技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本
發(fā)明屬于
生物醫(yī)用材料的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于軟組織缺損修復(fù)的復(fù)合組織補片的制備方法。
背景技術(shù)
[0002] 軟組織的缺損、薄弱是臨床上常見問題，引起的原因有先天
缺陷、病理因素及衰老等，臨床表現(xiàn)為：疝、瘺、瘢痕及皺紋等。這類軟組織的缺損、薄弱通常無法自行修復(fù)，極大的影響到相應(yīng)器官組織的功能及外觀。目前臨床上主要依靠組織補片充填修復(fù)，因此對組織補片的研發(fā)已成為現(xiàn)代生物醫(yī)用材料的熱點之一。
[0003] 組織補片的種類很多，按材質(zhì)分類有：尼龍補片、聚丙烯補片、膨化聚四氟乙烯補片、生物補片、復(fù)合補片等。其中的非生物補片存在有
生物相容性較差、不能降解、影響術(shù)后
生活質(zhì)量等問題。近年來，進(jìn)入市場的生物補片多為異體/異種的脫細(xì)胞產(chǎn)品及其衍生產(chǎn)品，如：脫細(xì)胞人真皮、脫細(xì)胞
牛真皮等。單純的脫細(xì)胞材料因為在去除細(xì)胞的過程中也去除了大量的活性物質(zhì)，生物活性極大的降低；但通過對脫細(xì)胞方法的改進(jìn)，可有效提高脫細(xì)胞材料的生物活性，同時為了進(jìn)一步改善脫細(xì)胞材料的性質(zhì)，使其具備更好的生物相容性，實現(xiàn)一定的生理功能，復(fù)合補片成為研究的重點。
[0004] 中國
專利(200610027044.9)公開了一種人
成纖維細(xì)胞修飾的異體/異種脫細(xì)胞真皮替代物，是將成纖維細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)復(fù)合培養(yǎng)，使脫細(xì)胞真皮表面形成
單層或多層人成纖維細(xì)胞，改善了脫細(xì)胞真皮的親合性和活
力，用作真皮替代物。該方法的不足在于：所制備的真皮替代物，其應(yīng)用范圍僅限于
皮膚組織；該真皮替代物含有細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中容易產(chǎn)生免疫排斥，因此難以應(yīng)用于體內(nèi)組織的修復(fù)；另外，含細(xì)胞的補片制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，質(zhì)量難以控制，產(chǎn)業(yè)化
瓶頸尚未突破。
[0005] 中國專利(200610153403.5)公開了一種具有生物活性劑的外科補片，該補片具有釋放抗炎劑、抗血小板劑、抗凝劑、纖維蛋白溶解劑、細(xì)胞周期
抑制劑和/或抗增殖劑的功能；但其僅限于血管補片，并且只是采用簡單的藥物涂布方法制備，無法實現(xiàn)藥物的持續(xù)作用。
[0006] 經(jīng)檢索，到目前為止尚無一種補片可以完全滿足臨床應(yīng)用的要求。
發(fā)明內(nèi)容
[0007] 針對
現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合軟組織補片的制備方法，使所得軟組織補片不僅有修補填充的功能，還具有促進(jìn)
細(xì)胞增殖及分泌基質(zhì)的能力，臨床表現(xiàn)上生物相容性和組織重建效果更好。
[0008] 本發(fā)明所提供的復(fù)合軟組織補片制備方法，采用有經(jīng)脫細(xì)胞處理的真皮基質(zhì)，其特征在于，是將含有人
體細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球，混合于凝膠溶液中，再與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在
真空條件下復(fù)合，經(jīng)干燥滅菌后得到可用于人體軟組織修復(fù)的復(fù)合軟組織補片。所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可以來源于異種或是異體，具有天然的三維結(jié)構(gòu)，其孔隙率可達(dá)90％以上，有利于細(xì)胞長入，是一種性能良好的生物
支架材料。所述的人體細(xì)胞培養(yǎng)分泌物，為人體細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌的多種活性因子和基質(zhì)蛋白構(gòu)成的細(xì)胞營養(yǎng)因子；所培養(yǎng)的細(xì)胞是根據(jù)補片用途需要，可以是人體組織中各類型的細(xì)胞；收集這些細(xì)胞培養(yǎng)的分泌物，與微球復(fù)合成為含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球；所述的微球可采用甲基
丙烯酸縮
水甘油酯右旋糖酐、聚乳酸、聚羥基乙酸、或明膠的任一種或幾種的混合物制備而成。所制得的組織補片具有更高的生物活性，在植入人體三個月內(nèi)可緩慢釋放細(xì)胞培養(yǎng)分泌物促進(jìn)細(xì)胞增殖和基質(zhì)分泌，促進(jìn)組織重建，從而達(dá)到更好的臨床
治療效果。
[0009] 本發(fā)明復(fù)合軟組織補片制備方法的具體步驟包括：
[0010] 步驟一、制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)：取健康(人、豬、牛等)
哺乳動物的新鮮皮膚，洗凈后去除皮下脂肪組織及表皮，保留0.1mm～2mm厚的真皮層皮片，用去離子水分別和無菌PBS溶液清洗，于4℃去離子水浸泡充分溶脹；置于-80℃中冷凍30分鐘以上，至組織完全凍透后取出融化，可有效的破壞細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)容物暴露出來，便于下一步的清除，此凍融過程為至少一次；再采用W/V為0.1％～0.3％的胰蛋白酶溶液消化皮片，解除
膠原蛋白與其它蛋白間的連接，松散組織，便于
抗原蛋白的去除；用含有曲拉通100/200、脫
氧膽酸鈉或十二烷基
硫酸鈉的任一種或幾種混合的去垢劑溶液清洗皮片，除去大部分的抗原成分，尚留部分小
片段核酸；再用40～150U/ml的DNA酶溶液消化，去除殘留的DNA，隨著
溫度的增加可適當(dāng)縮短消化時間；用1M的NaOH溶液消蝕真皮皮片1h，以去除真皮中的病毒，保證所制備真皮基質(zhì)的使用安全；最后將皮片分別用PBS溶液和純水洗凈，經(jīng)
冷凍干燥、滅菌后，4℃保存?zhèn)溆茫凰玫降拿摷?xì)胞真皮基質(zhì)具有較高的生物活性和生物相容性，其孔隙率在90％以上。
[0011] 步驟二、制備細(xì)胞培養(yǎng)分泌物：收集細(xì)胞培養(yǎng)過程中更換下的培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)方法可參考《組織工程學(xué)原理與技術(shù)》(金巖第四軍醫(yī)大學(xué)出版社2004年出版)或是其他已有技術(shù)；通過
超濾方法濃縮(超濾柱可采用30K孔徑)，用去離子水清洗去鹽；采用蛋白純化儀去除牛血清蛋白，余留蛋白成分為含有所需細(xì)胞營養(yǎng)因子的細(xì)胞培養(yǎng)分泌物，過濾除菌后保存；
[0012] 步驟三、制備含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球：參考《生長因子生物
控釋促進(jìn)
牙周組織再生的實驗研究》(陳發(fā)明，博士論文)或是其他已有技術(shù)，微球材料可采用甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、聚乳酸、聚羥基乙酸、或明膠的任一種或二種的混合，所制備微球的粒徑為10nm～3um，經(jīng)凍干滅菌后，在無菌條件下用水溶液
吸附的方法，使1g微球中含有100～500mg的細(xì)胞培養(yǎng)分泌物，經(jīng)凍干后即得含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球；
[0013] 步驟四、制備復(fù)合軟組織補片：采用膠原、
纖維素、海藻酸、透明質(zhì)酸、或殼聚糖的任一種或任幾種混合物為原料，制備W/V為0.2～1.5％的凝膠溶液，在其中加入含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球，使細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的終濃度為50～200mg/ml，混勻后均勻覆涂于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)表面，在真空條件下使含有細(xì)胞培養(yǎng)分泌物微球的凝膠溶液充分滲透到脫細(xì)2
胞真皮的孔隙中，覆涂量為0.5～1ml/cm，干燥后即為復(fù)合軟組織補片。
[0014] 本發(fā)明復(fù)合軟組織補片的保存與使用：應(yīng)在0～8℃下保存；使用時將補片裁成所需大小置于無菌容器中，用10～50倍量的生理鹽水浸泡5～30min，可用于各種創(chuàng)面的封閉、軟組織缺損的修補及薄弱處的增強；補片碎片和裁剪剩余經(jīng)
粉碎后可采用注射方式用于各種細(xì)小軟組織薄弱或凹陷處的充填。
[0015] 本發(fā)明制備的復(fù)合軟組織補片保留了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)良好的三維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的附著提供了天然的三維空間；由于酶處理、去垢劑清洗及
堿處理等方法的聯(lián)合使用，有效去除了抗原成分，不會引起明顯的免疫排斥反應(yīng)；復(fù)合時所采用的凝膠可以促進(jìn)細(xì)胞的長入；緩釋微球中攜帶有大量的細(xì)胞生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分可促進(jìn)細(xì)胞增殖和基質(zhì)分泌；將緩釋微球吸附到脫細(xì)胞真皮的孔隙中可有效延長細(xì)胞分泌物的釋放時間，使細(xì)胞分泌物的作用更穩(wěn)定持久。本發(fā)明由于未采用細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，使制作更簡便、成本更低、質(zhì)量容易控制、使用更方便。實驗表明，與單純的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)相比，本發(fā)明補片可有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖及基質(zhì)的分泌，具有更好的生物相容性及更優(yōu)的組織重建性。本發(fā)明補片可廣泛用于各種創(chuàng)面的封閉、軟組織缺損的修補及薄弱處的增強，也可制成粉末通過注射用于各種細(xì)小薄弱或凹陷處的充填，臨床上具有更廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施方式
[0016] 以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0018] 步驟一、制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)：取健康新鮮的豬皮膚，用取皮鼓去除皮下脂肪組織及表皮，保留0.1mm厚的真皮層，用去離子水洗凈，再用無菌PBS溶液清洗，于4℃去離子水浸泡充分溶脹后，置于-80℃中冷凍30分鐘以上，至組織完全凍透后取出置于37℃環(huán)境融化，反復(fù)2次；采用0.1％(W/V)的胰蛋白酶溶液消化皮片1天；隨后用0.02％(W/V)曲拉通100/200溶液清洗1天；采用40U/ml的DNA酶溶液37℃消化2小時；用1M的NaOH溶液浸泡真皮皮片1h；分別用PBS溶液和純水洗凈后，經(jīng)冷凍干燥、滅菌后，于4℃保存?zhèn)溆?；通過該方法制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)孔隙率為91％；
[0019] 步驟二、制備細(xì)胞培養(yǎng)分泌物：參考《組織工程學(xué)原理與技術(shù)》(金巖第四軍醫(yī)大學(xué)出版社2004年出版)進(jìn)行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，收集更換下的培養(yǎng)液；采用超濾方法濃縮，去離子水清洗去鹽，超濾柱采用30K孔徑；采用蛋白純化儀(AKTA PRIME)去除牛血清蛋白，余留蛋白成分為所需的人細(xì)胞培養(yǎng)分泌物，測分泌物含量(以蛋白總量計)，濃度調(diào)至200mg/ml，過濾除菌后保存；
[0020] 步驟三、制備含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球：參考《生長因子生物控釋促進(jìn)牙周組織再生的實驗研究》(陳發(fā)明，博士論文)中的方法制備甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐微球，微球的平均粒徑為50～100nm，凍干滅菌后，無菌條件下在1g微球中加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的水溶液，4℃下放置一天，凍干后得含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球；
[0021] 步驟四、制備復(fù)合軟組織補片：在W/V為0.3％的膠原溶液中加入細(xì)胞培養(yǎng)分泌物終濃度為80mg/ml的含細(xì)胞培養(yǎng)分泌物的緩釋微球，混勻后將該凝膠溶液均勻覆涂于脫細(xì)2
胞真皮基質(zhì)表面，覆涂量為0.6ml/cm，真空條件下使其充分滲透到脫細(xì)胞真皮的孔隙中，冷凍干燥后即得復(fù)合軟組織補片。
[0022] 本例制備的復(fù)合軟組織補片厚度為0.1～0.15mm，斷裂拉伸強度大于0.1Mpa。補片在4℃條件下保存，使用時將補片取出根據(jù)需要裁剪成適宜大小置于無菌容器中，加入10～20倍量的生理鹽水浸泡10min。該補片可用于人體體內(nèi)軟組織缺損的修復(fù)及軟組織薄弱的增強，如：疝修復(fù)、
腫瘤手術(shù)后創(chuàng)面的封閉等；其補片碎片和裁剪剩余經(jīng)粉碎后可用于局部填充，如注射除皺等。
