一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株、硫酸多粘菌素B的制備方法及
應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)
[0002] 多粘菌素是由多粘芽胞桿菌(Paenibacillus?polymyxa)產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。多粘菌素B供藥用，常用其
硫酸鹽。除
變形桿菌屬外，硫酸多粘菌素B對幾乎所有的革蘭氏陰性細菌都有抗菌作用，對生長繁殖期和靜止期的細菌都有效，臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、以及眼、氣管、腦膜炎、敗血癥、燒傷感染以及
皮膚粘膜感染等。
[0003] 硫酸多粘菌素B主要采用
微生物發(fā)酵法生物合成，再經(jīng)提取精制制備而成。關(guān)于
原料藥中的硫酸多粘菌素B的
質(zhì)量要求，USP/EP藥典有明確規(guī)定：多粘菌素B含量≥80％，最大單雜≤3.0％、總雜≤17％、B3≤6.0％、B1-1≤15％。代表世界最高
水平的硫酸多黏菌素B生產(chǎn)廠家--阿爾法姆，其產(chǎn)品含量為87％-90％，而國內(nèi)產(chǎn)品含量最高只能達到85％左右，含量雖然滿足USP/EP藥典要求，但與世界最高水平尚有差距。目前公開發(fā)表的硫酸多粘菌素B制備工藝均能達到80％以上的含量，但滿足單個雜質(zhì)控制要求的難度相對較大，尤其是最大單雜容易超標(biāo)，使用常規(guī)的硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株和分離純化手段難以有效的降低最大單雜比例。
[0004] 如
申請號為200710036929.X的
專利《發(fā)酵法合成多粘菌素B的方法》，發(fā)酵單位最高為6534.5U/ml，并且專利未對產(chǎn)品組分情況進行說明。申請?zhí)枮?01110385129.5的專利《一種從發(fā)酵液中提取多粘菌素B的方法》，雖然效價可以達到8100U/mg以上，但其產(chǎn)品純度只有85％左右。申請?zhí)枮?01310506594.9的專利《一種發(fā)酵法生產(chǎn)多粘菌素B的方法》，發(fā)酵單位最高為7500U/ml，并且專利未對產(chǎn)品組分情況進行說明。申請?zhí)枮?01610694064.5的專利《一種硫酸多粘菌素B結(jié)晶及其制備方法》，只是采用了結(jié)晶的辦法生產(chǎn)硫酸多粘菌素B，并未對其組分進行控制和優(yōu)化。申請?zhí)枮?01710280429.4的專利《發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法》，雖然該發(fā)明對發(fā)酵組分進行了部分控制，但其產(chǎn)品純度達不到90％。文獻《響應(yīng)面法優(yōu)化多粘菌素B的發(fā)酵條件》中國農(nóng)學(xué)通報2010，26(15)：57-53，其發(fā)酵單位915.77mg/ml。
發(fā)明內(nèi)容
[0005] 針對
現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株、硫酸多粘菌素B的制備方法及應(yīng)用，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株，菌種名稱為：Paenibacillus?polymyxa?DN8，保藏編號為CCTCC?NO：M?2019994。已于2019年12月2日保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072。
[0007] 如上述的一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株按以下方法制得：
[0008] 使用無菌水將長好的多粘菌素B菌種從斜面洗脫下來，然后用紫外燈誘變20～40s后，避光在含有甲基磺酸乙酯(DES)濃度0.05-0.5mol/L的無菌水里處理5～30min。然后避光涂布在含有多粘菌素B?0.6～1.0g/L斜面培養(yǎng)基(a)上，培養(yǎng)后挑取單菌落接種到搖瓶
種子培養(yǎng)基(b)中發(fā)酵，篩選出比對照單位高且單雜低的菌種，傳至三代，菌種
穩(wěn)定性較強，獲得誘變多黏菌素B菌種，該菌種為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)，單菌落形態(tài)是表面光滑，沒有皺褶，乳白色，卵圓型或者圓形，在
顯微鏡下桿狀，條件不好條件下形成芽孢，菌落及菌體形態(tài)圖見圖1和圖2所示。通過誘變育種，多粘菌素B的產(chǎn)量可由1.2g/L提高到2.0g/L，比出發(fā)菌株提高了50％，也遠高于目前公開資料的產(chǎn)量水平。
[0009] 其中：斜面培養(yǎng)基(a)，每100ml培養(yǎng)基含有以下組分：
蔗糖0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，
酵母浸粉0.2～0.5，
磷酸二氫
鉀0.05～0.1，瓊脂2.0，余量為水。
[0010] 搖瓶種子培養(yǎng)基(b)，每100ml培養(yǎng)基含有以下組分：糊精5.0～8.0，酵母浸粉0.2～1.0，磷酸二氫鉀0.05～0.2，硫酸銨0.2～0.6，硫酸
鈣0.2～0.6，消泡劑0.05，余量為水。
[0011] 如上述的一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)硫酸多黏菌素B中的應(yīng)用。
[0012] 一種硫酸多粘菌素B的制備方法，包括：利用
權(quán)利要求1中的硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株進行微生物發(fā)酵獲取發(fā)酵液，將發(fā)酵液進行過濾、大孔型離子交換
樹脂處理、
解吸液脫色、大孔層析樹脂處理、解吸液
堿結(jié)晶、溶解轉(zhuǎn)鹽、納濾濃縮、
噴霧干燥，得到硫酸多粘菌素B。
[0013] 進一步地，利用權(quán)利要求1中的硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株進行微生物發(fā)酵所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：每100ml培養(yǎng)基含可溶性
淀粉5.0～7.0g，酵母粉0.5～0.8g，
磷酸氫二鉀0.01～0.05g，硫酸銨0.2～0.4g，硫酸鈣0.2～0.4g，消泡劑0.05ml，余量為水；發(fā)酵條件為：
溫度28.0～29.5℃，罐壓0.03～0.04MPa，流量0.6～0.8vvm，轉(zhuǎn)速200～350rpm，培養(yǎng)周期38～43小時，接種量是5～8％。
[0014] 進一步地，對發(fā)酵液進行處理的過程包括以下步驟：
[0015] (1)用
草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至2.5-3.5，攪拌30min-60min，降溫至10-15℃，過濾，收集濾液；
[0016] (2)將步驟(1)的濾液用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，上大孔型離子交換樹脂柱
吸附，上柱完成后丟棄上柱透過液，用4-6倍樹脂體積的純化水洗柱，然后硫
酸溶液進行解吸，直至流出液小于1500單位停止解吸，得解吸液；
[0017] (3)步驟(2)的解吸液升溫至40-50℃，加入
活性炭，保溫攪拌，過濾，得到硫酸多黏菌素B脫色液；
[0018] (4)將步驟(3)中得到的硫酸多黏菌素B脫色液上大孔層析樹脂吸附上柱完成后丟棄上柱透過液，用4-6倍樹脂體積的純化水洗柱，然后
乙醇水溶液進行解吸，直至流出液小于1500單位停止解吸，得解吸液；
[0019] (5)將步驟(4)得到的解吸液降溫至5-10℃，用氫
氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至12.5-13.0，然后升溫至20-25℃，升溫后繼續(xù)攪拌1-2h，過濾，
濾餅用純化水洗滌3次，得到多黏菌素B堿結(jié)晶；
[0020] (6)用2mol/L的硫酸溶解多黏菌素B堿結(jié)晶，完全溶解后，最終調(diào)節(jié)pH至5.0-5.5，得到硫酸多黏菌素B溶解液；
[0021] (7)將硫酸多粘菌素B溶解液進行納濾濃縮，加壓
泵壓
力1.0-1.5MPa，純化水頂洗，收集濃縮液，得到納濾濃縮后硫酸多黏菌素B溶液；
[0022] (8)將步驟(7)得到的硫酸多黏菌素B溶解液依次過5μm和0.45μm的
濾芯，得到澄清過濾液，干燥后獲得硫酸多黏菌素B噴干粉。
[0023] 進一步地，步驟(1)中使用100-200nm孔徑的陶瓷
膜過濾。
[0024] 進一步地，步驟(2)中所用硫酸溶液濃度為0.2mol/L。
[0025] 進一步地，步驟(4)中所用乙醇水溶液的體積濃度為30-50％。
[0026] 如上述的一種硫酸多粘菌素B的制備方法在生產(chǎn)硫酸多黏菌素B中的應(yīng)用。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：
[0028] 1.利用本發(fā)明誘變得到的菌株產(chǎn)硫酸多黏菌素B能力強，放罐單位2.0g/L，超過行業(yè)平均水平20％。
[0029] 2.本發(fā)明通過對發(fā)酵培養(yǎng)基
碳源和氮源優(yōu)化，對接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、罐壓等發(fā)酵條件進行精準(zhǔn)調(diào)控，控制代謝產(chǎn)物的組分，放罐發(fā)酵液中USP/EP藥典所規(guī)定的幾種雜質(zhì)峰的比例，遠低于國內(nèi)文獻記載的水平。
[0030] 3.對發(fā)酵培養(yǎng)液進行分離純化獲得高純度高含量的硫酸多黏菌素B，產(chǎn)品質(zhì)量遠高于USP/EP標(biāo)準(zhǔn)，純度和含量均大于90％，單雜和組分均合格，總雜低于8％，生測效價大于8100u/mg。
附圖說明
[0031] 圖1是多粘菌素B菌種的菌落形態(tài)；
[0032] 圖2是多粘菌素B菌種的菌體形態(tài)；
[0033] 圖3是發(fā)酵液中各成分圖譜；
[0034] 圖4是硫酸多黏菌素B噴干粉的成分圖譜。
具體實施方式
[0035] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合
實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明，各實施例及試驗例中所用的設(shè)備和
試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0036] 本發(fā)明披露了一種硫酸多黏菌素B生產(chǎn)菌株、硫酸多粘菌素B的制備方法及應(yīng)用，具體如下各實施例所示。
[0037] 實施例1生產(chǎn)菌株的獲取
[0038] 使用無菌水將長好的多粘菌素B菌種從斜面洗脫下來，然后用紫外燈誘變20～40s，本實施例中選用40s后，避光在含有甲基磺酸乙酯(DES)濃度0.05-0.5mol/L，本實施例中選用0.25mol/L的無菌水里處理5～30min，本實施例中選用20min。然后避光涂布在含有多粘菌素B?0.6～1.0g/L，本實施例中選用0.7g/L斜面培養(yǎng)基(a)上，培養(yǎng)后挑取單菌落接種到搖瓶種子培養(yǎng)基(b)中發(fā)酵，篩選出比對照單位高且單雜低的菌種，傳至三代，菌種穩(wěn)定性較強，獲得誘變多黏菌素B菌種，該菌種為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)，單菌落形態(tài)是表面光滑，沒有皺褶，乳白色，卵圓型，在顯微鏡下桿狀。菌落及菌體形態(tài)圖見圖1和圖2所示。
[0039] 其中：斜面培養(yǎng)基(a)，每100ml培養(yǎng)基含有以下組分：蔗糖0.5～1.0(本實施例中為0.8)，蛋白胨0.5～1.0(本實施例中為0.6)，酵母浸粉0.2～0.5(本實施例中為0.44)，磷酸二氫鉀0.05～0.1(本實施例中為0.08)，瓊脂2.0，余量為水。
[0040] 搖瓶種子培養(yǎng)基(b)，每100ml培養(yǎng)基含有以下組分：糊精6.0(本實施例中為6.0)，酵母浸粉0.8(本實施例中為0.8)，磷酸二氫鉀0.1(本實施例中為0.1)，硫酸銨0.3(本實施例中為0.3)，硫酸鈣0.4(本實施例中為0.4)，消泡劑0.05，余量為水。
[0041] 實施例2硫酸多粘菌素B的制備
[0042] 1、菌種發(fā)酵
[0043] (1)將實施例1中獲得誘變多黏菌素B菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基(b)里進行培養(yǎng)，得到搖瓶種子液。
[0044] (2)把搖瓶種子液接種到10L種子罐里進行培養(yǎng)，得到種子液。
[0045] (3)把種子罐種子液移種到50L
發(fā)酵罐里進行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。
[0046] 其中：步驟(2)種子罐培養(yǎng)基配方同搖瓶種子培養(yǎng)基(b)。步驟(3)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉5.0～7.0(本實施例中為6.5)，酵母粉0.5～0.8(本實施例中為0.55)，磷酸氫二鉀0.01～0.05(本實施例中為0.04)，硫酸銨0.2～0.4(本實施例中為0.3)，硫酸鈣0.2～0.4(本實施例中為35)，消泡劑0.05，余量為水。
[0047] 碳源、氮源對發(fā)酵單位和雜質(zhì)影響很大，對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源(糊精，可溶性淀粉，淀粉，面粉)、有機氮源(蛋白胨，酵母粉，
牛肉膏)進行篩選，碳源中可溶性淀粉和面粉較好，優(yōu)選可溶性淀粉；氮源中酵母粉和牛肉膏較好，優(yōu)選酵母粉。
[0048] 步驟(1)和(2)的發(fā)酵條件采用公知方法步驟(1)的發(fā)酵條件：溫度28～30℃(本實施例中為29℃)，培養(yǎng)時間14～16h(本實施例中為15h)。步驟(2)的發(fā)酵條件：溫度28～30℃(本實施例中為30℃)，培養(yǎng)時間10～14h(本實施例中為13h)，接種量1％。步驟(3)的發(fā)酵條件：溫度28.0～29.5℃(本實施例中為29℃)，罐壓0.03～0.04MPa，流量0.6～0.8vvm，轉(zhuǎn)速200～350rpm(本實施例中為300rpm)，培養(yǎng)周期38～43小時(本實施例中為40h)，接種量是5～8％(本實施例中為6.5％)。
[0049] 利用誘變多黏菌素B菌種進行發(fā)酵，放罐單位在2.0g/L左右(參考文獻:田東.硫酸多粘菌素B菌種選育與發(fā)酵工藝的研究[D]北京化工大學(xué),2010.)，單雜小于2.0％。
[0050] 對發(fā)酵液進行色譜檢測，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，B3含量僅為2.90％、B1-1含量僅為3.81％，雜質(zhì)含量相當(dāng)?shù)?，只有在如此低的雜質(zhì)含量情況下，才能獲得高含量的有效成分。
[0051]
[0052] 對比發(fā)酵液組分，發(fā)現(xiàn)本工藝發(fā)酵液的有效組分比例比國內(nèi)專利報道提高10.58％，大大提高分離純化后產(chǎn)品的純度和含量，并且對產(chǎn)品整體質(zhì)量有比較大的提升。
[0053] 2、發(fā)酵液中硫酸多黏菌素B的提取精制
[0054] 將得到的誘變多黏菌素B菌種的發(fā)酵液進行過濾、大孔型離子交換樹脂處理、解吸液脫色、大孔層析樹脂處理、解吸液堿結(jié)晶、溶解轉(zhuǎn)鹽、納濾濃縮、噴霧干燥，得到硫酸多粘菌素B。本發(fā)明中大孔型離子交換樹脂包括D110、D113、D001、D151、SP112、NKC-9等型號樹脂。具體過程如下：
[0055] (1)用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至2.5-3.5(本實施例中為3.0)，攪拌30min-60min(本實施例中為40min)，降溫至10-15℃(本實施例中為10℃)。過濾(優(yōu)選100-200nm孔徑的陶瓷膜，本實施例中選用200nm)，收集濾液。該步驟收率控制在85％-95％。
[0056] (2)將步驟(1)的濾液用1-2M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)PH至6.0-6.5(本實施例中為6.4)，上D001大孔型離子交換樹脂柱吸附，上柱完成后丟棄上柱透過液，用4-6倍樹脂體積的純化水洗柱，然后用0.2mol/L的硫酸溶液進行解吸，直至流出液小于1500單位停止解吸，得解吸液。該步驟收率控制在85％-92％。
[0057] (3)步驟(2)的解吸液升溫至40-50℃(本實施例中為42℃)，加入活性炭，保溫攪拌30-60min(本實施例中為40min)，過濾，得到硫酸多黏菌素B脫色液。該步驟收率90％-95％。
[0058] (4)將步驟(3)中得到的硫酸多黏菌素B脫色液上HP20ss大孔層析樹脂吸附上柱完成后丟棄上柱透過液，用4-6倍樹脂體積的純化水洗柱。然后用30％-50％的乙醇水溶液進行解吸，直至流出液小于1500單位停止解吸，得解吸液。該步驟收率87％-92％。
[0059] (5)將步驟(4)得到的解吸液降溫至5-10℃，用2mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至12.5-13.0，然后升溫至20-25℃，升溫后繼續(xù)攪拌1-2h，過濾，濾餅用適量純化水洗滌3次，得到多黏菌素B堿結(jié)晶。該步驟收率為90％-95％。
[0060] (6)用2mol/L的硫酸溶解多黏菌素B堿結(jié)晶，完全溶解后，最終調(diào)節(jié)pH至5.0-5.5，得到硫酸多黏菌素B溶解液。
[0061] (7)將硫酸多粘菌素B溶解液進行納濾濃縮，加壓泵壓力1.0-1.5MPa，頂洗0.5倍體積量的純化水，收集濃縮液，得到納濾濃縮后硫酸多黏菌素B溶液。
[0062] (8)將步驟(7)得到的硫酸多黏菌素B溶解液依次過5μm和0.45μm的濾芯，得到澄清過濾液，設(shè)置好噴霧干燥塔的進
風(fēng)溫度170-190℃，出風(fēng)溫度80-100℃，開始進溶解液進行噴干，收集噴干粉，最終得到高純度高含量的硫酸多黏菌素B噴干粉。該步驟收率為95％-99％。
[0063] 對硫酸多黏菌素B噴干粉的成分進行色譜分析，結(jié)果如圖4所示，通過對比多批次、不同來源噴干粉的全檢結(jié)果(見下表)，本發(fā)明所制備的硫酸多黏菌素B各項指標(biāo)均符合或者高于USP標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)品，與世界最高生產(chǎn)水平的阿爾法姆相比，本發(fā)明的總含量高(＞92％)、總雜低(＜8％)、灰分低，最大單雜含量相近，可以說本發(fā)明所制備的硫酸多黏菌素B整體質(zhì)量已達到世界最高水平。
[0064] 將標(biāo)準(zhǔn)品、阿爾法姆生產(chǎn)樣品以及本申請中的三個樣品通過全檢，進行質(zhì)量比對，結(jié)果如下表所示：
[0065] 批號 USP標(biāo)準(zhǔn) USP標(biāo)準(zhǔn)品 阿爾法姆 樣品1 樣品2 樣品3pH 5.0-7.5 5.9 6.1 5.8 6.0 6.1
干燥失重 7.0％ 3.8 3.5 2.0 2.3 2.6
熾灼殘渣 ≤0.75％ 0.38 0.36 0.25 0.13 0.20
硫酸鹽 15.5％-17.5％ 16.5％ 15.9％ 16.1％ 15.8％ 16.3％
重金屬 20ppm 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合規(guī)定
最大單雜 ≤3.0％ 2.88％ 2.17％ 2.26％ 2.16％ 2.35％
總雜 ≤17.0％ 15.17％ 10.44％ 5.37％ 6.76％ 7.11％
B3 ≤6.0％ 4.01％ 3.95％ 1.14％ 2.40％ 2.33％
B1-1 ≤15.0％ 7.91％ 8.36％ 9.58％ 12.73％ 11.00％
總含量 ≥80.0％ 88.1％ 87.0％ 94.5％ 94.1％ 92.5％
[0066] 本發(fā)明得到的硫酸多黏菌素B噴干粉總含量可達94.5％、總雜5.37％、最大單雜2.26％、B1為63.09％、B1-1為9.58％、B2為18.01％、B3為1.14％、硫酸鹽含量16.1％。
[0067] 經(jīng)過提取后，有效組分總比例達到94.63％，含量也達到94.5％。超出阿爾法姆的水平。
[0068] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何
修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
