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已知肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte?growth?factor：在本發(fā)明中， 以下略作HGF)作為具有促進肝細(xì)胞增殖活性的蛋白質(zhì)存在于各種動 物種之中，且據(jù)報道HGF具有不同的氨基酸序列。自大工原等人從急 性肝炎患者血漿中發(fā)現(xiàn)了人肝細(xì)胞生長因子(以下略作hHGF)(特開 平63-22526號公報)之后，喜多村等人闡明了hHGF蛋白質(zhì)的氨基酸 序列以及其編碼基因(cDNA)序列(特開平3-72883號公報)。另外 有文章報道了應(yīng)用此cDNA的hHGF蛋白的生產(chǎn)方法和轉(zhuǎn)化體(特開平 3-285693號公報)。在此背景下，有望實現(xiàn)hHGF蛋白的大規(guī)模生產(chǎn) 及作為醫(yī)藥產(chǎn)品的應(yīng)用。
hHGF是一種糖蛋白，它是由非還原狀態(tài)下分子量約為80-90KDa 或還原狀態(tài)下分子量約為52-56KDa的α亞基和分子量約為30-36KDa 的β亞基構(gòu)成的異二聚體。除具有肝細(xì)胞生長因子的活性之外，hHGF 還具有擴散因子(scatter?factor；SF)活性、腎小管上皮細(xì)胞生長 因子活性、損傷組織修復(fù)因子活性、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子活性等多 種生物活性，且該蛋白有望作為肝臟疾病治療藥、腎臟疾病治療藥、 腦神經(jīng)障礙治療藥、毛發(fā)生長促進劑、創(chuàng)傷治療藥、抗腫瘤治療藥等 進行開發(fā)。
關(guān)于HGF的藥物制劑，WO90/10651公報、特開平6-247872號公 報以及特開平9-25241號公報均有報道。在上述WO90/10651公報中 報道了和HGF的比較缺失5個氨基酸殘基的缺失型HGF(TCF)的水性 制劑，并指出白蛋白、人血清、明膠、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等 能夠穩(wěn)定水溶液中的TCF。特開平6-247872號公報報道了通過將TCF 與堿性氨基酸等共存，制備出含有5-10mg/mL的高濃度TCF的注射 液。該刊物談及了TCF在水溶液中的溶解性，并報道了含有高濃度TCF 的水溶液，其中使用了堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸)作為注射劑的 “助溶劑”。
可是，HGF的水溶液制劑在中性pH時HGF的溶解性急劇降低，而 在低溫或者室溫保存數(shù)日時該制劑存在出現(xiàn)凝集、白色混濁、凝膠化 的問題。另外，該制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性低，例如形成降解產(chǎn)物和聚 集體；并且作為藥物制劑也不是很穩(wěn)定，例如生物活性降低。因此從 生物活性的角度來說，該制劑不適合長期保存。再者，HGF的水溶液 制劑在振動攪拌后產(chǎn)生的發(fā)泡等可引起凝集、白色混濁、凝膠化，進 而長期保存、銷售及搬運時會造成藥物制劑的品質(zhì)下降，藥效減低。 因此HGF制劑以凍干制劑為佳。
特開平9-25241號公報報道了HGF(TCF)的凍干制劑，但是與本 發(fā)明不同，該公報中闡述了用檸檬酸鹽作為緩沖液，以甘氨酸、丙氨 酸、山梨糖醇、甘露醇等作為穩(wěn)定劑，制備長期穩(wěn)定的高濃度HGF(TCF) 凍干制劑的方法。不過，該凍干制劑中由于將檸檬酸作為緩沖液，再 溶解后制劑的pH為酸性條件。其結(jié)果溶液的高滲透壓高，并可導(dǎo)致 注射給藥時產(chǎn)生疼痛、給藥部位出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和溶血現(xiàn)象等問題。
HGF作為具有極強生理活性的物質(zhì)，作為醫(yī)藥使用時，需要為臨 床提供極低濃度的藥物制劑。據(jù)本發(fā)明者等人的研究，特開平9-25241 號公報記載的含有甘氨酸以及丙氨酸的HGF(TCF)凍干制劑中，由含有 高濃度HGF的水溶液制得的凍干制劑，保存時生成的聚集體少，而適 于臨床應(yīng)用的含有低濃度HGF(一般情況下，HGF的濃度不超過 5mg/mL，例如2mg/mL的程度。)的水溶液，在甘氨酸和丙氨酸存在 的情況下凍干所得的制劑在保存時出現(xiàn)了聚集體。因此，特開平9- 25241號公報上所記載的甘氨酸和丙氨酸作為高濃度HGF凍干時使用 的穩(wěn)定劑很有效，但是作為低濃度HGF凍干時使用的穩(wěn)定劑效果不 佳。因此需要開發(fā)出由低濃度HGF的水溶液制備不易生成聚集體，且 長期保存穩(wěn)定性優(yōu)良的凍干制劑的制備方法。

本發(fā)明的課題是提供可制備含低濃度HGF的水溶液的HGF凍干制 劑。更具體地說，本發(fā)明的課題是提供一種HGF凍干制劑，該HGF凍 干制劑具有優(yōu)良的保存穩(wěn)定性，再溶解時不出現(xiàn)凝集、白色混濁、凝 膠化等現(xiàn)象。另外，提供凍干時具有良好的結(jié)塊形成性、且具有優(yōu)良 的再溶解性的凍干制劑也是本發(fā)明的研究課題。除此以外，提供具有 注射劑適宜的pH和滲透壓比的上述制劑也是本發(fā)明的研究課題。
本發(fā)明者等人為解決上述課題進行了悉心研究，結(jié)果表明將濃度 不超過5mg/mL的HGF，在穩(wěn)定劑、氯化鈉、以及緩沖劑存在的條件 下進行凍干，能夠制備出結(jié)塊形成性、溶解性、長期保存穩(wěn)定性良好 的凍干制劑，并且在該凍干制劑制備過程中以及凍干制劑的保存過程 中不生成聚集體，以及該凍干制劑具有極高的穩(wěn)定性。另外，發(fā)現(xiàn)由 此凍干制劑制備的水溶液不產(chǎn)生凝集、白色混濁、凝膠化等現(xiàn)象，以 及這種含低濃度HGF的水溶液在臨床能夠充分發(fā)揮藥效。本發(fā)明是基 于以上發(fā)現(xiàn)而完成的。
即，本發(fā)明提供：
含有肝細(xì)胞生長因子、阻止肝細(xì)胞生長因子生成聚集體的穩(wěn)定 劑、氯化鈉、以及緩沖劑的凍干制劑，且該凍干制劑是從肝細(xì)胞生長 因子濃度不超過5mg/mL的水溶液制備得到的制劑；
含有肝細(xì)胞生長因子、阻止肝細(xì)胞生長因子生成聚集體的穩(wěn)定 劑、氯化鈉、以及緩沖劑的凍干制劑，且該凍干制劑可用于制備再溶 解后肝細(xì)胞生長因子的濃度不超過5mg/mL的水溶液；以及，
含有肝細(xì)胞生長因子、阻止肝細(xì)胞生長因子生成聚集體的穩(wěn)定 劑、氯化鈉、以及緩沖劑的凍干制劑，且該凍干制劑是從肝細(xì)胞生長 因子濃度不超過5mg/mL的水溶液中制備得到，以及該凍干制劑可用 于制備再溶解后肝細(xì)胞生長因子的濃度不超過5mg/mL的水溶液。
這些HGF凍干制劑在凍干時以及凍干后的長期保存過程中，不生 成HGF的聚集體，且具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。另外，這些凍干制劑具有由 凍干制劑制備的水溶液不產(chǎn)生凝集、白色混濁、凝膠化等現(xiàn)象，甚至 在保存該水溶液時也難以生成聚集體的特征。
通常情況下，希望用于在小瓶中制備凍干制劑的水溶液與將得到 的凍干制劑在小瓶中溶解并制備的水溶液中含有同濃度的有效成 分。因此，優(yōu)選將HGF濃度不超過5mg/mL的水溶液在小瓶中或在安 瓿瓶中凍干而制備本發(fā)明的制劑。并且，本發(fā)明的制劑在凍干前和/ 或再溶解后的水溶液的pH優(yōu)選在注射劑適宜的5到6.5范圍，再者， 本發(fā)明的制劑在凍干前和/或再溶解后的水溶液優(yōu)選具有注射劑適宜 的滲透壓，例如與生物體幾乎等滲或注射劑允許的滲透壓比(1～2)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明提供穩(wěn)定劑是從精氨酸、賴氨 酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖類、 及它們的可藥用鹽構(gòu)成的組中選出的上述HGF凍干制劑；穩(wěn)定劑是從 精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu) 成的組中選出的上述HGF凍干制劑；穩(wěn)定劑是從精氨酸、賴氨酸、 組氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu)成的組中選出的上述HGF凍干制劑；穩(wěn) 定劑是從精氨酸、賴氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu)成的組中選出的上述 HGF凍干制劑。這些穩(wěn)定劑優(yōu)選按凍干時和/或凍干后保存時可防止生 成HGF聚集體的充分有效的用量，在上述制劑中配合使用。
另外，根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選方案，本發(fā)明提供磷酸鹽作為緩沖 劑的上述HGF凍干制劑，進而還含有表面活性劑的上述HGF凍干制 劑；表面活性劑為非離子性表面活性劑的上述HGF凍干制劑；非離子 性表面活性劑為聚氧乙烯醚類表面活性劑的上述凍干制劑。
根據(jù)其它的觀點，本發(fā)明提供將HGF濃度不超過5mg/mL的水溶 液進行凍干時所用的HGF穩(wěn)定劑，它是從精氨酸、賴氨酸、組氨酸、 谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖類、及它們的可 藥用鹽構(gòu)成的組中選出的穩(wěn)定劑。優(yōu)選從精氨酸、賴氨酸、組氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu)成的組中選出的穩(wěn)定劑，特 別優(yōu)選從精氨酸、賴氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu)成的組中選出的穩(wěn)定 劑。這些穩(wěn)定劑可防止HGF濃度不超過5mg/mL的水溶液在凍干時及 凍干后保存時HGF聚集體的生成。
其次，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還提供可由凍干含有上述穩(wěn)定劑和HGF 濃度不超過5mg/mL的水溶液而得到的，用于制備再溶解后HGF濃度 不超過5mg/mL的水溶液的HGF凍干制劑。上述凍干制劑優(yōu)選的制劑 可通過將含有穩(wěn)定劑(優(yōu)選從精氨酸、賴氨酸、及它們的可藥用鹽構(gòu) 成的組中選出的穩(wěn)定劑)、濃度不超過5mg/mL的HGF、氯化鈉、以及 緩沖劑的水溶液在小瓶中進行凍干而得到。
實施發(fā)明的最佳方案
對于本發(fā)明的凍干制劑中所含HGF的種類沒有特殊的限定。例 如，天然HGF可從已知為含有HGF的人或大鼠等哺乳動物來源的體液 和組織，或由能自發(fā)產(chǎn)生HGF的細(xì)胞中分離得到。但也可應(yīng)用通過基 因重組手段將該生長因子的cDNA導(dǎo)入細(xì)胞而得到的重組HGF.作為生 成重組HGF的宿主，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、絲狀菌、植物 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等。重組HGF的具體例子為，例如從上述 哺乳動物來源的胎盤，肝病患者的肝組織及血液，MRC-5細(xì)胞、IMR- 9細(xì)胞等纖維原細(xì)胞株獲得，或按特開平3-285693號公報所記載的方 法，將含有編碼hHGF的cDNA的表達載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞等宿主的HGF 生成株等獲得。
此外，作為HGF也可以應(yīng)用具有信號序列的蛋白質(zhì)等前體蛋白 質(zhì)，在不損傷肝細(xì)胞增殖活性的范圍內(nèi)一部分氨基酸發(fā)生置換、缺 失、和/或插入的修飾蛋白，或缺失或置換了糖基的改變蛋白。作為 改變蛋白，例如記載于特開平2-288899號公報、WO90/10651號公報、 特開平3-130091號公報、特開平3-255096號及4-30000號公報、 Nature，342，440-443(1989)等。
作為本發(fā)明的凍干制劑優(yōu)選應(yīng)用的HGF，例如具有以下的物理化 學(xué)性質(zhì)的蛋白因子。HGF優(yōu)選人源的HGF，特別優(yōu)選具有特開平3- 72883號公報和特開平4-89499號公報所記載氨基酸序列的HGF.
1)用SDS-PAGE(非還原條件下)測定的分子量約為76,000- 92,000，
2)具有肝細(xì)胞增殖活性，以及
3)對肝素具有很強的親和性。
進一步優(yōu)選的HGF，除具有上述物理化學(xué)性質(zhì)外，還有以下性質(zhì)：
4)80℃，10分鐘加熱處理，失去上述活性，以及
5)用胰蛋白酶進行消化處理或用胰凝乳蛋白酶進行消化處理，失 去上述活性。
在含有HGF、緩沖劑、和氯化鈉三種成分的HGF凍干制劑(記載 于特開平6-247872號公報以及特開平9-25241號公報；HGF的濃度 為5～20mg/mL)中，如果為避免產(chǎn)生HGF的沉淀等問題而降低HGF 的含量，則在凍干步驟中存在不能得到良好的結(jié)塊的問題。進而，將 上述三種成分構(gòu)成的凍干制劑再溶解的水溶液發(fā)生凝集、白色混濁、 凝膠化，并因此存在不能具有很好的物理化學(xué)穩(wěn)定性的問題。因此， 為了制備凍干后具有良好的結(jié)塊形狀、且可配制長期保存穩(wěn)定性優(yōu)良 的水溶液的凍干制劑，以改善結(jié)塊形成性和在水溶液中的保存穩(wěn)定性 為目的而加入添加劑是必須的。
本發(fā)明的凍干制劑由HGF濃度不超過5mg/mL的水溶液制備，和/ 或由凍干制劑制備的水溶液中HGF濃度不超過5mg/mL。該凍干制劑優(yōu) 選制備成凍干前和/或再溶解后的水溶液具有與注射劑適宜的pH、與 生物體幾乎等滲或具有注射劑所允許的滲透壓比(1～2)。本發(fā)明的 凍干制劑具有保存穩(wěn)定性優(yōu)良的特征。此外還具有以下特征：通過凍 干步驟能夠形成良好的凍干結(jié)塊，將凍干制劑再溶解后的水溶液中沒 有凝集、白色混濁、凝膠化等問題，因此具有很好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。 進而應(yīng)用于臨床時，能夠充分發(fā)揮出預(yù)期的藥理作用。
作為穩(wěn)定劑，例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸，肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、 硫酸角質(zhì)素、硫酸葡聚糖等硫酸多糖類，及這些物質(zhì)的可藥用鹽。作 為可藥用鹽，例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽等。這些穩(wěn)定劑可以兩種以 上組合使用。作為優(yōu)選的穩(wěn)定劑，例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷 氨酸、天冬氨酸等。其中特別優(yōu)選精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或它們 的組合。穩(wěn)定劑的添加量只要是能夠保證HGF的保存穩(wěn)定性的量，就 沒有特別的限定，相對于HGF的重量，優(yōu)選0.01～100倍的重量，最 優(yōu)選0.1～30倍的重量。
緩沖劑只要具有調(diào)節(jié)凍干前及再溶解后的水溶液的pH，保持HGF 的溶解性的作用，就沒有特別限制。例如，可應(yīng)用磷酸緩沖液、檸檬 酸緩沖液、醋酸緩沖液等。緩沖劑優(yōu)選使用磷酸緩沖液，特別優(yōu)選使 用磷酸鈉緩沖液。緩沖劑的添加量，例如相對于再溶解后的水量，為 1～100mM的程度。
氯化鈉雖然能夠提高凍干前及再溶解后的水溶液中HGF的溶解 度，但是添加到必要量以上時會導(dǎo)致滲透壓升高。一般情況下，優(yōu)選 按達到和生物體等滲的滲透壓的量添加，特別優(yōu)選注射劑的滲透壓比 所允許的滲透壓比1～2，例如優(yōu)選相對于再溶解后的水量為140mM 的程度。
因為中性pH與HGF的等電點(pI＝7～8)重疊，HGF在中性pH 時存在溶解度急劇減低的問題。例如，含有140mM氯化鈉的10mM磷 酸鈉緩沖液(PBS；室溫)的pH在7.0～7.5附近時，HGF的溶解度 稍低于1.0mg/mL，而在pH5.0附近HGF的溶解度在5mg/mL或以上， 并且HGF在pH低時溶解度變高。此外，當(dāng)氯化鈉的濃度為0.14M時， HGF的溶解度是1mg/mL的程度，0.3M或以上時，HGF以5mg/mL或以 上的濃度溶解。因此，為使HGF的溶解度上升，或可考慮將pH調(diào)至5 或以下的酸性條件，也可考慮將氯化鈉濃度提高到0.3M或以上。優(yōu) 選將本發(fā)明的制劑凍干前和/或再溶解后的水溶液的pH調(diào)節(jié)至弱酸性 范圍、具體指pH4.0～6.5，優(yōu)選調(diào)整pH為5.0～6.5。在這樣的pH 范圍里，能夠抑制聚集體的生成。
在本發(fā)明的HGF凍干制劑中優(yōu)選再添加表面活性劑。HGF易吸附 于玻璃和樹脂等容器材質(zhì)上，特別在低濃度時，HGF向容器的吸附會 導(dǎo)致給藥藥液中的藥物含量的降低。通過加入表面活性劑，能夠防止 再溶解后的HGF吸附于容器。作為表面活性劑，例如聚山梨醇酯80、 聚山梨醇酯20、HCO-40、HCO-60、普盧蘭尼可(Pluronic)F-68、 聚乙二醇等非離子表面活性劑，也可以將它們兩種以上組合應(yīng)用。表 面活性劑最優(yōu)選使用聚氧乙烯醚表面活性劑(聚山梨醇酯80等)。 表面活性劑的添加量，例如相對于再溶解后的水重量為0.001～2.0％ 的范圍。
本發(fā)明的HGF凍干制劑可通過用通常方法凍干含有HGF的水溶液 來制備。例如將HGF、穩(wěn)定劑、氯化鈉、以及緩沖劑溶解于注射用蒸 餾水中，根據(jù)需要添加表面活性劑后，過濾除菌，分裝在小瓶或者安 瓿瓶等容器進行凍干。本發(fā)明的HGF凍干制劑可以含有制劑化所必要 的其它的添加劑、例如抗氧化劑、防腐劑、賦形劑、鎮(zhèn)痛劑等。作為 凍干的方法，例如由以下三個單元操作組成的方法 (Pharm.Tech.Japan，8(1)，75-87.1992)。
(1)常壓下冷卻凍結(jié)的凍結(jié)過程；
(2)減壓下，升華干燥不被溶質(zhì)限制的自由水的一次干燥過程；
(3)除去溶質(zhì)固有的吸附水和結(jié)晶水的二次干燥過程；
但本發(fā)明的凍干制劑的制備方法并不僅限于上述方法。本發(fā)明的 凍干制劑在使用時，可加入注射用蒸餾水等溶劑進行溶解，但HGF的 濃度不要超過5mg/mL。
實施例
以下列舉實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實施 例。
例1：低濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有140mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸緩沖 液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過濾除菌后，得 到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小瓶中填充2mL， 按表1所示的條件進行凍干，可得到低濃度HGF凍干制劑。表中的 “→”表示溫度的變化。
表1
????????????凍結(jié)過程??????????一次干燥過程??????二次干燥過程
溫度(℃)????20→-40???-40?????-40→-20??-20?????-20→20???20
時間(Hr)????????1???????5????????3???????48?????????2?????24
壓力(mmHg??)??760??????760?????＜1??????＜1???????＜1????＜1
例2：低濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有140mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸緩沖 液(pH6.5)加熱溶解HGF，并使HGF終濃度為5mg/mL，過濾除菌后， 得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小瓶中填充 2mL，按表1所示的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干割劑。
例3：高濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為10mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，按表1所示的條件進行凍干，得到高濃度HGF凍干制 劑。
例4：低濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有300mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的檸檬酸緩 沖液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過濾除菌后， 得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小瓶中填充 2mL，按表1所示的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干制劑。
例5：低濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有300mM氯化鈉、5％甘氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的檸檬酸緩沖液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過 濾除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每 小瓶中填充2mL，按表1所示的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干 制劑。
例6：低濃度HGF凍干制劑的制備(比較例)
用含有300mM氯化鈉、5％丙氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的檸檬酸緩沖液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過 濾除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每 小瓶中填充2mL，按表1所示的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干 制劑。
例7：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸的10mM的磷酸緩沖液 (pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過濾除菌后，得到 HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小瓶中填充2mL， 采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干制 劑。使用這一制劑時，將此制劑溶解于2mL注射用蒸餾水中制備得到 含有1mg/mL濃度的HGF，并具有注射劑所允許的pH以及滲透壓比 (1.5；幾乎等滲)的注射液。
例8：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃 度HGF凍干制劑。
例9：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為2mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃 度HGF凍干制劑。
例10：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為3mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃 度HGF凍干制劑。
例11：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為4mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃 度HGF凍干制劑。
例12：低濃度凍干制劑的制備(比較例)
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為5mg/mL，過濾 除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶液的pH后，無菌條件下在每小 瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件相同的條件進行凍干，得到低濃 度HGF凍干制劑。
例13：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用10mM的磷酸緩沖液(pH6.0)代替10mM的磷酸緩 沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，得到低濃度HGF 凍干制劑。
例14：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用10mM的磷酸緩沖液(pH5.5)代替10mM的磷酸緩 沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，得到低濃度HGF 凍干制劑。
例15：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用10mM的磷酸緩沖液(pH5.0)代替10mM的磷酸緩 沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，得到低濃度HGF 凍干制劑。
例16：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用10mM的磷酸緩沖液(pH7.2)代替10mM的磷酸緩 沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，得到低濃度HGF 凍干制劑。
例17：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用10mM的磷酸緩沖液(pH7.0)代替10mM的磷酸緩 沖液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF終濃度為1mg/mL，得到低濃度HGF 凍干制劑。
例18：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用50mM的精氨酸代替100mM的精氨酸，得到低濃度 HGF凍干制劑。
例19：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用賴氨酸代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例20：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用組氨酸代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例21：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用谷氨酰胺代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例22：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用半胱氨酸代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例23：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用脯氨酸代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例24：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用谷氨酸鈉代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例25：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用天冬氨酸鈉代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例26：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用甘氨酸代替精氨酸，得到低濃度HGF凍干制劑。
例27：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
在例8中，用每小瓶5mL填充量代替每小瓶2mL填充量，得到低 濃度HGF凍干制劑。
例28：低濃度凍干制劑的制備(本發(fā)明)
用含有140mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸鈉緩 沖液(pH6.5)中溶解硫酸葡聚糖鈉使其終濃度至50mg/mL，并溶解 HGF使其終濃度至1mg/mL，過濾除菌后，得到HGF水溶液。調(diào)節(jié)此溶 液的pH后，無菌條件下在每小瓶中填充2mL，采用與例1凍干條件 相同的條件進行凍干，得到低濃度HGF凍干制劑。
試驗例1：有關(guān)HGF溶解度的評價
(1)HGF溶解度的評價方法
在聚丙烯制試管中稱量HGF，加入含有各種濃度的氯化鈉以及穩(wěn) 定劑、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸鈉緩沖液后，立即把試管在 恒溫保持24小時，使HGF溶解。溶解后立即進行離心分離 (15,000rpm、10分鐘、恒溫)，將HGF飽和溶液和未溶解的HGF完 全分離，并將上清作為試樣。用低蛋白吸附性的濾膜Millipore?GV (親水性Durapore；0.22μm)過濾，用HPLC法(凝膠過濾法)定 量測定得到的飽和溶液中的HGF濃度，以計算HGF的飽和溶解度。
HPLC的分析條件
柱：TOSOH?TSK?G-3000SWXL(φ0.78×30cm)
流速：0.3mL/分鐘
檢測波長：OD?280nm
溫度：30℃
流動相：0.3M?NaCl，50mM磷酸鈉，0.1％SDS，pH7.5
上樣量：50μl
HGF的保留時間：24.0分鐘
(2)pH對HGF溶解度的影響
用含有140mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸鈉緩 沖液配制pH不同的溶液，在4℃以及20℃按(1)的方法檢測HGF的 溶解度，其結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可以看到，隨著pH的降低，HGF 的溶解度緩慢增加，pH5.0或以下溶解度顯著上升。并且在任何情況 下，隨著溫度上升，溶解度也相應(yīng)增加。
表2
?????????20℃???4℃
pH7.5????0.8????0.4
pH7.0????1.8????1.0
pH6.0????2.3????1.3
pH5.0????5.9????4.2
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
(3)氯化鈉濃度對HGF溶解度的影響
配制含有不同濃度的氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸 鈉緩沖液(pH7.5)，在4℃以及20℃按(1)的方法檢測HGF的溶解 度，其結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可以看到，隨著氯化鈉濃度的上升， HGF的溶解度顯著增加。并且在任何情況下，隨著溫度上升，溶解度 也相應(yīng)增加。
表3
???????????????20℃?????4℃
未添???????????0.3??????0.1
+140mM?NaCl????0.8??????0.4
+230mM?NaCl????3.2??????1.4
+300mM?NaCl????8.5??????4.0
+900mM?NaCl????＞190????-
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
(4)各種穩(wěn)定劑對HGF溶解度的影響
在此，研究了各種藥品添加劑對HGF溶解度的影響。用含有不同 濃度的添加劑、140mM氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的磷酸鈉緩沖 液(pH6.8～7.5)溶解HGF，并使HGF的終濃度為1mg/mL，得到HGF 水溶液。在96孔微量滴定板每孔分別加入200μL，4℃保存48小時 后，通過平板測定儀(plate?reader)測定OD450nm，以求得HGF水 溶液的濁度。結(jié)果表明，隨著HGF溶解度降低導(dǎo)致的HGF的凝集和沉 淀，溶液的濁度上升。
對于添加物，如20種L-氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸鈉、谷氨酸鈉、半胱 氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸)、7種糖類(甘露醇、果糖、海藻 糖、葡萄糖、山梨醇糖、蔗糖、乳糖)、三種高分子類(硫酸葡聚糖、 葡聚糖、PEG)、三種蛋白質(zhì)(人血清白蛋白、酸性明膠、堿性明膠)、 三種表面活性劑(聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、HCO-40、HCO-60) 對HGF溶解度的影響進行研究的結(jié)果表明，下述物質(zhì)對HGF溶解度的 保持具有穩(wěn)定作用。
①氨基酸類：精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸鈉、天冬氨酸鈉、谷 氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸(0.05M時具有效果)
②多糖類：硫酸葡聚糖(0.1％時具有效果)
對于有顯著效果的氨基酸，配制含有不同濃度的氨基酸、140mM 氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，于4 ℃按(1)的方法檢測HGF的溶解度，其結(jié)果如表4所示。
表4
?????????????????飽和溶解度??滲透壓比
無添加劑?????????1.0????????????1.0
+L-Arg???50mM????7.3????????????1.3
+L-Lys???50mM????4.5????????????1.3
+L-His???50mM????3.2????????????1.2??
+L-GluNa?50mM????2.2????????????1.3
+L-Arg???100mM???＞10???????????1.6
+L-Lys???100mM???＞10???????????1.6
+L-His???100mM???4.8????????????1.4
+L-GluNa?100mM???3.2????????????1.6
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
試驗例2
凍干前后的HGF水溶液的性狀
為了測定凍干過程中HGF的物理穩(wěn)定性的變化，將凍干前的HGF 水溶液以及凍干后直接用純化水再溶解的HGF水溶液于4℃保存24 小時后，目測觀察溶解后的溶液的性狀(混濁)。同時也對凍干制劑 再溶解所需的時間以及滲透壓比進行測定。其結(jié)果如表5所示。
對于實施例1及實施例22的凍干制劑，將凍干制劑再溶解后于 4℃保存24小時時，出現(xiàn)了白色混濁，而其它實施例的制劑的性狀表 現(xiàn)穩(wěn)定。
表5
制劑?????凍干前的水溶液??再溶解后的水溶液????滲透壓比
實施例1????白色混濁??????即刻溶解、白色混濁????1.0
實施例4????澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????2.0
實施例5????澄清透明????????難溶、澄清透明??????4.0
實施例6????澄清透明????????難溶、澄清透明??????3.9
實施例8????澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.5
實施例19???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.6
實施例20???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.4
實施例21???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.3
實施例22???澄清透明????????難溶、白色混濁??????1.7
實施例23???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.3
實施例24???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.5
實施例25???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.5
實施例26???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.3
實施例28???澄清透明??????即刻溶解、澄清透明????1.3
試驗例3
凍干制劑溶解后的性狀
將實施例中制備的凍干制劑凍干之后，立即于25℃、40℃、50℃ 保存1個月，然后測定再溶解所需的時間、再溶解后溶液的性狀(混 濁)。用純化水溶解凍干制劑，于室溫進行性狀評價。其結(jié)果如表6 所示。
于25℃保存時，對于實施例22的制劑，凍干制劑再溶解后立刻 產(chǎn)生白色混濁，而其它實施例的制劑的性狀均表現(xiàn)穩(wěn)定。于40℃以及 50℃保存時，實施例1、22、23、24和25的制劑溶解后立刻產(chǎn)生白 色混濁，而其它實施例的制劑的性狀均表現(xiàn)穩(wěn)定。
??????????????????????????????????表6
??制劑?????????????????????????????1個月的保存品
???????????????????25℃?????????????????40℃????????????????50℃
實施例1????即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、白色混濁??即刻溶解、白色混濁
實施例4????即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例5???????難溶、澄清透明???????難溶、澄清透明??????難溶、澄清透明
實施例6???????難溶、澄清透明???????難溶、澄清透明??????難溶、澄清透明
實施例8????即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例19???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例20???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例21???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例22??????難溶、白色渾濁????????難溶、白色混濁??????難溶、白色混濁
實施例23???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、白色混濁??即刻溶解、白色混濁
實施例24???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、白色混濁??即刻溶解、白色混濁
實施例25???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、白色混濁??即刻溶解、白色混濁
實施例26???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
實施例28???即刻溶解、澄清透明????即刻溶解、澄清透明??即刻溶解、澄清透明
試驗例4
凍干制劑中聚集體含量變化
對于實施例中制備的凍干制劑，測定凍干后(原始值)、以及25℃、 40℃、50℃保存1個月后的凍干制劑中聚集體含量與HGF含量的比。 在此使用了試驗例1(1)的方法(凝膠過濾法)。其結(jié)果如表7以 及表8所示。
聚集體的保留時間：20.4分鐘，21.8分鐘
HGF的保留時間：24.0分鐘
盡管觀察到隨著保存溫度的上升，聚集體生成增加的傾向，但是 實施例8、19以及20的凍干制劑卻極少生成聚集體，并且物理化學(xué) 性質(zhì)穩(wěn)定。由測定結(jié)果可知，添加精氨酸、賴氨酸以及組氨酸后，即 使高溫保存，也僅生成很少的聚集體(聚集體生成率：40℃時約3％ 或以下，50℃時約5-9％或以下)，并且保存穩(wěn)定性提高。此外，用 除了不含有精氨酸以外、由同樣的成分和方法制備的實施例1的凍干 制劑作為比較例進行了同樣的試驗，結(jié)果表明隨著溫度的上升，聚集 體的生成大幅度增加。
再者，如表8中所示，通過將HGF濃度低濃度化(不超過5mg/mL)， 能夠促進聚集體的生成并導(dǎo)致保存穩(wěn)定性降低。如特開平9-25411 號公報記載，將甘氨酸和丙氨酸作為凍干制劑的穩(wěn)定劑應(yīng)用時，與高 濃度HGF凍干制劑(特開平9-25411號公報的實施例5和6： 20mg/mL)相比，可知低濃度HGF凍干制劑(實施例5、6和26：1mg/mL) 中聚集體生成被促進，以及保存穩(wěn)定性降低。
另一方面，測定結(jié)果還表明，對于應(yīng)用精氨酸、賴氨酸及組氨酸 作為凍干制劑的穩(wěn)定劑的實施例8、19及20的凍干制劑，即使在低 濃度HGF凍干制劑(1mg/mL)中也顯著抑制了聚集體的生成，并提高 了保存穩(wěn)定性。
????????????????????表7
制劑???????????????1個月的保存品
???????????原始值???25℃????40℃????50℃
實施例1?????0.48????5.50????24.27???40.63
實施例4?????0.35????0.48????3.80????11.24
實施例5?????0.31????0.69????4.40????9.58
實施例6?????0.30????0.54????3.20????9.53
實施例8?????0.30????0.11????0.18????0.60
實施例19????0.31????0.16????1.74????4.48
實施例20????0.31????0.18????0.28????0.88
實施例21????0.31????0.54????2.77????16.89
實施例22????-???????-???????-???????-
實施例23????0.32????0.31????3.24????11.24
實施例24????0.32????2.19????4.90????6.39
實施例25????0.34????1.11????4.80????7.73
實施例26????0.36????0.33????6.21????22.66
實施例28????2.74????3.48????13.30???32.87
實施例1*??1.07????6.17
實施例5*??0.92????4.09
實施例6*??0.93????2.90
實施例9*??1.78????14.01
*引用于特開平9-25241號公報的表4和表6
???????????表8
????制劑??????50℃保存1個月的凍干制劑的
????????????????聚集體含量/HGF含量
[不含氨基酸的制劑]
實施例1(HGF?1mg/mL)??????40.63
實施例4(HGF?1mg/mL)??????11.24
實施例9*(HGF?10mg/mL)????14.01
實施例1*(HGF?20mg/mL)????6.1?7
[含有甘氨酸的制劑]
實施例5(HGF?1mg/mL)??????9.58
實施例5*(HGF?20mg/mL)????4.09
[含有丙氨酸的制劑]
實施例6(HGF?1mg/mL)??????9.53
實施例6*(HGF?20mg/mL)????2.90
*引用于特開平9-25241號公報的表4和表6
試驗例5
凍干制劑中聚集體含量變化-pH對聚集體生成的影響
對于實施例8、13、14、16和17中制備的具有不同pH的凍干制 劑，立即測定凍干后(原始值)和50℃保存1個月、2個月、3個月 后的凍干制劑中含有的聚集體含量和HGF含量的比值。在此使用試驗 例1(1)的方法(凝膠過濾法)。其結(jié)果如表9所示。
聚集體的保留時間：20.4分鐘，21.8分鐘
HGF的保留時間：24.0分鐘
由測定結(jié)果可知，pH分別為7.0和7.2的實施例16和17的凍 干制劑在50℃保存時，隨著時間的延續(xù)，聚集體的生成增多；而pH 在6.5或以下的實施例8、13和14的制劑中聚集體生成少，在弱酸 性pH區(qū)域可使穩(wěn)定性提高。
?????????????????????????表9
制劑?????????????????????????50℃保存品
?????????????????原始值??保存1個?月保存2個月??保存3個月
實施例14(pH5.5)??0.48????0.38????0.56?????????0.76
實施例13(pH6.0)??0.35????0.91????0.51?????????1.31
實施例8(pH6.5)???0.31????1.40????1.58?????????1.28
實施例17(pH7.0)??0.30????1.26????2.16?????????2.96
實施例16(pH7.2)??0.30????5.64????7.63?????????12.71
試驗例6
凍干制劑的生物活性變化(比活性)
實施例1、8制得的凍干制劑在25℃、50℃保存2個月，或在 10℃、25℃保存1.5年。將其凍干制劑再溶解后的水溶液的生物活性 按下述生物活性測定的方法進行測定。其結(jié)果如表10所示。
生物活性的測定方法
培養(yǎng)人肝細(xì)胞株P(guān)L℃/PRF/5至對數(shù)生長期，確認(rèn)細(xì)胞的生存率 后，制備成0.7×105細(xì)胞數(shù)/mL的細(xì)胞溶液。將HGF樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 添加到96孔試驗板(assay?plate)中，然后每孔添加100μL細(xì)胞溶 液，并按0.7×104細(xì)胞數(shù)/孔的量接種(n＝4)。在5％二氧化碳培養(yǎng)箱 中，37℃預(yù)培養(yǎng)20小時后，再加入[3H-胸苷]，繼續(xù)培養(yǎng)6個小時。 培養(yǎng)結(jié)束后，用Pharmacia公司的Beta?Plate?System回收細(xì)胞，并 測定攝入細(xì)胞內(nèi)的[3H]的量。用平行線檢測法校驗測定結(jié)果，并將HGF 樣品的比活性除以標(biāo)準(zhǔn)品的比活性，以求得效價(％)。
實施例8中添加精氨酸的凍干制劑即使高溫保存，生物活性也幾 乎沒有變化，具有穩(wěn)定的生物活性。此外，用除不含精氨酸以外，由 同樣成分和方法制備的實施例1的凍干制劑作為比較例進行相同的試 驗，觀察到隨著保存溫度的上升，生物活性大幅度降低。
???????????????????表10
???????????2個月的保存品???????1.5年的保存品
???????????25℃??????50℃??????10℃??????25℃
實施例1????64.5％????10.2％????-?????????-
實施例8????87.1％????71.0％????72.6％????66.1％
產(chǎn)業(yè)上的實用性
本發(fā)明的凍干制劑可用于制備臨床上有用的含有低濃度HGF的水 溶液，并且該制劑在凍干時及凍干后的保存時聚集體生成少，穩(wěn)定性 優(yōu)良。此外，該制劑還具有凍干時具有良好的結(jié)塊形成性，再溶解性 優(yōu)良的特征，進而可用于制備具有注射劑適宜的pH和滲透壓比的制 劑。