生物組織分散用組合物
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專利匯可以提供生物組織分散用組合物專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 的目的是，以高效率從來自 生物 組織 的樣品獲得增殖性高的細胞。本發(fā)明提供用于使生物組織分散的組合物，所述組合物的 處方 溶液中的膠原酶活性通過FALGPA分解活性測定的方法測定為0.30U/mL-10U/mL，所述組合物的處方濃度中的胰蛋白酶活性通過BAEE 水 解 活性測定的方法測定為0U/mL-30U/mL。，下面是生物組織分散用組合物專利的具體信息內(nèi)容。
1.用于使生物組織分散的組合物，所述組合物的處方溶液中的膠原酶活性通過FALGPA分解活性測定的方法測定為0.30U/mL-10U/mL，所述組合物的處方溶液中的胰蛋白酶活性通過BAEE水解活性測定的方法測定為0U/mL-30U/mL。
2.權(quán)利要求1的組合物，其用于藥劑評價。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中生物組織是癌組織。
4.來自生物組織的細胞的獲得方法，其包含將來自生物組織的樣品以權(quán)利要求1-3中任一項的組合物處理。
5.細胞的培養(yǎng)結(jié)果的評價方法，其中培養(yǎng)的細胞是以權(quán)利要求1-3中任一項的組合物處理的細胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中細胞的培養(yǎng)結(jié)果是2維的培養(yǎng)結(jié)果。
7.權(quán)利要求5的方法，其中細胞的培養(yǎng)結(jié)果是3維的培養(yǎng)結(jié)果。
8.權(quán)利要求7的方法，其中3維的培養(yǎng)在滴塊狀凝膠內(nèi)進行。
9.用于實施權(quán)利要求4-8中任一項的方法的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的組合物。
生物組織分散用組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于使生物組織分散的組合物。另外，本發(fā)明涉及滴塊狀凝膠中包埋的細胞的培養(yǎng)結(jié)果的評價方法。進一步地，本發(fā)明涉及來自生物組織的細胞的獲得方法。另外，本發(fā)明涉及用于進行上述方法的試劑盒。
背景技術(shù)
[0002] 盡管抗癌劑也作用于正常細胞而存在表現(xiàn)強副作用的情況，但抗癌劑的奏效率，除了一部分以外不滿50％，抗癌劑的有效程度已知隨患者而大大不同。因此，希望在癌癥患者接受抗癌劑的施用的治療前，評價預(yù)定施用的抗癌劑對該癌癥患者是否有效，避免無效抗癌劑的不需要的施用，減少患者的身體上、經(jīng)濟上的負(fù)擔(dān)，避免治療機會的失去。
[0003] 作為如此的抗癌作用的評價方法，已知在模擬生物的滴塊狀凝膠中，以3維增殖癌細胞，使其與抗癌劑接觸，評價增殖結(jié)果的方法(專利文獻1-11)，希望在滴塊狀凝膠中獲得與生物內(nèi)同樣地增殖的細胞。
[0004] 專利文獻1-7中，作為在從來自生物組織的樣品獲得細胞時應(yīng)用的酶，記載了應(yīng)用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、彈性蛋白酶、分散酶等。另外，專利文獻9-11中記載了，將生物組織以包含選自梭菌屬中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(サーモライシン)、以及分散酶的1種以上蛋白酶，以及選自膠原酶I、膠原酶II、以及膠原酶IV的1種以上膠原酶的混合酶進行處理。
[0005] 另外，非專利文獻1-21中記載了使生物細胞分散的酶。在這些文獻中記載了，通過I型膠原酶、II型膠原酶、III型膠原酶、IV型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶等處理來自生物組織的樣品。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻
專利文獻1：日本專利2879978號公報
專利文獻2：日本特開平3-285696號公報
專利文獻3：日本特開平7-31470號公報
專利文獻4：日本特開平7-241190號公報
專利文獻5：日本特開平10-115612號公報
專利文獻6：日本特開2003-9853號公報
專利文獻7：日本特開2008-11797號公報
專利文獻8：日本特開2005-95058號公報
專利文獻9：日本特開2010-227088號公報
專利文獻10：日本特開2011-115106號公報
專利文獻11：國際公開第2011/090068號。
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356,?217,?2007
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Characterization?of?Two?New?Squamous?Cell?Carcinoma?Cell?Lines?Derived?from?Tumors?of?the?Head?and?Neck,?Cancer?Res?48,?2858,?1988
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發(fā)明內(nèi)容
[0008]發(fā)明要解決的課題
但是，通過以往的方法從來自生物組織的樣品配制的細胞，即使要使其增殖，也偶爾存在不按期待增殖的情況。另外，由于存在只能從生物獲得少量來自組織的樣品的情況，因此希望來自樣品的細胞的獲得效率高。因此，本發(fā)明的目的是，以高效率從來自生物組織的樣品獲得增殖性高的細胞。
但是，通過以往的方法從來自生物組織的樣品配制的細胞，即使要使其增殖，也偶爾存在不按期待增殖的情況。另外，由于存在只能從生物獲得少量來自組織的樣品的情況，因此希望來自樣品的細胞的獲得效率高。因此，本發(fā)明的目的是，以高效率從來自生物組織的樣品獲得增殖性高的細胞。
[0009] 用于解決課題的手段本發(fā)明人等經(jīng)過努力研究發(fā)現(xiàn)，在用于使來自生物組織的樣品分散所使用的組合物中包含的、被認(rèn)為促成組織的可溶化的胰蛋白酶妨礙膠原酶、其它有用酶的作用。另外發(fā)現(xiàn)，在胰蛋白酶活性高的情況下，細胞毒性高，使獲得的細胞的增殖性降低。以以上的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)進一步努力研究，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過使用與以往使用的組合物不同、抑制胰蛋白酶活性且確保膠原酶活性高的組合物使來自生物組織的樣品分散，能夠以高效率獲得增殖度高的細胞。在來自生物組織的樣品的分散不充分的情況下，存在細胞的獲得效率低的傾向，以往，一直使用顯示高胰蛋白酶活性的組合物，進行細胞分散。相反，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過使胰蛋白酶活性降低，能夠提高增殖度高的細胞的獲得效率，因此是突破性的發(fā)明。
[0010] 也即，在第1實施方式中，本發(fā)明提供用于使生物組織分散的組合物，所述組合物的處方溶液中的膠原酶活性通過FALGPA分解活性測定的方法測定為0.30U/mL-10U/mL，所述組合物的處方溶液中的胰蛋白酶活性通過BAEE水解活性測定的方法測定為0U/mL-30U/mL。
[0011] 另外，在第2實施方式中，本發(fā)明提供第1實施方式中記載的組合物，其用于藥劑評價。
[0012] 進一步地，在第3實施方式中，本發(fā)明提供第1實施方式或第2實施方式中記載的組合物，其中生物組織是癌組織。
[0013] 進一步地，在第4實施方式中，本發(fā)明提供來自生物組織的細胞的獲得方法，其包含將來自生物組織的樣品以第1實施方式-第3實施方式中任一項記載的組合物處理。
[0014] 進一步地，在第5實施方式中，本發(fā)明提供細胞的培養(yǎng)結(jié)果的評價方法，其中培養(yǎng)的細胞是以第1實施方式-第3實施方式中任一項記載的組合物處理的細胞。
[0015] 另外，在第6實施方式中，本發(fā)明提供第5實施方式中記載的方法，其中細胞的培養(yǎng)結(jié)果是2維的培養(yǎng)結(jié)果。
[0016] 另外，在第7實施方式中，本發(fā)明提供第5實施方式中記載的方法，其中細胞的培養(yǎng)結(jié)果是3維的培養(yǎng)結(jié)果。
[0017] 另外，在第8實施方式中，本發(fā)明提供第7實施方式中記載的方法，其中3維的培養(yǎng)在滴塊狀凝膠內(nèi)進行。
[0018] 進一步地，在第9實施方式中，本發(fā)明提供用于實施第4實施方式或第5實施方式中記載的方法的試劑盒，其包含第1實施方式-第3實施方式中任一項記載的組合物。
[0019] 發(fā)明的效果如果使用本發(fā)明的組合物處理來自生物組織的樣品，能夠有效地分散樣品，能夠以高效率獲得附著于周圍的組織量少、且酶毒性造成的傷害少、與生物內(nèi)同樣地增殖的細胞。特別地，如果使用本發(fā)明的組合物，能夠從硬癌等硬度高的組織以高效率獲得增殖度高的細胞。如果將使用本發(fā)明的組合物獲得的細胞立體地增殖，或以形成凝集塊的3維培養(yǎng)法培養(yǎng)，則由于細胞與生物內(nèi)同樣地增殖，能夠進行抗癌劑等藥劑的評價，基因、蛋白質(zhì)、糖鏈等功能性高分子等的生物物質(zhì)的分析等各種分析。進一步地，如果將使用本發(fā)明的組合物獲得的細胞在滴塊狀凝膠中包埋培養(yǎng)，則可從更少量的細胞進行各種分析。
附圖說明
附圖說明
[0020]【圖1】圖1是對比疑似間質(zhì)組織的消化效率的照片。
[0021] 【圖2】圖2是對比組合物對HCT-116細胞以及PC-14細胞的毒性的圖。
[0022] 【圖3】圖3是對比使用包含酶的組合物配制的細胞的增殖性的照片。
[0023] 【圖4】圖4是對比通過包含酶的組合物處理后的細胞的增殖性的圖。
[0024] 【圖5-1】圖5是對比通過包含酶的組合物處理后的細胞對各種藥劑的感受性的圖。
[0025] 【圖5-2】圖5是對比通過包含酶的組合物處理后的細胞對各種藥劑的感受性的圖。
[0026] 【圖6】圖6是關(guān)于實施例1的組合物與比較例1的組合物的T/C(%)值的1比1圖。
[0027] 【圖7】圖7是對比將包含酶的組合物處理得到的細胞在滴塊狀凝膠中培養(yǎng)后進行中性紅染色的結(jié)果的照片。
具體實施方式
[0028]本發(fā)明提供用于使生物組織分散的組合物。本發(fā)明的組合物的處方濃度下的膠原酶活性通過FALGPA分解活性測定的方法測定為0.30U/mL-10U/mL，優(yōu)選地為0.30U/mL-5U/mL，更優(yōu)選地為0.30U/mg-1U/mg。此處，對于FALPGA分解活性測定的方法，在后述試驗例2中，將使用示為FALGPA分解活性測定的方法的方案測定的值(U/mL)作為膠原酶活性。FALGPA是N-(3-［2-呋喃基］丙烯?；?-Leu-Gly-Pro-Ala。另外，本發(fā)明的組合物的處方濃度下的胰蛋白酶活性通過BAEE水解活性測定的方法測定為0U/mL-30U/mL，優(yōu)選地為0U/mL-20U/mL，更優(yōu)選地為0U/mL-10U/mL。對于BAEE水解活性測定的方法，在后述試驗例2中，將使用示為BAEE水解活性測定的方法的方案測定的值(U/mL)作為胰蛋白酶活性。BAEE是Nα-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽。處方濃度是使用本發(fā)明的組合物使生物組織分散時的本發(fā)明的組合物的濃度。
[0029] 本發(fā)明的組合物可如下制備：將市售的膠原酶、分散酶、透明質(zhì)酸酶等混合，通過FALGPA分解活性測定的方法、以及BAEE水解活性測定的方法，分別測定混合物的膠原酶活性以及胰蛋白酶活性，并將混合物中膠原酶活性以及胰蛋白酶活性調(diào)整至期望的范圍。作為膠原酶，可使用來自梭菌屬、來自放線菌等的任一。另外，膠原酶的純化度可使用任一，但期望含有粗純化的膠原酶。另外，本發(fā)明的組合物中也可包含透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、彈性蛋白酶、分散酶、嗜熱菌蛋白酶等各種分解酶。更優(yōu)選地，包含分散酶。分散酶能夠分解在生物中作為細胞的支架的IV型膠原蛋白、纖連蛋白，因此能夠更有效地獲得細胞。另外，為了控制胰蛋白酶活性，本發(fā)明的組合物也可包含胰蛋白酶活性的抑制劑。胰蛋白酶活性的抑制劑可列舉血清等。通過應(yīng)用血清，可使本發(fā)明的組合物中的細胞毒性降低。
[0030] 本發(fā)明的組合物可用于處理來自生物組織的樣品，使該樣品分散，獲得細胞。作為生物，除了人，可列舉小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、犬、貓、綿羊、豬、山羊、牛、猴等非人哺乳動物等。作為生物組織，例如可列舉，癌組織、正常組織等。作為癌癥，例如可列舉，消化器官癌、頭頸癌、乳癌、肺癌、癌性胸?腹膜炎、宮頸癌、子宮體癌、卵巣癌等。本發(fā)明的組合物尤其適于硬癌的消化以及分散。來自生物組織的樣品例如可列舉，手術(shù)材料的全部或一部分、活組織檢查樣品的全部或一部分等。手術(shù)材料例如可使用以治療為目的的外科切除術(shù)時摘出的組織。另外，可使用以病理診斷、疾病的治療以及病程預(yù)后的判定等為目的由低侵襲性采集法以試驗切除?試驗穿刺方式采集的組織。作為由低侵襲性采集法采集的組織，可列舉各種活組織檢查樣品、胸腔鏡下或腹腔鏡下材料、由腹水以及胸水等獲得的樣品等。樣品也可從生物采集后接受用剪刀、鑷子以及剃刀等的細切處理等機械分離處理。另外，樣品也可使用含有培養(yǎng)基成分、抗生素的洗滌液洗滌。另外，樣品也可通過從癌癥患者采集后的切碎處理成為糊狀。
[0031] 來自生物組織的樣品的分散可如下進行，例如，將本發(fā)明的組合物與來自生物組織的樣品混合，在25-40℃處理3分鐘-72小時。更優(yōu)選地，來自生物組織的樣品的分散可通過處理5分鐘-24小時而進行?；旌蠒r來自生物組織的樣品的含量例如為0.1-5g/10mL?；旌蠒r的膠原酶活性通過FALGPA分解活性測定的方法測定為0.30U/mL-10U/mL，優(yōu)選地為0.30U/mL-5U/mL，更優(yōu)選地為0.30U/mL-1U/mL。FALGPA分解活性測定的方法如前述。混合時的胰蛋白酶活性通過BAEE水解活性測定的方法測定為0U/mL-30U/mL，優(yōu)選地為0U/mL-20U/mL，更優(yōu)選地為0U/mL-10U/mL。FALGPA分解活性測定的方法如前述。
[0032] 分散后，可使用任意方法，從本發(fā)明的組合物與來自生物組織的樣品的混合物獲得細胞。為了使本發(fā)明的組合物中包含的酶造成的細胞毒性降低，并使獲得的細胞的增殖性提高，優(yōu)選地，用血清處理包含來自生物組織的樣品的分散后的混合物。另外，為了降低酶的作用，也可使用EDTA等金屬嵌合劑處理。進一步地，為了除去酶，也可通過離心分離去除酶液。獲得細胞時，也可使用尼龍網(wǎng)、細胞濾過器等濾器進行過濾。另外，也可將分散了來自生物組織的樣品的溶液接種在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，選擇性獲得增殖的細胞。培養(yǎng)也可用載體進行。接種來自生物組織的樣品的載體也可以層狀包被細胞粘附因子。作為細胞粘附因子，可優(yōu)選地列舉各種類型的膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、鈣粘著蛋白、明膠、肽以及整聯(lián)蛋白等細胞外基質(zhì)，這些可以使用僅1種，也可聯(lián)用2種以上，但從進一步提高細胞粘附性、細胞伸展性的觀點，使用各種膠原蛋白是更優(yōu)選的，在各種膠原蛋白中，特別優(yōu)選使用I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白。載體表面包被的細胞粘附因子也可與滴塊狀凝膠的凝膠化劑相同。粘附于載體的細胞的獲得可如下進行，例如，在除去含有血細胞、不需要細胞成分等的培養(yǎng)液后，添加細胞的剝離劑，剝離粘附于載體的細胞。細胞的剝離劑例如可列舉，EDTA-胰蛋白酶等。在載體存在包被物的情況下，粘附于載體的細胞的剝離也可通過添加包被物的剝離劑而進行。載體的包被物是膠原蛋白的情況下，包被物的剝離劑是例如膠原酶。通過膠原酶的添加進行細胞剝離的情況下，對活細胞作用之前，對活細胞粘附的膠原蛋白?凝膠層本身進行酶分解，對活細胞的損傷少。
[0033] 通過將使用本發(fā)明的組合物獲得的細胞以2維培養(yǎng)、或立體增殖、或以形成凝集塊的3維培養(yǎng)法培養(yǎng)，并評價培養(yǎng)結(jié)果，能夠評價與生物內(nèi)的條件同樣的培養(yǎng)結(jié)果。通過評價將以本發(fā)明的組合物處理的細胞3維培養(yǎng)得到的培養(yǎng)結(jié)果，可更進一步獲得與生物內(nèi)的條件類似的培養(yǎng)結(jié)果。3維培養(yǎng)法有，例如，在膠原蛋白、基質(zhì)膠(Matrigel)等細胞外基質(zhì)中包埋的方法，以培養(yǎng)面為低粘附性的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的方法，以培養(yǎng)面是U形底的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的方法，以培養(yǎng)面構(gòu)成微小圖案的培養(yǎng)器培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)的方法等，但不限于這些。如果將使用本發(fā)明的組合物獲得的細胞在滴塊狀凝膠中包埋培養(yǎng)，可從更少量的細胞進行各種分析。滴塊狀凝膠例如可列舉在平面基材上顯示凸表面形狀的滴塊狀凝膠。滴塊狀凝膠的容積的一個例子是3-300μL、3-150μL、5-100μL、15-50μL等。滴塊狀凝膠的高度例如2mm以下。滴塊狀凝膠例如可列舉，對400nm的光顯示透射率1-95％的透明度的滴塊狀凝膠。從兼顧容易操作和維持作為滴塊狀凝膠的形狀的觀點來看，滴塊狀凝膠的粘度例如為50-2000厘泊、100-1000厘泊等。滴塊狀凝膠可包含凝膠化劑。凝膠化劑可列舉酸可溶性I型膠原蛋白等膠原蛋白；基質(zhì)膠等細胞外基質(zhì)、軟瓊脂等。從兼顧維持作為滴塊狀凝膠的形狀的觀點來看，滴塊狀凝膠中膠原蛋白的含量例如為0.1-2.0重量％。進一步地，滴塊狀凝膠也可包含多糖類與其它細胞外基質(zhì)等高分子材料、血清培養(yǎng)基等培養(yǎng)基成分等。滴塊狀凝膠例如也可通過緩沖液等，例如設(shè)定為pH6.2-7.6、pH6.8-7.4等。滴塊狀凝膠的鹽強度或離子強度例如100-180mmol、140-160mmol等。
[0034] 滴塊狀凝膠可包埋以本發(fā)明的組合物處理來自生物組織的樣品得到的細胞而使用。包埋至滴塊狀凝膠的細胞的濃度例如是102-107細胞/mL，優(yōu)選地103-106細胞/mL。包埋細胞的滴塊狀凝膠可如下制備，例如，將包含凝膠化劑的溶液與細胞等成分混合，將得到的混合液以冰冷卻，用移液管滴至基材上，在30-45℃靜置30分鐘-2小時?；木邆淇晒潭ǖ螇K狀凝膠的表面?；目闪信e，例如，平皿、多孔板等培養(yǎng)皿；燒瓶與其它一般的培養(yǎng)容器；將玻璃、塑料成形為薄片狀的蓋玻片或細胞盤(cell?disk)等培養(yǎng)板等。從容易評價細胞培養(yǎng)結(jié)果的觀點來看，基材優(yōu)選地在光學(xué)上透明。滴塊狀凝膠中包埋的培養(yǎng)例如進行1-10日，優(yōu)選地3-8日。
[0035] 評價的培養(yǎng)結(jié)果例如可列舉，培養(yǎng)前后的生存細胞數(shù)的變化、培養(yǎng)前后的細胞內(nèi)的產(chǎn)物的變化等。細胞內(nèi)的產(chǎn)物可列舉DNA、RNA等核酸，蛋白質(zhì)等。細胞培養(yǎng)時，也可對滴塊狀凝膠添加藥劑。此時，通過比較培養(yǎng)前的細胞和培養(yǎng)后的細胞、比較添加藥劑培養(yǎng)的細胞與不添加藥劑培養(yǎng)的細胞，可評價藥劑對細胞的影響。
[0036] 作為藥劑評價，例如可列舉，評價藥劑對細胞的作用的方法，其包含在使含有藥劑的溶液接觸包埋細胞的滴塊狀凝膠后，使包埋細胞的滴塊狀凝膠與培養(yǎng)基接觸，在包埋細胞的滴塊狀凝膠中培養(yǎng)細胞，評價培養(yǎng)的結(jié)果。
[0037] 藥劑評價中的藥劑可列舉對疾病的治療、預(yù)防或改善劑。疾病可列舉癌癥等。作為對癌癥的治療、預(yù)防或改善劑，除了直接作用于癌細胞的抗癌劑，可列舉不直接攻擊癌細胞、但通過與生物內(nèi)的免疫細胞或其它藥劑協(xié)同作用而發(fā)揮抑制癌細胞的增殖、緩和癌細胞的活動、殺死癌細胞是功能的藥劑。作為抗癌劑，例如可列舉：5-FU等代謝拮抗劑；SN-38等伊立替康(irinotecan)系抗癌劑；多西他塞(docetaxel)等微管解聚抑制藥；順鉑、l-奧沙利鉑(1-oxaliplatin)等鉑制劑等。其它可列舉與細胞增殖有關(guān)的增殖因子及其受體，以及選擇性修飾與細胞增殖、細胞周期、凋亡及其信號傳導(dǎo)有關(guān)的分子或酶等，要獲得抗癌效果的分子靶標(biāo)藥。例如，有曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉非替尼(gifitinib)等作用于增殖因子受體的藥物，伊馬替尼(imatinib)、克唑替尼(crizotinib)等作用于融合基因的信號傳導(dǎo)的藥物，貝伐單抗(bevacizumab)等抑制癌組織的血管新生的藥物等。作為其它藥劑，可列舉抗癌劑的前體藥物、調(diào)整抗癌劑或其前體藥物的代謝相關(guān)的細胞內(nèi)代謝酶活性的藥劑、免疫療法劑等。
[0038] 作為藥劑評價中評價的作用，例如可列舉，對該細胞的來源生物施用該藥劑的情況下，與獲得該生物的治療、預(yù)防或改善的可能性有關(guān)的作用。作為治療、預(yù)防或改善的效果，例如可列舉，疾病細胞的增殖的降低、細胞的傷害、組織的縮小等。
[0039] 藥劑評價的方法中，對于滴塊狀凝膠與含有藥劑的溶液的接觸，例如，為了不使滴塊狀凝膠干燥成為平坦的干燥物，對位于基材上的滴塊狀凝膠，將含有藥劑的溶液多層化，通過含有藥劑的溶液覆蓋整個滴塊狀凝膠而進行是優(yōu)選的。接觸的含有藥劑的溶液除了藥劑之外可含有血清培養(yǎng)基等培養(yǎng)基。溶液中藥劑的濃度優(yōu)選為，在對細胞的來源生物施用藥劑時該細胞附近的藥劑濃度。
[0040] 與含有藥劑的溶液接觸后的細胞的培養(yǎng)使包埋細胞的滴塊狀凝膠與培養(yǎng)基接觸來進行，接觸的培養(yǎng)基優(yōu)選地是液體培養(yǎng)基。作為接觸的液體培養(yǎng)基，從抑制成纖維細胞的增殖的觀點看來，或者從維持、表現(xiàn)成纖維細胞的功能的觀點看來，優(yōu)選無血清培養(yǎng)基。對于與液體培養(yǎng)基的接觸，為了不使滴塊狀凝膠干燥成為平坦的干燥物，通過液體培養(yǎng)基覆蓋整個滴塊狀凝膠而進行是優(yōu)選的。進行培養(yǎng)的時間例如1-10日，優(yōu)選地3-8日。與液體培養(yǎng)基接觸的滴塊狀凝膠也可在與含有藥劑的溶液接觸后，通過洗滌將藥劑洗滌除去。
[0041] 藥劑評價可包含使包埋細胞的滴塊狀凝膠與培養(yǎng)基接觸，進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)的結(jié)果進行評價。該培養(yǎng)的結(jié)果的評價，例如，通過比較培養(yǎng)前后生存細胞的數(shù)量、比較添加藥劑進行培養(yǎng)時生存細胞的數(shù)量與不添加藥劑進行培養(yǎng)時生存細胞的數(shù)量來進行。生存細胞的數(shù)量的計測可通過用顯微鏡目視觀察而進行。另外，生存細胞的數(shù)量的計測也可通過進行對活細胞選擇性染色的染色法、測定由染色造成的顯色而進行。對活細胞選擇性染色的染色法可列舉，中性紅染色法等利用細胞的吞噬作用的染色法、乳膠粒子染色法、熒光素二乙酸染色法等利用細胞內(nèi)酶活性的染色法、使用其它熒光試劑的染色法等。染色后的細胞也可通過福爾馬林固定等固定。由此，可暫時防止染色劑的溶出，進行靈敏度高的染色。染色后的滴塊狀凝膠也可使其干燥。由此，可防止變質(zhì)、劣化。滴塊狀凝膠的干燥例如可通過風(fēng)干、以10-50℃左右的加熱強制干燥等進行。染色造成的顯色的測定也可通過對染色后的滴塊狀凝膠攝影、將攝影的圖像數(shù)值化進行評價而進行。數(shù)值化后的評價也可包含根據(jù)被染色細胞的圖像的形狀的數(shù)值修正。癌細胞有形成塊狀且深色圖像的傾向，成纖維細胞有形成細纖維狀且淺色圖像的傾向，通過選擇塊狀的染色圖的數(shù)值進行修正，可更正確且簡單地檢測出生存的癌細胞。
[0042] 對于該培養(yǎng)結(jié)果的評價的其它方法，例如通過比較培養(yǎng)前后、藥劑接觸有無下細胞的基因表達變化而進行。對于基因表達變化，對培養(yǎng)后細胞內(nèi)的mRNA表達，可通過實時RT-PCR法、應(yīng)用DNA芯片的方法等公知的方法分析而進行。作為當(dāng)成對象的基因，可比較所有的基因，也可分別或組合比較與成為藥劑的靶標(biāo)的分子、其功能有關(guān)的基因，與藥劑的代謝有關(guān)的基因，與細胞周期、細胞的生死有關(guān)的基因等。也可將基因的分析所需的藥劑在培養(yǎng)中添加至滴塊狀凝膠。
[0043] 另外，其它方法例如，通過比較培養(yǎng)前后、藥劑接觸有無下細胞表達的細胞表面抗原、受體蛋白質(zhì)、藥劑代謝酶等蛋白質(zhì)而進行。蛋白質(zhì)的檢測可使用免疫染色法、ELISA法、酶活性測定法等公知的技術(shù)。另外，也可在將培養(yǎng)后的滴塊狀凝膠回收固定、包埋后，制備病理標(biāo)本，并通過免疫組織染色法比較。也可將蛋白質(zhì)分析所需的藥劑添加至培養(yǎng)中的滴塊狀凝膠等培養(yǎng)基。
[0044] 另外，其它方法例如，通過比較培養(yǎng)前后、藥劑接觸有無下細胞具有的突變基因而進行。突變基因的檢測可使用PCR、DNA測序等公知的基因分析方法、原位雜交等公知的技術(shù)。也可將突變基因分析所需的藥劑添加至培養(yǎng)中的滴塊狀凝膠。
[0045] 使用本發(fā)明的組合物的細胞的獲得方法以及細胞的培養(yǎng)結(jié)果的評價方法也可使用包含本發(fā)明的組合物的試劑盒進行。試劑盒除了本發(fā)明的組合物也可包含膠原蛋白溶液以及液體培養(yǎng)基。也可在試劑盒中包含的膠原蛋白溶液用于與從來自生物組織的樣品獲得的細胞混合，制備滴塊狀凝膠。作為膠原蛋白溶液中包含的膠原蛋白，例如可列舉，酸可溶性的I型膠原蛋白或IV型膠原蛋白、或胃蛋白酶可溶性的I型膠原蛋白或III型膠原蛋白等。也可在試劑盒中包含的液體培養(yǎng)基為用于在滴塊狀凝膠中培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基也可為濃縮培養(yǎng)基。濃縮培養(yǎng)基例如可列舉，McCoy’s?5A、RPMI-1640、D-MEM、MEM、MCDB-
131、Ham’s?F-12、D-MEM/F-12、Medium-199等哺乳類細胞培養(yǎng)基本培養(yǎng)基。
131、Ham’s?F-12、D-MEM/F-12、Medium-199等哺乳類細胞培養(yǎng)基本培養(yǎng)基。
[0046] 進一步地，試劑盒可含有重構(gòu)緩沖液。重構(gòu)緩沖液中和酸可溶性膠原蛋白溶液并固化滴塊狀凝膠。重構(gòu)緩沖液例如可列舉，調(diào)整為pH7-10的氫氧化鈉水溶液等。另外，試劑盒可包含接種培養(yǎng)來自生物組織的樣品的載體。載體的例子可列舉膠原蛋白?凝膠?燒瓶、培養(yǎng)載體用管等。培養(yǎng)載體用管可列舉平底管容器等，其將管容器的一部分裁切為對容器中心軸有平緩角度的形狀，將表面積為0.01-25.0cm2的其平坦裁切面作為載體，該載體的表面為使細胞粘附進行培養(yǎng)的部分。試劑盒除了用于在滴塊狀凝膠中培養(yǎng)細胞的液體培養(yǎng)基之外，也可含有用于載體上的培養(yǎng)的培養(yǎng)基。用于載體上的培養(yǎng)的培養(yǎng)基可列舉，對來自生物組織的動物細胞具有增殖作用以及生理活性維持作用、同時對細菌具有殺死作用和/或增殖抑制作用的培養(yǎng)液。具體地，例如可列舉，Ham’s?F-12或D-MEM，或D-MEM/F-12混合液中以成為5-20％的方式添加胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基，或進一步添加各種生長增殖因子的培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基也可包含抗生素。
[0047] 另外，試劑盒可包含用于評價細胞的培養(yǎng)結(jié)果的細胞染色劑。細胞染色劑例如可列舉，中性紅等利用細胞的吞噬作用的染色劑。中性紅在與利用對溶酶體的吞噬作用的細胞活性相關(guān)性高的觀點來看是優(yōu)選的。試劑盒除了上述構(gòu)成物品以外，也可含有其它構(gòu)成物品。實施例
[0048] 以下，通過實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
[0049] 試驗例1 抗癌劑感受性試驗：以下的試驗例中，在沒有特別記載的情況下，抗癌劑感受性試驗按照以下的順序進行。
[0050] 1.分析物洗滌：從癌癥患者的胃癌、大腸癌、胰腺癌等消化器官癌、乳癌、肺癌、頭頸癌、癌性胸?腹膜炎、宮頸癌、子宮體癌或卵巣癌等固形癌組織摘出分析物。通過以下方法，去除分析物表面附著的雜菌。首先，準(zhǔn)備3個10cm的皿(dish)，各加入20mL添加抗生素的培養(yǎng)基溶液(分析物洗滌液)。將分析物在第1個皿的分析物洗滌液中，充分清洗分析物表面。將分析物移至第2個、以及第3個皿中，進行洗滌操作。應(yīng)用的分析物洗滌液為，在DF培養(yǎng)液(DF：達爾貝科改良伊格爾(DME)培養(yǎng)液與Ham’sF12培養(yǎng)液1：1的混合培養(yǎng)液)中，將Pentcillin(富山化學(xué)公司，Pentcillin注射用)以相對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的最終濃度為1mg/mL、卡那霉素(明治制果株式會社，硫酸卡那霉素注射液)以相對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的最終濃度為0.5mg/mL、兩性霉素B(和光純藥物公司)以最終濃度為2.5μg/mL添加而成。
[0051] 2.組織的細切處理：將進行洗滌的分析物移至新的皿，在皿上使用剪刀以及鑷子，將作為分析物的腫瘤組織快速細切成3-5mm見方大小。
[0052] 3.組織的切碎處理：將進行細切處理的分析物在皿上使用夾在持針器上的剃刀刃進行切碎，直至細切的腫瘤組織成為糊狀。向切碎的腫瘤組織加入20mL的DF培養(yǎng)液，將DF培養(yǎng)液與組織一起回收至
50mL離心管。進一步地加入10mL的DF培養(yǎng)液，充分回收粘附于培養(yǎng)皿的組織。用桌上型離心機以400×g離心3分鐘。
50mL離心管。進一步地加入10mL的DF培養(yǎng)液，充分回收粘附于培養(yǎng)皿的組織。用桌上型離心機以400×g離心3分鐘。
[0053] 4.組織分散：離心后，通過抽吸除去上清。向離心后的沉淀物添加9mL的DF培養(yǎng)液，搖晃離心管使組織片很好地分開。根據(jù)酶組合物也可添加10％FBS(FBS是胎牛血清)。添加1mL調(diào)整至處方濃度的10倍濃度的細胞分散用酶組合物，調(diào)整處方濃度的細胞分散溶液。在37℃恒溫器內(nèi)攪拌振蕩1-2小時左右。
[0054] 5.回收：加入10mL的DF培養(yǎng)液成為20mL，以400×g離心3分鐘，除去上清。除去上清后，輕輕搖晃離心管使細胞團塊分開，在添加10mL培養(yǎng)基后，進行劇烈的移液，使細胞團塊進一步地很好地分開。應(yīng)用孔徑尺寸為300μm的尼龍網(wǎng)，過濾含有細胞的懸浮液。添加10mL的DF培養(yǎng)液，將離心管與尼龍網(wǎng)充分地預(yù)洗。
[0055] 6.預(yù)培養(yǎng)：將回收處理得到的細胞離心回收，吸引除去上清。使離心后的細胞沉淀物在Primaster試劑盒(倉敷紡績株式會社)的5mL預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(PCM-1)中懸浮。將懸浮細胞的PCM-1培養(yǎng)液接種至膠原蛋白?凝膠?燒瓶內(nèi)。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置，培養(yǎng)一夜。培養(yǎng)一夜后，吸引除去包含血細胞、不需要細胞成分等的培養(yǎng)液。觀察到腫瘤細胞植入膠原蛋白?凝膠?燒瓶。
[0056] 7.細胞回收：吸引除去膠原蛋白?凝膠?燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入5mL的DF培養(yǎng)液洗滌后，加入2mL的DF培養(yǎng)液。進一步地，加入0.2mL調(diào)整為處方濃度的10倍濃度的細胞分散用酶組合物，調(diào)整處方濃度的酶溶液。以37℃振蕩15-30分鐘，溶解燒瓶內(nèi)的膠原蛋白?凝膠。將從膠原蛋白?凝膠?燒瓶剝離的細胞回收至50mL離心管。另外，在確認(rèn)細胞粘附至燒瓶的情況下，加入3mL的EDTA-胰蛋白酶振蕩5分鐘。確認(rèn)細胞的剝離后，添加5mL的10％血清培養(yǎng)基仔細預(yù)洗燒瓶內(nèi)部，回收至50mL離心管。加入10mL的DF培養(yǎng)液后，離心回收細胞。
[0057] 8.包埋：除去上清，向離心后的沉淀物加入2mL的EDTA-胰蛋白酶溶液處理3-7分鐘后，加入10mL的10％血清培養(yǎng)基進行移液，以孔徑尺寸100μm的尼龍網(wǎng)過濾細胞懸浮液。加入10mL的DF培養(yǎng)液，充分預(yù)洗離心管與尼龍網(wǎng)。將濾液離心后，吸引除去上清，回收細胞。在回收的細胞中混入膠原蛋白溶液。將混入細胞的膠原蛋白溶液用冰冷卻，使用微量移液管，以30μL/滴，在板上每1孔滴下3滴。在37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時，使膠原蛋白?滴凝膠化。凝膠化后，將含有10％FBS的DF培養(yǎng)基以每3mL/孔重疊。無血清培養(yǎng)基(PCM-2)也可。將培養(yǎng)基重疊后，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一夜。
[0058] 9.藥劑接觸：一夜培養(yǎng)后，以成為預(yù)定濃度的方式將濃縮藥劑液添加混合至培養(yǎng)基。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行對應(yīng)于藥劑的規(guī)定時間的接觸培養(yǎng)。
[0059] 10.藥劑除去以及培養(yǎng)：藥劑接觸結(jié)束后吸引除去培養(yǎng)液，在各孔中以每4mL重疊Primaster試劑盒(倉敷紡績株式會社)的無血清培養(yǎng)基(PCM-2)，在之后5天進行無血清培養(yǎng)。
[0060] 11.評價：無血清培養(yǎng)后，在各孔中各添加40μL中性紅(NR)溶液。在CO2培養(yǎng)箱溫育2小時，進行細胞染色。中性紅染色后，吸引除去含有染色液的培養(yǎng)液。除去培養(yǎng)液后，各添加4mL的10％中性福爾馬林溶液，在室溫進行約1小時的細胞固定。細胞固定后，除去中性福爾馬林溶液。將培養(yǎng)板浸漬在自來水中，水洗20分鐘。水洗后，仔細瀝干板的水分，進行送風(fēng)干燥。進行中性紅固定的細胞的圖像分析處理。圖像分析處理應(yīng)用日本特開平10-115612(癌細胞的定量測定方法)公開的圖像分析處理方法。
[0061] 試驗例2混合市售的膠原酶、分散酶、透明質(zhì)酸酶、以及脫氧核糖核酸酶，制備胰蛋白酶活性以及膠原酶活性為下表1所示的實施例1以及比較例1的組合物。制備的組合物用于試驗例1的
4.組織分散。
4.組織分散。
[0062] 【表1】? 膠原酶活性(U/mL) 胰蛋白酶活性(U/mL)
實施例1 0.367 9.8
比較例1 0.242 38.4
實施例1 0.367 9.8
比較例1 0.242 38.4
[0063] 實施例1以及比較例1的組合物的膠原酶活性通過以下的FALGPA分解活性測定的方法測定。
[0064] 1.FALGPA分解活性測定的方法：以下的方法刊載在Sigma-Aldrich公司網(wǎng)站(http://www.sigmaaldrich.com/
technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-
3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html)。
technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-
3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html)。
[0065] (1)縮寫：【表2】
FALGPA N-(3-［2-呋喃基］丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala
FAL N-(3［2-呋喃基］丙烯?；?-Leu
Leu 亮氨酸
Gly 甘氨酸
Pro 脯氨酸
Ala 丙氨酸
FALGPA N-(3-［2-呋喃基］丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala
FAL N-(3［2-呋喃基］丙烯?；?-Leu
Leu 亮氨酸
Gly 甘氨酸
Pro 脯氨酸
Ala 丙氨酸
[0066] (2)原理：測定在膠原酶的作用下FALGPA分解為FAL和Gly-Pro-Ala時，來自FALGPA的345nm吸光度(A345nm)的減少變量，算出活性。
[0067] (3)方法：a.試劑：
(a)試劑B 50mM兩性離子緩沖液(tricine)、10mMCaCl2、400mMNaCl、pH7.5(25℃)緩沖液：
將兩性離子緩沖液(Sigma-Aldrich、T0377)0.896g、NaCl(Sigma-Aldrich、S9888)
2.34g、CaCl2?2H2O(Sigma-Aldrich、C3881)0.147g溶解于80mL蒸餾水，用1M NaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)、或1M HCl溶液(Sigma-Aldrich、H3162)調(diào)整為pH7.5(25℃)后，加入蒸餾水至100mL。
(a)試劑B 50mM兩性離子緩沖液(tricine)、10mMCaCl2、400mMNaCl、pH7.5(25℃)緩沖液：
將兩性離子緩沖液(Sigma-Aldrich、T0377)0.896g、NaCl(Sigma-Aldrich、S9888)
2.34g、CaCl2?2H2O(Sigma-Aldrich、C3881)0.147g溶解于80mL蒸餾水，用1M NaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)、或1M HCl溶液(Sigma-Aldrich、H3162)調(diào)整為pH7.5(25℃)后，加入蒸餾水至100mL。
[0068] (b)試劑C 1.0mM N-(3-［2呋喃基］丙烯?；?-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA)：將9.6mg的FALGPA(Sigma-Aldrich、F5135)添加至20mL的A的溶液，攪拌30分鐘以上完全溶解。
[0069] (c)試劑D 蒸餾水：(d)試劑E 酶溶液：
將酶以使用時的5-10倍濃度溶解于蒸餾水。
將酶以使用時的5-10倍濃度溶解于蒸餾水。
[0070] b.條件：反應(yīng)液pH=7.5、反應(yīng)溫度=25℃、吸光度=A345nm、光程長度=1cm
c.反應(yīng)液的試劑組成以及操作：
【表3】
試劑 空白試驗 正式試驗
B 2.9mL 2.9mL
C 0.1mL -
D - 0.1mL
c.反應(yīng)液的試劑組成以及操作：
【表3】
試劑 空白試驗 正式試驗
B 2.9mL 2.9mL
C 0.1mL -
D - 0.1mL
[0071] 將2.9mL的試劑B放入1cm光程長度的比色池，加溫至25℃。如果A345nm穩(wěn)定則添加0.1mL的試劑C(空白試驗)或試劑D(正式試驗)，立即混合于25℃記錄A345nm的降低5分鐘。
[0072] (4)活性單位的定義和計算方法在前述條件下，在pH7.5、25℃、鈣離子的存在下，于1分鐘水解1.0μmole的FALGPA的酶量作為1FALGPA單位。FALGPA單位由下式求出。
[0073] FALGPA單位/mL={(E1-E2)×3/(F×0.1)}/0.53上式中的符號或數(shù)值如下顯示。
[0074] 【表4】E1： 正式試驗的每1分鐘的吸光度變化
E2： 空白試驗的每1分鐘的吸光度變化
0.53： FALGPA的分子吸光系數(shù)(⊿ε345/cm/mM)
3： 反應(yīng)液的總量(mL)
0.1： 酶溶液的使用量(mL)
F： 酶溶液使用時對濃度的倍率
E2： 空白試驗的每1分鐘的吸光度變化
0.53： FALGPA的分子吸光系數(shù)(⊿ε345/cm/mM)
3： 反應(yīng)液的總量(mL)
0.1： 酶溶液的使用量(mL)
F： 酶溶液使用時對濃度的倍率
[0075] 實施例1以及比較例1的組合物的胰蛋白酶活性通過以下的BAEE水解活性測定的方法測定。
[0076] 2.BAEE水解活性測定的方法：以下的方法刊載在Sigma-Aldrich公司的網(wǎng)站(http://www.sigmaaldrich.com/
technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html)。
technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html)。
[0077] (1)縮寫：BAEE=Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽
(2)原理：
測定胰蛋白酶的作用下BAEE水解為Nα-苯甲?；?L-精氨酸和乙醇時的253nm吸光度(A253nm)的增加變量，算出活性。
(2)原理：
測定胰蛋白酶的作用下BAEE水解為Nα-苯甲?；?L-精氨酸和乙醇時的253nm吸光度(A253nm)的增加變量，算出活性。
[0078] (3)方法：a.試劑：
(a)試劑A 67mM磷酸鈉緩沖液、pH7.5(25℃)緩沖液：
將0.804g磷酸二氫鈉(Sigma-Aldrich、S0751)溶解于80mL蒸餾水，用1M NaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)調(diào)整至pH7.6(25℃)后，加入蒸餾水至100mL。
(a)試劑A 67mM磷酸鈉緩沖液、pH7.5(25℃)緩沖液：
將0.804g磷酸二氫鈉(Sigma-Aldrich、S0751)溶解于80mL蒸餾水，用1M NaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)調(diào)整至pH7.6(25℃)后，加入蒸餾水至100mL。
[0079] (b)試劑B 0.25mM Nα-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽：將4.3mg的Nα-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(Sigma-Aldrich、B4500)添加并溶解于
50mL的A的溶液。
50mL的A的溶液。
[0080] (c)試劑C 蒸餾水：(d)試劑D 酶溶液：
將酶以使用時的5-10倍濃度溶解于蒸餾水。
將酶以使用時的5-10倍濃度溶解于蒸餾水。
[0081] b.條件：反應(yīng)液pH=7.6、反應(yīng)溫度=25℃、吸光度=A253nm、光程長度=1cm
c.反應(yīng)液的試劑組成以及操作：
【表5】
試劑 空白試驗 正式試驗
B 3.0mL 3.0mL
C 0.2mL -
D - 0.2mL
c.反應(yīng)液的試劑組成以及操作：
【表5】
試劑 空白試驗 正式試驗
B 3.0mL 3.0mL
C 0.2mL -
D - 0.2mL
[0082] 將3.0mL試劑B放入1cm光程長度的比色池，加溫至25℃。如果A253nm穩(wěn)定則添加0.1mL的試劑C(空白試驗)或試劑D(正式試驗)，立即混合于25℃記錄A253nm的降低5分鐘。
[0083] d.活性單位的定義和計算方法：在前述條件下，在pH7.6、25℃、反應(yīng)液量3.2mL、光程長度1cm下，將于1分鐘使A253nm升高0.001的酶量作為1BAEE單位。BAEE單位由下式求出。
[0084] BAEE單位/mL=(E1-E2)/{0.001×(F×0.1)}上式中的符號或數(shù)值如下顯示。
[0085] 【表6】E1： 正式試驗的每1分鐘的吸光度變化
E2： 空白試驗的每1分鐘的吸光度變化
0.001： 在pH7.6、25℃、反應(yīng)液量3.2mL、光程長度1cm的條件下，每1分鐘，增加酶1單位的A253nm的值
0.1： 酶溶液的使用量(mL)
F： 酶溶液使用時對濃度的倍率
E2： 空白試驗的每1分鐘的吸光度變化
0.001： 在pH7.6、25℃、反應(yīng)液量3.2mL、光程長度1cm的條件下，每1分鐘，增加酶1單位的A253nm的值
0.1： 酶溶液的使用量(mL)
F： 酶溶液使用時對濃度的倍率
[0086] 試驗例3 酶消化能力的比較：使用用于評價消化能力的豬皮，對實施例1的組合物和比較例1的組合物，比較豬皮的消化效率。具體地，在切碎的豬皮中混合0.1mL的實施例1或比較例1的組合物與0.9mL的加入10％FBS的DF培養(yǎng)基，在37℃振蕩，觀察豬皮的大小。0小時和2小時后的狀態(tài)示于圖1。
[0087] 如圖1所示，實施例1的組合物中，得到比比較例1的組合物好的消化結(jié)果。
[0088] 試驗例4應(yīng)用實施例1的組合物或比較例1的組合物，進行胃癌10個分析物、以及大腸癌10個分析物的癌組織的消化反應(yīng)，目視確認(rèn)未分解殘渣量進行比較評價。結(jié)果在下表7中示出。在下表7中，實施例1表示實施例1的未分解殘渣量比比較例1的未分解殘渣量少的分析物的數(shù)量，比較例1表示比較例1的未分解殘渣量比實施例1的未分解殘渣量少的分析物的數(shù)量。相同程度表示兩者的未分解殘渣量無大差別的分析物的數(shù)量。
[0089] 【表7】? 胃癌 大腸癌
分析物數(shù) 10 10
實施例1 5 5
比較例1 0 0
相同程度 5 5
分析物數(shù) 10 10
實施例1 5 5
比較例1 0 0
相同程度 5 5
[0090] 如表7所示，實施例1的組合物為，與比較例1的組合物比較，對胃癌組織以及大腸癌組織顯示非常優(yōu)良的消化性。如此，實施例1的組合物不論癌組織的種類，表示高消化性。
[0091] 試驗例5 對株化細胞的細胞毒性的比較：使用來自結(jié)腸癌的HCT-116細胞與來自肺癌的PC-14細胞，比較實施例1或比較例1的組合物造成的細胞毒性。具體地，在實施例1或比較例1的組合物中，混合約50萬個/mL的HCT-
116細胞或PC-14細胞的懸浮液(加入10％FBS的DF培養(yǎng)基)，以37℃溫育，每隔2小時確認(rèn)細胞數(shù)。
116細胞或PC-14細胞的懸浮液(加入10％FBS的DF培養(yǎng)基)，以37℃溫育，每隔2小時確認(rèn)細胞數(shù)。
[0092] 結(jié)果在圖2中示出。圖2為以0小時的細胞數(shù)作為100％的細胞數(shù)％為縱軸而制成的圖。如圖2所示，對HCT-116細胞，在實施例1的組合物的情況或比較例1的組合物的情況下，均與沒有酶一樣，幾乎沒有細胞的增減。對于PC-14細胞，沒有酶時細胞增加，在實施例1的組合物的情況下或比較例1的組合物的情況下，細胞都略微增加，沒有確認(rèn)到比初期細胞數(shù)少的情況。如此，實施例1的組合物以及比較例1的組合物的細胞毒性沒有大差別，實施例1的組合物與比較例1的組合物的細胞毒性幾乎相同程度地低。
[0093] 試驗例6應(yīng)用實施例1的組合物以及比較例1的組合物，通過試驗例1的2-7記載的方法從癌組織回收癌細胞，通過試驗例1的8以及10記載的方法將得到的癌細胞包埋培養(yǎng)于膠原蛋白?凝膠?滴7天。培養(yǎng)第2日以及培養(yǎng)7日后的細胞的中性紅(NR)染色圖在圖3示出。
[0094] 如圖3所示，在應(yīng)用比較例1的組合物的情況下，7日培養(yǎng)得到的增殖率是3.5倍，在應(yīng)用實施例1的組合物的情況下，增殖率是4.5倍。如此，在應(yīng)用實施例1的組合物的情況下，與應(yīng)用比較例1的組合物的情況相比，得到適于在膠原蛋白?滴中培養(yǎng)的細胞。
[0095] 試驗例7 細胞回收量：將大腸癌、胃癌、肺癌組織通過試驗例1的2、3記載的方法制成糊狀后分成2組，分別使用實施例1的組合物或比較例1的組合物，通過試驗例1的4、5記載的方法回收癌細胞，用試驗例1的6記載的方法預(yù)培養(yǎng)一夜后，用試驗例1的7記載的方法回收細胞，用臺盼藍染色法測定活細胞數(shù)。測定的細胞數(shù)在下表8-1至表8-3中示出。表8-1至表8-3中，組織的重量表示為了回收細胞使用的癌組織每1組的重量?；厥占毎麛?shù)比較表示同一分析物的實施例1的細胞數(shù)除以比較例1的細胞數(shù)的值。與回收的糊狀組織片中的細胞數(shù)不同，通過測定剛剛預(yù)培養(yǎng)后的細胞數(shù)，可更正確地測定未受損傷的細胞數(shù)。
[0096] 【表8-1】【表8-2】
【表8-3】
【表8-3】
[0097] 如果將回收細胞數(shù)的相對差異不足25%作為相同程度、25%以上作為一方比另一方多，則如表8所示，在使用實施例1的組合物的情況下，與使用比較例1的組合物的情況相比可從癌組織回收相同程度或較多數(shù)的細胞。
[0098] 試驗例8使用實施例1的組合物或比較例1的組合物，通過試驗例1的1-5記載的方法，從10個被分析物的胃癌組織、10個被分析物的大腸癌組織、6個被分析物的肺癌組織、2個被分析物的乳癌組織以及2個被分析物的胰腺癌組織回收癌細胞。應(yīng)用膠原蛋白?凝膠?燒瓶(倉敷紡績株式會社)，通過試驗例1的6記載的方法，預(yù)培養(yǎng)回收的癌細胞。預(yù)培養(yǎng)后，通過試驗例1的7記載的方法，從膠原蛋白?凝膠?燒瓶回收細胞。測定回收的細胞數(shù)量，進行實施例1的情況與比較例1的情況的比較。結(jié)果在下表9中示出。表9中，實施例1表示在實施例1的情況的回收細胞數(shù)比比較例1多25%以上的被分析物數(shù)。比較例1表示在比較例1的情況的回收細胞數(shù)比實施例1多25%以上的被分析物數(shù)。相同程度表示實施例1與比較例1的回收細胞數(shù)的相對差異不足25%的被分析物數(shù)。
[0099] 【表9】
[0100] 如表9所示，在應(yīng)用實施例1的組合物的情況下，對全部4種癌細胞，可確保與在比較例1的組合物的情況下同等以上的細胞數(shù)。另外，在應(yīng)用實施例1的組合物回收的情況下，與應(yīng)用比較例1的組合物的情況相比，從膠原蛋白?凝膠?燒瓶回收細胞時粘附于燒瓶的殘存細胞少，可有效地進行回收操作。
[0101] 在回收來自乳癌組織的癌細胞的情況下，與應(yīng)用實施例1的組合物的情況相比，在應(yīng)用比較例1的組合物的情況下，酶反應(yīng)后的未分解殘渣量少。但是，從膠原蛋白?凝膠?燒瓶的細胞回收量在實施例1的組合物的情況下較多。根據(jù)這一點認(rèn)為，即使實施例1的組合物沒有完全消化乳癌組織，也可使癌細胞從乳癌組織露出，可從乳癌組織有效回收癌細胞。
[0102] 在如此使用實施例1的組合物的情況下，與比較例1的組合物的情況相比，可以不論癌種類地有效回收癌細胞。
[0103] 試驗例9作為培養(yǎng)細胞株，應(yīng)用來自結(jié)腸癌的HCT-116和來自肺癌的PC-14這2種，驗證實施例1的組合物以及比較例1的組合物對于培養(yǎng)細胞株的增殖性的影響。具體地，在含有比較例1或?qū)嵤├?的組合物的酶液中溫育細胞株2小時后，通過試驗例1的8以及10的步驟，實施膠原蛋白?滴包埋培養(yǎng)，驗證24、48、120小時后的細胞增殖性。
[0104] 結(jié)果在圖4示出。如圖4所示，在酶未處理的情況、比較例1的情況、實施例1的情況，沒有確認(rèn)細胞增殖性的不同。如此，通過應(yīng)用實施例1的組合物，可獲得在滴塊狀凝膠中顯示適合的增殖性的細胞。
[0105] 試驗例10 應(yīng)用培養(yǎng)細胞的抗癌劑感受性試驗：設(shè)想組織消化，使來自結(jié)腸癌的HCT-116和來自肺癌的PC-14細胞與實施例1或比較例1的酶組合物接觸2小時后，用試驗例1的方法進行抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)，求出圖像分析值，比較各種藥劑感受性。
[0106] 結(jié)果在圖5中示出。圖5中的T/C率(％)是，將各藥劑濃度下120小時后的圖像分析值除以無藥劑的圖像分析值的值。未處理表示使用不進行酶液處理的細胞的情況下的實驗結(jié)果。如圖5所示，HCT-116以及PC-14中的任一細胞，在使用實施例1的組合物的情況下，對5-FU、順鉑(CDDP)以及SN-38的藥劑感受性與比較例1的組合物的情況為相同程度。另外，對于多西他塞以及奧沙利鉑，同樣地，在調(diào)查藥劑感受性時，在實施例1的組合物的情況、比較例1的組合物的情況、以及未處理的情況，藥劑感受性為相同程度。如此，通過應(yīng)用實施例1的組合物，可獲得對5-FU、CDDP、SN-38、多西他塞以及奧沙利鉑等各種抗癌劑表示同等的藥劑感受性的細胞。
[0107] 試驗例11對大腸癌細胞，通過與試驗例10同樣的方法求得使用實施例1或比較例1的情況的T/C(％)值進行1比1作圖。結(jié)果在圖6中示出。
[0108] 如圖6所示，從圖數(shù)據(jù)獲得斜率為1確認(rèn)到高相關(guān)性的回歸線。根據(jù)這一點，可認(rèn)為實施例1的組合物和比較例1的組合物在大腸癌有同等的藥劑感受性評價。
[0109] 試驗例12 抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)的成功率：使用實施例1的組合物或比較例1的組合物，通過試驗例1的方法，實施抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)。CD-DST法的實施分別對多數(shù)的被分析物進行。
[0110] 結(jié)果，一部分被分析物的情況無法完成CD-DST法。無法完成的原因是，沒有確認(rèn)集落狀的癌細胞增殖，沒有通過圖像分析得到有效的數(shù)值數(shù)據(jù)。將沒有這樣的問題、能夠進行感受性試驗的分析的被分析物數(shù)作為成功數(shù)。將成功數(shù)相對于作為實施的被分析物數(shù)的實施數(shù)的比例作為成功率(％)。將成功率等數(shù)值結(jié)果在下表10中示出。
[0111] 【表10】
[0112] 如表10所示，在使用實施例1的組合物的情況下，對任一癌癥種類都得到高的CD-DST法的成功率。根據(jù)這一點可知，實施例1的組合物在用于回收適于感受性試驗的形式的癌細胞中是有益的。
[0113] 試驗例13 胃癌病例的膠原蛋白?凝膠?滴培養(yǎng)細胞染色圖的比較：試驗例12中，在胃癌的情況下，對于培養(yǎng)的結(jié)果確認(rèn)到癌細胞的增殖的3個被分析物，將增殖后的細胞的中性紅染色圖在圖7中示出。
[0114] 如圖7所示，對于分析物1，實施例1這一方為深染色的癌細胞的增殖良好。另一方面，比較例1通過圖像分析得不到有效的數(shù)值數(shù)據(jù)，沒有進行CD-DST法。在實施例1的情況，認(rèn)為能夠回收更多細胞也是主要因素之一。
[0115] 對于分析物2、3，雖然接種相同程度的細胞數(shù)，但對于在培養(yǎng)144小時后的深染色癌細胞的增殖性，實施例1這一方是良好的。在分析物2的比較例1的情況下，通過圖像分析得不到有效的數(shù)值數(shù)據(jù)，沒有進行CD-DST法，但在分析物2的實施例1得到有效的數(shù)值數(shù)據(jù)，完成CD-DST法。
[0116] 如上述，應(yīng)用實施例1的組合物的情況下，從胃癌、大腸癌、乳癌等各種癌組織獲得以適于抗癌劑感受性試驗的形式增殖的合適細胞。
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