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用納米顆粒和/或納米乳液配制的醛在增強植物對黃龍病菌的疾病抗性中的用途
閱讀：1020發(fā)布：2020-08-21
專利匯可以提供用納米顆粒和/或納米乳液配制的醛在增強植物對黃龍病菌的疾病抗性中的用途專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且本 發(fā)明 提供了基于天然酚芳族 醛 (例如：肉桂醛、 苯甲醛 )的方法和組合物，發(fā)現(xiàn)其可用作活的 植物 的系統(tǒng)性細菌感染的 治療 劑，具體地針對革蘭氏陰性菌且更具體地針對黃龍病菌(Liberibacter)菌種，包括柑橘黃龍病亞洲種(Ca.Liberibacter?asiaticus)。所述治療劑組合物與其他抗 微 生物 化合物(諸如植物由于生物或非生物壓 力 而制造或釋放的那些)協(xié)同使用，包括主題醛、一些蛋白(無論是否由重組方法產(chǎn)生)、納米顆粒、 納米乳 液的應用，或通過天然精油如香芹酚或大蒜素。所述芳族醛具有高揮發(fā)性且當以超過一定量應用時呈現(xiàn)植物毒性?？芍委熛到y(tǒng)性感染和多種植物部位的侵染，包括葉和根的侵染。本發(fā)明公開了應用農(nóng)用組合物的方法。，下面是用納米顆粒和/或納米乳液配制的醛在增強植物對黃龍病菌的疾病抗性中的用途專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種組合物，其用于保護植物免受細菌感染，包括由昆蟲傳播的細胞內(nèi)細菌的感染，且用于治療由細菌感染的植物或減少感染的植物中細菌的水平，所述組合物包含(a)至少一種芳族醛；和(b)至少一種滲透極性溶劑，或(c)包含含有芳族醛的納米乳液和/或納米顆粒的制劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括摻入納米顆粒并用作納米顆粒的封蓋劑的芳族醛。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括摻入納米乳液的芳族醛。
4.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛。
5.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中所述至少一種滲透極性溶劑為DMSO。
6.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中存在額外應用的植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應的誘導劑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述SAR誘導劑選自水楊酸(SA)或新煙堿類殺蟲劑，包括吡蟲啉和噻蟲胺。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述SAR誘導劑是SA。
9.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中所述納米顆粒由氧化鋅制成。
10.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中所述納米乳液由維生素E、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、十二烷酸、硬脂酸鋅、甘油二肉豆蔻酸酯、卵磷脂、油酸和/或聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)制成。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述納米乳液由聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫
20)制成。
12.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所述納米顆粒由硫化鋅、氧化鋅、聚乙二醇或聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)制成。
13.一種組合物，其用于保護植物免受細菌感染，包括由昆蟲傳播的細胞內(nèi)細菌的感染，且用于治療由細菌感染的植物或減少感染的植物中細菌的水平，所述組合物包含納米乳液和/或納米顆粒。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述納米顆粒由PLGA制成。
15.保護植物免受細菌攻擊或感染的方法，所述方法包括用權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
16.保護植物免受細菌攻擊或感染的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
17.治療由細菌感染的植物的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述細菌是細胞內(nèi)定殖細菌。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述細菌是黃龍病菌(Liberibacter)屬的成員或黃龍病韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter)。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述細菌是柑橘黃龍病亞洲種(Ca.Liberibacter?asiaticus)。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物是柑橘樹。
22.用于治療受黃龍病菌感染的植物的方法，所述方法包括：用包含下述的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位：(a)至少一種芳族醛；和(b)至少一種滲透極性溶劑，或(c)包含含有芳族醛的納米乳液和/或納米顆粒的制劑，
其中所述至少一種芳族醛以應用至植物的總組合物的至多10％的量存在，且其中所述至少一種極性溶劑以總組合物的至少5％的量存在。
23.用于治療受黃龍病菌感染的植物的方法，所述方法包括：用包含下述的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位：(a)摻入納米顆?；蛴米骷{米顆粒的封蓋劑的至少一種芳族醛；和(b)至少一種極性溶劑，或(c)包含含有芳族醛的納米乳液和/或納米顆粒的制劑。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括摻入納米乳液的芳族醛。
25.權(quán)利要求21、權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的方法，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且所述至少一種極性溶劑包括DMSO、異丙醇或水，且所述乳化劑包括維生素E、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、十二烷酸、硬脂酸鋅、甘油二肉豆蔻酸酯、卵磷脂、油酸和/或聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)。
26.權(quán)利要求22、權(quán)利要求23、權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的方法，其中所述肉桂醛以約
1.5％至約10％的量存在且使用時，所述DMSO以總組合物的至少約50％的量存在。
27.權(quán)利要求22、權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的方法，其中所述受黃龍病菌感染的植物相對于未用所述組合物接觸或注入的植物而言呈現(xiàn)細菌的減少和果實產(chǎn)量的增加。
28.權(quán)利要求22、權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的方法，其中所述納米顆粒是(a)PLGA且以總組合物的0.02％-0.075％的范圍存在；(b)ZnS且以總組合物的約0.974％的量存在，或(c)ZnO且以總組合物約0.0625％的量存在。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述納米顆粒大小的范圍為約2nm-100nm。
30.權(quán)利要求22、權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的方法，其中在所述植物治療后一個月或更久后，感染的植物中細菌感染的水平減少至少5％。
31.權(quán)利要求22、權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的方法，其中所述植物是柑橘樹或幼苗。
32.一種方法，其用于治療柑橘樹或幼苗的任何黃龍病菌并保護柑橘樹和幼苗免受木虱的侵染，所述黃龍病菌能夠引起黃龍病，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種(Ca.L.asiaticus)、柑橘黃龍病非洲種(Ca.L.africanus)或柑橘黃龍病美洲種(Ca.L.americanus)，所述木虱能夠傳播黃龍病的媒介物，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種，所述方法包括：
用包含2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述柑橘樹或幼苗的一個或多個部位，其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少5％的減少。
33.一種方法，其用于治療具有黃龍病菌的馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽，且用于保護馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽免受由昆蟲載體攜帶的黃龍病菌的侵染，所述方法包括：
用包含約2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽的一個或多個部位，
其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少5％的減少。
34.一種組合物，其用于保護植物免受細菌包括由昆蟲傳播的細菌的感染，且用于治療由細菌感染的植物或減少感染的植物中細菌的水平，所述組合物包含(a)至少一種芳族醛；
和(b)至少一種滲透極性溶劑。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括摻入納米顆?；蛴米骷{米顆粒的封蓋劑的芳族醛。
36.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛。
37.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物，其中所述至少一種滲透極性溶劑是DMSO。
38.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物，其中存在額外應用的植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應的誘導劑。
39.權(quán)利要求38的組合物，其中SAR誘導劑選自水楊酸(SA)或新煙堿類殺蟲劑，包括吡蟲啉和噻蟲胺。
40.權(quán)利要求38的組合物，其中所述SAR誘導劑是SA。
41.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物，其中所述納米顆粒由氧化鋅制成。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述至少一種滲透極性溶劑是DMSO。
43.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物，其中所述納米顆粒由硫化鋅制成。
44.一種組合物，其用于保護植物免受細菌包括由昆蟲傳播的細菌的感染，且用于治療由細菌感染的植物或減少感染的植物中的細菌水平，所述組合物包含納米顆粒的乳液。
45.權(quán)利要求43的組合物，其中所述納米顆粒由氧化鋅、硫化鋅或PLGA制成。
46.保護植物免受細菌攻擊或感染的方法，所述方法包括用權(quán)利要求44或權(quán)利要求45的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
47.保護植物免受細菌攻擊或感染的方法，所述方法包括用權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
48.治療由細菌感染的植物的方法，所述方法包括用權(quán)利要求34或權(quán)利要求37的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述細菌是細胞內(nèi)定殖細菌。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述細菌是黃龍病菌屬的成員或黃龍病韌皮部桿菌。
51.權(quán)利要求47的方法，其中所述細菌是柑橘黃龍病亞洲種。
52.權(quán)利要求47的方法，其中所述植物是柑橘樹。
53.用于治療受黃龍病菌感染的植物的方法，所述方法包括：用包含下述的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位：(a)至少一種芳族醛，和(b)至少一種極性溶劑，其中所述至少一種芳族醛以應用至所述植物的總組合物的至多10％的量存在，且其中所述至少一種極性溶劑以總組合物的至少5％的量存在。
54.用于治療受黃龍病菌感染的植物的方法，所述方法包括：用包含下述的組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位：(a)至少一種摻入納米顆?；蛴米骷{米顆粒的封蓋劑的芳族醛；和(b)至少一種極性溶劑。
55.權(quán)利要求52或權(quán)利要求53的方法，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且所述至少一種極性溶劑包括DMSO、異丙醇或水。
56.權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的方法，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且所述至少一種極性溶劑包括水。
57.權(quán)利要求55或權(quán)利要求56的方法，其中所述肉桂醛以約1.5％的量存在且所述DMSO以總組合物的約50％的量存在。
58.權(quán)利要求53的方法，其中所述受黃龍病菌感染的植物相對于未用所述組合物接觸或注入的植物而言呈現(xiàn)細菌的減少和果實產(chǎn)量的增加。
59.權(quán)利要求54的方法，其中所述納米顆粒是(a)PLGA且以總組合物的0.02％-0.075％的范圍存在；(b)ZnS且以總組合物的約0.974％的量存在，或(c)ZnO且以總組合物約
0.0625％的量存在。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述納米顆粒大小的范圍為約2nm-4nm。
61.權(quán)利要求52或53的方法，其中在所述植物治療后一個月或更久，感染植物的數(shù)目存在至少30％的減少。
62.權(quán)利要求52或53的方法，其中所述植物是柑橘樹或幼苗。
63.一種方法，其用于治療柑橘樹或幼苗的任何黃龍病菌和保護柑橘樹和幼苗免受木虱的侵染，所述黃龍病菌能夠引起黃龍病，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種，所述木虱能夠傳播黃龍病的媒介物，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種，所述方法包括：
用包含2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述柑橘樹或幼苗的一個或多個部位，其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少10％的減少。
64.一種方法，其用于治療具有黃龍病菌的馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽，且用于保護馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽免受由昆蟲載體攜帶的黃龍病菌的侵染，所述方法包括：
用包含約2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽的一個或多個部位，
其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少10％的減少。
65.用于保護植物免受細菌攻擊或侵染的組合物，所述組合物包含：(a)至少一種芳族醛；和(b)至少一種極性質(zhì)子溶劑。
66.權(quán)利要求65的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛。
67.權(quán)利要求65的組合物，其中所述至少一種極性質(zhì)子溶劑包括短鏈醇。
68.權(quán)利要求67的組合物，其中所述短鏈醇是C1-C6醇。
69.權(quán)利要求65的組合物，其中所述至少一種極性質(zhì)子溶劑是乙醇。
70.權(quán)利要求65的組合物，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且所述至少一種極性質(zhì)子溶劑包括乙醇。
71.權(quán)利要求65的組合物，其中所述至少一種芳族醛是松柏醛。
72.保護植物免受細菌攻擊或侵染的方法，所述方法包括：用權(quán)利要求65的組合物接觸所述植物的一個或多個部位。
73.治療受細菌感染的植物的方法，其包括：用權(quán)利要求65的組合物接觸所述植物的一個或多個部位。
74.治療具有黃龍病的植物的方法，其包括：用權(quán)利要求65的組合物接觸所述植物的一個或多個部位。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述植物是柑橘樹。
76.用于治療受黃龍病(HLB)感染的植物的方法，其包括：用包含下述的組合物接觸所述植物的一個或多個部位：(a)至少一種芳族醛，和(b)至少一種極性質(zhì)子溶劑，其中所述至少一種芳族醛以總組合物的至多10％的量存在，且
其中所述至少一種極性質(zhì)子溶劑以總組合物的至少5％的量存在。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且所述至少一種極性質(zhì)子溶劑包括乙醇。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所示肉桂醛以不多于約1％的量存在且所述乙醇以總組合物的約70％的量存在。
79.權(quán)利要求77的方法，其中感染所述植物的黃龍病菌細胞滴定量存在至少70％的減少。
80.權(quán)利要求76的方法，其中所述植物是柑橘樹、幼苗或發(fā)芽種子。
81.權(quán)利要求76的方法，其中所述植物是表達引起對細菌外膜造成損傷的基因的轉(zhuǎn)基因植物，
其中相比于不表達所述基因的植物而言，所述損傷與所述方法的活性起協(xié)同作用。
82.一種方法，其用于治療具有柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種的柑橘樹、幼苗或發(fā)芽種子并保護柑橘樹和幼苗免受由攜帶柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種的木虱的侵染，所述方法包括：
用包含2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述柑橘樹、幼苗或發(fā)芽種子的一個或多個部位，
其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少10％的減少。
83.一種方法，其用于治療具有柑橘黃龍病茄科植物種(Ca.L.solanacearum)的馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽并保護馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽免受由攜帶柑橘黃龍病茄科植物種的昆蟲載體的侵染，所述方法包括：
用包含約2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽的一個或多個部位，
其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少10％的減少。
用納米顆粒和/或納米乳液配制的醛在增強植物對黃龍病菌
的疾病抗性中的用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求保護2014年3月21日提交的美國臨時申請61/968,498；2014年12月5日提交的美國臨時申請62/088,203；和2015年2月13日提交的美國臨時申請62/115893的優(yōu)先權(quán)；其全部內(nèi)容出于所有目的通過引用的方式全部并入本申請。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 黃龍病(Huanglongbing,HLB)，通常稱為柑橘“綠化”病，是在非洲、美洲和亞洲的三種最具傷害性的柑橘疾病之一。HLB通過木虱天然傳播，且通過嫁接或菟絲子(菟絲子屬，Cuscuta?spp.)實驗性傳播。疾病在1956年(Lin,1956)顯示為可嫁接傳播，且因此認為其通過推定的病毒引起。然而，在1970年，篩管限制性細菌在受影響的樹中發(fā)現(xiàn)。首先認為是類支原體(Laflèche?and?Bové,1970)，其很快被認為是革蘭氏陰性類型(Garnier等人，1984)的壁細菌(walled?bacteria)(Saglio等人，1971；Bové?and?Saglio,1974)且最終顯示為α-變形菌菌種(Jagoueix,等人，1994)。識別了兩個種：針對亞洲中的疾病的柑橘黃龍病亞洲種(Candidatus?Liberibacter?asiaticus,Las)和針對非洲中的疾病的柑橘黃龍病非洲種(Ca.L.africanus,Laf)。
[0005] 在2004年，當首次在美洲且更確切地在巴西圣保羅州發(fā)現(xiàn)HLB時，鑒定了兩種黃龍病菌種：(i)新種，即柑橘黃龍病美洲種(Ca.L.americanus,Lam)，其感染大部分受影響的樹，和(ii)已知的亞洲黃龍病菌，即Las，其存在于少數(shù)樹中(Teixeira等人，2005)。全部三種柑橘黃龍病菌是未培養(yǎng)的且韌皮部限制的。也就是說，這些細菌僅在存活植物韌皮部細胞中生存。Las目前分布最廣泛。當今，由Las引起的HLB已在佛羅里達州、路易斯安那州和加州中鑒定。
[0006] 由于在市場上無有效的治療選擇，因此對于抵抗其傳播的新的技術(shù)存在越來越大的需求。
發(fā)明內(nèi)容
[0007] 本申請教導了組合物，其用于保護植物免受細胞內(nèi)細菌攻擊和感染且具體地用于治療已受系統(tǒng)性黃龍病菌種感染的植物，所述組合物包含至少一種芳族醛類物質(zhì)且任選地，具有足以誘發(fā)植物防御響應的濃度。該公開還教導了至少一種極性溶劑和/或分層滲透劑(laminar?penetrant)和/或納米乳液和/或納米顆粒制劑在用于遞送醛且使其滲透至植物細胞中的用途。該公開還教導了植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)誘導劑與至少一種芳族醛的組合在增加植物防御響應中的用途。
[0008] 本申請教導了用于治療植物和農(nóng)作物包括樹且保護其免受細胞內(nèi)細菌疾病的組合物和方法，所述疾病包括由黃龍病菌屬的細菌種引起的疾病，所述組合物包含至少一種芳族醛類物質(zhì)。
[0009] 在一些實施方案中，所述組合物的應用或注射導致感染植物的細菌數(shù)目的減少，即滴定量(titer)減少。在其他實施方案中，組合物的應用和注射導致感染植物的細菌數(shù)、疾病發(fā)生率或疾病癥狀發(fā)生率的減少。在其他實施方案中，相比未治療的感染植物而言，細菌和細菌滴定量的減少是統(tǒng)計學顯著的。
[0010] 在一些實施方案中，組合物的應用或注射還導致農(nóng)作物或果實產(chǎn)量的增加。
[0011] 在一些實施方案中，植物的治療和保護相對未使用所述組合物治療的感染的對照植物進行測量。在其他實施方案中，感染植物的細菌、疾病的發(fā)生率或疾病癥狀的發(fā)生率的減少相對未使用所述組合物治療的感染的對照植物進行測量。
[0012] 在一些實施方案中，相比未治療的感染植物而言，組合物的應用或注射導致細菌從植物的部分清除。在進一步的實施方案中，部分清除可以是感染植物的細菌細胞包括黃龍病菌的滴定量的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98或99％。
[0013] 在一些實施方案中，本發(fā)明的芳族醛類物質(zhì)選自肉桂醛、松柏醛、香芹酚和香葉醇。在一個實施方案中，組合物包含肉桂醛作為芳族醛。
[0014] 在一些實施方案中，組合物包含短鏈(C1-C6)醇或二甲基亞砜(DMSO)溶劑用于醛、納米乳液制劑或納米顆粒制劑的應用和細胞滲透遞送。
[0015] 在一些實施方案中，納米乳液和納米顆粒由維生素E、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸、卵磷脂、油酸、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)、ZnS、ZnO和/或聚乙二醇或聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)制成。
[0016] 在本申請教導的一些實施方案中，極性溶劑是選自以下的至少一種：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、DMSO和水。在一些實施方案中，極性溶劑是乙醇。在其他實施方案中，極性溶劑是DMSO。本申請利用極性溶劑和質(zhì)子溶劑作為同義詞。
[0017] 在本申請教導的一些實施方案中，組合物包含納米乳液或納米級乳液，其使用維生素E、TPGS、十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸、卵磷脂、油酸和/或吐溫20形成。在一些實施方案中，納米乳液使用DMSO由TPGS形成。在一些實施方案中，納米乳液使用乙酸乙酯由TPGS形成。
[0018] 在本申請教導的一些實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒物質(zhì)選自氧化鋅、硫化鋅、聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，納米顆粒由PLGA形成。在其他實施方案中，納米顆粒由硫化鋅形成。
[0020] 在本申請教導的一些實施方案中，SAR誘導劑選自新煙堿類殺蟲劑，包括吡蟲啉(imidacloprid)和噻蟲胺(clothianidin)。在另一實施方案中，SAR誘導劑是水楊酸(SA)。
[0021] 在本發(fā)明的一些實施方案中，用于治療和/或控制植物中的細胞內(nèi)細菌的方法包括使用包含至少一種芳族醛的組合物注入植物。
[0023] 在另一實施方案中，注入植物的方法通過滴袋進行。
[0024] 在本發(fā)明的一些實施方案中，用于治療和/或控制植物中的細胞內(nèi)細菌的方法包括葉面噴施包含至少一種芳族醛的組合物。
[0025] 在一些實施方案中，感染植物的細胞內(nèi)細菌是韌皮部限制的。
[0026] 在一些實施方案中，感染植物的細胞內(nèi)細菌是黃龍病菌。
[0027] 在一些實施方案中，在方法中利用的組合物包含肉桂醛作為芳族醛。
[0028] 在另一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的方法中利用的組合物包含DMSO、異丙醇或乙醇作為針對芳族醛的極性溶劑。
[0029] 在一個實施方案中，保護植物免受細菌攻擊或感染的方法包括以所述組合物接觸或注入植物的一個或多個部位。在進一步的實施方案中，所述方法包括以所述組合物接觸或注入植物的一個或多個部位。
[0030] 在一個實施方案中，治療受細菌感染的植物的方法，本申請的方法包括以所述組合物接觸或注入植物的一個或多個部位。
[0031] 在一個實施方案中，治療受黃龍病菌感染的植物的方法包括以組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位，所述組合物包含至少一種芳族醛；和至少一種滲透極性溶劑，或包含含有芳族醛的納米級乳液和/或納米顆粒的制劑，其中所述至少一種芳族醛以應用至植物的總組合物的至多10％的量存在，且其中所述至少一種極性溶劑以總組合物的至少5％的量存在。
[0032] 在一個實施方案中，用于治療受黃龍病菌感染的植物的方法包括以組合物接觸或注入所述植物的一個或多個部位，所述組合物包含至少一種摻入納米顆?；蛴米骷{米顆粒的封蓋劑(capping?agent)的芳族醛；和至少一種極性溶劑或包含含有芳族醛的納米級乳液和/或納米顆粒的制劑。在進一步的實施方案中，芳族醛包括摻入納米乳液的芳族醛。在進一步的實施方案中，至少一種芳族醛包括肉桂醛，且至少一種極性溶劑包括DMSO、異丙醇和水，且乳化劑包括維生素E、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、十二烷酸、硬脂酸鋅、甘油二肉豆蔻酸酯、卵磷脂、油酸和/或聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)。
[0033] 在一個實施方案中，相對于未用組合物接觸或注射的植物而言，使用所述組合物治療植物導致受黃龍病菌感染的植物呈現(xiàn)細菌的減少和果實產(chǎn)量的增加。
[0034] 在一個實施方案中，應用至植物的組合物包含納米顆粒如PLGA且以總組合物約0.02％至約0.075％的范圍存在；ZnS且以總組合物約0.974％的量存在；或ZnO且以總組合物約0.0625％的量存在。在進一步的實施方案中，納米顆粒大小的范圍為約2nm-約100nm。
[0035] 在一個實施方案中，在治療植物后1個月或更久，以所述組合物治療植物的方法導致感染植物中細菌感染或細菌滴定量的水平減少至少5％。在進一步的實施方案中，植物是柑橘樹或幼苗。
[0036] 在一個實施方案中，用于治療柑橘樹或幼苗的任何黃龍病菌并保護柑橘樹和幼苗免受木虱的侵染的方法包括以含有約2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸所述柑橘樹或幼苗的一個或多個部位，所述黃龍病菌能夠引起黃龍病，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種(Ca.L.asiaticus)、柑橘黃龍病非洲種(Ca.L.africanus)或柑橘黃龍病美洲種(Ca.L.americanus)，所述木虱能夠傳播黃龍病的媒介物(agent)，其包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種、柑橘黃龍病非洲種或柑橘黃龍病美洲種，其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少約5％的減少。
[0037] 在一個實施方案中，用于治療馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽的黃龍病菌且用于保護馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽免受由昆蟲載體攜帶的黃龍病菌的侵染的方法包括以含有約2.5-100g/l的量的肉桂醛的制劑接觸馬鈴薯、番茄、芹菜或胡蘿卜植物、幼苗或芽的一個或多個部位，其中所述量足以提供黃龍病菌細胞滴定量的至少約5％的減少。
[0038] 在一些實施方案中，組合物可包含(a)至少一種芳族醛；和(b)至少一種極性溶劑，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛且至少一種極性溶劑包括DMSO。在進一步的實施方案中，組合物可包含(a)至少一種芳族醛和(b)至少一種用于形成納米乳液的乳化劑，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛，所述納米乳液的大小小于約200nm且至少一種乳化劑包括維生素E、TPGS、十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸、卵磷脂或吐溫20。
[0039] 在一些實施方案中，所述組合物包含(a)摻入納米顆?；蛴米骷{米顆粒的封蓋劑的至少一種芳族醛；和(b)至少一種極性溶劑，其中所述至少一種芳族醛包括肉桂醛，所述納米顆粒的大小小于約200nm且至少一種極性溶劑包括DMSO。在一些實施方案中，納米顆粒選自氧化鋅、硫化鋅、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)或(PLGA)聚合物。
[0040] 在一些實施方案中，本申請教導的方法包括以肉桂醛注射或噴施具有疾病的植物或?qū)Σ≡w攻擊易感的植物的一個或多個部位或組織，無論所述肉桂醛是否摻入納米顆?；蚣{米乳液，且滲透溶劑的量足以控制靶病原生物體的生長。
[0041] 在一些實施方案中，本申請教導的組合物為抵抗引起黃龍病(HLB)的黃龍病菌(包括但不限于柑橘黃龍病亞洲種)感染的有效抗菌治療劑。
[0042] 在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含摻入納米顆?；蚣{米乳液的芳族醛在大于5％的DMSO、乙醇或異丙醇中的溶液。
[0043] 在其他實施方案中，本發(fā)明的組合物包含芳族醛在水中的溶液，其摻入或未摻入大小小于200nm的納米乳液或納米顆粒中。
[0044] 在其他實施方案中，本發(fā)明的組合物包含芳族醛在大于10％的DMSO中的溶液，其摻入或未摻入大小小于200nm的納米乳液或納米顆粒中。
[0045] 在一些實施方案中，組合物涉及摻入或未摻入納米乳液或納米顆粒的芳族醛在水中的可注射溶液。
[0046] 在一些實施方案中，組合物涉及摻入或未摻入納米乳液或納米顆粒的芳族醛在大于5％的乙醇中的可注射溶液。
[0047] 在一些實施方案中，組合物涉及摻入或未摻入納米乳液或納米顆粒的芳族醛在0％到至多100％的DMSO中的可注射溶液。
[0048] 在另一實施方案中，本發(fā)明涉及摻入或未摻入納米乳液或納米顆粒的芳族醛在任何適當?shù)臉O性溶劑或溶劑組合中的溶液。
[0049] 在一個實施方案中，所教導的組合物是包含摻入納米顆粒中的約1.5％的肉桂醛在約70％的異丙醇或乙醇中的溶液。
[0050] 在一個實施方案中，所教導的組合物是包含摻入納米乳液中的至少約1.5％肉桂醛在水中的溶液。
[0051] 在進一步的實施方案中，所教導的組合物是包含摻入納米乳液中的少于或等于約9％的肉桂醛在水中的溶液。
[0052] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％的肉桂醛在約50％的DMSO中的溶液。
[0053] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％的肉桂醛在約100％的DMSO中的溶液。
[0054] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％至約3％的肉桂醛在使用TPGS形成的乳液中的溶液。
[0055] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％至約3％的肉桂醛在硫化鋅納米顆粒溶液中的溶液。
[0056] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％的肉桂醛在PLGA納米顆粒溶液中的溶液。
[0057] 在另一實施方案中，所教導的組合物是包含約1.5％的肉桂醛在氧化鋅納米顆粒溶液中的溶液。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的肉桂醛、摻入納米顆粒的肉桂醛和植物細胞滲透溶劑如DMSO或乙醇的組合物提供增強的肉桂醛滲透，且與植物的天然防御系統(tǒng)組合，或與額外的協(xié)同元素組合(植物的化學或遺傳增強防御系統(tǒng))，提供了由黃龍病菌和在活的植物細胞內(nèi)生存的可能的其他細菌引起的疾病的治療。附圖說明
[0059] 圖1.針對移植至Swingle?citrumello砧木上的Hamlin柑橘樹的Las的標準化百分比感染率，如在約7個月的時間段所測量。結(jié)果以％Las感染表示(陽性葉樣品的總數(shù)(如實施例5中所述通過qPCR評估)除以在給定的采樣日期每個處理采集的葉樣品總數(shù))。在6-7個月的時間每月采樣。圖1中的每個條形代表針對10棵樹的每次處理的平均％Las感染，且針對每兩個月的時間合并數(shù)據(jù)。"第0月"的樣品是任何處理前每個處理中所采集的全部樹的平均值。給出的數(shù)據(jù)是標準化的，進而預處理感染為100％。非重疊標準誤在P<0.05是顯著的。對照組包含以50％DMSO噴施的5棵樹和以50％DMSO注射的5棵樹。實驗處理如下：處理1：使用40ml/樹的在50％DMSO中的1.5％(w/v)肉桂醛進行樹干注射，隨后在第4個月再次施用；處理2：使用800ml/樹的在50％DMSO中的1.5％肉桂醛進行葉面噴施，隨后在第4個月再次施用；處理3：使用異丙醇將2.5g濕重的ZnO納米顆粒稀釋至4L(0.0625％ZnO)并以800ml/樹噴施；處理4：在250ml異丙醇中的5％肉桂醛裝載至2.5g濕重的ZnO納米顆粒上并使用在
70％異丙醇中的1.5％肉桂醛稀釋至4L(0.0625％ZnO)，并以800ml/樹噴施；處理5：使用
70％異丙醇將2.5g濕重的ZnO納米顆粒稀釋至750ml(0.33％ZnO)并以40ml/樹注射；處理6：
將250ml?70％異丙醇中的5％肉桂醛裝載至2.5g濕重的ZnO納米顆粒上并使用在70％異丙醇中的1.5％肉桂醛稀釋至750ml(0.33％ZnO)且以40ml/樹注射；處理7：將如實施例10所述的PLGA納米顆粒+肉桂醛以800ml/樹噴施；處理8:將如實施例10所述的PLGA納米顆粒+肉桂醛以40ml/樹注射；處理9:將如實施例10所述的在稀釋劑中缺乏肉桂醛的PLGA納米顆粒以
40ml/樹注射；處理10:將如實施例11所述的PLGA+肉桂醛以40ml/樹注射；處理11:將如實施例11所述的處理10的溶液的1:1稀釋液以40ml/樹注射；處理12:將如實施例11所述的使用
50％DMSO+1.5％肉桂醛作為稀釋劑以1:5.3稀釋的PLGA納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品以800ml/樹噴施；處理13:將如實施例11所述的使用水作為稀釋劑的PLGA納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品的1:
5.3稀釋液以800ml/樹噴施；處理14:將如實施例12中所述的ZnS納米顆粒+3％肉桂醛產(chǎn)品和50％DMSO以40ml/樹注射；處理15:將如實施例12所述的使用25％DMSO稀釋的處理14的注射液的溶液以800ml/樹噴施；處理16:將如實施例13所述的ZnS納米顆粒+肉桂醛和PEG產(chǎn)品及25％DMSO以40ml/樹注射；處理17:將如實施例13所述的在25％DMSO中的處理16的注射液的稀釋溶液以800ml/樹噴施；處理18:注射1.85％SA在水中的40ml溶液；處理19:將水中的
3.7％SA以2L/樹噴施；處理20:將如實施例14中的封蓋的ZnS納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品+1.85％SA及25％DMSO以40ml/樹注射；處理21:將如實施例14所述的使用10％DMSO和3.7％SA進行
1:40稀釋的處理20的注射液的溶液以2L/樹噴施。
70％異丙醇中的1.5％肉桂醛稀釋至4L(0.0625％ZnO)，并以800ml/樹噴施；處理5：使用
70％異丙醇將2.5g濕重的ZnO納米顆粒稀釋至750ml(0.33％ZnO)并以40ml/樹注射；處理6：
將250ml?70％異丙醇中的5％肉桂醛裝載至2.5g濕重的ZnO納米顆粒上并使用在70％異丙醇中的1.5％肉桂醛稀釋至750ml(0.33％ZnO)且以40ml/樹注射；處理7：將如實施例10所述的PLGA納米顆粒+肉桂醛以800ml/樹噴施；處理8:將如實施例10所述的PLGA納米顆粒+肉桂醛以40ml/樹注射；處理9:將如實施例10所述的在稀釋劑中缺乏肉桂醛的PLGA納米顆粒以
40ml/樹注射；處理10:將如實施例11所述的PLGA+肉桂醛以40ml/樹注射；處理11:將如實施例11所述的處理10的溶液的1:1稀釋液以40ml/樹注射；處理12:將如實施例11所述的使用
50％DMSO+1.5％肉桂醛作為稀釋劑以1:5.3稀釋的PLGA納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品以800ml/樹噴施；處理13:將如實施例11所述的使用水作為稀釋劑的PLGA納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品的1:
5.3稀釋液以800ml/樹噴施；處理14:將如實施例12中所述的ZnS納米顆粒+3％肉桂醛產(chǎn)品和50％DMSO以40ml/樹注射；處理15:將如實施例12所述的使用25％DMSO稀釋的處理14的注射液的溶液以800ml/樹噴施；處理16:將如實施例13所述的ZnS納米顆粒+肉桂醛和PEG產(chǎn)品及25％DMSO以40ml/樹注射；處理17:將如實施例13所述的在25％DMSO中的處理16的注射液的稀釋溶液以800ml/樹噴施；處理18:注射1.85％SA在水中的40ml溶液；處理19:將水中的
3.7％SA以2L/樹噴施；處理20:將如實施例14中的封蓋的ZnS納米顆粒+肉桂醛產(chǎn)品+1.85％SA及25％DMSO以40ml/樹注射；處理21:將如實施例14所述的使用10％DMSO和3.7％SA進行
1:40稀釋的處理20的注射液的溶液以2L/樹噴施。
[0060] 圖2.Hamlin柑橘果實產(chǎn)量，通過每棵樹收獲的果樹的磅數(shù)測量，表示為測量的總果實重量/樹。對照和實驗組如上文圖1所述。非重疊標準誤在P<0.05是顯著的。
[0062] 圖4.在肉桂醛和DMSO存在下生成的ZnS納米顆粒的透射電子顯微鏡照片(TEM)。肉桂醛封蓋的ZnS納米顆粒估計大小的范圍為2-4nm，如顯微鏡照片所示。
具體實施方式
[0063] 柑橘綠化(citrus?greening)
[0064] 黃龍病(HLB)，通常稱為柑橘“綠化”疾病，其由樹和其他農(nóng)作物品種的部分系統(tǒng)性細菌感染引起，導致葉的變色和果實生產(chǎn)減少。在佛羅里達，侵襲性的HLB疾病的傳播是對柑橘產(chǎn)業(yè)的主要威脅，由于該傳染造成的損失每年達數(shù)百萬美元。由于昆蟲載體已到達德克薩斯和加利福尼亞，在這些州該疾病的爆發(fā)早晚將會發(fā)生。
[0065] HLB已與三種黃龍病菌菌種的感染相關：針對亞洲疾病的柑橘黃龍病亞洲種(Las)，針對非洲疾病的柑橘黃龍病非洲種(Laf)，和針對美洲疾病的柑橘黃龍病美洲種(Lam)。
[0066] 全部的三種柑橘黃龍病菌為未培養(yǎng)的和韌皮部限制的。也就是說，在植物中這些細菌完全在活的植物韌皮部細胞中生存。Las目前是最廣泛分布的。在整個亞洲，從印度次大陸到巴布亞新幾內(nèi)亞，HLB僅通過Las引起且通過亞洲柑橘木虱，即亞洲柑桔木虱(Diaphorina?citri)傳播。2004年以前，報導Las僅在亞洲存在；現(xiàn)報導其在北美、中美和南美也存在。在非洲和馬達加斯加，HLB由Laf引起并通過非洲柑橘木虱，即非洲木虱(Trioza?erytreae)傳播?！胺侵蕖奔膊“l(fā)生在寒冷地區(qū)，經(jīng)常在600m海拔以上，溫度30℃以下。Laf和非洲木虱都原生于非洲(Hollis,1984；Beattie等人，2008；Bové,2013)且都是熱敏感的(Moran?and?Blowers,1967；Catling,1969；Schwarz?and?Green,1972；Bové等人，1974)。在巴西，Las和Lam都由亞洲柑橘木虱傳播。Lam比Las的熱耐受顯著更低(Lopes等人，2009b)。
[0067] 除三種與HLB相關的柑橘黃龍病菌，還描述了三種非柑橘的黃龍病菌品種。柑橘黃龍病茄科植物種(Ca.L.solanacearum,Lso)已鑒別為美國、墨西哥、危地馬拉、洪都拉斯和新西蘭的馬鈴薯(“Zebra?chip”)、番茄(“psyllid?yellows”)和其他茄科作物的嚴重疾病致病因子(Hansen?et?al.,2008；Abad?et?al.,2009；Liefting?et?al.,2009；Secor?et?al.,2009)。在茄科作物中，Lso通過番茄/馬鈴薯木虱(Bactericera?cockerelli)攜載。最近，Lso的不同單倍型發(fā)現(xiàn)感染瑞典、挪威、芬蘭、西班牙和加那利群島的胡蘿卜(Alfaro-Fernandez等人，2012a,2012b?Munyaneza等人，2012a,2012b；Nelson等人，2011)。Lso的胡蘿卜單倍型通過胡蘿卜木虱(Trioza?apicalis)傳播，其并不在茄科植物上喂養(yǎng)。第五種黃龍病菌Ca.L.europaeus(Leu)最近發(fā)現(xiàn)于梨衰退植原體(pear?decline?phytoplasma)的載體木虱，即梨木虱(Cacopsylla?pyri)。使用梨木虱作為載體，Leu被傳播至梨樹，其中黃龍病菌達到高滴定量但不誘導癥狀，因此作為內(nèi)生菌而非病原體發(fā)揮作用(Raddadi等人，2011)。最后，第六種黃龍病菌Liberibacter?crescens(Lcr)最近在從患病的山番木瓜(Babaco)分離后進行了表征。除Lcr已知為非病原體外，全部的其他所述黃龍病菌均為病原體且必須通過特定的昆蟲注入活的植物細胞內(nèi)。此外，病原性黃龍病菌僅可在特定的昆蟲和植物細胞內(nèi)生存；作為專性寄生蟲，其并不具有游離的存活狀態(tài)。
[0068] 至今，Lcr是僅有的在無菌培養(yǎng)中生長的黃龍病菌(Leonard等人，2012)，且因此可作為用于抗微生物化學品的體外測試的代表發(fā)揮作用。至今未報導Lcr在任何植物中成功地再接種和生長。在植物中，黃龍病菌完全在活的韌皮部細胞中生存。其在植物中稱為部分系統(tǒng)性，通過韌皮部從注射位點移動至根并移動至新形成的葉和莖組織。將這些細菌暴露至可對其進行控制的化學品需要所述化學品首先滲透多植物或昆蟲細胞層，隨后以系統(tǒng)或半系統(tǒng)的方式移動。
[0069] 疾病適應可幫助柑橘綠化細菌避免觸發(fā)植物先天免疫系統(tǒng)
[0070] 盡管事實是Las和Lam具有完整的外膜且想必Lso也是如此(Wulffe等人，2014)，但大多在Las和Lso中發(fā)現(xiàn)的脂多糖(LPS)生物合成所需的基因從Lam中失去，包括lpxA、lpxB和lpxC，其參與脂質(zhì)A生物合成的第一步驟。革蘭氏陰性菌種中LPS的缺失非常罕見，但通過LPS發(fā)揮作用的屏障功能對病原體黃龍病菌而言可能并不需要。如果LPS在一種黃龍病菌中無需作為屏障功能，隨后其在其他中可能也不會作為屏障發(fā)揮良好的功能，這對于不大可能針對具有常規(guī)LPS屏障的細菌發(fā)揮作用的異?；瘜W控制測量而言提供了機會。一些有前景的化學品目前處于農(nóng)田試驗中。注入樹的廣譜抗生素獲得某種程度的成功，包括青霉素G(Aubert?and?Bove,1980；Zhang,Duan等人，2010；Zhang,Powell等人，2011)。
[0071] 事實上，通常由LPS提供的屏障功能可能至少部分由外膜中其他種類的脂質(zhì)的生成補償。例如，齒垢密螺旋體(Treponema?denticola)顯示失去LPS但取而代之具有脂磷壁酸質(zhì)(lipoteichoic?acid)樣膜脂質(zhì)、核心結(jié)構(gòu)和作為替代滲透屏障發(fā)揮功能的重復單位(Schultz等人，1998)。相似地，少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas?paucimobilis)(Kawahara等人，1991)和莢膜(S.capsulate)(Kawahara等人，2000)沒有LPS，但具有包含(S)-2-羥基肉豆蔻酸作為替代糖鞘脂。此外，纖維堆囊菌(Sorangium?cellulosum)產(chǎn)生鞘脂作為外膜中的主要脂質(zhì)種類，連同含鳥氨酸的脂質(zhì)和醚脂質(zhì)(Keck等人，2011)。
[0072] Lam?LPS的喪失表明通過LPS喪失導致的不同的選擇優(yōu)勢，這是植物天然免疫或天然防御響應的主要誘因。LPS是數(shù)種經(jīng)典的“病原相關分子模式”或PAMP之一，其一般是由特定的植物受體識別的微生物來源的保守分子，經(jīng)常以協(xié)同的方式激發(fā)早期和晚期的防御響應，包括氧化爆發(fā)、水楊酸(SA)積累和胼胝質(zhì)沉積(Zipfel&Robatzek,2010)。重要的是，缺陷的LPS仍能夠誘導PAMP激發(fā)的免疫(Deng等人，2010)。
[0073] 植物病原微生物必須避免PAMP識別或主動抑制由該識別導致的植物防御響應(Hann等人，2010)。明顯的是，LPS屏障功能中的缺陷相比大多植物病原微生物而言將賦予Lam對天然植物免疫多得多的敏感性，但能夠具有PAMP活性的全部LPS組分的喪失首先應導致減少的響應。
[0074] 除喪失幾乎全部的LPS編碼基因外，Lam還喪失關鍵外膜蛋白和已知的PMAP激發(fā)子OmpA，其有助于穩(wěn)定革蘭氏陰性細菌的外膜，提供其結(jié)構(gòu)形狀并將其錨定至肽聚糖層(Smith等人，2007)。OmpA是腸桿菌中最豐富的外膜蛋白(Bosshart等人，2012)；其在大腸桿菌中以100,000拷貝細胞-1存在(Koebnik等人，2000)。在大腸桿菌中，認為OmpA是弱孔蛋白，其參與非特異性小溶質(zhì)貫穿外膜的擴散(Sugawara?and?Nikaido?1992)。OmpA是主要的PAMP(Jeannin等人，2002)。
[0075] 針對小數(shù)目(10-15％)的細菌包括根瘤菌(Rhizobium)和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)(Geiger等人，2013)而言獨特的磷脂酰膽堿(PC)合酶途徑(de?Rudder等人，1999)在全部測序的黃龍病菌中發(fā)現(xiàn)(Lam_551；CLIBASIA_03680；CKC_04930；B488_05590)，且可允許PC從在植物或昆蟲宿主中存在的大量膽堿進行生物合成。在合成PC的那些細菌中，PC強烈影響細菌膜的理化特性(Geiger等人，2013)。缺少PC的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)突變體在毒力上被顯著破壞且對去污劑高度敏感(Wessel等人，2006)。最后，嗜熱棲熱菌(Thermus?thermophilus)不具有LPS但具有極性糖脂且在外膜中檢測到磷酸糖脂(Leone等人，2006)。
[0076] 盡管在Las中報導了幾乎全部的鞭毛生物合成基因集合，一些鞭毛生物合成基因作為假基因報導(Duan等人，2009)。然而，在任何文獻中未報導發(fā)現(xiàn)Las或Lam鞭毛，盡管具有這些細菌感染植物和木虱的許多電子顯微照片(例如，Bove,2006)。鞭毛的缺少表明不能產(chǎn)生或活化鞭毛蛋白表達，導致該PAMP活性的喪失。由于依賴宿主防御的活化和細胞死亡響應的避免的細胞內(nèi)存活方式，Las和Lam都已清楚地演變?yōu)楸苊釶AMP的策略。激發(fā)植物防御響應的任何化學品如水楊酸(SA)(Pieterse等人，1996)或新煙堿類殺蟲劑(Ford等人，2010)將發(fā)揮黃龍病菌外膜屏障的功能，其可能作為抵抗這些植物防御的非常敏感的最后防線。
[0077] 黃龍病菌傳播主要通過木虱載體控制且不易經(jīng)其控制，其首要通過使用新煙堿類殺蟲劑。目前針對植物中的系統(tǒng)性黃龍病菌病原體的有效控制測量尚不知曉，且治療感染植物的方法尚不知曉。由于HLB疾病引起這種嚴重的柑橘果實喪失和最終柑橘樹的死亡，且由于樹林中的柑橘樹可持續(xù)15-25年，這些樹代表了相當可觀的投資。對于疾病的治療迫在眉睫。
[0078] 治療柑橘綠化(黃龍病或HLB)
[0079] 本發(fā)明部分基于芳族醛的發(fā)現(xiàn)，當與溶劑滲透劑如DMSO組合或配制成為納米顆粒(NP)或NP乳液(此后稱為NP)，且與溶劑滲透劑(如乙醇或DMSO)或表面活性劑滲透劑(如TPGS、十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸或吐溫20或無)組合時，可提供能夠治療由黃龍病菌感染引起的HLB的有益的植物毒性組合物。盡管發(fā)明人不希望受任何一種功能的理論束縛，其假設低水平的醛經(jīng)DMSO和/或表面活性劑和/或憑借小尺寸的NP遞送媒介物而滲透通過植物細胞，且緩慢釋放的特征引起黃龍病菌外膜屏障功能的不足。因此，發(fā)明人假設當與通過應用本發(fā)明的組合物引起的非致死性細胞毒性應激響應組合時，在植物中引起有益的系統(tǒng)性清除作用。
[0081] 肉桂醛是有機芳族醛化合物，最知名的是其給予肉桂風味和氣味。淡黃色粘稠液體天然存在于肉桂樹的樹皮和其他樟屬(Cinnamomum)的種中。據(jù)報導產(chǎn)生精油如肉桂醛的植物在質(zhì)體中合成化合物，其中其被釋放入細胞質(zhì)并通過周圍的質(zhì)膜(細胞膜)分泌且至少部分運輸至發(fā)育木質(zhì)化和蜂窩(增厚)細胞壁的特定細胞，成為代謝失活的，并使這些經(jīng)常為毒性的組分與代謝活躍的細胞區(qū)分(Geng等人，2012和其中的參考文獻)。肉桂醛可占一些植物品種的精油的60％-90％，該量對生產(chǎn)植物周圍的代謝活躍細胞具有毒性(Geng等人，2012)。當用作草本植物的殺蟲劑時，已知肉桂醛是植物毒性的(Cloyd&Cycholl,2002)。
[0082] 肉桂醛的高揮發(fā)性和植物毒性使得將其推薦作為首選殺菌劑(Pscheidt?and?Ocamb,2014)。由于其殺菌劑特性，當與其他防腐劑化合物組合時，還發(fā)現(xiàn)肉桂醛在表面接觸害蟲控制的農(nóng)業(yè)環(huán)境中的有限用途。之前在農(nóng)業(yè)應用中使用的一種植物精油而現(xiàn)在不再持續(xù)使用的是ProGuard?RTM?30％肉桂醛可流動性殺蟲劑、殺螨劑和殺真菌劑(美國專利號6,750,256B1和6,251,951B1)，其包含化學防腐劑鄰苯基苯酚。美國專利號4,978,686公開了需要抗氧化劑與肉桂醛用于在農(nóng)作物施用中使用的組合物。在美國專利號4,978,686中公開了使用包含肉桂醛且還需要抗氧化劑的組合物保護農(nóng)作物免受害蟲包括昆蟲攻擊的方法。通過應用包含肉桂醛的水性組合物而抵抗昆蟲害蟲保護農(nóng)作物公開于法國專利申請
2529755中。美國專利號2,465,854描述了包含肉桂醛衍生物的殺蟲組合物。
2529755中。美國專利號2,465,854描述了包含肉桂醛衍生物的殺蟲組合物。
[0083] 然而，在所有這些情況中，作為噴施或作為土壤灌溉應用至植物表面時，肉桂醛僅作為接觸殺蟲劑、殺線蟲劑、殺螨劑或殺真菌劑有效，但不具有超過消毒劑的確立值的值。將洗滌劑或乳化劑用于配制濃縮的產(chǎn)品。未考慮或建議含有肉桂醛的納米顆?；蚣{米乳液制劑。由于與這些病原體接觸將不大可能發(fā)生，且此外，將預期植物毒性或昆蟲毒性，因此還未考慮或建議的是應用肉桂醛控制植物的細菌感染，特別是控制植物或昆蟲的內(nèi)部細菌感染，更特別地未考慮或建議的是細胞內(nèi)控制移植植物或昆蟲的細菌。
[0084] 在一些實施方案中，本發(fā)明的肉桂醛可通過多種本領域的技術(shù)人員已知的合成方法制備。例如，參見J.March,ed.,Appendix?B,Advanced?Organic?Chemistry:Reactions,Mechanisms,and?Structure,2nd?Ed.,McGraw-Hill,New?York,1977。肉桂醛可合成制備，例如，通過肉桂醇的氧化(Traynelis等人，J.Am.Chem.Soc.(1964)86:298)或通過苯乙烯與甲酰甲基苯胺的縮合(Brit.patent?504,125)。肉桂醛還可通過從本領域的技術(shù)人員已知的天然來源分離來獲得。肉桂醛來源的非限制性實例包括木材腐朽真菌(woodrotting?fungi)密絨韌革菌(Stereum?subpileatum)或其他來源的樟屬品種(Birkinshaw等人，1957.Biochem.J.66:188)。具體而言，肉桂醛是肉桂油的主要成分，其包含85％的精油且油中肉桂醛的純度很高(>95％)(Ooi等人，2006)。基于21CFR(聯(lián)邦法規(guī))部分172.515(CFR?
2009)，肉桂皮提取物已批準為GRAS(一般認可的安全性)材料以用于食品用途。肉桂皮提取物包含多種活性化合物，包括肉桂醛，其抑制微生物(Burt?2004)。
2009)，肉桂皮提取物已批準為GRAS(一般認可的安全性)材料以用于食品用途。肉桂皮提取物包含多種活性化合物，包括肉桂醛，其抑制微生物(Burt?2004)。
[0085] 還發(fā)現(xiàn)多種芳香族和脂肪族醛可在本發(fā)明中使用，如苯甲醛、乙醛、胡椒醛和香草醛，其全部認可為安全的(GRAS)合成調(diào)味劑(21CFR?172.515)。在一些實施方案中，發(fā)現(xiàn)松柏醛也可用于本發(fā)明。
[0086] 細胞滲透劑
[0087] 本發(fā)明提供基本上無系統(tǒng)性細菌植物病原體的植物、種子、幼苗和植物部分諸如果實，特別是之前感染有黃龍病菌屬的系統(tǒng)性細菌病原體的那些植物、種子、幼苗和植物部分。在一些實施方案中，本發(fā)明還提供使用至少一種芳族醛和極性溶劑和/或植物細胞滲透劑用于控制植物進一步的系統(tǒng)性細菌病原體感染的方法。
[0088] 在一些實施方案中，至少一種芳族醛與細胞滲透劑如納米乳液和/或納米顆粒組合。在一些實施方案中，至少一種芳族醛與細胞滲透劑如十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸或TPGS組合。
[0089] 在其他實施方案中，至少一種芳族醛與DMSO細胞滲透劑組合。盡管DMSO已證明作為細胞滲透劑有效，其植物毒性總被認為是不良屬性，限制其在農(nóng)業(yè)環(huán)境中的實踐應用。
[0090] 本發(fā)明公開了以下驚人發(fā)現(xiàn)，即如果在劑量上適當校準，在滲透溶劑如DMSO中或形成納米乳液或納米顆粒的芳族醛如肉桂醛的植物毒性可用于增強植物針對一些系統(tǒng)性感染植物的細菌病原體的天然抗性，這是之前并不知曉的這些化合物的特性。此外，本發(fā)明公開了醛與DMSO的組合或使用以可辨別的植物毒性水平應用的特定乳化劑所形成的納米乳液或納米顆粒的協(xié)同抗菌作用。
[0091] 在一些實施方案中，細胞滲透劑以按重量或按體積計為如下的濃度或約為如下的濃度使用：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、20％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、
20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％和99％；其中“為”或“約為”的修飾語適于上述每個百分比。
20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％和99％；其中“為”或“約為”的修飾語適于上述每個百分比。
[0092] 在一些實施方案中，細胞滲透劑包含為或約為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、20％、11％、12％、
13％、14％、15％、16％、17％、18％19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、
28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、
43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、
58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最終溶液，其中“為”或“約為”的修飾語適用于上述每個百分比。
13％、14％、15％、16％、17％、18％19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、
28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、
43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、
58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最終溶液，其中“為”或“約為”的修飾語適用于上述每個百分比。
[0093] 納米乳液
[0094] 乳液指在標準條件下通常不混溶(不能混合或不能共混)的兩種或多種液體的混合物。乳液的實例包括香醋、牛奶和蛋黃醬。
[0095] 納米乳液與乳液區(qū)別在于液滴大小通常等于或小于250nm。納米乳液不自發(fā)形成；必須應用外切以將較大液滴破裂成較小液滴，且有關生成和控制納米乳液形成相對已知較少(Mason等人)。一般而言，已接受的是載劑或輔料、乳化劑或分散劑的選擇很少增加給定劑的滲透，這是由于其僅作用以使該劑更好分布或與植物表面接觸。已知很少物質(zhì)是真正的植物細胞滲透劑，且未發(fā)現(xiàn)一般可與任何特定劑應用至材料的那些可增加所述劑的滲透；但必須發(fā)現(xiàn)這些。納米乳液和納米級乳液用作同義詞用于本申請的相同術(shù)語。
[0096] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導納米乳液治療柑橘綠化疾病的用途。Donsi等人(2012)教導通過高壓均質(zhì)化制備并通過不同乳化劑如卵磷脂、豌豆蛋白和吐溫20穩(wěn)定的納米乳液中香芹酚、檸檬烯和肉桂醛的包囊。當以直接與微生物接觸的方式應用時，這種制劑被教導為是抗微生物的，且認為在食品加工中有用，包括摻入食物產(chǎn)品或包裝。然而，不存在這樣的納米乳液可用于控制攻擊活的植物的疾病的教導或建議，更不必說用于治療植物或昆蟲中的系統(tǒng)內(nèi)生菌。
[0097] 在一些實施方案中，乳液和納米乳液在乳化劑存在下生成。在一些實施方案中，乳化劑可選自但不限于下述(連同相應的CAS注冊號)：硬脂酸銨，1002-89-7；棕櫚酸抗壞血酸酯，137-66-6；硬脂酸丁酯，123-95-5；硬脂酸鈣，1592-23-0；單油酸二甘油酯，49553-76-6；單硬脂酸二甘油酯，12694-22-3；十二烷酸，與1,2,3-丙三醇的單酯，27215-38-9；甘油單油酸酯，111-03-5；甘油二辛酸酯，36354-80-0；甘油二肉豆蔻酸酯，53563-63-6；甘油二油酸酯，25637-84-7；甘油二硬脂酸酯，1323-83-7；甘油單肉豆蔻酸酯，27214-38-6；甘油單辛酸酯，26402-26-6；甘油單油酸酯，25496-72-4；甘油單硬脂酸酯，31566-31-1；甘油硬脂酸酯，
11099-07-3；肉豆蔻酸異丙酯，110-27-0；卵磷脂，8002-43-5；1-甘油單月桂酸酯，142-18-
7；1-甘油單肉豆蔻酸酯，589-68-4；甘油單棕櫚酸酯，26657-96-5；辛酸，鉀鹽，764-71-6；辛酸，鈉鹽，1984-06-1；油酸，112-80-1；棕櫚酸，57-10-3；聚甘油油酸酯，9007-48-1；聚甘油硬脂酸酯，9009-32-9；聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)，9005-64-5；肉豆蔻酸鉀，
13429-27-1；油酸鉀，143-18-0；硬脂酸鉀，593-29-3；油酸鈉，143-19-1；硬脂酸鈉，822-16-
2；大豆卵磷脂，8030-76-0；生育酚聚乙二醇琥珀酸鹽(TPGS)，9002-96-4；維生素E，1406-
18-4；557-05-1和硬脂酸鋅，557-05-1。
11099-07-3；肉豆蔻酸異丙酯，110-27-0；卵磷脂，8002-43-5；1-甘油單月桂酸酯，142-18-
7；1-甘油單肉豆蔻酸酯，589-68-4；甘油單棕櫚酸酯，26657-96-5；辛酸，鉀鹽，764-71-6；辛酸，鈉鹽，1984-06-1；油酸，112-80-1；棕櫚酸，57-10-3；聚甘油油酸酯，9007-48-1；聚甘油硬脂酸酯，9009-32-9；聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)，9005-64-5；肉豆蔻酸鉀，
13429-27-1；油酸鉀，143-18-0；硬脂酸鉀，593-29-3；油酸鈉，143-19-1；硬脂酸鈉，822-16-
2；大豆卵磷脂，8030-76-0；生育酚聚乙二醇琥珀酸鹽(TPGS)，9002-96-4；維生素E，1406-
18-4；557-05-1和硬脂酸鋅，557-05-1。
[0098] 在進一步的實施方案中，本發(fā)明教導具有至多90％肉桂醛的肉桂醛乳液的用途。
[0099] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導TPGS、維生素E、十二烷酸、十八烷酸、十四烷酸、卵磷脂和吐溫20形成用于治療柑橘綠化的具有醛例如肉桂醛的乳液的用途。在一些實施方案中，在生成乳液和納米乳液中利用多種乳化劑。
[0100] 在一些實施方案中，納米乳液包含小于為或小于約為下述的液滴：250nm、245nm、240nm、235、nm?230nm、225nm、220nm、215nm、210nm、205、nm?200nm、195nm、190nm、185nm、
180nm、175nm、170nm、165nm、160nm、155nm、150nm、145nm、140nm、135nm、130nm、125nm、
120nm、115nm、110nm、105nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、
50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm；其中“為”或“約為”的修飾語用于上述每個描述的尺寸。
180nm、175nm、170nm、165nm、160nm、155nm、150nm、145nm、140nm、135nm、130nm、125nm、
120nm、115nm、110nm、105nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、
50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm；其中“為”或“約為”的修飾語用于上述每個描述的尺寸。
[0101] 在一些實施方案中，納米乳液包含大小約為下述范圍的液滴：1nm-5nm、1nm-10nm、1nm-50nm、1nm-100nm、1nm-150nm、1nm-200nm、1nm-250nm、5nm-10nm、5nm-50nm、5nm-100nm、
5nm-150nm、5nm-200nm、2nm-250nm、10nm-50nm、10nm-100nm、10nm-150nm、10-200nm、10nm-
250nm、25nm-50nm、25nm-100nm、25nm-150nm、25nm-200nm、25nm-250nm、50nm-100nm、50nm-
150nm、50nm-200nm、50nm-250nm、100nm-150nm、100nm-200nm、100nm-250nm、150nm-200nm、
150nm-250nm和200nm-250nm；其中“約為”的修飾語適用于每個上述的范圍。
5nm-150nm、5nm-200nm、2nm-250nm、10nm-50nm、10nm-100nm、10nm-150nm、10-200nm、10nm-
250nm、25nm-50nm、25nm-100nm、25nm-150nm、25nm-200nm、25nm-250nm、50nm-100nm、50nm-
150nm、50nm-200nm、50nm-250nm、100nm-150nm、100nm-200nm、100nm-250nm、150nm-200nm、
150nm-250nm和200nm-250nm；其中“約為”的修飾語適用于每個上述的范圍。
[0102] 輔料
[0103] 輔料理解為包含在作物害蟲控制制劑中添加至噴施罐以改進害蟲控制活性或應用特征的任何物質(zhì)。噴施輔料一般分為兩個廣泛的類別，其已知為活化劑輔料和特殊目的輔料。
[0104] 活化劑輔料通過調(diào)節(jié)殺蟲劑活性、在植物組織內(nèi)的吸收、耐雨性(耐性)和光降解而用于增強害蟲控制性能。一些常用的活化劑輔料包括表面活性劑、油、氮肥、粘展劑(spreader-stickers)、潤濕劑和滲透劑。表面活性劑通過減少噴施液滴和葉表面間的表面張力發(fā)揮作用。表面活性劑可歸類為非離子、陰離子、陽離子、兩性和有機硅氧烷表面活性劑。油輔料可歸類為石油和植物油，例如用于滲透蠟質(zhì)角質(zhì)層的植物油。
[0105] 特殊目的的輔料用于擴大給定制劑有效的條件范圍且可甚至改變噴施溶液的物理特征。常見的特殊目的輔料可包括相容劑、緩沖劑、消泡劑和漂移控制劑(drift?control?agent)。
[0106] 在一些實施方案中，輔料以按重量或按體積計為或約為下述濃度使用：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、20％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、
23％、24％、25％、25％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、
38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％和99％；其中“為”或“約為”的修飾語用于每個上述大小。
8％、9％、20％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、
23％、24％、25％、25％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、
38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％和99％；其中“為”或“約為”的修飾語用于每個上述大小。
[0107] 在一些實施方案中，輔料包含為或約為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、20％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、28％、
29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最終溶液；其中“為”或“約為”的修飾語用于每一個上述大小。
14％、15％、16％、17％、18％19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、25％、27％、28％、
29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最終溶液；其中“為”或“約為”的修飾語用于每一個上述大小。
[0108] 納米顆粒
[0109] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導納米顆粒治療柑橘綠化疾病的用途。相比大塊材料的性質(zhì)，納米顆粒(NP)由于納米級顆粒性質(zhì)的顯著和不預期的變化而獲得廣泛關注。對于大于1微米(micron)的大塊材料，在表面的原子的百分比相對于在大塊材料中的原子數(shù)目而言是不顯著的，而納米級顆粒具有大得多的表面積與體積比。NP的高的表面積與體積比提供了用于擴散的巨大的驅(qū)動力，且此外，可強烈影響分子進入植物的能力。NP吸收至植物表面并通過天然開口或傷口采用。
[0110] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導ZnO?NP治療柑橘綠化的用途。氧化鋅(ZnO)制成的NP可通過許多方法制造，且數(shù)種方法導致范圍為2nm的ZnO的NP(Xie等人，2011)。類似肉桂醛，ZnO?NP也已顯示呈現(xiàn)表面殺菌的特性(Hsu等人，2013)。然而，不存在教導或建議這種NP可用于控制攻擊活的植物的疾病，更不用說用于治療系統(tǒng)性內(nèi)生菌。
[0111] 在其他實施方案中，本發(fā)明教導形成用于治療柑橘綠化的NP的聚(乳酸--乙醇酸共聚物)(PLGA)乳液的用途。由PLGA聚合物生成的NP大小的乳液廣泛用于制藥工業(yè)，從而1)保護活性成分免受惡劣的環(huán)境；2)改進疏水性活性材料在水性環(huán)境中的遞送，和3)增加活性材料的細胞攝取(Weiss等人，2006；Hill等人，2013)。在一些實施方案中，本發(fā)明教導PLGA包囊用于治療柑橘綠化的疏水性活性材料的用途。不存在這種納米包囊可用于控制攻擊活的植物的教導或建議。
[0112] 在其他實施方案中，本發(fā)明教導使用用于治療柑橘綠化的硫化鋅(ZnS)NP。氧化鋅(ZnS)制成的NP可通過許多方法制造，且數(shù)種方法生成3-4nm范圍的ZnS?NP，取決于使用的封蓋劑；封蓋劑包括蛋白、氨基酸和聚合物如PVP(Weilnau?et?al,2011)。ZnS優(yōu)于ZnO的進一步優(yōu)勢是ZnS已知具有更大的抵抗大腸桿菌的抗菌性和可忽略的哺乳動物細胞毒性(Li?et?al,2010)。
[0113] 在一些實施方案中，納米顆粒的PLGA、ZnS或ZnO以為或約為下述范圍存在：0.01-0.1％、0.01-0.09％、0.01-0.08％、0.01-0.07％、0.01-0.06％、0.01-0.05％、0.01-
0.04％、0.01-0.03％、0.01-0.02％、0.02-0.1％、0.02-0.09％、0.02-0.08％、0.02-
0.07％、0.02-0.06％、0.02-0.05％、0.02-0.04％、0.02-0.03％、0.03-0.09％、0.03-
0.08％、0.03-0.07％、0.03-0.06％、0.03-0.05％、0.03-0.04％、0.04-0.09％、0.04-
0.08％、0.04-0.07％、0.04-0.06％、0.04-0.05％、0.05-0.09％、0.05-0.08％、0.05-
0.07％、0.05-0.06％、0.06-0.09％、0.06-0.08％、0.06-0.07％、0.07-0.09％、0.07-
0.08％、0.08-0.09％和0.02-0.075％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每種上述范圍。
0.04％、0.01-0.03％、0.01-0.02％、0.02-0.1％、0.02-0.09％、0.02-0.08％、0.02-
0.07％、0.02-0.06％、0.02-0.05％、0.02-0.04％、0.02-0.03％、0.03-0.09％、0.03-
0.08％、0.03-0.07％、0.03-0.06％、0.03-0.05％、0.03-0.04％、0.04-0.09％、0.04-
0.08％、0.04-0.07％、0.04-0.06％、0.04-0.05％、0.05-0.09％、0.05-0.08％、0.05-
0.07％、0.05-0.06％、0.06-0.09％、0.06-0.08％、0.06-0.07％、0.07-0.09％、0.07-
0.08％、0.08-0.09％和0.02-0.075％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每種上述范圍。
[0114] 在一些實施方案中，納米顆粒的PLGA、ZnS或ZnO以為或約為下述的量存在：0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、
0.06％、0.0625％、0.065％、0.0675％、0.070％、0.075％、0.080％、0.0825％、0.085％、
0.0875％、0.090％、0.0925％、0.095％、0.0974％、0.0975％和0.1％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述百分比。
0.06％、0.0625％、0.065％、0.0675％、0.070％、0.075％、0.080％、0.0825％、0.085％、
0.0875％、0.090％、0.0925％、0.095％、0.0974％、0.0975％和0.1％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述百分比。
[0115] 在其他實施方案中，納米顆粒的大小可為或約為下述的范圍：0.5-1nm、1-2nm、1-3nm、1-4nm、1-5nm、2-3nm、2-4nm、2-5nm、3-4nm、3-5nm、4-5nm、5-10nm、10-15nm、15-25nm、
25-50nm、50-75nm、75-100nm、100-150nm、150-200nm、0.5-200nm、1-150nm、2-200nm、2-
150nm、2-100nm、2-75nm、2-50nm、2-25nm、2-15nm和2-10nm。
25-50nm、50-75nm、75-100nm、100-150nm、150-200nm、0.5-200nm、1-150nm、2-200nm、2-
150nm、2-100nm、2-75nm、2-50nm、2-25nm、2-15nm和2-10nm。
[0116] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明教導肉桂醛作為封蓋劑的用途，且因此形成的NP的尺寸為3-4nm的范圍。
[0117] 在進一步的具體的實施方案中，本發(fā)明教導以至多3％的肉桂醛裝載的肉桂醛的用途。
[0118] 一些NP的表面包衣對確定重要的特性如穩(wěn)定性、溶解性、形狀、尺寸和靶向是至關重要的。ZnO?NP將在水中沉淀且ZnO和ZnS?NP都顯示在水中不良的穩(wěn)定性。這在這些NP在植物內(nèi)最終降解方面而言是主要的優(yōu)勢。因此在一些實施方案中，本發(fā)明教導封蓋劑如肉桂醛改進NP的穩(wěn)定性的用途。在一些實施方案中，本發(fā)明的封蓋劑的范圍可為長鏈碳氫化合物至氨基酸、至蛋白、至多羥基化合物，其變得被NP吸收且強烈結(jié)合以至其難以被去除(Niu&Lee,2013)。在其他實施方案中，使用表面活性劑如二氫硫辛酸(DHLA)形成NP。在一些實施方案中，使用DHLA作為表面活性劑的益處是α硫辛酸(DHLA的氧化形式)是GRAS。膳食α硫辛酸在大多數(shù)細胞中可容易地通過NADH或NADPH轉(zhuǎn)化為DHLA。盡管DHLA目前尚未出現(xiàn)在FDA?GRAS列表上，其作為膳食補充(抗氧化劑)可在健康食品商店柜臺可獲得。
[0119] 多種不同的材料可用于配制本發(fā)明的NP，包括但不限于：殼聚糖、PLGA、ZnO和ZnS。
[0120] 治療柑橘綠化的組合物和方法
[0121] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導肉桂醛和溶劑單獨或與其他活性或非活性物質(zhì)組合的用途。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以濃縮液體、溶液、懸浮液、粉末等形式通過噴施、土壤灌溉、澆注、浸漬來施用，所述形式包含最適于目前具體目的的濃度的活性化合物。肉桂醛是高度疏水的且當以正常用于接觸滅菌的30％溶液的4.98ml/L的標準比率(等于1.49ml肉桂醛/L或0.15％)使用時，對植物具有植物毒性。肉桂醛的疏水特性可具體地限制其作為抗菌劑在水性環(huán)境中有效發(fā)揮功能的能力(Kalemba和Kunicka?2003)。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)為更有效地在葉面噴施或可注射制劑中使用芳族醛，盡管所述醛和溶劑可單獨配制，但醛可通過包括表面活性劑如吐溫80或Silwet?L77而導致更多的滲透。在本發(fā)明的一些實施方案中，其他可單獨使用或與肉桂醛組合使用的治療黃龍病菌的化合物包括松柏醛、苯甲醛、乙醛、胡椒醛和香草醛，以及萜烯香芹酚。
[0122] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及治療黃龍病菌的化合物在大于5％的乙醇或DMSO中的可噴施或可注射的溶液。
[0123] 在其他實施方案中，本發(fā)明涉及醛和任何適當?shù)臉O性溶劑的溶液。
[0124] 在本申請的一些實施方案中，至少一種芳族醛以至多為或約為下述的量存在：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
[0125] 在本申請的一些實施方案中，極性溶劑以至多為或約為下述的量存在：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％或99％的總組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
[0126] 在本發(fā)明的一些實施方案中，用于治療感染有黃龍病菌的植物的組合物包含為或約為0.001％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的治療黃龍病菌的化合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的治療黃龍病菌的化合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
[0127] 在本申請的實施方案中，治療感染有黃龍病菌的植物的溶液包含0.001％-10％或0.01％-10％或0.1-10％或1-5％或1-10％的治療黃龍病菌的化合物。
[0128] 在一些治療方案中，治療黃龍病菌的化合物是芳族醛。
[0129] 在具體的實施方案中，芳族醛是肉桂醛：
[0130]
[0131] 在另一實施方案中，芳族醛是松柏醛：
[0132]
[0133] 在一些實施方案中，治療黃龍病菌的化合物選自肉桂醛、松柏醛、苯甲醛、乙醛、胡椒醛和香草醛，以及萜烯香芹酚。
[0134] 在本申請的一些實施方案中，治療黃龍病菌的化合物溶于為或約為下述百分比的極性溶劑中：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。在一些實施方案中，質(zhì)子溶劑是乙醇、甲醇、異丙醇和乙酸等。
75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。在一些實施方案中，質(zhì)子溶劑是乙醇、甲醇、異丙醇和乙酸等。
[0135] 在本申請的一些實施方案中，治療黃龍病菌的化合物溶于為或約為下述百分比的DMSO中：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
[0136] 在一些實施方案中，制劑包括制劑中的肉桂醛和/或松柏醛，所述制劑涉及納米顆粒的形成和在包含70％乙醇的水性溶液中的分散。一種用于治療黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯或番茄的制劑，包含按重量計0.001％-10％的肉桂醛和/或松柏醛，其在70％乙醇或50％DMSO中。在一些實施方案中，應用至植物的制劑中存在的醛的總量為1.5％或更少。制劑在不使用抗氧化劑時是有效且穩(wěn)定的，盡管特定的醛可具有固有的抗氧化特性，例如，松柏醛。制劑的穩(wěn)定性可通過多種方法評估，包括加速測試，其中將感興趣的制劑以設置的時間暴露至升高的溫度。在規(guī)律的時間間隔采集制劑樣品并通過本領域的技術(shù)人員已知確定降解的比率和性質(zhì)的方法進行化學分析。
[0137] 用于包含肉桂醛和/或松柏醛的組合物的最有效的量可使用如實施例所述的那些方案確定。在一些實施方案中，有效處理的量為或至少為0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、
0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、
9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、25g/l、
30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l(w/v)的治療黃龍病菌的化合物。在一些實施方案中，治療黃龍病菌的化合物的有效的處理的量為0.01g/l-25g/l。這些方案還可針對特定的條件以及在特定的植物上的使用優(yōu)化每種化合物，以最小化植物毒性同時最大化制劑的抗病原作用。
0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、
9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、25g/l、
30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l(w/v)的治療黃龍病菌的化合物。在一些實施方案中，治療黃龍病菌的化合物的有效的處理的量為0.01g/l-25g/l。這些方案還可針對特定的條件以及在特定的植物上的使用優(yōu)化每種化合物，以最小化植物毒性同時最大化制劑的抗病原作用。
[0138] 在一些實施方案中，制劑包含為或約為下述范圍的本申請的醛：0.01-1g/l、0.5-1g/l、1-5g/l、1-10g/l、1-20g/l、1-30g/l、1-40g/l、1-50g/l、1-60g/l、1-70g/l、1-80g/l、
1-90g/l、1-100g/l、2-20g/l、2-40g/l、2-60g/l、2-80g/l、2-100g/l、2.5-100g/l、5-10g/l、
5-20g/l、5-40g/l、5-60g/l、5-80g/l、5-100g/l、10-20g/l、10-40g/l、10-60g/l、10-80g/l、
10-100g/l、20-40g/l、20-60g/l、20-80g/l、20-100g/l、40-60g/l、40-80g/l、40-100g/l、
60-80g/l、60-100g/l、80-100g/l、25-100g/l、50-100g/l、75-100g/l(w/v)；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的范圍。
1-90g/l、1-100g/l、2-20g/l、2-40g/l、2-60g/l、2-80g/l、2-100g/l、2.5-100g/l、5-10g/l、
5-20g/l、5-40g/l、5-60g/l、5-80g/l、5-100g/l、10-20g/l、10-40g/l、10-60g/l、10-80g/l、
10-100g/l、20-40g/l、20-60g/l、20-80g/l、20-100g/l、40-60g/l、40-80g/l、40-100g/l、
60-80g/l、60-100g/l、80-100g/l、25-100g/l、50-100g/l、75-100g/l(w/v)；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的范圍。
[0139] 在一些實施方案中，制劑包含至少為或約為下述的本申請的醛：0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l(w/v)；其“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的濃度。
[0140] 在一些實施方案中，本發(fā)明教導包含納米顆粒的組合物的用途。納米顆?？蓡为毷褂没蚺c其他活性或非活性物質(zhì)組合使用。這些活性或非活性物質(zhì)可粘附在納米顆粒上或與其緊密連接，或其可摻入納米顆粒的結(jié)構(gòu)中，如使用納米顆粒封蓋時所發(fā)生。
[0141] 在一些實施方案中，納米顆粒包含氧化鋅、硫化鋅、PEG和PLGA。在一些實施方案中，有效的處理的量為或約為0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、
0.8g/l、0.9g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、
13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l(w/v)的納米顆粒、納米乳液、納米顆粒組合物或納米乳液組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的濃度。
0.8g/l、0.9g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、
13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l(w/v)的納米顆粒、納米乳液、納米顆粒組合物或納米乳液組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的濃度。
[0142] 在進一步的實施方案中，有效的處理的量為或約為0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、
0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、
13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％(w/v)的納米顆粒、納米乳液、納米顆粒組合物或納米乳液組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、
13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％(w/v)的納米顆粒、納米乳液、納米顆粒組合物或納米乳液組合物；其中“為”或“約為”的修飾語適用于每個上述的百分比。
[0143] 在一些實例中，制劑的效力可通過添加一種或多種其他組分(即除了肉桂醛之外的化合物)至制劑而增加，其對于改變制劑的特定方面是理想的。例如，其對于減少植物毒性或增加制劑的抗病理作用(例如，實現(xiàn)滴定量(指感染植物的細菌數(shù))的減少、疾病的發(fā)生率或疾病癥狀的發(fā)生率的降低)或兩者的一些應用可以是理想的。在一個實施方案中，額外的組分在最小化植物毒性的同時增加制劑的抗病理作用。特別感興趣的是在協(xié)同以增加平均疾病抗性的同時最小化植物毒性作用的組分的使用，如與特定制劑相關。"協(xié)同"意指組分由于其存在而增加大于添加量所產(chǎn)生的理想的作用。
[0144] 協(xié)同作用可通過應用Colby公式(Colby,R.S.,"Calculating?Synergistic?and?Antagonistic?Responses?of?Herbicide?Combinations",1967Weeds,vol.15,pp.20-22)來定義，即(E)＝X+Y-(X*Y/100)。
[0145] 一種或多種其他制劑成分的濃度可進行修飾同時保有或增強制劑的理想的植物毒性和抗病理作用。特別感興趣的是將組分添加至制劑以允許一種或多種其他給定制劑中的組分的減少同時基本上維持制劑的效力。這種組分與其他制劑成分的組合可在一個或多個步驟中以在任何適當?shù)幕旌虾?或應用階段完成。
[0146] 實施例
[0148]
[0149]
[0150] *果實產(chǎn)量增加，但季節(jié)中應用較晚，在90％置信水平顯著
[0151] NSD，無顯著性差異；NA，不適用
[0152] 實施例1：肉桂醛、香芹酚和香葉醇對大腸桿菌的作用
[0153] 從Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)購得精油肉桂醛(Aldrich，W228605；≥98％純度)、香芹酚(Aldrich，W224502；≥98％純度)和香葉醇(Aldrich。163333；98％純度)。大腸桿菌Stratagene菌株“Solopack”的單菌落接種于5ml的Luria?Broth(LB)液體培養(yǎng)基，伴隨在37℃振蕩過夜。將200μl的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物置于LB瓊脂平板上，并使用玻璃珠涂勻。允許細菌培養(yǎng)物吸收于LB培養(yǎng)基。吸收后30分鐘內(nèi)，分開放置20μl的三種精油(肉桂醛、香芹酚或香葉醇)液滴而不在6mm盤上稀釋(Whatman,Cat?No.2017-006；GE?healthcare?Life?Science)，并將處理的盤置于具有大腸桿菌的平板上。隨后孵育平板24小時。與文獻一致的是，結(jié)果是全部三種化學品對大腸桿菌的生長具有抑制性，其中香芹酚比肉桂醛具有更多的抑制性，而肉桂醛比香葉醇具有更多的抑制性。重復實驗，獲得相同的結(jié)果。
[0154] 實施例2：肉桂醛、香芹酚和香葉醇對Liberibacter?crescens的作用
[0155] 使用L.crescens菌株BT-1(Lcr)實施與實施例1中所實施相似的實驗，除了使用BM7培養(yǎng)基培養(yǎng)Lcr，使用頂部瓊脂，且使用70％乙醇三種化學品(肉桂醛、香芹酚和香葉醇)將稀釋至2mg/ml-0.125mg/ml的濃度。BM7培養(yǎng)基包含在1升(L)水中的2gα-酮戊二酸(alpha?ketoguraric?acid)、10g?N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸、N-(氨甲?；谆??；撬帷?.75g?KOH、150ml胎牛血清、300ml?TNM-FH。以20g/L添加瓊脂用于固體培養(yǎng)基。Lcr?BT-1細菌在29℃伴隨振蕩孵育直至達到在600nm(OD600)的0.5-0.6的光密度。在該時間點，將500μl的培養(yǎng)物添加至4ml的0.6％BM7頂部瓊脂，混勻，隨后倒至一個BM7平板頂部并允許固化。
固化后，立即使用在70％乙醇中的2倍連續(xù)稀釋液中的范圍為2mg/ml-0.125mg/ml的20μl三種精油(肉桂醛、香芹酚和香葉醇)液滴置于6mm盤上，且將處理的盤置于具有Lcr的平板頂部。隨后孵育平板5天。在每組實驗中將不含有任何添加的精油的70％乙醇對照溶液也置于盤上并在相同的時間施用。結(jié)果是僅肉桂醛和香芹酚對Lcr的生長具有抑制性，其中肉桂醛在2mg/ml具有驚人的強抑制性而在相同濃度(具有植物毒性的香芹酚而非肉桂醛的濃度；
參照下文實施例3)的香芹酚僅具有微弱的抑制性。香葉醇在這些水平對Lcr不是抑制性的。
在這些測試中在1mg/ml水平的肉桂醛也是抑制性的。重復實驗兩次。
固化后，立即使用在70％乙醇中的2倍連續(xù)稀釋液中的范圍為2mg/ml-0.125mg/ml的20μl三種精油(肉桂醛、香芹酚和香葉醇)液滴置于6mm盤上，且將處理的盤置于具有Lcr的平板頂部。隨后孵育平板5天。在每組實驗中將不含有任何添加的精油的70％乙醇對照溶液也置于盤上并在相同的時間施用。結(jié)果是僅肉桂醛和香芹酚對Lcr的生長具有抑制性，其中肉桂醛在2mg/ml具有驚人的強抑制性而在相同濃度(具有植物毒性的香芹酚而非肉桂醛的濃度；
參照下文實施例3)的香芹酚僅具有微弱的抑制性。香葉醇在這些水平對Lcr不是抑制性的。
在這些測試中在1mg/ml水平的肉桂醛也是抑制性的。重復實驗兩次。
[0156] 實施例3：10％肉桂醛、香芹酚和70％乙醇葉面噴施對柑橘的植物毒性作用
[0157] 為測試70％乙醇中的肉桂醛或香芹酚以及單獨的70％乙醇對柑橘植物的植物毒性，我們在Swingle砧木(～6英寸至1英尺高)上通過噴施以達到噴施的徑流(run-off)的程度來施用1％(w/v)和10％(w/v)的肉桂醛或香芹酚(各溶解于70％乙醇)，以及在甜橙(～3英寸高)上通過噴涂葉表面部分的一側(cè)或雙側(cè)來施用。在這兩種方法中我們還施用70％乙醇作為對照。
[0158] 結(jié)果是通過處理后24小時可觀察到即使70％乙醇中的1％香芹酚對柑橘和對甜橙葉也是具有高度植物毒性的。相反，70％乙醇中的1％的肉桂醛以及單獨的70％乙醇對柑橘完全不具有植物毒性。70％乙醇中的10％w/v的肉桂醛具有中度植物毒性，產(chǎn)生褪綠和葉卷曲，但并不落葉。
[0159] 實施例4：肉桂醛、香芹酚和70％乙醇土壤浸泡對柑橘的植物毒性作用
[0160] 為進一步測試70％乙醇中的肉桂醛或香芹酚以及單獨的70％乙醇對柑橘植物的植物毒性，我們在Swingle砧木(～6英寸至1英尺高)上通過添加足夠的液體于盆栽柑橘土壤以達到浸泡的徑流的程度來施用1％和10％肉桂醛或香芹酚(各溶解于70％乙醇)。在這兩種方法中我們還施用70％乙醇作為對照。
[0161] 結(jié)果是通過處理后60小時可觀察到70％乙醇中的8mg/ml(1％)的香芹酚作為土壤浸泡對柑橘是具有高度植物毒性的。相反，70％乙醇中的1％的肉桂醛以及單獨的70％乙醇作為土壤浸泡施用對柑橘完全無植物毒性。70％乙醇中的10％w/v的肉桂醛具有中度植物毒性，產(chǎn)生褪綠和葉卷曲，但并不落葉。
[0162] 實施例5：1％肉桂醛和70％乙醇噴施對治療Las感染的柑橘無效果
[0163] 為測試1％肉桂醛對系統(tǒng)性感染的菠蘿甜橙柑橘植物(由種子長成并保持在溫室中)的Las的治療能力，我們首先移植接種植物，等待癥狀出現(xiàn)(約6個月后)且隨后通過半定量聚合酶鏈式反應(qPCR或PCR)測試對Las感染的存在進行測試。將顆粒吡蟲啉以推薦的比率施用至所有溫室生長的植物。歷時至少3個月的時間在多個測試中證實了植物被感染。隨后通過噴施以達到噴施的徑流的程度將1％(w/v)肉桂醛(溶于70％乙醇)施用至感染的甜橙植物的葉片(～3英尺高的樹)。隨后在1-2周后進行的qPCR測試為qPCR陽性且持續(xù)保持陽性至少數(shù)月。使用qPCR引物和如通過Li等人(2006)所述的方法，將陽性樣品定義為實現(xiàn)小于或等于35的Ct(閾值周期)值的那些。Ct值是qPCR反應中靶標濃度的相對量度。僅使用70％乙醇噴施的對照柑橘植物是qPCR陽性的且保持陽性至少數(shù)月。這些結(jié)果表明由于植物中細胞內(nèi)存在提供的保護，肉桂醛商業(yè)可獲得的制劑(其中沒有已知以DMSO進行配制或使用NP進行配制)將不會通過其自身殺死Las或治療Las感染的柑橘。
[0164] 實施例6：50％DMSO中0.3％和1.5％的肉桂醛噴施對具有HLB癥狀的從田地生長移植盆栽的柑橘的作用。
[0165] 為測試噴施的肉桂醛通過噴施達到徑流的程度并使用50％DMSO作為滲透溶劑對系統(tǒng)性感染的甜橙樹的黃龍病菌的治療能力，將在田間條件移植至Swingle砧木上并呈現(xiàn)強黃龍病(HLB)癥狀的約3年成熟的Hamlin甜橙樹修剪到約4-5英尺的高度，從田地挖出，置于大的(25加侖)盆中，移至溫室并通過PCR測試Las感染的存在。歷時兩周，在多個測試中證實植物被感染。這些植物在田間已使用吡蟲啉處理且以推薦的比率施用顆粒狀吡蟲啉至所有溫室生長的植物。隨后以0.3％和1.5％(溶于50％DMSO)的濃度通過噴施葉片以達到噴施的徑流的程度來施用肉桂醛。已通過鏟倒和翻盆施加壓力的1.5％肉桂醛處理的甜橙樹在6-7天后完全脫葉；0.3％肉桂醛處理的植物表現(xiàn)出未受影響。約2周后，1.5％處理的植物開始出現(xiàn)新芽，且下一周，新芽大到足以開始進行針對Las存在的PCR測試。以50％DMSO中的
1.5％肉桂醛處理的植物完全是Las陰性的，但0.3％處理的植物保持未受感染。隨后在接下來的9個月每周進行的后續(xù)qPCR測試證實1.5％處理的植物保持完全陰性。以50％DMSO噴施或注射的相似的樹也脫葉，但隨后出現(xiàn)的新芽死去或為qPCR陽性。這證明可利用50％DMSO中的1.5％肉桂醛通過噴施重新盆栽且因此高度受壓的柑橘樹以達到徑流的程度來治療柑橘的Las感染。
1.5％肉桂醛處理的植物完全是Las陰性的，但0.3％處理的植物保持未受感染。隨后在接下來的9個月每周進行的后續(xù)qPCR測試證實1.5％處理的植物保持完全陰性。以50％DMSO噴施或注射的相似的樹也脫葉，但隨后出現(xiàn)的新芽死去或為qPCR陽性。這證明可利用50％DMSO中的1.5％肉桂醛通過噴施重新盆栽且因此高度受壓的柑橘樹以達到徑流的程度來治療柑橘的Las感染。
[0166] 實施例7：1.5％肉桂醛和100％DMSO注具有入HLB癥狀的田間生長移植至盆的柑橘的作用。
[0167] 為測試當通過注射使用DMSO遞送時肉桂醛治療系統(tǒng)性感染的甜橙樹的黃龍病菌的能力，將在田間的條件移植至Swingle砧木上并呈現(xiàn)強黃龍病(HLB)癥狀的3年成熟的Hamlin甜橙樹修剪到約4-5英尺的高度，從田地挖出，置于大的(25加侖)盆中，移至溫室并通過PCR測試Las感染的存在。這些植物在田間已使用吡蟲啉處理且以推薦的比率施用顆粒狀吡蟲啉至所有溫室生長的植物。歷時兩周，在多個測試中證實植物被感染。我們隨后在每棵樹上使用兩個裝載彈簧的注射器(Chemjet?Tree?Injectors；Queensland?Plastics,Australia)。每個注射器盛有20ml體積的注射材料；在該情況下，1.5％(w/v)的肉桂醛在100％DMSO中。在土壤線上約12-14"的位點，將注射器通過鉆1/2"的孔(貫穿約每個樹干直徑的4/5)置于樹中。將注射器在位置擰緊且隨后釋放裝載彈簧的注射器，產(chǎn)生溶液的壓力化注射。已通過如在實施例6中的鏟倒和翻盆施加壓力的1.5％肉桂醛注射的甜橙樹在6-7天后完全脫葉。約2周后，這些處理的植物開始出現(xiàn)新芽，且下一周，新芽大到足以開始進行針對Las存在的PCR測試。1.5％處理的植物完全是Las陰性的，且隨后在接下來的9個月每周進行的后續(xù)qPCR測試證實1.5％注射的植物保持完全PCR陰性。這證明可利用100％DMSO中的1.5％肉桂醛通過注射重新盆栽且因此高度受壓的柑橘樹以達到徑流的程度來治療柑橘的Las感染。
[0168] 實施例8：通過樹干注射和通過噴施施用1.5％肉桂醛和50％DMSO對商業(yè)樹林中生長的黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0169] 維護良好的整個商業(yè)樹林中大多的樹，移植至Swingle?citrumello砧木上并用吡蟲啉殺蟲劑(一種植物SAR誘導劑(Ford等人，2010))規(guī)律處理的四年Hamlin樹發(fā)現(xiàn)嚴重患病，其具有典型的HLB癥狀，包括斑點斑駁、一些樹枝變黃和過早果實下降。選擇具有嚴重癥狀的柑橘樹，編號且將其全部徹底隨機化進行處理。對取自每個具有癥狀的樹的不同樹枝的每樹2-3個隨機采樣的樹葉的后續(xù)qPCR測試得到在樹林中大于70％的Las陽性感染率。使用40ml的1.5％(w/v)肉桂醛和50％DMSO，隨機選擇十棵具有癥狀的樹用于如實施例7闡述的樹干注射(圖1和2中的處理1)，并隨機選擇另10棵感染的樹使用800ml以與實施例6中使用的相似的方式的相同處理用于噴施施用，但使用800ml來覆蓋更大的、四年田間生長的樹，由此不存在徑流(圖1和2中的處理2)。使用50％DMSO注射5棵樹并噴施5棵樹(圖1和2中的對照)。
[0170] 圖1中所示的結(jié)果為％Las感染(陽性葉樣品的總數(shù)(通過如上文所述的qPCR評估)除以在給定取樣日期每個處理取得的葉樣品的總數(shù))。歷時6-7個月每月采集樣品。圖1中的每個條狀代表對于10棵樹的每個處理的平均％Las感染，逐月采樣。任何處理前在每個處理中采集的"0月"樣品的所有樹的平均值。將所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)標準化由此預處理感染為100％。非重疊標準誤在P<0.05是顯著的。
[0171] 對于圖2中所示的果實產(chǎn)量數(shù)據(jù)，在秋季(在該田間對于Hamlin柑橘是正常的)的相同時間收獲所有樹，并測量每棵樹的總果實重量。處理1收獲66磅果實/樹，其顯著高于對照組的45磅果實/每樹的產(chǎn)量(圖2中標記為"Cont")，而處理2僅收獲35磅果實/樹，其與對照組產(chǎn)量無顯著差異。
[0172] 從這些結(jié)果，可以清楚的是將50％DMSO中的40ml的1.5％肉桂醛注射入大的、田間生長(4年)的Hamlin柑橘樹(處理1)導致Las感染的顯著減少(從約100％至約35％感染)，且該結(jié)果持續(xù)約3個月。使用50％DMSO中的800ml的1.5％肉桂醛的噴施處理(處理2)還對Las感染水平具有統(tǒng)計學顯著的影響，但該影響僅持續(xù)2個月，且基于由全部處理測量的總體果實產(chǎn)量的分析，在施用的施用比率整體上表現(xiàn)的不那么有效(參照圖2)。處理1和2是僅有的在該田間試驗中再次施用的處理；以所述方式將兩種處理在4個月后再次施用至相同的樹上。再次，觀察到相似的結(jié)果，其中使用注射或噴施方法兩者，感染水平都變得顯著減少。
[0173] 實施例9：田間試驗中通過注射和通過噴施施用的單獨的氧化鋅納米顆粒或裝載有1.5％肉桂醛的70％異丙醇中的納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0174] 用Palanikumar等人(2013)所述的略微修改方法合成氧化鋅(ZnO)納米顆粒。伴隨攪拌30分鐘，將硝酸鋅(Zn(NO3)2.6H2O,0.148g)溶于50ml去離子水，并將10.5g六亞甲基四胺(HMT)分開溶解在50ml去離子水中。在室溫攪拌兩種溶液30分鐘且隨后混合并在60℃的水浴中攪拌45分鐘。通過在4000X?g離心收獲獲得的納米顆粒并稱重。制備以肉桂醛裝載或未裝載的ZnO納米顆?；鞈乙?約2.5g濕重)。使用70％異丙醇將無肉桂醛的ZnO納米顆粒稀釋至4000ml并以800ml/樹的比率將0.0625％ZnO?NP噴施至樹上(圖1和2中的處理3)。將250ml?70％異丙醇中的5％的肉桂醛裝載至2.5g濕重的ZnO納米顆粒上并在室溫攪拌60分鐘。使用70％異丙醇中的1.5％肉桂醛將以肉桂醛裝載的納米顆粒混懸液稀釋至4000ml并以800ml/樹的比率噴施至樹上(處理4，圖1和2和表1)。這些結(jié)果證明歷時7個月，以該水平通過噴施施用的ZnO納米顆粒(含有或不含有1.5％肉桂醛)對Las感染無統(tǒng)計學顯著的影響，且無抑制作用(處理4)或?qū)麑嵁a(chǎn)量無顯著作用(處理3)。這些結(jié)果還證實了實施例4做出和所示的結(jié)論，即通過噴施施用的商業(yè)可獲得的肉桂醛制劑(1.5％肉桂醛)自身無法殺死Las或治療Las感染的柑橘。
[0175] 使用70％異丙醇將無肉桂醛的ZnO納米顆?；鞈乙?約2.5g)稀釋至750ml并以40ml/樹的比率以0.33％ZnO?NP的濃度注入樹中(處理5，圖1和2和表1)。隨后將250ml?70％異丙醇中的5％肉桂醛裝載至2.5g(濕重)ZnO納米顆粒上并在室溫攪拌60分鐘。使用70％異丙醇中的1.5％肉桂醛將以肉桂醛裝載的納米顆?；鞈乙合♂屩?50ml并以40ml/樹的比率以0.33％的濃度注入樹中(處理6，圖1和2和表1)。結(jié)果表明無來自單獨注射的ZnO?NP的直接作用(處理5)，但來自以肉桂醛轉(zhuǎn)載的ZnO?NP并使用70％異丙醇施用的注射對Las感染具有延遲但顯著的影響(處理6，圖1)。
[0176] 該結(jié)論得到圖2中的果實產(chǎn)量數(shù)據(jù)的支持，其表明來自處理6的較高的產(chǎn)量，盡管使用這些處理濃度來自該施用的產(chǎn)量增加在95％的置信水平并非是統(tǒng)計學顯著的。果實產(chǎn)量的增加和Las感染水平的降低可能是由于單獨的肉桂醛注射，但延遲的效果表明ZnO?NP可能將肉桂醛固定在韌皮部中。因此，不存在DMSO時，ZnO?NP的注射表現(xiàn)出將肉桂醛充分固定在韌皮部中。
[0177] 實施例10：在田間試驗中通過樹干注射和通過噴施施用，具有或不具有0.03％肉桂醛制備的PLGA共混的乳液對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0178] 用Khemeni等人(2012)所述的略微修改的方法使用PLGA乳液(使用雙十二烷基二甲基溴化銨(DMAB)作為表面活性劑共混)包囊至多0.03％的肉桂醛。將1g?PLGA溶于50ml?DMSO并包囊151μl(～160mg)肉桂醛用于處理7和8，但在處理9的乳液和稀釋液兩者中省略了肉桂醛(參見圖1和2和表1)。將上述溶液逐滴加入至具有0.3％DMAB的100ml?60％-70％DMSO中同時劇烈攪拌；使用商業(yè)攪拌器乳化溶液10分鐘，隨后過濾并添加至500ml去離子水。對于處理7(0.02％PLGA和0.03％肉桂醛)，將PLGA乳液與在50％DMSO中的2.8L的1.5％肉桂醛混合。如實施例9所述隨機選擇10棵具有癥狀的樹用于使用800ml/樹進行噴施施用。
[0179] 對于樹干注射，如實施例7所述，將650ml的PLGA乳液與100％DMSO中的650ml的3％肉桂醛混合，使用40ml/樹的相同的處理(0.02％PLGA，0.03％肉桂醛)。作為僅使用PLGA用于樹干注射的對照，將650ml的PLGA乳液與650ml的100％DMSO混合(圖1和2中的處理9；0.08％PLGA)。結(jié)果是單獨的PLGA共混乳液(無論噴施或注射)對Las感染具有顯著的作用(圖1的處理7、8和9)，但對果實產(chǎn)量無顯著作用(圖2)。這些結(jié)果證明了PLGA乳液減少了Las感染。
[0180] 實施例11：在田間試驗中通過樹干注射和通過噴施施用，具有或不具有1.5％肉桂醛制備的PLGA納米顆粒大小的超聲乳液對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0181] 使用PLGA乳液包囊至多1.5％的肉桂醛，再次使用DMAB作為表面活性劑，但如實施例10所述對操作進行額外的修飾。為確定超聲對制造PLGA納米顆粒的影響，對于處理10、11、12和13，將1g?PLGA溶于50ml?DMSO并添加10ml(～10.5g)肉桂醛(圖1和2和表1)。將上述溶液逐滴添加至具有0.3％DMAB的100ml?60％-70％DMSO中同時劇烈攪拌；將溶液逐滴加入至500ml去離子水中同時劇烈攪拌，并超聲混合物。裝載肉桂醛的、PLGA超聲的產(chǎn)物通過透射電子顯微鏡(TEM)檢查并示于圖3。肉桂醛包囊的PLGA乳液形成60-180nm大小的納米顆粒。
[0182] 對于處理10(參見圖1和2和表1)，將40ml的該肉桂醛+PLGA(0.15％PLGA)產(chǎn)物直接注射至每棵樹。對于處理11，1:1稀釋的20ml相同產(chǎn)物通過添加50％DMSO中的20ml?1.5％肉桂醛制備并注射至每棵樹(0.08％PLGA)。對于處理12，將900ml肉桂醛+PLGA納米顆粒產(chǎn)物通過添加在50％DMSO中的3.9L的1.5％C稀釋。每棵樹以800ml的該溶液(0.03％PLGA)每樹噴施。對于處理13，隨后將900ml肉桂醛+PLGA納米顆粒產(chǎn)物通過添加3.9L去離子水稀釋。每棵樹以800ml的該溶液(0.03％PLGA)每樹噴施。
[0183] 結(jié)果是全部四種超聲的PLGA處理有效顯著降低田間樹的Las感染，且包囊有1.5％肉桂醛(用50％DMSO或水稀釋)的注射(處理11)和噴施(處理13)的PLGA?NP兩者分別表現(xiàn)出顯著增加處理的樹的果實產(chǎn)量。這些結(jié)果證明了：1)PLGA超聲的乳液形成了NP；2)至多1.5％的肉桂醛可通過PLGA包囊，和3)包囊有1.5％肉桂醛(用50％DMSO或水稀釋)的PLGA?NP在田間生長的柑橘中在減少Las滴定量和增加果實產(chǎn)量中都有效。
[0184] 實施例12：在田間試驗中通過樹干注射和通過噴施施用，以在25％DMSO中的3％肉桂醛封蓋的ZnS納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0185] 依照Weilnau等人2011中所述的方案(略微修改)合成ZnS納米顆粒。將肉桂醛(1.4ml)添加至23.57ml的100％DMSO，伴隨不斷的攪拌且隨后逐滴添加15ml去離子水。添加5.0ml的1.0M醋酸鋅后，將溶液通過不斷攪拌混合并添加5.0ml的0.85M硫化鈉并同時持續(xù)攪拌。通過在2000X?g離心15分鐘收集NP并用去離子水淋洗兩次。洗滌NP并在50ml的25％DMSO中重新混懸。將這些以3％肉桂醛封蓋的ZnS?NP呈遞至TEM，且評估的大小范圍為2-4nm(圖4)。顯著的是，預測約5nm或更小的NP能夠橫穿未損傷細胞的植物細胞壁(Dietz&Herth,
2011)。如前所述，將40ml的該懸液注射至每棵樹(處理14)。對于噴施施用，將相同量的混懸液使用在水中的25％DMSO稀釋至800ml并將800ml施用至每棵樹(處理15)。
2011)。如前所述，將40ml的該懸液注射至每棵樹(處理14)。對于噴施施用，將相同量的混懸液使用在水中的25％DMSO稀釋至800ml并將800ml施用至每棵樹(處理15)。
[0186] 結(jié)果是3％肉桂醛封蓋的ZnS?NP(無論注射或噴施)在處理組中都顯著抑制Las感染，且兩種處理都顯著增加果實產(chǎn)量，盡管處于減少的置信水平(90％置信)。這些處理的田間施用晚于處理10、11、12和13發(fā)生；如果將處理14和15較早施用，則對果實產(chǎn)量的效果將可能更高。這些結(jié)果證明了ZnS?NP：1)可直接以肉桂醛封蓋；2)這些ZnS?NP的大小為2-4nm的范圍，且3)這些NP(無論注射或噴施)都在田間生長的受Las感染并顯示HLB癥狀的樹中有效降低Las滴定量并增加柑橘果實產(chǎn)量。
[0187] 實施例13：在田間試驗中通過樹干注射和通過噴施施用，以25％DMSO中的0.33％PEG和1.5％肉桂醛封蓋的ZnS納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0188] 依照Zhang等人2014中所述的方案(略微修改)合成以PEG封蓋的ZnS納米顆粒。使用不斷攪拌，將0.2g?PEG溶于10ml去離子水并伴隨不斷攪拌并添加至10ml?100％DMSO，隨后添加858μl肉桂醛，隨后添加20ml?0.3M醋酸鋅和20ml?0.3M硫化鋅。通過在3500rpm離心10分鐘收集獲得的納米顆粒，用去離子水淋洗兩次并在60ml的5％DMSO中重新混懸。如前所述，將40ml的該懸液注射至每棵樹(處理16)。對于噴施施用，使用在水中的25％DMSO稀釋相同量的混懸液至800ml并將800ml施用至每棵樹(處理17)。
[0189] 結(jié)果是注射的PEG和肉桂醛封蓋的ZnS?NP表現(xiàn)出提供一些對Las感染的抑制，但在果實產(chǎn)量中無顯著改善，且相同NP的噴施施用表現(xiàn)出具有很少或無效果。
[0190] 實施例14：在田間試驗中通過樹干注射和通過噴施施用，以添加了1.85-3.7％水楊酸(SA)的10-50％DMSO中的3％肉桂醛封蓋的ZnS納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘樹的作用。
[0191] 如上述實施例12，依照Weilnau等人2011中所述的方案(略微修改)合成ZnS納米顆粒。將肉桂醛(1.4ml)添加至23.57ml的100％DMSO伴隨不斷攪拌，且隨后逐滴添加15ml去離子水。添加5.0ml的1.0M醋酸鋅后，通過不斷攪拌混合溶液并添加0.85M硫化鈉同時持續(xù)攪拌。通過在2000X?g離心15分鐘收集納米顆粒并將產(chǎn)物重新混懸于50ml的50％DMSO中。向該懸液添加0.925g的水楊酸鈉伴隨攪拌，并注射40ml的所獲溶液至每棵樹(處理20)。作為對照，注射40ml的1.85％SA溶液至每棵樹(處理18)。對于噴施施用，使用具有3.7％SA的10％DMSO將50ml的ZnS?NP產(chǎn)物進行1:40稀釋并將2L的該稀釋產(chǎn)物噴施至每棵樹(處理21)。作為對照，將2L3.7％SA溶液噴施至每棵樹(處理19)。
[0192] 結(jié)果是僅使用SA觀察到對Las感染或果實產(chǎn)量影響很小或無影響(處理18和19)。此外，使用如處理14和15中使用的相同的肉桂醛封蓋的ZnS?NP僅觀察到對Las感染率的中度影響且對果實產(chǎn)量無影響(處理20和21)。由于商業(yè)測試樹林中使用樹基于常規(guī)基礎使用吡蟲啉處理，且吡蟲啉是與SA相同或相似植物防御途徑的強效誘導劑，因此SA可能未對這些處理增添益處。SA在其他這樣的誘導劑不存在下可提供益處。處理14和15與20和21的比較揭示了就對果實產(chǎn)量和感染抑制兩者而言14和15更好，這可能是由于與處理20和21中的
10％相比，在處理14和15中使用的DMSO水平為25％。因此以醛封蓋和/或裝載的小顆粒尺寸的NP和DMSO滲透能力的組合可能提供了對醛向受植物組織保護的細菌的遞送的協(xié)同作用。
10％相比，在處理14和15中使用的DMSO水平為25％。因此以醛封蓋和/或裝載的小顆粒尺寸的NP和DMSO滲透能力的組合可能提供了對醛向受植物組織保護的細菌的遞送的協(xié)同作用。
[0193] 實施例15：1.5％肉桂醛和5-50％DMSO對黃龍病菌感染的馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0194] 為測試肉桂醛對系統(tǒng)性感染的馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的黃龍病菌的治療能力，包括柑橘黃龍病茄科植物種和新的待描述的黃龍病菌菌株，使用本領域的技術(shù)人員已知的方法通過PCR測試了黃龍病菌感染的存在。將1.5％肉桂醛(溶于5-50％DMSO)通過噴施植物葉片以達到噴施的徑流的程度施用至感染的馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物。1-2周后使用PCR進行后續(xù)PCR測試。預期這些后續(xù)的PCR測試在處理后將是陰性的或?qū)@示滴定量的減少。
[0195] 實施例16：以1.5％肉桂醛封蓋并以水或以5-50％DMSO稀釋的0.02％-0.075％PLGA超聲的納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0196] 為確定超聲對制造PLGA納米顆粒的影響，使用如實施例10提供的相似的方法，其涉及以肉桂醛裝載的PLGA?NP的制造。將對于噴施施用對柑橘提供益處的不同噴施處理(特別是處理12和13)通過噴施植物葉片以達到噴施的徑流的程度施用至黃龍病菌感染的馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物。
[0197] 實施例17：以至多3％肉桂醛和DMSO制備并以水或以水+輔料稀釋的TPGS納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0198] 使用如實施例11中所述(幾處修改)制備的TPGS乳液包囊至多3％肉桂醛。使用DMSO中的至多3％的肉桂醛，但無PLGA。將該溶液逐滴加入0.3％TPGS中同時劇烈攪拌；溶液首先通過在高速渦旋乳化且隨后裝載入50ml注射器并使用高壓均化將其壓入通過小直徑(18規(guī)格)針。重復其5X。使用水或0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO稀釋溶液5X和10X且將其噴施直至處理的植物濕透。
[0199] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0200] 實施例18：以至多3％肉桂醛和乙酸乙酯制備并以水或以水+輔料稀釋的TPGS納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0201] 使用如實施例17所述制備的TPGS乳液包囊至多3％的肉桂醛，除了使用乙酸乙酯替代DMSO。使用水或水中的0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將溶液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0202] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0203] 實施例19：以3％肉桂醛和乙酸乙酯制備并以水或以水+輔料稀釋的吐溫20納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0204] 使用如實施例17所述制備的吐溫20乳液包囊至多3％的肉桂醛，除了使用吐溫20替代TPGS。使用水或水中的0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將溶液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0205] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0206] 實施例20：以6％肉桂醛和乙酸乙酯制備并以溶質(zhì)或以溶質(zhì)+輔料稀釋的吐溫20納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0207] 通過將40ml(～42g)肉桂醛逐滴加入至50ml乙酸乙酯乳化至多6％肉桂醛同時劇烈攪拌；將溶液逐滴加入去離子水中的50ml?0.3％吐溫20同時劇烈攪拌。隨后通過裝載入50ml注射器并使用高壓力均化將其壓入通過小直徑(18規(guī)格)針，將乳液減少至納米乳液大小。重復其5X。將溶液添加至250ml去離子水伴隨不斷攪拌，形成持續(xù)至少一周的穩(wěn)定乳液。
使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0208] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0209] 實施例21：以3％肉桂醛或4.1％肉桂油制備并以溶質(zhì)或以溶質(zhì)+輔料稀釋的吐溫20納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0210] 通過添加82％肉桂油或60％肉桂醛和22％礦物油至18％吐溫20乳化至多4.1％的肉桂油或3％肉桂醛并伴隨攪拌。使用去離子水1:20稀釋乳液。隨后通過裝載入50ml注射器并使用高壓力均化將其壓入通過小直徑(27規(guī)格)針，將乳液減少至納米乳液大小。重復其5X。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0211] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0212] 實施例22：以8.2％肉桂油制備并以水或以水+輔料稀釋的吐溫20納米顆粒以及1.5％肉桂醛對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0213] 如實施例21納米乳化至多8.2％的肉桂油。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0214] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0215] 實施例23：以至多8.2％肉桂油制備并以水或以水+輔料稀釋的十二烷酸組合物納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0216] 如實施例21納米乳化至多8.2％的肉桂油，但使用至多18％的十二烷酸。隨后使用高壓力均化將這些乳液減少至納米乳液大小。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0217] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0218] 實施例24：以至多8.2％肉桂油制備并以水或以水+輔料稀釋的硬脂酸鋅組合物納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0219] 如實施例21納米乳化至多8.2％的肉桂油，但使用至多18％的硬脂酸鋅。隨后使用高壓力均化將這些乳液減少至納米乳液大小。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0220] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0221] 實施例25：以至多8.2％肉桂油制備并以水或以水+輔料稀釋的卵磷脂組合物納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0222] 如實施例21納米乳化至多8.2％的肉桂油，但使用至多18％的卵磷脂。隨后使用高壓力均化將這些乳液減少至納米乳液大小。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0223] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0224] 實施例26：以至多8.2％肉桂油制備并以水或以水+輔料稀釋的甘油二肉豆蔻酸酯組合物納米顆粒對黃龍病菌感染的柑橘、馬鈴薯、番茄、芹菜和胡蘿卜植物的作用。
[0225] 如實施例21納米乳化至多8.2％的肉桂油，但使用至多18％的甘油二肉豆蔻酸酯。隨后使用高壓力均化將這些乳液減少至納米乳液大小。使用水、0.05％商業(yè)輔料或5-50％DMSO將穩(wěn)定的納米乳液稀釋5X和10X且進行噴施直至處理的植物濕透。
[0226] 預期顯著減少的感染率和增加的產(chǎn)量。
[0227] 除非另外定義，本申請使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領域的技術(shù)人員所理解相同的含義。盡管任何方法和材料、與本申請所述的那些相似或等同物可在實踐和測試本發(fā)明中使用，但是優(yōu)選的方法和材料描述于本申請。引用的全部的出版物、專利和專利公開出于全部目的通過引用的方式將其全部內(nèi)容并入本申請。
[0228] 本申請討論的出版物僅針對其早于本發(fā)明申請日的公開內(nèi)容提供。本申請沒有內(nèi)容應理解為承認本發(fā)明由于在先發(fā)明而不具有比這樣的公開內(nèi)容要早的日期。
[0229] 本申請引用的全部參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開和專利申請出于全部目的通過引用的方式以其全部內(nèi)容并入本申請。然而，對本申請引用的任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開和專利申請的提及不應理解為是對其構(gòu)成有效的現(xiàn)有技術(shù)或形成世界上任何國家的公知常識的一般分的承認或任何形式的暗示。
[0230] 盡管本發(fā)明已結(jié)合其具體實施方案進行了描述，但是應該理解的是其能夠進一步修飾且本申請意在覆蓋本發(fā)明的任何變化、用途或改變，只要其原則上落入本發(fā)明的原理，并包括這樣的對于本發(fā)明的偏離，只要其在已知的或本發(fā)明所屬領域的常規(guī)實踐范圍內(nèi)且可適于前文所述的實質(zhì)特征并遵循附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
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