X濃度的函數(shù)的因子X的激活。
[0042] 圖12.rFVIII-Fc的生物化學(xué)表征：作為因子IXa濃度的函數(shù)的因子X的激活。
[0043] 圖13.觀察到的平均FVIII活性(±SE)(一步測定法，25IU/kg(A)或65IU/kg(B)；和生色測定法，25IU/kg(C)或65IU/kg(D))對時間。
[0044] 圖14.觀察到的組平均FVIII活性(±SE)(一步測定法(A)或生色測定法(B))對時間。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 本發(fā)明提供了使用更長的給藥間隔和/或更大的AUC(與利用目前已知的因子VIII產(chǎn)品可能獲得的給藥間隔和/或AUC相比較的)利用因子VIII治療血友病A的方法。
本發(fā)明還提供了改進(jìn)的因子VIII嵌合多肽、因子VIII嵌合多核苷酸以及產(chǎn)生方法。
本發(fā)明還提供了改進(jìn)的因子VIII嵌合多肽、因子VIII嵌合多核苷酸以及產(chǎn)生方法。
[0047] 血友病A的治療是靶向使FVIII活性恢復(fù)至1至5%的正常水平以防止自發(fā)性出血的替代療法(Mannucci，P.M.等人，N.Engl.J.Med.344:1773-9(2001)，通過引用整體并
入本文)。存在可用于按需治療出血事件或通過預(yù)防性治療防止出血事件發(fā)生的血漿源
性FVIII產(chǎn)物和重組FVIII產(chǎn)物?；谶@類產(chǎn)物的半衰期(10-12小時)(White G.C.等
人，Thromb.Haemost.77:660-7(1997)；Morfini，M.，Haemophilia 9(增刊):94-99；論述
100(2003))，治療方案需要通常每周2至3次(對于預(yù)防)和每天1至3次(對于按需治
療)的頻繁靜脈內(nèi)施用(Manco-Johnson，M.J.等人，N.Engl.J.Med.357:535-544(2007))，
將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。這樣的頻繁的施用是痛苦且不便的。
入本文)。存在可用于按需治療出血事件或通過預(yù)防性治療防止出血事件發(fā)生的血漿源
性FVIII產(chǎn)物和重組FVIII產(chǎn)物?；谶@類產(chǎn)物的半衰期(10-12小時)(White G.C.等
人，Thromb.Haemost.77:660-7(1997)；Morfini，M.，Haemophilia 9(增刊):94-99；論述
100(2003))，治療方案需要通常每周2至3次(對于預(yù)防)和每天1至3次(對于按需治
療)的頻繁靜脈內(nèi)施用(Manco-Johnson，M.J.等人，N.Engl.J.Med.357:535-544(2007))，
將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。這樣的頻繁的施用是痛苦且不便的。
[0048] 本發(fā)明提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括以等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的
多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍的給藥間隔給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII
多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽或這類多肽的雜交體。
多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍的給藥間隔給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII
多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽或這類多肽的雜交體。
[0049] 給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5至6倍、1.5至5
倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。給藥間隔可為等量的不具有非-因子VIII部分
例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔
的至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍。給藥間隔可以為約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次。
倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。給藥間隔可為等量的不具有非-因子VIII部分
例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔
的至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍。給藥間隔可以為約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次。
[0050] 給藥間隔可以為至少約1.5至5天、1.5天、2天、3天、4天或5天或更長時間。
[0051] 本發(fā)明還提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括給受試者施用治療劑量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽或這類多肽的雜交體，以獲
得為通過等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述
因子VIII部分組成的多肽)獲得的AUC的至少約1.25倍的血漿濃度-時間曲線下面積
(AUC)。
得為通過等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述
因子VIII部分組成的多肽)獲得的AUC的至少約1.25倍的血漿濃度-時間曲線下面積
(AUC)。
[0052] 本發(fā)明還提供了給有此需要的受試者施用因子VIII的方法，其包括以約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次的給藥間隔給受試者施用治療劑量的包含因子VIII和Fc的多肽或這類多肽的雜交體。
[0053] 可對需要預(yù)防性治療或按需治療的需要的受試者實施本發(fā)明的方法。
[0054] 如本文中所用，“施用”意指通過藥學(xué)上可接受的途徑給受試者提供本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的VIII多肽。優(yōu)選施用途徑是靜脈內(nèi)途徑例如靜脈注射和靜脈內(nèi)輸注。施用的其它途徑包括例如皮下、肌內(nèi)、口服、經(jīng)鼻和經(jīng)肺施用。可將嵌合多肽和雜交蛋白作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的部分來施用。
[0055] 如本文中所用的“血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)”與藥理學(xué)領(lǐng)域的術(shù)語的含義相同，并且基于施用后因子VIII的吸收的速率和程度。使用基于曲線的斜率，使用外推法
測定在指定的時間段例如12、18、24、36、48或72小時、或無窮時間內(nèi)的AUC。除非本文中另外指定，否則測定無窮時間的AUC。可在單個受試者中或在計算其平均值的受試者群體中進(jìn)行AUC的測定。
測定在指定的時間段例如12、18、24、36、48或72小時、或無窮時間內(nèi)的AUC。除非本文中另外指定，否則測定無窮時間的AUC。可在單個受試者中或在計算其平均值的受試者群體中進(jìn)行AUC的測定。
[0056] 如本文中所用，因子VIII的“B結(jié)構(gòu)域”與本領(lǐng)域已知的B結(jié)構(gòu)域相同，其由內(nèi)部氨基酸序列同一性和被凝血酶切割的蛋白酶水解切割位點界定，例如全長人因
子VIII的殘基Ser741-Argl648。其它人因子VIII結(jié)構(gòu)域由下列氨基酸殘基界定：
A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基
Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。
其余序列殘基Glul 649-Arg1689通常被稱為因子VIII輕鏈激活肽。豬、小鼠和犬因子
VIII的所有結(jié)構(gòu)域(包括B細(xì)胞域的邊界)的定位在本領(lǐng)域也是已知的。優(yōu)選地，因子
VIII的B結(jié)構(gòu)域缺失(“B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的實例
為REFACTO(重組BDD FVIII)，其具有與表2A(i)中的序列的因子VIII部分(SEQ ID NO:2
的氨基酸-19-1438或1-1438)相同的序列。
子VIII的殘基Ser741-Argl648。其它人因子VIII結(jié)構(gòu)域由下列氨基酸殘基界定：
A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基
Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。
其余序列殘基Glul 649-Arg1689通常被稱為因子VIII輕鏈激活肽。豬、小鼠和犬因子
VIII的所有結(jié)構(gòu)域(包括B細(xì)胞域的邊界)的定位在本領(lǐng)域也是已知的。優(yōu)選地，因子
VIII的B結(jié)構(gòu)域缺失(“B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的實例
為REFACTO(重組BDD FVIII)，其具有與表2A(i)中的序列的因子VIII部分(SEQ ID NO:2
的氨基酸-19-1438或1-1438)相同的序列。
[0057] “B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”可具有美國專利No.6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、
5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563中公開的完全或
部分缺失，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明的B結(jié)
構(gòu)域缺失的因子VIII序列包含在美國專利No.6,316,226(也在US 6,346,513中)的
第4欄第4行至第5欄第28行和實施例1-5中公開的任一缺失。在一些實施方案中，
本發(fā)明的B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有美國專利No.5,789,203(也在US 6,060,447、
US 5,595,886和US 6,228,620中)的第2欄第26-51行和實施例5-8中公開的缺失。
在一些實施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有美國專利No.5,972,885的第1欄第
25行至第2欄第40行；美國專利No.6,048,720的第6欄，第1-22行和實施例；美國專
利No.5,543,502的第2欄第17-46行；美國專利No.5,171,844的第4欄第22行至第
5欄第36行；美國專利No.5,112,950的第2欄第55-68行、圖2和實施例1；美國專利
No.4,868,112的第2欄第2行至第19欄，第21行和表2；美國專利No.7,041,635的第2
欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第
26行以及第11欄第5行至第13欄第39行；美國專利No.6,458,563的第4欄第25至53
行中描述的缺失。在一些實施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有大部分B結(jié)構(gòu)域的
缺失，但仍然包含為初級翻譯產(chǎn)物至兩條多肽鏈的體內(nèi)蛋白酶加工所必需的B結(jié)構(gòu)域的氨
基末端序列，如WO91/09122(其通過引用整體并入本文)中公開。在一些實施方案中，利
用氨基酸747-1638的缺失即實際上B結(jié)構(gòu)域的完全缺失構(gòu)建B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。
Hoeben R.C.等人，J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，通過引用整體并入本文。B
結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII還可包含因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺
失。Meulien P.等人Protein Eng.2(4):301-6(1988)，通過引用整體并入本文。為本發(fā)
明的部分的其它B結(jié)構(gòu)域缺失包括例如氨基酸982-1562或760-1639(Toole等人，Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83，5939-5942))、797-1562(Eaton等人Biochemistry(1986
)25:8343-8347))、741-1646(Kaufman(PCT公布申請No.WO 87/04187))、747-1560(Sarver
等 人，DNA(1987)6:553-564))，741-1648(Pasek(PCT 申 請 No.88/00831))、816-1598 或
741-1689(Tagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25，EP 295597))(將所述每一篇
文獻(xiàn)或申請通過引用整體并入本文)的缺失?？梢砸匀魏我蜃覸III序列制備上述缺失的
每一個。
5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563中公開的完全或
部分缺失，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明的B結(jié)
構(gòu)域缺失的因子VIII序列包含在美國專利No.6,316,226(也在US 6,346,513中)的
第4欄第4行至第5欄第28行和實施例1-5中公開的任一缺失。在一些實施方案中，
本發(fā)明的B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有美國專利No.5,789,203(也在US 6,060,447、
US 5,595,886和US 6,228,620中)的第2欄第26-51行和實施例5-8中公開的缺失。
在一些實施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有美國專利No.5,972,885的第1欄第
25行至第2欄第40行；美國專利No.6,048,720的第6欄，第1-22行和實施例；美國專
利No.5,543,502的第2欄第17-46行；美國專利No.5,171,844的第4欄第22行至第
5欄第36行；美國專利No.5,112,950的第2欄第55-68行、圖2和實施例1；美國專利
No.4,868,112的第2欄第2行至第19欄，第21行和表2；美國專利No.7,041,635的第2
欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第
26行以及第11欄第5行至第13欄第39行；美國專利No.6,458,563的第4欄第25至53
行中描述的缺失。在一些實施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有大部分B結(jié)構(gòu)域的
缺失，但仍然包含為初級翻譯產(chǎn)物至兩條多肽鏈的體內(nèi)蛋白酶加工所必需的B結(jié)構(gòu)域的氨
基末端序列，如WO91/09122(其通過引用整體并入本文)中公開。在一些實施方案中，利
用氨基酸747-1638的缺失即實際上B結(jié)構(gòu)域的完全缺失構(gòu)建B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。
Hoeben R.C.等人，J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，通過引用整體并入本文。B
結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII還可包含因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺
失。Meulien P.等人Protein Eng.2(4):301-6(1988)，通過引用整體并入本文。為本發(fā)
明的部分的其它B結(jié)構(gòu)域缺失包括例如氨基酸982-1562或760-1639(Toole等人，Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83，5939-5942))、797-1562(Eaton等人Biochemistry(1986
)25:8343-8347))、741-1646(Kaufman(PCT公布申請No.WO 87/04187))、747-1560(Sarver
等 人，DNA(1987)6:553-564))，741-1648(Pasek(PCT 申 請 No.88/00831))、816-1598 或
741-1689(Tagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25，EP 295597))(將所述每一篇
文獻(xiàn)或申請通過引用整體并入本文)的缺失?？梢砸匀魏我蜃覸III序列制備上述缺失的
每一個。
[0058] 如本文中所用，"嵌合多肽"意指在其中包括至少2種來自不同來源的多肽(或子序列或肽)。嵌合多肽可包含例如2、3、4、5、6、7或更多種來自不同來源例如不同基因、不同cDNA或不同動物或其它物種的多肽。嵌合多肽可包括例如一個或多個連接不同子序列
的接頭。因此，可直接連接子序列或在單個嵌合多肽內(nèi)直接、通過接頭或通過這兩種方式連接它們。嵌合多肽可包括例如額外的肽例如信號序列和序列例如6His和FLAG(其可幫助
蛋白質(zhì)純化或缺失)。此外，嵌合多肽還可具有至N-和/或C-端的氨基酸或肽的添加。
的接頭。因此，可直接連接子序列或在單個嵌合多肽內(nèi)直接、通過接頭或通過這兩種方式連接它們。嵌合多肽可包括例如額外的肽例如信號序列和序列例如6His和FLAG(其可幫助
蛋白質(zhì)純化或缺失)。此外，嵌合多肽還可具有至N-和/或C-端的氨基酸或肽的添加。
[0059] 在一些實施方案中，嵌合多肽包含因子VIII部分和非-因子VIII部分。示例性非-因子VIII部分包括例如Fc、XTEN和白蛋白。本發(fā)明的示例性嵌合多肽包括例如嵌合
因子VIII-Fc多肽、嵌合因子VIII-XTEN多肽和嵌合因子VIII-白蛋白多肽。
因子VIII-Fc多肽、嵌合因子VIII-XTEN多肽和嵌合因子VIII-白蛋白多肽。
[0060] 示例性嵌合因子VIII-Fc多肽包括例如SEQ ID NO:2、6、8、10和12(表2)(具有或不具有它們的信號序列)和SEQ ID NO:4的嵌合Fc多肽(表2)。
[0061] 嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或與2A(i)中顯示的
具有信號序列的因子VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少
90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子
VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與表2A(i)中顯示
的具有信號序列VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有同一性的
序列。
具有信號序列的因子VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少
90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含與表2A(i)中顯示的不具有信號序列的因子
VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或與表2A(i)中顯示
的具有信號序列VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有同一性的
序列。
[0062] 如上所述，示例性嵌合多肽包括融合至一個或多個XTEN多肽的因子VIII。Schellenburger等人，Nat.Biotech.27:1186-90(2009)(將其通過引用整體并入本文)。
可將因子VIII融合至XTEN多肽的N末端或XTEN多肽的C末端，只要因子VIII-XTEN
融合蛋白的VIII組分可被蛋白酶加工以產(chǎn)生含有經(jīng)加工的因子VIII的多肽。可將
蛋白酶位點包含在NTEN部分與因子VIII部分之間以允許這樣的加工。XTEN多肽包
括 例 如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682 和 US
2009/0092582(將所述每一個申請通過引用整體并入本文)中公開的多肽。
可將因子VIII融合至XTEN多肽的N末端或XTEN多肽的C末端，只要因子VIII-XTEN
融合蛋白的VIII組分可被蛋白酶加工以產(chǎn)生含有經(jīng)加工的因子VIII的多肽。可將
蛋白酶位點包含在NTEN部分與因子VIII部分之間以允許這樣的加工。XTEN多肽包
括 例 如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682 和 US
2009/0092582(將所述每一個申請通過引用整體并入本文)中公開的多肽。
[0063] 如上所論述的，示例性嵌合多肽還包括融合至一個或多個白蛋白多肽的因子。優(yōu)選地白蛋白是人白蛋白。還可將因子VIII融合至白蛋白的N末端或白蛋白的C末端，只
要因子VIII-白蛋白融合蛋白的因子VIII組分可被酶促活性前蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein
convertase)加工以產(chǎn)生含有經(jīng)加工的因子VIII的多肽即可?？捎糜诒景l(fā)明的白蛋白
例如其片段的實例在例如美國專利No.7,592,010；美國專利No.6,686,179；和Schulte，
Thrombosis Res.124增刊.2:S6-S8(2009)(將每一篇所述專利和文獻(xiàn)通過引用整體并入
本文)中是已知的。
要因子VIII-白蛋白融合蛋白的因子VIII組分可被酶促活性前蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein
convertase)加工以產(chǎn)生含有經(jīng)加工的因子VIII的多肽即可?？捎糜诒景l(fā)明的白蛋白
例如其片段的實例在例如美國專利No.7,592,010；美國專利No.6,686,179；和Schulte，
Thrombosis Res.124增刊.2:S6-S8(2009)(將每一篇所述專利和文獻(xiàn)通過引用整體并入
本文)中是已知的。
[0064] 在一些實施方案中，含有因子VIII部分的嵌合多肽具有與由相同因子VIII部分組成但無非因子VIII部分的多肽相比增加的半衰期(t1/2)。具有增加的t1/2的嵌合因子
VIII多肽在本文中可稱為長效因子VIII。長效嵌合因子VIII多肽包括例如融合至Fc的
因子VIII(包括例如以雜交體FVIIIFc單體二聚體雜交體形式存在的嵌合因子VIII多肽；
參見實施例1，圖1和表2A；和美國專利No.7,404,956和7,348,004)、融合至XTEN的因子
VIII和融合至白蛋白的因子VIII。
VIII多肽在本文中可稱為長效因子VIII。長效嵌合因子VIII多肽包括例如融合至Fc的
因子VIII(包括例如以雜交體FVIIIFc單體二聚體雜交體形式存在的嵌合因子VIII多肽；
參見實施例1，圖1和表2A；和美國專利No.7,404,956和7,348,004)、融合至XTEN的因子
VIII和融合至白蛋白的因子VIII。
[0065] 如本文中所用，“培養(yǎng)”、“進(jìn)行培養(yǎng)”和“正在培養(yǎng)”意指在允許細(xì)胞生長或分裂或?qū)⒓?xì)胞維持在活的狀態(tài)中的體外條件下溫育細(xì)胞。如本文中所用，“培養(yǎng)的細(xì)胞”意指在體外增殖的細(xì)胞。
[0066] 如本文中所用，“因子VIII”，除非另外指出，否則意指在凝結(jié)中以其正常作用發(fā)揮功能的因子VIII多肽。因此，術(shù)語因子VIII包括具有功能的變異多肽。優(yōu)選因子VIII蛋白是人、豬科動物、犬科動物和鼠因子VIII蛋白。如背景領(lǐng)域部分中所述，全長多肽和多核苷酸的序列是已知的，同樣地許多功能性片段、突變體和經(jīng)修飾的形式的序列也是已知的。
人因子VIII的序列的實例顯示為SEQ ID NO:2、6、8、10和12(表2)中的子序列。因子VIII
多肽包括例如全長因子VII、除去N末端上的Met的全長因子VIII、成熟因子VIII(除去信
號序列)、在N末端上具有額外Met的成熟因子VIII和/或具有B結(jié)構(gòu)域的全長或部分缺
失的因子VIII。優(yōu)選因子VIII變體包括B結(jié)構(gòu)域缺失，無論是部分還是完全缺失。
人因子VIII的序列的實例顯示為SEQ ID NO:2、6、8、10和12(表2)中的子序列。因子VIII
多肽包括例如全長因子VII、除去N末端上的Met的全長因子VIII、成熟因子VIII(除去信
號序列)、在N末端上具有額外Met的成熟因子VIII和/或具有B結(jié)構(gòu)域的全長或部分缺
失的因子VIII。優(yōu)選因子VIII變體包括B結(jié)構(gòu)域缺失，無論是部分還是完全缺失。
[0067] 許多功能性因子VIII變體是已知的，如在上文和下文中論述的。此外，已在血友病患者中鑒定了因子VIII的數(shù)百個非功能性突變，并且已確定這類突變對因子VIII
功能的作用更主要地歸因于它們在,因子VIII的三維結(jié)構(gòu)存在的位置而非置換的性質(zhì)
(Cutler等人，Hum.Mutat.19:274-8(2002))(通過引用整體并入本文)。此外，人與其它物
種的因子VIII之間的比較已鑒定了可能是功能所需的保守性殘基(Cameron等人，Thromb.
Haemost.79:317-22(1998)；US6,251,632)(通過引用整體并入本文)。
功能的作用更主要地歸因于它們在,因子VIII的三維結(jié)構(gòu)存在的位置而非置換的性質(zhì)
(Cutler等人，Hum.Mutat.19:274-8(2002))(通過引用整體并入本文)。此外，人與其它物
種的因子VIII之間的比較已鑒定了可能是功能所需的保守性殘基(Cameron等人，Thromb.
Haemost.79:317-22(1998)；US6,251,632)(通過引用整體并入本文)。
[0068] 人因子VIII基因已被分離并且將其在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)(Toole，J.J.等人，Nature 312:342-347(1984)；Gitschier，J. 等 人，Nature 312:326-330(1984)；Wood，W.I.等人，Nature 312:330-337(1984)；Vehar，G.A.等人，Nature312:337-342(1984)；WO
87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美國專利No.4,757,006)(將所述每一篇文獻(xiàn)、申
請、專利通過引用整體并入本文)，并且從cDNA推斷出所述氨基酸序列。Capon等人，美國
專利No.4,965,199(通過引用整體并入本文)公開了用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生因子
VIII和純化人因子VIII的重組DNA方法。已報導(dǎo)了人因子VIII在CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)
胞和BHKC(幼倉鼠腎細(xì)胞)中的表達(dá)。已對人因子VIII進(jìn)行了修飾以缺失部分或全部B結(jié)
構(gòu)域(美國專利No.4,994,371和4,868,112，將所述每一個專利通過引用整體并入本文)，
并且已進(jìn)行了人因子V B結(jié)構(gòu)域?qū)θ艘蜃覸III B結(jié)構(gòu)域的替換(美國專利No.5,004,803，
通過引用整體并入本文)。編碼人因子VIII的cDAN序列和預(yù)測的氨基酸序列分別示于美
國申請公布第2005/0100990號(通過引用整體并入本文)的SEQ ID NO:l和2中。
87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美國專利No.4,757,006)(將所述每一篇文獻(xiàn)、申
請、專利通過引用整體并入本文)，并且從cDNA推斷出所述氨基酸序列。Capon等人，美國
專利No.4,965,199(通過引用整體并入本文)公開了用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生因子
VIII和純化人因子VIII的重組DNA方法。已報導(dǎo)了人因子VIII在CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)
胞和BHKC(幼倉鼠腎細(xì)胞)中的表達(dá)。已對人因子VIII進(jìn)行了修飾以缺失部分或全部B結(jié)
構(gòu)域(美國專利No.4,994,371和4,868,112，將所述每一個專利通過引用整體并入本文)，
并且已進(jìn)行了人因子V B結(jié)構(gòu)域?qū)θ艘蜃覸III B結(jié)構(gòu)域的替換(美國專利No.5,004,803，
通過引用整體并入本文)。編碼人因子VIII的cDAN序列和預(yù)測的氨基酸序列分別示于美
國申請公布第2005/0100990號(通過引用整體并入本文)的SEQ ID NO:l和2中。
[0069] 美國專利No.5,859,204，Lollar.J.S.(通過引用整體并入本文)報導(dǎo)了具有減小的抗原性和減小的免疫反應(yīng)性的因子VIII的功能性突變體。美國專利No.6,376,463，
Lollar，J.S.(通過引用整體并入本文)也報導(dǎo)了具有減小的免疫反應(yīng)性的因子VIII的突
變體。美國申請公布第2005/0100990號，Saenko等人(通過引用整體并入本文)報導(dǎo)了
因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域中的功能性突變。
Lollar，J.S.(通過引用整體并入本文)也報導(dǎo)了具有減小的免疫反應(yīng)性的因子VIII的突
變體。美國申請公布第2005/0100990號，Saenko等人(通過引用整體并入本文)報導(dǎo)了
因子VIII的A2結(jié)構(gòu)域中的功能性突變。
[0070] 許多功能性因子VIII分子(包含B結(jié)構(gòu)域缺失)公開于下列專利US6,316,226和US 6,346,513(兩個專利都屬于Baxter)；屬于In2Gen的US7,041,635；屬于Chiron
的US 5,789,203、US 6,060,447、US 5,595,886和US6,228,620；屬于Biovitrum的US
5,972,885和US 6,048,720、屬于Novo Nordisk的US 5,543,502和US 5,610,278；屬
于Immuno Ag的US 5,171,844；屬于Transgene S.A的US 5,112,950；屬于Genetics
Institute的US 4,868,112，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
的US 5,789,203、US 6,060,447、US 5,595,886和US6,228,620；屬于Biovitrum的US
5,972,885和US 6,048,720、屬于Novo Nordisk的US 5,543,502和US 5,610,278；屬
于Immuno Ag的US 5,171,844；屬于Transgene S.A的US 5,112,950；屬于Genetics
Institute的US 4,868,112，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
[0071] 豬 因 子 VIII 序 列 已 被 公 布 (Toole，J.J.等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5939-5942(1986))(所述文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)，并且已報導(dǎo)了獲自豬脾
cDNA文庫的因子VIII序列的PGR擴(kuò)增的完全豬cDNA序列(Healey，J.F.等人，Blood
88:4209-4214(1996)(通過引用整體并入本文)。所有結(jié)構(gòu)域、所有亞單位以及特定的氨基
酸序列被置換的雜交體人/豬因子VIII公開于Lollar和Runge的美國專利No.5,364,771
和在WO 93/20093(通過引用整體并入本文)中。更近以來，在WO 94/11503(通過引用整
體并入本文)中報導(dǎo)了用豬Al和/或A2結(jié)構(gòu)域置換了相應(yīng)的人結(jié)構(gòu)域的豬因子VIII和
嵌合因子VIII的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列。美國專利No.5,859,204，Lollar，J.S.還公
開了豬cDNA和推斷的氨基酸序列。屬于Emory的6,458,563(通過引用整體并入本文)公
開了了B-結(jié)構(gòu)域缺失的豬因子VIII。
cDNA文庫的因子VIII序列的PGR擴(kuò)增的完全豬cDNA序列(Healey，J.F.等人，Blood
88:4209-4214(1996)(通過引用整體并入本文)。所有結(jié)構(gòu)域、所有亞單位以及特定的氨基
酸序列被置換的雜交體人/豬因子VIII公開于Lollar和Runge的美國專利No.5,364,771
和在WO 93/20093(通過引用整體并入本文)中。更近以來，在WO 94/11503(通過引用整
體并入本文)中報導(dǎo)了用豬Al和/或A2結(jié)構(gòu)域置換了相應(yīng)的人結(jié)構(gòu)域的豬因子VIII和
嵌合因子VIII的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列。美國專利No.5,859,204，Lollar，J.S.還公
開了豬cDNA和推斷的氨基酸序列。屬于Emory的6,458,563(通過引用整體并入本文)公
開了了B-結(jié)構(gòu)域缺失的豬因子VIII。
[0072] 因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表2中顯示的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ
ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具
有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表2中顯示
的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6
的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID
NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。
ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具
有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表2中顯示
的不具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6
的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID
NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。
[0073] 因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；
SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨
基酸-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)
可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII的氨基酸(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；
SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基
酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨
基酸-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)
可與表2中顯示的具有信號序列的因子VIII的氨基酸(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；
SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基
酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。
[0074] 如本文中所用，“等量的”意指以國際單位表示的相同量的因子VIII活性，其不依賴于所述多肽的分子量。因子VIII活性的一個國際單位(IU)大致對應(yīng)于1毫升正常人血漿中的因子VIII的量。幾個測定法可用于測量因子VIII活性，包括歐洲藥典生色底物測
定法(European Pharmacopoeia chromogenic substrate assay)和一步凝集測定法。
定法(European Pharmacopoeia chromogenic substrate assay)和一步凝集測定法。
[0075] 如本文中所用，“Fc”，除非另外指出，否則意指功能性新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合伴侶。FcRn結(jié)合伴侶是可被FcRn受體特異性結(jié)合，隨后通過FcRn結(jié)合伴侶的FcRn受體主動運輸?shù)娜魏畏肿?。因此，術(shù)語Fc包括具有功能的IgG Fc的任何變體。已基于X-射
線晶體學(xué)描述了結(jié)合FcRn受體的IgG的Fc部分的區(qū)域(Burmeister等人1994，Nature
372:379，通過引用整體并入本文)。Fc與FcRn的主要接觸區(qū)域靠近CH2與CH3結(jié)構(gòu)域的
接合處。Fc-FcRn接觸全部在單Ig重鏈內(nèi)。FcRn結(jié)合伴侶包括例如完整的IgG、IgG的
Fc片段、包括FcRn的完整結(jié)合區(qū)域的IgG的其它片段。主要接觸位點包括CH2結(jié)構(gòu)域的
氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428和433-436。提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區(qū)域的氨基酸
編號全部基于Kabat等人1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，
美國公共生部，Bethesda；MD，通過引用整體并入本文。(已從幾種哺乳動物物種(包括
人)分離了FcRn受體。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人
1994，J.Exp.Med.180:2377)，通過引用整體并入文)。Fc可包含具有或不具有免疫球蛋白
的鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。示例性Fc變體提供于WO 2004/101740和
WO2006/074199(通過引用整體并入本文)中。
線晶體學(xué)描述了結(jié)合FcRn受體的IgG的Fc部分的區(qū)域(Burmeister等人1994，Nature
372:379，通過引用整體并入本文)。Fc與FcRn的主要接觸區(qū)域靠近CH2與CH3結(jié)構(gòu)域的
接合處。Fc-FcRn接觸全部在單Ig重鏈內(nèi)。FcRn結(jié)合伴侶包括例如完整的IgG、IgG的
Fc片段、包括FcRn的完整結(jié)合區(qū)域的IgG的其它片段。主要接觸位點包括CH2結(jié)構(gòu)域的
氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428和433-436。提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區(qū)域的氨基酸
編號全部基于Kabat等人1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，
美國公共生部，Bethesda；MD，通過引用整體并入本文。(已從幾種哺乳動物物種(包括
人)分離了FcRn受體。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人
1994，J.Exp.Med.180:2377)，通過引用整體并入文)。Fc可包含具有或不具有免疫球蛋白
的鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。示例性Fc變體提供于WO 2004/101740和
WO2006/074199(通過引用整體并入本文)中。
[0076] Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可包含一個或多個突變以及突變的組合。
[0077] Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可包含賦予增加的半衰期的突變例如M252Y、S254T、T256E及其組合，如Oganesyan等人，Mol.Immunol.46:1750(2009)(將其通過引用整體并入
本文)中公開的；H433K、N434F及其組合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23:1283(2005)(通過引用整體并入本文)中公開的；US2009/0264627Al(將其通過引用整體并入本文)的
第1-2頁的段落[0012]以及實施例9和10中公開的突變；和US 20090163699A1(將其通
過引用整體并入本文)的第2頁段落[0014]至[0021]中公開的突變體。
本文)中公開的；H433K、N434F及其組合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23:1283(2005)(通過引用整體并入本文)中公開的；US2009/0264627Al(將其通過引用整體并入本文)的
第1-2頁的段落[0012]以及實施例9和10中公開的突變；和US 20090163699A1(將其通
過引用整體并入本文)的第2頁段落[0014]至[0021]中公開的突變體。
[0078] Fc(或嵌合多肽的Fc部分)還可包括下列突變：IgG的Fc區(qū)域可按照公認(rèn)的方法例如定向誘變等來進(jìn)行修飾以產(chǎn)生可被FcRn結(jié)合的經(jīng)修飾IgG或其Fc片段或部分。
此類修飾包括例如遠(yuǎn)離FcRn接觸位點的修飾以及接觸位點內(nèi)的修飾，所述修飾保持或甚
至增強(qiáng)對FcRn的結(jié)合。例如，人IgG1Fc中的下列單個氨基酸殘基(Fcyl)可被置換而無
對FcRn的Fc結(jié)合親和力的顯著丟失：P238A、S239A、K246A、248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375AD376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D41 A.414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A.E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在位置編號238上被置換的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基
酸可在上文中指定的位點上置換野生型氨基酸?？蓪⑼蛔儐蝹€地引入Fc，從而產(chǎn)生超過
100多種與天然Fc不同的FcRn結(jié)合伴侶。此外，可將2、3或更多個這類單個突變的組合
一起引入，從而產(chǎn)生超過數(shù)百種FcRn結(jié)合伴侶。這類突變的某些突變可賦予FcRn結(jié)合功
能新的功能性。例如，一個實施方案整合N297A，從而除去高度保守的N-糖基化位點。該
突變的效應(yīng)是減小免疫原性，從而增加FcRn結(jié)合伴侶的循環(huán)半衰期和使得FcRn結(jié)合伴侶
不能結(jié)合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，但不損害對于FcRn的親和力(Routledge
等人1995，Transplantation60:847，將其通過引用整體并入本文；Friend等人1999，
Transplantation 68:1632，將其通過引用度整體并入本文；Shields等人1995，J.Biol.
Chem.276:6591，將其通過引用整體并入本文)。此外，至少3種人Fcγ受體似乎識別IgG
上的更下方的鉸鏈區(qū)內(nèi)的結(jié)合位點(通常氨基酸234-237)。因此，新功能性和潛在減小的
免疫原性的另一個實例可因該區(qū)域的突變而產(chǎn)生，如例如通過來自IgG2“PVA”的相應(yīng)序列(具有一個氨基酸缺失)替代人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236來產(chǎn)生。已顯示當(dāng)這類突
變已被引入時，介導(dǎo)各種效應(yīng)子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII將不結(jié)合IgG1(Ward和
Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2:77，將其通過引用整體并入本文；和Armour等
人1999，Eur.J.Immunol.29:2613，將其通過引用整體并入本文)。作為由上述突變產(chǎn)生的
新功能性的其它實例，對FcRn的親和力在一些情況下可被增加超過野生型的親和力。該增
加的親和力可反映增加的“結(jié)合”率(on rate)、減小的“離解”率(off rate)或增加的“結(jié)合率(on rate)”和減小的“離解率(off rate)”。據(jù)認(rèn)為賦予增加的對FcRn的親和力的
突變包括例如T256A，T307A，E380A和N434A(Shields等人2001，J.Biol.Chem.276:6591，
將其通過引用整體并入本文)。
此類修飾包括例如遠(yuǎn)離FcRn接觸位點的修飾以及接觸位點內(nèi)的修飾，所述修飾保持或甚
至增強(qiáng)對FcRn的結(jié)合。例如，人IgG1Fc中的下列單個氨基酸殘基(Fcyl)可被置換而無
對FcRn的Fc結(jié)合親和力的顯著丟失：P238A、S239A、K246A、248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375AD376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D41 A.414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A.E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在位置編號238上被置換的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基
酸可在上文中指定的位點上置換野生型氨基酸?？蓪⑼蛔儐蝹€地引入Fc，從而產(chǎn)生超過
100多種與天然Fc不同的FcRn結(jié)合伴侶。此外，可將2、3或更多個這類單個突變的組合
一起引入，從而產(chǎn)生超過數(shù)百種FcRn結(jié)合伴侶。這類突變的某些突變可賦予FcRn結(jié)合功
能新的功能性。例如，一個實施方案整合N297A，從而除去高度保守的N-糖基化位點。該
突變的效應(yīng)是減小免疫原性，從而增加FcRn結(jié)合伴侶的循環(huán)半衰期和使得FcRn結(jié)合伴侶
不能結(jié)合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，但不損害對于FcRn的親和力(Routledge
等人1995，Transplantation60:847，將其通過引用整體并入本文；Friend等人1999，
Transplantation 68:1632，將其通過引用度整體并入本文；Shields等人1995，J.Biol.
Chem.276:6591，將其通過引用整體并入本文)。此外，至少3種人Fcγ受體似乎識別IgG
上的更下方的鉸鏈區(qū)內(nèi)的結(jié)合位點(通常氨基酸234-237)。因此，新功能性和潛在減小的
免疫原性的另一個實例可因該區(qū)域的突變而產(chǎn)生，如例如通過來自IgG2“PVA”的相應(yīng)序列(具有一個氨基酸缺失)替代人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236來產(chǎn)生。已顯示當(dāng)這類突
變已被引入時，介導(dǎo)各種效應(yīng)子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII將不結(jié)合IgG1(Ward和
Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2:77，將其通過引用整體并入本文；和Armour等
人1999，Eur.J.Immunol.29:2613，將其通過引用整體并入本文)。作為由上述突變產(chǎn)生的
新功能性的其它實例，對FcRn的親和力在一些情況下可被增加超過野生型的親和力。該增
加的親和力可反映增加的“結(jié)合”率(on rate)、減小的“離解”率(off rate)或增加的“結(jié)合率(on rate)”和減小的“離解率(off rate)”。據(jù)認(rèn)為賦予增加的對FcRn的親和力的
突變包括例如T256A，T307A，E380A和N434A(Shields等人2001，J.Biol.Chem.276:6591，
將其通過引用整體并入本文)。
[0079] Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一
性。Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID
NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。
性。Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可與表2中顯示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基
酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID
NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。
[0080] 如本文中所用，“雜交體”多肽和蛋白質(zhì)意指嵌合多肽與第二多肽的組合。雜交體中的嵌合多肽和第二多肽可通過蛋白質(zhì)間相互作用例如電荷-電荷或疏水相互作用彼此結(jié)合。雜交體中的嵌合多肽和第二多肽可通過二硫鍵或其它共價鍵彼此締合。雜交體描述
于WO 2004/101740和WO 2006/074199(將所述每一個申請通過引用整體并入本文)。也參
見美國專利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。第二
多肽可以是相同嵌合多肽的第二拷貝或其可以是非-同一嵌合多肽。參見，例如，圖1、實
施例1和表2。在優(yōu)選實施方案中，所述第二多肽是包含F(xiàn)c的多肽。在優(yōu)選實施方案中，
嵌合多肽為嵌合因子VIII-Fc多肽并且第二多肽基本上由Fc組成，例如實施例1的雜交多
肽(其為rFVIIIFc重組融合蛋白，由融合至人IgiG1的二聚Fc結(jié)構(gòu)域的重組B結(jié)構(gòu)域缺
失的人FVIII(BDD-rFVIII)的單個分子組成，無間插接頭序列)。該雜交多肽在本文中稱為
FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIIFc雜交體和FVIIIFc單體-二
聚體。參見實施例1、圖1和表2。實施例提供了該雜交多肽的臨床前和臨床數(shù)據(jù)。
于WO 2004/101740和WO 2006/074199(將所述每一個申請通過引用整體并入本文)。也參
見美國專利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。第二
多肽可以是相同嵌合多肽的第二拷貝或其可以是非-同一嵌合多肽。參見，例如，圖1、實
施例1和表2。在優(yōu)選實施方案中，所述第二多肽是包含F(xiàn)c的多肽。在優(yōu)選實施方案中，
嵌合多肽為嵌合因子VIII-Fc多肽并且第二多肽基本上由Fc組成，例如實施例1的雜交多
肽(其為rFVIIIFc重組融合蛋白，由融合至人IgiG1的二聚Fc結(jié)構(gòu)域的重組B結(jié)構(gòu)域缺
失的人FVIII(BDD-rFVIII)的單個分子組成，無間插接頭序列)。該雜交多肽在本文中稱為
FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIIFc雜交體和FVIIIFc單體-二
聚體。參見實施例1、圖1和表2。實施例提供了該雜交多肽的臨床前和臨床數(shù)據(jù)。
[0081] 雜交體的第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或與表2A(ii)中顯示的具有
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的
序列或基本上由所述序列組成。第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的
氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號
序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序
列組成。
信號序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的
序列或基本上由所述序列組成。第二多肽可包含與表2A(ii)中顯示的不具有信號序列的
氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或與表2A(ii)中顯示的具有信號
序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序
列組成。
[0082] 圖1為顯示B結(jié)合域缺失的因子VIII-Fc嵌合多肽的結(jié)構(gòu)以及其與作為Fc多肽的第二多肽的結(jié)合的示意圖。為了獲得該雜交體，使用FVIII特異性引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合
酶鏈多反應(yīng)(RT-PCR)從人肝poly A RNA(Clontech)獲得人重組B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII
的編碼序列。FVIII序列包括FVIII的天然信號序列。B結(jié)構(gòu)域缺失從絲氨酸743(S743；
2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；4969bp)，總共2682bp的缺失。然后，使用Fc特異性引
物通過RT-PCR從人白細(xì)胞cDNA文庫(Clontech)獲得人重組Fc的編碼序列。設(shè)計引物以
便將B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列直接融合至Fc序列的N端而不用間插接頭。在CMV啟動
子的控制之下將FVIIIFc DNA序列克隆入哺乳動物雙表達(dá)載體pBUDCE4.1(Invitrogen)。
通過RT-PCR獲得包含小鼠Igk信號序列的第二相同的Fc序列，然后將其克隆在表達(dá)載體
pBUDCE4.1中的第二啟動子EF1α的下游。
酶鏈多反應(yīng)(RT-PCR)從人肝poly A RNA(Clontech)獲得人重組B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII
的編碼序列。FVIII序列包括FVIII的天然信號序列。B結(jié)構(gòu)域缺失從絲氨酸743(S743；
2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；4969bp)，總共2682bp的缺失。然后，使用Fc特異性引
物通過RT-PCR從人白細(xì)胞cDNA文庫(Clontech)獲得人重組Fc的編碼序列。設(shè)計引物以
便將B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列直接融合至Fc序列的N端而不用間插接頭。在CMV啟動
子的控制之下將FVIIIFc DNA序列克隆入哺乳動物雙表達(dá)載體pBUDCE4.1(Invitrogen)。
通過RT-PCR獲得包含小鼠Igk信號序列的第二相同的Fc序列，然后將其克隆在表達(dá)載體
pBUDCE4.1中的第二啟動子EF1α的下游。
[0083] 使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑(Invitrogen)將rFVIIIFc表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人胚胎腎293細(xì)胞(HEK293H；Invitrogen)。通過用Zeocin(Invitrogen)選擇產(chǎn)生穩(wěn)定
克隆細(xì)胞系。將一個克隆細(xì)胞系3C4-22用于產(chǎn)生FVIIIFc以進(jìn)行體內(nèi)表征。在Biogen
Idec(Cambridge，MA)產(chǎn)生和純化重組FVIIIFc(McCue等人2009)。預(yù)期上述轉(zhuǎn)錄策略產(chǎn)生
3種產(chǎn)物，即單體rFVIIIFc雜交體、二聚rFVIIIFc雜交體和二聚Fc。然而，在來自這類細(xì)
胞的條件化培養(yǎng)基中基本上不存在可檢測的二聚rFVIIIFc。相反，條件化培養(yǎng)基包含F(xiàn)c和
單體rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc的尺寸可能太大，從而被阻止從細(xì)胞高效分泌。該結(jié)果是有
益的，因為其使得單體的純化比在所有3種蛋白質(zhì)都存在的情況下簡單。這類研究中使用
的材料具有約9000IU/mg的比活性。
克隆細(xì)胞系。將一個克隆細(xì)胞系3C4-22用于產(chǎn)生FVIIIFc以進(jìn)行體內(nèi)表征。在Biogen
Idec(Cambridge，MA)產(chǎn)生和純化重組FVIIIFc(McCue等人2009)。預(yù)期上述轉(zhuǎn)錄策略產(chǎn)生
3種產(chǎn)物，即單體rFVIIIFc雜交體、二聚rFVIIIFc雜交體和二聚Fc。然而，在來自這類細(xì)
胞的條件化培養(yǎng)基中基本上不存在可檢測的二聚rFVIIIFc。相反，條件化培養(yǎng)基包含F(xiàn)c和
單體rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc的尺寸可能太大，從而被阻止從細(xì)胞高效分泌。該結(jié)果是有
益的，因為其使得單體的純化比在所有3種蛋白質(zhì)都存在的情況下簡單。這類研究中使用
的材料具有約9000IU/mg的比活性。
[0084] 如本文中所用，“給藥間隔”，意指給受試者施用的多個劑量之間逝去的時間的量?？稍趩蝹€受試者或在受試者群體中進(jìn)行給藥間隔的比較，然后可計算群體中獲得的平均
值。
值。
[0085] 當(dāng)施用本發(fā)明的嵌合因子VIII多肽例如嵌合因子VIII-Fc多肽(包含因子VIII的多肽或雜交體)時，給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部分例如無Fc部分的
所述因子VIII(由所述因子VIII組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍。給藥間
隔可以為等量的不具有非因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII
組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或
1.5至2倍。給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子
VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、
4.5、5、5.5或6倍。給藥間隔可以為約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次。給藥間隔可以為至少約1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更長時間。對于按需治療，所述嵌合多肽或雜交體的給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
所述因子VIII(由所述因子VIII組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍。給藥間
隔可以為等量的不具有非因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII
組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或
1.5至2倍。給藥間隔可以為等量的不具有非-因子VIII部分例如無Fc部分的所述因子
VIII(由所述因子VIII部分組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、
4.5、5、5.5或6倍。給藥間隔可以為約每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更長時間一次。給藥間隔可以為至少約1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更長時間。對于按需治療，所述嵌合多肽或雜交體的給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
[0086] 優(yōu)選地，有效劑量為25-65IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、
62、64或65IU/kg)并且給藥間隔為每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8天或更多天一次，或每周3次，或每周不超過3次。優(yōu)選地，有效劑量為65IU/kg并且給藥間隔為每周一次或每
6-7天一次。
62、64或65IU/kg)并且給藥間隔為每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8天或更多天一次，或每周3次，或每周不超過3次。優(yōu)選地，有效劑量為65IU/kg并且給藥間隔為每周一次或每
6-7天一次。
[0087] “長效因子VIII”為與參照因子VIII相比較具有增加的半衰期(在本文中也稱為t1/2、1/2β、消除半衰期和HL)的因子VIII。長效因子VIII的增加的半衰期可歸因于至一
個或多個非-因子VIII多肽例如Fc、XTEN或白蛋白的融合。增加的半衰期可歸因于一種
或多種修飾例如PEG化。示例性長效因子VIII多肽包括例如包含F(xiàn)c的嵌合因子VIII多
肽、包含XTEN的嵌合因子VIII和包含白蛋白的嵌合因子VIII多肽。其它示例性長效因子
VIII多肽包括例如PEG化的因子VIII。
個或多個非-因子VIII多肽例如Fc、XTEN或白蛋白的融合。增加的半衰期可歸因于一種
或多種修飾例如PEG化。示例性長效因子VIII多肽包括例如包含F(xiàn)c的嵌合因子VIII多
肽、包含XTEN的嵌合因子VIII和包含白蛋白的嵌合因子VIII多肽。其它示例性長效因子
VIII多肽包括例如PEG化的因子VIII。
[0088] “參照”多肽，在長效嵌合因子VIII多肽的情況下，為基本上由嵌合多肽的因子VIII部分組成的多肽，例如無Fc部分、無XTEN部分或無白蛋白部分的相同因子VIII部分。
同樣地，在修飾因子VIII的情況下，參照多肽為不具有修飾的相同因子VIII，例如不具有
PEG化的因子VIII。
同樣地，在修飾因子VIII的情況下，參照多肽為不具有修飾的相同因子VIII，例如不具有
PEG化的因子VIII。
[0089] 在一些實施方案中，當(dāng)給受試者施用時，長效因子VIII具有下列性質(zhì)的一個或多個性質(zhì)：
[0090] 約14-41.3小時的所述受試者中的平均停留時間(MRT)(活性)；
[0091] 約1.22-5.19mL/小時/kg或更少的所述受試者中的清除率(CL)(活性)；
[0092] 約11-26.4小時的所述受試者中的t1/2β(活性)；
[0093] 約1.38-2.88IU/dL每IU/g的所述受試者中的增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
[0094] 約37.7-79.4mL/kg的所述受試者中的Vss(活性)；和
[0095] 約19.2-81.7IU*h/dL每IU/kg的所述受試者中的AUC/劑量。
[0096] 在一些實施方案中，當(dāng)給患者群體施用時，長效因子VIII具有下列性質(zhì)的一個或多個性質(zhì)：
[0097] 大于1.38IU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀察到的)；
[0098] 至少約1.5、至少約1.85或至少約2.46IU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀察到的)。
[0099] 約2.33±1.08mL/小時/kg或更小的所述患者群體中的平均清除率(CL)(活性)；
[0100] 約1.8-2.69mL/小時/kg的所述患者群體中的平均清除率(CL)(活性)；
[0101] 為包含不具有修飾的所述因子VIII的多肽的清除率的約65%的所述患者群體中的平均清除率(CL)(活性)；
[0102] 至少約26.3±8.33小時的所述患者中的平均停留時間(MRT)(活性)；
[0103] 約25.9-26.5小時的所述患者群體中的平均MRT(活性)；
[0104] 為包含不具有修飾的所述因子VIII的多肽的平均MRT的約1.5倍的所述患者群體中的平均MRT(活性)；
[0105] 約18.3±5.79小時的所述患者群體中的平均t1/2β(活性)；
[0106] 為約18-18.4小時的所述患者群體中的平均t1/2β(活性)；
[0107] 為包含不具有修飾的所述因子VIII的多肽的平均t1/2β的約1.5倍的所述患者群體中的平均t1/2β(活性)；
[0108] 約2.01±0.44IU/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
[0109] 約1.85-2.46IU/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
[0110] 為包含不具有修飾的所述因子VIII的多肽的平均增量恢復(fù)的約90%的所述患者群體中的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀察到的)；
[0111] 約55.1±12.3mL/kg的所述患者群體中的平均Vss(活性)；
[0112] 約45.3-56.1mL/kg的所述患者群體的平均Vss(活性)；
[0113] 約49.9±18.2IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均AUC/劑量(活性)；
[0114] 約44.8-57.6IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體中的平均AUC/劑量(活性)
[0115] 如本文中所用，“按需治療”意指有意在短時程內(nèi)發(fā)生和響應(yīng)現(xiàn)有病況例如出血事件的治療或感覺性需要(perceived need)例如計劃的手術(shù)(planned surgery)?？尚枰葱柚委煹牟r包括例如出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、出血、至肌肉內(nèi)的出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸道出血、顱內(nèi)出血、腹腔內(nèi)出血、,胸腔內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期處理(perioperative management)或手術(shù)治療。此類手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷性手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)。
[0116] 優(yōu)選地，按需治療以單次劑量解決超過80%(超過80%、超過81%、超過82%、超過83%、超過84%、超過85%、超過86%、超過87%、超過88%、超過89%、超過90%、超過91%、超過92%、超過93%、超過94%、超過95%、超過96%、超過97%、超過98%、超過99%或100%)或
80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血(例如，自發(fā)性出血)。優(yōu)選地，超過80%(超過81%、超過82%、超過83%、超過84%、超過85%、超過86%、超過87%、超過
88%、超過89%、超過90%、超過91%、超過92%、超過93%、超過94%、超過95%、超過96%、超過
97%、超過98%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血事
件在按需治療后被醫(yī)生評定為優(yōu)良或良好。優(yōu)選地，超過5%、(超過6%、超過7%、超過8%、超過9%、超過10%、超過11%、超過12%、超過13%、超過14%、超過15%、超過16%、超過17%、超過18%、超過19%、超過20%)或5-20%、5-15%、5-10%、10-20%或10-15%的出血事件在按需治療后被醫(yī)生評定為相當(dāng)好(fair)。
80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血(例如，自發(fā)性出血)。優(yōu)選地，超過80%(超過81%、超過82%、超過83%、超過84%、超過85%、超過86%、超過87%、超過
88%、超過89%、超過90%、超過91%、超過92%、超過93%、超過94%、超過95%、超過96%、超過
97%、超過98%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血事
件在按需治療后被醫(yī)生評定為優(yōu)良或良好。優(yōu)選地，超過5%、(超過6%、超過7%、超過8%、超過9%、超過10%、超過11%、超過12%、超過13%、超過14%、超過15%、超過16%、超過17%、超過18%、超過19%、超過20%)或5-20%、5-15%、5-10%、10-20%或10-15%的出血事件在按需治療后被醫(yī)生評定為相當(dāng)好(fair)。
[0117] “多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用并且是指由共價連接的氨基酸殘基組成的多聚化合物。
[0118] “多核苷酸”和“核酸”可互換使用且是指由共價連接的核苷酸殘基組成的多聚化合物。多核苷酸可以是DNA、cDNA、RNA(單鏈的或雙鏈的)、載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒。多核苷酸包括例如表1中的多核苷酸，其編碼表2的多肽(參見表1)。多核苷酸還包括例如表1的多核苷酸的片段，例如編碼表2的多肽的片段例如表2的多肽的因子VIII、Fc、信號
序列、6His和其它片段的那些多核苷酸。
序列、6His和其它片段的那些多核苷酸。
[0119] 如本文中所用，“預(yù)防性治療”意指在一段時間內(nèi)以多個劑量給受試者施用因子VIII多肽以升高受試者的血漿中的因子VIII的活性水平。優(yōu)選地，升高的水平足以降低自
發(fā)性出血的發(fā)病率或防止出血，例如在意外損傷的事件中。優(yōu)選地，在預(yù)防性治療過程中，受試者的血漿蛋白質(zhì)水平不低于受試者的基線水平，或不低于表征嚴(yán)重血友病的因子VIII
的水平(<1IU/dl[1%])。
發(fā)性出血的發(fā)病率或防止出血，例如在意外損傷的事件中。優(yōu)選地，在預(yù)防性治療過程中，受試者的血漿蛋白質(zhì)水平不低于受試者的基線水平，或不低于表征嚴(yán)重血友病的因子VIII
的水平(<1IU/dl[1%])。
[0120] 優(yōu)選地，給個體患者“定制”預(yù)防性方案，優(yōu)選通過測定每一個患者的PK數(shù)據(jù)和以維持1-3%FVIII活性的波谷水平的給藥間隔施用本發(fā)明的因子VIII來進(jìn)行。當(dāng)受試者經(jīng)歷不可接受的流血事件(定義為在滾動的2個月的時期內(nèi)≥2次自發(fā)性出血事件)時可進(jìn)
行調(diào)整。在該情況下，調(diào)整將靶向3-5%的低谷水平。優(yōu)選地，預(yù)防性治療導(dǎo)致出血的預(yù)防
和控制、出血的持久控制、持久的出血保護(hù)作用和/或持久的益處。預(yù)防，例如持久的保護(hù)作用可通過增加的至最終測量時間點的AUC(AUC-LAST)和減少的清除率(從而導(dǎo)致與短效
FVIII相比較增加的終t1/2)來證明。優(yōu)選地，預(yù)防通過更好的Cmax、更好的Tmax和/或
更大的平均停留時間對短效FVIII來證明。優(yōu)選地，預(yù)防導(dǎo)致在注射(例如，最后一次注
射)后約24、36、48、72或96小時(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、
89、90、91、92、93、94、95或96小時，優(yōu)選72小時內(nèi))內(nèi)無自發(fā)性出血事件。優(yōu)選，對于每周給藥一次(例如，以65IU/kg)，預(yù)防導(dǎo)致大于30%(例如，大于31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90%，優(yōu)選大于50%)的年出血事件的平均減少。
行調(diào)整。在該情況下，調(diào)整將靶向3-5%的低谷水平。優(yōu)選地，預(yù)防性治療導(dǎo)致出血的預(yù)防
和控制、出血的持久控制、持久的出血保護(hù)作用和/或持久的益處。預(yù)防，例如持久的保護(hù)作用可通過增加的至最終測量時間點的AUC(AUC-LAST)和減少的清除率(從而導(dǎo)致與短效
FVIII相比較增加的終t1/2)來證明。優(yōu)選地，預(yù)防通過更好的Cmax、更好的Tmax和/或
更大的平均停留時間對短效FVIII來證明。優(yōu)選地，預(yù)防導(dǎo)致在注射(例如，最后一次注
射)后約24、36、48、72或96小時(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、
89、90、91、92、93、94、95或96小時，優(yōu)選72小時內(nèi))內(nèi)無自發(fā)性出血事件。優(yōu)選，對于每周給藥一次(例如，以65IU/kg)，預(yù)防導(dǎo)致大于30%(例如，大于31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90%，優(yōu)選大于50%)的年出血事件的平均減少。
[0121] 如本文中所用，“受試者”意指人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括例如小鼠、狗、靈長類動物、猴、貓、馬、牛、豬和其它馴養(yǎng)動物和小動物。
[0122] 如本文中所用，“治療劑量”意指實現(xiàn)治療目的的劑量，如本文中所描述的。因子VIII的必需劑量的計算基于這樣的經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)：平均地，1IU因子VIII/kg體重升高血漿因子VIII活性約2IU/dL。使用下列公式測定必需劑量：
[0123] 必需單位=體重(kg)x期望的因子VIII升高(IU/dL或正常的%)x0.5(IU/kg/IU/dL)
[0124] 可用于本發(fā)明的方法的治療劑量為約10-100IU/kg，更具體地10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg，更具體地10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
[0125] 可用于本發(fā)明的方法的其它治療劑量為約10至約150IU/kg，更具體地，約100-110、110-120、120-130、130-140、140-150IU/kg，更具體地，約110、115、120、125、130、
135、140、145或150IU/kg。
135、140、145或150IU/kg。
[0126] 如本文中所用，“變體”是指與原始多核苷酸或多肽不同但保留其基本性質(zhì)例如因子VIII促凝活性或Fc(FcRn結(jié)合)活性的多核苷酸或多肽。通常，變體總體上十分相似，并且在許多區(qū)域與原始多核苷酸或多肽相同。變體包括例如原始多肽的多肽和多核苷酸片
段、缺失、插入和修飾形式。
段、缺失、插入和修飾形式。
[0127] 變體多核苷酸可包含與例如編碼這樣的核苷酸序列或替代地由所述核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的核苷酸編碼序列(因子VIII部分、Fc部分，單獨地或一起地)或與其互補的鏈、已知的突變和重組因子VIII或Fc(例
如本文中引用的出版物和專利中公開的那些突變和重組因子VIII或Fc)的核苷酸編碼序
列或與其互補的鏈、編碼SEQ IDNO:2、4、6、8、10或12的多肽(因子VIII部分、Fc部分，單獨地或一起地)的核苷酸序列和/或這類核酸分子的任一個的多核苷酸片段(例如，本文
中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。與這類核酸分子在嚴(yán)格雜交條件或更低嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸也包括為變體，對于由這類多核苷酸
編碼的多肽亦如此，只要它們具有功能。
如本文中引用的出版物和專利中公開的那些突變和重組因子VIII或Fc)的核苷酸編碼序
列或與其互補的鏈、編碼SEQ IDNO:2、4、6、8、10或12的多肽(因子VIII部分、Fc部分，單獨地或一起地)的核苷酸序列和/或這類核酸分子的任一個的多核苷酸片段(例如，本文
中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。與這類核酸分子在嚴(yán)格雜交條件或更低嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸也包括為變體，對于由這類多核苷酸
編碼的多肽亦如此，只要它們具有功能。
[0128] 變體多肽可包含與SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中顯示的多肽序列(因子VIII部分、Fc部分，單獨地或一起地)和/或這類多肽的任一個的多肽片段(例如，本文中描述
的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列或替代地由所述氨基酸序列組成。
的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列或替代地由所述氨基酸序列組成。
[0129] 對于具有與參照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的核酸，其意指除核苷酸序列可包含最多5個點突變每100個參照核苷酸序列的核苷酸外，所述核酸的核苷酸序列與參照序列具有同一性。換句話說，為了獲得具有與參照核苷酸序列具有
至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，參照序列中的最多5%核苷酸可缺失或用另一種核
苷酸進(jìn)行置換，或可將參照序列中的最多5%總核苷酸的許多核苷酸插入?yún)⒄招蛄?。查詢?br>列可以是例如SEQID NO:1或3中顯示的完整序列、ORF(開放閱讀框架)或本文中描述的
指定的任何片段。
至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，參照序列中的最多5%核苷酸可缺失或用另一種核
苷酸進(jìn)行置換，或可將參照序列中的最多5%總核苷酸的許多核苷酸插入?yún)⒄招蛄?。查詢?br>列可以是例如SEQID NO:1或3中顯示的完整序列、ORF(開放閱讀框架)或本文中描述的
指定的任何片段。
[0130] 作為一個實際問題，任何特定核酸分子或多肽是否與本發(fā)明的核苷酸序列或多肽具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性可使用已知的計算機(jī)程序來進(jìn)
行常規(guī)測定。用于測定查詢序列(參照序列或原始序列)與受試序列之間的最佳總體
匹配的優(yōu)選方法(也稱為全局序列比對)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.
(1990)6:237-245)(將其通過引用整體并入本文)的算法的FASTDB計算機(jī)程序來測定。
在序列比對中，查詢序列與受試序列都為DNA序列?？赏ㄟ^將U轉(zhuǎn)變換成T來比較RNA序
列。所述全局序列比對的結(jié)果以同一性%表示。用于DNA序列的FASTDB算法以計算同
一性%的優(yōu)選參數(shù)為：矩陣=Unitary，k-元組=4，錯配罰分(Mismatch Penalty)=1，連接
罰分(Joining Penalty)=30，隨機(jī)化組長度(Randomization Group Length)=0，截止評
分(Cutoff Score)=1，空位罰分=5，空位大小評分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小
(Window Size)=500或受試核苷酸序列的長度，擇其中較短的。
行常規(guī)測定。用于測定查詢序列(參照序列或原始序列)與受試序列之間的最佳總體
匹配的優(yōu)選方法(也稱為全局序列比對)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.
(1990)6:237-245)(將其通過引用整體并入本文)的算法的FASTDB計算機(jī)程序來測定。
在序列比對中，查詢序列與受試序列都為DNA序列?？赏ㄟ^將U轉(zhuǎn)變換成T來比較RNA序
列。所述全局序列比對的結(jié)果以同一性%表示。用于DNA序列的FASTDB算法以計算同
一性%的優(yōu)選參數(shù)為：矩陣=Unitary，k-元組=4，錯配罰分(Mismatch Penalty)=1，連接
罰分(Joining Penalty)=30，隨機(jī)化組長度(Randomization Group Length)=0，截止評
分(Cutoff Score)=1，空位罰分=5，空位大小評分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小
(Window Size)=500或受試核苷酸序列的長度，擇其中較短的。
[0131] 如果受試序列因5'或3'缺失而非因內(nèi)部缺失而比查詢序列短，則必須對結(jié)果進(jìn)行手工校正。這是因為當(dāng)計算同一性%時，F(xiàn)ASTDB程序不負(fù)責(zé)受試者的5'和3'截短。對
于在5'或3'末端截短的受試序列，相對于查詢序列，通過將作為受試序列的5'和3'但不
匹配/對齊的查詢序列的堿基的數(shù)目計算為查詢序列的總堿基的百分比來校正同一性%。
利用FASTDB序列比對的結(jié)果來確定核苷酸是否匹配/對齊。然后從使用指定的參數(shù)通過
上述FASTDB程序計算的同一性%減去該百分比，以獲得最終的同一性%評分。該校正的評
分就是用于本發(fā)明的目的評分。為了手工調(diào)整同一性%評分，僅計算受試序列的5'和3'
堿基外的堿基(如通過FASTDB比對顯示的)，所述堿基與查詢序列不匹配/對齊。
于在5'或3'末端截短的受試序列，相對于查詢序列，通過將作為受試序列的5'和3'但不
匹配/對齊的查詢序列的堿基的數(shù)目計算為查詢序列的總堿基的百分比來校正同一性%。
利用FASTDB序列比對的結(jié)果來確定核苷酸是否匹配/對齊。然后從使用指定的參數(shù)通過
上述FASTDB程序計算的同一性%減去該百分比，以獲得最終的同一性%評分。該校正的評
分就是用于本發(fā)明的目的評分。為了手工調(diào)整同一性%評分，僅計算受試序列的5'和3'
堿基外的堿基(如通過FASTDB比對顯示的)，所述堿基與查詢序列不匹配/對齊。
[0132] 例如，將90個堿基受試序列與100個堿基的查詢序列比對以測定同一性%。缺失在受試序列的5'末端上發(fā)生，從而FASTDB比對未顯示5'末端上前10個堿基的匹配/比
對。10個未配對的堿基代表10%的序列(5'和3'末端上未配對的堿基數(shù)/查詢序列中堿
基的總數(shù))，因此從利用FASTDB程序計算的同一性%評分減去10%。如果剩余90個堿基完
全匹配，則最終同一性%可為90%。在另一個實例中，將90個堿基的受試序列與100個堿基
的查詢序列相比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失，這樣在受試序列的5'或3'上不存在不與查詢
序列匹配/對齊的堿基。在該情況下，通過FASTDB計算的同一性%未進(jìn)行手工校正。再次
地，僅手工校正與查詢序列不匹配/對齊的受試序列的堿基5'和3'。無需為了本發(fā)明而進(jìn)
行其它手工校正。
對。10個未配對的堿基代表10%的序列(5'和3'末端上未配對的堿基數(shù)/查詢序列中堿
基的總數(shù))，因此從利用FASTDB程序計算的同一性%評分減去10%。如果剩余90個堿基完
全匹配，則最終同一性%可為90%。在另一個實例中，將90個堿基的受試序列與100個堿基
的查詢序列相比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失，這樣在受試序列的5'或3'上不存在不與查詢
序列匹配/對齊的堿基。在該情況下，通過FASTDB計算的同一性%未進(jìn)行手工校正。再次
地，僅手工校正與查詢序列不匹配/對齊的受試序列的堿基5'和3'。無需為了本發(fā)明而進(jìn)
行其它手工校正。
[0133] 對于具有與本發(fā)明的查詢氨基酸序列具有至少例如95%的“同一性”的氨基酸序列的多肽，其意指除受試多肽序列可包含最多5個點突變每100個查詢核苷酸序列的核苷
酸外，受試多肽的氨基酸序列與參照序列具有同一性。換句話說，為了獲得具有與查詢核苷酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽，或可將受試序列中的最多5%氨基酸可
用另一種氨基酸插入、缺失、(插入缺失(indel))或置換。參照序列的這些改變可在參照
氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或這些末端位置之間的任何位置上發(fā)生，單個地散布
在參照序列的殘基之間或以一個或多個連續(xù)組散布在參照序列內(nèi)。
酸外，受試多肽的氨基酸序列與參照序列具有同一性。換句話說，為了獲得具有與查詢核苷酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽，或可將受試序列中的最多5%氨基酸可
用另一種氨基酸插入、缺失、(插入缺失(indel))或置換。參照序列的這些改變可在參照
氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或這些末端位置之間的任何位置上發(fā)生，單個地散布
在參照序列的殘基之間或以一個或多個連續(xù)組散布在參照序列內(nèi)。
[0134] 作為一個實際問題，任何特定多肽是否與例如SEQ ID NO:2(因子VIII部分、Fc部分，單獨地或一起)或4的氨基酸序列或已知的因子VIII或Fc多肽序列具有至少85%、
90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，可常規(guī)地使用已知的計算機(jī)程序來確定。用于確定查詢序列(參照或原始序列)與受試序列之間的最佳總體匹配的優(yōu)選方法(也稱為全局序
列比對)可使用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)(通過引用整體并
入本文)的算法的FASTDB計算機(jī)程序來測定。在序列比對中，查詢序列與受試序列都為核
苷酸序列或都為氨基酸序列。所述全局序列比對的結(jié)果以同一性%表示。FASTDB氨基酸
比對中使用的優(yōu)選參數(shù)為：矩陣=PAM 0，k-元組=2，錯配罰分=1，連接罰分=20，隨機(jī)化組長度=0，截止評分=1，窗口大小=序列長度?？瘴涣P分=5，空位大小罰分=0.05，窗口大小
=500或受試氨基酸序列的長度，擇其中較短的。
90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，可常規(guī)地使用已知的計算機(jī)程序來確定。用于確定查詢序列(參照或原始序列)與受試序列之間的最佳總體匹配的優(yōu)選方法(也稱為全局序
列比對)可使用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)(通過引用整體并
入本文)的算法的FASTDB計算機(jī)程序來測定。在序列比對中，查詢序列與受試序列都為核
苷酸序列或都為氨基酸序列。所述全局序列比對的結(jié)果以同一性%表示。FASTDB氨基酸
比對中使用的優(yōu)選參數(shù)為：矩陣=PAM 0，k-元組=2，錯配罰分=1，連接罰分=20，隨機(jī)化組長度=0，截止評分=1，窗口大小=序列長度?？瘴涣P分=5，空位大小罰分=0.05，窗口大小
=500或受試氨基酸序列的長度，擇其中較短的。
[0135] 如果受試序列因N-或C-末端缺失而非因為內(nèi)部缺失而比查詢序列短，則必須對結(jié)果進(jìn)行手工校正。這是因為當(dāng)計算全局同一性%時FASTDB程序不負(fù)責(zé)受試序列的N-和
C-末端截短。對于在N-和C-末端上截短的受試序列，相對于查詢序列，通過將作為受試序
列的N-和C-末端的查詢序列的殘基的數(shù)目(所述殘基與相應(yīng)的受試殘基不配對/對齊)
計算為查詢序列的總堿基的百分比來校正同一性%。利用FASTDB序列比對的結(jié)果來確定殘
基是否錯配/對齊。隨后從使用指定的參數(shù)通過上述FASTDB程序計算的同一性%減去該
百分比，以獲得最終的同一性%評分。該最終的同一性%評分就是用于本發(fā)明的目的的評
分。為了手工調(diào)整同一性%評分僅考慮將至受試序列的N-和C-末端的殘基(所述殘基與
查詢序列不匹配/對齊)。即，僅受試序列的最遠(yuǎn)N-和C-末端殘基外的查詢殘基位置。
C-末端截短。對于在N-和C-末端上截短的受試序列，相對于查詢序列，通過將作為受試序
列的N-和C-末端的查詢序列的殘基的數(shù)目(所述殘基與相應(yīng)的受試殘基不配對/對齊)
計算為查詢序列的總堿基的百分比來校正同一性%。利用FASTDB序列比對的結(jié)果來確定殘
基是否錯配/對齊。隨后從使用指定的參數(shù)通過上述FASTDB程序計算的同一性%減去該
百分比，以獲得最終的同一性%評分。該最終的同一性%評分就是用于本發(fā)明的目的的評
分。為了手工調(diào)整同一性%評分僅考慮將至受試序列的N-和C-末端的殘基(所述殘基與
查詢序列不匹配/對齊)。即，僅受試序列的最遠(yuǎn)N-和C-末端殘基外的查詢殘基位置。
[0136] 例如，將90個氨基酸殘基的受試序列與100個殘基的查詢序列比對以測定同一性%。缺失在受試者序列的N-末端上發(fā)生，從而FASTDB比對未顯示N-末端上的前10個
殘基的匹配/比對。10個未配對的殘基代表10%的序列(N-和C-末端上不匹配的殘基的
數(shù)目/查詢序列中的殘基的總數(shù))，因此從利用FASTDB程序計算的同一性%評分減去10%。
如果剩余的90個殘基完全匹配，則最終同一性%為90%。在另一個實例中，將90個殘基的
受試序列與100個殘基的查詢序列相比較。這次缺失是內(nèi)部缺失，這樣在受試序列的N-或
C-端上不存在不與所述查詢序列匹配/對齊的殘基。在該情況下，未對利用FASTDB計算的
同一性%進(jìn)行手工校正。再次地，僅手工校正受試序列的N-和C-末端外的殘基位點(如
FASTDB比對中顯示的)，所述殘基位點不與查詢序列匹配/對齊。無需為本發(fā)明進(jìn)行其它
手工校正。
殘基的匹配/比對。10個未配對的殘基代表10%的序列(N-和C-末端上不匹配的殘基的
數(shù)目/查詢序列中的殘基的總數(shù))，因此從利用FASTDB程序計算的同一性%評分減去10%。
如果剩余的90個殘基完全匹配，則最終同一性%為90%。在另一個實例中，將90個殘基的
受試序列與100個殘基的查詢序列相比較。這次缺失是內(nèi)部缺失，這樣在受試序列的N-或
C-端上不存在不與所述查詢序列匹配/對齊的殘基。在該情況下，未對利用FASTDB計算的
同一性%進(jìn)行手工校正。再次地，僅手工校正受試序列的N-和C-末端外的殘基位點(如
FASTDB比對中顯示的)，所述殘基位點不與查詢序列匹配/對齊。無需為本發(fā)明進(jìn)行其它
手工校正。
[0137] 多核苷酸變體可包含編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者中的改變。特別優(yōu)選的是包含產(chǎn)生沉默置換、添加或缺失但不改變編碼的多肽的性質(zhì)或活性的改變的多核苷酸變體。通過沉
默置換(歸因于遺傳密碼子的簡并性)產(chǎn)生的核苷酸變體是優(yōu)選的。此外，其中以任何組
合置換、缺失或添加5-10、1-5或1-2個氨基酸的變體也是優(yōu)選的?？梢驗樵S多原因例如
最優(yōu)化用于特定宿主的密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變成細(xì)菌宿主例如大腸桿菌
(E.coli)偏愛的密碼子)來產(chǎn)生多核苷酸變體。
默置換(歸因于遺傳密碼子的簡并性)產(chǎn)生的核苷酸變體是優(yōu)選的。此外，其中以任何組
合置換、缺失或添加5-10、1-5或1-2個氨基酸的變體也是優(yōu)選的?？梢驗樵S多原因例如
最優(yōu)化用于特定宿主的密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變成細(xì)菌宿主例如大腸桿菌
(E.coli)偏愛的密碼子)來產(chǎn)生多核苷酸變體。
[0138] 天然存在的變體稱為“等位基因變體”，是指占據(jù)生物體的染色體上給定的基因座的基因的幾個備選形式之一(Genes II，Lewin，B.編，John Wiley&Sons，New York(1985))。這些等位基因變體可在多核苷酸和/或多肽水平上變化并且包括在本發(fā)明中?；蛘?，非天
然存在的變體可通過誘變技術(shù)或通過直接合成來產(chǎn)生。
然存在的變體可通過誘變技術(shù)或通過直接合成來產(chǎn)生。
[0139] 通過使用蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的已知方法，可產(chǎn)生變體來改進(jìn)或改變多肽的特征。例如，可從分泌型蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失一個或多個氨基酸而基本上不
丟失生物功能。Ron等人.J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通過引用整體并入本文)
的作者報導(dǎo)了即使在缺失3、8或27個氨基末端氨基酸殘基后仍具有肝素結(jié)合活性的變異
KGF蛋白。類似地，干擾素γ在從該蛋白質(zhì)的羧基末端缺失8-10個氨基酸殘基后展示高
達(dá)10倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，通過引用整體并入本
文)。
丟失生物功能。Ron等人.J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通過引用整體并入本文)
的作者報導(dǎo)了即使在缺失3、8或27個氨基末端氨基酸殘基后仍具有肝素結(jié)合活性的變異
KGF蛋白。類似地，干擾素γ在從該蛋白質(zhì)的羧基末端缺失8-10個氨基酸殘基后展示高
達(dá)10倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，通過引用整體并入本
文)。
[0140] 此外，充足的證據(jù)表明變體通常保留與天然存在的蛋白質(zhì)的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通過引用整體并入本
文)進(jìn)行人細(xì)胞因子IL-1a的廣泛的突變分析。它們使用隨機(jī)誘變來產(chǎn)生3,500個以上單
獨的IL-1a突變體，在分子的整個長度上每變體平均具有2.5個氨基酸改變。在第一個可
能的氨基酸位置上檢查多個突變。研究者發(fā)現(xiàn)“大多數(shù)分子可被改變而對[結(jié)合或生物活
性]幾乎無影響”。(參見Abstract)。事實上，在檢查的3,500多個核苷酸序列中，只有23
個獨特的氨基酸序列產(chǎn)生在活性上與野生型顯著不同的蛋白質(zhì)。
文)進(jìn)行人細(xì)胞因子IL-1a的廣泛的突變分析。它們使用隨機(jī)誘變來產(chǎn)生3,500個以上單
獨的IL-1a突變體，在分子的整個長度上每變體平均具有2.5個氨基酸改變。在第一個可
能的氨基酸位置上檢查多個突變。研究者發(fā)現(xiàn)“大多數(shù)分子可被改變而對[結(jié)合或生物活
性]幾乎無影響”。(參見Abstract)。事實上，在檢查的3,500多個核苷酸序列中，只有23
個獨特的氨基酸序列產(chǎn)生在活性上與野生型顯著不同的蛋白質(zhì)。
[0141] 如上文中提及的，多肽變體包括例如修飾多肽。修飾包括例如乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生
物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、PEG化(Mei等人Blood
116:270-79(2010)，將其通過引用整體并入本文)、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運-RNA介導(dǎo)的氨基酸至蛋白質(zhì)的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些實施方案中，在任何方便的位置修飾例如PEG化因子VIII。在一些實施方案中，在因子VIII的表面暴露氨基酸優(yōu)選表面暴露半胱氨酸上PEG化因子VIII，所
述半胱氨酸可以是工程化半胱氨酸。Mei等人(2010)。在一些實施方案中，修飾因子VIII
例如PEG化的因子VIII是長效因子VIII。
物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、PEG化(Mei等人Blood
116:270-79(2010)，將其通過引用整體并入本文)、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運-RNA介導(dǎo)的氨基酸至蛋白質(zhì)的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些實施方案中，在任何方便的位置修飾例如PEG化因子VIII。在一些實施方案中，在因子VIII的表面暴露氨基酸優(yōu)選表面暴露半胱氨酸上PEG化因子VIII，所
述半胱氨酸可以是工程化半胱氨酸。Mei等人(2010)。在一些實施方案中，修飾因子VIII
例如PEG化的因子VIII是長效因子VIII。
[0142] 如本文中所用，“穩(wěn)態(tài)分布容積(Vss)”具有與藥理學(xué)中使用的術(shù)語相同的含義，其為藥物分布在其中的表觀空間(apparent space)(容積)。Vss=身體中藥物的量除以穩(wěn)態(tài)血漿濃度(plasma concentration at steady state)。
[0143] 如本文中關(guān)于范圍所用的“約”修飾范圍的兩端。因此，“約10-20”意指“約10至約20”。
[0144] 在現(xiàn)已詳細(xì)地描述了本發(fā)明后，通過參考下列實施例可更清楚地理解本發(fā)明，隨同包括的所述實施例僅為了舉例說明而無意限定本發(fā)明。本文中提及的全部專利和申請明
確地通過引用并入本文。
確地通過引用并入本文。
[0145] 實施例1
[0147] 產(chǎn)生重組B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白以延長FVIII的半衰期。在嚴(yán)重血友病A的小鼠和狗模型中研究FVIIIFc，將其與 相比較。與
相比較，對于rFVIIIFc，血友病A小鼠的全血凝固時間(WBCT)被校正約2至3倍
并且血漿的消除半衰期幾乎為2倍。在血友病A狗中，rFVIIIFc(125IU/kg)的靜脈內(nèi)劑量將
WBCT校正至正常。WBCT保持少于20分鐘，與FVIII:C>1%一致的時間，與利用 處
理的狗的48小時相比較，持續(xù)約96小時。當(dāng)使用ELISA或生色活性測定測量時，rFVIIIFc
在狗血漿中的消除半衰期分別為15.7±1.7小時和15.4±0.3小時。 校正的WBCT
約為rFVIIIFc的一半長，并且血漿半衰期為7.0小時。因此，F(xiàn)VIII至Fc的融合產(chǎn)生了具
有增加的血漿半衰期和提供延長的出血保護(hù)作用的能力的分子。
相比較，對于rFVIIIFc，血友病A小鼠的全血凝固時間(WBCT)被校正約2至3倍
并且血漿的消除半衰期幾乎為2倍。在血友病A狗中，rFVIIIFc(125IU/kg)的靜脈內(nèi)劑量將
WBCT校正至正常。WBCT保持少于20分鐘，與FVIII:C>1%一致的時間，與利用 處
理的狗的48小時相比較，持續(xù)約96小時。當(dāng)使用ELISA或生色活性測定測量時，rFVIIIFc
在狗血漿中的消除半衰期分別為15.7±1.7小時和15.4±0.3小時。 校正的WBCT
約為rFVIIIFc的一半長，并且血漿半衰期為7.0小時。因此，F(xiàn)VIII至Fc的融合產(chǎn)生了具
有增加的血漿半衰期和提供延長的出血保護(hù)作用的能力的分子。
[0148] 引言
[0149] 由于血漿衍生以及重組FVIII的開發(fā)，死亡率的降低、關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防以及生活質(zhì)量的改善已取得重要成就。延長的出血保護(hù)作用代表血友病A患者的治療中的另一個至
關(guān)重要的成就。本發(fā)明人已產(chǎn)生重組因子VIII-Fc(rFVIIIFc)嵌合蛋白和雜交體作為延長
FVIII的半衰期的方法。
關(guān)重要的成就。本發(fā)明人已產(chǎn)生重組因子VIII-Fc(rFVIIIFc)嵌合蛋白和雜交體作為延長
FVIII的半衰期的方法。
[0150] rFVIIIFc為異二聚體雜交蛋白質(zhì)，其由重組地融合至人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc結(jié)構(gòu)域的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII組成(圖1，SEQ ID NO:2；表2A)(該蛋白在本文中也
稱為FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIIFc雜交體和FVIIIFc單
體-二聚體)。Fc使得能夠結(jié)合新生兒Fc受體(FcRn)，其負(fù)責(zé)保護(hù)IgG免受降解并且賦
予IgG 3周的半衰期(在人中觀察到的)(Ghetie V和Ward ES.，Annu.Rev.Immunol.2000；
18:739-766；Roopenian DC.和Akilesh S.，Nature Rev.Immunol.2007；7:715-725，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
稱為FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIIFc雜交體和FVIIIFc單
體-二聚體)。Fc使得能夠結(jié)合新生兒Fc受體(FcRn)，其負(fù)責(zé)保護(hù)IgG免受降解并且賦
予IgG 3周的半衰期(在人中觀察到的)(Ghetie V和Ward ES.，Annu.Rev.Immunol.2000；
18:739-766；Roopenian DC.和Akilesh S.，Nature Rev.Immunol.2007；7:715-725，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
[0151] 已將IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域整合至生長因子、細(xì)胞因子、酶和受體的配體結(jié)合區(qū)(Ashkanazi A等人，Int.Rev.Immunol.1993:10:219-27；Chamow SM和Ashkanazi A，Trends Biotechnol.1996:14:52-60；Fisher等人，N.Engl.J.Med.1996:334(26):1697-702，將所
述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。這類分子中的幾種分子已成為重要的治療性分
子(例如，依那西普、阿來法塞、阿巴他塞)。在這類融合蛋白中，可將兩個效應(yīng)分子與兩
個Fc分子連接。在該實施例中，rFVIII Fc已被構(gòu)建為單體Fc融合蛋白(一個拷貝的由
表2A(i)(SEQ ID NO:2)的具有或不具有信號序列的序列組成的多肽和一個拷貝的由表
2A(ii)(SEQ ID NO:4)的具有或不具有信號序列的序列組成的多肽)，即，僅具有一個拷貝
的效應(yīng)分子(參見圖1)，并且本文中所示的研究在血友病A的小鼠和狗模型中比較該新
型蛋白與rFVIII的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)。信號序列在分泌過程中被切割。該蛋白質(zhì)構(gòu)建
體在本文中稱為FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIFc雜交體和
FVIIIFc單體-二聚體。關(guān)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生，參見實施例1、圖1、表2A；和美國專
利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。這類分子中的幾種分子已成為重要的治療性分
子(例如，依那西普、阿來法塞、阿巴他塞)。在這類融合蛋白中，可將兩個效應(yīng)分子與兩
個Fc分子連接。在該實施例中，rFVIII Fc已被構(gòu)建為單體Fc融合蛋白(一個拷貝的由
表2A(i)(SEQ ID NO:2)的具有或不具有信號序列的序列組成的多肽和一個拷貝的由表
2A(ii)(SEQ ID NO:4)的具有或不具有信號序列的序列組成的多肽)，即，僅具有一個拷貝
的效應(yīng)分子(參見圖1)，并且本文中所示的研究在血友病A的小鼠和狗模型中比較該新
型蛋白與rFVIII的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)。信號序列在分泌過程中被切割。該蛋白質(zhì)構(gòu)建
體在本文中稱為FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交體、單體FVIIIFc雜交體和
FVIIIFc單體-二聚體。關(guān)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生，參見實施例1、圖1、表2A；和美國專
利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
[0152] 方法和材料
[0153] FVIII制劑
[0154] 重組FVIIIFc
[0155] 使用FVIII特異性引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從人肝polyARNA(Clontech)獲得人重組B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII的編碼序列。所述FVIII序列包括FVIII
的天然信號序列。B結(jié)構(gòu)域缺失為從絲氨酸743(S743；2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；
4969bp)，總共2682bp的缺失。關(guān)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生，參見實施例1、圖1、表2A；和美國專利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
的天然信號序列。B結(jié)構(gòu)域缺失為從絲氨酸743(S743；2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；
4969bp)，總共2682bp的缺失。關(guān)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生，參見實施例1、圖1、表2A；和美國專利No.7,404,956和7,348,004，將所述每一個專利通過引用整體并入本文。
[0156] 使用Fc特異性引物通過RT-PCR從人白細(xì)胞cDNA文庫(Clontech)獲得人重組Fc的編碼序列。設(shè)計使B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列直接融合至Fc序列的N-末端而不用間插
接頭的引物。將FVIIIFc DNA序列在CMV啟動子的控制之下克隆入哺乳動物雙表達(dá)載體
pBUDCE4.1(Invitrogen)。通過T-PCR獲得包含小鼠Igk信號序列的第二相同的Fc序列，
然后將其克隆在所述表達(dá)載體pBUDCE4.1的第二啟動子EF1α的下游。
接頭的引物。將FVIIIFc DNA序列在CMV啟動子的控制之下克隆入哺乳動物雙表達(dá)載體
pBUDCE4.1(Invitrogen)。通過T-PCR獲得包含小鼠Igk信號序列的第二相同的Fc序列，
然后將其克隆在所述表達(dá)載體pBUDCE4.1的第二啟動子EF1α的下游。
[0157] 使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑(Invitrogen)將rFVIII Fc表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人胚胎腎293細(xì)胞(HEK293H；Invitrogen)。通過利用Zeocin(Invitrogen)選擇產(chǎn)生穩(wěn)定
的克隆細(xì)胞系。將一個克隆細(xì)胞系3C4-22用于產(chǎn)生FVIIIFc以進(jìn)行體內(nèi)表征。在Biogen
Idec(Cambridge，MA)產(chǎn)生和純化重組FVIIIFc(McCueJT等人，J.Chromatogr.A 2009；
7824-7830，通過引用整體并入本文)。預(yù)期上述轉(zhuǎn)錄策略產(chǎn)生3種產(chǎn)物，即單體rFVIIIFc雜交體、二聚rFVIIIFc雜交體和二聚Fc。然而，在來自這類細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中基本上不
存在可檢測的二聚rFVIIIFc。相反，條件化培養(yǎng)基包含F(xiàn)c和單體rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc
的尺寸可能太大以至于被阻止從細(xì)胞高效分泌。該結(jié)果是有益的，因為其使得單體的純化
比在所有3種蛋白質(zhì)都存在的情況下簡單。這類研究中使用的材料具有約9000IU/mg的比
活性。此外，這類人細(xì)胞產(chǎn)生比在本實驗中嘗試的其它細(xì)胞更高的蛋白質(zhì)水平。
的克隆細(xì)胞系。將一個克隆細(xì)胞系3C4-22用于產(chǎn)生FVIIIFc以進(jìn)行體內(nèi)表征。在Biogen
Idec(Cambridge，MA)產(chǎn)生和純化重組FVIIIFc(McCueJT等人，J.Chromatogr.A 2009；
7824-7830，通過引用整體并入本文)。預(yù)期上述轉(zhuǎn)錄策略產(chǎn)生3種產(chǎn)物，即單體rFVIIIFc雜交體、二聚rFVIIIFc雜交體和二聚Fc。然而，在來自這類細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中基本上不
存在可檢測的二聚rFVIIIFc。相反，條件化培養(yǎng)基包含F(xiàn)c和單體rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc
的尺寸可能太大以至于被阻止從細(xì)胞高效分泌。該結(jié)果是有益的，因為其使得單體的純化
比在所有3種蛋白質(zhì)都存在的情況下簡單。這類研究中使用的材料具有約9000IU/mg的比
活性。此外，這類人細(xì)胞產(chǎn)生比在本實驗中嘗試的其它細(xì)胞更高的蛋白質(zhì)水平。
[0158] 重組FVIII
[0159] 重組B結(jié)構(gòu)域缺失的 購自Novis Pharmaceuticals并且按照制造商的說明書進(jìn)行制備。 (重組B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII)具有與SEQ ID NO:2的
氨基酸1-1438相同的氨基酸序列。
氨基酸1-1438相同的氨基酸序列。
[0160] 血友病A動物
[0161] 血友病A小鼠為129xB6背景上的FVIII外顯子16敲除，所述129xB6背景獲 自 University of Pennsylvania 的 Dr.Kazazian(Bi L 等 人，Nat.Genet.1995；
10(1):119-121，通過引用整體并入本文)并且飼養(yǎng)于Syntonix。這些小鼠展示延長的全血
凝固時間(>60分鐘)，從而是嚴(yán)重血友病A的良好模型。
10(1):119-121，通過引用整體并入本文)并且飼養(yǎng)于Syntonix。這些小鼠展示延長的全血
凝固時間(>60分鐘)，從而是嚴(yán)重血友病A的良好模型。
[0162] 血友病A狗來自在University of North Carolina，Chapel Hill的弗蘭西斯歐文血液研究實驗室(Francis Owen Blood Research Laboratory)維持的近交群(Graham，JB
等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111，通過引用整體并入本文)。這些狗具有可與人疾病的嚴(yán)重形式相比較的嚴(yán)重血友病表型(Graham，JB等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111；Lozier，JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2002；99:12991-12996，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111，通過引用整體并入本文)。這些狗具有可與人疾病的嚴(yán)重形式相比較的嚴(yán)重血友病表型(Graham，JB等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111；Lozier，JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2002；99:12991-12996，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
[0163] 研究設(shè)計
[0164] 血友病A小鼠的研究
[0165] 在FVIII缺陷小鼠中研究rFVIIIFc和 對全血凝固時間(WBCT)的影響。以50IU/kg靜脈內(nèi)施用每一種蛋白質(zhì)，在給藥前和給藥后不同的時間點上從每一只小鼠的
尾靜脈收集血。將血液樣品在37℃下于微量管中進(jìn)行溫育，每分鐘目測檢查凝固的存在一
次。記錄凝固形成的時間。如果到了60分鐘無凝固形成，則將凝固時間記錄為>60分鐘。
在WBCT測定中正常小鼠的血液在約4分鐘(范圍2-7分鐘，n=10只小鼠)內(nèi)凝固。
尾靜脈收集血。將血液樣品在37℃下于微量管中進(jìn)行溫育，每分鐘目測檢查凝固的存在一
次。記錄凝固形成的時間。如果到了60分鐘無凝固形成，則將凝固時間記錄為>60分鐘。
在WBCT測定中正常小鼠的血液在約4分鐘(范圍2-7分鐘，n=10只小鼠)內(nèi)凝固。
[0166] 在第二組研究中，給血友病A小鼠靜脈內(nèi)施用單劑50IU/kg rFVIIIFc、或 (4只小鼠/時間點)。在給藥后0.25、8、24，48和72小時通過心臟穿刺激將
血液收集在1/10體積的3.2%檸檬酸鈉中。制備血漿，將其于-80℃下貯存直至使用FVIII
特異性生色活性測定法對FVIII活性進(jìn)行分析。
血液收集在1/10體積的3.2%檸檬酸鈉中。制備血漿，將其于-80℃下貯存直至使用FVIII
特異性生色活性測定法對FVIII活性進(jìn)行分析。
[0167] 血友病A狗的研究
[0168] 在rFVIIIFc的單劑量PK/PD研究中，給來自Chapel Hill繁殖群的兩條血友病A狗靜脈內(nèi)施用單劑125IU/kg，在給藥前和給藥后指定的時間點上收集血液樣品以用于
WBCT、激活部分促凝血酶原激酶時間(activated partial thromboplastin time)(aPTT)、FVIIIFc血漿濃度、血液學(xué)和血清化學(xué)。用于WBCT的時間點包括給藥前、給藥后5和30分
鐘以及1、2、4、8、24、32、48、72、96、144和168小時。用于凝固活性(aPTT)和FVIIIFc血漿濃度的血液收集包括上文對于WBCT所列的時間點以及給藥后15分鐘和3、6、12小時。
WBCT、激活部分促凝血酶原激酶時間(activated partial thromboplastin time)(aPTT)、FVIIIFc血漿濃度、血液學(xué)和血清化學(xué)。用于WBCT的時間點包括給藥前、給藥后5和30分
鐘以及1、2、4、8、24、32、48、72、96、144和168小時。用于凝固活性(aPTT)和FVIIIFc血漿濃度的血液收集包括上文對于WBCT所列的時間點以及給藥后15分鐘和3、6、12小時。
[0169] 進(jìn)行第二研究，其中靜脈內(nèi)施用 (114IU/g(針對狗M12)和120IU/kg(針對狗M38))。測量WBCT直至凝固時間超過20分鐘(與FVIII:C>1%一致)，隨后將125IU/
kg rFVIIIFc靜脈內(nèi)施用至相同的狗，收集血液樣品以進(jìn)行WBCT、aPTT、FVIIIFc血漿濃度、血液學(xué)和血清化學(xué)。用于WBCT的時間點包括給藥前、給藥后5和30分鐘以及1、2、4、8、24、
32、48、72小時。還在利用FVIIIFc給藥后96、120、144和168小時收集血液。用于凝固活
性和FVIIIFc血漿濃度的血液收集包括上文所列用于WBCT的時間點以及給藥后15分鐘和
3、6、12小時。
kg rFVIIIFc靜脈內(nèi)施用至相同的狗，收集血液樣品以進(jìn)行WBCT、aPTT、FVIIIFc血漿濃度、血液學(xué)和血清化學(xué)。用于WBCT的時間點包括給藥前、給藥后5和30分鐘以及1、2、4、8、24、
32、48、72小時。還在利用FVIIIFc給藥后96、120、144和168小時收集血液。用于凝固活
性和FVIIIFc血漿濃度的血液收集包括上文所列用于WBCT的時間點以及給藥后15分鐘和
3、6、12小時。
[0170] 血友病A狗的WBCT過程與血友病A小鼠中的略微不同。在用rFVIIIFc或給藥后，在不同的時間點收集1mL的血液，將0.5mL稀釋入兩個硅化玻璃管中，隨
后將所述玻璃管置于28℃水浴中。始于第1分鐘，將一個管每30秒傾斜一次，第二個管保
持不動。當(dāng)凝塊在傾斜的管中形成時，隨后使第二個管每30秒傾斜一次直至凝塊形成。將
第二個管中完全膠化凝塊形成所需的時間記錄為WBCT。
后將所述玻璃管置于28℃水浴中。始于第1分鐘，將一個管每30秒傾斜一次，第二個管保
持不動。當(dāng)凝塊在傾斜的管中形成時，隨后使第二個管每30秒傾斜一次直至凝塊形成。將
第二個管中完全膠化凝塊形成所需的時間記錄為WBCT。
[0171] 血漿中的FVIII活性
[0172] 利用FVIII特異性生色測定法測量血漿中的FVIII活性
[0173] 使用Sysmex CA1500儀通過自動生色法測試血漿樣品的FVIII活性，試劑來自Siemans Healthcare Diagnostics(Dallas，TX，試劑盒#B4238-40)。使用利用濃度范圍為
1.5-0.016IU/mL的摻入人FVIII-耗盡的血漿(Stago USA)的第7國際標(biāo)準(zhǔn)因子FVIII濃
縮物(NIBSC代碼99/678)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定rFVIIIFc的活性。
1.5-0.016IU/mL的摻入人FVIII-耗盡的血漿(Stago USA)的第7國際標(biāo)準(zhǔn)因子FVIII濃
縮物(NIBSC代碼99/678)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定rFVIIIFc的活性。
[0174] 利用ELISA測量rFVIIIFc或FVIII
[0175] 利用ELISA測量狗血漿中的FVIIIFc
[0176] 將特異于A1結(jié)構(gòu)域的FVIII抗體(Green Mountain Antibodies:GMA-8002)涂覆在96孔板上并且在37℃下溫育1小時。在室溫下用含有Tween 20、CaCl2和牛血清白蛋白
的Tris-緩沖鹽溶液封閉涂覆的板1小時，隨后將標(biāo)準(zhǔn)、對照和在正常狗血漿中制備的樣品
以1:10稀釋，然后添加至板中并且在37℃下溫育1小時。洗滌板，隨后添加驢(F(ab)'2)
抗-人Fc-HRP(Jackson:709-036-098)，將其在37℃下溫育1小時。洗滌后，將TMB(BioFx
超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中，用酸淬滅底物反應(yīng)，在Spectra Max Plus板讀數(shù)器
(MolecularDevices)上于450nm處測量吸光度。
的Tris-緩沖鹽溶液封閉涂覆的板1小時，隨后將標(biāo)準(zhǔn)、對照和在正常狗血漿中制備的樣品
以1:10稀釋，然后添加至板中并且在37℃下溫育1小時。洗滌板，隨后添加驢(F(ab)'2)
抗-人Fc-HRP(Jackson:709-036-098)，將其在37℃下溫育1小時。洗滌后，將TMB(BioFx
超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中，用酸淬滅底物反應(yīng)，在Spectra Max Plus板讀數(shù)器
(MolecularDevices)上于450nm處測量吸光度。
[0177] 利用ELISA測量狗血漿中的
[0178] 將 特 異 于 重 鏈 上 的 A1 結(jié) 構(gòu) 域 的 FVIII 抗 體 (Green MountainAntibodies:GMA-8002)涂覆在96孔板上并且在室溫下溫育2小時。在37℃下封閉涂覆的
板1小時，洗滌后，將1:10稀釋的標(biāo)準(zhǔn)、對照和在正常狗水漿中制備的樣品添加至板中并且在室溫下溫育2小時。洗滌板，隨后用檢測抗體預(yù)稀釋的抗-FVIII辣根過氧化物酶綴合物
(Affinity Biologicals:F8C-EIA-D)處理板，在室溫下溫育1小時。洗滌后，將TMB(BioFx
超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中進(jìn)行10分鐘。用酸淬滅底物反應(yīng)，在Spectra Max
Plus板讀數(shù)器(MolecularDevices)上于450nm的波長處測量信號。
板1小時，洗滌后，將1:10稀釋的標(biāo)準(zhǔn)、對照和在正常狗水漿中制備的樣品添加至板中并且在室溫下溫育2小時。洗滌板，隨后用檢測抗體預(yù)稀釋的抗-FVIII辣根過氧化物酶綴合物
(Affinity Biologicals:F8C-EIA-D)處理板，在室溫下溫育1小時。洗滌后，將TMB(BioFx
超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中進(jìn)行10分鐘。用酸淬滅底物反應(yīng)，在Spectra Max
Plus板讀數(shù)器(MolecularDevices)上于450nm的波長處測量信號。
[0179] 血纖蛋白原的測量
[0180] 按 照 制 造 商 的 說 明 書，使 用 包 括HemoslLTM PT-Fibrinogen-HS試 劑(Instrumentation Laboratory，Lexington，MA，Catalog#0008468210) 和 ACL
7000Coagulation分析儀(Beckman Coulter)的試劑盒在Esoterix(Research Triangle
Park，NC)上測量血漿中血纖蛋白原的濃度。
7000Coagulation分析儀(Beckman Coulter)的試劑盒在Esoterix(Research Triangle
Park，NC)上測量血漿中血纖蛋白原的濃度。
[0181] 血小板的測量
[0182] 使用利用物種特異性智能卡編程的Vet-ABC-Diff Hematology分析儀(SCILAnimal Care Co.，Gurnee，IL)通過自動化方法在EDTA抗凝全血中對血小板進(jìn)行計數(shù)。
[0183] 藥代動力學(xué)分析
[0184] 使用來自Pharsight的WinNonlin軟件5.2版(Mountain View，Ca)通過非房室模型分析(Noncompartmental Analysis)計算藥代動力學(xué)參數(shù)。PK參數(shù)包括最大血漿濃
度(Cmax)、血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)、消除半衰期(t1/2)、分布容積(volume of
distribution)(Vss)和清除率(Cl)。
度(Cmax)、血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)、消除半衰期(t1/2)、分布容積(volume of
distribution)(Vss)和清除率(Cl)。
[0185] 結(jié)果
[0186] 重組FVIII-Fc
[0187] rFVIIIFc為人B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII與來自人IgG1的Fc的具有無間插接頭序列的重組融合物(rFVIIIFc；圖1)。
[0188] 純化的rFVIIIFc具有約9000IU/mg的比活性，如使用生色活性測定法測定的。重組B結(jié)構(gòu)域缺失的 具有報導(dǎo)的9110-13700IU/mg的比活性?？紤]
了FVIIIFc與 (分別地216kDa和170kDa)之間的大小差異的比活性至IU/
nmol的轉(zhuǎn)化表明兩種蛋白質(zhì)具有幾乎相等的比活性(1970IU/nmol(針對rFVIIIFc)和
1521-2287IU/nmol(針對 ))。因此，rFVIIIFc的FVIII活性不受人FVIII的C
末端至人Fc的N末端的融合影響。
了FVIIIFc與 (分別地216kDa和170kDa)之間的大小差異的比活性至IU/
nmol的轉(zhuǎn)化表明兩種蛋白質(zhì)具有幾乎相等的比活性(1970IU/nmol(針對rFVIIIFc)和
1521-2287IU/nmol(針對 ))。因此，rFVIIIFc的FVIII活性不受人FVIII的C
末端至人Fc的N末端的融合影響。
[0189] 至血友病A小鼠的施用
[0190] 將單次50IU/kg劑量的rFVIIIFc或 靜脈內(nèi)施用給FVIII缺陷小鼠(n=6/組)。給藥前和在給藥后120小時的過程中收集血液樣品，如材料和方法中所述測定
WBCT?；€WBCT大于60分鐘。來自代表性實驗的數(shù)據(jù)示于圖2和表3中。WBCT在利用
rFVIIIFc或 給藥后即刻被校正至2-17分鐘。來自用 處理的小鼠的血
液喪失了在42小時凝固的能力，然而來自所有用rFVIIIFc處理的小鼠的血液仍然在96小
時凝固，6只小鼠中有1只的血液在第113小時凝固，但全部喪失在120小時凝固的能力。
這些數(shù)據(jù)表明rFVIIIFc的作用持續(xù)時間約為 的2至3倍。
WBCT?；€WBCT大于60分鐘。來自代表性實驗的數(shù)據(jù)示于圖2和表3中。WBCT在利用
rFVIIIFc或 給藥后即刻被校正至2-17分鐘。來自用 處理的小鼠的血
液喪失了在42小時凝固的能力，然而來自所有用rFVIIIFc處理的小鼠的血液仍然在96小
時凝固，6只小鼠中有1只的血液在第113小時凝固，但全部喪失在120小時凝固的能力。
這些數(shù)據(jù)表明rFVIIIFc的作用持續(xù)時間約為 的2至3倍。
[0191] 在單次50IU/kg的靜脈內(nèi)注射后在FVIII缺陷小鼠中研究rFVIIIFc、或 (全長重組FVIII)的生色活性。在給藥前和給藥后第8、24、48和72小時收
集血液。使用FVIII特異性生色活性測定法測量活性，所述活性示于圖3中。藥代動力學(xué)
參數(shù)報告于表4中。rFVIIIFc的循環(huán)半衰期為 (7小時)和 (5小時)
的約1.6至2倍(11.1小時)。與針對 的0.47±0.30IU/mL和針對 的
0.67±0.44IU/mL相比較，針對rFVIIIFc的Cmax為1.6±0.36IU/mL。在血友病A小時中，
與 (6.94小時IU/mL)和 (3.90小時IU/mL)相比較，對于rFVIIIFc(22.6
小時IU/mL)，rFVIIIFc的全身性暴露顯著更大，并且與 (7.2mL/小時/kg)和
(12.8小時/mL/kg)相比較，rFIIIFc的清除率顯著更低(2.09mL/小時/kg)。
集血液。使用FVIII特異性生色活性測定法測量活性，所述活性示于圖3中。藥代動力學(xué)
參數(shù)報告于表4中。rFVIIIFc的循環(huán)半衰期為 (7小時)和 (5小時)
的約1.6至2倍(11.1小時)。與針對 的0.47±0.30IU/mL和針對 的
0.67±0.44IU/mL相比較，針對rFVIIIFc的Cmax為1.6±0.36IU/mL。在血友病A小時中，
與 (6.94小時IU/mL)和 (3.90小時IU/mL)相比較，對于rFVIIIFc(22.6
小時IU/mL)，rFVIIIFc的全身性暴露顯著更大，并且與 (7.2mL/小時/kg)和
(12.8小時/mL/kg)相比較，rFIIIFc的清除率顯著更低(2.09mL/小時/kg)。
[0192] 至血友病A狗的施用
[0193] 在血友病A狗的Chapel Hill繁殖群中研究rFVIIIFc的藥效學(xué)(PD)和藥代動力學(xué)(PK)。給4只血友病A狗的每一只施用125IU/kg rFVIIIFc的單次靜脈內(nèi)劑量，WBCT立
即被校正至正常(圖4)。正常狗中的WBCT的范圍為8-12分鐘。WBCT保持少于20分鐘，
與FVIII:C>1%一致的時間，持續(xù)約96小時(除一只具有少于20分鐘的WBCT且持續(xù)72小
時的狗外)。此外，aPTT也立即被校正至正常(表6)。使用被設(shè)計用以檢測分子的FVIII
和Fc部分的特異性ELISA測量rFVIIIFc的血漿濃度。血漿濃度-時間曲線示于圖5中。
數(shù)據(jù)的PK分析顯示t1/2為15.7±1.7小時(表5)。當(dāng)使用FVIII特異性生色活性測定法
測量時，獲得相似的結(jié)果(t1/2=15.4±0.3小時，表5)，使用兩種方法(圖5和6)產(chǎn)生的血
漿濃度-時間曲線相似。當(dāng)使用rFVIIIFc的比活性將活性數(shù)據(jù)從IU/mL轉(zhuǎn)換成ng/mL時，
存在與ELISA數(shù)據(jù)的良好相關(guān)性，從而證明通過ELISA測量的蛋白質(zhì)具有完全活性。
即被校正至正常(圖4)。正常狗中的WBCT的范圍為8-12分鐘。WBCT保持少于20分鐘，
與FVIII:C>1%一致的時間，持續(xù)約96小時(除一只具有少于20分鐘的WBCT且持續(xù)72小
時的狗外)。此外，aPTT也立即被校正至正常(表6)。使用被設(shè)計用以檢測分子的FVIII
和Fc部分的特異性ELISA測量rFVIIIFc的血漿濃度。血漿濃度-時間曲線示于圖5中。
數(shù)據(jù)的PK分析顯示t1/2為15.7±1.7小時(表5)。當(dāng)使用FVIII特異性生色活性測定法
測量時，獲得相似的結(jié)果(t1/2=15.4±0.3小時，表5)，使用兩種方法(圖5和6)產(chǎn)生的血
漿濃度-時間曲線相似。當(dāng)使用rFVIIIFc的比活性將活性數(shù)據(jù)從IU/mL轉(zhuǎn)換成ng/mL時，
存在與ELISA數(shù)據(jù)的良好相關(guān)性，從而證明通過ELISA測量的蛋白質(zhì)具有完全活性。
[0194] 在利用rFVIIIFc給藥前72小時，兩條用rFVIIIFc處理的狗還接受單次劑量的114IU/kg(針對狗M12)和120IU/kg(針對狗M38)。在用 給藥后，WBCT
和aPTT立即被校正至正常。然而，在單次劑量的rFVIIIFc后WBCT的正常化持續(xù)時間約
為 的2倍(圖4)。此外，當(dāng)利用ELISA測量蛋白質(zhì)的血漿濃度時(表5)，對于
rFVIIIFc，rFVIIIFc的血漿半衰期(15.7±1.7小時)約為 (7.0和6.7小時)
的2倍。當(dāng)利用FVIII特異性生色活性測量兩種分子時，獲得相似的結(jié)果。
和aPTT立即被校正至正常。然而，在單次劑量的rFVIIIFc后WBCT的正常化持續(xù)時間約
為 的2倍(圖4)。此外，當(dāng)利用ELISA測量蛋白質(zhì)的血漿濃度時(表5)，對于
rFVIIIFc，rFVIIIFc的血漿半衰期(15.7±1.7小時)約為 (7.0和6.7小時)
的2倍。當(dāng)利用FVIII特異性生色活性測量兩種分子時，獲得相似的結(jié)果。
[0195] 為了評估凝血活性(thrombogenicity)的潛在風(fēng)險，測量血小板和血纖蛋白原。在利用rFVIIIFc或 給藥后，血小板數(shù)目和血漿血纖蛋白原濃度與給前值(數(shù)未
顯示)相比較未改變。
顯示)相比較未改變。
[0196] 討論
[0197] 在來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的人胚胎腎293(HEK 293)細(xì)胞中產(chǎn)生重組FVIIIFc，將其從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。人細(xì)胞系中的產(chǎn)生與目前市售的在中國倉鼠卵巢細(xì)胞或幼倉鼠腎
細(xì)胞中產(chǎn)生的rFVIII產(chǎn)物相比較顯示了制造上的顯著變化。該變化的基礎(chǔ)理論是預(yù)期最
佳地配備人細(xì)胞以進(jìn)行該分子的FVIII部分的必需翻譯后修飾。
細(xì)胞中產(chǎn)生的rFVIII產(chǎn)物相比較顯示了制造上的顯著變化。該變化的基礎(chǔ)理論是預(yù)期最
佳地配備人細(xì)胞以進(jìn)行該分子的FVIII部分的必需翻譯后修飾。
[0198] 考慮到rFVIIIFc與重組B結(jié)構(gòu)域缺失的 的分子量的差異的比活性至IU/nmol的轉(zhuǎn)換表明兩種蛋白質(zhì)的比活性(1970IU/nmol(針對rFVIIIFc)和
1521-2287IU/nmol(針對 ))是相似的。有點令人驚訝的是rFVIIIFc的比活性
不受FVIII的C末端與Fc的N末端的融合影響，因為FVIII的C1和C2結(jié)構(gòu)域參與完全
FVIII活性所必需的磷脂結(jié)合(Fay，PJ，J.Hematology 83:103-8(2006)和Raut，S等人，
Br.J.Haematol.107:323(1999)，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
1521-2287IU/nmol(針對 ))是相似的。有點令人驚訝的是rFVIIIFc的比活性
不受FVIII的C末端與Fc的N末端的融合影響，因為FVIII的C1和C2結(jié)構(gòu)域參與完全
FVIII活性所必需的磷脂結(jié)合(Fay，PJ，J.Hematology 83:103-8(2006)和Raut，S等人，
Br.J.Haematol.107:323(1999)，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
[0199] 在出血事件發(fā)生時按需治療血友病A，或利用預(yù)防法治療血病A以預(yù)防出血。雖然仍然頻繁使用按需治療，但存在朝向關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防和防止的趨勢(Blanchette P
等 人，Haemophilia 2004:10；679-683，Manco-Johnson，MJ 等 人，N.Engl.J.Med.2007；
357:535-544，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。為了進(jìn)行預(yù)防，現(xiàn)有FVIII產(chǎn)
品因10-12小時的相對短的半衰期而要每2或3天施用一次以在患者中維持高于1%的
FVIII:C(Morfini，M，Haemophilia2003；9(增刊1):94-99；discussion 100，White GC等人，Thromb.Haemost.1997:77:660-7，Blanchette，P等 人，J.Thromb.Haemost.2008Aug；
6(8):1319-26，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。提供延長的出血保護(hù)作用的
長效FVIII療法可代表血友病A患者的生活質(zhì)量的顯著提高。延長凝血因子的半衰期的策
略包括已成功地用于其它分子的策略，包括PEG化(Rostin J等人，Bioconj.Chem.2000；
11:387-96，通過引用整體并入本文)、糖聚乙二醇化(glycopegylation)(Stennicke HR等
人，Thromb.Haemost.2008；100:920-8，通過引用整體并入本文)、利用PEG化的脂質(zhì)體的配制(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，Pan J等人，Blood 2009；114:2802-2811，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)和與白蛋白的綴合(Schulte S.，Thromb.
Res.2008；122增刊4:S14-9，通過引用整體并入本文)。PEG化代表降低清除率的方法，然
而，修飾的體內(nèi)作用目前尚不清楚。在體內(nèi)FVIII的直接PEG化的結(jié)果目前尚不清楚，然而
已臨床研究了利用PEG化脂質(zhì)配制的RVIII，所述RVIII顯示了對出血事件的中等作用至無
作用(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，SpiraJ等人，Thromb.Haemost.2008Sep；
100(3):429-34，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
等 人，Haemophilia 2004:10；679-683，Manco-Johnson，MJ 等 人，N.Engl.J.Med.2007；
357:535-544，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。為了進(jìn)行預(yù)防，現(xiàn)有FVIII產(chǎn)
品因10-12小時的相對短的半衰期而要每2或3天施用一次以在患者中維持高于1%的
FVIII:C(Morfini，M，Haemophilia2003；9(增刊1):94-99；discussion 100，White GC等人，Thromb.Haemost.1997:77:660-7，Blanchette，P等 人，J.Thromb.Haemost.2008Aug；
6(8):1319-26，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。提供延長的出血保護(hù)作用的
長效FVIII療法可代表血友病A患者的生活質(zhì)量的顯著提高。延長凝血因子的半衰期的策
略包括已成功地用于其它分子的策略，包括PEG化(Rostin J等人，Bioconj.Chem.2000；
11:387-96，通過引用整體并入本文)、糖聚乙二醇化(glycopegylation)(Stennicke HR等
人，Thromb.Haemost.2008；100:920-8，通過引用整體并入本文)、利用PEG化的脂質(zhì)體的配制(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，Pan J等人，Blood 2009；114:2802-2811，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)和與白蛋白的綴合(Schulte S.，Thromb.
Res.2008；122增刊4:S14-9，通過引用整體并入本文)。PEG化代表降低清除率的方法，然
而，修飾的體內(nèi)作用目前尚不清楚。在體內(nèi)FVIII的直接PEG化的結(jié)果目前尚不清楚，然而
已臨床研究了利用PEG化脂質(zhì)配制的RVIII，所述RVIII顯示了對出血事件的中等作用至無
作用(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，SpiraJ等人，Thromb.Haemost.2008Sep；
100(3):429-34，將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。
[0200] 延長FVIII的半衰期的本方法是將FVIII重組地融合至IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)合天然存在的受體FcRn，其正常功能是保護(hù)IgG免受降解。本文中描述的結(jié)果代表血友病A小
鼠和血友病A狗中rFVIIIFc與rFVIII產(chǎn)物相比較的初始藥代動力學(xué)和效率的表征。在兩
個物種中，rFVIIIFc的半衰期都為當(dāng)通過FVIII活性或ELISA(僅用于狗)測量時的rFVIII
的半衰期的約2倍。這些數(shù)據(jù)也與來自兩個動物模型的WBCT結(jié)果良好相關(guān)，即rFVIIIFc
對WBCT的作用的持續(xù)時間約為 的2倍。在狗中，rFVIIIFc與 的Cmax
和清除率相似，rFVIIIFc的AUC和穩(wěn)態(tài)分布容積分別為 的約1.5倍和2倍。在該
動物模型中 的PK參數(shù)與文獻(xiàn)(Brinkhous K等人，Sem.Thromb.Haemost.2002；
28:269-272，通過引用整體并入本文)中報導(dǎo)的值一致。
鼠和血友病A狗中rFVIIIFc與rFVIII產(chǎn)物相比較的初始藥代動力學(xué)和效率的表征。在兩
個物種中，rFVIIIFc的半衰期都為當(dāng)通過FVIII活性或ELISA(僅用于狗)測量時的rFVIII
的半衰期的約2倍。這些數(shù)據(jù)也與來自兩個動物模型的WBCT結(jié)果良好相關(guān)，即rFVIIIFc
對WBCT的作用的持續(xù)時間約為 的2倍。在狗中，rFVIIIFc與 的Cmax
和清除率相似，rFVIIIFc的AUC和穩(wěn)態(tài)分布容積分別為 的約1.5倍和2倍。在該
動物模型中 的PK參數(shù)與文獻(xiàn)(Brinkhous K等人，Sem.Thromb.Haemost.2002；
28:269-272，通過引用整體并入本文)中報導(dǎo)的值一致。
[0201] 如果這些發(fā)現(xiàn)翻譯成人中半衰期的相同延長，則這可代表血友病A患者的治療中的重大進(jìn)步。
[0202] 其它參考資料(將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)
[0203] Berkner K.，Methods Enzymol.1993；222:450-477.
[0204] Bitonti AJ和Dumont JA.，Adv.Drug Del.Rev.2006；58:1106-1118.
[0205] Dumont J A等人，J.Aerosol Med.2005；18:294-303.
[0206] Dumont JA等人，BioDrugs 2006:20:151-160.
[0207] Ellis CN和Krueger GG.，N.Engl.J.Med.2001；345:248-55.
[0208] Low SC等人，Hum Reprod.2005:7:1805-1813.
[0209] Manco-Johnson，M.，Haemophilia 2007；13增刊；2:4-9.
[0210] Mannucci，PM.和Tuddenham，EGD.，N.Engl.J.Med.2001；344:1773-1779.
[0211] Peyvandi F等人Haemophilia 2006；12(增刊3):82-89.
[0212] Rodriguez-Merchan，EC，Semin.Thromb.Hemost.2003；29:87-96.
[0213] Srour MA等人，Ann.Hematol.2008；87:107-12.
[0214] 實施例2
[0215] 本研究的目的是測定在單次靜脈內(nèi)劑量后rFVIIIFc和在食蟹猴中的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)。
[0216] 材料和方法
[0217] rFVIIIFc(Biogen Idec)，以1.2mg/mL和9882IU/mL的濃度作為冷凍液體提供。比活性為8235IU/mg。于-70℃下貯存。注射前將其稀釋。
[0218] 名稱：Xyntha(Novis Pharmaceuticals)，作為凍干的粉劑(按照制造商的說明書將其重建以產(chǎn)生具有525IU/mL的標(biāo)稱濃度的溶液)。按照制造商的推薦進(jìn)行貯存。
[0219] 動物
[0220] 使用來自新伊比利亞研究中心(New Iberia Research Center)(NIRC)繁殖群的食蟹猴，本研究在(NIRC研究#8733-0903)在批準(zhǔn)的NIRC IACUC方案(APS2008-8733-058)
下于New Iberia，LA的NIRC進(jìn)行。
下于New Iberia，LA的NIRC進(jìn)行。
[0221] 在研究中使用6只經(jīng)確定處于良好健康狀況的首次用于實驗的食蟹猴(3只雄性，3只雌性)。
[0222] 按照方案和UL Lafayette-NIRC標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行研究。
[0223] 研究設(shè)計
[0224] 以125IU/kg給6只猴(3只雄性，3只雌性)的每一只靜脈內(nèi)施用rFVIIIFc。在交叉設(shè)計中以125IU/kg給相同的動物靜脈內(nèi)施用Xyntha(BDD-rFVIII)。組1動物(n=3)在
第0天接受Xyntha，在第3天接受rFVIIIFc，然而組2動物(n=3)在第0天接受rFVIIIFc，
然后在第4天接受Xyntha。用于組2的劑量之間多出的一天是為了確保rFVIIIFc具有足
夠的時間來下降至低于設(shè)計的基線水平。在給藥前和給藥后第0.25、4、12、24、36、48和72小時將每一只動物的血液收集在1/10體積的3.2%檸檬酸鈉中(以獲得血漿)，以用于通過
ELISA和FVIII特異性生色活性測定法測量rFVIIIFc或Xyntha。
第0天接受Xyntha，在第3天接受rFVIIIFc，然而組2動物(n=3)在第0天接受rFVIIIFc，
然后在第4天接受Xyntha。用于組2的劑量之間多出的一天是為了確保rFVIIIFc具有足
夠的時間來下降至低于設(shè)計的基線水平。在給藥前和給藥后第0.25、4、12、24、36、48和72小時將每一只動物的血液收集在1/10體積的3.2%檸檬酸鈉中(以獲得血漿)，以用于通過
ELISA和FVIII特異性生色活性測定法測量rFVIIIFc或Xyntha。
[0225] 測量血漿中的rFVIIIFc和FVIII的ELISA
[0226] 測量猴血漿中的rFVIIIFc的方法
[0227] 設(shè)計該酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)以定量猴血漿中的rFVIIIFc。在該ELISA法中，將來自Bethyl Laboratories(Cat#A80-319A)的山羊抗-人IgG-(H+L)抗體(猴吸收
的)稀釋于涂覆緩沖液中，將其固定在96孔微量滴定樣品板上。抽吸該板，通過添加封閉緩沖液(3%BSA/1xTris)在37℃下進(jìn)行約2小時來封閉該所有未吸附的位置。用高鈣樣品稀
釋緩沖液(3%的含有30mM CaC12的脫脂干乳/TBST)以1:20稀釋血漿樣品，將其分配至樣
品板中。將板在37℃下溫育約2小時。隨后洗滌板，將來自Green Mountain Antibodies
的小鼠抗-B結(jié)構(gòu)域缺失的(a.BDDA1)因子VIII(A1結(jié)構(gòu)域)抗體(Cat#GMA-8002)添加至
板中，在37℃下溫育約1小時。洗滌板后，將來自Southern Biotech的綴合有HRP的山羊
抗-小鼠IgG2a抗體(Cat#1080-05)添加至板中，在室溫下溫育約30分鐘。再次洗滌板，加
入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化物酶底物溶液，在室溫下溫育約30分鐘。通過添加非酸性終
止溶液終止反應(yīng)。顏色顯現(xiàn)與樣品中的rFVIIIFc的量成正比。使用單檢測波長650nm在
吸收板讀數(shù)器上讀取板。在通過使用4參數(shù)邏輯曲線擬合程序(four-parameter logistic
curve-fitting program)將光密度(OD)對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定rFVIIIFc的
濃度。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍是5%猴血漿中的0.400ng/mL-51.2ng/mL(100%的猴血漿
中的8.00ng/mL-1024ng/mL)?？砂ㄔ跍y定的定量范圍外的一個校準(zhǔn)點(5%猴血漿中的
0.200ng/mL)來用作有助于曲線擬合的錨點(anchor point)?？苫谇€的最佳擬合(即，
在確定的精確度內(nèi)讀取最高數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)，%RE)除去或保留錨點。
的)稀釋于涂覆緩沖液中，將其固定在96孔微量滴定樣品板上。抽吸該板，通過添加封閉緩沖液(3%BSA/1xTris)在37℃下進(jìn)行約2小時來封閉該所有未吸附的位置。用高鈣樣品稀
釋緩沖液(3%的含有30mM CaC12的脫脂干乳/TBST)以1:20稀釋血漿樣品，將其分配至樣
品板中。將板在37℃下溫育約2小時。隨后洗滌板，將來自Green Mountain Antibodies
的小鼠抗-B結(jié)構(gòu)域缺失的(a.BDDA1)因子VIII(A1結(jié)構(gòu)域)抗體(Cat#GMA-8002)添加至
板中，在37℃下溫育約1小時。洗滌板后，將來自Southern Biotech的綴合有HRP的山羊
抗-小鼠IgG2a抗體(Cat#1080-05)添加至板中，在室溫下溫育約30分鐘。再次洗滌板，加
入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化物酶底物溶液，在室溫下溫育約30分鐘。通過添加非酸性終
止溶液終止反應(yīng)。顏色顯現(xiàn)與樣品中的rFVIIIFc的量成正比。使用單檢測波長650nm在
吸收板讀數(shù)器上讀取板。在通過使用4參數(shù)邏輯曲線擬合程序(four-parameter logistic
curve-fitting program)將光密度(OD)對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定rFVIIIFc的
濃度。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍是5%猴血漿中的0.400ng/mL-51.2ng/mL(100%的猴血漿
中的8.00ng/mL-1024ng/mL)?？砂ㄔ跍y定的定量范圍外的一個校準(zhǔn)點(5%猴血漿中的
0.200ng/mL)來用作有助于曲線擬合的錨點(anchor point)?？苫谇€的最佳擬合(即，
在確定的精確度內(nèi)讀取最高數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)，%RE)除去或保留錨點。
[0228] 測量猴血漿中的FVIII的方法
[0229] 設(shè)計該酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)以定量猴血漿中的FVIII。在該ELISA法中，將來自Green Mountain Antibodies(Cat#GMA-8002)的小鼠αBDDA1FVIII抗體稀釋于
涂覆緩沖液中，并且將其固定在96孔微量滴定樣品板上。抽吸該板，通過添加封閉緩沖液
(3%BSA/1xTris)在37℃下進(jìn)行約1小時來封閉所有未吸附的位置。用高鈣樣品稀釋緩沖
液(含有100mM CaC12的封閉緩沖液)以1:20稀釋血漿樣品，將其分配至樣品板上。將板
在37℃下溫育約2小時。洗滌板后，將來自Affinity Biologicals試劑盒的檢測抗體HRP
標(biāo)記的多克隆抗體(Cat#F8C-EIA-D)進(jìn)一步稀釋于TBS/0.05%Tween 20中，然后添加至板
并且在室溫下溫育約1小時。再次洗滌板，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化物酶底物溶液，
在室溫下溫育約30分鐘。通過添加酸性終止溶液終止反應(yīng)。顏色顯現(xiàn)與樣品中的FVIIIF
的量成正比。使用單檢測波長450nm在吸收板讀數(shù)器上讀取板。在通過使用4參數(shù)邏輯曲
線擬合程序?qū)⒐饷芏?OD)對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定FVIIIF的濃度。該方法的標(biāo)
準(zhǔn)曲線范圍是5%猴血漿中的0.625ng/mL-20ng/mL(100%的猴血漿中的12.5ng/mL-400ng/
mL)?？砂ㄔ跍y定的定量范圍外的2個校準(zhǔn)點(5%猴血漿中的0.313和0.156ng/mL)來
用作有助于曲線擬合的錨點?？苫谇€的最佳擬合(即，在確定的精確度內(nèi)讀取最高數(shù)
量的標(biāo)準(zhǔn)，%RE)除去或保留錨點。
涂覆緩沖液中，并且將其固定在96孔微量滴定樣品板上。抽吸該板，通過添加封閉緩沖液
(3%BSA/1xTris)在37℃下進(jìn)行約1小時來封閉所有未吸附的位置。用高鈣樣品稀釋緩沖
液(含有100mM CaC12的封閉緩沖液)以1:20稀釋血漿樣品，將其分配至樣品板上。將板
在37℃下溫育約2小時。洗滌板后，將來自Affinity Biologicals試劑盒的檢測抗體HRP
標(biāo)記的多克隆抗體(Cat#F8C-EIA-D)進(jìn)一步稀釋于TBS/0.05%Tween 20中，然后添加至板
并且在室溫下溫育約1小時。再次洗滌板，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化物酶底物溶液，
在室溫下溫育約30分鐘。通過添加酸性終止溶液終止反應(yīng)。顏色顯現(xiàn)與樣品中的FVIIIF
的量成正比。使用單檢測波長450nm在吸收板讀數(shù)器上讀取板。在通過使用4參數(shù)邏輯曲
線擬合程序?qū)⒐饷芏?OD)對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定FVIIIF的濃度。該方法的標(biāo)
準(zhǔn)曲線范圍是5%猴血漿中的0.625ng/mL-20ng/mL(100%的猴血漿中的12.5ng/mL-400ng/
mL)?？砂ㄔ跍y定的定量范圍外的2個校準(zhǔn)點(5%猴血漿中的0.313和0.156ng/mL)來
用作有助于曲線擬合的錨點?？苫谇€的最佳擬合(即，在確定的精確度內(nèi)讀取最高數(shù)
量的標(biāo)準(zhǔn)，%RE)除去或保留錨點。
[0230] FVHI-特異性生色測定
[0231] 基于施用的劑量估計食蟹猴血漿樣品中的FVIII活性，然后將其在人FVIII-缺失的血漿(Diagnostica Stago)中稀釋至約0.25-1IU/ml。使用FVIII chromogenic試劑
盒(Siemens)在Sysmex CA1500(Siemens Diagnostic Healthcare)上分析樣品。在該生
色測定中，血漿中的rFVIIIFc被凝血酶激活。激活的因子VIII(FVIIIa)隨后在激活的因
子IX(FIXa)、磷脂(PL)和鈣離子存在的情況下加速因子X(FX)至因子Xa(FXa)的轉(zhuǎn)化。
通過特異于FXa的對硝基苯胺底物的水解來評估FXa活性。在405nm測量的對硝基苯胺
(pNA)的初始釋放速率與FXa活性成正比，從而與樣品中的FVIII活性成正比。在本測定中
因rFVIIIFc而產(chǎn)生的FVIII活性的定量限為約0.3IU/ml。所述測定法可測量下限降至約
0.06IU/ml的總FVIII活性，精確度為±20%。從每一個時間點上的值減去個體動物的給藥
前樣品的計算活性以產(chǎn)生PD曲線(FVIII活性對時間)。
盒(Siemens)在Sysmex CA1500(Siemens Diagnostic Healthcare)上分析樣品。在該生
色測定中，血漿中的rFVIIIFc被凝血酶激活。激活的因子VIII(FVIIIa)隨后在激活的因
子IX(FIXa)、磷脂(PL)和鈣離子存在的情況下加速因子X(FX)至因子Xa(FXa)的轉(zhuǎn)化。
通過特異于FXa的對硝基苯胺底物的水解來評估FXa活性。在405nm測量的對硝基苯胺
(pNA)的初始釋放速率與FXa活性成正比，從而與樣品中的FVIII活性成正比。在本測定中
因rFVIIIFc而產(chǎn)生的FVIII活性的定量限為約0.3IU/ml。所述測定法可測量下限降至約
0.06IU/ml的總FVIII活性，精確度為±20%。從每一個時間點上的值減去個體動物的給藥
前樣品的計算活性以產(chǎn)生PD曲線(FVIII活性對時間)。
[0232] 從在人FVIII缺陷血漿中稀釋至1IU/ml的NIBSC第7國際標(biāo)準(zhǔn)FVIII濃縮物產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線在Sysmex儀中進(jìn)行系列稀釋以產(chǎn)生0.15、0.1、0.05、0.025、0.0053和0.0026IU/ml的濃度。由于儀器在內(nèi)部以1:10稀釋所有樣品，因此FVIII標(biāo)準(zhǔn)濃度相應(yīng)
于1.5-0.026IU/ml的血漿濃度，這在可測量的FVIII活性的范圍內(nèi)。
于1.5-0.026IU/ml的血漿濃度，這在可測量的FVIII活性的范圍內(nèi)。
[0233] PK分析
[0234] 使用WinNonlin軟件系統(tǒng)(5.2版，Pharsight Corporation.Mountain View，CA)中的非房室模型分析模塊評估濃度時間譜。
[0235] 結(jié)果
[0236] 使用測量分子的FVIII和Fc部分的夾心ELISA形式測量rFVIIIFc的猴血漿濃度，在表7中報告數(shù)據(jù)。所有給藥前樣品低于定量限。圖7舉例說明隨時間過去組平均rFVIIIFc
和Xyntha血漿濃度，個體血漿濃度-時間曲線示于圖8中。rFVIIIFc和Xyntha的PK參
數(shù)的概述分別示于表9和10中。rFVIIIFc的平均t1/2為11.9±1.7小時(從9.3小時
變化至14.1小時)，對于Xyntha，平均清除率t1/2為12.7±4.4小時(從9.2小時變化至
19.9小時)。
和Xyntha血漿濃度，個體血漿濃度-時間曲線示于圖8中。rFVIIIFc和Xyntha的PK參
數(shù)的概述分別示于表9和10中。rFVIIIFc的平均t1/2為11.9±1.7小時(從9.3小時
變化至14.1小時)，對于Xyntha，平均清除率t1/2為12.7±4.4小時(從9.2小時變化至
19.9小時)。
[0237] 使用FVIII特異性生色活性測定法測量FVIII活性，將數(shù)據(jù)報告于表8中。從所有樣品減去因內(nèi)源FVIII而產(chǎn)生的給藥前活性。平均組數(shù)據(jù)的圖表示于圖9中，個體血漿
濃度-時間曲線示于圖10中。rFVIIIFc和Xyntha的PK參數(shù)的概述分別報告于表9和10
中。平均清除率t1/2為16.1±6.9小時(從11.6小時變化至29.4小時)(針對rFVIIIFc)
和12.5±1.7小時(從10.4小時變化至14.3小時)(針對Xyntha)。
濃度-時間曲線示于圖10中。rFVIIIFc和Xyntha的PK參數(shù)的概述分別報告于表9和10
中。平均清除率t1/2為16.1±6.9小時(從11.6小時變化至29.4小時)(針對rFVIIIFc)
和12.5±1.7小時(從10.4小時變化至14.3小時)(針對Xyntha)。
[0238] 討論和結(jié)論
[0239] 在125IU/kg的單次靜脈內(nèi)劑量后，無論利用ELISA還是利用生色活性測定法來測定檢品，rFVIIIFc與Xyntha的消除半衰期都相似。
[0240] 實施例3
[0241] 這將是設(shè)計用以評估單次劑量的rFVIIIFc在患有嚴(yán)重(定義為<1IU/dL[1%]內(nèi)源因子VIII[FVIII])血友病A的受試者中的安全性、耐受性和藥代動學(xué)的I/IIa期、開放
標(biāo)記、交叉、劑量遞增、多中心和首次在人中的研究。招募總共約12個先前治療的患者，以
25或65IU/kg施用rFVIIIFc。在篩查(在 [rFVIII](對照比較試劑)的首次劑
量之前28天內(nèi)安排的)和在首次注射之前在無FVIII處理的情況下經(jīng)歷最少4天(96小
時)后，大約6個受試者將接受單次25IU/kg劑量的 然后進(jìn)行3天(72小時)的
藥代動力學(xué)(PK)表征，隨后進(jìn)行交叉，然后接受25IU/kg的單次開放標(biāo)記劑量的rFVIIIFc
以進(jìn)行7天(168小時)的PK表征。順次地給前3個受試者給藥。對于前三個(3)利用
25IU/kg rFVIIIFc給藥的受試者，每一個受試者將在rFVIIIFc注射后第14天(336小時)
經(jīng)歷抑制劑評估。一旦完成抑制劑測試，將對接下來的受試者(僅對于前3個受試者)給
藥。在第3個受試者完成14天的抑制劑評估后，開始將將其余3個受試者(以25IU/kg)
和6個受試者(以65IU/kg)至少相隔1天順次招募入每一個劑量組。
標(biāo)記、交叉、劑量遞增、多中心和首次在人中的研究。招募總共約12個先前治療的患者，以
25或65IU/kg施用rFVIIIFc。在篩查(在 [rFVIII](對照比較試劑)的首次劑
量之前28天內(nèi)安排的)和在首次注射之前在無FVIII處理的情況下經(jīng)歷最少4天(96小
時)后，大約6個受試者將接受單次25IU/kg劑量的 然后進(jìn)行3天(72小時)的
藥代動力學(xué)(PK)表征，隨后進(jìn)行交叉，然后接受25IU/kg的單次開放標(biāo)記劑量的rFVIIIFc
以進(jìn)行7天(168小時)的PK表征。順次地給前3個受試者給藥。對于前三個(3)利用
25IU/kg rFVIIIFc給藥的受試者，每一個受試者將在rFVIIIFc注射后第14天(336小時)
經(jīng)歷抑制劑評估。一旦完成抑制劑測試，將對接下來的受試者(僅對于前3個受試者)給
藥。在第3個受試者完成14天的抑制劑評估后，開始將將其余3個受試者(以25IU/kg)
和6個受試者(以65IU/kg)至少相隔1天順次招募入每一個劑量組。
[0242] 在最后一個受試者接受25IU/kg劑量的rFVIIIFc后1周，大約6個獨特的受試者被招募來用作65IU/kg的組群。65IU/kg組群中的每一個受試者將接受單次65IU/kg劑量
的 然后進(jìn)行4天(96小時)PK表征，然后進(jìn)行交叉表征，接受65IU/kg的單次開
放標(biāo)記劑量的rFVIIIFc，進(jìn)行10天(240小時)的表征。如果在任何組群中，出血事件在
rFVIIIFc的首次注射之前發(fā)生，則應(yīng)當(dāng)將受試者的研究前FVIII產(chǎn)物用于治療，隨后必須
經(jīng)歷至少4天的間隔，然后才開始接受rFVIIIFc的首次注射來進(jìn)行PK表征。
的 然后進(jìn)行4天(96小時)PK表征，然后進(jìn)行交叉表征，接受65IU/kg的單次開
放標(biāo)記劑量的rFVIIIFc，進(jìn)行10天(240小時)的表征。如果在任何組群中，出血事件在
rFVIIIFc的首次注射之前發(fā)生，則應(yīng)當(dāng)將受試者的研究前FVIII產(chǎn)物用于治療，隨后必須
經(jīng)歷至少4天的間隔，然后才開始接受rFVIIIFc的首次注射來進(jìn)行PK表征。
[0243] 為安全起見，在施用rFVIIIFc 25IU/kg或65IU/kg后使所有受試者經(jīng)歷14天(336個小時)和28天的安全評估期。所有受試者在將經(jīng)歷給藥前和給藥后藥代動力學(xué)取
樣以及在指定的時間點將血液樣品用于FVIII活性分析。
樣以及在指定的時間點將血液樣品用于FVIII活性分析。
[0244] 實施例4
[0245] Xase復(fù)合物內(nèi)的活性
[0246] 為了研究FVIII蛋白(rBDD FVIII和rFVIIIFc)與FIXa的結(jié)合和測量這類蛋白激活FX的能力，進(jìn)行動力學(xué)研究以在Xase復(fù)合物的背景中檢查這些相互作用。該測定包
括在鈣存在的情況下利用激活的FIX和激活的rBDD FVIII或rFVIIIFc蛋白在磷脂表面上
形成Xase復(fù)合物，監(jiān)控FX至FXa的轉(zhuǎn)化，如通過生色或發(fā)熒光底物的切割測量的。
括在鈣存在的情況下利用激活的FIX和激活的rBDD FVIII或rFVIIIFc蛋白在磷脂表面上
形成Xase復(fù)合物，監(jiān)控FX至FXa的轉(zhuǎn)化，如通過生色或發(fā)熒光底物的切割測量的。
[0247] 簡而言之，首先用α-凝血酶激活FVIII，進(jìn)行5分鐘，然后在Ca2+和合成磷脂囊泡(25%磷脂酰絲氨酸(PS)/75%磷脂酰膽堿(PC))或血小板存在的情況下將其與FIXa混
合。在下述條件下，F(xiàn)VIIIa與FIXa在磷脂表面和鈣離子存在的情況下相互作用以形成活
性Xase復(fù)合物，該復(fù)合物通過蛋白酶解加工介導(dǎo)FX至FXa的轉(zhuǎn)化。依次地，F(xiàn)Xa切割FXa
特異性生色或發(fā)熒光底物。切割的底物產(chǎn)生顏色，從而溶液中切割的底物的量表示產(chǎn)生的
FXa的量。這可通過測量405nm處的溶液的吸光度來定量。
合。在下述條件下，F(xiàn)VIIIa與FIXa在磷脂表面和鈣離子存在的情況下相互作用以形成活
性Xase復(fù)合物，該復(fù)合物通過蛋白酶解加工介導(dǎo)FX至FXa的轉(zhuǎn)化。依次地，F(xiàn)Xa切割FXa
特異性生色或發(fā)熒光底物。切割的底物產(chǎn)生顏色，從而溶液中切割的底物的量表示產(chǎn)生的
FXa的量。這可通過測量405nm處的溶液的吸光度來定量。
[0248] A.因子X的激活
[0249] 如上所述在Xase復(fù)合物的背景中研究rBDD FVIII和rFVIIIFc激活FX的能力。在鈣存在的情況下將凝血酶激活的FVIII蛋白與FIXa和磷脂一起溫育，隨后在FX特異性
底物存在的情況下添加至不同濃度的FX中，測定FXa產(chǎn)生的速率(圖11)。
底物存在的情況下添加至不同濃度的FX中，測定FXa產(chǎn)生的速率(圖11)。
[0250] 基于這些數(shù)據(jù)，在Xase復(fù)合物的背景中計算不同F(xiàn)VIII蛋白的Km和Vmax(Chang1997)(表11)。數(shù)據(jù)表示為6個分析(3個包括一式兩份運行的實驗)的平均值±相應(yīng)的
標(biāo)準(zhǔn)差?；谶@些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在測定的變型內(nèi)這類蛋白(rBDD FVIII和rFVIIIFc)具有相
當(dāng)?shù)腒m和Vmax值。因此，利用rFVIIIFc形成的Xase復(fù)合物與利用獲得許可的產(chǎn)品rBDD
FVIII(ReFacto)形成的Xase復(fù)合物在與磷脂相互作用和激活FX的能力方面表現(xiàn)出相似的
行為。注意，這些可比較的數(shù)據(jù)還顯示rFVIIIFc在用凝血酶短暫溫育后被激活至可與rBDD FVIII相比較的程度。
標(biāo)準(zhǔn)差?；谶@些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在測定的變型內(nèi)這類蛋白(rBDD FVIII和rFVIIIFc)具有相
當(dāng)?shù)腒m和Vmax值。因此，利用rFVIIIFc形成的Xase復(fù)合物與利用獲得許可的產(chǎn)品rBDD
FVIII(ReFacto)形成的Xase復(fù)合物在與磷脂相互作用和激活FX的能力方面表現(xiàn)出相似的
行為。注意，這些可比較的數(shù)據(jù)還顯示rFVIIIFc在用凝血酶短暫溫育后被激活至可與rBDD FVIII相比較的程度。
[0251] B.與FIXa的相互作用
[0252] 也在Xase復(fù)合物的背景中檢查rBDD FVIII和rFVIIIFc與FIXa之間的相互作用。如上使用固定量的FX和變化的FIXa水平裝配Xase復(fù)合物，測定FXa的產(chǎn)生速率(圖12)。
從這些數(shù)據(jù)測定利用兩種FVIII蛋白形成的Xase復(fù)合物對FIXa的Kd值(Chang 1997)。
數(shù)據(jù)表示為6個分析(3個包含一式兩份運行的實驗)的平均值±相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(表12)。
發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)具有相似的Kd和Vmax值，表明rFVIIIFc具有可與被許可的rBDD FVIII
產(chǎn)品相比較的與FIXa的相互作用。
從這些數(shù)據(jù)測定利用兩種FVIII蛋白形成的Xase復(fù)合物對FIXa的Kd值(Chang 1997)。
數(shù)據(jù)表示為6個分析(3個包含一式兩份運行的實驗)的平均值±相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(表12)。
發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)具有相似的Kd和Vmax值，表明rFVIIIFc具有可與被許可的rBDD FVIII
產(chǎn)品相比較的與FIXa的相互作用。
[0253] 實施例5
[0254] 實施例3中論述的I/IIa期臨床試驗的臨時藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)(Interimpharmacokinetic data)顯示下列FVIIIFc的結(jié)果。FVIIIFc與ADVATE(全長rFVIII)相比
較具有約50%的全身性暴露量(systemic exposure)(AUCINF)的增加、約50%的清除率(CI)
的減少以及約50-70%的消除半衰期和MRT的增加。此外，F(xiàn)VIIIFc與ADVATE相比較顯示
增加的C168、TBLP1、TBLP3和TBLP5值。
較具有約50%的全身性暴露量(systemic exposure)(AUCINF)的增加、約50%的清除率(CI)
的減少以及約50-70%的消除半衰期和MRT的增加。此外，F(xiàn)VIIIFc與ADVATE相比較顯示
增加的C168、TBLP1、TBLP3和TBLP5值。
[0255] AUCINF 從0至無窮大的濃度-時間曲線下面積
[0256] βHL 消除期半衰期；也稱為t1/2β
[0257] C168 在給藥后約168小時高于基線的估計的FVIIIFc活性
[0258] Cl 清除率
[0259] MRT平均停留時間
[0260] TBLP1 給藥后當(dāng)FVIIIFc活性下降至約高于基線1IU/dL時模型預(yù)測的時間
[0261] TBLP3 給藥后當(dāng)FVIIIFc活性下降至高于基線約3IU/dL時模型預(yù)測的時間
[0262] TBLP5 給藥后當(dāng)FVIIIFc活性下降至高于基線約5IU/dL時模型預(yù)測的時間
[0263] 實施例6
[0264] 重組B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白已被產(chǎn)生用作延長FVIII的半衰期的方法。在血友病A小鼠中進(jìn)行將rFVIIIFc與rFVIII的藥代動力學(xué)(PK)比較。
我們發(fā)現(xiàn)rFVIIIFc的終半衰期為rFVIII的2倍。為了驗證半衰期延長的背后機(jī)制歸歸于
FcRn對rFVIIIFc的保護(hù)作用，在FcRn敲除和人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中評估PK。施用單次靜
脈內(nèi)劑量(125IU/kg)，使用生色活性測定法測量血漿濃度。在兩個小鼠品系中rFVIIIFc與
的Cmax相似。然而，雖然在FcRn敲除小鼠中，rFVIIIFc的半衰期可與
rFVIII的相比較，但在hFcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中，rFVIIIFc的半衰期被延長至rFVIII的約2倍。
這些結(jié)果確認(rèn)了FcRn介導(dǎo)與rFVIII相比較rFVIIIFc的延長的半衰期或是該延長的半衰
期的形成原因。由于已顯示在血友病小鼠的出血模型以及臨床應(yīng)用中通過旋轉(zhuǎn)血栓彈性測
定法(rotation fhromboelastometry)(ROTEM)測量的全血的動態(tài)平衡與凝血因子的效率
相關(guān)，因此我們尋求使用ROTEM來在血友病A小鼠評估rFVIIIFc的離體效率。給血友病A小
鼠施用單次靜脈內(nèi)劑量的50IU/kg rFVIIIFc、 或
在給藥后5分鐘，凝塊形成在凝固時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)和α-角上相似。然而，
rFVIIIFc在給藥后72和96小時顯示顯著改善的CT，在96小時后與
和 相比較CFT和α-角也得到改善，這與rFVIIIFc的延長的PK一致。
因此FVIII的Fc融合的構(gòu)建產(chǎn)生了具有確定的作用機(jī)制的分子，所述分子具有增加的半衰
期和提供延長的出血保護(hù)作用的潛能。
我們發(fā)現(xiàn)rFVIIIFc的終半衰期為rFVIII的2倍。為了驗證半衰期延長的背后機(jī)制歸歸于
FcRn對rFVIIIFc的保護(hù)作用，在FcRn敲除和人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中評估PK。施用單次靜
脈內(nèi)劑量(125IU/kg)，使用生色活性測定法測量血漿濃度。在兩個小鼠品系中rFVIIIFc與
的Cmax相似。然而，雖然在FcRn敲除小鼠中，rFVIIIFc的半衰期可與
rFVIII的相比較，但在hFcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中，rFVIIIFc的半衰期被延長至rFVIII的約2倍。
這些結(jié)果確認(rèn)了FcRn介導(dǎo)與rFVIII相比較rFVIIIFc的延長的半衰期或是該延長的半衰
期的形成原因。由于已顯示在血友病小鼠的出血模型以及臨床應(yīng)用中通過旋轉(zhuǎn)血栓彈性測
定法(rotation fhromboelastometry)(ROTEM)測量的全血的動態(tài)平衡與凝血因子的效率
相關(guān)，因此我們尋求使用ROTEM來在血友病A小鼠評估rFVIIIFc的離體效率。給血友病A小
鼠施用單次靜脈內(nèi)劑量的50IU/kg rFVIIIFc、 或
在給藥后5分鐘，凝塊形成在凝固時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)和α-角上相似。然而，
rFVIIIFc在給藥后72和96小時顯示顯著改善的CT，在96小時后與
和 相比較CFT和α-角也得到改善，這與rFVIIIFc的延長的PK一致。
因此FVIII的Fc融合的構(gòu)建產(chǎn)生了具有確定的作用機(jī)制的分子，所述分子具有增加的半衰
期和提供延長的出血保護(hù)作用的潛能。
[0265] 實施例7
[0266] 本實施例提供來自16個用25和65IU/kg FVIII產(chǎn)品治療的患者的FVIII活性的最終分析結(jié)果。參見實施例3和5。
[0267] 在本實施例中，rFVIIIFc為重組融合蛋白，其由融合至人IgG1的嵌合Fc結(jié)構(gòu)域的重組B結(jié)構(gòu)域缺失的人FVIII的單個分子(BDD-rFVIII)組成，該分子無間插接頭序列。該
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在本文中也稱為rFVIIIFc異二聚雜交蛋白、FVIIIFc單聚Fc融合蛋白、FVIIIFc
單體雜交體、單體FVIIIIFc要交體以及FVIIIFc單體-二聚體。參見實施例1、圖1和表
2A。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在本文中也稱為rFVIIIFc異二聚雜交蛋白、FVIIIFc單聚Fc融合蛋白、FVIIIFc
單體雜交體、單體FVIIIIFc要交體以及FVIIIFc單體-二聚體。參見實施例1、圖1和表
2A。
[0268] 利用rFVIIIFc的臨床前研究已顯示與商購可得的rFVIII產(chǎn)品相比較rFVIII活性的約2倍的半衰期延長。本研究的原理是在嚴(yán)重血友病A受試者中評估單次劑量的以冷
凍液體制劑形式存在的rFVIIIFc的安全性和耐受性以及提供關(guān)于PK的數(shù)據(jù)。為了進(jìn)行
本研究，16個可評價的受試者可用于PK評估。兩個劑量(以25(n=6)和65IU/kg的體重
(n=10)的標(biāo)稱劑量)的rFVIIIFc和Advate的單次施用是在約10分鐘的時期內(nèi)進(jìn)行靜脈
內(nèi)輸注。在輸注之前以及在給藥后達(dá)到10天，獲得用于血漿PK評估的血液樣品。在本研
究中使用模型依賴性方法表征Advate和rFVIIIFc的FVIII活性的PK。
凍液體制劑形式存在的rFVIIIFc的安全性和耐受性以及提供關(guān)于PK的數(shù)據(jù)。為了進(jìn)行
本研究，16個可評價的受試者可用于PK評估。兩個劑量(以25(n=6)和65IU/kg的體重
(n=10)的標(biāo)稱劑量)的rFVIIIFc和Advate的單次施用是在約10分鐘的時期內(nèi)進(jìn)行靜脈
內(nèi)輸注。在輸注之前以及在給藥后達(dá)到10天，獲得用于血漿PK評估的血液樣品。在本研
究中使用模型依賴性方法表征Advate和rFVIIIFc的FVIII活性的PK。
[0269] 目的
[0270] 本研究的主要目的是在先前治療的年齡12歲以上的嚴(yán)重血友病A患者(PTP)中評估兩個劑量(25和65IU/kg)的rFVIIIFc的單次施用的安全性和耐受性。
[0271] 第二目的是在一步凝集測定和生色測定中測定25或65IU/kg的rFVIIIFc的單次施用后隨時間過去FVIII相對于Advate的藥代動力學(xué)(PK)參數(shù)(通過FVIII的藥效(PD)
活性測定的)。
活性測定的)。
[0272] 研究設(shè)計(參見實施例3)
[0273] 在篩查隨訪時(在施用Advate之前28天內(nèi))、在注射當(dāng)天(Advate的注射)和在注射后第10分鐘和30分鐘以及第1、3、6和9小時、在Advate的注射后第1天(第24小
時)、在Advate注射后第2天(第48小時)、在Advate的注射后第3天(第72小時)以
及在高劑量的Advate注射(僅組群B)后第4天(在第96小時)收集Advate血液樣品以
進(jìn)行FVIII活性的PK評估。
時)、在Advate注射后第2天(第48小時)、在Advate的注射后第3天(第72小時)以
及在高劑量的Advate注射(僅組群B)后第4天(在第96小時)收集Advate血液樣品以
進(jìn)行FVIII活性的PK評估。
[0274] 在即將施用rFVIIIFc之前在rFVIIIFc注射當(dāng)天、在rFVIIIFc注射后第10分鐘和30分鐘以及第1、3、6和9小時；在rFVIIIFc注射后第1天(第24小時)；在rFVIIIFc
注射后第2天至第5天(第48、72、96和120小時)、在rFVIIIFc注射后第7天(第168
小時)、在高劑量的rFVIIIFc注射(僅組群B)后第8、9和第10天(第192、216和240小
時)收集血液樣品以進(jìn)行FVIII活性的PK評估。也在最終的研究隨訪(rFVIIIFc注射后
28天)時，在rFVIIIFc注射后第672小時測量FVIII活性。
注射后第2天至第5天(第48、72、96和120小時)、在rFVIIIFc注射后第7天(第168
小時)、在高劑量的rFVIIIFc注射(僅組群B)后第8、9和第10天(第192、216和240小
時)收集血液樣品以進(jìn)行FVIII活性的PK評估。也在最終的研究隨訪(rFVIIIFc注射后
28天)時，在rFVIIIFc注射后第672小時測量FVIII活性。
[0275] 藥代動力學(xué)建模和計算
[0276] 縮寫
[0277] TBLP1=在給藥后當(dāng)FVIII活性下降至高于基線1IU/dL時模型預(yù)測的時間
[0278] TBLP3=在給藥后當(dāng)FVIII活性下降至高于基線3IU/dL時模型預(yù)測的時間
[0279] KV_M=Cmax_M/實際劑量(IU/kg)
[0280] KV_OB=Cmax_OB/實際劑量(IU/kg)
[0281] IVR_M=100xCmax_Mx血漿體積(dL)/以IU表示的總劑量；其中以ml表示的血漿體積=(23.7Ht(以cm表示))+(9.0Wt(以kg表示))-1709。
[0282] IVR_OB=100Cmax_OBx血漿體積(dL)/以IU表示的總劑量；其中以ml表示的血漿體積=(23.7xHt(以cm表示))+(9.0Wt(以kg表示))-1709。
[0283] 結(jié)果
[0284] 圖13.觀察到的組平均值(+SE)FVIII活性-時間曲線，通過劑量水平分選的，通過化合物分組的(一步測定法，25IU/kg(A)和65IU/g(B))和(生色測定法，25IU/kg(C)和
65IU/kg(D))。
65IU/kg(D))。
[0285] 圖14.觀察到的組平均值(+SE)FVIII活性-時間曲線，通過劑量水平和化合物分組的(一步測定法；A)(生色測定法；B)。
[0286] 單次劑量藥代動力學(xué)(一步測定法)
[0287] 在Advate或rFVIIIFc的短暫IV輸注后觀察到的FVIII活性急劇升高，25和65IU/kg劑量組的平均(±SD)模型預(yù)測的Cmax值分別為56.6±4.74和121±28.2IU/
dL(針對Advate)以及55.6±8.18和108±16.9IU/dL(針對rFVIIIFc)。所有Advate-和
rFVIIIFc-處理的患者具有FVIII活性的劑量相關(guān)增加。觀察到的Cmax和AUCINF的增加
的程度在評估的劑量范圍內(nèi)略低于劑量的增加。
dL(針對Advate)以及55.6±8.18和108±16.9IU/dL(針對rFVIIIFc)。所有Advate-和
rFVIIIFc-處理的患者具有FVIII活性的劑量相關(guān)增加。觀察到的Cmax和AUCINF的增加
的程度在評估的劑量范圍內(nèi)略低于劑量的增加。
[0288] 輸注結(jié)束后，觀察到的FVIII活性的下降顯示單指數(shù)衰減(monoexponentialdecay)特征直至達(dá)到基線水平。rFVIIIFc的FVIII活性的下降速率比Advate慢，對于25和
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型-預(yù)測的消除半衰期值分別為11.9±2.98和10.4±3.03
小時(針對Advate)以及18.0±3.88和18.4±6.99小時(針對rFVIIIFc)。消除半衰期
在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型-預(yù)測的消除半衰期值分別為11.9±2.98和10.4±3.03
小時(針對Advate)以及18.0±3.88和18.4±6.99小時(針對rFVIIIFc)。消除半衰期
在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
[0289] 在以25和65IU/kg劑量水平施用rFVIIIFc后，總的全身性FVIII暴露(通過AUCINF評估的)分別比Advate大~48%和61%。對于25和65IU/kg的劑量組，平均(±SD)
模型預(yù)測的AUCINF值分別為974±259和1810±606小時*IU/dL(針對Advate)以及
1440±316和2910±1320小時*IU/dL(針對rFVIIIFc)。
模型預(yù)測的AUCINF值分別為974±259和1810±606小時*IU/dL(針對Advate)以及
1440±316和2910±1320小時*IU/dL(針對rFVIIIFc)。
[0290] 與消除半衰期類似，相對于Advater，F(xiàn)VIIIFc的MRT獲得延長。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的MRT值分別為17.1±4.29和14.9±4.38小時(針對
Advate)以及25.9±5.60和26.5±10.1小時(針對rFVIIIFc)。MRT值在對兩種FVIII產(chǎn)
物進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
Advate)以及25.9±5.60和26.5±10.1小時(針對rFVIIIFc)。MRT值在對兩種FVIII產(chǎn)
物進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
[0291] 此外，測定CL和V的一級PK參數(shù)值。rFVIIIFc的CL值僅約占對于等劑量的Advate觀察到的CL值的66%。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的CL
值分別為2.70±0.729和4.08±1.69mL/小時/kg(針對Advate)以及1.80±0.409和
2.69±1.25mL/小時/kg(針對rFVIIIFc)。Advate與rFVIIIFc的V值相當(dāng)，對于25和
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的V值分別為43.9±4.27和56.1±13.4mL/kg(針
對Advate)以及45.3±7.23和61.6±10.6mL/kg(針對rFVIIIFc)。隨Advate和rFVIIIFc
的劑量逐漸增加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/
kg劑量上的標(biāo)準(zhǔn)差的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。例如，rFVIIIFc處
理組的CV%幾何平均CL值從23.0%(25IU/kg)增加至48.6%(65IU/kg)。
值分別為2.70±0.729和4.08±1.69mL/小時/kg(針對Advate)以及1.80±0.409和
2.69±1.25mL/小時/kg(針對rFVIIIFc)。Advate與rFVIIIFc的V值相當(dāng)，對于25和
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的V值分別為43.9±4.27和56.1±13.4mL/kg(針
對Advate)以及45.3±7.23和61.6±10.6mL/kg(針對rFVIIIFc)。隨Advate和rFVIIIFc
的劑量逐漸增加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/
kg劑量上的標(biāo)準(zhǔn)差的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。例如，rFVIIIFc處
理組的CV%幾何平均CL值從23.0%(25IU/kg)增加至48.6%(65IU/kg)。
[0292] 除了一級PK參數(shù)外，還測定二級PK參數(shù)(例如K-值、IVR等)以評估效應(yīng)的FVIII持續(xù)時間。對于rFVIIIFc也觀察到PK差異的證據(jù)，證明了與等劑量的Advate相比較TBLP1
和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相當(dāng)。隨著Advate和rFVIIIFc的
劑量逐漸增加，觀察到LBLP1和LBLP3值的略微增加。相反地，隨著Advate和rFVIIIFc的
劑量逐漸增加，注意到平均IVR和K-值的略微減小。如先前所指出的，這些參數(shù)的劑量依
賴性的評估因有限的劑量水平而含糊不清。
和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相當(dāng)。隨著Advate和rFVIIIFc的
劑量逐漸增加，觀察到LBLP1和LBLP3值的略微增加。相反地，隨著Advate和rFVIIIFc的
劑量逐漸增加，注意到平均IVR和K-值的略微減小。如先前所指出的，這些參數(shù)的劑量依
賴性的評估因有限的劑量水平而含糊不清。
[0293] 對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP1分別為2.88±0.733和2.93±0.848IU/dL 每IU/kg(針 對Advate) 以 及 4.28±0.873和 5.16±2.02IU/dL
每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP3分
別為2.06±0.527和2.26±0.666IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.09±0.623和
3.93±1.59IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。
每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP3分
別為2.06±0.527和2.26±0.666IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.09±0.623和
3.93±1.59IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。
[0294] 使用觀察到的Cmax值計算的平均IVR和K-值(扣除基線和模型中的殘留藥物)通常大于使用模型預(yù)測的Cmax值測定的值；與使用單室模型(one-compartment model)
產(chǎn)生的觀察到的峰值活性的略微低估相一致。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)
觀察到的K-值分別為2.57±0.198和2.13±0.598IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及
2.46±0.330和1.85±0.332IU/dL每IU/g(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量
組，平均(±SD)觀察到的IVR值分別為94.1±15.6和85.8±16.5%(針對Advate)以及
89.5±11.9和74.8±6.72%(針對rFVIIIFc)。
產(chǎn)生的觀察到的峰值活性的略微低估相一致。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)
觀察到的K-值分別為2.57±0.198和2.13±0.598IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及
2.46±0.330和1.85±0.332IU/dL每IU/g(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量
組，平均(±SD)觀察到的IVR值分別為94.1±15.6和85.8±16.5%(針對Advate)以及
89.5±11.9和74.8±6.72%(針對rFVIIIFc)。
[0295] 單次劑量藥代動力學(xué)(生色測定法)
[0296] 在Advate或rFVIIIFc的短暫IV輸注后觀察到的FVIII活性急劇升高，對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的Cmax值分別為70.2±9.60和157±38.6IU/
dL(針對Advate)以及70.3±10.0和158±34.7IU/dL(針對rFVIIIFc)。
dL(針對Advate)以及70.3±10.0和158±34.7IU/dL(針對rFVIIIFc)。
[0297] 所有Advate-和rFVIIIFc-處理的患者具有FVIII活性的劑量相關(guān)增加。觀察到的Cmax和AUCINF的增加的程度在評估的劑量范圍內(nèi)比劑量的增加略低。
[0298] 輸注結(jié)束后，觀察到的FVIII活性的下降顯示單指數(shù)衰減直至達(dá)到基線水平。rFVIIIFc的FVIII活性的下降速率比Advate慢，對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)
模型-預(yù)測的消除半衰期值分別為10.7±1.98和10.3±3.27小時(針對Advate)以及
16.2±2.92和19.0±7.94小時(針對rFVIIIFc)。消除半衰期在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行
評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
模型-預(yù)測的消除半衰期值分別為10.7±1.98和10.3±3.27小時(針對Advate)以及
16.2±2.92和19.0±7.94小時(針對rFVIIIFc)。消除半衰期在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行
評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
[0299] 在以25和65IU/kg劑量水平施用rFVIIIFc后，總的全身性FVIII暴露(通過AUCINF評估的)分別比Advate大~53%和84%。對于25和65IU/kg的劑量組，平均(±SD)
模型預(yù)測的AUCINF值分別為1080±236和2320±784小時*IU/dL(針對Advate)以及
1650±408和4280±1860小時*IU/dL(針對rFVIIIFc)。
模型預(yù)測的AUCINF值分別為1080±236和2320±784小時*IU/dL(針對Advate)以及
1650±408和4280±1860小時*IU/dL(針對rFVIIIFc)。
[0300] 與消除半衰期類似，相對于Advater，F(xiàn)VIIIFc的MRT獲得延長。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的MRT值分別為15.3±2.86和14.8±4.72小時(針對
Advate)以及23.4±4.22和27.3±11.4小時(針對rFVIIIFc)。MRT值在對兩種FVIII產(chǎn)
物進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
Advate)以及23.4±4.22和27.3±11.4小時(針對rFVIIIFc)。MRT值在對兩種FVIII產(chǎn)
物進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不依賴于劑量。
[0301] 此外，測定CL和V的一級PK參數(shù)值。rFVIIIFc的CL值僅占對于等劑量的Advate觀察到的CL值的~58-66%。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的
CL值分別為2.39±0.527和3.21±1.40mL/小時/kg(針對Advate)以及1.57±0.349和
1.86±0.970mL/小時/kg(針對rFVIIIFc)。Advate與rFVIIIFc的V值相當(dāng)，對于25和
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的V值分別為5.8±5.52和43.6±11.2mL/kg(針對
Advate)以及35.9±6.65和42.7±8.91mL/kg(針對rFVIIIFc)。隨Advate和rFVIIIFc
的劑量逐漸增加，注意到平均CL和V值的增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/kg劑
量上的標(biāo)準(zhǔn)差的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。
CL值分別為2.39±0.527和3.21±1.40mL/小時/kg(針對Advate)以及1.57±0.349和
1.86±0.970mL/小時/kg(針對rFVIIIFc)。Advate與rFVIIIFc的V值相當(dāng)，對于25和
65IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預(yù)測的V值分別為5.8±5.52和43.6±11.2mL/kg(針對
Advate)以及35.9±6.65和42.7±8.91mL/kg(針對rFVIIIFc)。隨Advate和rFVIIIFc
的劑量逐漸增加，注意到平均CL和V值的增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/kg劑
量上的標(biāo)準(zhǔn)差的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。
[0302] 除了一級PK參數(shù)外，還測定二級PK參數(shù)(例如K-值、IVR等)以評估效應(yīng)的FVIII持續(xù)時間。對于rFVIIIFc也觀察到PK差異的證據(jù)，證明了與等劑量的Advate相比
較TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相當(dāng)。
較TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相當(dāng)。
[0303] 隨著Advate和rFVIIIFc的劑量逐漸增加，觀察到LBLP1和LBLP3值的略微增加。相反地，隨著Advate和rFVIIIFc的劑量逐漸增加，注意到平均IVR和K-值的略微減小。如
先前所指出的，這些參數(shù)的劑量依賴性的評估因有限的劑量水平而含糊不清。
先前所指出的，這些參數(shù)的劑量依賴性的評估因有限的劑量水平而含糊不清。
[0304] 對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP1分別為2.70±0.511和3.09±0.978IU/dL 每IU/kg(針 對Advate) 以 及 4.06±0.798和 5.66±2.38IU/dL
每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP3分
別為1.98±0.377和2.39±0.718IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.04±0.598和
4.44±1.84IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。
每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的TBLP3分
別為1.98±0.377和2.39±0.718IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.04±0.598和
4.44±1.84IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。
[0305] 使用觀察到的Cmax值計算的平均IVR和K-值(扣除基線和模型中的殘留藥物)通常大于使用模型預(yù)測的Cmax值測定的值；與使用單室模型產(chǎn)生的觀察到的峰
值活性的略微低估相一致。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的K-值分
別為3.08±0.429和2.85±0.721IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.12±0.451和
2.92±0.985IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/g劑量組，平均(±SD)
觀察到的IVR值分別為112±14.5和116±26.9%(針對Advate)以及113±16.3和
117±33.6%(針對rFVIIIFc)。
值活性的略微低估相一致。對于25和65IU/kg劑量組，平均(±SD)觀察到的K-值分
別為3.08±0.429和2.85±0.721IU/dL每IU/kg(針對Advate)以及3.12±0.451和
2.92±0.985IU/dL每IU/kg(針對rFVIIIFc)。對于25和65IU/g劑量組，平均(±SD)
觀察到的IVR值分別為112±14.5和116±26.9%(針對Advate)以及113±16.3和
117±33.6%(針對rFVIIIFc)。
[0306] 結(jié)論
[0307] 所有Advate-處理和rFVIIIFc-處理的患者在評估的劑量范圍內(nèi)具有Cmax和AUCINF的劑量相關(guān)增加。通常在輸注結(jié)束后第1小時內(nèi)觀察到Advate和rFVIIIFc的峰
值血漿水平，其在給藥后數(shù)天中仍可被檢測到。在輸注結(jié)束后，基線校正的FVIII活性的下降顯示單指數(shù)衰減直至達(dá)到兩種產(chǎn)品的基線。在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)
消除半衰期和MRT的參數(shù)值表現(xiàn)出不依賴于劑量。隨著Advate和rFVIIIFc的劑量逐漸增
加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/kg劑量上的受
試者間差異性的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。
值血漿水平，其在給藥后數(shù)天中仍可被檢測到。在輸注結(jié)束后，基線校正的FVIII活性的下降顯示單指數(shù)衰減直至達(dá)到兩種產(chǎn)品的基線。在對兩種FVIII產(chǎn)品進(jìn)行評估的劑量范圍內(nèi)
消除半衰期和MRT的參數(shù)值表現(xiàn)出不依賴于劑量。隨著Advate和rFVIIIFc的劑量逐漸增
加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，與有限的劑量水平偶聯(lián)的65IU/kg劑量上的受
試者間差異性的增加使得這些參數(shù)的劑量依賴性的評估含糊不清。
[0308] rFVIIIFc與Advate活性的PK的比較顯示對于相當(dāng)劑量的Advate，rFVIIIFc的全身性暴露增加約48-61%(一步測定法)或53-84%(生色測定法)、清除率減少約30-40%
以及清除半衰期和MRT增加約50-80%。對于rFVIIIFc也觀察到PK差異的證據(jù)，證明了與
等劑量的Advate相比較TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相
當(dāng)。
以及清除半衰期和MRT增加約50-80%。對于rFVIIIFc也觀察到PK差異的證據(jù)，證明了與
等劑量的Advate相比較TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相
當(dāng)。
[0309] 除生色測定產(chǎn)生更高的暴露參數(shù)評估(例如Cmax、AUCINF等)外，獲自生色測定結(jié)果的PK參數(shù)通常與來自一步測定法的PK參數(shù)一致。
[0311] 實施例8
[0312] 基于來自rFVIII:Fc的首次在人中的研究(實施例3)的臨時PK分析，設(shè)計A-LONG研究。A-LONG是重組因子VIII Fc融合物(FVIII:Fc)在先前治療的患有嚴(yán)重血友病A(定
義為<1IU/dL[<1%]內(nèi)源FVIII)的受試者的出血的預(yù)防和治療中的安全性、藥代動力學(xué)和
效率的開放標(biāo)記、多中心評估。
義為<1IU/dL[<1%]內(nèi)源FVIII)的受試者的出血的預(yù)防和治療中的安全性、藥代動力學(xué)和
效率的開放標(biāo)記、多中心評估。
[0313] 約106個受試者被招募入3個方案之一：定制的預(yù)防性方案(arm 1)、每周一次的給藥方案(arm 2)和按需治療方案(arm 3)。
[0314] Arm 1:定制的預(yù)防性方案
[0315] Arm 1可包括總體組和PK亞組。招募了大約66個受試者。初始方案為每周2次，第1天以25IU/kg施用，然后在該周的第4天以50IU/g施用。受試者將在該周預(yù)防法中施
用rFVIIIFc直至rFVIIIFc的PK結(jié)果可獲得。基于這些結(jié)果，將建立每一個個體的定制的
預(yù)防性方案，其中確定劑量和間隔以維持1-3%的波谷水平的FVIII活性。隨后在整個研究
過程中，每一個受試者施用他的單獨定制的預(yù)防性方案。
用rFVIIIFc直至rFVIIIFc的PK結(jié)果可獲得。基于這些結(jié)果，將建立每一個個體的定制的
預(yù)防性方案，其中確定劑量和間隔以維持1-3%的波谷水平的FVIII活性。隨后在整個研究
過程中，每一個受試者施用他的單獨定制的預(yù)防性方案。
[0316] 在整個研究過程中監(jiān)控受試者，進(jìn)行劑量和間隔調(diào)整。僅當(dāng)受試者經(jīng)歷不可接受的出血事件(定義為在滾動的2個月時期內(nèi)超過2次自發(fā)性出血)時進(jìn)行調(diào)整。在該情況
下，調(diào)整將靶向3-5%的波谷水平。
下，調(diào)整將靶向3-5%的波谷水平。
[0317] Arm 2:每周一次給藥的方案
[0318] 大約20個受試者被招募/隨機(jī)化，并且如下經(jīng)歷簡短的rFVIIIFc PK表征：至少96小時的清洗(Washout)；單次劑量的rFVIIIFc 65IU/kg；始于rFVIIIFc當(dāng)天，包括注射
前和從注射開始10(±2)分鐘、3小時(±15分鐘)、72(±2)小時[第3天]和96(±2)小
時[第4天]的簡短取樣。在簡短的PK表征后，受試者可隨后每7天施用一次固定劑量的
65IU/kg rFVIIIFc。
前和從注射開始10(±2)分鐘、3小時(±15分鐘)、72(±2)小時[第3天]和96(±2)小
時[第4天]的簡短取樣。在簡短的PK表征后，受試者可隨后每7天施用一次固定劑量的
65IU/kg rFVIIIFc。
[0319] Arm 3：按需方案
[0320] 在本研究中將評估至少5個受試者的最少10個大手術(shù)。大手術(shù)定義為包括全身麻醉(general anesthesia)和/或呼吸援助的任何手術(shù)過程(選擇的或應(yīng)急的
(emergent))，其中大體腔被穿透并且暴露，或因為該手術(shù)產(chǎn)生了身體或生理功能的重大損傷(例如，剖腹手術(shù)、開胸術(shù)、開顱術(shù)、關(guān)節(jié)置換術(shù)和截肢術(shù))。
(emergent))，其中大體腔被穿透并且暴露，或因為該手術(shù)產(chǎn)生了身體或生理功能的重大損傷(例如，剖腹手術(shù)、開胸術(shù)、開顱術(shù)、關(guān)節(jié)置換術(shù)和截肢術(shù))。
[0321] 為在手術(shù)期間進(jìn)行預(yù)防，每12至24小時利35至50IU/kg rFVIIIFc處理受試者。在手術(shù)之前，醫(yī)生將仔細(xì)研究受試者的rFVIIIFc PK特征并且估量受試者的計劃手術(shù)的類
型和臨床狀態(tài)通常所需的因子VIII替代的劑量方案。在手術(shù)治療期(包括任何康復(fù)時間)
中對rFVIIIFc的適當(dāng)給藥的推薦將考慮這些因素。
型和臨床狀態(tài)通常所需的因子VIII替代的劑量方案。在手術(shù)治療期(包括任何康復(fù)時間)
中對rFVIIIFc的適當(dāng)給藥的推薦將考慮這些因素。
[0322] 本研究的主要目的是(a)評估作為預(yù)防性治療方案、按需治療方案和手術(shù)治療方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性；和(b)評估作為預(yù)防性治療方案、按需治療方案和
手術(shù)治療方案施用的rFVIIIFc的效率。本研究的第二目的是(a)表征rFVIIIFc的PK特征
和比較FVIIIFc與目前市售的產(chǎn)品ADVATE的PK；(b)評估個體對FVIIIFc的反應(yīng)；和(c)
評估FVIIIFc的消耗。
手術(shù)治療方案施用的rFVIIIFc的效率。本研究的第二目的是(a)表征rFVIIIFc的PK特征
和比較FVIIIFc與目前市售的產(chǎn)品ADVATE的PK；(b)評估個體對FVIIIFc的反應(yīng)；和(c)
評估FVIIIFc的消耗。
[0323] 主要目的
[0324] ·評估作為預(yù)防性治療方案、每周一次的治療方案、按需治療方案和手術(shù)治療方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性
[0325] ·評估作為定制的預(yù)防性治療方案、按需治療方案和手術(shù)治療方案施用的rFVIIIFc的效率
[0326] 次要目的
[0327] ·表征rFVIIIFc的PK特征和比較FVIIIFc與目前市售的產(chǎn)品 的PK
[0328] ·評估個體對rFVIIIFc的反應(yīng)
[0329] ·表征足以在預(yù)防性方案中預(yù)防出血所需的劑量范圍和時間安排；維持外科設(shè)置的動態(tài)平衡；或以按需、每周一次的治療或預(yù)防性設(shè)置治療出血事件
[0330] ·評估rFVIIIFc的消耗(例如，總的年rFVIIIFc消耗/受試者)
[0331] 實施例9
[0332] 臨床ROTEM評估
[0333] 在實施例8中的研究中，除通過一步活化部分凝血活酶時間(one-stageactivated partial thromboplastin time)(aPTT)測定法對血漿FVIII活性的測量外，
還已開發(fā)了全血旋轉(zhuǎn)血栓彈力測定法(whole blood rotational thromboelastometry)
(ROTEM)來評估2個受試者中(具體地，1個在低劑量組群中，1個在高劑量組群中)由
rFVIIIFc和Advate產(chǎn)生的全局止血(global hemostasis)的提高。
還已開發(fā)了全血旋轉(zhuǎn)血栓彈力測定法(whole blood rotational thromboelastometry)
(ROTEM)來評估2個受試者中(具體地，1個在低劑量組群中，1個在高劑量組群中)由
rFVIIIFc和Advate產(chǎn)生的全局止血(global hemostasis)的提高。
[0334] 當(dāng)在rFVIIIFc治療之前摻入受試者的血液時，rFVIIIFc和Advate在血塊形成中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)幕钚?。凝血時間(CT)在約1%至100%的正常的范圍內(nèi)與rFVIIIFc和Advate
的劑量線性相關(guān)，并且在相同的受試者中rFVIIIFc與Advate的劑量反應(yīng)是相當(dāng)?shù)摹?br>
的劑量線性相關(guān)，并且在相同的受試者中rFVIIIFc與Advate的劑量反應(yīng)是相當(dāng)?shù)摹?br>
[0335] 在用Advate，隨后用rFVIIIFc給藥后，在不同時間點上對檸檬酸化全血采樣，然后利用ROTEM監(jiān)控復(fù)鈣(recalcification)后血塊形成。盡管可變基線CT歸因于Advate
和rFVIIIFc給藥前殘留的FVIII水平，但兩種產(chǎn)品都在注射后30分鐘將CT有效地校正至
可比較水平。此外，CT的改善在25IU/kg的rFVIIIFc注射時和注射后3小時相對于Advate
在以該低劑量給藥的受試者中持續(xù)更久。然而，在65IU/kg劑量上rFVIIIFc對Advate的
差異改善幾乎看不出來。
和rFVIIIFc給藥前殘留的FVIII水平，但兩種產(chǎn)品都在注射后30分鐘將CT有效地校正至
可比較水平。此外，CT的改善在25IU/kg的rFVIIIFc注射時和注射后3小時相對于Advate
在以該低劑量給藥的受試者中持續(xù)更久。然而，在65IU/kg劑量上rFVIIIFc對Advate的
差異改善幾乎看不出來。
[0336] 表
[0337] 表1:多核苷酸序列
[0338] A.B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIIIFc
[0339] (i)B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIIIFc鏈DNA序列(FVIII信號肽用下劃線標(biāo)示，F(xiàn)c區(qū)用粗體標(biāo)示)(SEQ ID NO:1，其編碼SEQ ID NO:2)
[0340]
[0341]
[0342] (ii)Fc DNA序列(小鼠Igκ信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:3，其編碼SEQ IDNO:4)
[0343]
[0344] B.F全長FVIIIFc
[0345] (i)全長FVIIIFc DNA序列(FVIII信號肽用下劃線標(biāo)示，F(xiàn)c區(qū)用粗體標(biāo)示)(SEQID NO:5，其編碼SEQ ID NO:6)
[0346]
[0347]
[0348]
[0349] (ii)Fc(與A(ii)(SEQ ID NO:3)相同的序列)]
[0350] C.
[0351] (i)重鏈(HC)-Fc DNA序列(HC與Fc之間無接頭)(信號肽用下劃線標(biāo)示，F(xiàn)c區(qū)用粗體標(biāo)示)(SEQ ID NO:7，其編碼SEQ ID NO:8)
[0352]
[0353]
[0354] C.
[0355] (ii)重鏈(HC)-Fc DNA序列(HC與Fc之間的5個氨基酸的接頭)(信號肽用下劃線標(biāo)示，F(xiàn)c區(qū)以粗體標(biāo)示,5個氨基酸的接頭用雙下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:9，其編碼SEQ
ID NO:10)
ID NO:10)
[0356]
[0357]
[0358] C.
[0359] (iii)輕鏈(LC)-Fc DNA序列(信號肽用下劃線標(biāo)示，F(xiàn)c區(qū)用粗體標(biāo)示)(SEQ IDNO:11，其編碼SEQ ID NO:12)
[0360]
[0361]
[0362] 表2:多肽序列
[0363] A.B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII-Fc單體雜交體(BDD FVIIIFc單體二聚體):通過表達(dá)BDD FVIIIFc和Fc鏈產(chǎn)生的。
[0364] 構(gòu)建體=HC-LC-Fc融合物。將Fc表達(dá)盒與BDDFVIII-Fc一起共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生BDDFVIIIFc單體-。對于BDD FVIIIFc鏈，F(xiàn)c序列以粗體顯示；HC序列用雙下劃線顯示；剩下
的B結(jié)構(gòu)域序列以斜體字顯示。信號肽用下劃線標(biāo)示。
的B結(jié)構(gòu)域序列以斜體字顯示。信號肽用下劃線標(biāo)示。
[0365] i)B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII-Fc鏈(19個氨基酸序列用下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:2)
[0366]
[0367] ii)Fc鏈(來自小鼠Igκ鏈20個氨基酸的異源信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ IDNO:4)
[0368]
[0369] B.全長FVIIIFc單體雜交體(全長FVIIIFc單體二聚體):通過表達(dá)FVIIIFc和Fc鏈產(chǎn)生的。
[0370] 構(gòu)建體=HC-B-LC-Fc融合物。將Fc表達(dá)盒與全長FVIII-Fc一起共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生全長FVIIIFc單體。對于FVIIIFc鏈，F(xiàn)c序列以粗體顯示；HC序列用雙下劃線顯示；B結(jié)構(gòu)域
序列以斜體字顯示。信號肽以下劃線標(biāo)示。
序列以斜體字顯示。信號肽以下劃線標(biāo)示。
[0371] i)全長FVIIIFc鏈(FVIII信號肽用下劃線標(biāo)示(SEQ ID NO:6)
[0372]
[0373]
[0374] ii)Fc鏈(來自小鼠Igκ鏈的20個氨基酸的異源信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ IDNO:4)
[0375]
[0376] C.FVIII-Fc異二聚體雜交體
[0377] 這可通過共轉(zhuǎn)染HC-Fc和LC-Fc構(gòu)建體來產(chǎn)生。已制備了兩個HC-Fc構(gòu)建體。一個在HC與Fc之間不具有接頭(HC-Fc)，而另一個在HC與Fc之間具有5個氨基酸的接頭
(HC+5-Fc)。將FVIII信號肽用于HC-Fc構(gòu)建體，然而將小鼠Igκ信號序列用于LC-Fc構(gòu)
建體。
(HC+5-Fc)。將FVIII信號肽用于HC-Fc構(gòu)建體，然而將小鼠Igκ信號序列用于LC-Fc構(gòu)
建體。
[0378] (i)HC-Fc (Fc以粗體顯示，信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:8)
[0379]
[0380] (ii)HC+5-Fc (Fc序列以粗體顯示，5個氨基酸的接頭序列(來自FVIII的B結(jié)構(gòu)域)以斜體字顯示，信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:10)
[0381]
[0382]
[0383] (iii)LC-Fc6His(Fc序列以粗體顯示，信號肽用下劃線標(biāo)示)(SEQ ID NO:12)
[0384]
[0385] 表3.在單次50IU/kg rFVIIIFc或 的靜脈內(nèi)劑量后血友病A小鼠中的全血凝固時間(WBCT)測定.
[0386] A.
[0387]
[0388] ND=由于先前時間點超過60分鐘而未被測定的
[0389] B.
[0390]
[0391] ND=由于先前時間點超過60分鐘而未被測定的
[0392] 表4.單次靜脈內(nèi)劑量(50IU/kg)后血友病A小鼠中的PK參數(shù)
[0393]
[0394] 表5.單次靜脈內(nèi)劑量(125IU/kg rFVIIIFc,114和120IU/kg )后血友病A狗中的PK參數(shù)
[0395] A.從生色活性數(shù)據(jù)測定的PK
[0396]
[0397] B.從ELISA數(shù)據(jù)測定的PK
[0398]
[0399] 平均值±sd,n=4(針對rFVIIIFc),
[0400] *由于只有兩只狗，款報告 的sd
[0401] 表6.用rFVIIIFc或 單次靜脈內(nèi)給藥后通過aPTT測量的血友病A狗中的凝血活性。
[0402]
[0403] 表7.通過ELISA測量的以125IU/kg的單次靜脈內(nèi)劑量施用的猴中rFVIIIFc或Xyntha的血漿濃度
[0404] A.血漿中的rFVIIIFc濃度(μg/mL)
[0405]
[0406] B.血漿中的Xyntha濃度(μg/mL)
[0407]
[0408] 表8.施用了125IU/kg的單次靜脈內(nèi)劑量的猴的rFVIIIFc或Xyntha的血漿濃度，通過FVIII-特異性生色活性測定測量的(以IU/mL報告)。
[0409] A.Xyntha
[0410]
[0411] B.rFVIIIFc
[0412]
[0413] BLQ=低于定量限
[0414] 表9.單次125IU/kg劑量后rFVIIIFc的PK參數(shù)
[0415]
[0416]
[0417] 表10.單次IV劑量(125IU/kg)后Xyntha的PK參數(shù)
[0418]
[0419]
[0420] 表11.因子X的激活
[0421]Km(nM) Vmax(nM/分鐘)
rFVIIIFc 55.0±5.9 65.6±8.6
BDD FVIII 51.0±8.7 73.5±10.1
rFVIIIFc 55.0±5.9 65.6±8.6
BDD FVIII 51.0±8.7 73.5±10.1
[0422] 表12.與因子IXa的相互作用
[0423]Kd(nM) Vmax(nM/分鐘)
rFVIIIFc 2.8±0.4 4.5±0.3
BDD FVIII 2.5±0.3 4.0±1.0
rFVIIIFc 2.8±0.4 4.5±0.3
BDD FVIII 2.5±0.3 4.0±1.0
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