白丝美女被狂躁免费视频网站,500av导航大全精品,yw.193.cnc爆乳尤物未满,97se亚洲综合色区,аⅴ天堂中文在线网官网

首頁(yè) / 專利庫(kù) / 病理 / 神經(jīng)退行性變 / 肽在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诤蜕窠?jīng)退行性變起重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病的局部治療中的應(yīng)用

肽在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诤?a href='/zhuanli/list-23563-1.html' target='_blank'>神經(jīng)退行性變起重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病的局部治療中的應(yīng)用

閱讀：240發(fā)布：2020-05-13

專利匯可以提供肽在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诤?a href='/zhuanli/list-23563-1.html' target='_blank'>神經(jīng)退行性變起重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病的局部治療中的應(yīng)用專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及用于 視網(wǎng)膜 神經(jīng)退行性 疾病 ，特別是糖尿病視網(wǎng)膜病變的局部 治療 和/或 預(yù)防 的肽，所述肽的序列長(zhǎng)度為13-50個(gè) 氨 基酸，所述肽的N-端主要包含序列HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4(SEQ ID NO：1)，其中：Xaa1是選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；Xaa2是選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸；Xaa3是選自絲氨酸和賴氨酸的氨基酸；Xaa4是選自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；且組氨酸是N-末端殘基。本發(fā)明也包括用于這些疾病的局部治療和/或預(yù)防的 局部用藥 物組合物。，下面是肽在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诤?a href='/zhuanli/list-23563-1.html' target='_blank'>神經(jīng)退行性變起重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病的局部治療中的應(yīng)用專利的具體信息內(nèi)容。

1.序列長(zhǎng)度為13-50個(gè)氨基酸的肽，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部治療和/或預(yù)防，所述肽的N-端區(qū)域主要包含下述序列：
1 2 3 4
HXaaEGTFTSDXaaSXaaXaa(SEQ ID NO：1)，其中：
1
Xaa是選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；
2
Xaa是選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸；
3
Xaa是選自絲氨酸和賴氨酸的氨基酸；
4
Xaa是選自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；以及
組氨酸是N-末端殘基。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用的肽，其中所述序列長(zhǎng)度為30-40個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病選自：糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病為糖尿病視網(wǎng)膜病變。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用的肽，其用于糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙陔A段的局部治療。
1 2 3
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中Xaa 是丙氨酸，Xaa 是纈氨酸，Xaa 是
4
絲氨酸，Xaa是酪氨酸。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其是哺乳動(dòng)物胰高血糖素樣肽-1。
8.如權(quán)利要求7所述應(yīng)用的肽，其是氨基酸序列為SEQ ID NO：2的人胰高血糖素樣肽-1(7-37)。
9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：3的肽：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG，
其中所述賴氨酸殘基(K)包括通過酰胺連接與賴氨酸側(cè)鏈的氨基相連的親脂性取代ε α
基N –(γ-谷酰基(N –十六烷?；?)。
1 2 3
10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中Xaa 是甘氨酸，Xaa 是亮氨酸，Xaa
4
是賴氨酸，Xaa是谷氨酰胺。
11.如權(quán)利要求10所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：4的肽：
5
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa，其中
5
Xaa是-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的絲氨酸殘基。
12.如權(quán)利要求10所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：8的肽：
6
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXa a，其中
6
Xaa是-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的賴氨酸殘基。
13.局部用藥物組合物，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部治療和/或預(yù)防，其包括權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的肽。
14.如權(quán)利要求13所述應(yīng)用的局部用藥物組合物，其選自：溶液、面霜、洗液、藥膏、乳劑和懸浮液。
15.如權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的局部用藥物組合物，其是滴眼液。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的局部用藥物組合物，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病選自：糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的局部用藥物組合物，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變。
1.序列長(zhǎng)度為13-50個(gè)氨基酸的肽，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部眼部治療和/或預(yù)防，所述肽能夠到達(dá)視網(wǎng)膜且其N-端區(qū)域主要包含下述序列：
1 2 3 4
HXaaEGTFTSDXaaSXaaXaa(SEQ ID NO：1)，其中：
1
Xaa是選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；
2
Xaa是選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸；
3
Xaa是選自絲氨酸和賴氨酸的氨基酸；
4
Xaa是選自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；以及
組氨酸是N-末端殘基。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用的肽，其中所述序列長(zhǎng)度為30-40個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病選自：糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病為糖尿病視網(wǎng)膜病變。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用的肽，其用于糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙陔A段的局部治療。
1 2 3
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中Xaa 是丙氨酸，Xaa 是纈氨酸，Xaa 是
4
絲氨酸，Xaa是酪氨酸。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其是哺乳動(dòng)物胰高血糖素樣肽-1。
8.如權(quán)利要求7所述應(yīng)用的肽，其是氨基酸序列為SEQ ID NO：2的人胰高血糖素樣肽-1(7-37)。
9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：3的肽：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG，
其中所述賴氨酸殘基(K)包括通過酰胺連接與賴氨酸側(cè)鏈的氨基相連的親脂性取代ε α
基N –(γ-谷?；?N –十六烷?；?)。
1 2 3
10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的肽，其中Xaa 是甘氨酸，Xaa 是亮氨酸，Xaa
4
是賴氨酸，Xaa是谷氨酰胺。
11.如權(quán)利要求10所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：4的肽：
5
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa，其中
5
Xaa是-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的絲氨酸殘基。
12.如權(quán)利要求10所述應(yīng)用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ ID NO：8的肽：
6
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXa a，其中
6
Xaa是-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的賴氨酸殘基。
13.局部眼用藥物組合物，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部眼睛治療和/或預(yù)防，其包括權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的肽。
14.如權(quán)利要求13所述應(yīng)用的局部眼用藥物組合物，其選自：溶液、面霜、洗液、藥膏、乳劑和懸浮液。
15.如權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的局部眼用藥物組合物，其是滴眼液。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的局部眼用藥物組合物，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病選自：糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。

說明書全文

肽在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是在糖尿病視網(wǎng)膜病變

早期和神經(jīng)退行性變起重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病的局部

治療中的應(yīng)用

[0001] 本發(fā)明涉及可能導(dǎo)致部分或全部失明的眼部疾病的醫(yī)治方法領(lǐng)域。本發(fā)明提供可局部用于眼部的有用工具，包括肽和這些肽的類似物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病指以漸進(jìn)的神經(jīng)元丟失為特征的視網(wǎng)膜病況。糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎被認(rèn)為是神經(jīng)退行性變?cè)谄渲衅鹬匾饔玫囊暰W(wǎng)膜疾病。
[0004] 可 以 從 Schmidt et al.,“Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery”,Current Neuropharmacology–2008,Vol.No.6,pp.:164-178摘選對(duì)這些疾病、它們的關(guān)鍵部位的深入分析以及保護(hù)的可能方法和恢復(fù)的方法。
[0005] 糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，并且在發(fā)達(dá)國(guó)家仍是工作年齡個(gè)體失明的主要原因?，F(xiàn)有的DR的治療如激光光凝術(shù)、皮質(zhì)類固醇或抗-VEGF藥劑的玻璃體內(nèi)注射的病征在該疾病的太晚期階段才顯示，并與顯著的副作用有關(guān)。
[0006] 糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)通常被認(rèn)為是視網(wǎng)膜微循環(huán)疾病。然而，有些數(shù)據(jù)顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變是DR發(fā)病機(jī)理中的早期事件，其參與在DR中發(fā)生的微循環(huán)異
常，這可以從代表“糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谥委煹臍W洲聯(lián)盟”(EUROCONDOR)的Simó et al.“Neurodegeneration is an early event in diabetic retinopathy:therapeutic implications”,Br.J.Ophthalmol.–2012,vol.96,pp.1285-1290中推理得出。
[0007] 在DR中，神經(jīng)退行性變(有效神經(jīng)元的丟失)發(fā)生在疾病的早期階段，并引起功能異常如辨色力和對(duì)比靈敏度的喪失。這些改變可通過對(duì)糖尿病患者的電生理學(xué)研究來檢測(cè)，即使其患糖尿病的時(shí)間少于兩年，即在可通過眼科檢查檢測(cè)到微血管損傷之前。此外，延遲的多焦ERG(視網(wǎng)膜電圖)隱式時(shí)間(mfERG-IT)預(yù)測(cè)了早期微血管異常的發(fā)生。而且，神經(jīng)視網(wǎng)膜退變啟動(dòng)和/或激活了一些代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路將參與微血管病過程以及血視網(wǎng)膜屏障的破壞(DR發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵部分)。
[0008] 目前，并未對(duì)與發(fā)病機(jī)理有關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)退行性變的早期階段進(jìn)行治療，盡管其能夠防止早期病變，如導(dǎo)致視網(wǎng)膜新血管化的微循環(huán)問題。因此在早期階段，特別是DR，沒有進(jìn)行治療，而是進(jìn)行患者的標(biāo)準(zhǔn)隨訪。
[0009] 另一方面，當(dāng)把這些視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的早期階段作為治療目標(biāo)時(shí)，建議積極的治療(例如激光光凝術(shù)或玻璃體內(nèi)注射)將是不可想象的。迄今為
止，不認(rèn)為滴眼液的使用是施用藥物以預(yù)防或阻止DR的好途徑。這是因?yàn)槿鏤rtti A et al.,“Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery”.Adv.Drug.Deliv.Rev.2006,vol.58,pp.1131-1135中聲明的：通常認(rèn)為它們不能到達(dá)
眼后段(即玻璃體和視網(wǎng)膜)。盡管存在少量證據(jù)證明，在角膜中施用的組合物能夠到
達(dá)視網(wǎng)膜，但是它們代表的是孤立事件，并且對(duì)應(yīng)于低分子量的組合物，如Aiello et al.,“Targeting Intraocular Neovascularization and Edema–One Drop at a Time”,N.Eng.J Med–2008,vol.359,pp.967-969中提到的那些。Aiello et al.顯示，在兩個(gè)不同的測(cè)試中，一種由吡咯烷衍生來的化合物(名為TG100572，4-氯-3-(5-甲基-3-{[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]氨基}-1,2,4-苯并三嗪-7-基)苯酚)，一旦以滴眼液的形式
施用就能夠到達(dá)視網(wǎng)膜靶點(diǎn)，該化合物具有作為涉及新血管產(chǎn)生和視網(wǎng)膜水腫的激酶的抑制劑而發(fā)揮作用的能力。盡管如此，這一小分子化合物不能與其它天然存在的化合物進(jìn)行比較，如具有高分子量的肽或蛋白。
[0010] 糖尿病是具有高血糖癥特征的一組慢性疾病。為了預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，使用血糖降低劑降低高血糖是必不可少的。因此，任何葡萄糖降低藥物對(duì)預(yù)防或阻止糖尿病并發(fā)癥(包括DR)都可能在理論上是有益的。然而，缺少關(guān)于抗糖尿病劑不依賴于其對(duì)血糖水平的降低作用而對(duì)DR有直接效果的信息。通過舉例說明的方式，使用被稱為艾塞那肽(Byeta,Amylin Pharmaceuticals)和利拉魯肽(Victoza,Novo Nordisk)的胰高血糖素樣肽-1激動(dòng)劑，通過促進(jìn)血糖水平的降低來治療2-型糖尿病。此外，已知這些激動(dòng)劑引起代謝綜合癥相關(guān)疾病如肥胖和高血壓的改善。專利申請(qǐng)文件WO2007062434也公開了一種鼻內(nèi)施用的藥物組合物，其中遞送同樣的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)來治療代謝綜合癥和糖尿病并發(fā)癥，包括DR。
[0011] 根據(jù)以上所述，由于疾病的主要原因或起因，特別是血液中高水平的葡萄糖，在最終的實(shí)例中得到了改善，因而已知施用此種胰高血糖素樣肽-1激動(dòng)劑也可改善或減輕DR癥狀。盡管如此，這些治療并未消除系統(tǒng)性副作用。此外，如果這些物質(zhì)必須以治療有效濃度到達(dá)視網(wǎng)膜就需要高劑量，因而增強(qiáng)了副作用。
[0012] 在 Zhang et al.,“Intravitreal injection of exendin-4 analogueprotects retinal cells in early diabetic rats”,Invest Ophthalmol Vis
Sci.-2011,vol.52(1),pp.278-85中公開的一項(xiàng)研究顯示，在體內(nèi)模型中由GLP-1R激活介導(dǎo)了神經(jīng)保護(hù)。作者報(bào)道，在患有鏈脲霉素(STZ)引起的糖尿病的大鼠中，玻璃體內(nèi)施用毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽)預(yù)防了與神經(jīng)退行性變有關(guān)的視網(wǎng)膜電圖(ERG)異常和形態(tài)學(xué)特征。然而，不能輕易地將Zhang et al.研究中的結(jié)果推測(cè)到人DR(或具有視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的其它疾病)。首先，由于在STZ-DM模型中，對(duì)結(jié)果的解釋可能受STZ神經(jīng)毒性作用的影響。第二，盡管在大鼠視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)了GLP-1R的表達(dá)，但是這在人視網(wǎng)膜中還未有在先報(bào)道。最后，如上文提到的，對(duì)在眼底檢查中僅有極少(如果有)微血管異常的患者實(shí)施玻璃體內(nèi)注射是不合適且有侵襲性的。
[0013] 目前，對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病沒有特定的治療方法。具體以DR為例，這意味著對(duì)于背景性視網(wǎng)膜病變或非增殖性DR，沒有特定的治療方法，也沒有保護(hù)神經(jīng)視網(wǎng)膜免受損傷(導(dǎo)致神經(jīng)元丟失)的具體方法。因此，當(dāng)神經(jīng)退行性變看上去要開始時(shí)，需要新的藥物治療方法用于該疾病早期階段。在減緩向需要積極治療(如外科手術(shù))晚期階段的發(fā)展中，DR的早期治療將是有效的。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一些肽(所有這些肽均在N-端區(qū)域具有相同的特定序列)以及包含所述肽的組合物，盡管它們分子量很高，但當(dāng)在眼部局部施用時(shí)(即在角膜或結(jié)膜穹窿)它們能夠到達(dá)視網(wǎng)膜，并且也能保護(hù)和預(yù)防視網(wǎng)膜退變。這些化合物作為視網(wǎng)膜(特別是神經(jīng)視網(wǎng)膜，它是視網(wǎng)膜的一部分，包括神經(jīng)元但不包括視網(wǎng)膜的色素上皮)的局部神經(jīng)保護(hù)劑起作用。
[0016] 應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)局部施用根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的肽，不僅到達(dá)了視網(wǎng)膜，也達(dá)到了阻止糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的有效濃度。
[0017] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及序列長(zhǎng)度為13-50個(gè)氨基酸的肽，其應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部治療和/或預(yù)防，所述肽的N-端區(qū)域主要包含下述序列：
[0018] HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4(SEQ ID NO:1)，其中：
[0019] Xaa1是選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；
[0020] Xaa2是選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸；
[0021] Xaa3是選自絲氨酸和賴氨酸的氨基酸；
[0022] Xaa4是選自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；和
[0023] 組氨酸是N末端殘基；
[0024] 局部治療和/或預(yù)防是局部眼部治療和/或預(yù)防，由于當(dāng)局部施用于眼部時(shí)所述肽能夠到達(dá)視網(wǎng)膜這一事實(shí)，因而是在眼部表面(即在角膜或結(jié)膜穹窿)。這適用于本發(fā)明公開的任何實(shí)施方案和實(shí)施方案的組合。
[0025] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1Rc)存在于人視網(wǎng)膜中，并且與所有在先假設(shè)相反，它們能夠證明分子量為3.35kDa-4.18kDa的天然存在的肽物質(zhì)，當(dāng)局部施用于眼部(即，在角膜)時(shí)，能夠到達(dá)視網(wǎng)膜。因而，發(fā)明人建議局部施用(局部眼部施用)包含30-40個(gè)氨基酸且包含SEQ ID NO：1的肽，該序列被認(rèn)為負(fù)責(zé)GLP-1Rc的激活，并且也存在于哺乳動(dòng)物GLP-1中。
[0026] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)，分子量大于1kDa的分子一旦被局部施用于角膜表面將能夠到達(dá)視網(wǎng)膜，這是出乎意料的。
[0027] GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)是在應(yīng)答食物時(shí)由胃腸道L細(xì)胞分泌的內(nèi)源性促胰島素肽(“腸促胰島素反應(yīng)”)。GLP-1通過與它的受體(GLP-1Rc)徹底反應(yīng)，對(duì)葡萄糖依賴性胰島素分泌、胰島素基因表達(dá)、胰島β細(xì)胞再生、胃腸蠕動(dòng)、能量平衡和食物攝取有強(qiáng)大的影響。GLP-1受體(GLP-1Rc)是肽激素結(jié)合類B1(分泌素樣受體)家族的成員，該家族具有七個(gè)跨膜異源三聚體G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)。GLP-1Rs分布廣泛，它們被發(fā)現(xiàn)存在于胰腺、脂肪組織、肌肉、心臟、胃腸道和肝臟中。此外，GLP-1Rs被發(fā)現(xiàn)遍及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(即，下丘腦、紋狀體、腦干、黑質(zhì)和室管膜下層)，并且也有一些證據(jù)證明，在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中受GLP-1刺激的GLP-1R發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[0028] 人GLP是具有37個(gè)氨基酸殘基的肽，其來源于在回腸末端L細(xì)胞、胰腺和腦中合成的前胰高血糖素原。人前胰高血糖素原鑒別于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)P01275，2007年2月6日；第3版。對(duì)前胰高血糖素原進(jìn)行處理以產(chǎn)生GLP-1(7-36)氨基化合物、GLP-1(7-37)和GLP-2主要發(fā)生在L細(xì)胞。使用一個(gè)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)來描述肽的片段和類似物。因此，例如，8
Gly-GLP-1(7-37)代表GLP-1的一個(gè)片段(類似物)，其通過缺失Nos.1-6位的氨基酸殘
基以及用Gly取代第8位的天然存在的氨基酸殘基(Ala)而形式上衍生自GLP-1。類似地，
34 ε
Lys (N –十四烷?；?-GLP-1(7-37)代表GLP-1(7-37)，其中在34位的Lys殘基的ε-氨基被十四烷?；?br>
[0029] 因此，與所有偏見相反，發(fā)明人通過將其局部施用或作為局部組合物(即局部眼用組合物)的組分，提供可以到達(dá)視網(wǎng)膜并在此發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的肽，解決了眼科領(lǐng)域的長(zhǎng)期需要。此外，這些組合物的局部施用將它們的作用局限于眼部，并將相關(guān)的系統(tǒng)性副作用降低至最小。
[0030] 由于該肽的神經(jīng)保護(hù)作用，本發(fā)明的這一方面也可表述為肽在制備視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的治療和/或預(yù)防(指局部眼部治療和/或預(yù)防)，特別是對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病早期階段視網(wǎng)膜的治療和/或預(yù)防，特別是DR早期階段的治療和/或預(yù)防的藥物中的應(yīng)用，其中所述肽序列長(zhǎng)度為13-50個(gè)氨基酸，并且在其N端區(qū)域包括如上所述的主要包
1 2 3 4
含HXaaEGTFTSDXaaSXaaXaa(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。本發(fā)明也涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)退
行性疾病的治療和/或預(yù)防的方法，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病早期階段的神經(jīng)保護(hù)，特別是DR早期階段的治療和/或預(yù)防的方法，所述方法包括向需要的對(duì)象(包括人)施用(指在眼部局部施用)治療有效量的肽和藥物可接受的賦形劑和/或載體，所述肽序列長(zhǎng)度
1 2 3 4
為13-50個(gè)氨基酸，且其N端區(qū)域包括如上所述的主要包含HXaaEGTFTSDXaaSXaaXaa(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
附圖說明
[0031] 圖1表示特定視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病—糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)(早期階段和晚期階段)以及根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)用于每個(gè)階段的治療方法的示意圖。水平箭頭代表時(shí)間(任意單位)，血液中葡萄糖水平隨其的增加是可檢測(cè)的(糖尿病或高血糖水平)?！胺荄R”指正常眼部檢查(沒有微動(dòng)脈瘤、微量出血或滲出物)；“NPDR”指非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變；
“DMO”指糖尿病黃斑水腫；“CapOc”指毛細(xì)血管閉塞，“PDR”指增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變；
“PHC”指光凝術(shù)；“IVTR”指玻璃體內(nèi)注射；“VTR”指玻璃體切除術(shù)。術(shù)語新生血管指新生成的血管。
[0032] 圖2顯示人體組織樣本中GLP-1受體的表達(dá)。圖A是柱形圖，其中通過定量實(shí)時(shí)PCR分析GLP-1受體mRNA的相對(duì)量。在圖B中，人神經(jīng)視網(wǎng)膜切片的光學(xué)顯微鏡圖像(20×)清楚地暴露了在光感受器段(PR)受體的存在(用粗箭頭表示)?！癘NL”指外核層；“INL”指內(nèi)核層；“GCL”指神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，它們?nèi)渴巧窠?jīng)視網(wǎng)膜的基本部分。
[0033] 圖3涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)，是視網(wǎng)膜切片(載玻片(slide))的顯微圖像(Olympus顯微鏡)，其中將膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的存在作為膠質(zhì)細(xì)胞激活的指示因子進(jìn)行評(píng)估。它顯示用GLP-1(7-37)類似物(是GLP-1R激動(dòng)劑)(左圖，測(cè)試，T)處理的糖
尿病小鼠和用媒介物處理的糖尿病小鼠(右圖，對(duì)照，C)的代表性樣本之間在視網(wǎng)膜中的GFAP免疫反應(yīng)性的比較(箭頭)。將細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記。ONL：外核層；INL：內(nèi)核層；GCL：
神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。
[0034] 圖4也涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)，是柱形圖，顯示了TUNEL檢測(cè)的結(jié)果。圖A顯示了用GLP-1(7-37)類似物(是GLP-1R激動(dòng)劑)(測(cè)試，T，n＝10)處理的糖尿病小鼠和用媒介物處理(對(duì)照，C，n＝10)的糖尿病小鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的
百分比(％)。圖B顯示了來用GLP-1R激動(dòng)劑(T)處理的糖尿病小鼠和用媒介物(對(duì)照，
C)處理的糖尿病小鼠的全部神經(jīng)視網(wǎng)膜中TUNEL陽(yáng)性的免疫熒光。A.U.：任意單位。結(jié)果為平均值±SD。*p<0.05。
[0035] 圖5也涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)，是柱形圖，顯示來自用GLP-1R激動(dòng)劑(T)處理的糖尿病小鼠和用媒介物(對(duì)照，C)處理的糖尿病小鼠的全部神經(jīng)視網(wǎng)膜中谷氨酸免疫熒光(圖A)和GLAST免疫熒光(圖B)的結(jié)果。A.U.：任意單位。結(jié)果為平均值±SD。*p<0.05。
[0036] 發(fā)明詳述
[0037] 為了理解，包含下述定義。
[0038] 在本發(fā)明中，術(shù)語“神經(jīng)保護(hù)”指可使用的任何種類的治療或預(yù)防方法，所述方法使組成神經(jīng)視網(wǎng)膜的神經(jīng)元處在保護(hù)中并且相對(duì)于健康對(duì)象動(dòng)物(包括人)而言處于生理狀態(tài)?！吧窠?jīng)視網(wǎng)膜”是視網(wǎng)膜的一部分，包括神經(jīng)元且不包括視網(wǎng)膜色素上皮。神經(jīng)視網(wǎng)膜負(fù)責(zé)視覺循環(huán)。
[0039] 表述“在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙陔A段的神經(jīng)保護(hù)”涉及在確定DR晚期階段(前增殖性或增殖性DR)之前實(shí)施的任何治療或預(yù)防方法。
[0040] 對(duì)于“糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期階段”，其應(yīng)被理解為下述時(shí)間，在該時(shí)間，由于糖尿病的存在，眼部可以檢測(cè)到功能異常(即辨色力、對(duì)比靈敏度和視網(wǎng)膜電圖異常)，但還不能完全確定DR微血管的變化模式，即不能觀察到前增殖性或增殖性DR的典型損傷。
[0041] “人胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺(GLP-1(7-36)酰胺)”和“人胰高血糖素樣肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))”涉及衍生自人胰高血糖素原的片段，其分別包括所述人胰高血糖素原氨基酸序列的氨基酸7-36或氨基酸7-37。
[0042] 作為“人GLP-1(7-37)類似物”，其應(yīng)被理解為一種肽，其中GLP-1(7-37)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被其它的氨基酸殘基取代，和/或其中GLP-1(7-37)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被加至GLP-1(7-37)。
[0043] 本文使用的表述“治療有效量”指當(dāng)施用化合物時(shí)，足夠阻止被處理疾病的一種或多種癥狀的發(fā)展或?qū)⑵錅p輕至一定程度的化合物的量。根據(jù)本發(fā)明施用的化合物的具體劑量當(dāng)然由圍繞該事件的具體情況確定，包括所施用的化合物、給藥途徑、所治療的具體病況和類似的考慮。
[0044] 本文使用的術(shù)語“藥物可接受的”包括化合物、材料、組合物和/或在合適的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的劑型，所述劑型適合與對(duì)象(如人)的組織接觸使用，且沒有顯著的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，其與合理的效果/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)。從與藥物組合物其它材料相容的意義來說，每種載體、賦形劑等也必須是“可接受的”。它也必須適合與人體或動(dòng)物組織接觸使用，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)、免疫原性或與合理的效果/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)?shù)钠渌鼏栴}或并發(fā)癥。合適的載體、賦形劑等可以從標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)教材中找到，并且以舉例說明的方式，其包括防腐劑、粘著劑、濕潤(rùn)劑、潤(rùn)膚劑和抗氧化劑。
[0045] “N-端區(qū)域”或“N-端”(也被稱為氨基端、NH2-端、N末端或胺端，在此它們?nèi)孔鳛榭苫Q的表述使用)指以含有自由胺基(-NH2)的氨基酸終止的蛋白或多肽的起點(diǎn)。書寫肽序列的習(xí)慣是將N-端置于左側(cè)，且從N-端至C-端書寫序列。當(dāng)?shù)鞍子尚攀筊NA翻譯時(shí)，它從N-端至C-端生成。
[0046] 對(duì)于“N-端殘基”，其應(yīng)被理解為肽中的殘基，其含有自由的或者至少未被其它氨基酸殘基酰化的氨基(例如，它可以被?；蚣柞；?，這被稱為N-端殘基(N-terminal)；它位于N-端(N-terminus)。含有自由的或至少未將其它氨基酸殘基酰化的羧基的殘基(例如，它可以?；币陨扫CNH–CHR–CO–NH2)被稱為C-端殘基。
[0047] 如上所述，發(fā)明人第一次提出視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(神經(jīng)退行性變起重要作用的視網(wǎng)膜疾病)的治療方法，其除了不具有侵襲性外，可應(yīng)用于這些疾病早期階段的治療，特別是DR早期階段的治療。
[0048] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明在局部治療和/或預(yù)防中使用的肽具有30-50個(gè)氨基酸的序列長(zhǎng)度。
[0049] 另一個(gè)實(shí)施方案是序列長(zhǎng)度為30-40個(gè)氨基酸的肽，其應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部治療和/或預(yù)防，所述肽的N-端區(qū)域主要包含下述序列：
[0050] HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4(SEQ ID NO:1)，其中：
[0051] Xaa1是選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；
[0052] Xaa2是選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸；
[0053] Xaa3是選自絲氨酸和賴氨酸的氨基酸；
[0054] Xaa4是選自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；和
[0055] 組氨酸是N末端殘基。
[0056] 但是在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽序列的長(zhǎng)度為13-40個(gè)氨基酸。
[0057] 這意味著具有任意所述特定序列長(zhǎng)度的任何肽，都可應(yīng)用于制造視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的治療和/或預(yù)防(指局部眼部治療和/或預(yù)防)的藥物，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病早期階段視網(wǎng)膜的治療和/或預(yù)防，特別是DR的早期階段。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(指局部眼部治療和/或預(yù)防)治療和/或預(yù)防
的方法，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病早期階段的神經(jīng)保護(hù)，特別是DR的早期階段。所述方法包括施用(指在眼部局部施用)治療有效量的肽，該肽具有以上所述特定的任何序列長(zhǎng)度。
[0058] 特別地，根據(jù)本發(fā)明所述肽在局部治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用(指在局部眼部治療/或預(yù)防中的應(yīng)用)是視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的治療和/或預(yù)防，所述視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病選自：DR、老年性黃斑變性、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。
[0059] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述肽在局部治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用是DR的治療和/或預(yù)防。
[0060] 進(jìn)一步，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述肽在局部治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用是DR早期階段的治療和/或預(yù)防。
[0061] 具體地，在這些早期階段，當(dāng)DR還未確定時(shí)，局部施用的本發(fā)明的肽，作為神經(jīng)視網(wǎng)膜的保護(hù)劑發(fā)揮作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這意味著保護(hù)神經(jīng)元免受損傷和功能喪失，并且將其維持在健康生理狀態(tài)。同樣的論證適用于其它的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病。的確，所述肽可以因?yàn)樗纳窠?jīng)保護(hù)特性而被使用。
[0062] 糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的圖示可以參見圖1。簡(jiǎn)要地，由高血糖癥觸發(fā)的代謝途徑和高血糖癥自身導(dǎo)致DR，但是在DR能夠通過眼底檢查被診斷之前還需至少五年的時(shí)間。可以觀察到的第一階段為背景性視網(wǎng)膜病變或非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)(其由微動(dòng)脈瘤、微出血和硬滲出物組成)。在這一階段，除了糖尿病對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)隨訪，沒有進(jìn)行特定的治療。從這一階段開始，疾病的自然過程可以沿兩個(gè)互不排斥的方向發(fā)展。其中之一為臨床顯著的糖尿病黃斑水腫(DMO)的發(fā)展，其最重要的致病因素是血視網(wǎng)膜屏障(BRB)的損壞。此種情況在2-型糖尿病患者中發(fā)生更為頻繁。另一個(gè)方向是朝增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)方向發(fā)展，這在1-型糖尿病中更頻繁。在后一種情況下，毛細(xì)血管閉塞在引起血管生成和抗血管生成因子之間的不平衡中起至關(guān)重要的作用，這最終刺激新血管生成(PDR的標(biāo)志)。然而，甚至在眼科檢查中能夠檢測(cè)到NPDR之前，視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變就已經(jīng)存在。如圖1所示，當(dāng)DMO和PDR確診時(shí)，實(shí)施積極治療。所述治療包括光凝術(shù)(PGC)、玻璃體內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇和/或抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(IVTR)和玻璃體切除術(shù)(VTR)。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明隨著所述肽用于DR的局部治療和/或預(yù)防，如果在疾病的早期階段，當(dāng)能夠檢測(cè)到功能異常時(shí)(即，辨色力、對(duì)比靈敏度和視網(wǎng)膜電圖異常)，對(duì)象接受能夠幫助視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)的化合物，就可避免一些這樣的積極治療方法。因此，如果保護(hù)視網(wǎng)膜免受慢性血糖水平的影響，就可以將主要的并發(fā)癥最小化，或隨著糖尿病患者生活質(zhì)量的真正改善甚至不再出現(xiàn)。向眼部局部施用所述肽表現(xiàn)出了真正的優(yōu)勢(shì)，避免了進(jìn)一步的積極治療。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的治療和/預(yù)防的肽具有一定的序列長(zhǎng)度，所述序列長(zhǎng)度選自：31、32、33、34、37、36、37、38和39個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，所述序列長(zhǎng)度選自14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、37、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和49個(gè)氨基酸。
[0065] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部(眼睛)治療1
和/或預(yù)防的肽是那些在N-端包括主要包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，其中Xaa為
2 3 4
丙氨酸，Xaa為纈氨酸，Xaa 為絲氨酸，且Xaa 為酪氨酸。即，它們包括氨基酸序列SEQ ID NO：5(HAEGTFTSDVSSY)。特別地，這些肽應(yīng)用于DR的局部治療和/或預(yù)防，其應(yīng)用于DR的局部眼部的治療和/或預(yù)防。
[0066] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽是哺乳動(dòng)物胰高血糖素樣肽-1。該肽在其N-端(N-端區(qū)域)包含如SEQ ID NO：5所述的序列，該序列在大部分的哺乳動(dòng)物中都存在，例如人、豬和猴子。此外，這是被GLP-1Rc主要識(shí)別的序列。
[0067] 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(DR)局部(眼睛)治療和/預(yù)防的肽包含氨基酸序列為SEQ ID NO：2的人胰高血糖素樣肽-1和這一人類肽的變體，該序列對(duì)應(yīng)于HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。所述變體涉及對(duì)象之間的突變，同時(shí)這些突變不影響其與GLP-1Rc的相互作用，并且不剝奪所述肽通過該受體發(fā)揮作用(特別是作為導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)或降低血糖水平的后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激動(dòng)劑或激活劑)?！巴蛔儭睉?yīng)被理解為一個(gè)或兩個(gè)氨基酸的缺失以及一個(gè)保守氨基酸的替代或插入。
[0068] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽具有氨基酸序列SEQ OD NO：3(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG)，其中賴氨酸(K)包含通過酰胺連接與賴氨酸側(cè)鏈的氨基相ε α連的親脂性取代基N –(γ-谷酰基(N –十六烷?；?)。即，所述肽主要包含SEQ ID NO：
3。
[0069] SEQ ID NO：3對(duì)應(yīng)于被稱為利拉魯肽的活性成分(也被稱為Arg34Lys26(Nε–α(γ-谷?；?N –十六烷酰基)))-GLP-1(7-37))，它被認(rèn)為是那些在至少一個(gè)氨基酸處包含親脂性取代基的GLP-1(7-37)的類似物，所述親脂性取代基為直鏈或支鏈烷烴α,ω-二羧酸的酰基。這些GLP-1(7-37)的類似物的優(yōu)選?；x自HOOC(CH2)mCO-，其中m為4-38，優(yōu)選為4-24，更優(yōu)選選自：HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-和HOOC(CH2)22CO-。
[0070] 因此，本發(fā)明也包括哺乳動(dòng)物胰高血糖素樣肽-1(7-37)或其類似物，其應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的局部(眼睛)治療，其中所述胰高血糖素樣肽-1(7-37)的類似物是包含至少一種下述修飾的肽：
[0071] a)胰高血糖素樣肽-1(7-37)的至少一個(gè)氨基酸缺失；
[0072] b)胰高血糖素樣肽-1(7-37)的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代；和[0073] c)在胰高血糖素樣肽-1(7-37)的C-端插入至少一個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)在N-端區(qū)它們包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。除人胰高血糖素樣肽-1受體的肽激動(dòng)劑外，當(dāng)在受體前測(cè)試時(shí)，所述類似物能刺激cAMP生成。
[0074] 特別地，在疾病的早期階段，可將哺乳動(dòng)物胰高血糖素樣肽-1(7-37)或其類似物應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的治療和/或預(yù)防。在早期階段，當(dāng)在眼部局部施用所述肽時(shí)，其作為神經(jīng)保護(hù)劑發(fā)揮作用(在預(yù)防治療中避免神經(jīng)退行性變)。
[0075] 也應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的治療和/或預(yù)防的GLP-1(7-37)26 ε 34 ε
類似物的實(shí)例包括利拉魯肽的一部分，Lys (N –(十四烷酰基)-GLP-1(7-37)、Lys (N –
26,34 ε 26 ε
(十四烷?；?-GLP-1(7-37)、Lys 二(N –(十四烷?；?-GLP-1(7-37)、Lys (N –
34 8 26,34 35 ε
(十四烷?；?Arg -GLP-1(7-37)、GlyArg Lys (N –(十四烷?；?-GLP-1(7-37)、
26,34 36 ε 26,34 ε
Arg Lys (N –( 十 四 烷 酰 基 )-GLP-1(7-37)、Lys 二(N –(ω- 羧 基 十 九
34 26 ε
烷 酰 基))-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(ω-羧 基 十 九 烷 酰 基 ))-GLP-1(7-37)、
34 26 ε 26,34 36 ε
Arg Lys (N –(ω-羧基十七烷?；?)-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(ω-羧基十七
26,34 36 ε 26，
烷?；?)-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(ω-羧基十一烷?；?)-GLP-1(7-37)、Lys
34 ε 34 26 ε
二(N –(ω-羧基十一烷?；?)-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(ω-羧基十一烷酰
34 26 ε 26,34 36 ε
基))-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –
26,34 ε
(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-37)、Lys 二(N –(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-37)、
34 26 ε 34 26 ε
Arg Lys (N –(ω-羧基十五烷?；?)-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(石膽?；?br>26,34 ε
(lithocholyl))-GLP-1(7-37)、Lys 二(N –(ω-羧基十三烷?；?)-GLP-1(7-37)、
26,34 ε α 26,34 ε
Lys (N –(γ-谷?；?N –十四烷酰基)))-GLP-1(7-37)、Lys 二(N –(γ-谷
α 34 26 ε α
?；?N –十六烷?；?))-GLP-1(7-37)、Arg Lys (N –(γ-谷?；?N –十四烷酰
基)))-GLP-1(7-37)。
[0076] 所有這些類似物被廣泛公開在專利文件EP0944648(Novo Nordisk)中，其中也包括它們合成的實(shí)例。它們中的大部分是通過在微生物中實(shí)施重組技術(shù)以及通過化學(xué)合成獲得的。
[0077] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的局部(眼睛)治療和/或1
預(yù)防的肽，是那些在N-端區(qū)域包括主要包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，其中Xaa為
2 3 4
甘氨酸，Xaa為亮氨酸，Xaa 為賴氨酸，且Xaa 為谷氨酰胺。特別地，所述肽用于DR的局部治療和/或預(yù)防。
[0078] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)治療和/或預(yù)防的肽主要包含氨基酸序列SEQ ID NO：4(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPX5 5
aa)或該肽的序列為氨基酸序列SEQ ID NO：4，其中Xaa是其-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的絲氨酸殘基。該SEQ ID NO：4對(duì)應(yīng)于被稱為艾塞那肽(Amylin Pharmaceuticals)的活性成分。所述化合物可按專利文件US5424286中公開的，通過固體化學(xué)合成或在微生物中使用DNA重組技術(shù)獲得。
[0079] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，特別是DR治療和/或預(yù)防的肽，主要包含氨基酸序列SEQ ID NO：8(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKK6 6
KKXaa)，或該肽的序列為氨基酸序列SEQ ID NO：8，其中Xaa是其-COOH端被-NH2基團(tuán)取代的賴氨酸殘基。該SEQ ID NO：8對(duì)應(yīng)于被稱為利西拉來(Amylin Pharmaceuticals)的活性成分。所述化合物可通過固體化學(xué)合成(梅里菲爾德固相法，Merifield solid-phase methodology)獲得。該產(chǎn)品廣泛公開于專利文件US6528486中。
[0080] 本發(fā)明中所有的這些肽以及定義為GLP-1(7-37)類似物的任何肽都是GLP-1Rc的激動(dòng)劑，所述肽長(zhǎng)度為13-50個(gè)氨基酸，特別地為30-50或30-40個(gè)氨基酸，并且其在N-端(N-端區(qū)域)包括主要包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。的確，據(jù)認(rèn)為SEQ ID NO：1是與GLP-1Rc相互作用的至少部分氨基酸序列。如下所證實(shí)的，它們?nèi)靠杀痪植坑糜谝暰W(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是DR)的治療和/或預(yù)防。
[0081] 因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽是GLP-1Rc的激動(dòng)劑。
[0082] 具體肽的激動(dòng)劑活性的確定可以通過分析(assay)來測(cè)試，所述分析為在表達(dá)克隆的人GLP-1Rc的細(xì)胞系中刺激cAMP的生成。此種分析的一個(gè)實(shí)例可從專利文件EP0944648(Novo Nordisk)得到。
[0083] 簡(jiǎn)要地，通過劑量反應(yīng)曲線計(jì)算具體肽的EC50，所述曲線使用表達(dá)人胰腺GLP-1Rc的幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞來測(cè)定。在緩沖液(10mmol/L Tris-HCI和30mmol/L NaCl pH 7.4，此外還含有1mmol/L二硫蘇糖醇、5mg/L亮抑肽酶(Sigma,St.Louis,MO,USA)、
5mg/L胃酶抑素(Sigma,St.Louis,MO,USA)、100mg/L桿菌肽(Sigma,St.Louis,MO,USA)和
16mg/L抑肽酶(Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark))中通過均化制備細(xì)胞的質(zhì)膜。然后在41w/v％蔗糖的頂層將勻漿離心。將兩層之間的白帶在緩沖液中稀釋并離心。該分析可在96孔微量滴定板中實(shí)施，總體積為140μl。使用的緩沖液可以是加入1mmol/L EGTA、
1.5mmol/L MgSO4、1.7mmol/L ATP、20mM GTP、2mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.01％Tween-20和0.1％人血清白蛋白(Reinst,Behringwerke AG,Marburg,Germany)的50mmol/L Tris-HCI，pH 7.4。將要測(cè)試激動(dòng)劑活性的化合物溶解并稀釋于緩沖液中，加入膜制備物，將混合物37℃孵育2h。通過加入25μl 0.05mol/L HCl終止反應(yīng)。在通過閃爍迫近分析法(RPA 538，Amersham，UK)分析cAMP之前，將樣品稀釋10倍。
[0084] 如果在這些條件下，肽的EC50(pM)為至少GLP-1(7-37)之一，即從至少55pM或優(yōu)選從至少60pM，則將該肽作為激動(dòng)劑。
[0085] 保護(hù)通過一些眼科檢查檢測(cè)到的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變是在血管異常發(fā)生之前治療DR的好方法。在DR的早期階段，存在神經(jīng)退行性變(其可以通過辨色力和對(duì)比靈敏度的喪失、膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)細(xì)胞凋亡來檢測(cè))。在這些早期階段，當(dāng)沒有指示進(jìn)行治療且只建議隨訪，直至確定了DR的更晚期階段(臨床顯著的糖尿病黃斑水腫和/或增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變)，局部施用(在眼部局部施用)本發(fā)明的肽是有用的。
[0086] 在DR早期階段的治療有真正的優(yōu)勢(shì)，其避免了進(jìn)一步的并發(fā)癥，即微動(dòng)脈瘤、微出血、硬滲出物、新血管生成、毛細(xì)血管閉塞和血視網(wǎng)膜屏障(BRB)損壞。
[0087] 在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的肽是局部用藥物組合物的成分(組分)，所述組合物包括至少一種如上公開的肽以及任何藥物可接受的載體和/或賦形劑。因此，本發(fā)明也涉及局部用藥物組合物，其應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病(特別是糖尿病視網(wǎng)膜病變)局部治療和/或預(yù)防，所述組合物包含至少一種如上所述的肽。具體的載體和/或賦形劑涉及水、生理鹽水緩沖液和油中水的混合物或水中油的混合物。具體的賦形劑選自：防腐劑、粘著劑、濕潤(rùn)劑、潤(rùn)膚劑和抗氧化劑。
[0088] 優(yōu)選的局部用藥物組合物選自：溶液(例如滴眼液)、面霜、洗液、藥膏、乳劑、氣溶膠和非氣溶膠噴霧、凝膠、油膏和懸浮液。如上所述，所述局部用藥物組合物應(yīng)被理解為局部眼用組合物。
[0089] 此外，本發(fā)明的組合物可包含其它的成分，如芳香劑、著色劑和在局部制劑中使用的本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的其它組分。
[0090] 本發(fā)明的局部組合物可根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的方法來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)要制備的制劑的類型可以很容易地確定適合的賦形劑和/或載體以及它們的量。
[0091] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的局部組合物是滴眼液形式的溶液，也稱為滴眼液。以滴眼液形式施用該肽具有極大的優(yōu)勢(shì)：易于需要的對(duì)象使用，且無不適感。
[0092] 在整個(gè)描述和權(quán)利要求中，術(shù)語“包括/包含”及其變體并不意圖排除其它的技術(shù)特征、添加劑、組分或步驟。此外，術(shù)語“包括”包含“由…組成”的情況。通過查看本描述，本發(fā)明其它的目的、優(yōu)勢(shì)和特征對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，或者可以通過實(shí)踐本發(fā)明學(xué)到。下述實(shí)施例和附圖以舉例說明的方式提供，并且它們不意圖限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明涵蓋本文描述的具體實(shí)施方案和優(yōu)選實(shí)施方案的所有可能的組合。實(shí)施例
[0093] 實(shí)施例1.GLP-1Rc在人視網(wǎng)膜中表達(dá)
[0094] 已知，在糖尿病供體死亡前一年的眼底檢查中，其視網(wǎng)膜中已經(jīng)存在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的主要特征(細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞激活)，但沒有任何的微循環(huán)異常(Carrasco et al.,“Lower Somatostatin Expression Is an Early Event in Diabetic Retinopathy and Is Associated With Retinal Neurodegeneration”,Diabetes Care-2007,Vol.No.30,pp.:2902-2908)。因此，正常的眼底檢查不排除糖尿病患者眼部已經(jīng)存在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的可能性。
[0095] 在本研究中發(fā)明人希望檢測(cè)，在人視網(wǎng)膜中GLP-1受體(GLP-1Rc)是否表達(dá)。
[0096] 從8個(gè)糖尿病供體和8個(gè)非糖尿病供體(年齡：66.9±5.4歲)中獲得了八個(gè)人死后的眼睛。從死亡到眼球摘除術(shù)經(jīng)過的時(shí)間少于4h。在摘除術(shù)之后，每一供體的一只眼睛在-80℃速凍且保存，直至用于mRNA檢測(cè)。另一只眼杯固定于4％的多聚甲醛，并包埋于石蠟中用于免疫組化研究。
[0097] 所有眼部組織的使用都符合適用法律以及涉及人組織研究的赫爾辛基宣言。此外此項(xiàng)研究經(jīng)Vall d’Hebron醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(Barcelona-Spain)。
[0098] 在將從供體中分離的眼杯顯微解剖后，收集神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮(REP)。使用研缽將每只眼睛的神經(jīng)視網(wǎng)膜和RPE在液氮中研磨成粉末。使用QIAshredder吸附柱(Quiagen，Hilden，Germany)將組織均化，并且根據(jù)廠商的使用說明書，利用RNeasy微小試劑盒(Quiagen，Hilden，Germany)從組織中提取mRNA。通過RNA nano Lab Chip Kit生物分析儀(Agilent，Palo Alto，CA，USA)測(cè)定mRNA的濃度和完整性。按照廠商針對(duì)隨機(jī)六聚體核苷酸引發(fā)的使用方法，使用 反轉(zhuǎn)錄試劑(Applied Biosystems，Roche，New
Jersey，USA))將1μg總mRNA反轉(zhuǎn)錄。按照廠商的使用方法利用ABI Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)(Perkin-Elmer Applied Biosystems；Madrid,Spain)實(shí)施定量實(shí)時(shí)PCR(Q-RT-PCR)。
用TaqMan Assay評(píng)估GLP-1Rc的水平。
[0099] 在免疫熒光分析中，將被石蠟包埋的眼睛連續(xù)切成7μm的厚度。將切片用二甲苯脫蠟，并在乙醇中再水化。然后將切片固定并將其置于抗原修復(fù)液(Dako A/S，Glostrup，Denmark)中95℃20min。然后在含有0.3％Triton X-100的PBS中，將切片與1％BSA孵育1h以封閉抗體的非特異性結(jié)合，然后與對(duì)人GLP-1Rc(Abcam，Cambridge，UK)具有特異性的初級(jí)抗體4℃孵育過夜。洗滌切片，然后將其與Alexa 488(Molecular Probes，
Eugene，OR)二級(jí)抗體在室溫孵育1h。用一滴含有DAPI的封固劑覆蓋載玻片以使細(xì)胞核可見(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。
[0100] 定量實(shí)時(shí)PCR(Q-RT-PCR)分析的結(jié)果顯示于圖2A中，其中表現(xiàn)了在一些人組織中對(duì)應(yīng)于GLP-1受體的mRNA的相對(duì)量。特別地，分析的組織是糖尿病供體的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE DBT)樣本、糖尿病供體的神經(jīng)視網(wǎng)膜(NR DBT)樣本、非糖尿病供體的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)樣本、非糖尿病供體的神經(jīng)視網(wǎng)膜(NR)樣本。作為對(duì)比分析，分析了GLP-1受體在其它組織，即在人胰腺(HP)、腸(BW)、肝臟(LV)和內(nèi)臟脂肪(F)細(xì)胞系中的表達(dá)。用人β-肌動(dòng)蛋白作為Q-RT-PCR的內(nèi)參。
[0101] 圖2A中的數(shù)據(jù)顯示，可以在糖尿病供體和非糖尿病供體(RPE/DBT；NR/DBT；RPE，NR)的視網(wǎng)膜中檢測(cè)到GLP-1Rc mRNA的表達(dá)。
[0102] 免疫熒光分析的結(jié)果顯示于圖2B中，其中顯示了一個(gè)石蠟切片的20×的光學(xué)顯微鏡圖像。粗箭頭指的是綠色染色，因而對(duì)應(yīng)于GLP-1受體。虛線箭頭顯示外核層(ONL)的核。圖2B是為通過免疫組化再次證明，在視網(wǎng)膜中也檢測(cè)到了GLP-1受體。
[0103] 實(shí)施例2.在糖尿病小鼠中局部施用GLP-1Rc激動(dòng)劑預(yù)防了視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變[0104] 動(dòng)物和處理
[0105] 包括從Harlan Laboratories，Inc.獲得的總共20只C57BL/KsJ-db/db小鼠。將10只C57BL/KsJ非糖尿病小鼠作為對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)的實(shí)施都符合Vall
d’Hebron Institut de Recerca(VHIR，Barcelona-Spain)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議和CEE(86/609/CEE)以及ARVO(視覺和眼科學(xué)研究協(xié)會(huì))的原則。將小鼠置于下述受控條件下飼養(yǎng)：具有12小時(shí)光/暗周期，溫度20℃和濕度60％，且可自由地得到水和食物。
[0106] C57BL/KsJ-db/db小鼠是研究DR患者中觀察到的神經(jīng)退行性特征的很好的模型。C57BL/KsJ-db/db小鼠在瘦素受體基因上攜帶一個(gè)突變，也是肥胖導(dǎo)致的2-型糖尿病的模型。由于過多的食物消耗，這些小鼠在-4-6周的年齡開始有高血糖癥發(fā)生。
[0107] 在對(duì)GLP-1受體激動(dòng)劑的效果進(jìn)行分析之前，發(fā)明人對(duì)與糖尿病有關(guān)的視網(wǎng)膜異常的時(shí)間順序進(jìn)行了評(píng)估。進(jìn)行了視網(wǎng)膜電圖和一些神經(jīng)退行性變的檢測(cè)，包括視網(wǎng)膜形態(tài)測(cè)量、膠質(zhì)細(xì)胞激活和細(xì)胞凋亡評(píng)估。結(jié)論為在16-24周之間，與非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠中總視網(wǎng)膜厚度顯著降低。此外，在糖尿病小鼠中觀察到了以膠質(zhì)原纖維酸性蛋白增生和上調(diào)(膠質(zhì)細(xì)胞激活的指示)為特征的“反應(yīng)性(reactive)”糖尿病表型。也觀察到在8、16和24周，與非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的凋亡神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。因此，該小鼠模型對(duì)于測(cè)試涉及治療或預(yù)防DR的任何化合物都是很好的模型，甚至比用于研究DR的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的被稱為鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型(STZ-DM)更好，在該模型中，STZ的神經(jīng)毒性效果能夠危及結(jié)果。
[0108] GLP-1Rc激動(dòng)劑利拉魯肽是一種GLP-1(7-37)類似物，通過注射器將其以滴眼液的形式(利拉魯肽濃度：在0.9％氯化鈉蒸餾水溶液中6mg/mL)直接施用于8周齡小鼠每只眼睛的上方角膜表面。作為對(duì)照，施用媒介物(含有0.9％的氯化鈉水溶液)滴眼液。用利拉魯肽處理10只小鼠，用媒介物處理10只小鼠。每天(利拉魯肽或媒介物)處理一次，處理14天。在第15天，在尸體解剖前約一小時(shí)，向小鼠眼睛注入一滴利拉魯肽或媒介物。
通過頸椎脫臼法使小鼠安樂死。立即摘除眼睛，并分離神經(jīng)視網(wǎng)膜。將一只眼睛的神經(jīng)視網(wǎng)膜凍于液氮中，并在-80℃保存以用于mRNA和蛋白評(píng)估。將另一只眼睛速凍于組織冰凍TM
包埋劑；TFM (Electron Microscopy Sciences)，通過浸入液氮，穿過背側(cè)/腹側(cè)平面切成
8mm的冰凍超薄切片。將切片置于載玻片上，并在-80℃保存。制備這些切片以用于視網(wǎng)膜形態(tài)評(píng)估，GLP-1Rc的存在、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的存在和末端轉(zhuǎn)移dUTP缺口端標(biāo)記(Terminal Transfer dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)免疫反應(yīng)性的評(píng)價(jià)。
[0109] 通過利用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定mRNA的表達(dá)，以及通過免疫組化和免疫印跡分析，對(duì)小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中GLP-1Rc的存在進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0110] GLP-1Rc mRNA的表達(dá)
[0111] 通過 實(shí)時(shí) PCR 分析 GLP-1Rc 的表 達(dá)。使 用下 述引 物：GGGTCTCTGGCTACATAAGGACAAC(正向，SEQ ID NO：6)和AAGGATGGCTGAAGCGATGAC(反向，SEQ ID NO：7)。
[0112] 免疫組化分析
[0113] 使用對(duì)GLP-1Rc具有特異性的抗體，通過熒光顯微法對(duì)GLP-1Rc進(jìn)行評(píng)估。將切片在酸性甲醇(-20℃)中固定2min，然后用PBS洗三次，每次5min。用0.1％的
TBS-Triton X-100將切片通透，然后室溫在封閉劑(含有10％BSA和10％山羊血清的
PBS)中孵育30min。接下來在潮濕環(huán)境中將切片與GLP-1Rc(Abcam Ltd,Cambridge,U.
K.)于4℃孵育過夜。用PBS將切片洗三次，每次5min，然后與二級(jí)抗體Alexa 594山羊
抗兔(Invitrogen,UK)(1:200稀釋于配好的封閉溶液)孵育。將切片在PBS中洗三次，用Hoechst復(fù)染，用熒光封固劑(Prolong,Invitrogen)固定，且用蓋玻片封固。使用相同的亮度和對(duì)比度設(shè)置，用Olympus顯微鏡記錄圖像。
[0114] 免疫印跡分析：
[0115] 將神經(jīng)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至含有來自Sigma的1×蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich，UK)的裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 7.5；苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1mM；Triton，1％；NaCl，
150mM；NaF，20mM；Na3PO4，2mM)中，然后用注射器將其均化。將勻漿冰上孵育30min，然后
1000rpm 4℃離心15分鐘。利用BCA分析(Pierce，Thermo Scientific USA)測(cè)定上清中的蛋白濃度。將樣品與6×上樣緩沖液(Tris-HCl，1M，pH，6.8；十二烷基硫酸鈉(SDS)，
20％；10％甘油；巰基乙醇和0.01g溴酚藍(lán))混合，煮沸10分鐘。用10％SDS-PAGE溶解
蛋白樣品。電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad Laboratories，UK)。用含5％脫脂奶粉、0.1％Tween的Tris緩沖生理鹽水(TBS)將膜于室溫封閉1小時(shí)，然后在
4℃與抗GLP-1R的初級(jí)抗體(1:1000稀釋；Abcam Ltd，Cambridge，UK)孵育過夜。將膜用TBS-T(0.1％Tween)充分洗滌，然后在室溫與用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育1小時(shí)(1:5000稀釋，Dako，Denmark)。使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Millipore，USA)使條帶可見。
利用ImageJ對(duì)蛋白表達(dá)相對(duì)量進(jìn)行定量。
[0116] 神經(jīng)退行性變測(cè)定：
[0117] 為了確定神經(jīng)退行性變，實(shí)施免疫組化分析以對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞激活和細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)估。此外，對(duì)谷氨酸代謝進(jìn)行評(píng)估。
[0118] 利用對(duì)GFAP(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)具有特異性的抗體，通過熒光顯微法對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞激活進(jìn)行評(píng)估。將切片在酸性甲醇(-20℃)中固定2min，然后用PBS洗三次，每
次5min。用0.025％的TBS-Triton X-100將切片通透，然后于室溫在封閉劑(含有1％
BSA和10％山羊血清的PBS)中孵育2小時(shí)。然后在潮濕環(huán)境中將切片與兔抗-GFAP抗
體(Abcam Ltd,Cambridge,U.K.)(1:500稀釋于配好的封閉液)于4℃孵育過夜。將切片
用PBS洗三次，每次5min，然后與二級(jí)抗體Alexa 488山羊抗-兔(Invitrogen)(1:200
稀釋于配好的封閉溶液)孵育。將切片在PBS中洗三次，用Hoechst復(fù)染，用熒光封固
劑(Prolong,Invitrogen)封固，并且用蓋玻片固定。使用相同的亮度和對(duì)比度設(shè)置，用Olympus顯微鏡記錄來自糖尿病和對(duì)照樣本的比較數(shù)字圖像。
[0119] 使用基于在先報(bào)道的GFAP染色程度的評(píng)分系統(tǒng)(Anderson et al.“Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-beta in the neuralretina of the rat”.Clin Ophthalmol–2008,Vol.No.:2,pp.:801-816)以評(píng)估膠質(zhì)細(xì)胞激活的程度。所述評(píng)分系統(tǒng)如下：只有繆勒氏細(xì)胞末端腳板區(qū)域/GCL(1分)；繆勒氏細(xì)胞末端腳板區(qū)域/GCL和一些鄰近進(jìn)程(2分)；繆勒氏細(xì)胞末端腳板區(qū)和許多進(jìn)程，但未延伸至ONL(3分)；繆勒氏細(xì)胞末端腳板區(qū)和一些位于ONL中的全部進(jìn)程(4分)；繆勒氏細(xì)胞末端腳板區(qū)和許多從GCL至ONL外層邊緣的暗進(jìn)程(5分)。
[0120] 使用與熒光素(DeadEnd Fluorometric TUNEL System kit；PROMEGA，USA)結(jié)合的DAPI(4’,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色的TUNEL(Terminal Transferase dUTP Nick-End Labeling)方法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)估。通過與新制備的含0.1％Triton X-100的0.1％檸檬酸鈉在冰上孵育2min，將視網(wǎng)膜冰凍切片通透。二級(jí)抗體是Alexa 594山羊抗-兔抗體(Invitrogen)(1:200稀釋于配好的含5％BSA的封閉溶液中)。為了通過熒光顯微法評(píng)估，使用在450-500nm范圍內(nèi)的激發(fā)波長(zhǎng)(例如488nm)，且在515-565nm(綠色)范圍內(nèi)檢測(cè)。
[0121] 谷氨酸在細(xì)胞外間隙的積累和谷氨酸受體的過度激活(“興奮性中毒”)在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變中發(fā)揮重要作用。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)于將細(xì)胞外谷氨酸濃度維持在神經(jīng)毒性水平以下是必要的。谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)是最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中占谷氨酸攝取的至少50％。使用特異性抗體[兔抗-GLAST(EAAT1)(1:100，Abcam ab416，Cambridge，UK)或兔抗L-谷氨酸(1:100，Abcam ab9440，Cambridge，UK)]，通過熒光顯微法對(duì)GLAST和谷氨酸進(jìn)行評(píng)估。
[0122] 對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用柯爾莫哥羅夫-斯米爾諾夫(Kolmogorov-Smirnov)檢驗(yàn)對(duì)變量的正態(tài)分布進(jìn)行評(píng)估。將數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。使用非配對(duì)的Student T-檢驗(yàn)對(duì)糖尿病和非糖尿病小鼠之間的連續(xù)變量進(jìn)行比較。通過
Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)分類變量之間進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)顯著性水平設(shè)定為p<0.05。
[0123] 結(jié)果：
[0124] GLP-1Rc在小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)：
[0125] 盡管未顯示數(shù)據(jù)，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)了糖尿病(db/db)小鼠以及非糖尿病(db/+)小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中GLP-1Rc mRNA的表達(dá)。在視網(wǎng)膜中觀察到的GLP-1Rc的表達(dá)與在胰腺(公認(rèn)的GLP-1靶向組織)中觀察到的范圍相同。也通過免疫組化和免疫印跡分析對(duì)
GLP-1Rc蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。
[0126] 膠質(zhì)細(xì)胞激活的數(shù)據(jù)描述于圖3中。從圖3中可以看出，在用安慰劑(C)處理的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中，在繆勒氏細(xì)胞末端腳板以及穿過視網(wǎng)膜內(nèi)層(INL)和外層(ONL)延伸的繆勒氏細(xì)胞放射纖維中，GFAP主要是沿內(nèi)界膜(INL)表達(dá)。用利拉魯肽滴眼液處理的糖尿病小鼠(T)比用媒介物處理的糖尿病小鼠表現(xiàn)出顯著更低的GFAP免疫熒光得分(p<0.05)，且其與非糖尿病小鼠的相似(p＝n.s)(表1)。
[0127] 接下來，表1顯示了基于評(píng)分系統(tǒng)(Anderson et al.Clin Ophthalmol2008,同上)的膠質(zhì)細(xì)胞激活的定量(以百分?jǐn)?shù)表示，％)。
[0128] 表1
[0129]
[0130]
[0131] 通過TUNEL檢測(cè)對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)估的數(shù)據(jù)顯示于圖4中。其中圖A顯示了用GLP-1(7-37)類似物利拉魯肽處理的糖尿病小鼠(T，n＝10)和用媒介物處理的糖尿病小鼠(對(duì)照，C，n＝10)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。該數(shù)據(jù)也顯示于圖B中，用于表示用GLP-1R激動(dòng)劑處理的糖尿病小鼠(T)和用媒介物處理的糖尿病小鼠(對(duì)照，C)的神經(jīng)視網(wǎng)膜中TUNEL陽(yáng)性的免疫熒光。在該圖B中，以任意單位描述了整個(gè)視網(wǎng)膜(神經(jīng)視網(wǎng)膜)中TUNEL熒光的定量。A.U：任意單位。結(jié)果為平均值±SD。*p<0.05。
[0132] 從圖4中可以看出，與在年齡相當(dāng)?shù)姆翘悄虿?duì)照的視網(wǎng)膜中觀察到的相比，整個(gè)視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞的總百分?jǐn)?shù)以及視網(wǎng)膜層(外核層、內(nèi)核層以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層)中凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是顯著增加的(p<0.01)。在所有組中，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的凋亡水平最高。與用安慰劑處理的糖尿病小鼠相比，用GLP-1Rc激動(dòng)劑(利拉魯肽)處理的糖尿病小鼠在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層表現(xiàn)出顯著更低比例的細(xì)胞凋亡(p<0.05)。此外，用GLP-1Rc激動(dòng)劑滴眼液處理的糖尿病小鼠比用媒介物處理的糖尿病小鼠表現(xiàn)出顯著更低的TUNEL+免疫熒光強(qiáng)度，且其與非糖尿病小鼠的相似(p＝n.s)。因此，在經(jīng)過處理的小鼠中，凋亡細(xì)胞的水平更低，這是較低視網(wǎng)膜損傷的間接測(cè)定。
[0133] 在用GLP-1Rc激動(dòng)劑(T)處理的糖尿病小鼠中，由糖尿病(C)引起的谷氨酸水平的升高得到了消除。這一有益效果與用GLP-1Rc激動(dòng)劑(T)處理的糖尿病小鼠中GLAST水平的顯著升高有關(guān)(圖5)。
[0134] 所有這些數(shù)據(jù)合起來為局部眼部施用(滴眼液)GLP-1Rc激動(dòng)劑在預(yù)防發(fā)生在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙陔A段的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性進(jìn)程中具有有效效果提供了第一項(xiàng)證據(jù)。該數(shù)據(jù)也為可以通過局部眼部施用(滴眼液)GLP-1Rc激動(dòng)劑(特別是局部施用上文公開的肽)來治療和/或預(yù)防神經(jīng)退行性變?cè)谄渲邪l(fā)揮重要作用的其它視網(wǎng)膜疾病提供了證據(jù)。
[0135] 本申請(qǐng)引用的參考文獻(xiàn)
[0136] -Schmidt et al.,“Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery”,Current Neuropharmacology–2008,Vol.No.6,pp.:164-178.
[0137] -Simo et al.,“Neurodegeneration is an early event indiabetic retinopathy:therapeutic implications”,Br.J.Ophthalmol.–
2012,vol.96,pp.1285-1290Aiello et al.,“Targeting Intraocular
Neovascularization and Edema–One Drop at a Time”,N.Eng.J Med–
2008,vol.359,pp.967-969.
[0138] -Urtti A et al.,“Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery”.Adv.Drug.Deliv.Rev.2006,vol.58,pp.1131-1135.
[0139] -WO2007062434
[0140] -Zhang et al.,“Intravitreal injection of exendin-4analogue protects retinal cells in early diabetic rats”,Invest Ophthalmol Vis Sci.-2011,vol.52(1),pp.:278-85.
[0141] -EP0944648.
[0142] -US5424286
[0143] -Carrasco et al.,“Lower Somatostatin Expression Is an Early Event in Diabetic Retinopathy and Is Associated With Retinal Neurodegeneration”,Diabetes Care-2007,Vol.No.30,pp.:2902-2908
[0144] -Anderson et al.“Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-beta in the neural retina of the rat”.Clin Ophthalmol–2008,Vol.No.:2,pp.:801-816.
高效檢索全球?qū)＠?/div>

專利匯是專利免費(fèi)檢索,專利查詢,專利分析-國(guó)家發(fā)明專利查詢檢索分析平臺(tái)，是提供專利分析，專利查詢，專利檢索等數(shù)據(jù)服務(wù)功能的知識(shí)產(chǎn)權(quán)數(shù)據(jù)服務(wù)商。

我們的產(chǎn)品包含105個(gè)國(guó)家的1.26億組數(shù)據(jù)，免費(fèi)查、免費(fèi)專利分析。

申請(qǐng)?jiān)囉?/a>

QQ群二維碼
意見反饋