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生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法
閱讀：543發(fā)布：2020-05-14
專利匯可以提供生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且提供了用于生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)諸如香草 醛 和香 草酸 的方法。通過(guò)使用具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能 力 的 微 生物 從 碳 源或目標(biāo)物質(zhì)的前體生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)，所述微生物已經(jīng)以烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行了修飾。，下面是生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟：
通過(guò)使用具有生產(chǎn)所述目標(biāo)物質(zhì)的能力的微生物來(lái)生產(chǎn)所述目標(biāo)物質(zhì)，
其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比烯醇化酶的活性得以降低的方式進(jìn)行了修飾，且
其中所述目標(biāo)物質(zhì)選自由以下組成的組：L-甲硫氨酸、需要S-腺苷甲硫氨酸來(lái)進(jìn)行生物合成的代謝物和它們的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生產(chǎn)包括：
在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物以在所述培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生產(chǎn)包括：
通過(guò)使用所述微生物來(lái)將所述目標(biāo)物質(zhì)的前體轉(zhuǎn)化成所述目標(biāo)物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化包括：
在含有所述前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物以在所述培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化包括：
在反應(yīng)混合物中允許所述微生物的細(xì)胞作用于所述前體以在所述反應(yīng)混合物中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞是存在于所述微生物的培養(yǎng)液中的細(xì)胞、從所述培養(yǎng)液中收集的細(xì)胞、存在于所述培養(yǎng)液的加工產(chǎn)物中的細(xì)胞、存在于收集的細(xì)胞的加工產(chǎn)物中的細(xì)胞，或這些的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前體選自由以下組成的組：原兒茶酸、原兒茶醛、L-色氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸和它們的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括收集所述目標(biāo)物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述烯醇化酶是由eno基因編碼的蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述eno基因編碼選自由以下組成的組的蛋白質(zhì)：
(a)包含SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
(b)包含SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列，且該氨基酸序列包含1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白質(zhì)，且其中所述蛋白質(zhì)具有烯醇化酶活性，和(c)包含與SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且其中所述蛋白質(zhì)具有烯醇化酶活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)弱化編碼烯醇化酶的基因的表達(dá)或通過(guò)破壞編碼烯醇化酶的基因來(lái)降低烯醇化酶的活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過(guò)對(duì)所述基因的表達(dá)控制序列進(jìn)行修飾來(lái)弱化編碼烯醇化酶的基因的表達(dá)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物是屬于腸桿菌科的細(xì)菌、棒狀桿菌細(xì)菌或酵母。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述微生物是屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述微生物是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述代謝物選自由以下組成的組：香草醛、香草酸、褪黑激素、麥角硫因、麥根酸、阿魏酸、多胺、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和肌酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比參與所述目標(biāo)物質(zhì)的生物合成的酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步修飾。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的所述方法，其中所述參與目標(biāo)物質(zhì)的生物合成的酶選自由以下組成的組：3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、3-脫氫莽草酸脫水酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、芳族醛氧化還原酶和它們的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比參與除所述目標(biāo)物質(zhì)以外的物質(zhì)的副生產(chǎn)的酶的活性得以降低的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述參與除目標(biāo)物質(zhì)以外的物質(zhì)的副生產(chǎn)的酶選自由以下組成的組：香草酸脫甲基酶、原兒茶酸3,4-雙加氧酶、醇脫氫酶、莽草酸脫氫酶和它們的組合。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步修飾。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述L-半胱氨酸生物合成酶是由選自由以下組成的組的基因編碼的蛋白質(zhì)：cysI基因、cysX基因、cysH基因、cysD基因、cysN基因、cysY基因、cysZ基因、fpr2基因和它們的組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中通過(guò)增加由cysR基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來(lái)增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比由NCgl2048基因編碼的蛋白質(zhì)的活性得以降低的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
28.一種生產(chǎn)香草醛的方法，所述方法包括：
通過(guò)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)生產(chǎn)香草酸；和
將所述香草酸轉(zhuǎn)化成香草醛。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述微生物是屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 香草醛是提供香草氣味的主要成分，并且用作食品、飲料、香水等中的芳香物。香草醛通常通過(guò)從天然產(chǎn)物中提取或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)。
[0004] 已經(jīng)嘗試在生產(chǎn)香草醛的方法中嘗試生物工程技術(shù)，例如通過(guò)使用各種微生物與丁香油酚、異丁香油酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子殼等(Kaur?B.and?Chakraborty?D.,Biotechnological?and?molecular?approaches?for?vanillin?production:a?review.Appl?Biochem?Biotechnol.2013?Feb；169(4):1353-72)。另外，使用生物工程技術(shù)生產(chǎn)香草醛的其他方法包括以糖苷生產(chǎn)(WO2013/022881和WO2004/111254)，使用香草醛合酶從阿魏酸生產(chǎn)香草醛(JP2015-535181)，通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)香草酸，然后將香草酸酶促轉(zhuǎn)化為香草醛(美國(guó)專利No.6,372,461)。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明描述了用于改善目標(biāo)物質(zhì)諸如香草醛和香草酸的生產(chǎn)的新技術(shù)，因此提供了用于有效生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法。
[0008] 本發(fā)明的一方面是通過(guò)以烯醇化酶的活性得以降低的方式修飾微生物，微生物可以以顯著改善的方式生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)諸如香草酸。
[0009] 本發(fā)明的一方面提供了生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟：通過(guò)使用具有生產(chǎn)所述目標(biāo)物質(zhì)的能力的微生物來(lái)生產(chǎn)所述目標(biāo)物質(zhì)，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比烯醇化酶的活性得以降低的方式進(jìn)行了修飾，且其中所述目標(biāo)物質(zhì)選自由以下組成的組：L-甲硫氨酸、需要S-腺苷甲硫氨酸來(lái)進(jìn)行生物合成的代謝物和它們的組合。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生產(chǎn)包括：在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物以在所述培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生產(chǎn)包括：通過(guò)使用所述微生物來(lái)將所述目標(biāo)物質(zhì)的前體轉(zhuǎn)化成所述目標(biāo)物質(zhì)。
[0012] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化包括：在含有所述前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物以在所述培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化包括：在反應(yīng)混合物中允許所述微生物的細(xì)胞作用于所述前體以在所述反應(yīng)混合物中生產(chǎn)和積累所述目標(biāo)物質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述細(xì)胞是存在于所述微生物的培養(yǎng)液中的細(xì)胞、從所述培養(yǎng)液中收集的細(xì)胞、存在于所述培養(yǎng)液的加工產(chǎn)物中的細(xì)胞、存在于收集的細(xì)胞的加工產(chǎn)物中的細(xì)胞，或這些的組合。
[0015] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述前體選自由以下組成的組：原兒茶酸、原兒茶醛、L-色氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸和它們的組合。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，所述方法還包括收集所述目標(biāo)物質(zhì)。
[0017] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述烯醇化酶是由eno基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0018] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述eno基因編碼選自由以下組成的組的蛋白質(zhì)：
[0019] (a)包含SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0020] (b)包含SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列，且該氨基酸序列包含1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白質(zhì)，且其中所述蛋白質(zhì)具有烯醇化酶活性，和[0021] (c)包含與SEQ?ID?NO:129的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且其中所述蛋白質(zhì)具有烯醇化酶活性。
[0022] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通過(guò)弱化編碼烯醇化酶的基因的表達(dá)或通過(guò)破壞編碼烯醇化酶的基因來(lái)降低烯醇化酶的活性。
[0023] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通過(guò)對(duì)所述基因的表達(dá)控制序列進(jìn)行修飾來(lái)弱化編碼烯醇化酶的基因的表達(dá)。
[0024] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是屬于腸桿菌科的細(xì)菌、棒狀桿菌細(xì)菌或酵母。
[0025] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌。
[0026] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
[0027] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
[0028] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
[0029] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述代謝物選自由以下組成的組：香草醛、香草酸、褪黑激素、麥角硫因、麥根酸、阿魏酸、多胺、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和肌酸。
[0030] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比參與所述目標(biāo)物質(zhì)的生物合成的酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步修飾。
[0031] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述參與目標(biāo)物質(zhì)的生物合成的酶選自由以下組成的組：3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、3-脫氫莽草酸脫水酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、芳族醛氧化還原酶和它們的組合。
[0032] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
[0033] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比參與除所述目標(biāo)物質(zhì)以外的物質(zhì)的副生產(chǎn)的酶的活性得以降低的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
[0034] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述參與除目標(biāo)物質(zhì)以外的物質(zhì)的副生產(chǎn)的酶選自由以下組成的組：香草酸脫甲基酶、原兒茶酸3,4-雙加氧酶、醇脫氫酶、莽草酸脫氫酶和它們的組合。
[0035] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了進(jìn)一步修飾。
[0036] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述L-半胱氨酸生物合成酶是由選自由以下組成的組的基因編碼的蛋白質(zhì)：cysI基因、cysX基因、cysH基因、cysD基因、cysN基因、cysY基因、cysZ基因、fpr2基因和它們的組合。
[0037] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中通過(guò)增加由cysR基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來(lái)增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。
[0038] 本發(fā)明的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已經(jīng)以與未修飾的菌株相比由NCgl2048基因編碼的蛋白質(zhì)的活性得以降低的方式進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾。
[0039] 本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)香草醛的方法，所述方法包括：通過(guò)如上文所述的方法來(lái)生產(chǎn)香草酸；和將所述香草酸轉(zhuǎn)化成香草醛。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041] <1>微生物
[0042] 如本文所述的微生物是具有生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力的微生物，所述微生物已經(jīng)以烯醇化酶的活性得以降低的方式進(jìn)行了修飾。生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力也可以稱為“目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力”。
[0043] <1-1>具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物
[0044] 短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指能夠生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的微生物。
[0045] 短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指在微生物用于發(fā)酵方法的情況下能夠通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的微生物。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指能夠從碳源生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的微生物。具體而言，短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指當(dāng)在含有碳源的培養(yǎng)基等培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠在培養(yǎng)基中以一定程度生產(chǎn)并積累目標(biāo)物質(zhì)，從而可以從培養(yǎng)基中收集目標(biāo)物質(zhì)的微生物。
[0046] 短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”還可以指在將微生物用于生物轉(zhuǎn)化方法的情況下能夠通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的微生物。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指能夠從目標(biāo)物質(zhì)的前體生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的微生物。具體而言，短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”可以指當(dāng)在含有目標(biāo)物質(zhì)的前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能夠在培養(yǎng)基中以一定程度生產(chǎn)并積累目標(biāo)物質(zhì)，從而可以從培養(yǎng)基中收集目標(biāo)物質(zhì)的微生物。具體而言，短語(yǔ)“具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物”還可以指能夠在被允許作用于反應(yīng)混合物中的目標(biāo)物質(zhì)的前體時(shí)在反應(yīng)混合物中以一定程度生產(chǎn)和積累目標(biāo)物質(zhì)，從而可以從反應(yīng)混合物中收集目標(biāo)物質(zhì)的微生物。
[0047] 具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物可以是能夠在培養(yǎng)基或反應(yīng)混合物中以比用非修飾菌株可以獲得的量更大的量生產(chǎn)和積累目標(biāo)物質(zhì)的微生物。非修飾的菌株也可以稱為“非修飾的微生物的菌株”。短語(yǔ)“非修飾微生物的菌株”或“非修飾的菌株”可以指尚未以烯醇化酶的活性得以降低的方式進(jìn)行修飾的對(duì)照菌株。具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物可以能夠在培養(yǎng)基或反應(yīng)混合物中以例如0.01g/L以上、0.05g/L以上或0.09g/L以上的量積累目標(biāo)物質(zhì)。
[0048] 目標(biāo)物質(zhì)可以選自L-甲硫氨酸和需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)進(jìn)行生物合成的代謝物。需要SAM進(jìn)行生物合成的代謝物的實(shí)例可以包括例如香草醛、香草酸、褪黑激素、麥角硫因、麥根酸、阿魏酸、多胺、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和肌酸。微生物可以能夠僅產(chǎn)生一種目標(biāo)物質(zhì)的能力，或者可以能夠產(chǎn)生兩種或更多種目標(biāo)物質(zhì)的能力。此外，微生物可以能夠從目標(biāo)物質(zhì)的一種前體或目標(biāo)物質(zhì)的兩種或更多種前體產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)的能力。
[0049] 當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)是能夠形成鹽的化合物時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)可以作為游離化合物，其鹽或它們的混合物獲得。也就是說(shuō)，除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)物質(zhì)”可以指游離形式的目標(biāo)物質(zhì)、其鹽或其混合物。鹽的實(shí)例可以包括例如硫酸鹽，鹽酸鹽，碳酸鹽，銨鹽，鈉鹽和鉀鹽。作為目標(biāo)物質(zhì)的鹽，可以使用一種鹽，或者可以組合使用兩種或更多種鹽。
[0050] 可以用作親本菌株以構(gòu)建如本文中描述的微生物的微生物沒(méi)有特別限制。微生物的實(shí)例可以包括細(xì)菌和酵母。
[0051] 細(xì)菌的實(shí)例可以包括屬于腸桿菌科的細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌。
[0052] 屬于腸桿菌科的細(xì)菌的實(shí)例可以包括屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、摩根菌屬(Morganella)的細(xì)菌。具體地，可以使用根據(jù)用于NCBI(National? Center?for? Biotechnology? Information)數(shù)據(jù)庫(kù)的分類學(xué)
(ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)分類為腸桿菌科的細(xì)菌。
(ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)分類為腸桿菌科的細(xì)菌。
[0053] 埃希氏菌屬細(xì)菌沒(méi)有特別限制，并且其實(shí)例可以包括根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分類學(xué)分類為埃希氏菌屬的細(xì)菌。埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以包括例如記載于Neidhardt?et?al.(Backmann?B.J.,1996,Derivations?and?Genotypes?of?some?mutant?derivatives?of?Escherichia?coli?K-12,pp.2460-2488,Table?1,In?F.D.Neidhardt(編),Escherichia?coli?and?Salmonella?Cellular?and?Molecular?Biology/第二版,American?Society?for?Microbiology?Press,Washington,D.C.)工作中的那些細(xì)菌。埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以包括例如大腸桿菌。大腸桿菌的具體實(shí)例可以包括大腸桿菌K-12菌株，諸如W3110菌株(ATCC?27325)和MG1655菌株(ATCC?47076)；大腸桿菌K5菌株(ATCC?23506)；大腸桿菌B菌株，諸如BL21(DE3)菌株；以及其衍生菌株。
[0054] 腸桿菌屬細(xì)菌沒(méi)有特別限制，并且其實(shí)例可以包括根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分類學(xué)分類為腸桿菌屬的細(xì)菌。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以包括例如聚團(tuán)腸桿菌(Enterobacter?agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter?aerogenes)。聚團(tuán)腸桿菌的具體實(shí)例可以包括例如聚團(tuán)腸桿菌ATCC?12287菌株。產(chǎn)氣腸桿菌的具體實(shí)例可以包括例如產(chǎn)氣腸桿菌ATCC?13048菌株、NBRC?12010菌株(Biotechnol.Bioeng.,2007,Mar.27；98(2):340-348)和AJ110637菌株(FERM?BP-10955)。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例還可以包括例如記載于歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)(EP-A)No.0952221中的菌株。另外，聚團(tuán)腸桿菌還可以包括分類為成團(tuán)泛菌(Pantoea?agglomerans)的一些菌株。
[0055] 泛菌屬細(xì)菌沒(méi)有特別限制，并且其實(shí)例可以包括根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分類學(xué)分類為泛菌屬的細(xì)菌。泛菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以包括例如菠蘿泛菌(Pantoea?ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea?stewartii)、成團(tuán)泛菌和檸檬泛菌(Pantoea?citrea)。菠蘿泛菌的具體實(shí)例可以包括例如菠蘿泛菌LMG20103菌株、AJ13355菌株(FERM?BP-6614)、AJ13356菌株(FERM?BP-6615)、AJ13601菌株(FERM?BP-7207)、SC17菌株(FERM?BP-11091)、SC17(0)菌株(VKPM?B-9246)和SC17sucA菌株(FERM?BP-8646)。一些腸桿菌屬細(xì)菌和歐文氏菌屬細(xì)菌重新分類為泛菌屬(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989)；Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如，基于16S?rRNA等的核苷酸序列分析，一些聚團(tuán)腸桿菌菌株最近重新分類為成團(tuán)泛菌、菠蘿泛菌、斯氏 泛菌等
(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。泛菌屬細(xì)菌可以包括如上文描述的重新分類為泛菌屬的那些細(xì)菌。
(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。泛菌屬細(xì)菌可以包括如上文描述的重新分類為泛菌屬的那些細(xì)菌。
[0056] 歐文氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例可以包括解淀粉歐文氏菌(Erwinia?amylovora)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia?carotovora)?？死撞暇鷮偌?xì)菌的實(shí)例可以包括植物克雷伯氏菌(Klebsiella?planticola)。
[0057] 棒狀桿菌細(xì)菌的實(shí)例可以包括屬于棒桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、細(xì)桿菌屬(Microbacterium)等的細(xì)菌。
[0058] 此類棒狀桿菌細(xì)菌的具體實(shí)例可以包括以下物種。
[0059] 嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(Corynebacterium?acetoacidophilum)
[0060] 醋谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?acetoglutamicum)
[0061] 解烷棒狀桿菌(Corynebacterium?alkanolyticum)
[0062] 帚石南棒狀桿菌(Corynebacterium?callunae)
[0063] 鈍齒棒狀桿菌(Corynebacterium?crenatum)
[0064] 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)
[0065] 百合棒桿菌(Corynebacterium?lilium)
[0066] 棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium?melassecola)
[0067] 熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacterium?thermoaminogenes)(有效棒桿菌(Corynebacterium?efficiens))
[0068] 力士棒桿菌(Corynebacterium?herculis)
[0069] 二歧短桿菌(Brevibacterium?divaricatum)(谷氨酸棒桿菌)
[0070] 黃色短桿菌(Brevibacterium?flavum)(谷氨酸棒桿菌)
[0071] 未成熟短桿菌(Brevibacterium?immariophilum)
[0072] 乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium?lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)
[0073] 玫瑰色短桿菌(Brevibacterium?roseum)
[0074] 解糖短桿菌(Brevibacterium?saccharolyticum)
[0075] 硫殖短桿菌(Brevibacterium?thiogenitalis)
[0076] 產(chǎn)氨短桿菌(Corynebacterium?ammoniagenes)(Corynebacterium?stationis)[0077] 白色短桿菌(Brevibacterium?album)
[0078] 蠟狀短桿菌(Brevibacterium?cerinum)
[0079] 嗜氨細(xì)桿菌(Microbacterium?ammoniaphilum)
[0080] 棒狀桿菌細(xì)菌的具體實(shí)例可以包括以下菌株。
[0081] 嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium?acetoacidophilum)ATCC?13870
[0082] 醋谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?acetoglutamicum)ATCC?15806
[0083] 解烷棒桿菌(Corynebacterium?alkanolyticum)ATCC?21511
[0084] 帚石南棒桿菌(Corynebacterium?callunae)ATCC?15991
[0085] 鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum)AS1.542
[0086] 谷氨酸棒桿菌ATCC?13020,ATCC?13032,ATCC?13060,ATCC?13869,FERM?BP-734[0087] 百合棒桿菌(Corynebacterium?lilium)ATCC?15990
[0088] 棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium?melassecola)ATCC?17965
[0089] 有效棒桿菌(Corynebacterium?efficiens)(熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacterium?thermoaminogenes))AJ12340(FERM?BP-1539)
[0090] 力士棒桿菌(Corynebacterium?herculis)ATCC?13868
[0091] 二歧短桿菌(Brevibacterium?divaricatum)(谷氨酸棒桿菌)ATCC?14020
[0092] 黃色短桿菌(Brevibacterium?flavum)(谷氨酸棒桿菌)ATCC?13826,ATCC?14067,AJ12418(FERM?BP-2205)
[0093] 未成熟短桿菌(Brevibacterium?immariophilum)ATCC?14068
[0094] 乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium?lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)ATCC?13869[0095] 玫瑰色短桿菌(Brevibacterium?roseum)ATCC?13825
[0096] 解糖短桿菌(Brevibacterium?saccharolyticum)ATCC?14066
[0097] 硫殖短桿菌(Brevibacterium?thiogenitalis)ATCC?19240
[0098] 產(chǎn)氨短桿菌(Corynebacterium?ammoniagenes)(停滯棒桿菌(Corynebacterium?stationis))ATCC?6871,ATCC?6872
[0099] 白色短桿菌(Brevibacterium?album)ATCC?15111
[0100] 蠟狀短桿菌(Brevibacterium?cerinum)ATCC?15112
[0101] 嗜氨細(xì)桿菌(Microbacterium?ammoniaphilum)ATCC?15354
[0102] 棒狀桿菌細(xì)菌可以包括先前被分類為短桿菌屬但目前并入棒狀桿菌屬中的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滯棒桿菌可以包括先前已被分類為產(chǎn)氨棒狀桿菌，但目前基于16S?rRNA的核苷酸序列分析等重新分類為停滯棒桿菌的細(xì)菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。
[0103] 酵母可以是芽殖酵母或裂殖酵母。酵母可以是單倍體或二倍體以上的多倍體酵母。酵母的實(shí)例可包括屬于酵母屬(Saccharomyces)的酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，屬于畢赤酵母屬(Pichia)(其也可以稱為Wickerhamomyces屬)的酵母，如西弗畢赤酵母(Pichia?ciferrii)，賽道威畢赤酵母(Pichia?sydowiorum)和巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)，屬于假絲酵母屬(Candida)的酵母，諸如實(shí)用假性酵母(Candida?utilis)，屬于漢遜酵母屬(Hansenula)的酵母，如多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)和屬于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)的酵母，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces?pombe)。
[0104] 這些菌株可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：P.O.Box?1549,Manassas,VA?20108,United?States?of?America；或atcc.org)獲得。也就是說(shuō)，注冊(cè)號(hào)被賦予各自的菌株，并且菌株可以通過(guò)使用這些注冊(cè)號(hào)訂購(gòu)(參見(jiàn)atcc.org)。美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中列出了菌株的注冊(cè)號(hào)。這些菌株也可以從例如菌株保藏的保藏所獲得。
[0105] 微生物可以固有具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力，或者可以已經(jīng)以使它具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方式進(jìn)行了修飾。具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物可以通過(guò)賦予如上所述的此類微生物以目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力或增強(qiáng)如上提及的此類微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力來(lái)獲得。
[0106] 以下，說(shuō)明賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生成能力的方法的具體實(shí)例。為了賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力，下面舉例說(shuō)明的此類修飾可以獨(dú)立使用，或者以適當(dāng)組合使用。
[0107] 目標(biāo)物質(zhì)可以通過(guò)參與目標(biāo)物質(zhì)生物合成的酶的作用產(chǎn)生。此類酶也可以稱為“目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶”。因此，微生物可以具有目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶。換言之，微生物可以具有編碼目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的基因。此類基因也可以稱為“目標(biāo)物質(zhì)生物合成基因”。微生物可以固有具有目標(biāo)物質(zhì)生物合成基因，或者可以已經(jīng)引入了目標(biāo)物質(zhì)生物合成基因。本文解釋了用于引入基因的方法。
[0108] 另外，通過(guò)提高目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的活性，可以改善微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力。也就是說(shuō)，賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生成能力的方法的實(shí)例可以包括提高目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的活性的方法。也就是說(shuō)，微生物可以經(jīng)修飾而使得增加了目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的活性。一種目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的活性可以得以增加，或者兩種或更多種目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的活性可以得以增加。本文描述了用于增加蛋白質(zhì)(諸如酶等)的活性的方法。通過(guò)例如增加編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，可以提高蛋白質(zhì)(諸如酶等)的活性。
[0109] 目標(biāo)物質(zhì)可以從例如碳源和/或目標(biāo)物質(zhì)的前體產(chǎn)生。因此，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例可以包括例如催化從碳源和/或前體向目標(biāo)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的酶。例如，3-脫氫莽草酸可以通過(guò)部分莽草酸途徑產(chǎn)生，其可以包括由3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)，3-脫氫奎尼酸合酶和3-脫氫奎尼酸脫水酶催化的步驟；可以通過(guò)3-脫氫莽草酸脫水酶(DHSD)的作用將3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化為原兒茶酸；可以通過(guò)O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)或芳香醛氧化還原酶，諸如芳香羧酸還原酶，ACAR的作用將原兒茶酸分別轉(zhuǎn)化為香草酸或原兒茶醛；以及可以通過(guò)ACAR或OMT的作用將香草酸或原兒茶醛轉(zhuǎn)化為香草醛。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的具體實(shí)例可以包括例如DAHP合酶，3-脫氫奎尼酸合酶，3-脫氫奎尼酸脫水酶，DHSD，OMT和ACAR。
[0110] 術(shù)語(yǔ)“3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)”可以指具有催化將D-赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚糖酮酸7-磷酸(DAHP)和磷酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?2.5.1.54)。編碼DAHP合酶的基因也可以稱為“DAHP合酶基因”。DAHP合酶的實(shí)例可以包括分別由aroF、aroG和aroH基因編碼的AroF、AroG和AroH蛋白。在這些中，AroG可以作為主要的DAHP合酶發(fā)揮功能。DAHP合酶諸如AroF、AroG和AroH蛋白的實(shí)例包括各種生物體如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌的那些。DAHP合酶的具體實(shí)例可以包括大腸桿菌天然的AroF、AroG和AroH蛋白。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的aroG基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，并且由該基因編碼的AroG蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
[0111] DAHP合酶活性可以通過(guò)例如將酶與底物，諸如D-赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸溫育并測(cè)量DAHP的酶和底物依賴性生成來(lái)測(cè)量。
[0112] 術(shù)語(yǔ)“3-脫氫奎尼酸合酶”可以指具有催化使DAHP脫磷酸化以產(chǎn)生3-脫氫奎寧酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?4.2.3.4)。編碼3-脫氫奎尼酸合酶的基因也可以稱為“3-脫氫奎尼酸合酶基因”。3-脫氫奎尼酸合酶的實(shí)例可以包括由aroB基因編碼的AroB蛋白。3-脫氫奎尼酸合酶如AroB蛋白的實(shí)例可以包括各種生物體如腸桿菌科細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌天然的那些。3-脫氫奎尼酸合酶的具體實(shí)例可以包括大腸桿菌天然的AroB。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的aroB基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，并且由該基因編碼的AroB蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。
[0113] 3-脫氫奎尼酸合酶活性可以通過(guò)例如將酶與底物，諸如DAHP溫育并測(cè)量3-脫氫奎寧酸的酶和底物依賴性產(chǎn)生來(lái)測(cè)量。
[0114] 術(shù)語(yǔ)“3-脫氫奎尼酸脫水酶”可以指具有催化使3-脫氫奎寧酸脫水以生成3-脫氫莽草酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?4.2.1.10)。編碼3-脫氫奎尼酸脫水酶的基因也可以稱為“3-脫氫奎尼酸脫水酶基因”。3-脫氫奎尼酸脫水酶的實(shí)例可以包括由aroD基因編碼的AroD蛋白。3-脫氫奎尼酸脫水酶諸如AroD蛋白的實(shí)例可以包括各種生物體如腸桿菌科細(xì)菌和棒桿菌的那些。3-脫氫奎尼酸脫水酶的具體實(shí)例可以包括大腸桿菌天然的AroD蛋白。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的aroD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，并且由該基因編碼的AroD蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:6所示。
[0115] 3-脫氫奎尼酸脫水酶活性可以通過(guò)例如將酶與底物，諸如3-脫氫奎寧酸溫育并測(cè)量3-脫氫莽草酸的酶和底物依賴性產(chǎn)生來(lái)測(cè)量。
[0116] 術(shù)語(yǔ)“3-脫氫草酸脫水酶(DHSD)”可以指具有催化使3-脫氫莽草酸脫水以生成原兒茶酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?4.2.1.118)。編碼DHSD的基因也可以稱為“DHSD基因”。DHSD的實(shí)例可以包括由asbF基因編碼的AsbF蛋白。DHSD例如AsbF蛋白的實(shí)例包括各種生物體如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)，粗糙脈孢菌(Neurospora?crassa)和Podospora?pauciseta天然的那些。蘇云金芽孢桿菌BMB171菌株天然的asbF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:7所示，并且由該基因編碼的AsbF蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:8所示。
[0117] DHSD活性可以通過(guò)例如將酶與底物，諸如3-脫氫莽草酸溫育并測(cè)量原兒茶酸的酶和底物依賴性產(chǎn)生來(lái)測(cè)量。
[0118] 編碼莽草酸途徑的酶如DAHP合酶，3-脫氫奎尼酸合酶和3-脫氫奎尼酸脫水酶的基因的表達(dá)受到酪氨酸阻遏物TyrR阻遏，所述TyrR其由tyrR基因編碼。因此，莽草酸途徑酶的活性也可以通過(guò)降低酪氨酸阻遏物TyrR的活性而增加。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的tyrR基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:9所示，并且由該基因編碼的TyrR蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:10所示。
[0119] 術(shù)語(yǔ)“O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)”可以指具有在甲基供體存在下催化物質(zhì)的羥基的甲基化反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?2.1.1.68等)。此活性也可以稱為“OMT活性”。編碼OMT的基因也可以稱為“OMT基因”。根據(jù)在如本文中所述的方法中生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的特定生物合成途徑，OMT可以具有需要的底物特異性。例如，當(dāng)經(jīng)由原兒茶酸向香草酸的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，可以使用至少對(duì)原兒茶酸特異性的OMT。此外，例如，當(dāng)經(jīng)由原兒茶醛向香草醛的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，可以使用至少對(duì)原兒茶醛特異性的OMT。也就是說(shuō)，具體地，術(shù)語(yǔ)“O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)”可以指具有催化在存在甲基基團(tuán)供體的情況下使原兒茶酸和/或原兒茶醛甲基化(即間位上的羥基基團(tuán)的甲基化)以產(chǎn)生香草酸和/或香草醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。OMT可以對(duì)作為底物的原兒茶酸和原兒茶醛兩者是特異性的，但不一定限于此。也就是說(shuō)，可以采用具有所需底物特異性的OMT，這取決于在本發(fā)明的方法中生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的生物合成途徑的類型。OMT通?？梢允褂迷瓋翰杷岷驮瓋翰枞﹥烧咦鳛榈孜铮遣槐厝幌抻诖?。甲基基團(tuán)供體的實(shí)例可以包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。OMT的實(shí)例可以包括各種生物體天然的OMT，諸如智人(Homo?sapiens)(Hs)天然的OMT(GenBank登錄號(hào)NP_000745和NP_009294)、擬南芥(Arabidopsis?thaliana)天然的OMT(GenBank登錄號(hào)NP_200227和NP_009294)、Fragaria?x?ananassa天然的OMT(GenBank登錄號(hào)AAF28353)以及WO2013/022881A1中示例的哺乳動(dòng)物、植物和微生物的其他各種OMT。對(duì)于智人天然的OMT基因，已知四種轉(zhuǎn)錄物變體和兩種OMT同種型。這四種轉(zhuǎn)錄物變體(轉(zhuǎn)錄物變體1-4，GenBank登錄號(hào)NM_000754.3，NM_001135161.1，NM_001135162.1和NM_007310.2)的核苷酸序列顯示為SEQ?ID?NO:11至14，較長(zhǎng)OMT同種型(MB-COMT，GenBank登錄號(hào)NP_000745.1)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:15所示，并且較短OMT同種型(S-COMT，GenBank登錄號(hào)NP_009294.1)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:16所示。SEQ?ID?NO:16對(duì)應(yīng)于截短了N端的50個(gè)氨基酸殘基的SEQ?ID?NO:15。OMT的實(shí)例可以進(jìn)一步包含擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌，即屬于擬桿菌門的細(xì)菌天然的OMT。擬桿菌門細(xì)菌的實(shí)例可以包括屬于Niastella、Terrimonas、Chitinophaga等屬的細(xì)菌(International?Journal?of?Systematic?and?Evolutionary?Microbiology(2007),57,1828-1833)。Niastella細(xì)菌的實(shí)例可以包括Niastella?koreensis。Niastella?koreensis天然的OMT基因的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:130顯示，并且由此基因編碼的OMT的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:131顯示。
[0120] OMT還可以催化原兒茶酸和/或原兒茶醛的甲基化反應(yīng)以產(chǎn)生異香草酸和/或異香草醛(即對(duì)位羥基的甲基化)作為副反應(yīng)。OMT可以選擇性催化間位羥基的甲基化的。表述“選擇性催化間位羥基的甲基化”可以意味著OMT選擇性地從原兒茶酸生成香草酸的OMT和/或選擇性地從原兒茶醛生成香草醛的OMT。表述“從原兒茶酸選擇性產(chǎn)生香草酸”可以表示當(dāng)允許OMT作用于原兒茶酸時(shí)按摩爾比計(jì)，OMT產(chǎn)生香草酸的量為異香草酸的量的例如3倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，25倍或更多，或30倍或更多。此外，表述“從原兒茶醛選擇性產(chǎn)生香草酸”可以表示當(dāng)允許OMT作用于原兒茶醛時(shí)按摩爾比計(jì)，OMT產(chǎn)生香草醛的量為異香草酸的量的例如3倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，25倍或更多，或者30倍或更多。選擇性催化間位羥基甲基化的OMT的實(shí)例可以包括本文所述的具有“特定突變”的OMT。
[0121] 具有“特定突變”的OMT也可以稱為“突變體OMT”。編碼突變體OMT的基因也可以稱為“突變體OMT基因”。
[0122] 不具有“特定突變”的OMT也可以稱為“野生型OMT”。編碼野生型OMT的基因也可以稱為“野生型OMT基因”。本文中提及的術(shù)語(yǔ)“野生型”是為了方便將“野生型”O(jiān)MT與“突變體”O(jiān)MT區(qū)分開(kāi)而使用，并且“野生型”O(jiān)MT不限于作為天然物質(zhì)獲得的那些，并且可以包括任何沒(méi)有“特定突變”的OMT。野生型OMT的實(shí)例可以包括例如上面例示的OMT。另外，上述例示的所有OMT保守變體應(yīng)當(dāng)認(rèn)為包括在野生型OMT中，條件是此類保守變體不具有“特定突變”。
[0123] “特定突變”的實(shí)例可以包括WO2013/022881A1中描述的突變體OMT中包含的突變。也就是說(shuō)，“特定突變”的實(shí)例可以包括野生型OMT的198位亮氨酸殘基(L198)被比亮氨酸殘基的疏水性指數(shù)(hydrophobic?index)具有更低疏水性指數(shù)(親水性指數(shù)(hydropathy?index))的氨基酸殘基取代的突變，以及野生型OMT的199位谷氨酸殘基(E199)被在pH7.4具有中性或正側(cè)鏈電荷的氨基酸殘基取代的突變。突變體OMT可以具有這些突變中的一個(gè)或兩者。
[0124] “比亮氨酸殘基的疏水性指數(shù)具有更低疏水性指數(shù)(親水指數(shù))的氨基酸殘基”的實(shí)例可以包括Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr。作為“比亮氨酸殘基的疏水性指數(shù)具有更低疏水性指數(shù)(親水指數(shù))的氨基酸殘基”，特別地優(yōu)選選自Ala,Arg,Asn,Asp,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr的氨基酸殘基，并且Tyr是更具體的實(shí)例。
[0125] “在pH7.4具有中性或正側(cè)鏈電荷的氨基酸殘基”可以包括Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr和Val。作為“在pH7.4具有中性或正側(cè)鏈電荷的氨基酸殘基”，Ala和Gln是具體的實(shí)例。
[0126] 任意的野生型OMT中的“L198”和“E199”可以指“與以SEQ?ID?NO:16所示的氨基酸序列的第198位的亮氨酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基”和“與以SEQ?ID?NO:16所示的氨基酸序列的第199位谷氨酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基”。這些氨基酸殘基的位置表示相對(duì)位置，并且其絕對(duì)位置可以由于氨基酸殘基的缺失，插入，添加等而改變。例如，若在SEQ?ID?NO:16所示的氨基酸序列中的位置X的N端側(cè)的位置缺失或插入一個(gè)氨基酸殘基，則原來(lái)在位置X處的氨基酸殘基重新定位在位置X-1或X+1，但仍被認(rèn)為是“與SEQ?ID?NO:16所示的氨基酸序列的X位的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基”。此外，雖然“L198”和“E199”通常分別是亮氨酸殘基和谷氨酸殘基，但它們可以不是亮氨酸殘基和谷氨酸殘基。也就是說(shuō)，當(dāng)“L198”和“E199”分別不是亮氨酸殘基和谷氨酸殘基時(shí)，“特定突變”可以包括那些氨基酸殘基各自被任何上述氨基酸殘基替換的突變。
[0127] 在任意OMT的氨基酸序列中，哪個(gè)氨基酸殘基為對(duì)應(yīng)于“L198”或“E199”的氨基酸殘基可以通過(guò)將任意OMT的氨基酸序列和SEQ?ID?NO:16的氨基酸序列比對(duì)確定。比對(duì)可以通過(guò)例如使用已知的基因分析軟件來(lái)進(jìn)行。此類軟件的具體實(shí)例可以包括由Hitachi?Solutions生產(chǎn)的DNASIS，Genetyx生產(chǎn)的GENETYX等(Elizabeth?C.Tyler?et?al.,Computers?and?Biomedical?Research,24(1)72-96,1991；Barton?GJ?et?al.,Journal?of?Molecular?Biology,198(2),327-37,1987)。
[0128] 例如，可以通過(guò)修飾野生型OMT基因使得由其編碼的OMT具有“特定突變”來(lái)獲得突變體OMT基因。待修飾的野生型OMT基因可以通過(guò)例如從具有野生型OMT基因的生物體的克隆或化學(xué)合成來(lái)獲得。此外，也可以不使用野生型OMT基因而獲得突變體OMT基因。例如，可以通過(guò)化學(xué)合成直接獲得突變體OMT基因。獲得的突變OMT基因可以原樣使用，或者在使用前進(jìn)一步修飾。
[0129] 基因可以使用已知的方法進(jìn)行修飾。例如，可以通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變方法將目標(biāo)突變引入DNA的靶位點(diǎn)中。位點(diǎn)特異性誘變方法的實(shí)例可以包括使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCR?Technology,Erlich,H.A.編,Stockton?Press(1989)；Carter?P.,Meth.In?Enzymol.,154,382(1987))；以及使用噬菌體的方法(Kramer,W.and?Frits,H.J.,Meth.in?Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et?al.,Meth.in?Enzymol.,154,367(1987))。
[0130] 可以通過(guò)例如在SAM存在下將酶與底物，諸如原兒茶酸或原兒茶醛溫育并測(cè)量相應(yīng)產(chǎn)物，諸如香草酸或香草醛的酶和底物依賴性產(chǎn)生來(lái)測(cè)量OMT活性(WO2013/022881A1)。此外，通過(guò)在相同條件下測(cè)量相應(yīng)副產(chǎn)物，諸如異香草酸或異香草醛的產(chǎn)生，并將副產(chǎn)物的產(chǎn)生與產(chǎn)物的產(chǎn)生進(jìn)行比較，可以確定OMT是否選擇性地生成產(chǎn)物。
[0131] 術(shù)語(yǔ)“芳族醛氧化還原酶(芳族羧酸還原酶；ACAR)”可以指具有催化在電子供體和ATP存在下還原香草酸和/或原兒茶酸的反應(yīng)以產(chǎn)生香草醛和/或原兒茶醛的活性的蛋白質(zhì)(EC?1.2.99.6等)。此活性也可以稱為“ACAR活性”。編碼ACAR的基因也可稱為“ACAR基因”。ACAR通常可以使用香草酸和原兒茶酸兩者作為底物，但不必限于此。也就是說(shuō)，ACAR可以具有需要的底物特異性，這取決于在如本文所述的方法中生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的特定生物合成途徑。例如，當(dāng)通過(guò)香草酸向香草醛的轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，可以使用至少對(duì)香草酸特異性的ACAR。另外，例如，當(dāng)通過(guò)原兒茶酸向原兒茶醛的轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，可以使用至少對(duì)原兒茶酸特異性的ACAR。電子供體的實(shí)例可以包括NADH和NADPH。ACAR的實(shí)例可以包括各種生物體如諾卡爾菌屬種(Nocardia?sp.)菌株NRRL?5646、放線菌屬種(Actinomyces?sp.)、熱乙酸梭菌(Clostridium?thermoaceticum)、黑曲霉(Aspergillus?niger)、甜瓜棒孢(Corynespora?melonis)、云芝屬種(Coriolus?sp.)和鏈孢霉屬種(Neurospora?sp.)天然的ACAR(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。諾卡爾菌屬種菌株NRRL?5646已被分類為艾阿華諾卡氏菌(Nocardia?iowensis)。ACAR的實(shí)例還可包括其他諾卡氏菌細(xì)菌，例如巴西諾卡氏菌(Nocardia?brasiliensis)和傷口諾卡氏菌(Nocardia?vulneris)的ACAR。巴西諾卡氏菌ATCC?700358天然的ACAR基因的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:17顯示，并且由此基因編碼的ACAR的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:18顯示。巴西諾卡氏菌ATCC?700358天然的變體ACAR基因的實(shí)例的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:19顯示，并且由此基因編碼的ACAR的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:20顯示。
[0132] ACAR活性可以通過(guò)例如在ATP和NADPH存在下將酶與底物，諸如香草酸或原兒茶酸一起溫育，并且測(cè)量NADPH的酶和底物依賴性氧化來(lái)測(cè)量(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485中描述的方法的修改)。
[0133] 可以通過(guò)磷酸泛酰巰基乙胺化(phosphopantetheinylation)將ACAR變?yōu)榛钚悦?J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。因此，ACAR活性也可以通過(guò)增加催化蛋白質(zhì)的磷酸泛酰巰基乙胺化的酶(其也可以稱為“磷酸泛酰巰基乙胺基化酶”)的活性來(lái)增加。也就是說(shuō)，賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法的實(shí)例可以包括增加磷酸泛酰巰基乙胺基化酶的活性的方法。也就是說(shuō)，微生物可以以使磷酸泛酰巰基乙胺基化酶的活性得以增加的方式進(jìn)行了修飾。磷酸泛酰巰基乙胺基化酶的實(shí)例可以包括磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT)。
[0134] 術(shù)語(yǔ)“磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT)”可以指具有在磷酸泛酰巰基乙胺基供體存在下催化使ACAR磷酸泛酰巰基乙胺化的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。此活性也可以稱為“PPT活性”。編碼PPT的基因也可以稱為“PPT基因”。磷酸泛酰巰基乙胺基供體的實(shí)例可以包括輔酶A(CoA)。PPT的實(shí)例可以包括EntD蛋白，其由entD基因編碼。PPT例如EntD蛋白質(zhì)的實(shí)例可以包括各種生物體天然的那些。PPT的具體實(shí)例可以包括大腸桿菌天然的EntD蛋白。大腸桿菌K-12MG1655菌株的entD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:21所示，并且由該基因編碼的EntD蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:22所示。PPT的具體實(shí)例還可以包括巴西諾卡菌天然的PPT，皮疽諾卡菌(Nocardia?farcinica)IFM10152天然的PPT(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)和谷氨酸棒桿菌天然的PPT(App.Env.Microbiol.2009,Vol.75,No.9,pp.2765-2774)。谷氨酸棒桿菌ATCC?13032菌株天然的PPT基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:23所示，并且由該基因編碼的PPT的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:24所示。
[0135] PPT活性可以基于例如在CoA存在下與ACAR溫育時(shí)觀察到的ACAR活性的增強(qiáng)來(lái)測(cè)量(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。
[0136] 褪黑激素可以從L-色氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括例如L-色氨酸生物合成酶和催化L-色氨酸轉(zhuǎn)化成褪黑激素的酶。L-色氨酸生物合成酶的實(shí)例可以包括芳香族氨基酸的常見(jiàn)生物合成酶，例如3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF,aroG,aroH)，3-脫氫喹啉合酶(aroB)，3-脫氫喹啉脫水酶(aroD)，莽草酸脫氫酶(aroE)，莽草酸激酶(aroK,aroL)，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)和分支酸合酶(aroC)；以及鄰氨基苯甲酸合酶(trpED)和色氨酸合酶(trpAB)。在酶的名稱之后的括號(hào)中顯示了編碼酶的基因的名稱的實(shí)例(這在下文也適用于相同的情況)。通過(guò)色氨酸5-羥化酶(EC?1.14.16.4)，5-羥色氨酸脫羧酶(EC?4.1.1.28)，芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AANAT；EC?2.3.1.87)和乙酰血清素O-甲基轉(zhuǎn)移酶(EC?2.1.1.4)的作用，L-色氨酸可以依次轉(zhuǎn)化為羥色氨酸，5-羥色胺，N-乙酰血清素和褪黑激素。也就是說(shuō)，催化L-色氨酸轉(zhuǎn)化為褪黑激素的酶的實(shí)例可以包括這些酶。值得注意的是，乙酰血清素O-甲基轉(zhuǎn)移酶是OMT的一個(gè)實(shí)例，其催化使用SAM作為甲基供體使N-乙酰血清素甲基化以產(chǎn)生褪黑激素的反應(yīng)。
[0137] 麥角硫因可以從L-組氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括例如L-組氨酸生物合成酶和催化L-組氨酸轉(zhuǎn)化為麥角硫因的酶。L-組氨酸生物合成酶的實(shí)例可以包括ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hisG)，磷酸核糖基AMP環(huán)化水解酶(hisI)，磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisI)，磷酸核糖基亞胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸異構(gòu)酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole?carboxamide?ribotide?isomerase)(hisA)，氨基轉(zhuǎn)移酶(hisH)，磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶(hisC)，組氨醇磷酸酶(hisB)和組氨醇脫氫酶(hisD)。L-組氨酸可以通過(guò)分別由egtB、egtC、egtD和egtE基因編碼的EgtB、EgtC、EgtD和EgtE蛋白的作用連續(xù)轉(zhuǎn)化為組氨酸三甲基內(nèi)鹽(hercynine)，hercynyl-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸亞砜，hercynyl-L-半胱氨酸亞砜和麥角硫因。組氨酸三甲基內(nèi)鹽還可以通過(guò)由egt1基因編碼的Egt1蛋白的作用轉(zhuǎn)化為hercynyl-L-半胱氨酸亞砜。也就是說(shuō)，催化L-組氨酸轉(zhuǎn)化為麥角硫因的酶的實(shí)例可以包括這些酶。值得注意的是，EgtD是S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)依賴性組氨酸N,N,N-甲基轉(zhuǎn)移酶，其催化使用SAM作為甲基供體使組氨酸甲基化以產(chǎn)生組氨酸三甲基內(nèi)鹽的反應(yīng)。
[0138] 愈創(chuàng)木酚可以從香草酸生產(chǎn)。因此，上述關(guān)于香草酸的目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的描述可以在必要修飾后適用于愈創(chuàng)木酚的目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶。香草酸可以通過(guò)香草酸脫羧酶(VDC)的作用轉(zhuǎn)化為愈創(chuàng)木酚。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括VDC。
[0139] 阿魏酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚可以從L-苯丙氨酸或L-酪氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括例如L-苯丙氨酸生物合成酶，L-酪氨酸生物合成酶，以及催化L-苯丙氨酸或L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚或4-乙基愈創(chuàng)木酚的酶。L-苯丙氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括上文例示的芳香族氨基酸的常見(jiàn)生物合成酶，以及分支酸變位酶(pheA)，預(yù)苯酸脫水酶(pheA)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrB)。分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶可以由pheA基因編碼為雙功能酶。L-酪氨酸生物合成酶的實(shí)例可以包括上文例示的芳香族氨基酸的常見(jiàn)生物合成酶，以及分支酸變位酶(tyrA)，預(yù)苯酸脫氫酶(tyrA)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrB)。分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫氫酶可以由tyrA基因編碼為雙功能酶。L-苯丙氨酸可以通過(guò)苯丙氨酸脫氨酶(PAL；EC?4.3.1.24)的作用轉(zhuǎn)化為肉桂酸，然后通過(guò)肉桂酸4-羥化酶(C4H；EC?1.14.13.11)的作用轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸。此外，L-酪氨酸可通過(guò)酪氨酸脫氨酶(TAL；EC?4.3.1.23)的作用轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸。對(duì)香豆酸可以分別通過(guò)羥基肉桂酸3-羥化酶(C3H)，O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)，阿魏酸脫羧酶(FDC)和乙烯基苯酚還原酶(VPR)的作用連續(xù)轉(zhuǎn)化為咖啡酸，阿魏酸，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚。也就是說(shuō)，催化L-苯丙氨酸或L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚或4-乙基愈創(chuàng)木酚的酶的實(shí)例可以包括這些酶。為了生產(chǎn)阿魏酸，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚或4-乙基愈創(chuàng)木酚，可以使用至少使用咖啡酸的OMT。
[0140] 多胺可以從L-精氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可包括，例如，L-精氨酸生物合成酶，L-鳥(niǎo)氨酸生物合成酶，以及催化L-精氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為多胺的酶。L-鳥(niǎo)氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)，N-乙酰谷氨酸激酶(argB)，N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)，乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD)和乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙酰酶(argE)。L-精氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括上文例示的L-鳥(niǎo)氨酸生物合成酶，以及氨甲酰磷酸合成酶(carAB)，鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(argF,argI)，精氨琥珀酸合成酶(argG)，精氨基琥珀酸裂合酶(argH)。L-精氨酸可以通過(guò)精氨酸脫羧酶(speA；EC?4.1.1.19)的作用轉(zhuǎn)化為胍丁胺，然后通過(guò)胍丁胺尿素水解酶(speA；EC?4.1.1.19)的作用轉(zhuǎn)化為腐胺。此外，L-鳥(niǎo)氨酸可以通過(guò)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(speC；EC?4.1.1.17)的作用轉(zhuǎn)化為腐胺。腐胺可以通過(guò)亞精胺合酶(speE；EC?2.5.1.16)的作用轉(zhuǎn)化為亞精胺，然后通過(guò)精胺合成酶(EC?2.5.1.22)的作用轉(zhuǎn)化為精胺。胍丁胺也可以通過(guò)胍丁胺/三胺氨基丙基轉(zhuǎn)移酶的作用轉(zhuǎn)化為氨基丙基胍丁胺，然后通過(guò)氨基丙基胍丁胺尿素水解酶的作用轉(zhuǎn)化為亞精胺。
也就是說(shuō)，催化L-精氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為多胺的酶的實(shí)例可以包括這些酶。值得注意的是，亞精胺合酶，精胺合成酶和胍丁胺/三胺氨基丙基轉(zhuǎn)移酶各自催化將來(lái)自脫羧的S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)(其可以通過(guò)脫羧作用從SAM產(chǎn)生)的丙胺基團(tuán)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的底物中的反應(yīng)。
也就是說(shuō)，催化L-精氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為多胺的酶的實(shí)例可以包括這些酶。值得注意的是，亞精胺合酶，精胺合成酶和胍丁胺/三胺氨基丙基轉(zhuǎn)移酶各自催化將來(lái)自脫羧的S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)(其可以通過(guò)脫羧作用從SAM產(chǎn)生)的丙胺基團(tuán)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的底物中的反應(yīng)。
[0141] 肌酸可以從L-精氨酸和甘氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括例如L-精氨酸生物合成酶，甘氨酸生物合成酶和催化L-精氨酸和甘氨酸轉(zhuǎn)化成肌酸的酶。可以將L-精氨酸和甘氨酸組合以通過(guò)精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(AGAT,EC?2.1.4.1)的作用產(chǎn)生胍基乙酸(guanidinoacetate)和鳥(niǎo)氨酸；使用SAM作為甲基供體，可以通過(guò)胍基乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GAMT,EC?2.1.1.2)的作用使胍基乙酸甲基化以生成肌酸。也就是說(shuō)，催化L-精氨酸和甘氨酸轉(zhuǎn)化為肌酸的酶的實(shí)例可包括這些酶。
[0142] 麥根酸可以從SAM生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可以包括例如催化SAM轉(zhuǎn)化為麥根酸的酶?？梢酝ㄟ^(guò)煙草胺(nicotianamine)合酶(EC?2.5.1.43)的作用從三個(gè)SAM分子合成一個(gè)煙草胺分子。煙草胺可以通過(guò)煙草胺轉(zhuǎn)氨酶(EC?2.6.1.80)、3"-脫氨基-3"-氧煙草胺(oxonicotianamine)還原酶(EC?1.1.1.285)和2'-脫氧麥根酸2'-雙加氧酶(EC?1.14.11.24)的作用連續(xù)轉(zhuǎn)化為3"-脫氨基-3"-氧煙草胺、2'-脫氧麥根酸和麥根酸。也就是說(shuō)，催化SAM轉(zhuǎn)化為麥根酸的酶的實(shí)例可以包括這些酶。
[0143] L-甲硫氨酸可以從L-半胱氨酸生產(chǎn)。也就是說(shuō)，目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的實(shí)例還可包括，例如，L-半胱氨酸生物合成酶和催化L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的酶。L-半胱氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括本文中描述的CysIXHDNYZ蛋白、Fpr2蛋白和CysK蛋白碼。催化L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的酶的實(shí)例可包括胱硫醚-γ-合酶和胱硫醚-β-裂合酶。
[0144] 用于賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法的實(shí)例還可以包括提高目標(biāo)物質(zhì)以外物質(zhì)，例如在生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)期間作為中間產(chǎn)物生成的物質(zhì)和用作目標(biāo)物質(zhì)前體的物質(zhì)的攝取系統(tǒng)的活性的方法。也就是說(shuō)，本發(fā)明的細(xì)菌可以以使此類攝取系統(tǒng)的活性得以增加的方式進(jìn)行了修飾。術(shù)語(yǔ)“物質(zhì)的攝取系統(tǒng)”可以指具有將來(lái)自細(xì)胞外部的物質(zhì)摻入細(xì)胞的功能的蛋白質(zhì)。此活性也可以稱為“物質(zhì)的攝取活性”。編碼此類攝取系統(tǒng)的基因也可以稱為“攝取系統(tǒng)基因”。此類攝取系統(tǒng)的實(shí)例可以包括香草酸攝取系統(tǒng)和原兒茶酸攝取系統(tǒng)。香草酸攝取系統(tǒng)的實(shí)例可以包括由vanK基因編碼的VanK蛋白(M.T.Chaudhry,et?al.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒桿菌ATCC13869菌株天然的vanK基因(NCgl2302)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:25所示，并且由該基因編碼的VanK蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:26所示。原兒茶酸攝取系統(tǒng)基因可以包括由pcaK基因編碼的PcaK蛋白(M.T.Chaudhry,et?al.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒桿菌ATCC13869菌株天然的pcaK基因(NCgl1031)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:27所示，并且由該基因編碼的PcaK蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:28所示。
[0145] 可以根據(jù)例如已知方法(M.T.Chaudhry,et?al.,Microbiology,2007.153:857-865)測(cè)量物質(zhì)的攝取活性。
[0146] 用于賦予或提高目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法的實(shí)例還可以包括降低參與目標(biāo)物質(zhì)以外的物質(zhì)的副生成的酶的活性的方法。除了目標(biāo)物質(zhì)以外的此類物質(zhì)也可以稱為“副產(chǎn)物”。此類酶也可以稱為“副產(chǎn)物生成酶”。副產(chǎn)物生成酶的實(shí)例可以包括例如參與目標(biāo)物質(zhì)利用的酶和催化遠(yuǎn)離目標(biāo)物質(zhì)的生物合成途徑分支的反應(yīng)以產(chǎn)生除目標(biāo)物質(zhì)之外的物質(zhì)的酶。本文描述了降低蛋白質(zhì)諸如酶等的活性的方法。通過(guò)例如破壞編碼蛋白質(zhì)的基因可以降低蛋白質(zhì)諸如酶等的活性。例如，據(jù)報(bào)道，在棒狀桿菌細(xì)菌中，香草醛按香草醛->香草酸->原兒茶酸的順序代謝并利用(Current?Microbiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。也就是說(shuō)，副產(chǎn)物生成酶的具體實(shí)例可以包括催化香草醛轉(zhuǎn)化為原兒茶酸的酶和催化原兒茶酸進(jìn)一步代謝的酶。此類酶的實(shí)例可以包括香草酸脫甲基酶，原兒茶酸3,4-雙加氧酶，以及將原兒茶酸3,4-雙加氧酶的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步分解為琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的各種酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。此外，可以通過(guò)醇脫氫酶的作用將香草醛轉(zhuǎn)化成香草醇(Kunjapur?AM.et?al.,J.Am.Chem.Soc.,2014,Vol.136,p11644-
11654.；Hansen?EH.et?al.,App.Env.Microbiol.,2009,Vol.75,p2765-2774.)。也就是說(shuō)，副產(chǎn)物生成酶的具體實(shí)例也可以包括醇脫氫酶(ADH)。此外，作為香草酸和香草醛生物合成途徑中間體的3-脫氫莽草酸也可以通過(guò)莽草酸脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為莽草酸。也就是說(shuō)，副產(chǎn)物生成酶的具體實(shí)例還可以包括莽草酸脫氫酶。
11654.；Hansen?EH.et?al.,App.Env.Microbiol.,2009,Vol.75,p2765-2774.)。也就是說(shuō)，副產(chǎn)物生成酶的具體實(shí)例也可以包括醇脫氫酶(ADH)。此外，作為香草酸和香草醛生物合成途徑中間體的3-脫氫莽草酸也可以通過(guò)莽草酸脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為莽草酸。也就是說(shuō)，副產(chǎn)物生成酶的具體實(shí)例還可以包括莽草酸脫氫酶。
[0147] 術(shù)語(yǔ)“香草酸脫甲基酶”可以指具有催化香草酸脫甲基化生成原兒茶酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。此活性也可以稱為“香草酸脫甲基酶活性”。編碼香草酸脫甲基酶的基因也可以稱為“香草酸脫甲基酶基因”。香草酸脫甲基酶的實(shí)例可以包括由vanAB基因編碼的VanAB蛋白(Current?Microbiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。vanA基因和vanB基因分別編碼香草酸脫甲基酶的亞基A和亞基B。為了降低香草酸脫甲基酶活性，這兩種vanAB基因可以被破壞等，或者兩者中僅一種可以被破壞等。谷氨酸棒桿菌ATCC13869天然菌株的vanAB基因的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:29和31所示，并且由這些基因編碼的VanAB蛋白的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:30和32所示。vanAB基因通常與vanK基因一起構(gòu)成vanABK操縱子。因此，為了降低香草酸脫甲基酶活性，vanABK操縱子可以被完全破壞等(例如缺失)。在此類情況下，可以將vanK基因再引入宿主。例如，當(dāng)使用存在于細(xì)胞外的香草酸，并且vanABK操縱子完全被破壞等(例如缺失)時(shí)，優(yōu)選再引入vanK基因。
[0148] 香草酸脫甲基酶活性可以通過(guò)例如將酶與底物諸如香草酸溫育并測(cè)量原兒茶酸的酶和底物依賴性產(chǎn)生來(lái)測(cè)量(J?Bacteriol,2001,Vol.183,p3276-3281)。
[0149] 術(shù)語(yǔ)“原兒茶酸3,4-雙加氧酶”可以指具有催化氧化原兒茶酸反應(yīng)生成β-羧基-順,順-粘康酸的反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)。此活性也可以稱為“原兒茶酸3,4-雙加氧酶活性”。編碼原兒茶酸3,4-雙加氧酶的基因也可以稱為“原兒茶酸3,4-雙加氧酶基因”。原兒茶酸3,4-雙加氧酶的實(shí)例可以包括由pcaGH基因編碼的PcaGH蛋白(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。pcaG基因和pcaH基因分別編碼原兒茶酸3,4-雙加氧酶的α亞基和β亞基。為了降低原兒茶酸3,4-雙加氧酶活性，這兩種pcaGH基因可以被破壞等，或者兩者中僅一種可以被破壞等。谷氨酸棒桿菌ATCC?13032菌株天然的pcaGH基因的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:33和35所示，并且由這些基因編碼的PcaGH蛋白的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:34和36所示。
[0150] 原兒茶酸3,4-雙加氧酶活性可以通過(guò)例如將酶與底物諸如原兒茶酸溫育并測(cè)量酶和底物依賴性氧消耗量來(lái)測(cè)量(Meth.Enz.,1970,Vol.17A,p526-529)。
[0151] 術(shù)語(yǔ)“醇脫氫酶(ADH)”可以指具有在電子供體存在下催化醛還原以產(chǎn)生醇的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?1.1.1.1，EC?1.1.1.2，EC?1.1.1.71等)。此活性也可以稱為“ADH活性”。編碼ADH的基因也可以稱為“ADH基因”。電子供體的實(shí)例可以包括NADH和NADPH。
[0152] 作為ADH，具有在電子供體存在下催化還原香草醛的反應(yīng)以產(chǎn)生香草醇的活性的ADH是一個(gè)特別的例子。該活性也可以特別稱為“香草醇脫氫酶活性”。此外，具有香草醇脫氫酶活性的ADH也可以特別稱為“香草醇脫氫酶”。作為ADH，具有催化在電子供體存在下還原香草醛以產(chǎn)生香草醇的反應(yīng)的活性的ADH是具體的實(shí)例。此活性也可以特別稱為“香草醇脫氫酶活性”。此外，具有香草醇脫氫酶活性的ADH也可以特別稱為“香草醇脫氫酶”。
[0153] ADH的實(shí)例可以包括分別由yqhD基因，NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因編碼的YqhD蛋白，NCgl0324蛋白質(zhì)，NCgl0313蛋白質(zhì)，NCgl2709蛋白質(zhì)，NCgl0219蛋白質(zhì)和NCgl2382蛋白質(zhì)。yqhD基因和NCgl0324基因編碼香草醇脫氫酶。yqhD基因可以在例如屬于腸桿菌科的細(xì)菌，諸如大腸桿菌中找到。NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因可以例如在棒狀桿菌細(xì)菌例如谷氨酸棒桿菌中找到。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的yqhD基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:37所示，并且由此基因編碼的YqhD蛋白的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:38所示。谷氨酸棒桿菌ATCC13869菌株天然的NCgl0324基因，NCgl0313基因和NCgl2709基因的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:39,41和43所示，并且由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:40,42和44所示。谷氨酸棒桿菌ATCC?13032菌株天然的NCgl0219基因和NCgl2382基因的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:45和47所示，并且由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:46和48所示。可以降低一種ADH的活性，或者可以降低兩種或更多種ADH的活性。例如，可以降低諸如NCgl0324蛋白質(zhì)，NCgl2709蛋白質(zhì)和NCgl0313蛋白質(zhì)中的一種或多種的活性。特別地，可以至少降低NCgl0324蛋白質(zhì)的活性。
[0154] ADH活性可以通過(guò)例如在NADPH或NADH存在下將酶與底物(諸如醛，如香草醛)一起溫育，并測(cè)量NADPH或NADH的酶和底物依賴性氧化來(lái)測(cè)量。
[0155] 術(shù)語(yǔ)“莽草酸脫氫酶”可以指具有催化在電子供體存在下還原3-脫氫莽草酸以產(chǎn)生莽草酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?1.1.1.25)。該活性也可稱為“莽草酸脫氫酶活性”。編碼莽草酸脫氫酶的基因也可稱為“莽草酸脫氫酶基因”。電子供體的實(shí)例可包括NADH和NADPH。莽草酸脫氫酶的實(shí)例可包括AroE蛋白，其由aroE基因編碼。大腸桿菌K-12MG1655菌株天然的aroE基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:49所示，并且由該基因編碼的AroE蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:50所示。
[0156] 莽草酸脫氫酶活性可以通過(guò)例如在NADPH或NADH存在下將酶與底物諸如3-脫氫莽草酸一起溫育，并測(cè)量NADPH或NADH的酶和底物依賴性氧化來(lái)測(cè)量。
[0157] 用于賦予或增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法的實(shí)例還可以包括增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性的方法。
[0158] 術(shù)語(yǔ)“L-半胱氨酸生物合成酶”可以指參與L-半胱氨酸生物合成的蛋白質(zhì)。編碼L-半胱氨酸生物合成酶的基因也可稱為“L-半胱氨酸生物合成基因”。L-半胱氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括參與硫利用的蛋白質(zhì)。參與硫利用的蛋白質(zhì)的實(shí)例可包括CysIXHDNYZ蛋白質(zhì)和Fpr2蛋白質(zhì)，它們分別由cysIXHDNYZ基因和fpr2基因編碼。CysIXHDNYZ蛋白特別涉及無(wú)機(jī)硫化合物如硫酸鹽和亞硫酸鹽的還原。特別地，F(xiàn)pr2蛋白可以參與電子轉(zhuǎn)運(yùn)以還原亞硫酸鹽。L-半胱氨酸生物合成酶的實(shí)例還可包括O-乙酰絲氨酸(硫醇)-裂合酶。O-乙酰絲氨酸(硫醇)-裂合酶的實(shí)例可包括CysK蛋白，其由cysK基因編碼。L-半胱氨酸生物合成酶的實(shí)例可包括各種生物體，例如腸桿菌科細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌天然的那些。L-半胱氨酸生物合成酶的具體實(shí)例可包括谷氨酸棒桿菌天然的CysIXHDNYZ蛋白，F(xiàn)pr2蛋白和CysK蛋白。谷氨酸棒桿菌ATCC?13869菌株天然的cysIXHDNYZ基因和fpr2基因的核苷酸序列分別以SEQ?ID?NOS:88,90,92,94,96,98,100,和102顯示，并且這些基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別以SEQ?ID?NOS:89,91,93,95,97,99,101和103顯示?？梢栽黾右环NL-半胱氨酸生物合成酶的活性，或者可以增加兩種或更多種L-半胱氨酸生物合成酶的活性。例如，可以增加CysIXHDNYZ蛋白、Fpr2蛋白和CysK蛋白中一種或多種的活性，或者可以增加CysIXHDNYZ蛋白和Fpr2蛋白中一種或多種的活性。
[0159] L-半胱氨酸生物合成酶的活性可以通過(guò)例如增加編碼L-半胱氨酸生物合成酶的基因(例如cysIXHDNYZ基因、fpr2基因和cysK基因)的表達(dá)來(lái)增加。
[0160] L-半胱氨酸生物合成基因的表達(dá)可以通過(guò)例如修飾(例如增加或減少)基因表達(dá)調(diào)節(jié)物的活性來(lái)增加。也就是說(shuō)，L-半胱氨酸生物合成基因的表達(dá)可以通過(guò)例如增加基因的正表達(dá)調(diào)節(jié)物(例如活化劑)的活性來(lái)增加。此外，L-半胱氨酸生物合成基因的表達(dá)可以通過(guò)例如降低基因的負(fù)表達(dá)調(diào)節(jié)物(例如阻遏物)的活性來(lái)增加。此類調(diào)節(jié)物也可稱為“調(diào)節(jié)蛋白”。編碼此類調(diào)節(jié)因子的基因也可稱為“調(diào)節(jié)基因”。
[0161] 此類活化劑的實(shí)例可包括CysR和SsuR蛋白，它們分別由cysR和ssuR基因編碼。CysR蛋白活性的增加可導(dǎo)致cysIXHDNYZ基因，fpr2基因和ssuR基因中一種或多種的表達(dá)增加。此外，SsuR蛋白活性的增加可以導(dǎo)致參與有機(jī)硫化合物利用的基因表達(dá)增加。此類活化劑的實(shí)例可包括各種生物體，例如腸桿菌科細(xì)菌和棒狀桿菌的那些活化劑。此類活化劑的具體實(shí)例可包括谷氨酸棒桿菌天然的CysR和SsuR蛋白。谷氨酸棒桿菌ATCC?13869菌株天然的cysR基因(NCgl0120)和ssuR基因的核苷酸序列分別以SEQ?ID?NO:104和106顯示，并且由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別以SEQ?ID?NO:105和107顯示?？梢栽黾覥ysR蛋白和SsuR蛋白中的一種或兩種的活性。例如，可以至少增加CysR蛋白的活性?？梢酝ㄟ^(guò)例如增加編碼活化劑的基因的表達(dá)來(lái)增加此類活化劑的活性。
[0162] 此類阻遏物的實(shí)例是McbR蛋白，其由mcbR基因編碼。McbR蛋白活性降低可以導(dǎo)致cysR和ssuR基因中一種或多種的表達(dá)增加，從而可進(jìn)一步導(dǎo)致cysIXHDNYZ基因和fpr2基因中一種或多種的表達(dá)增加。此類阻遏物的活性可以通過(guò)例如降低編碼阻遏物的基因的表達(dá)或通過(guò)破壞編碼阻遏物的基因來(lái)降低。
[0163] 也就是說(shuō)，具體地，可以通過(guò)例如增加cysIXHDNYZ基因，fpr2基因，cysR基因和ssuR基因中的一種或多種的表達(dá)來(lái)增加L-半胱氨酸生物合成酶的活性。因此，短語(yǔ)“L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加”可以表示例如cysIXHDNYZ基因，fpr2基因，cysR基因和ssuR基因中的一種或多種的表達(dá)得以增加。例如，可以至少增加cysR基因的表達(dá)。此外，例如，可以增加所有這些基因的表達(dá)。可以通過(guò)增加cysR基因的表達(dá)來(lái)增加cysIXHDNYZ基因，fpr2基因和ssuR基因中一種或多種的表達(dá)。
[0164] 用于賦予或增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法的實(shí)例可以進(jìn)一步包括降低NCgl2048蛋白活性的方法。
[0165] 術(shù)語(yǔ)“NCgl2048蛋白”可以指由NCgl2048基因編碼的蛋白質(zhì)。NCgl2048蛋白的實(shí)例可以包括各種生物體，諸如腸桿菌科細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌天然的蛋白。NCgl2048蛋白的具體實(shí)例可以包括谷氨酸棒桿菌天然的NCgl2048蛋白。谷氨酸棒桿菌ATCC?13869菌株天然的NCgl2048基因的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:119顯示，并且由此基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:120顯示。順便提及，關(guān)于本文中描述的保守變體，NCgl2048蛋白的原始功能可以指具有以SEQ?ID?NO:120所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能，或者也可以指微生物中的蛋白質(zhì)活性降低提供目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)增加的特性。
[0166] 待修飾活性的蛋白質(zhì)可以根據(jù)產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)的生物合成途徑的類型以及選定的微生物中固有存在的蛋白質(zhì)的類型和活性來(lái)適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)通過(guò)原兒茶酸的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛時(shí)，可優(yōu)選增強(qiáng)OMT，ACAR，PPT和原兒茶酸攝取系統(tǒng)中一種或多種的活性。此外，當(dāng)通過(guò)原兒茶醛生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛時(shí)，可以優(yōu)選增強(qiáng)OMT的活性。
[0167] 用于育種出具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物的基因和蛋白質(zhì)可以分別具有例如上面列舉的或其他已知的核苷酸序列和氨基酸序列。此外，用于育種出具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物的基因和蛋白質(zhì)可以是上面例示的基因和蛋白質(zhì)的保守變體，例如分別具有上述例示或其他已知核苷酸序列和氨基酸序列的基因和蛋白質(zhì)。具體地，例如，用于育種出具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物的基因可以各自是編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有上述例示的氨基酸序列或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列但可以包含一個(gè)或幾個(gè)位置處一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加，只要保持蛋白質(zhì)的原始功能，即其酶活性，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等即可。對(duì)于基因和蛋白質(zhì)的保守變體，可以在必要修改后適用關(guān)于本文描述的烯醇化酶基因和烯醇化酶的保守變體的描述。
[0168] <1-2>烯醇化酶活性的降低
[0169] 微生物可以以烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行修飾。具體地，微生物可以以與未修飾的菌株相比烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行修飾。通過(guò)以烯醇化酶活性得以降低的方式修飾微生物，可以改善微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力，并且也就是說(shuō)，可以增加通過(guò)使用微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)。此外，通過(guò)以烯醇化酶活性得以降低的方式修飾微生物，可能改善微生物生成或再生SAM的能力。也就是說(shuō)，具體地，微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的增加可以是由于微生物生成或再生SAM的能力增加所致。
[0170] 可以通過(guò)以烯醇化酶活性得以降低的方式修飾具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物獲得如本文中所述的微生物。也可以通過(guò)以烯醇化酶活性得以降低的方式修飾微生物，然后對(duì)微生物賦予目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力或增強(qiáng)微生物的目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力來(lái)獲得微生物。另外，由于降低烯醇化酶活性的修飾，或者由于降低烯醇化酶活性的修飾和賦予或增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力的其他修飾的組合，微生物可以已經(jīng)獲得了目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力。可以以任意順序進(jìn)行構(gòu)建微生物的修飾。
[0171] 術(shù)語(yǔ)“烯醇化酶”可以指具有催化將2-磷酸-D-甘油酸脫水以生成磷酸烯醇丙酮酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)(EC?4.2.1.11)。此活性也可以稱為“烯醇化酶活性”。烯醇化酶也可以稱為“磷酸丙酮酸水合酶”。編碼烯醇化酶的基因也可以稱為“烯醇化酶基因”。烯醇化酶的實(shí)例可以包括Eno蛋白，其由eno基因編碼。烯醇化酶諸如Eno蛋白的實(shí)例可以包括各種生物體，諸如腸桿菌科細(xì)菌和棒狀桿菌細(xì)菌天然的蛋白。烯醇化酶的具體實(shí)例可以包括谷氨酸棒桿菌天然的Eno蛋白。谷氨酸棒桿菌ATCC?13869菌株天然的eno基因(NCgl0935)的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:128顯示，并且由此蛋白質(zhì)編碼的Eno蛋白的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:129顯示。
[0172] 也就是說(shuō)，烯醇化酶基因可以是例如具有以SEQ?ID?NO:128所示的核苷酸序列的基因。此外，烯醇化酶可以是例如具有以SEQ?ID?NO:129所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。表述“基因或蛋白質(zhì)具有核苷酸或氨基酸序列”涵蓋當(dāng)基因或蛋白質(zhì)包含核苷酸或氨基酸序列時(shí)，以及當(dāng)基因或蛋白質(zhì)僅包含核苷酸或氨基酸序列時(shí)。
[0173] 烯醇化酶基因可以是上文例示的任何烯醇化酶基因(即eno基因)的變體，只要保持其原始功能即可。類似地，烯醇化酶可以是上文例示的任何烯醇化酶(諸如Eno蛋白)的變體，只要保持其原始功能即可。保持其原始功能的變體也可以稱為“保守變體”。用上述基因名稱定義的基因和用上述蛋白質(zhì)名稱定義的蛋白質(zhì)不僅可以分別包括上面例示的基因和蛋白質(zhì)，還可以包括其保守變體。也就是說(shuō)，例如，術(shù)語(yǔ)“eno基因或NCgl0935基因”不僅可以包括上面例示的eno基因，例如具有以SEQ?ID?NO:128所示核苷酸序列的eno基因，還可以包括其保守變體。類似地，術(shù)語(yǔ)“Eno蛋白或NCgl0935蛋白”不僅可包括上文例示的Eno蛋白，例如具有以SEQ?ID?NO:129所示的氨基酸序列的Eno蛋白，還可包括其保守變體。保守變體的實(shí)例可包括例如上文例示的基因和蛋白質(zhì)的同源物和人工修飾形式。
[0174] 表述“保持原始功能”指基因或蛋白質(zhì)的變體具有對(duì)應(yīng)于原始基因或蛋白質(zhì)的功能(例如活性或性質(zhì))的功能(例如活性或性質(zhì))。當(dāng)提到基因時(shí)，表述“保持原始功能”指該基因的變體編碼保持原始功能的蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，當(dāng)提及烯醇化酶基因時(shí)，表述“保持原始功能”指基因的變體編碼烯醇化酶。當(dāng)提及參與烯醇化酶時(shí)，表述“保持原始功能”指蛋白質(zhì)的變體具有烯醇化酶活性。
[0175] 烯醇化酶活性可以通過(guò)將酶與底物諸如2-磷酸-D-甘油酸一起溫育，并且測(cè)量磷酸烯醇丙酮酸的酶和底物依賴性生成來(lái)測(cè)量。
[0176] 以下將解釋保守變體的實(shí)例。
[0177] 烯醇化酶基因同源物或烯醇化酶同源物可以使用上述例示的烯醇化酶基因的任何核苷酸序列或上文例示的烯醇化酶的任何氨基酸序列作為查詢序列通過(guò)例如BLAST搜索或FASTA搜索從公共數(shù)據(jù)庫(kù)容易地獲得。此外，烯醇化酶基因的同源物可以通過(guò)例如使用棒狀桿菌細(xì)菌等生物體的染色體作為模板和基于上述例示的烯醇化酶基因的任何核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物的PCR獲得。
[0178] 烯醇化酶基因基因可以編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有任何上述氨基酸序列如以SEQ?ID?NO:129所示的氨基酸序列，且包括在一個(gè)或幾個(gè)位置處一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失，插入和/或添加，只要保持原始功能即可。例如，編碼的蛋白質(zhì)可以具有延伸的或缺失的N端和/或C端。盡管以上使用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或幾個(gè)”所表示的數(shù)目可以隨蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置或氨基酸殘基的類型而不同，具體而言，它例如為1至50，1至40，1至30，1至20，1至10，1至5，或1至3。
[0179] 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的上述取代，缺失，插入和/或添加可以各自是保持蛋白質(zhì)原始功能的保守突變。保守突變的典型實(shí)例是保守取代。若取代位點(diǎn)是芳香氨基酸，則保守取代是其中取代在Phe，Trp和Tyr之間相互發(fā)生的突變；若它是疏水性氨基酸，則保守取代是取代在Leu，Ile和Val之間相互發(fā)生的突變；若它是極性氨基酸；則保守取代是取代在Gln和Asn之間相互發(fā)生的突變；若它是堿性氨基酸，則保守取代是取代在Lys，Arg和His之間相互發(fā)生的突變；若它是酸性氨基酸，則保守取代是取代在Asp和Glu之間相互發(fā)生的突變；以及若它是具有羥基的氨基酸，則保守取代是取代在Ser和Thr之間相互發(fā)生的突變。認(rèn)為是保守取代的取代的實(shí)例可以具體包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln，His，或Lys取代Arg，用Glu，Gln，Lys，His，或Asp取代Asn，用Asn，Glu，或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn，Glu，Lys，His，Asp，或Arg取代Gln，用Gly，Asn，Gln，Lys，或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn，Lys，Gln，Arg，或Tyr取代His，用Leu，Met，Val，或Phe取代Ile，用Ile，Met，Val，或用Phe取代Leu，用Asn，Glu，Gln，His，或Arg取代Lys，用Ile，Leu，Val，或Phe取代Met，用Trp，Tyr，Met，Ile，或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His，Phe，或Trp取代Tyr，以及用Met，Ile，或Leu取代Val。此外，如上所述的氨基酸殘基的此類取代，缺失，插入，添加等可以包括由于個(gè)體差異引起的天然存在的突變或者該基因來(lái)源的生物體的物種的差異(突變體或變體)。
[0180] 此外，烯醇化酶基因可以是編碼與上述任何氨基酸序列的總氨基酸序列具有例如50％或更多，65％或更多，80％或更多，90％或更多，95％或更多，97％或更多，或99％或更多的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，只要保持原始功能。另外，在本說(shuō)明書(shū)中，“同源性”等同于“同一性”。
[0181] 此外，烯醇化酶基因可以是能夠在嚴(yán)格條件下與可以從任何前述核苷酸序列，如以SEQ?ID?NOS:128所示的核苷酸序列制備的探針，例如與任何上述核苷酸序列的全部序列或部分序列互補(bǔ)的序列雜交的基因(例如DNA)，只要保持原始功能?！皣?yán)格條件”可以指形成所謂特異性雜合物，并且不形成非特異性雜合物的條件。嚴(yán)格條件的實(shí)例可以包括高度同源的DNA彼此雜交(例如，不小于50％，65％，或80％同源，不小于90％同源，不小于95％同源，不小于97％同源，或不小于99％同源的DNA彼此雜交，并且同源性小于上述項(xiàng)的DNA不彼此雜交)的那些條件，或典型的Southern雜交的清洗條件，即在與1x?SSC，0.1％SDS于60℃；0.1x?SSC，0.1％SDS于60℃；或者0.1x?SSC，0.1％SDS于68℃對(duì)應(yīng)的鹽濃度和溫度清洗1次，或2或3次的條件。
[0182] 用于上述雜交的探針可以是與如上述的基因互補(bǔ)的序列的一部分。此類探針可以使用基于已知基因序列制備的寡核苷酸作為引物和含有任何上述基因的DNA片段作為模板通過(guò)PCR制備。作為探針，例如可以使用長(zhǎng)度約300bp的DNA片段。當(dāng)使用長(zhǎng)度為約300bp的DNA片段作為探針時(shí)，具體地，雜交的清洗條件可以是例如50℃，2xSSC和0.1％SDS。
[0183] 此外，由于關(guān)于密碼子簡(jiǎn)并性的性質(zhì)隨宿主而變化，烯醇化酶基因可以包括相應(yīng)等同密碼子對(duì)任意密碼子的替換。也就是說(shuō)，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，烯醇化酶基因可以是以上例示的任何烯醇化酶基因的變體。例如，烯醇化酶基因可以以使其根據(jù)選擇的宿主中的密碼子頻率而具有最佳密碼子的方式進(jìn)行了修飾的基因。
[0184] 例如，可以通過(guò)數(shù)學(xué)算法來(lái)確定兩個(gè)序列之間的序列同一性的百分比。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例可以包括Myers?and?Miller(1988)CABIOS?4:11-17的算法、Smith?et?al(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman?and?Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比對(duì)算法、Pearson?and?Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的同源性篩選方法和Karlin?and?Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA?87:2264的算法的修改形式，諸如記載于Karlin?and?Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA?90:5873-5877的。
[0185] 通過(guò)使用基于此類數(shù)學(xué)算法的程序，可以進(jìn)行用于確定序列同一性的序列比較和比對(duì)。該程序可以由計(jì)算機(jī)適當(dāng)?shù)貓?zhí)行。此類程序的實(shí)例可以包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL(可從Intelligenetics,Mountain?View,Calif.獲得)，ALIGN程序(版本2.0)以及Wisconsin?Genetics?Software?Package,版本8(可從Genetics?Computer?Group(GCG),575?Science?Drive,Madison,Wis.,USA獲得)的GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA和TFASTA。使用這些程序的比對(duì)可以通過(guò)使用例如初始參數(shù)來(lái)進(jìn)行。CLUSTAL程序充分記載于Higgins?et?al.(1988)Gene?73:237-244(1988),Higgins?et?al.(1989)CABIOS?5:151-153,Corpet?et?al.(1988)Nucleic?Acids?Res.16:10881-90,Huang?et?al.(1992)CABIOS?8:155-65,以及Pearson?et?al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。
[0186] 為了獲得與靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，具體而言，例如，可以通過(guò)使用BLASTN程序以100的得分和12的字長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索。為了獲得與靶蛋白質(zhì)同源的氨基酸序列，特別地，例如可以通過(guò)以50的得分和3的字長(zhǎng)使用BLASTX程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索。關(guān)于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白質(zhì)搜索，參見(jiàn)ncbi.nlm.nih.gov。另外，為了比較目的，可以使用Gapped?BLAST(BLAST?2.0)以獲得包含缺口的比對(duì)。另外，可以使用PSI-BLAST來(lái)進(jìn)行重復(fù)搜索以檢測(cè)序列之間的遠(yuǎn)距離關(guān)系。關(guān)于Gapped?BLAST和PSI-BLAST，參見(jiàn)Altschul?et?al.(1997)Nucleic?Acids?Res.25:3389。當(dāng)使用BLAST、Gapped?BLAST或PSI-BLAST時(shí)，可以使用每個(gè)程序的初始參數(shù)(例如核苷酸序列的BLASTN和氨基酸序列的BLASTX)。比對(duì)也可以手動(dòng)進(jìn)行。
[0187] 兩個(gè)序列之間的序列同一性計(jì)算為在比對(duì)兩個(gè)序列以便彼此最大限度配合時(shí)兩個(gè)序列中匹配的殘基的比率。
[0188] 前述關(guān)于基因和蛋白質(zhì)的保守變體的描述可以在必要修改后應(yīng)用于任意蛋白質(zhì)的變體，例如目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶和編碼它們的基因。
[0189] <1-3>增加蛋白質(zhì)活性的方法
[0190] 以下，將解釋用于增加蛋白質(zhì)活性的方法。
[0191] 表述“蛋白質(zhì)的活性得以增加”指與非修飾菌株相比，蛋白質(zhì)的活性增加。具體而言，表述“蛋白質(zhì)的活性得以增加”可以意味著與非修飾菌株相比，每細(xì)胞的蛋白質(zhì)的活性增加。術(shù)語(yǔ)“非修飾菌株”或“非修飾的微生物的菌株”可以指尚未以增加目標(biāo)蛋白質(zhì)活性的方式進(jìn)行修飾的對(duì)照菌株。非修飾菌株的實(shí)例可以包括野生型菌株和親本菌株。非修飾菌株的具體實(shí)例可以包括微生物物種的相應(yīng)類型菌株。非修飾菌株的具體實(shí)例還可以包括以上關(guān)于微生物描述所例示的菌株。也就是說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，與類型菌株，即微生物所屬的物種的類型菌株相比，蛋白質(zhì)的活性可以得以增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與谷氨酸棒桿菌ATCC13869菌株相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與大腸桿菌K-12MG1655菌株相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以增加?！暗鞍踪|(zhì)活性得以增加”的短語(yǔ)也可以表達(dá)為“蛋白質(zhì)的活性得以增強(qiáng)”。更具體地說(shuō)，表述“蛋白質(zhì)的活性得以增加”可以意味著與非修飾菌株相比每細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分子數(shù)目增加，和/或蛋白質(zhì)的每個(gè)分子的功能增加。也就是說(shuō)，表述“蛋白質(zhì)活性得以增加”中的術(shù)語(yǔ)“活性”不限于蛋白質(zhì)的催化活性，而且還可以指編碼蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄量(即mRNA的量)，或蛋白質(zhì)的翻譯量(即蛋白質(zhì)的量)。此外，“蛋白質(zhì)的活性得以增加”的短語(yǔ)不僅包括當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性在固有具有目標(biāo)蛋白質(zhì)活性的菌株中增加時(shí)，而且還包括當(dāng)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性賦予不固有地具有目標(biāo)蛋白質(zhì)活性的菌株時(shí)。此外，只要蛋白質(zhì)的活性最終得以增加，宿主中固有存在的目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性可以弱化和/或消除，然后可以將適當(dāng)類型的目標(biāo)蛋白質(zhì)賦予宿主。
[0192] 蛋白質(zhì)活性增加的程度不受特別限制，只要蛋白質(zhì)的活性與非修飾菌株相比增加即可。蛋白質(zhì)的活性可以增加至例如非修飾菌株的蛋白質(zhì)活性的1.2倍以上，1.5倍以上，2倍以上，或3倍以上。此外，當(dāng)非修飾菌株不具有目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性時(shí)，足夠的是由于引入編碼蛋白質(zhì)的基因而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并且例如，蛋白質(zhì)可以以使其活性可以得到測(cè)量的程度生產(chǎn)。
[0193] 提高蛋白質(zhì)活性的修飾可以通過(guò)例如增加編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。短語(yǔ)“基因的表達(dá)得以增加”意指與非修飾菌株如野生型菌株和親本菌株相比，基因的表達(dá)得以增加。具體而言，短語(yǔ)“基因表達(dá)得以增加”可以意味著每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)量與非修飾菌株相比得以增加。更具體地，短語(yǔ)“基因表達(dá)得以增加”可以意味著基因的轉(zhuǎn)錄量(即mRNA的量)得以增加，和/或基因的翻譯量(即從基因表達(dá)的蛋白質(zhì)量)得以增加?！盎虮磉_(dá)得以增加”的短語(yǔ)也稱為“基因表達(dá)得以增強(qiáng)”?；虻谋磉_(dá)可以增加至例如非修飾菌株的表達(dá)的1.2倍以上，1.5倍以上，2倍以上，或3倍以上。此外，“基因表達(dá)得以增加”的短語(yǔ)不僅可以包括當(dāng)目標(biāo)基因的表達(dá)量在固有表達(dá)目標(biāo)基因的菌株中得以增加時(shí)，而且還包括當(dāng)將基因引入到不固有地表達(dá)目標(biāo)基因并在其中表達(dá)的菌株中時(shí)。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“基因表達(dá)得以增加”也可以意指例如，將目標(biāo)基因引入不擁有該基因的菌株中并在其中表達(dá)。
[0194] 例如，可以通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)來(lái)增加基因的表達(dá)。
[0195] 可以通過(guò)將基因引入宿主的染色體來(lái)增加基因的拷貝數(shù)。例如可以通過(guò)使用同源重組(Miller,J.H.,Experiments?in?Molecular?Genetics,1972,Cold?Spring?Harbor?Laboratory)將基因引入染色體。使用同源重組的基因轉(zhuǎn)移方法的實(shí)例可以包括使用線性DNA的方法，諸如Red驅(qū)動(dòng)的整合(Datsenko,K.A.,and? Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，使用含有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法，使用能夠接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，使用不具有在宿主中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法，使用噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法?？梢砸牖虻膬H一個(gè)拷貝，或可以引入基因的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。例如，通過(guò)使用以染色體上的多個(gè)拷貝存在的序列作為靶標(biāo)進(jìn)行同源重組，可以將多個(gè)拷貝的基因引入染色體。以多個(gè)拷貝存在于染色體上的此類序列的實(shí)例可以包括重復(fù)DNA和位于轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復(fù)序列?；蛘?，可以通過(guò)使用染色體上的適當(dāng)序列，如對(duì)于產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)不必要的基因作為靶標(biāo)進(jìn)行同源重組。另外，也可以用轉(zhuǎn)座子或Mini-Mu(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.2-109985,美國(guó)專利No.5,882,888,EP?805867B1)將基因隨機(jī)引入染色體。
[0196] 可以通過(guò)使用具有與全部基因或其一部分互補(bǔ)的序列的探針進(jìn)行Southern雜交、使用基于該基因序列制備的引物的PCR等確認(rèn)靶基因?qū)θ旧w的引入。
[0197] 此外，通過(guò)將含有該基因的載體引入宿主中，也可以增加基因的拷貝數(shù)。例如，通過(guò)將含有靶基因的DNA片段與在宿主中起作用的載體連接以構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，并用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，可以增加靶基因的拷貝數(shù)?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用具有靶基因的微生物的基因組DNA作為模板的PCR獲得含有靶基因的DNA片段。作為載體，可以使用宿主細(xì)胞中可自主復(fù)制的載體。該載體可以是多拷貝載體。此外，載體可以具有用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)志物如抗生素抗性基因。此外，載體可以具有用于表達(dá)引入的基因的啟動(dòng)子和/或終止子。載體可以是例如源自細(xì)菌質(zhì)粒的載體，源自酵母質(zhì)粒的載體，源自噬菌體的載體，粘粒，噬菌粒等。可在腸桿菌科細(xì)菌諸如大腸桿菌中自主復(fù)制的載體的具體實(shí)例可以包括例如pUC19,pUC18,pHSG299,pHSG399,pHSG398,pBR322,pSTV29(所有這些可購(gòu)自Takara?Bio),pACYC184,pMW219(NIPPON?GENE),pTrc99A(Pharmacia),pPROK系列載體(Clontech),pKK233-2(Clontech),pET系列載體(Novagen),pQE系列載體(QIAGEN),pCold?TF?DNA(TaKaRa),pACYC系列載體，和寬宿主范圍的載體RSF1010。可在棒狀桿菌細(xì)菌中自主復(fù)制的載體的具體實(shí)例可以包括例如pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；通過(guò)改善這些質(zhì)粒獲得并具有藥物抗性基因的質(zhì)粒；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.3-210184中描述的質(zhì)粒pCRY30；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.2-72876和美國(guó)專利No.5,185,262中描述的質(zhì)粒pCRY21，pCRY2KE，pCRY2KX，pCRY31，pCRY3KE和pCRY3KX；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.1-191686中描述的質(zhì)粒pCRY2和pCRY3；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.58-192900中描述的pAJ655，pAJ611和pAJ1844；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.57-134500中描述的pCG1；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.58-35197中描述的pCG2；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.57-183799中描述的pCG4和pCG11；日本專利公開(kāi)(Kokai)No.10-215883中描述的pVK7；WO2007/046389中描述的pVK9；WO2013/069634中描述的pVS7；和日本專利公開(kāi)(Kokai)No.9-070291中描述的pVC7。
[0198] 當(dāng)引入基因時(shí)，宿主可以表達(dá)基因是足夠的。具體而言，宿主中存在基因以便其在宿主中起作用的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)是足夠的。術(shù)語(yǔ)“在宿主中起作用的啟動(dòng)子”可以指在宿主中顯示啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是源自宿主的啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是待引入基因的天然啟動(dòng)子或另一基因的啟動(dòng)子。作為啟動(dòng)子，例如也可以使用如本文描述的更強(qiáng)的啟動(dòng)子。
[0199] 終止基因轉(zhuǎn)錄的終止子可以位于基因的下游。終止子沒(méi)有特別限制，只要其在選擇的宿主中起作用。終止子可以是源自宿主的終止子或異源終止子。終止子可以是待引入基因的天然終止子或另一基因的終止子。終止子的具體實(shí)例可以包括例如T7終止子、T4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子和trpA終止子。
[0200] 在“Fundamental?Microbiology?Vol.8,Genetic?Engineering,KYORITSU?SHUPPAN?CO.,LTD,1987”中詳細(xì)公開(kāi)了可用于各種微生物中的載體，啟動(dòng)子和終止子，并且可以使用那些。
[0201] 此外，當(dāng)引入兩個(gè)或更多個(gè)基因時(shí)，基因各自可以由宿主表達(dá)是足夠的。例如，所有基因可以由單個(gè)表達(dá)載體或染色體攜帶。此外，基因可以分別由兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)載體攜帶，或者分開(kāi)由單一或兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)載體和染色體攜帶。也可以引入由兩個(gè)或更多個(gè)基因構(gòu)成的操縱子。“引入2個(gè)或更多個(gè)基因”的短語(yǔ)可以指例如引入編碼2種或更多種蛋白質(zhì)(酶等)的相應(yīng)基因，引入編碼構(gòu)成單一蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如酶復(fù)合物)的2種或更多種亞基的相應(yīng)基因以及它們的組合。
[0202] 待引入的基因沒(méi)有特別限制，只要它編碼在宿主中起作用的蛋白即可。待引入的基因可以是源自宿主的基因，或者可以是異源基因?？梢岳缡褂没谠摶虻暮塑账嵝蛄性O(shè)計(jì)的引物，并使用具有該基因的生物體的基因組DNA，攜帶該基因的質(zhì)粒等作為模板通過(guò)PCR獲得待引入的基因。待引入的基因也可以完全合成，例如基于該基因的核苷酸序列(Gene,60(1),115-127(1987))。獲得的基因可以原樣使用，或者根據(jù)需要在修飾后使用。也就是說(shuō)，可以通過(guò)修飾基因來(lái)獲得基因的變體?；蚩梢酝ㄟ^(guò)已知技術(shù)進(jìn)行修飾。例如，可以通過(guò)位點(diǎn)特異性突變方法將目標(biāo)突變引入DNA的目標(biāo)位點(diǎn)。也就是說(shuō)，可以通過(guò)位點(diǎn)特異性突變方法修飾基因的編碼區(qū)，使得編碼蛋白的特定位點(diǎn)包括氨基酸殘基的取代，缺失，插入和/或添加。位點(diǎn)特異性突變方法的實(shí)例可以包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCR?Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton?Press(1989)；Carter,P.,Meth.in?Enzymol.,154,382(1987))和利用噬菌體的方法(Kramer,W.and?Frits,H.J.,Meth.于Enzymol.,154,
350(1987)；Kunkel,T.A.et?al.,Meth.in?Enzymol.,154,367(1987))?；蛘撸梢酝耆铣苫虻淖凅w。
350(1987)；Kunkel,T.A.et?al.,Meth.in?Enzymol.,154,367(1987))?；蛘撸梢酝耆铣苫虻淖凅w。
[0203] 另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)作為由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合物起作用時(shí)，可以修飾多個(gè)亞基的部分或全部，只要蛋白質(zhì)的活性最終得以增加。也就是說(shuō)，例如，當(dāng)通過(guò)增加基因的表達(dá)來(lái)增加蛋白質(zhì)的活性時(shí)，可以增強(qiáng)編碼亞基的多個(gè)基因的部分或全部的表達(dá)。通常優(yōu)選增強(qiáng)編碼亞基的多個(gè)基因全部的表達(dá)。此外，構(gòu)成該復(fù)合物的亞基可以源自單一種類的生物體或兩種或更多種生物體，只要該復(fù)合物具有目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能即可。也就是說(shuō)，例如，可以將編碼多個(gè)亞基的相同生物體的基因引入宿主，或者可以將編碼多個(gè)亞基的不同生物體的基因引入宿主中。
[0204] 此外，可以通過(guò)改善基因的轉(zhuǎn)錄效率增加基因的表達(dá)。另外，通過(guò)提高基因的翻譯效率也可以增加基因的表達(dá)?；虻霓D(zhuǎn)錄效率和基因的翻譯效率可以通過(guò)例如修飾基因的表達(dá)控制序列來(lái)改善。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”可以共同指影響基因表達(dá)的位點(diǎn)。表達(dá)控制序列的實(shí)例可以包括例如啟動(dòng)子，Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS))和RBS與起始密碼子之間的間隔物區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)使用啟動(dòng)子搜索載體或基因分析軟件如GENETYX來(lái)鑒定表達(dá)控制序列。這些表達(dá)調(diào)控序列可以通過(guò)例如使用溫度敏感性載體的方法或Red驅(qū)動(dòng)整合方法(WO2005/010175)進(jìn)行修飾。
[0205] 通過(guò)例如用更強(qiáng)的啟動(dòng)子替換染色體上的基因的啟動(dòng)子可以提高基因的轉(zhuǎn)錄效率。術(shù)語(yǔ)“更強(qiáng)的啟動(dòng)子”可以指與基因的固有的野生型啟動(dòng)子相比提供改善的基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。更強(qiáng)的啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括例如已知的高表達(dá)啟動(dòng)子，諸如T7啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、thr啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、araBAD啟動(dòng)子、rpoH啟動(dòng)子、msrA啟動(dòng)子、Pm1啟動(dòng)子(源自雙歧桿菌屬(Bifidobacterium))、PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子。在棒狀桿菌細(xì)菌中可用的更強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括例如在棒狀桿菌細(xì)菌中用乙酸、乙醇、丙酮酸等可誘導(dǎo)的人工修飾的P54-6啟動(dòng)子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)),pta,aceA,aceB,adh,和amyE啟動(dòng)子，cspB，SOD和tuf(EF-Tu)啟動(dòng)子，它們是能夠在棒狀桿菌細(xì)菌中提供大表達(dá)量的有力啟動(dòng)子(Journal?of?Biotechnology,104(2003)311-323；Appl.Environ.Microbiol.,2005Dec；71(12):8587-96)，P2啟動(dòng)子(SEQ?ID?NO:
108的位置942-1034)和P3啟動(dòng)子(SEQ?ID?NO:111)以及l(fā)ac啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子。此外，作為更強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過(guò)使用各種報(bào)道基因也可以獲得高活性類型的現(xiàn)有啟動(dòng)子。例如，通過(guò)使啟動(dòng)子區(qū)中的-35和-10區(qū)更接近共有序列，可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性(WO00/
18935)。高活性型啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括各種tac樣啟動(dòng)子(Katashkina?JI?et?al.,Russian?Federation?Patent?Application?No.2006134574)。在Goldstein?et?al.(Prokaryotic?Promoters?in?Biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))的論文等中描述了評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例。
108的位置942-1034)和P3啟動(dòng)子(SEQ?ID?NO:111)以及l(fā)ac啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子。此外，作為更強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過(guò)使用各種報(bào)道基因也可以獲得高活性類型的現(xiàn)有啟動(dòng)子。例如，通過(guò)使啟動(dòng)子區(qū)中的-35和-10區(qū)更接近共有序列，可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性(WO00/
18935)。高活性型啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括各種tac樣啟動(dòng)子(Katashkina?JI?et?al.,Russian?Federation?Patent?Application?No.2006134574)。在Goldstein?et?al.(Prokaryotic?Promoters?in?Biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))的論文等中描述了評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例。
[0206] 例如，通過(guò)用更強(qiáng)的SD序列替換染色體上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS))，可以改善基因的翻譯效率。術(shù)語(yǔ)“更強(qiáng)的SD序列”可以指與基因固有的野生型SD序列相比提供改善的mRNA翻譯的SD序列。更強(qiáng)的SD序列的實(shí)例可以包括例如源自噬菌體T7的基因10的RBS(Olins?P.O.et?al,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知在RBS和起始密碼子之間的間隔物區(qū)中，特別是在緊鄰起始密碼子上游的序列(5'-UTR)中，幾個(gè)核苷酸的取代，插入或缺失顯著影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，因此，也可以通過(guò)修飾來(lái)改善基因的翻譯效率。
[0207] 基因的翻譯效率也可以通過(guò)例如修飾密碼子來(lái)改善。例如，通過(guò)用更頻繁使用的同義密碼子取代基因中存在的稀有密碼子，可以提高基因的翻譯效率。也就是說(shuō)，例如，基因可以以使該基因含有根據(jù)在選擇的宿主中觀察到的密碼子頻率的最佳密碼子的方式進(jìn)行了修飾。例如，可以通過(guò)用于將目標(biāo)突變引入DNA的目標(biāo)位點(diǎn)中的位點(diǎn)特異性突變方法替換密碼子?；蛘?，可以完全合成替換目標(biāo)密碼子的基因片段。“密碼子選擇數(shù)據(jù)庫(kù)”(kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et?al,Nucl.Acids?Res.,28,292(2000))中公開(kāi)了各種生物體中的密碼子的頻率。
[0208] 此外，基因的表達(dá)還可以通過(guò)擴(kuò)增增加基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子或缺失或弱化減少基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子來(lái)增加。
[0209] 可以獨(dú)立使用或以任意組合使用如上所述用于增加基因表達(dá)的此類方法。
[0210] 此外，也可以通過(guò)例如增強(qiáng)酶的比活性來(lái)獲得增加蛋白質(zhì)活性的修飾。比活性的增強(qiáng)也可以包括對(duì)反饋抑制的脫敏。也就是說(shuō)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被代謝物反饋抑制時(shí)，可以通過(guò)使選擇的宿主中的基因或蛋白質(zhì)突變以對(duì)反饋抑制脫敏來(lái)增加蛋白質(zhì)的活性。短語(yǔ)“對(duì)反饋抑制脫敏”可以包括消除反饋抑制，和弱化反饋抑制，除非另有敘述。此外，“對(duì)反饋抑制脫敏”的短語(yǔ)，即當(dāng)反饋抑制得到消除或弱化時(shí)，也可以稱為“對(duì)反饋抑制耐受”。通過(guò)例如搜索各種生物體可以獲得顯示增強(qiáng)的比活性的蛋白質(zhì)。此外，通過(guò)向現(xiàn)有蛋白質(zhì)中引入突變也可以獲得高活性類型的固有蛋白質(zhì)。待引入的突變可以是例如在蛋白質(zhì)的一個(gè)或幾個(gè)位置上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失，插入和/或添加。可以通過(guò)例如如上所述的此類位點(diǎn)特異性突變方法來(lái)引入突變。突變也可以通過(guò)例如誘變處理來(lái)引入。誘變處理的實(shí)例可以包括X射線照射，紫外線照射和用突變劑如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)處理。此外，可以通過(guò)用羥胺在體外直接處理DNA來(lái)誘導(dǎo)隨機(jī)突變。比活性的增強(qiáng)可以獨(dú)立使用，或者可以與如上述用于增強(qiáng)基因表達(dá)的此類方法任意組合使用。
[0211] 用于轉(zhuǎn)化的方法不受特別限制，并且可以使用常規(guī)已知的方法。可以使用例如用氯化鈣處理接受細(xì)胞以增加其對(duì)DNA的通透性的方法，其已經(jīng)對(duì)大腸桿菌K-12菌株報(bào)道(Mandel,M.and?Higa,A.,J.Mol.Biol.,1970,53,159-162)，以及從生長(zhǎng)階段中的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞，接著用DNA轉(zhuǎn)化的方法，其已經(jīng)對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)報(bào)告(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and?Young,F.E.,Gene,1977,1:153-167)?；蛘撸梢允褂檬笵NA-接受細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體或原生質(zhì)球(其可以容易攝取重組DNA)，接著將重組DNA引入DNA-接受細(xì)胞中的方法，已知該方法適用于枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母(Chang,S.and?Choen,S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.,168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and?Hopwood,O.A.,1978,Nature,274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and?Fink,G.R.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933)。此外，也可以使用對(duì)棒狀桿菌細(xì)菌報(bào)告的電脈沖方法(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.2-207791)。
[0212] 可以通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)的活性來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)活性的增加。
[0213] 通過(guò)確認(rèn)編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增加，也可以確認(rèn)蛋白質(zhì)活性的增加。可以通過(guò)確認(rèn)基因轉(zhuǎn)錄量的增加或通過(guò)確認(rèn)從該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)量的增加來(lái)確認(rèn)基因表達(dá)的增加。
[0214] 可以通過(guò)比較從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與非修飾菌株如野生型菌株或親本菌株的mRNA量來(lái)確認(rèn)基因轉(zhuǎn)錄量的增加。用于評(píng)估m(xù)RNA量的方法的實(shí)例可以包括Northern雜交，RT-PCR等(Sambrook,J.,et?al.,Molecular?Cloning?A?Laboratory?Manual/第三版,Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,Cold?Spring?Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加到例如非修飾菌株的mRNA量的1.2倍以上，1.5倍以上，2倍以上或3倍以上。
[0215] 可以通過(guò)使用抗體的Western印跡法(Molecular?Cloning,Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,Cold?Spring?Harbor(USA),2001)來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)量的增加。蛋白質(zhì)的量(諸如每細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子的數(shù)目)可以增加到例如非修飾菌株的蛋白質(zhì)量的1.2倍以上，1.5倍以上，2倍以上或3倍以上。
[0216] 上述提高蛋白質(zhì)活性的方法可用于提高任意蛋白質(zhì)如目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶，磷酸泛酰巰基乙胺基化酶和物質(zhì)攝取系統(tǒng)的活性，和增強(qiáng)任意基因如編碼那些任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。
[0217] <1-4>降低蛋白質(zhì)活性的方法
[0218] 以下，將解釋用于降低蛋白質(zhì)諸如烯醇化酶的活性的方法。
[0219] 表述“蛋白質(zhì)的活性得以降低”指與非修飾菌株相比蛋白質(zhì)的活性得以降低。具體而言，表述“蛋白質(zhì)的活性得以降低”可以意味著與非修飾菌株相比，每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的活性得以降低。術(shù)語(yǔ)“非修飾菌株”可以指尚未以使目的蛋白質(zhì)的活性得以降低的方式進(jìn)行修飾的對(duì)照菌株。非修飾菌株的實(shí)例可以包括野生型菌株和親本菌株。非修飾菌株的具體實(shí)例可以包括微生物物種的相應(yīng)類型菌株。非修飾菌株的具體實(shí)例還可以包括以上關(guān)于微生物描述所例示的菌株。也就是說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，與類型菌株，即微生物所屬的物種的類型菌株相比，可以降低蛋白質(zhì)的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與谷氨酸棒桿菌ATCC?13869菌株相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與谷氨酸棒桿菌ATCC?13032相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以降低。另一個(gè)實(shí)施方案中，與大腸桿菌K-12?MG1655菌株相比，蛋白質(zhì)的活性也可以得以降低。“蛋白質(zhì)活性得以降低”的短語(yǔ)還可以包括當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的活性已經(jīng)完全消失時(shí)。更具體地說(shuō)，表述“蛋白質(zhì)的活性得以降低”可以意味著與非修飾的菌株相比每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分子數(shù)目得以減少，和/或蛋白質(zhì)的每個(gè)分子的功能得以降低。也就是說(shuō)，表述“蛋白質(zhì)的活性得以降低”中的術(shù)語(yǔ)“活性”不限于蛋白質(zhì)的催化活性，而且還可以指編碼蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄量(即mRNA的量)或蛋白質(zhì)的翻譯量(即蛋白質(zhì)的量)?！懊總€(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分子數(shù)目得以減少”的短語(yǔ)還可以包括當(dāng)完全不存在蛋白質(zhì)時(shí)?！暗鞍踪|(zhì)的每個(gè)分子的功能得以降低”的短語(yǔ)也可以包括當(dāng)每個(gè)蛋白質(zhì)分子的功能完全消失時(shí)。蛋白質(zhì)活性降低的程度沒(méi)有特別限制，只要活性與非修飾菌株的活性相比降低即可。蛋白質(zhì)的活性可以降低到例如非修飾菌株的蛋白質(zhì)活性的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
[0220] 可以通過(guò)例如減少編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)用于降低蛋白質(zhì)活性的修飾。短語(yǔ)“基因的表達(dá)得以降低”指與非修飾菌株如野生型菌株和親本菌株相比，該基因的表達(dá)得以降低。具體而言，短語(yǔ)“基因表達(dá)得以降低”可以意味著與非修飾菌株相比，每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)得以降低。更具體地說(shuō)，短語(yǔ)“基因表達(dá)得以降低”可以意味著基因的轉(zhuǎn)錄量(即mRNA的量)得以減少，和/或基因的翻譯量(即從基因表達(dá)的蛋白質(zhì)量)得以減少。“基因表達(dá)得以降低”的短語(yǔ)也可以包括當(dāng)基因完全不表達(dá)時(shí)?！盎虮磉_(dá)得以降低”的短語(yǔ)也可以稱為“基因表達(dá)得以弱化”。基因的表達(dá)可以降低到例如非修飾菌株的表達(dá)的50％或更少，
20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
[0221] 基因表達(dá)的降低可以是由于例如轉(zhuǎn)錄效率降低，翻譯效率降低或組合所致。可以通過(guò)修飾基因的表達(dá)控制序列諸如啟動(dòng)子，Shine-Dalgarno(SD)序列(其也可以稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS))，和基因的RBS和起始密碼子之間的間隔物區(qū)來(lái)降低基因的表達(dá)。當(dāng)修飾表達(dá)控制序列時(shí)，修飾表達(dá)控制序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸，或三個(gè)或更多個(gè)核苷酸。例如，通過(guò)用更弱的啟動(dòng)子替換染色體上基因的啟動(dòng)子，可以降低基因的轉(zhuǎn)錄效率。術(shù)語(yǔ)“更弱的啟動(dòng)子”可以指與基因固有的野生型啟動(dòng)子相比，提供基因的弱化轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。更弱啟動(dòng)子的實(shí)例可以包括例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。也就是說(shuō)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以在非誘導(dǎo)條件下，例如在不存在相應(yīng)誘導(dǎo)物的情況下，起到更弱啟動(dòng)子的作用。更弱啟動(dòng)子的實(shí)例還可以包括例如P4和P8啟動(dòng)子(分別為SEQ?ID?NO:109的位置872-969和SEQ?ID?NO:110的位置901-1046)。此外，可以缺失表達(dá)控制序列的一部分或全部?；虻谋磉_(dá)還可以通過(guò)例如操縱負(fù)責(zé)表達(dá)控制的因子來(lái)降低。負(fù)責(zé)表達(dá)控制的因子的實(shí)例可以包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的低分子(諸如誘導(dǎo)劑，抑制劑等)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子等)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的核酸(諸如siRNA等)，等等。此外，通過(guò)例如對(duì)基因的編碼區(qū)引入降低基因表達(dá)的突變，也可以降低基因的表達(dá)。例如，通過(guò)用在宿主中不太頻繁使用的同義密碼子替換基因編碼區(qū)中的密碼子，可以降低基因的表達(dá)。此外，例如，如本文所述，基因表達(dá)可以由于基因的破壞而降低。
[0222] 用于降低蛋白質(zhì)活性的修飾也可以通過(guò)例如破壞編碼該蛋白質(zhì)的基因來(lái)獲得。短語(yǔ)“基因受到破壞”可以指基因以使得不產(chǎn)生通?？梢云鹱饔玫牡鞍踪|(zhì)的方式進(jìn)行了修飾?！安划a(chǎn)生通?？梢云鹱饔玫牡鞍踪|(zhì)”的短語(yǔ)可以包括當(dāng)完全不從基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)和當(dāng)從基因產(chǎn)生每個(gè)分子的功能(例如活性或性質(zhì))得以降低或消除的蛋白質(zhì)時(shí)。
[0223] 可以通過(guò)例如缺失染色體上的基因來(lái)獲得基因的破壞。術(shù)語(yǔ)“基因的缺失”可以指基因編碼區(qū)的部分或整個(gè)區(qū)域的缺失。此外，可以缺失包括染色體上基因的編碼區(qū)上游和下游序列的整個(gè)基因。只要可以降低蛋白質(zhì)的活性，待缺失的區(qū)域可以是任何區(qū)域，例如N端區(qū)域(即編碼蛋白質(zhì)的N端區(qū)域的區(qū)域)，內(nèi)部區(qū)域或C端區(qū)域(即編碼蛋白質(zhì)的C端區(qū)域的區(qū)域)。缺失更長(zhǎng)的區(qū)域通?？梢愿_定地使基因失活。待缺失的區(qū)域可以是具有例如基因的編碼區(qū)的總長(zhǎng)度的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或95％以上的長(zhǎng)度的區(qū)域。此外，優(yōu)選的是，待缺失的區(qū)域的上游和下游序列的閱讀框不相同。讀碼框的不一致性可以引起待缺失的區(qū)域下游的移碼。
[0224] 例如，也可以通過(guò)對(duì)染色體上基因的編碼區(qū)引入用于氨基酸取代的突變(錯(cuò)義突變)，終止密碼子的突變(無(wú)義突變)，添加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸殘基的突變(移碼突變)等獲得基因的破壞(Journal?of?Biological?Chemistry,272:8611-8617(1997)；Proceedings?of?the?National?Academy?of?Sciences,USA,95?5511-5515(1998)；
Journal?of?Biological?Chemistry,26?116,20833-20839(1991))。
Journal?of?Biological?Chemistry,26?116,20833-20839(1991))。
[0225] 也可以通過(guò)例如將另一個(gè)核苷酸序列插入到染色體上的基因的編碼區(qū)中獲得基因的破壞。插入的位點(diǎn)可以位于基因的任何區(qū)域中，并且插入更長(zhǎng)的核苷酸序列通常可以更確定地使基因失活。優(yōu)選的是插入位點(diǎn)上游和下游序列的閱讀框不相同。讀碼框的不一致性可以引起待缺失的區(qū)域下游的移碼。其他核苷酸序列沒(méi)有特別限制，只要選擇降低或消除所編碼蛋白質(zhì)活性的序列即可，并且其實(shí)例可以包括例如標(biāo)志物基因如抗生素抗性基因，以及可用于產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)的基因。
[0226] 特別地，可以以編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列得以缺失的方式進(jìn)行基因的破壞。換言之，可以通過(guò)例如缺失蛋白質(zhì)的氨基酸序列，特別地修飾基因以使該基因編碼氨基酸序列得以的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)降低蛋白質(zhì)活性的修飾。短語(yǔ)“蛋白質(zhì)的氨基酸序列的缺失”可以指蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分或整個(gè)區(qū)域的缺失。另外，短語(yǔ)“蛋白質(zhì)的氨基酸序列的缺失”可以指原始氨基酸序列在蛋白質(zhì)中消失，并且還可以包括當(dāng)原始氨基酸序列變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸序列時(shí)。也就是說(shuō)，例如，通過(guò)移碼改變?yōu)榱硪话被嵝蛄械膮^(qū)域可以視為缺失區(qū)域。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸序列得以缺失時(shí)，通?？s短蛋白質(zhì)的總長(zhǎng)度，但也可以存在蛋白質(zhì)的總長(zhǎng)度沒(méi)有改變或延長(zhǎng)的情況。例如，通過(guò)缺失基因編碼區(qū)的部分或整個(gè)區(qū)域，可以在編碼的蛋白質(zhì)中缺失由缺失區(qū)域編碼的區(qū)域。另外，例如，通過(guò)將終止密碼子引入基因的編碼區(qū)中，可以在編碼的蛋白質(zhì)中缺失由引入位點(diǎn)的下游區(qū)域編碼的區(qū)域。另外，例如，通過(guò)在基因的編碼區(qū)中移碼，可以在編碼的蛋白質(zhì)中缺失由移碼區(qū)編碼的區(qū)域。關(guān)于基因缺失中待缺失區(qū)域的位置和長(zhǎng)度的上述描述可以在必要修改后應(yīng)用于缺失蛋白質(zhì)氨基酸序列中待缺失區(qū)域的位置和長(zhǎng)度。
[0227] 如上所述的染色體上基因的此類修飾可以如下獲得：通過(guò)例如制備以使基因不能產(chǎn)生通常起作用的蛋白質(zhì)的方式進(jìn)行了修飾的破壞類型基因，并用含有破壞類型基因的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主以引起破壞類型基因和染色體上的野生型基因之間的同源重組，從而用該破壞類型基因取代染色體上的野生型基因。在該程序中，若重組DNA中包括根據(jù)宿主特征如營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇的標(biāo)志物基因，則操作變得更容易。破壞類型基因的實(shí)例可以包括編碼區(qū)的部分或整個(gè)區(qū)域得以缺失的基因，包含錯(cuò)義突變的基因，包括無(wú)義突變的基因，包含移碼突變的基因，以及包含轉(zhuǎn)座子或標(biāo)志物基因插入的基因。由破壞類型基因編碼的蛋白質(zhì)即使產(chǎn)生也具有與野生型蛋白質(zhì)不同的構(gòu)象，因此其功能得以降低或消除。已經(jīng)建立了基于使用同源重組的基因取代的此類基因破壞，并且存在使用線性DNA的方法，諸如稱為“Red驅(qū)動(dòng)整合”的方法(Datsenko,K.A,and?Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，以及利用Red驅(qū)動(dòng)的整合與源自λ噬菌體的切除系統(tǒng)的組合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))(參考WO2005/010175)，使用具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法，使用能夠接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，利用沒(méi)有在宿主中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法(美國(guó)專利號(hào)6,303,383，日本專利公開(kāi)(Kokai)No.05-007491)，等等。
[0228] 用于降低蛋白質(zhì)活性的修飾也可以通過(guò)例如誘變處理來(lái)獲得。誘變處理的實(shí)例包括X射線或紫外線的照射和用突變劑如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)處理。
[0229] 如上文提及的用于降低蛋白質(zhì)活性的此類方法可以獨(dú)立使用或者以任意組合使用。
[0230] 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)作為由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合物起作用時(shí)，可以修飾多個(gè)亞基的部分或全部，只要蛋白質(zhì)的活性最終得以降低。也就是說(shuō)，例如，編碼相應(yīng)亞基的多個(gè)基因的部分或全部可以得以破壞等。此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)存在多種同工酶時(shí)，多種同工酶的部分或全部活性可以得以降低，只要蛋白質(zhì)的活性最終得以降低。也就是說(shuō)，例如，編碼相應(yīng)同功酶的多個(gè)基因的部分或全部可以得以破壞等。
[0231] 可以通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)的活性確認(rèn)蛋白質(zhì)活性的降低。
[0232] 蛋白質(zhì)活性的降低也可以通過(guò)確認(rèn)編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)的降低來(lái)確認(rèn)。基因表達(dá)的降低可以通過(guò)確認(rèn)基因轉(zhuǎn)錄量的減少或從基因表達(dá)的蛋白質(zhì)量的降低來(lái)確認(rèn)。
[0233] 通過(guò)比較從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與非修飾菌株中觀察到的量，可以確認(rèn)基因轉(zhuǎn)錄量的降低。用于評(píng)估m(xù)RNA量的方法的實(shí)例可以包括Northern雜交，RT-PCR等(Molecular?Cloning,Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,Cold?Spring?Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以降低到例如在非修飾菌株中觀察到的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
[0234] 通過(guò)使用抗體的Western印跡法(Molecular?Cloning,Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,Cold?Spring?Harbor(USA)2001)可以確認(rèn)蛋白質(zhì)量的減少。蛋白質(zhì)的量(諸如每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分子數(shù)目)可以降低到例如在非修飾菌株中觀察到的蛋白質(zhì)量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
[0235] 可以根據(jù)用于破壞的手段通過(guò)確定基因的部分或全部的核苷酸序列，基因的限制酶圖譜，全長(zhǎng)等來(lái)確認(rèn)基因的破壞。
[0236] 除烯醇化酶活性的弱化外，上述的降低蛋白質(zhì)活性的方法還可以適用于任意蛋白質(zhì)諸如副產(chǎn)物生成酶的活性降低，以及任意基因諸如編碼那些任意蛋白的基因的表達(dá)降低。
[0237] <2>用于生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法
[0238] 如本文中描述的方法是通過(guò)使用如本文中描述的微生物生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法。
[0239] <2-1>發(fā)酵方法
[0240] 可以通過(guò)例如如本文中描述的微生物的發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)。也就是說(shuō)，如本文中描述的方法的實(shí)施方案可以是通過(guò)發(fā)酵微生物來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法。此實(shí)施方案也可以稱為“發(fā)酵方法”。此外，通過(guò)發(fā)酵如本文中所述的微生物生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的步驟也可以稱為“發(fā)酵步驟”。
[0241] 可以通過(guò)培養(yǎng)如本文中描述的微生物來(lái)進(jìn)行發(fā)酵步驟。具體而言，在發(fā)酵方法中，可以從碳源生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)。也就是說(shuō)，發(fā)酵步驟可以是例如在培養(yǎng)基，諸如含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累目標(biāo)物質(zhì)的步驟。也就是說(shuō)，發(fā)酵方法可以是用于生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法，其包括以下步驟：例如在培養(yǎng)基，諸如含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累目標(biāo)物質(zhì)的方法。此外，換言之，發(fā)酵步驟可以是例如通過(guò)使用微生物從碳源生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的步驟。
[0242] 待使用的培養(yǎng)基沒(méi)有特別限制，只要微生物可以在其中增殖并產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)即可。作為培養(yǎng)基，例如可以使用用于培養(yǎng)微生物諸如細(xì)菌和酵母的典型培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以根據(jù)需要含有碳源，氮源，磷酸鹽源，硫源，以及其他培養(yǎng)基組分，如各種有機(jī)組分和無(wú)機(jī)組分。培養(yǎng)基成分的類型和濃度可以根據(jù)諸如選擇的微生物的類型等各種條件適當(dāng)確定。
[0243] 碳源沒(méi)有特別限制，只要微生物可以利用它并產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)即可。碳源的具體實(shí)例可以包括例如糖類，諸如葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，赤糖糊(blackstrap?molasses)，淀粉的水解物和生物質(zhì)的水解物；有機(jī)酸如乙酸，檸檬酸，琥珀酸和葡糖酸；醇如乙醇，甘油和粗甘油；和脂肪酸。作為碳源，特別地，可以使用植物來(lái)源的材料。植物的實(shí)例可以包括例如玉米，稻，小麥，大豆，甘蔗，甜菜和棉。植物來(lái)源材料的實(shí)例可以包括例如器官，諸如根，莖，干，枝，葉，花和種子，包括它們的植物體和這些植物器官的分解產(chǎn)物。植物來(lái)源材料的在其使用時(shí)的形式?jīng)]有特別限定，并且它們可以以諸如未加工產(chǎn)物，汁，研磨產(chǎn)物，純化產(chǎn)物等任何形式使用。戊糖如木糖，己糖如葡萄糖或它們的混合物可從例如植物生物質(zhì)獲得并且得到使用。具體而言，可以通過(guò)將植物生物質(zhì)進(jìn)行處理，諸如蒸汽處理，濃酸水解，稀酸水解，纖維素酶等酶水解，堿處理而得到這些糖類。由于半纖維素與纖維素相比通常更容易水解，因此可預(yù)先水解植物生物質(zhì)中的半纖維素以釋放戊糖，然后可以水解纖維素以產(chǎn)生己糖。此外，木糖可以通過(guò)例如通過(guò)對(duì)微生物賦予用于將己糖如葡萄糖轉(zhuǎn)化為木糖的途徑從己糖轉(zhuǎn)化供應(yīng)。作為碳源，可以使用一種碳源，或者可以組合使用兩種或更多種碳源。
[0244] 培養(yǎng)基中碳源的濃度沒(méi)有特別限制，只要微生物可以增殖并產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)即可。培養(yǎng)基中碳源的濃度可以在使得目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)不受抑制的范圍內(nèi)盡可能高。碳源在培養(yǎng)基中的初始濃度通?？梢允抢缤ǔ?至30％(w/v)，或10至20％(w/v)。此外，可以根據(jù)需要對(duì)培養(yǎng)基添加碳源。例如，可以與伴隨發(fā)酵進(jìn)展的碳源的減少或消減成比例地對(duì)培養(yǎng)基添加碳源。雖然可以暫時(shí)消減碳源，但是只要最終可以生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)，可以優(yōu)選以不消減碳源或不繼續(xù)消減碳源的方式進(jìn)行培養(yǎng)。
[0245] 氮源的具體實(shí)例可以包括例如銨鹽如硫酸銨，氯化銨和磷酸銨，有機(jī)氮源如蛋白胨，酵母提取物，肉膏和大豆蛋白分解產(chǎn)物，氨和尿素。用于pH調(diào)節(jié)的氨氣和氨水也可用作氮源。作為氮源，可以使用一種氮源，也可以組合使用兩種或更多種的氮源。
[0247] 硫源的具體實(shí)例可以包括例如無(wú)機(jī)硫化合物如硫酸鹽，硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽，以及含硫氨基酸如半胱氨酸，胱氨酸和谷胱甘肽。作為硫源，可以使用一種硫源，或者可以組合使用兩種或更多種硫源。
[0248] 其他各種有機(jī)和無(wú)機(jī)組分的具體實(shí)例可以包括例如無(wú)機(jī)鹽如氯化鈉和氯化鉀；微量金屬如鐵，錳，鎂和鈣；維生素如維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酸，煙酰胺和維生素B12；氨基酸；核酸；和含有這些的有機(jī)成分如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物和大豆蛋白分解產(chǎn)物。作為其他各種有機(jī)和無(wú)機(jī)組分，可以使用一種組分，或者可以組合使用兩種或更多種組分。
[0249] 此外，當(dāng)使用需要營(yíng)養(yǎng)物如氨基酸進(jìn)行生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)基含有此類需要的營(yíng)養(yǎng)物。此外，培養(yǎng)基可以含有用于生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的組分。此類組分的具體實(shí)例可以包括例如甲基供體例如SAM及其前體例如甲硫氨酸。
[0250] 培養(yǎng)條件沒(méi)有特別限制，只要微生物可以增殖并且產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)即可。培養(yǎng)可以用例如用于培養(yǎng)微生物諸如細(xì)菌和酵母的典型條件進(jìn)行。培養(yǎng)條件可以根據(jù)諸如選擇的微生物的種類等各種條件適當(dāng)確定。
[0251] 培養(yǎng)可以通過(guò)使用液體培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行。在培養(yǎng)時(shí)，例如，可以將在諸如瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的微生物直接接種到液體培養(yǎng)基中，或者將在液體培養(yǎng)基中作為種子培養(yǎng)物培養(yǎng)的微生物接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行主要培養(yǎng)。也就是說(shuō)，培養(yǎng)可以作為種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)分開(kāi)進(jìn)行。在此類情況下，種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)的培養(yǎng)條件可以是相同的或者可以是不相同。至少在主要培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)是足夠的。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基中存在的微生物的量沒(méi)有特別限制。例如，顯示OD660為4-100的種子培養(yǎng)液可以在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)以0.1-100質(zhì)量％，或1-50質(zhì)量％的量接種到用于主要培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。
[0252] 培養(yǎng)可以以分批培養(yǎng)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)或這些的組合進(jìn)行。在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)使用的培養(yǎng)基也可以稱為“起始培養(yǎng)基”。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中添加到培養(yǎng)系統(tǒng)(例如發(fā)酵罐)的培養(yǎng)基也可以稱為“補(bǔ)料培養(yǎng)基”。為了在補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者連續(xù)培養(yǎng)中向培養(yǎng)系統(tǒng)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基也可以稱為“補(bǔ)料”。此外，當(dāng)作為種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)分開(kāi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)的培養(yǎng)方案可以相同或可以不同。例如，種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)兩者都可以作為分批培養(yǎng)進(jìn)行?；蛘撸?，種子培養(yǎng)可以作為分批培養(yǎng)進(jìn)行，并且主要培養(yǎng)可以以補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行。
[0253] 各種組分諸如碳源可以存在于起始培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基或兩者中。也就是說(shuō)，各種組分諸如碳源可以在培養(yǎng)期間獨(dú)立地或以任意組合的方式添加到培養(yǎng)基。這些組分可以添加一次或多次，或者可以連續(xù)添加。起始培養(yǎng)基中存在的組分的類型可以與補(bǔ)料培養(yǎng)基中存在的組分的類型相同或不同。此外，起始培養(yǎng)基中存在的組分的濃度可以與補(bǔ)料培養(yǎng)基中存在的組分的濃度相同或不同。此外，可以使用兩種或更多種含有不同類型和/或不同濃度組分的補(bǔ)料培養(yǎng)基。例如，當(dāng)間歇進(jìn)行兩次或更多次補(bǔ)料時(shí)，補(bǔ)料培養(yǎng)基中存在的組分的類型和/或濃度對(duì)于每次補(bǔ)料可以是相同的或者可以是不同的。
[0254] 培養(yǎng)可以例如在需氧條件下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“需氧條件”可以指其中培養(yǎng)基中的溶解氧濃度為0.33ppm或更高，或1.5ppm或更高的條件?？梢詫⒀鯘舛瓤刂茷槔顼柡脱鯘舛鹊?-50％，或約5％。培養(yǎng)可以例如在通氣或搖動(dòng)下進(jìn)行。培養(yǎng)基的pH值可以是例如3至10，或4.0至9.5。培養(yǎng)基的pH可以根據(jù)需要在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)基的pH可以通過(guò)使用各種堿性和酸性物質(zhì)如氨氣，氨水，碳酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸鉀，碳酸氫鉀，碳酸鎂，氫氧化鈉，氫氧化鈣和氫氧化鎂來(lái)調(diào)節(jié)。培養(yǎng)溫度可以是例如20至45℃，或25至37℃。培養(yǎng)時(shí)間可以是例如
10至120小時(shí)。例如，可以繼續(xù)培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中存在的碳源被消耗，或者直到微生物的活性喪失。
10至120小時(shí)。例如，可以繼續(xù)培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中存在的碳源被消耗，或者直到微生物的活性喪失。
[0255] 通過(guò)在諸如上文所述的條件下培養(yǎng)微生物，在培養(yǎng)基中積累目標(biāo)物質(zhì)。
[0256] 可以通過(guò)用于檢測(cè)或鑒定化合物的已知方法來(lái)確認(rèn)目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)生。此類方法的實(shí)例可以包括例如HPLC，UPLC，LC/MS，GC/MS和NMR。這些方法可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。這些方法也可以用于確定培養(yǎng)基中存在的各種組分的濃度。
[0257] 生產(chǎn)的目標(biāo)物質(zhì)可以適當(dāng)收集。也就是說(shuō)，發(fā)酵方法可以進(jìn)一步包括收集目標(biāo)物質(zhì)的步驟。此步驟也可以稱為“收集步驟”。收集步驟可以是從培養(yǎng)肉湯，特別是從培養(yǎng)基中收集目標(biāo)物質(zhì)的步驟。目標(biāo)物質(zhì)可以通過(guò)用于分離和純化化合物的已知方法收集。此類方法的實(shí)例可以包括例如離子交換樹(shù)脂法，膜處理，沉淀，提取，蒸餾和結(jié)晶。具體地，目標(biāo)物質(zhì)也可以通過(guò)用有機(jī)溶劑如乙酸乙酯萃取或通過(guò)蒸汽蒸餾來(lái)收集。這些方法可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。
[0258] 此外，當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)沉淀在培養(yǎng)基中時(shí)，它可以通過(guò)例如離心或過(guò)濾收集。在培養(yǎng)基中溶解的目標(biāo)物質(zhì)結(jié)晶后，可以將沉淀在培養(yǎng)基中的目標(biāo)物質(zhì)和溶解在培養(yǎng)基中的目標(biāo)物質(zhì)一起分離。
[0259] 除了目標(biāo)物質(zhì)之外，收集的目標(biāo)物質(zhì)可以包含例如微生物細(xì)胞，培養(yǎng)基組分，水分和微生物的副產(chǎn)物代謝物。收集的目標(biāo)物質(zhì)的純度可以是例如30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)或更高。
[0260] <2-2>生物轉(zhuǎn)化方法
[0261] 目標(biāo)物質(zhì)也可以通過(guò)例如使用如本文中所述的微生物的生物轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生。也就是說(shuō)，如本文中所述的方法的另一個(gè)實(shí)施方案可以是使用微生物通過(guò)生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的方法。該實(shí)施方案也可以稱為“生物轉(zhuǎn)化方法”。此外，使用微生物通過(guò)生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的步驟也可以稱為“生物轉(zhuǎn)化步驟”。
[0262] 具體而言，在生物轉(zhuǎn)化方法中，目標(biāo)物質(zhì)可以從目標(biāo)物質(zhì)的前體產(chǎn)生。更具體而言，在生物轉(zhuǎn)化方法中，通過(guò)使用微生物，可以通過(guò)將目標(biāo)物質(zhì)的前體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)。也就是說(shuō)，生物轉(zhuǎn)化步驟可以是通過(guò)使用微生物將目標(biāo)物質(zhì)的前體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)物質(zhì)的步驟。
[0263] 目標(biāo)物質(zhì)的前體也可以簡(jiǎn)稱為“前體”。前體的實(shí)例可以包括下述物質(zhì)，該物質(zhì)向目標(biāo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化包括需要SAM。前體的具體實(shí)例可以包括目標(biāo)物質(zhì)的生物合成途徑的中間體，如就目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的描述而言所述的那些，條件是中間體向目標(biāo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化需要SAM。前體的更具體實(shí)例可以包括例如原兒茶酸，原兒茶醛，L-色氨酸，L-組氨酸，香草酸，苯甲酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-精氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸和甘氨酸。原兒茶酸可以用作生產(chǎn)例如香草醛，香草酸或愈創(chuàng)木酚的前體。原兒茶醛可以用作生產(chǎn)例如香草醛的前體。L-色氨酸可以用作生產(chǎn)例如褪黑激素的前體。L-組氨酸可以用作生產(chǎn)例如麥角硫因的前體。L-苯丙氨酸和L-酪氨酸各自可以用作生產(chǎn)例如阿魏酸，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚或4-乙基愈創(chuàng)木酚的前體。L-精氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸各自可以用作生產(chǎn)例如多胺的前體。L-精氨酸和甘氨酸各自可以用作生產(chǎn)例如肌酸的前體。作為前體，可以使用一種前體，或者可以組合使用兩種或更多種前體。在前體是可以形成鹽的化合物的情況下，前體可以作為游離化合物，其鹽或其混合物使用。也就是說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“前體”可以指游離形式的前體，其鹽或其混合物，除非另有說(shuō)明。鹽的實(shí)例可以包括例如硫酸鹽，鹽酸鹽，碳酸鹽，銨鹽，鈉鹽和鉀鹽。作為前體的鹽，可以使用一種鹽，或者可以組合使用兩種或更多種鹽。
[0264] 作為前體，可以使用商業(yè)產(chǎn)品，或者可以使用適當(dāng)制備和獲得的產(chǎn)品。也就是說(shuō)，生物轉(zhuǎn)化方法可以進(jìn)一步包括生產(chǎn)前體的步驟。生產(chǎn)前體的方法沒(méi)有特別限定，例如可以使用已知的方法。前體可以通過(guò)例如化學(xué)合成法，酶法，生物轉(zhuǎn)化法，發(fā)酵法，提取方法或它們的組合來(lái)生產(chǎn)。也就是說(shuō)，例如，目標(biāo)物質(zhì)的前體可以使用酶(該酶也可以稱為“前體生物合成酶”)從其另外的前體產(chǎn)生，所述酶催化此類另外的前體轉(zhuǎn)化成目標(biāo)物質(zhì)的前體。此外，例如，通過(guò)使用具有前體生產(chǎn)能力的微生物，可以從碳源或此類另外的前體生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的前體。短語(yǔ)“具有前體生產(chǎn)能力的微生物”可以指能夠從碳源或其另外的前體生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的前體的微生物。例如，根據(jù)酶法或生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)原兒茶酸的方法的實(shí)例可以包括使用惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)KS-0180(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.7-75589)將對(duì)甲酚轉(zhuǎn)化為原兒茶酸的方法，使用NADH依賴性對(duì)羥基苯甲酸羥化酶將對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化為原兒茶酸的方法(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.5-244941)，通過(guò)在含有對(duì)苯二甲酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有參與從對(duì)苯二甲酸生成原兒茶酸的反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)化體來(lái)生產(chǎn)原兒茶酸的方法(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.2007-104942)，以及通過(guò)使用具有原兒茶酸生產(chǎn)能力并且具有原兒茶酸5-氧化酶活性降低或該活性缺乏的微生物從其前體生產(chǎn)原兒茶酸的方法(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.2010-207094)。此外，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)原兒茶酸的方法的實(shí)例可以包括通過(guò)使用短桿菌屬細(xì)菌和乙酸作為碳源生產(chǎn)原兒茶酸的方法(日本專利公開(kāi)(Kokai)No.50-89592)，通過(guò)使用引入有編碼3-二氫莽草酸脫氫酶的基因的埃希氏菌屬或克雷伯氏菌屬細(xì)菌和葡萄糖作為碳源生產(chǎn)原兒茶酸的方法(美國(guó)專利號(hào)5,272,073)。此外，原兒茶醛可以通過(guò)根據(jù)使用ACAR的酶法或使用具有ACAR的微生物的生物轉(zhuǎn)化法使用原兒茶酸作為前體生產(chǎn)。生產(chǎn)的前體可以原樣或者根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砣鐫饪s，稀釋，干燥，溶解，分餾，提取和純化后用于生物轉(zhuǎn)化方法。也就是說(shuō)，作為前體，例如可以使用純化至所需程度的純化產(chǎn)物，或者可以使用含有前體的材料。含有前體的材料沒(méi)有特別限制，只要微生物可以使用前體即可。含有前體的材料的具體實(shí)例可以包括通過(guò)培養(yǎng)具有前體生產(chǎn)能力的微生物獲得的培養(yǎng)肉湯，與培養(yǎng)肉湯分離的培養(yǎng)上清液及其加工產(chǎn)物如其濃縮產(chǎn)物(如濃縮液體)和其干燥產(chǎn)物。
[0265] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生物轉(zhuǎn)化步驟可以通過(guò)例如培養(yǎng)如本文中所述的微生物來(lái)進(jìn)行。該實(shí)施方案也可以稱為“生物轉(zhuǎn)化方法的第一實(shí)施方案”。也就是說(shuō)，生物轉(zhuǎn)化步驟可以是例如在含有目標(biāo)物質(zhì)的前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以將該前體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)物質(zhì)的步驟。生物轉(zhuǎn)化步驟具體可以是在含有目標(biāo)物質(zhì)的前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累目標(biāo)物質(zhì)的步驟。
[0266] 要使用的培養(yǎng)基沒(méi)有特別限制，只要培養(yǎng)基含有目標(biāo)物質(zhì)的前體，并且微生物可以在其中增殖并產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)。培養(yǎng)條件沒(méi)有特別限制，只要微生物可以增殖并且產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)即可。關(guān)于發(fā)酵方法所提及的培養(yǎng)的描述，諸如關(guān)于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的描述可以在必要修改后適用于生物轉(zhuǎn)化方法的第一實(shí)施方案中的培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基在第一實(shí)施方案中含有前體。
[0267] 前體可以在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)存在在培養(yǎng)基中，或者可以在培養(yǎng)的部分時(shí)期期間存在在培養(yǎng)基中。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“在含有前體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物”并不一定意味著培養(yǎng)基中在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)都存在前體。例如，從培養(yǎng)開(kāi)始起培養(yǎng)基中可以存在或可以不存在前體。當(dāng)在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基中不存在前體時(shí)，在培養(yǎng)開(kāi)始后將前體添加到培養(yǎng)基。添加的時(shí)機(jī)可以根據(jù)諸如培養(yǎng)期的長(zhǎng)度等各種條件適當(dāng)確定。例如，在微生物充分生長(zhǎng)后，可以將前體添加到培養(yǎng)基中。此外，在任何情況下，可以根據(jù)需要將前體添加到培養(yǎng)基。例如，可以與伴隨目標(biāo)物質(zhì)生成的前體的減少或消減成比例地對(duì)培養(yǎng)基添加前體。用于將前體添加到培養(yǎng)基的方法沒(méi)有特別限制。例如，可以通過(guò)將含有前體的補(bǔ)料培養(yǎng)基補(bǔ)料到培養(yǎng)基來(lái)將前體供應(yīng)給培養(yǎng)基。此外，例如，如本文中所述的微生物和具有前體生產(chǎn)能力的微生物可以共培養(yǎng)以允許具有前體生產(chǎn)能力的微生物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生前體，從而將前體添加到培養(yǎng)基。這些添加方法可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。前體在培養(yǎng)基中的濃度沒(méi)有特別限制，只要微生物可以使用該前體作為目標(biāo)物質(zhì)的原料即可。前體在培養(yǎng)基中的濃度例如可以為0.1g/L或更高，1g/L或更高，2g/L或更高，5g/L或更高，10g/L或更高，或者15g/L或更高，或者可以是200g/L或更低，100g/L或更低，50g/L或更低，或者20g/L或更低，或者可以在由其組合限定的范圍內(nèi)(按游離化合物的重量計(jì))。在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，前體可以以或不以上文例示的范圍內(nèi)的濃度存在于培養(yǎng)基中。例如，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)前體可以以上文例示的范圍內(nèi)的濃度存在于培養(yǎng)基中，或者可以將其添加到培養(yǎng)基，從而在培養(yǎng)開(kāi)始后獲得上文例示的范圍。在培養(yǎng)分別作為種子培養(yǎng)和主要培養(yǎng)進(jìn)行的情況下，至少在主要培養(yǎng)期間產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)是足夠的。因此，足夠的是至少在主要培養(yǎng)期間，即在主要培養(yǎng)的整個(gè)時(shí)期內(nèi)或在主要培養(yǎng)的部分時(shí)期期間，培養(yǎng)基中存在前體，并且也就是說(shuō)，在種子培養(yǎng)期間培養(yǎng)基中可以存在或可以不存在前體。在此類情況下，關(guān)于培養(yǎng)的術(shù)語(yǔ)，如“培養(yǎng)期(培養(yǎng)時(shí)期)”和“培養(yǎng)開(kāi)始”可以理解為與主要培養(yǎng)有關(guān)的術(shù)語(yǔ)。
[0268] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物轉(zhuǎn)化步驟也可以通過(guò)例如使用如本文中所述的微生物的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。該實(shí)施方案也可以稱為“生物轉(zhuǎn)化方法的第二實(shí)施方案”。也就是說(shuō)，生物轉(zhuǎn)化步驟可以是例如通過(guò)使用微生物的細(xì)胞將反應(yīng)混合物中的目標(biāo)物質(zhì)的前體轉(zhuǎn)化成目標(biāo)物質(zhì)的步驟。生物轉(zhuǎn)化步驟具體可以是使微生物的細(xì)胞作用于反應(yīng)混合物中的目標(biāo)物質(zhì)的前體以在反應(yīng)混合物中生成并積累目標(biāo)物質(zhì)的步驟。通過(guò)使用此類細(xì)胞進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化步驟也可以稱為“轉(zhuǎn)化反應(yīng)”。
[0269] 微生物的細(xì)胞可以通過(guò)培養(yǎng)微生物來(lái)獲得。用于獲得細(xì)胞的培養(yǎng)方法沒(méi)有特別限制，只要微生物可以增殖即可。在用于獲得細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，前體可以存在或可以不存在于培養(yǎng)基中。此外，在用于獲得細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生或可以不產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)。關(guān)于發(fā)酵方法中所述的培養(yǎng)的描述，例如關(guān)于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的描述可以在必要修改后應(yīng)用于獲得用于生物轉(zhuǎn)化方法的第二實(shí)施方案的細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0270] 細(xì)胞可以在存在于培養(yǎng)肉湯(具體是培養(yǎng)基)中時(shí)，或者在從培養(yǎng)肉湯(具體是培養(yǎng)基)中收集后用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。也可以根據(jù)需要在進(jìn)行處理后將細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。也就是說(shuō)，細(xì)胞的實(shí)例可以包括含有細(xì)胞的培養(yǎng)肉湯，從培養(yǎng)肉湯中收集的細(xì)胞和其加工產(chǎn)物。換言之，細(xì)胞的實(shí)例可以包括存在于微生物的培養(yǎng)肉湯中的細(xì)胞，從培養(yǎng)肉湯中收集的細(xì)胞或存在于其加工產(chǎn)物中的細(xì)胞。加工產(chǎn)物的實(shí)例可以包括通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，特別地通過(guò)對(duì)含有細(xì)胞的培養(yǎng)肉湯或從培養(yǎng)肉湯中收集的細(xì)胞進(jìn)行處理而獲得的產(chǎn)物。這些形式的細(xì)胞可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。
[0271] 從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限制，例如可以使用已知的方法。此類方法的實(shí)例可以包括例如自發(fā)沉淀，離心和過(guò)濾。也可以使用絮凝劑。這些方法可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。收集的細(xì)胞可以根據(jù)需要通過(guò)使用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行清洗。收集的細(xì)胞可以根據(jù)需要通過(guò)使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基重懸浮?？捎糜谇逑椿驊腋〖?xì)胞的培養(yǎng)基的實(shí)例可以包括例如水性介質(zhì)(水性溶劑)，如水和緩沖水溶液。
[0272] 細(xì)胞處理的實(shí)例可以包括例如稀釋，冷凝，在載體如丙烯酰胺和角叉菜膠上固定化，冷凍和融化處理，以及增加細(xì)胞膜通透性的處理。例如，可以通過(guò)使用表面活性劑或有機(jī)溶劑來(lái)增加細(xì)胞膜的通透性。這些處理可以獨(dú)立使用，或者可以以適當(dāng)?shù)慕M合使用。
[0273] 用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的細(xì)胞沒(méi)有特別限制，只要細(xì)胞具有目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力。優(yōu)選細(xì)胞保持其代謝活性。短語(yǔ)“細(xì)胞保持其代謝活性”可以表示細(xì)胞具有利用碳源產(chǎn)生或再生產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)所需物質(zhì)的能力。此類物質(zhì)的實(shí)例可以包括例如ATP，電子供體如NADH和NADPH，以及甲基供體如SAM。細(xì)胞可以具有或可以不具有增殖能力。
[0274] 轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物中進(jìn)行。具體而言，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以通過(guò)使細(xì)胞和前體共存于適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物中來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以通過(guò)分批方法進(jìn)行或可以通過(guò)柱方法進(jìn)行。在分批法的情況下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以通過(guò)例如將微生物的細(xì)胞和前體混合在反應(yīng)容器中所含的反應(yīng)混合物中來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以靜態(tài)進(jìn)行，或者可以在攪拌或搖動(dòng)反應(yīng)混合物的情況下進(jìn)行。在柱方法的情況下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以通過(guò)例如使含有前體的反應(yīng)混合物通過(guò)填充有固定化細(xì)胞的柱來(lái)進(jìn)行。反應(yīng)混合物的實(shí)例可以包括基于水性介質(zhì)(水性溶劑)如水和水性緩沖液的那些。
[0275] 除了前體之外，反應(yīng)混合物可以根據(jù)需要含有除前體之外的組分。除前體以外的成分的實(shí)例可以包括ATP，電子供體諸如NADH，NADPH，甲基供體諸如SAM，金屬離子，緩沖劑，表面活性劑，有機(jī)溶劑，碳源，磷酸鹽源，和其它各種培養(yǎng)基成分。也就是說(shuō)，例如，含有前體的培養(yǎng)基也可以用作反應(yīng)混合物。也就是說(shuō)，關(guān)于生物轉(zhuǎn)化方法的第一實(shí)施方案中提及的培養(yǎng)基的描述也可以在必要修改后適用于生物轉(zhuǎn)化方法的第二實(shí)施方案中的反應(yīng)混合物。存在于反應(yīng)混合物中的組分的類型和濃度可以根據(jù)各種條件來(lái)確定，例如待使用的前體的類型和待使用的細(xì)胞的形式。
[0276] 轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件，諸如溶解氧濃度，反應(yīng)混合物的pH，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，各種成分的濃度等沒(méi)有特別限制，只要產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)。轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以用例如用于利用微生物細(xì)胞諸如靜止細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的典型條件來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件可以根據(jù)各種條件來(lái)確定，例如選擇的微生物的類型。轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以例如在需氧條件下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“需氧條件”可以指其中反應(yīng)混合物中的溶解氧濃度為0.33ppm或更高，或1.5ppm或更高的條件。氧濃度可以控制為例如飽和氧濃度的1-50％，或約5％。反應(yīng)混合物的pH值通?？梢允抢?.0至10.0，或6.5至9.0。反應(yīng)溫度可以是例如15至50℃，或15至45℃，或20至40℃。反應(yīng)時(shí)間可以是例如5分鐘至200小時(shí)。在柱方法的情況下，反應(yīng)混合物的加載速率可以是例如使得反應(yīng)時(shí)間落入上述例示的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)的速率。此外，轉(zhuǎn)化反應(yīng)也可以在例如培養(yǎng)條件下進(jìn)行，例如用于培養(yǎng)微生物諸如細(xì)菌和真菌的典型條件。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)期間，細(xì)胞可以增殖或可以不增殖。也就是說(shuō)，關(guān)于生物轉(zhuǎn)化方法的第一實(shí)施方案的培養(yǎng)條件的描述也可以在必要修改后適用于生物轉(zhuǎn)化方法的第二實(shí)施方案中轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件，只是細(xì)胞可以或不可以在第二實(shí)施方案中增殖。在此類情況下，用于獲得細(xì)胞的培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件可以相同或不同。前體在反應(yīng)混合物中的濃度例如可以為0.1g/L或更高，1g/L或更高，2g/L或更高，5g/L或更高，10g/L或更高，或者15g/L或更高，或者可以是200g/L或更低，100g/L或更低，50g/L或更低，或者20g/L或更低，或者可以在由其組合限定的范圍內(nèi)(按游離化合物的重量計(jì))。例如，反應(yīng)混合物中細(xì)胞的密度可以是1或更高，或者可以是300或更低，或者可以在其組合限定的范圍內(nèi)(按600nm的光密度(OD)計(jì))。
[0277] 在轉(zhuǎn)化反應(yīng)期間，可以將細(xì)胞，前體和其他組分獨(dú)立地或以其任何任意組合添加到反應(yīng)混合物。例如，可以與伴隨目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生的前體的減少或消耗成比例將前體添加到反應(yīng)混合物。這些組分可以添加一次或多次，或者可以連續(xù)添加。
[0278] 用于向反應(yīng)混合物添加諸如前體的各種組分的方法沒(méi)有特別限制。這些組分各自可以通過(guò)例如直接將它們加入到反應(yīng)混合物中而添加到反應(yīng)混合物中。此外，例如，可以將如本文中所述的微生物和具有前體生產(chǎn)能力的微生物共培養(yǎng)，以使具有前體生產(chǎn)能力的微生物在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生前體，從而將前體提供給反應(yīng)混合物。此外，例如，組分如ATP，電子給體和甲基供體可以各自在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生或再生，可以在微生物的細(xì)胞中產(chǎn)生或再生，或者可以通過(guò)不同細(xì)胞之間的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生或再生。例如，當(dāng)微生物的細(xì)胞保持其代謝活性時(shí)，它們可以通過(guò)使用碳源在它們內(nèi)部產(chǎn)生或再生諸如ATP，電子供體和甲基供體等組分。例如，具體地，微生物可以具有增強(qiáng)的SAM生成或再生能力，并且其生成或再生的SAM可以用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。SAM的生成或再生可以與用于生成或再生SAM的任何其他方法組合而得到進(jìn)一步增強(qiáng)。另外，ATP生成或再生方法的實(shí)例可以包括例如通過(guò)使用棒狀桿菌屬細(xì)菌從碳源提供ATP的方法(Hori,H.et?al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(6):693-698(1997))，通過(guò)使用酵母細(xì)胞和葡萄糖再生ATP的方法(Yamamoto,S? et?al.,
Biosci.Biotechnol.Biochem.,69(4):784-789(2005))，使用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶再生ATP的方法(C.Aug'e?and?Ch.Gautheron,Tetrahedron?Lett.,29:789-790(1988))，以及通過(guò)使用多磷酸和多磷酸激酶再生ATP的方法(Murata,K.et?al.,Agric.Biol.Chem.,
52(6):1471-1477(1988))。
Biosci.Biotechnol.Biochem.,69(4):784-789(2005))，使用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶再生ATP的方法(C.Aug'e?and?Ch.Gautheron,Tetrahedron?Lett.,29:789-790(1988))，以及通過(guò)使用多磷酸和多磷酸激酶再生ATP的方法(Murata,K.et?al.,Agric.Biol.Chem.,
52(6):1471-1477(1988))。
[0279] 此外，反應(yīng)條件可以從轉(zhuǎn)化反應(yīng)的開(kāi)始至結(jié)束是恒定的，或者它們可以在轉(zhuǎn)化反應(yīng)期間改變。表述“反應(yīng)條件在轉(zhuǎn)化反應(yīng)期間改變”不僅可以包括當(dāng)反應(yīng)條件在時(shí)間上改變時(shí)，而且還包括當(dāng)反應(yīng)條件在空間上改變時(shí)。表述“反應(yīng)條件在空間上改變”表示例如當(dāng)通過(guò)柱法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)溫度和孔密度等反應(yīng)條件隨流動(dòng)中的位置而不同。
[0280] 通過(guò)進(jìn)行如上所述的生物轉(zhuǎn)化步驟，獲得培養(yǎng)肉湯(具體地培養(yǎng)基)或含有目標(biāo)物質(zhì)的反應(yīng)混合物。目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)生和目標(biāo)物質(zhì)的收集的確認(rèn)可以以與上述發(fā)酵方法相同的方式進(jìn)行。也就是說(shuō)，生物轉(zhuǎn)化方法可以進(jìn)一步包括收集步驟，例如從培養(yǎng)肉湯(具體地培養(yǎng)基)或反應(yīng)混合物中收集目標(biāo)物質(zhì)的步驟。除了目標(biāo)物質(zhì)之外，收集的目標(biāo)物質(zhì)可以包含例如微生物細(xì)胞，培養(yǎng)基組分，反應(yīng)混合物組分，水分和微生物的副產(chǎn)物代謝物。收集的目標(biāo)物質(zhì)的純度可以是，例如，30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)或更高。
[0281] <2-3>生產(chǎn)香草醛和其他目標(biāo)物質(zhì)的方法
[0282] 當(dāng)通過(guò)使用如本文所述的微生物，即通過(guò)發(fā)酵方法或生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，由此產(chǎn)生的目標(biāo)物質(zhì)可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為另一種目標(biāo)物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了制備第二目標(biāo)物質(zhì)，即目標(biāo)物質(zhì)B的方法，所述方法包括以下步驟：通過(guò)使用微生物，即通過(guò)發(fā)酵方法或生物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生第一目標(biāo)物質(zhì)，即目標(biāo)物質(zhì)A，并且將由此產(chǎn)生的第一目標(biāo)物質(zhì)A轉(zhuǎn)化為第二目標(biāo)物質(zhì)B。
[0283] 例如，當(dāng)通過(guò)使用如本文所述的微生物，即通過(guò)發(fā)酵方法或生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)香草酸時(shí)，由此產(chǎn)生的香草酸可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香草醛。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)香草醛的方法，其包括通過(guò)使用微生物，即通過(guò)發(fā)酵方法或生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)香草酸，并將由此產(chǎn)生的香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛的步驟。該方法也可以稱為“香草醛生產(chǎn)方法”。
[0284] 通過(guò)使用微生物產(chǎn)生的香草酸可以原樣用于轉(zhuǎn)化成香草醛，或者在根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砣鐫饪s，稀釋，干燥，溶解，分餾，提取和純化之后用于轉(zhuǎn)化成香草醛。也就是說(shuō)，作為香草酸，例如，可以使用純化至期望程度的純化產(chǎn)物，或者可以使用含有香草酸的物質(zhì)。含有香草酸的物質(zhì)沒(méi)有特別限制，只要催化轉(zhuǎn)化的組分(例如微生物和酶)可以使用香草酸。含有香草酸的材料的具體實(shí)例可以包括含有香草酸的培養(yǎng)肉湯或反應(yīng)混合物，從培養(yǎng)肉湯或反應(yīng)混合物中分離的上清液，及其加工產(chǎn)物，如濃縮產(chǎn)物，如其濃縮液及其干燥產(chǎn)物。
[0285] 將香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛的方法沒(méi)有特別限制。
[0286] 可以通過(guò)例如使用具有ACAR的微生物的生物轉(zhuǎn)化方法將香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛。具有ACAR的微生物可以以烯醇化酶活性得以降低的方式或者可以不以烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行修飾。關(guān)于如本文所述的微生物的描述可以在必要的修改后適用于具有ACAR的微生物，只是具有ACAR的微生物可以以使烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行修飾或可以不以使烯醇化酶活性得以降低的方式進(jìn)行修飾。具有ACAR的微生物可以以ACAR、PPT和香草酸攝取系統(tǒng)中的一種或多種的活性得以增強(qiáng)的方式進(jìn)行修飾。另外，關(guān)于使用微生物生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化方法的描述可以在必要的修改后適用于使用具有ACAR的微生物將香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛的生物轉(zhuǎn)化方法。
[0287] 也可以例如通過(guò)使用ACAR的酶方法將香草酸轉(zhuǎn)化成香草醛。
[0288] ACAR可以通過(guò)允許具有ACAR基因的宿主表達(dá)ACAR基因來(lái)生成。ACAR也可以用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生成。
[0289] 具有ACAR基因的宿主也可以稱為“具有ACAR的宿主”。具有ACAR基因的宿主可以是固有地具有ACAR基因的宿主，或者可以是經(jīng)修飾而具有ACAR基因的宿主。固有地具有ACAR基因的宿主的實(shí)例可以包括衍生出上述示例的ACAR的生物體。經(jīng)修飾而具有ACAR基因的宿主的實(shí)例可以包括已經(jīng)引入有ACAR基因的宿主。此外，固有地具有ACAR基因的宿主可以以ACAR得以增加的方式進(jìn)行修飾。用于表達(dá)ACAR的宿主不受特別限制，只要宿主可以表達(dá)可以起作用的ACAR即可。宿主的實(shí)例可以包括例如，微生物，如細(xì)菌和酵母(真菌)，植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
[0290] 可以通過(guò)培養(yǎng)具有ACAR基因的宿主來(lái)表達(dá)ACAR基因。培養(yǎng)方法沒(méi)有特別限制，只要具有ACAR基因的宿主可以增殖并表達(dá)ACAR即可。關(guān)于發(fā)酵方法培養(yǎng)的描述可以在必要的修改后適用于具有ACAR基因的宿主的培養(yǎng)。必要時(shí)，可以誘導(dǎo)ACAR基因的表達(dá)。作為培養(yǎng)的結(jié)果，可以獲得含有ACAR的培養(yǎng)肉湯。ACAR可以在宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中積累。
[0291] 在宿主細(xì)胞，培養(yǎng)基等中包含的ACAR可以原樣用于酶促反應(yīng)，或者自其純化的ACAR可以用于酶促反應(yīng)?？梢赃M(jìn)行純化到期望的程度。也就是說(shuō)，作為ACAR，可以使用純化的ACAR，或者可以使用含有ACAR的級(jí)分。此類級(jí)分沒(méi)有特別限制，只要其中含有的ACAR可以作用于香草酸即可。此類級(jí)分的實(shí)例可以包括具有ACAR基因的宿主的培養(yǎng)肉湯，即具有ACAR的宿主；從培養(yǎng)肉湯中收集細(xì)胞；細(xì)胞的加工產(chǎn)物，如細(xì)胞破碎物，細(xì)胞裂解物，細(xì)胞提取物和固定化細(xì)胞，如用丙烯酰胺，角叉菜膠等固定化的細(xì)胞；從培養(yǎng)肉湯中收集的培養(yǎng)物上清液；其部分純化產(chǎn)物，例如粗產(chǎn)物；及其組合。這些級(jí)分可以獨(dú)立使用或與純化的ACAR組合使用。
[0292] 酶促反應(yīng)可以通過(guò)允許ACAR作用于香草酸來(lái)進(jìn)行。酶促反應(yīng)的條件沒(méi)有特別限制，只要產(chǎn)生香草醛即可。酶促反應(yīng)可以用例如用于使用酶或微生物細(xì)胞如靜息細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的典型條件進(jìn)行。例如，關(guān)于生物轉(zhuǎn)化方法的第二實(shí)施方案中的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的描述也可以在必要的修改后適用于香草醛生產(chǎn)方法中的酶促反應(yīng)。
[0293] 通過(guò)進(jìn)行如上所述的轉(zhuǎn)化獲得含有香草醛的反應(yīng)混合物。香草醛的產(chǎn)生和香草醛的收集的確認(rèn)可以以與上述發(fā)酵方法相同的方式進(jìn)行。也就是說(shuō)，香草醛生產(chǎn)方法可以進(jìn)一步包括從反應(yīng)混合物中收集香草醛的步驟。除香草醛外，收集的香草醛可以含有例如微生物細(xì)胞，培養(yǎng)基組分，反應(yīng)混合物組分，ACAR，水分和微生物的副產(chǎn)物代謝物。收集的香草醛的純度可以是例如30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)更高。
[0294] 香草酸也可以通過(guò)例如使用具有VDC的微生物的生物轉(zhuǎn)化方法或使用VDC的酶促方法轉(zhuǎn)化為愈創(chuàng)木酚。阿魏酸可以通過(guò)例如使用具有FDC的微生物的生物轉(zhuǎn)化方法或使用FDC的酶促方法轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚可以通過(guò)例如使用具有VPR的微生物的生物轉(zhuǎn)化方法或使用VPR的酶促方法轉(zhuǎn)化為4-乙基愈創(chuàng)木酚。通過(guò)這些方法的組合，阿魏酸也可以轉(zhuǎn)化為4-乙基愈創(chuàng)木酚。具體地，阿魏酸可以通過(guò)例如與VPR或具有VPR的微生物組合同時(shí)或依次使用FDC或具有FDC的微生物，或使用具有FDC和VPR兩者的微生物轉(zhuǎn)化為4-乙基愈創(chuàng)木酚。關(guān)于香草醛生產(chǎn)方法的上述描述可以在必要的修改后適用于生產(chǎn)其他目標(biāo)物質(zhì)的方法。實(shí)施例
[0295] 下文，將參考以下非限制性實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。
[0296] 在本實(shí)施例中，從作為親本菌株的谷氨酸棒桿菌2256菌株(ATCC?13869)構(gòu)建具有編碼烯醇化酶的NCgl0935基因(eno)的弱化表達(dá)的菌株，并且用構(gòu)建的菌株進(jìn)行香草酸生產(chǎn)。
[0297] <1>香草酸脫甲基酶基因缺陷的菌株(FKS0165菌株)的構(gòu)建
[0298] 已經(jīng)報(bào)道了在棒狀桿菌細(xì)菌中，香草醛按香草醛->香草酸->原兒茶酸的順序代謝，并利用(Current?Microbiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。從香草酸到原兒茶酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)由香草酸脫甲基酶催化。vanA基因和vanB基因分別編碼香草酸脫甲基酶的亞基A和亞基B。vanK基因編碼香草酸攝取系統(tǒng)，并與vanAB基因一起構(gòu)成vanABK操縱子(M.T.Chaudhry,et?al.,Microbiology,2007,153:857-865)。因此，首先通過(guò)缺失vanABK操縱子從谷氨酸棒桿菌2256菌株構(gòu)建目標(biāo)物質(zhì)諸如香草醛和香草醛利用能力缺陷的菌株(FKS0165菌株)。程序如下所示。
[0299] <1-1>用于缺失vanABK基因的質(zhì)粒pBS4SΔvanABK56的構(gòu)建
[0300] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:51和52的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有vanA基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:53和54的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有vanK基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:52和53的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，以近似等摩爾量混合含有vanA基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有vanK基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SΔvanABK56。
[0301] <1-2>FKS0165菌株的構(gòu)建
[0302] 上面獲得的pBS4SΔvanABK56不含能使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域。因此，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SΔvanABK56導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌2256菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L?KH2PO4、0.4g/L?MgSO4-7H2O、0.01g/L?FeSO4-7H2O、0.01g/L?MnSO4-7H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解物、10μg/L生物素、15g/L瓊脂，用NaOH調(diào)節(jié)到pH?7.5)，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SΔvanABK56摻入基因組中。此一次重組的菌株具有野生型vanABK基因和缺陷型vanABK基因兩者。
[0303] 將一次重組菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基(與CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基具有相同的組成，只是它不含瓊脂)中培養(yǎng)過(guò)夜，并將該培養(yǎng)肉湯應(yīng)用于S10瓊脂培養(yǎng)基(100g/L蔗糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L?KH2PO4,0.4g/L?MgSO4-7H2O,0.01g/L?FeSO4-7H2O,0.01g/L?MnSO4-4-5H2O，3g/L尿素，1.2g/L大豆蛋白水解物溶液，10μg/L生物素，20μg/L瓊脂，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5，并在120℃高壓滅菌20分鐘)，并在31.5℃培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化顯示卡那霉素易感性的菌株。通過(guò)從純化的菌株中制備基因組DNA，并使用它用SEQ?ID?NO:55和56的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，確認(rèn)了vanABK基因的缺失，并將該菌株命名為FKS0165菌株。
[0304] <2>醇脫氫酶同源基因缺陷菌株(FKFC14菌株)的構(gòu)建
[0305] 隨后，通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌菌株FKS0165作為親本株，通過(guò)以下程序構(gòu)建菌株FKFC14，其是醇脫氫酶同源基因(即NCgl0324基因(adhC)、NCgl0313基因(adhE)、和NCgl2709gene(adhA))缺陷的。
[0306] <2-1>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的構(gòu)建
[0307] <2-1-1>用于缺失NCgl0324基因的質(zhì)粒pBS4SΔ2256adhC的構(gòu)建
[0308] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:57和58的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0324基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:59和60的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0324基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:58和59的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，將約等摩爾量的含有NCgl0324基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有NCgl0324基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物混合，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)插入已經(jīng)用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將其中插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SΔ2256adhC。
[0309] <2-1-2>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的構(gòu)建
[0310] 由于上述獲得的pBS4SΔ2256adhC不含使質(zhì)粒能夠在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SΔ2256adhC導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌FKS0165菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)，生長(zhǎng)的菌株是通過(guò)同源重組將pBS4SΔ2256adhC摻入基因組中的一次重組菌株。此一次重組菌株具有野生型NCgl0324基因和缺陷型NCgl0324基因兩者。
[0311] 將一次重組的菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)肉湯應(yīng)用到S10瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，顯示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化。從純化的菌株制備基因組DNA，并用SEQ?ID?NO:61和62的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以確認(rèn)NCgl0324基因的缺失，并將該菌株命名為FKFC5菌株。
[0312] <2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313菌株)的構(gòu)建
[0313] <2-2-1>用于缺失NCgl0313基因的質(zhì)粒pBS4SΔ2256adhE的構(gòu)建
[0314] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:63和64的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0313基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA為模板和SEQ?ID?NO:65和66的合成DNA為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0313基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:64和65的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，將約等摩爾量的含有NCgl0313基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有NCgl0313基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物混合，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將其中插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SΔ2256adhE。
[0315] <2-2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313株)的構(gòu)建
[0316] 由于上述獲得的pBS4SΔ2256adhE不含有使質(zhì)粒能夠在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中的自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，但它在非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖方法將pBS4SΔ2256adhE導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌FKFC5菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃下培養(yǎng)。通過(guò)PCR證實(shí)，生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SΔ2256adhE摻入基因組中。此一次重組菌株具有野生型NCgl0313基因和缺陷型NCgl0313基因兩者。
[0317] 將一次重組的菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)肉湯應(yīng)用到S10瓊脂培養(yǎng)基上，并在31.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，顯示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化。從純化的菌株制備基因組DNA，并使用SEQ?ID?NO:67和68的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以確認(rèn)NCgl0313基因的缺失，并將該菌株命名為FKFC11菌株。
[0318] <2-3>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709株)的構(gòu)建[0319] <2-3-1>用于缺失NCgl2709基因的質(zhì)粒pBS4SΔ2256adhA的構(gòu)建
[0320] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:69和70的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得含有NCgl2709基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA為模板和SEQ?ID?NO:71和72的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以得到含有NCgl2709基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:70和71的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，將約等摩爾量的含有NCgl2709基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有NCgl2709基因的C端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物混合，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)插入到用BamHI和PstI處理的pBS4S載體中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將其中插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SΔ2256adhA。
[0321] <2-3-2>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709菌株)的構(gòu)建
[0322] 由于上文獲得的pBS4SΔ2256adhA不含能夠使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，但它在非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SΔ2256adhA導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌FKFC11菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)，生長(zhǎng)的菌株是通過(guò)同源重組將pBS4SΔ2256adhA摻入基因組中的一次重組菌株。該一次重組菌株具有野生型NCgl2709基因和缺陷型NCgl2709基因兩者。
[0323] 將一次重組的菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)肉湯應(yīng)用到S10瓊脂培養(yǎng)基上，并在31.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，顯示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化。從純化的菌株制備基因組DNA，并用SEQ?ID?NO:73和74的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以確認(rèn)NCgl2709基因的缺失，并將該菌株命名為FKFC14菌株。
[0324] <3>原兒茶酸雙加氧酶基因缺陷菌株(FKFC14ΔpcaGH菌株)的構(gòu)建
[0325] 隨后，通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌FKFC14菌株作為親本菌株，通過(guò)外包構(gòu)建菌株FKFC14ΔpcaGH，其是編碼原兒茶酸3,4-雙加氧酶的α亞基和β亞基的NCgl2314基因(pcaG)和NCgl2315基因(pcaH)缺陷的。也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建FKFC14ΔpcaGH菌株。
[0326] <3-1>用于缺失NCgl2314和NCgl2315基因的質(zhì)粒pBS4SΔ2256pcaGH的構(gòu)建
[0327] NCgl2314和NCgl2315基因彼此相鄰，因此可以一起缺失這些基因。通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:75和76的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得含有NCgl2315基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:77和78的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl2314基因的下游區(qū)的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:76和77的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，混合近似等摩爾量的含有NCgl2315基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有NCgl2314基因的下游區(qū)的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SΔ2256pcaGH。
[0328] <3-2>FKFC14ΔpcaGH菌株的構(gòu)建
[0329] 由于上面獲得的pBS4SΔ2256pcaGH不含能使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SΔ2256pcaGH導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌FKFC14菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SΔ2256pcaGH摻入基因組中。此一次重組的菌株具有野生型NCgl2314和NCgl2315基因，和缺陷型NCgl2314和NCgl2315基因兩者。
[0330] 將一次重組菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，并將該培養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)用于S10瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化顯示卡那霉素易感性的菌株。通過(guò)從純化的菌株中制備基因組DNA，并使用它用SEQ?ID?NO:79和80的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，確認(rèn)了NCgl2314和NCgl2315基因的缺失，并將該菌株命名為FKFC14ΔpcaGH菌株。
[0331] <4>Dp2_0340菌株(FKFC14ΔpcaGH?P2::NCgl0120?P8::NCgl2048?P4::NCgl0935菌株)的構(gòu)建
[0332] <4-1>Ap1_0007菌株(FKFC14ΔpcaGH?P2::NCgl0120菌株)的構(gòu)建
[0333] 隨后，通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌FKFC14ΔpcaGH菌株作為親本菌株，通過(guò)外包構(gòu)建菌株Ap1_0007，其中編碼Crp家族表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白的NCgl0120基因(cysR)的啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)用P2啟動(dòng)子替換以增強(qiáng)此基因的表達(dá)。此菌株中含有P2啟動(dòng)子的基因組區(qū)域的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:108顯示，其中位置942-1034對(duì)應(yīng)于P2啟動(dòng)子。也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建Ap1_0007菌株。
[0334] <4-1-1>用于替換NCgl0120基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBS4SP2::NCgl0120的構(gòu)建
[0335] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:81和82的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得含有NCgl0120基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:83和84的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0120基因的下游區(qū)的PCR產(chǎn)物。另外，通過(guò)人工基因合成獲得含有P2啟動(dòng)子區(qū)的SEQ?ID?NO:85的DNA片段。然后，通過(guò)使用SEQ?ID?NO:85的DNA片段作為模板，和SEQ?ID?NO:86和87的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有P2啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:82和86的序列彼此部分互補(bǔ)，并且SEQ?ID?NO:83和87的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，混合近似等摩爾量的含有NCgl0120基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物、含有NCgl0120基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有P2啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SP2::NCgl0120。
[0336] <4-1-2>Ap1_0007菌株的構(gòu)建
[0337] 由于上面獲得的pBS4SP2::NCgl0120不含能使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SP2::NCgl0120導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌FKFC14ΔpcaGH菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SP2::NCgl0120摻入基因組中。
[0338] 將一次重組菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，并將該培養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)用于S10瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化顯示卡那霉素易感性的菌株。通過(guò)從純化的菌株中制備基因組DNA，并用于進(jìn)行核苷酸序列分析以確認(rèn)P2啟動(dòng)子位于NCgl0120基因上游，并且該菌株命名為Ap1_0007菌株。
[0339] <4-2>Bp1_0112菌株(FKFC14ΔpcaGH?P2::NCgl0120?P8::NCgl2048菌株)的構(gòu)建[0340] 隨后，通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌Ap1_0007菌株作為親本菌株，通過(guò)外包構(gòu)建菌株Bp1_0112，其中NCgl2048基因的啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)用P8啟動(dòng)子替換以弱化此基因的表達(dá)。此菌株中含有P8啟動(dòng)子的基因組區(qū)的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:110顯示，其中位置901-1046對(duì)應(yīng)于P8啟動(dòng)子。Bp1_0112菌株也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建。
[0341] <4-2-1>用于替換NCgl2048基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBS4SP8::NCgl2048的構(gòu)建
[0342] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:112和113的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl2048基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物。分開(kāi)通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:114和115的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl2048基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。另外，通過(guò)人工基因合成獲得含有P8啟動(dòng)子區(qū)的SEQ?ID?NO:116的DNA片段。然后，通過(guò)使用SEQ?ID?NO:116的DNA片段作為模板，和SEQ?ID?NO:117和118的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有P8啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:113和117的序列彼此部分互補(bǔ)，并且SEQ?ID?NO:114和118的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，混合近似等摩爾量的含有NCgl2048基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物、含有NCgl2048基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有P8啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SP8::NCgl2048。
[0343] <4-2-2>Bp1_0112菌株的構(gòu)建
[0344] 由于上面獲得的pBS4SP8::NCgl2048不含能使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SP8::NCgl2048導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌Ap1_0007菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SP8::NCgl2048摻入基因組中。
[0345] 將一次重組菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將該培養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)用于S10瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化顯示卡那霉素易感性的菌株。通過(guò)從純化的菌株中制備基因組DNA，并用于進(jìn)行核苷酸序列分析以確認(rèn)P8啟動(dòng)子位于NCgl2048基因上游，并且該菌株命名為Bp1_0112菌株。
[0346] <4-3>Dp2_0340菌株(FKFC14ΔpcaGH?P2::NCgl0120?P8::NCgl2048?P4::NCgl0935菌株)的構(gòu)建
[0347] 隨后，通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌Bp1_0112菌株作為親本菌株，通過(guò)外包構(gòu)建菌株Dp2_0340，其中編碼烯醇化酶的NCgl0935基因(eno)的啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)用P4啟動(dòng)子替換以弱化此基因的表達(dá)。此菌株中含有P4啟動(dòng)子的基因組區(qū)域的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:109顯示，其中位置872-969對(duì)應(yīng)于P4啟動(dòng)子。Dp2_0340菌株也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建。
[0348] <4-3-1>用于替換NCgl0935基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBS4SP4::NCgl0935的構(gòu)建
[0349] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:121和122的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得含有NCgl0935基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物。分別通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板和SEQ?ID?NO:123和124的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有NCgl0935基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。另外，通過(guò)人工基因合成獲得含有P4啟動(dòng)子區(qū)的SEQ?ID?NO:125的DNA片段。然后，通過(guò)使用SEQ?ID?NO:125的DNA片段作為模板和SEQ?ID?NO:126和127的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得含有P4啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物。SEQ?ID?NO:122和126的序列彼此部分互補(bǔ)，并且SEQ?ID?NO:123和127的序列彼此部分互補(bǔ)。然后，混合近似等摩爾量的含有NCgl0935基因的上游區(qū)的PCR產(chǎn)物、含有NCgl0935基因的N端側(cè)編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物和含有P4啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將其插入用BamHI和PstI處理的pBS4S載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4SP4::NCgl0935。
[0350] <4-3-2>Dp2_0340菌株的構(gòu)建
[0351] 由于上面獲得的pBS4SP4::NCgl0935不含能使質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，若用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌細(xì)菌，則通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒摻入基因組中的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，盡管它以非常低的頻率發(fā)生。因此，通過(guò)電脈沖法將pBS4SP4::NCgl0935導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌Bp1_0112菌株。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。通過(guò)PCR確認(rèn)生長(zhǎng)的菌株是一次重組菌株，其中通過(guò)同源重組將pBS4SP4::NCgl0935摻入基因組中。
[0352] 將一次重組菌株在CM-Dex液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將該培養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)用于S10瓊脂培養(yǎng)基，并在31.5℃培養(yǎng)。在出現(xiàn)的菌落中，在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上純化顯示卡那霉素易感性的菌株。通過(guò)從純化的菌株中制備基因組DNA，并用于進(jìn)行核苷酸序列分析以確認(rèn)P4啟動(dòng)子位于NCgl0935基因上游，并且該菌株命名為Dp2_0340菌株。
[0353] <5>用于表達(dá)Niastella?koreensis的OMT基因的質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35的構(gòu)建[0354] 通過(guò)外包獲得質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35。質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35含有針對(duì)谷氨酸棒桿菌的密碼子選擇進(jìn)行密碼子優(yōu)化的Niastella?koreensis的OMT基因。此基因也可以稱為“omt35基因”，并且由此基因編碼的OMT也可以稱為“OMT35”。omt35基因的核苷酸序列以SEQ?ID?NO:135顯示，并且OMT35的氨基酸序列以SEQ?ID?NO:131顯示。質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建。
[0355] 通過(guò)使用谷氨酸棒桿菌2256菌株的基因組DNA作為模板，和SEQ?ID?NO:132和133的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得含有cspB基因的啟動(dòng)子區(qū)和SD序列的PCR產(chǎn)物。分開(kāi)地通過(guò)人工基因合成獲得含有omt35基因的ORF的SEQ?ID?NO:134的DNA片段。然后，通過(guò)使用In?Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech)將PCR產(chǎn)物和DNA片段插入用BamHI和PstI處理的pVK9載體(WO2007/046389)中。利用該DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Takara?Bio)，并且將細(xì)胞應(yīng)用于含有100μM?IPTG，40μg/mL?X-Gal和25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并培養(yǎng)過(guò)夜。然后，挑取出現(xiàn)的白色菌落，并且分離成單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將插入了靶PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pVK9::PcspB-omt35。
[0356] <6>香草酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建
[0357] 通過(guò)外包構(gòu)建谷氨酸棒桿菌Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株(其含有質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35)。這些菌株也可以經(jīng)由以下程序構(gòu)建。
[0358] 通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pVK9::PcspB-omt35導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌Bp1_0112和Dp2_0340菌株中。將細(xì)胞應(yīng)用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基，并且于31.5℃培養(yǎng)。在相同的瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株，并且分別命名為Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35。
[0359] 將這些菌株各自接種到試管中存在的4mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex?w/o?mameno培養(yǎng)基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L?KH2PO4、0.4g/L?MgSO4-7H2O、0.01g/L?FeSO4-7H2O、0.01g/L?MnSO4-7H2O、3g/L尿素、10μg/L生物素，用KOH調(diào)節(jié)到pH?
7.5)中，并且于31.5℃在搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)約16小時(shí)。將獲得的培養(yǎng)肉湯的0.9mL等分試樣與0.6mL?50％甘油水溶液混合以獲得甘油儲(chǔ)液，并且于-80℃貯存。
7.5)中，并且于31.5℃在搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)約16小時(shí)。將獲得的培養(yǎng)肉湯的0.9mL等分試樣與0.6mL?50％甘油水溶液混合以獲得甘油儲(chǔ)液，并且于-80℃貯存。
[0360] <7>谷氨酸棒桿菌Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的香草酸生產(chǎn)
[0361] 將Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的甘油儲(chǔ)液的各5μL等分試樣接種到試管中存在的4mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex?w/o?mameno培養(yǎng)基，并且于31.5℃在搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)20小時(shí)作為預(yù)培養(yǎng)物。將獲得的預(yù)培養(yǎng)物肉湯的0.5mL等分試樣接種到具有擋板的錐形瓶中存在的50mL含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex?w/o?mameno培養(yǎng)基，并且于31.5℃在搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)20小時(shí)。以8000rpm將獲得的培養(yǎng)物肉湯離心5分鐘，除去上清液，并且在經(jīng)滅菌的生理鹽水中懸浮細(xì)胞。測(cè)量細(xì)胞懸浮液的光密度(OD)，并且用生理鹽水稀釋細(xì)胞懸浮液以獲得600nm處的OD為50。將稀釋的細(xì)胞懸浮液的5mL等分試樣接種到具有擋板的錐形瓶中存在的20mL含有25μg/mL卡那霉素的香草酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(75g/L葡萄糖、0.6g/L?MgSO4-7H2O、6.3g/L(NH4)2SO4、2.5g/L?KH2PO4、12.5mg/L?FeSO4-7H2O、12.5mg/L?MnSO4-4-5H2O、2.5g/L酵母提取物、150μg/L維生素B1、150μg/L生物素、6.9g/L原兒茶酸，用KOH調(diào)節(jié)到pH?7，然后與37.5g/L?CaCO3(用180℃的熱空氣滅菌3小時(shí))混合)中，并且于31.5℃在搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0362] 在培養(yǎng)開(kāi)始和完成時(shí)，用Biotech分析儀AS-310(Sakura?SI)分析培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。也通過(guò)使用超高效液相層析NEXERA?X2系統(tǒng)(SHIMADZU)用以下條件分析培養(yǎng)基中的原兒茶酸和香草酸濃度。
[0363] UPLC分析條件：
[0364] 柱：KINETEX?2.6μm?XB-C18,150x?30mm(Phenomenex)
[0365] 爐溫度：40℃
[0366] 流動(dòng)相(A):0.1％三氟乙酸
[0367] 流動(dòng)相(B):0.1％三氟乙酸/80％乙腈
[0368] 梯度程度(時(shí)間，A(％),B(％)):(0,90,10)->(3,80,20)
[0369] 流速：1.5ml/min
[0370] 表1中顯示了結(jié)果。對(duì)Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株觀察到的培養(yǎng)基中的香草酸濃度是對(duì)Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株觀察到的香草酸濃度的約2.3倍。
[0371] [表1]
[0372] 表1：谷氨酸棒桿菌香草酸生產(chǎn)菌株的香草酸生產(chǎn)
[0373]
[0374]
[0375] <8>通過(guò)定量PCR分析NCgl0935基因(eno)的表達(dá)量
[0376] 隨后，通過(guò)定量PCR分析Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因(eno)表達(dá)量。
[0377] <8-1>RNA的制備
[0378] 將含有細(xì)胞的培養(yǎng)肉湯的250μL等分試樣與500μL?RNA?Protect?Bacteria?Reagent(QIAGEN)混合，并且于-80℃貯存，所述培養(yǎng)肉湯對(duì)于Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35和Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株的每種在實(shí)施例<7>中在培養(yǎng)開(kāi)始后5小時(shí)獲得。于室溫融化冷凍的混合物，與200μL含有溶菌酶的TE緩沖液(10mM?Tris，1mM?EDTA,pH?8.0)以及與10μL蛋白酶K(20mg/mL)一起添加，混合，然后于室溫溫育40分鐘。使用RNeasy?Mini試劑盒(QIAGEN)進(jìn)行以下程序。將經(jīng)處理的產(chǎn)物與700μL含有1％2-巰基乙醇的RLT緩沖液一起添加，混合，并且離心以獲得上清液。將上清液與500μL乙醇一起添加，混合，并且應(yīng)用到試劑盒中包含柱，并且將柱離心。用350μL?RW1緩沖液清洗柱，然后將80μL?DNA酶I溶液添加到柱以于室溫進(jìn)行DNA酶處理15分鐘。此外，用350μL?RW1緩沖液清洗柱，并且用500μL?RPE緩沖液清洗兩次，并且用無(wú)RNA酶的滅菌水洗脫以獲得RNA。使用NanoDrop(Thermo?Fisher?Scientific)量化獲得的RNA，并且使用BioAnalyer(Agilent?Technologies)用RNA?
6000Nano試劑盒(Agilent?Technologies)通過(guò)進(jìn)行電泳分析以確認(rèn)獲得的RNA具有足夠的純度。
6000Nano試劑盒(Agilent?Technologies)通過(guò)進(jìn)行電泳分析以確認(rèn)獲得的RNA具有足夠的純度。
[0379] <8-2>通過(guò)反向轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0380] 使用具有g(shù)DNA?Eraser的PrimeScript?RT試劑試劑盒(TAKARA?BIO)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將1μg?RNA等分試樣與1μL?gDNA?Eraser和2μL?5×DNA?Eraser緩沖液一起添加，用滅菌水稀釋至總體積10μL，并且于42℃溫育2min以降解染色體DNA。將所得的混合物與4μL?5×PrimeScript?Buffer2、1μL?PrimeScript?RT酶混合物I、1μL?RT引物混合物和4μL滅菌水進(jìn)一步一起添加，于37℃溫育15分鐘和85℃溫育5秒以獲得cDNA。
[0381] <8-3>定量PCR
[0382] 用以下程序從cDNA擴(kuò)增NCgl0935基因(eno)作為靶基因：2μL?cDNA、10μL?Power?SYBR?Green?PCR主混合物(Life?Technologies)、SEQ?ID?NO:136和137的引物(各500nM，作為終濃度)，并且混合滅菌水以獲得總體積20μL；使用7000實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied?Bio?Systems)以95℃變性10分鐘，接著95℃達(dá)15秒和60℃達(dá)1min的40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。另外，使用與用于靶基因擴(kuò)增的程序相同的程序從cDNA擴(kuò)增16S?rRNA基因作為持家基因，只是使用2μL?32倍稀釋的cDNA作為模板并且使用SEQ?ID?NO:138和139。在擴(kuò)增反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析以確認(rèn)PCR產(chǎn)物的一致性。此外，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCT產(chǎn)物以確認(rèn)PCR產(chǎn)物具有用使用的引物可獲得的長(zhǎng)度。
[0383] <8-4>表達(dá)量的分析
[0384] 使用ΔΔCt方法(METHODS,25,402(2001))來(lái)分析NCgl0935基因(eno)的表達(dá)量。提供通過(guò)從NCgl0935基因(eno)的Ct值扣除持家基因的Ct值獲得的數(shù)值作為ΔCt值。然而，
5
由于使用32倍稀釋(即2 倍稀釋)的cDNA作為擴(kuò)增持家基因的模板，作為持家基因的Ct值，使用通過(guò)將5加到實(shí)際測(cè)量的持家基因的ΔCt值獲得的值。提供通過(guò)從Dp2_0340/pVK9::
PcspB-omt35菌株的ΔCt值扣除Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35的ΔCt值獲得的數(shù)值作為ΔΔCt值。基于Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株，Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的-ΔΔCt
NCgl0935基因(eno)的相對(duì)表達(dá)量作為2 計(jì)算。
5
由于使用32倍稀釋(即2 倍稀釋)的cDNA作為擴(kuò)增持家基因的模板，作為持家基因的Ct值，使用通過(guò)將5加到實(shí)際測(cè)量的持家基因的ΔCt值獲得的值。提供通過(guò)從Dp2_0340/pVK9::
PcspB-omt35菌株的ΔCt值扣除Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35的ΔCt值獲得的數(shù)值作為ΔΔCt值。基于Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株，Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的-ΔΔCt
NCgl0935基因(eno)的相對(duì)表達(dá)量作為2 計(jì)算。
[0385] 表2中顯示了結(jié)果。Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因(eno)的相對(duì)表達(dá)量是Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35菌株中的NCgl0935基因的相對(duì)表達(dá)量的低于三十分之一(1/30)。
[0386] [表2]
[0387] 表2：NCgl0935基因(eno)的相對(duì)表達(dá)量
[0388]菌株 2-ΔΔCt
Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35 1.0
Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35 0.03
Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35 1.0
Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35 0.03
[0389] [工業(yè)適用性]
[0390] 根據(jù)本發(fā)明，微生物用于生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)，諸如香草醛和香草酸的能力可以得到改善，并且可以有效生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)。
[0392] SEQ?ID?NOS:
[0393] 1：大腸桿菌MG1655的aroG基因的核苷酸序列
[0394] 2：大腸桿菌MG1655的AroG蛋白的氨基酸序列
[0395] 3：大腸桿菌MG1655的aroB基因的核苷酸序列
[0396] 4：大腸桿菌MG1655的AroB蛋白的氨基酸序列
[0397] 5：大腸桿菌MG1655的aroD基因的核苷酸序列
[0398] 6：大腸桿菌MG1655的AroD蛋白的氨基酸序列
[0399] 7：蘇云金芽孢桿菌BMB171的asbF基因的核苷酸序列
[0400] 8：蘇云金芽孢桿菌BMB171的AsbF蛋白的氨基酸序列
[0401] 9：大腸桿菌MG1655的tyrR基因的核苷酸序列
[0402] 10：大腸桿菌MG1655的TyrR蛋白的氨基酸序列
[0403] 11-14：智人OMT基因的轉(zhuǎn)錄物變體1至4的核苷酸序列
[0404] 15：智人OMT同種型(MB-COMT)的氨基酸序列
[0405] 16：智人OMT同種型(S-COMT)的氨基酸序列
[0406] 17：巴西諾卡菌的ACAR基因的核苷酸序列
[0407] 18：巴西諾卡菌的ACAR蛋白的氨基酸序列
[0408] 19：巴西諾卡菌的ACAR基因的核苷酸序列
[0409] 20：巴西諾卡菌的ACAR蛋白的氨基酸序列
[0410] 21：大腸桿菌MG1655的entD基因的核苷酸序列
[0411] 22：大腸桿菌MG1655的EntD蛋白的氨基酸序列
[0412] 23：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的PPT基因的核苷酸序列
[0413] 24：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的PPT蛋白的氨基酸序列
[0414] 25：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的vanK基因的核苷酸序列
[0415] 26：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的VanK蛋白的氨基酸序列
[0416] 27：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的pcaK基因的核苷酸序列
[0417] 28：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的PcaK蛋白的氨基酸序列
[0418] 29：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的vanA基因的核苷酸序列
[0419] 30：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的VanA蛋白的氨基酸序列
[0420] 31：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的vanB基因的核苷酸序列
[0421] 32：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的VanB蛋白的氨基酸序列
[0422] 33：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的pcaG基因的核苷酸序列
[0423] 34：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的PcaG蛋白的氨基酸序列
[0424] 35：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的pcaH基因的核苷酸序列
[0425] 36：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的PcaH蛋白的氨基酸序列
[0426] 37：大腸桿菌MG1655的yqhD基因的核苷酸序列
[0427] 38：大腸桿菌MG1655的YqhD蛋白的氨基酸序列
[0428] 39：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl0324基因的核苷酸序列
[0429] 40：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl0324蛋白的氨基酸序列
[0430] 41：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl0313基因的核苷酸序列
[0431] 42：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl0313蛋白的氨基酸序列
[0432] 43：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl2709基因的核苷酸序列
[0433] 44：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl2709蛋白的氨基酸序列
[0434] 45：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的NCgl0219基因的核苷酸序列
[0435] 46：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的NCgl0219蛋白的氨基酸序列
[0436] 47：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的NCgl2382基因的核苷酸序列
[0437] 48：谷氨酸棒桿菌ATCC?13032的NCgl2382蛋白的氨基酸序列
[0438] 49：大腸桿菌MG1655的aroE基因的核苷酸序列
[0439] 50：大腸桿菌MG1655的AroE蛋白的氨基酸序列
[0440] 51-84：引物
[0441] 85：含有P2啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的核苷酸序列
[0442] 86和87：引物
[0443] 88：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysI基因的核苷酸序列
[0444] 89：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysI蛋白的氨基酸序列
[0445] 90：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysX基因的核苷酸序列
[0446] 91：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysX蛋白的氨基酸序列
[0447] 92：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysH基因的核苷酸序列
[0448] 93：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysH蛋白的氨基酸序列
[0449] 94：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysD基因的核苷酸序列
[0450] 95：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysD蛋白的氨基酸序列
[0451] 96：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysN基因的核苷酸序列
[0452] 97：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysN蛋白的氨基酸序列
[0453] 98：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysY基因的核苷酸序列
[0454] 99：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysY蛋白的氨基酸序列
[0455] 100：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysZ基因的核苷酸序列
[0456] 101：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysZ蛋白的氨基酸序列
[0457] 102：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的fpr2基因的核苷酸序列
[0458] 103：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的Fpr2蛋白的氨基酸序列
[0459] 104：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的cysR基因的核苷酸序列
[0460] 105：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的CysR蛋白的氨基酸序列
[0461] 106：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的ssuR基因的核苷酸序列
[0462] 107：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的SsuR蛋白的氨基酸序列
[0463] 108：含有P2啟動(dòng)子的核苷酸序列
[0464] 109：含有P4啟動(dòng)子的核苷酸序列
[0465] 110：含有P6啟動(dòng)子的核苷酸序列
[0466] 111：含有P8啟動(dòng)子的核苷酸序列
[0467] 112-115：引物
[0468] 116：含有P8啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的核苷酸序列
[0469] 117和118：引物
[0470] 119：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl2048基因的核苷酸序列
[0471] 120：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的NCgl2048蛋白的氨基酸序列
[0472] 121-124：引物
[0473] 125：含有P4啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的核苷酸序列
[0474] 126和127：引物
[0475] 128：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的eno基因的核苷酸序列
[0476] 129：谷氨酸棒桿菌2256(ATCC?13869)的Eno蛋白的氨基酸序列
[0477] 130：Niastella?koreensis的OMT基因的核苷酸序列
[0478] 131：Niastella?koreensis的OMT的氨基酸序列
[0479] 132和133：引物
[0480] 134：含有omt35基因的DNA片段的核苷酸序列
[0481] 135：omt35基因的核苷酸序列(Niastella?koreensis的經(jīng)密碼子優(yōu)化的OMT基因)[0482] 136-139：引物
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