首頁 /
專利庫 /
病理 / 神經(jīng)退行性變 / 牛海綿狀腦病 / 噬菌體的P3作為淀粉樣蛋白結合劑的用途
噬菌體的P3作為淀粉樣蛋白結合劑的用途
閱讀：404發(fā)布：2020-06-23
專利匯可以提供噬菌體的P3作為淀粉樣蛋白結合劑的用途專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且本 發(fā)明 涉及用于減少 淀粉 樣蛋白形成和/或用于促進淀粉樣蛋白解聚的 試劑 和藥物組合物。所述組合物也可以用于檢測淀粉樣蛋白。，下面是噬菌體的P3作為淀粉樣蛋白結合劑的用途專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種藥物組合物，其包含結合淀粉樣蛋白的多肽和藥學上可接受的載體，其中所述多肽包含至少一個基因3蛋白(g3p)或其淀粉樣蛋白結合片段，其中所述組合物不包含噬菌體。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其中所述多肽包含g3p的N2結構域的淀粉樣蛋
白結合片段。
3.根據(jù)權利要求2所述的藥物組合物，其中所述多肽包含g3p的整個N2結構域。
4.根據(jù)權利要求2-3中的任一項所述的藥物組合物，其中所述多肽進一步包含g3p的
N1結構域的片段。
5.根據(jù)權利要求2-3中的任一項所述的藥物組合物，其中所述多肽進一步包含g3p的
整個N1結構域。
6.根據(jù)權利要求1-5中的任一項所述的藥物組合物，其中所述多肽包含g3p。
7.根據(jù)權利要求1-6中的任一項所述的藥物組合物，其中所述多肽進一步包含載體，所述載體與所述多肽共價地或非共價地連接。
8.根據(jù)權利要求1-7中的任一項所述的藥物組合物，其中存在于所述多肽中的至少一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的氨基酸序列與野生型g3p的對應部分的氨基酸序列相同。
9.根據(jù)權利要求1-8中的任一項所述的藥物組合物，其中存在于所述多肽中的至少一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段是突變體g3p。
10.根據(jù)權利要求1-9中的任一項所述的藥物組合物，其中所述g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的氨基酸序列與SEQ ID NO:1-20中的任一個的對應部分具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性。
11.根據(jù)權利要求9或權利要求10所述的藥物組合物，其中所述多肽包含g3p的N1和
N2結構域，其中N2的鉸鏈區(qū)是突變的，使得鉸鏈Tm低于野生型M13噬菌體的鉸鏈Tm，且其中所述多肽以比M13更高的親和力結合淀粉樣蛋白。
12.一種融合蛋白，其包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域結合淀粉樣蛋白，其中所述第一結構域包含至少一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。
13.根據(jù)權利要求12所述的融合蛋白，其中所述第一結構域包含g3p的N2結構域的淀
粉樣蛋白結合片段。
14.根據(jù)權利要求12或權利要求13所述的融合蛋白，其中所述第一結構域包含整個
N2結構域。
15.根據(jù)權利要求13或權利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一結構域進一步包含g3p的N1結構域的片段。
16.根據(jù)權利要求13或權利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一結構域進一步包含g3p的整個N1結構域。
17.根據(jù)權利要求12-16中的任一項所述的融合蛋白，其中存在于所述第一結構域中
的至少一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的氨基酸序列與野生型g3p的對應部分的氨基酸序列相同。
18.根據(jù)權利要求12-17中的任一項所述的融合蛋白，其中，存在于所述融合蛋白中的至少一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段是突變體或變體g3p。
19.根據(jù)權利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一結構域包含g3p的突變體或變體
或它們的片段，其保留g3p的結合淀粉樣蛋白的能力，且當與SEQ ID NO:1-20中的任一個的氨基酸序列的對應部分比對時，其具有包含不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、
7、6、5、4、3、2或1個氨基酸差異的氨基酸序列。
20.根據(jù)權利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一結構域包含g3p的N1和N2結構
域片段，其中N1和N2結構域中的至少一個包含沒有破壞所述片段的結合淀粉樣蛋白的能力的突變，且其中所述N1和N2結構域片段當與SEQ ID NO:1-20中的任一個的對應氨基酸比對時，具有包含不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸差異的氨基酸序列。
21.根據(jù)權利要求12-20中的任一項所述的融合蛋白，其中所述第二結構域包含免疫
球蛋白恒定區(qū)。
22.根據(jù)權利要求21所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)是Fc片段。
23.根據(jù)權利要求22所述的融合蛋白，其中所述Fc片段選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM的Fc片段。
24.根據(jù)權利要求12所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含與SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:11或SEQ ID NO:13具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少
98％同一性的氨基酸序列。
25.根據(jù)權利要求24所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含與SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:11或SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列。
26.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權利要求12-25中的任一項所述的融合蛋白。
27.一種藥物組合物，其包含分離的絲狀噬菌體，所述絲狀噬菌體表達突變體或變體g3p。
28.根據(jù)權利要求27所述的藥物組合物，其中所述突變體或變體g3p的氨基酸序列與
SEQ ID NO:1具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性。
29.一種藥物組合物，其包含分離的絲狀噬菌體，所述絲狀噬菌體表達g3p的5個或更多個拷貝，或突變體或變體g3p的5個或更多個拷貝。
30.根據(jù)權利要求1-11或26-29中的任一項所述的藥物組合物或根據(jù)權利要求12-25
中的任一項所述的融合蛋白，其用于在有此需要的患者中減少淀粉樣蛋白、抑制淀粉樣蛋白形成、抑制淀粉樣蛋白聚集、或除去有毒寡聚體和/或阻止有毒寡聚體的形成。
31.根據(jù)權利要求1-11或26-29中的任一項所述的藥物組合物或根據(jù)權利要求12-25
中的任一項所述的融合蛋白，其用于治療選自以下的疾病或病癥：阿爾茨海默氏病，包括早發(fā)型阿爾茨海默氏病、遲發(fā)型阿爾茨海默氏病和癥狀發(fā)生前的阿爾茨海默氏病；帕金森病；
SAA淀粉樣變性；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；遺傳性冰島綜合征；年老；多發(fā)性骨髓瘤；朊病毒病，包括庫魯病、克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)、羊瘙癢癥和牛海綿狀腦炎(BSE)；肌萎縮性側索硬化(ALS)；脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA1、SCA3、SCA6或SCA7)；亨廷頓病；齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮；脊髓延髓肌肉萎縮癥；遺傳性腦淀粉樣蛋白血管??；家族性淀粉樣變性；額顳葉癡呆；英國/丹麥癡呆；和家族性腦病。
32.根據(jù)權利要求30或權利要求31所述的藥物組合物，其中當將生物標志物
florbetapir用作正電子發(fā)射斷層攝影術中的成像劑時，所述患者是所述生物標志物陽性的。
33.根據(jù)權利要求30-32中的任一項所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥是帕金
森病、阿爾茨海默氏病或亨廷頓病。
34.根據(jù)權利要求33所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥是阿爾茨海默氏病。
35.根據(jù)權利要求31所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥是朊病毒病。
36.根據(jù)權利要求35所述的藥物組合物，其中所述朊病毒病選自：克雅病、庫魯病、致死性家族性失眠癥和 綜合征。
37.一種減少有此需要的患者中的淀粉樣蛋白的方法，所述方法包括：給所述患者施用有效量的根據(jù)權利要求1-11或26-29中的任一項所述的藥物組合物或根據(jù)權利要求
12-25中的任一項所述的融合蛋白。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述患者正在表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白的存在有關的神經(jīng)變性疾病的征狀。
39.根據(jù)權利要求37或權利要求38所述的方法，其中當將生物標志物florbetapir用
作正電子發(fā)射斷層攝影術中的成像劑時，所述患者是所述生物標志物陽性的。
40.根據(jù)權利要求37-39中的任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病、阿爾茨海默氏病或亨廷頓病。
41.根據(jù)權利要求40所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
42.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述患者正在表現(xiàn)出朊病毒介導的疾病的征
狀。
43.根據(jù)權利要求42所述的方法，其中所述朊病毒介導的疾病選自：克雅病、庫魯病、致死性家族性失眠癥或 綜合征。
44.一種編碼結合淀粉樣蛋白的多肽的核酸，其中所述多肽包含g3p或其淀粉樣蛋白
結合片段，其中所述多肽與SEQ ID NO:1相比包含在所述g3p或其淀粉樣蛋白結合片段中的一個或多個突變，且其中所述突變非排它地選自Q129H、G153D、W181A、F190A和F194A。
45.根據(jù)權利要求44所述的核酸，其中所述多肽包含g3p的N2結構域的淀粉樣蛋白結
合片段。
46.一種載體，其包含根據(jù)權利要求44或權利要求45所述的核酸。
47.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求46所述的載體。
48.一種制備結合淀粉樣蛋白的多肽的方法，其中所述多肽包含g3p或其淀粉樣蛋白
結合片段，其中所述多肽與SEQ ID NO:1相比包含在N2部分中的一個或多個突變，且其中所述突變非排它地選自Q129H、G153D、W181A、F190A和F194A，所述方法包括：表達由根據(jù)權利要求46所述的載體中的核酸編碼的多肽，和分離表達的蛋白。
49.根據(jù)權利要求48所述的方法，其中所述多肽包含g3p的N2結構域的淀粉樣蛋白結
合片段。
50.一種核酸，其編碼根據(jù)權利要求12-25中的任一項所述的融合蛋白。
51.一種載體，其包含根據(jù)權利要求50所述的核酸。
52.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求51所述的載體。
53.一種制備根據(jù)權利要求12-25中的任一項所述的融合蛋白的方法，所述方法包括：
表達由根據(jù)權利要求51所述的載體中的核酸編碼的融合蛋白，和分離表達的融合蛋白。
54.根據(jù)權利要求1-11中的任一項所述的藥物組合物或根據(jù)權利要求12-25中的任一
項所述的融合蛋白，其中所述組合物中的多肽或所述融合蛋白進一步包含可檢測標記。
18 11
55.根據(jù)權利要求54所述的藥物組合物或融合蛋白，其中所述標記是選自 F、C或
123
I的放射性標記。
56.一種檢測患者中的淀粉樣蛋白的方法，所述方法包括下述步驟：
a)給所述患者施用根據(jù)權利要求54所述的藥物組合物或融合蛋白；和
b)檢測所述標記。
57.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中通過正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)檢測所述標
記。
58.一種成像劑，其包含根據(jù)權利要求54或55所述的組合物。
59.一種用于診斷患者中與淀粉樣蛋白有關的疾病或障礙的方法，所述方法包括下述步驟：
a)給所述患者施用根據(jù)權利要求58所述的成像劑；
b)允許所述試劑結合存在的任何淀粉樣蛋白；
c)檢測已經(jīng)與淀粉樣蛋白結合的任何成像劑，和
d)當檢測到所述成像劑時，診斷與淀粉樣蛋白有關的疾病或障礙。
噬菌體的P3作為淀粉樣蛋白結合劑的用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含絲狀噬菌體g3p蛋白、g3p的淀粉樣蛋白結合片段以及g3p的結合淀粉樣蛋白的突變體和變體，并涉及這樣的組合物作為治療劑用于降低與疾病有關的淀粉樣蛋白負載的用途，所述疾病為諸如全身性和周圍性淀粉樣蛋白疾病、神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性Tau病變和傳播性海綿狀腦病(朊病毒相關的疾病)。也包括那些組合物用于預防與這些疾病有關的淀粉樣蛋白負載的積累的用途，以及那些組合物作為診斷劑用于檢測淀粉樣蛋白和從而診斷這樣的疾病的用途。
背景技術
[0002] 絲狀噬菌體M13和有關的絲狀噬菌體已經(jīng)表現(xiàn)出在蛋白錯誤折疊疾病的動物模型中的效用，并因此代表蛋白錯誤折疊疾病的潛在治療劑類別。參見美國專利公開US
2011/0142803，通過引用整體并入本文。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，絲狀噬菌體具有介導已經(jīng)在腦中形成的淀粉樣蛋白的清除的能力。參見，例如，WO2006083795和WO2010060073，通過引用整體并入本文。
2011/0142803，通過引用整體并入本文。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，絲狀噬菌體具有介導已經(jīng)在腦中形成的淀粉樣蛋白的清除的能力。參見，例如，WO2006083795和WO2010060073，通過引用整體并入本文。
[0003] 形成淀粉樣蛋白的疾病的特征在于神經(jīng)元變性和錯誤折疊的、聚集的蛋白在腦中的存在。這些錯誤折疊的和聚集的蛋白在不同的疾病中存在差異，但是在大多數(shù)情況下，它們具有結合剛果紅染料并顯示蘋果綠雙折射的交叉-β-折疊片結構。預期淀粉樣蛋白的除去會減輕多種以淀粉樣蛋白為特征的疾病、減慢所述疾病的進展、或甚至逆轉與所述疾病有關的征狀。
[0004] 用于預防和/或逆轉與形成淀粉樣蛋白的疾病有關的病理學和/或征狀的潛在治療方案包括，例如，抑制淀粉樣蛋白形成、促進淀粉樣蛋白清除和抑制淀粉樣蛋白聚集。參見，例如，Aguzzi&O-Connor,Nature Review Drug Discovery(2010)9:237-48。除去有毒寡聚體和/或阻止有毒寡聚體的形成，在形成淀粉樣蛋白的疾病的治療和預防中也可能是有益的。出處同上。
[0005] 已知與錯誤折疊的和/或聚集的蛋白有關的神經(jīng)變性疾病包括：阿爾茨海默氏病、帕金森病、朊病毒病、神經(jīng)變性Tau病變、肌萎縮性側索硬化(ALS)、脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷頓病、齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮、脊髓延髓肌肉萎縮癥、遺傳性腦淀粉樣蛋白血管病、家族性淀粉樣變性、額顳葉退化(FTLD)包括額顳葉癡呆、英國/丹麥癡呆和家族性腦病。其它疾病涉及周圍的錯誤折疊的和/或聚集的蛋白—所以被稱作周圍性淀粉樣變性。參見，例如，Chiti&Dobson,Annu Rev Biochem(2006)75:333-66；和Josephs等人,Acta Neuropathol(2011)122:137-153。對于預防和/或減少淀粉樣蛋白聚集體形成(即，錯誤折疊的和/或聚集的蛋白)以治療這些
疾病或減輕這些疾病的征狀或嚴重程度，存在巨大需求。
疾病或減輕這些疾病的征狀或嚴重程度，存在巨大需求。
[0006] 近年來，國立老齡研究所(National Institute on Aging)和阿爾茨海默氏病協(xié)會(Alzheimer’s Association)公布了診斷“所有原因”癡呆和阿爾茨海默氏病癡呆的標準。參見，McKhann等人,Alzheimer’s&Dementia,(2011)7(3):263-9?；谠撝笇?，當行為或認知征狀滿足5個試驗時，診斷為“所有原因”癡呆，所述試驗包括，例如，干擾在工作時或在慣?；顒訒r起作用的能力，和從以前的功能和執(zhí)行水平的下降。所述試驗包括病史采集和客觀認知評估的組合。如本文中所述的，絲狀噬菌體g3p蛋白、g3p的淀粉樣蛋白結合片段和g3p的結合淀粉樣蛋白的突變體和變體會結合淀粉樣蛋白的發(fā)現(xiàn)，提供了用于診斷任何疾病或由淀粉樣蛋白形成引起的癡呆(包括“所有原因”癡呆和阿爾茨海默氏病癡呆)的補充方法。
[0007] 絲狀噬菌體是一組結構上相關的病毒，其感染細菌細胞且含有環(huán)形單鏈DNA基因組。它們在生產(chǎn)性感染過程中不會殺死它們的宿主。Rasched和Oberer,MicrobiolRev(1986)50:401-427。絲狀噬菌體的例子包括Ff家族的噬菌體(例如，M13、f1
和fd)。自1978年以來，已經(jīng)知道fd的核苷酸序列。Beck等人,Nucleic Acids
Research(1978)5(12):4495-4503。在1980年公布了M13的完整序列。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。在1982年之前對噬菌體f1進行了測序。Hill和Petersen,J.Virol.(1982)44(1):32-46。f1基因組包含6407個核苷酸，其比噬菌體fd小。它與fd序列相差186個核苷酸(包括1個核苷酸缺失)，從而導致噬菌體f1和fd的蛋白之間的12個
氨基酸差異。f1序列與M13序列相差52個核苷酸，從而導致對應的蛋白之間的5個氨基酸差異。出處同上。M13和fd的DNA序列相差192個(3％)核苷酸，但是這些差異中的僅12
個導致對應的氨基酸序列的變化(6.25％)。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。
和fd)。自1978年以來，已經(jīng)知道fd的核苷酸序列。Beck等人,Nucleic Acids
Research(1978)5(12):4495-4503。在1980年公布了M13的完整序列。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。在1982年之前對噬菌體f1進行了測序。Hill和Petersen,J.Virol.(1982)44(1):32-46。f1基因組包含6407個核苷酸，其比噬菌體fd小。它與fd序列相差186個核苷酸(包括1個核苷酸缺失)，從而導致噬菌體f1和fd的蛋白之間的12個
氨基酸差異。f1序列與M13序列相差52個核苷酸，從而導致對應的蛋白之間的5個氨基酸差異。出處同上。M13和fd的DNA序列相差192個(3％)核苷酸，但是這些差異中的僅12
個導致對應的氨基酸序列的變化(6.25％)。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。
[0008] 絲狀噬菌體的結構是非常確定的，且綜述在，例如，Marvin,Curr.Opin.in Struct.Biol.(1998)8:150-158；Rasched 和 Oberer,Microbiological Reviews
(1986)50(4):401-427。絲狀噬菌體具有“外殼”，其包含由基因8編碼的主要衣殼蛋白(g8p、p8或pVIII)的數(shù)千個拷貝。裝配的g8p-DNA復合物形成噬菌體的特征性絲狀形狀。
次要外殼蛋白(即，僅以幾個(3-5個)拷貝存在的那些)位于絲的末端處。這些尖蛋白之一g3p(也被稱作p3或pIII)是細菌宿主結合和開始感染所必需的。
(1986)50(4):401-427。絲狀噬菌體具有“外殼”，其包含由基因8編碼的主要衣殼蛋白(g8p、p8或pVIII)的數(shù)千個拷貝。裝配的g8p-DNA復合物形成噬菌體的特征性絲狀形狀。
次要外殼蛋白(即，僅以幾個(3-5個)拷貝存在的那些)位于絲的末端處。這些尖蛋白之一g3p(也被稱作p3或pIII)是細菌宿主結合和開始感染所必需的。
[0009] M13噬菌體具有406個氨基酸的成熟g3p。GenBank Ref Seq NP_510891.1提供了一種參照序列，其包括18殘基氨基端信號序列。與公開的序列相比具有氨基酸差異的變體是常見的。I-家族的絲狀噬菌體具有與Ff家族成員不同的g3p，但是即使在家族g3p之間仍然是高度保守的。Stassen等人,J Mol Evol(1992)34:141-52。
[0010] 可得到g3p的晶體結構。Lubkowski等人,Structure(1998)7(6)711-722。該蛋白包含3個被柔性的富含甘氨酸的接頭序列隔開的折疊結構域。2個氨基端結構域N1和N2(包含262個氨基酸)相互作用以形成N1-N2復合物。羧基端(CT,也稱為N3)結構域
是146個氨基酸，它通過與g8p的疏水相互作用而起將g3p錨定在噬菌體顆粒中的作用。
Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8:150-158。在圖1中呈現(xiàn)了可公開得到的、使用Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4):649-57的N1-N2結構域融合蛋白2g3p制備的帶結構。
是146個氨基酸，它通過與g8p的疏水相互作用而起將g3p錨定在噬菌體顆粒中的作用。
Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8:150-158。在圖1中呈現(xiàn)了可公開得到的、使用Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4):649-57的N1-N2結構域融合蛋白2g3p制備的帶結構。
[0011] 不同于大多數(shù)蛋白，g3p需要N1和N2結構域從潛在的“鎖定”形式解折疊才能獲得它的天然生物活性。Eckert&Schmid,J.Mol.Biol.(2007)373:452-461。在感染的初始步驟中，N2經(jīng)由在N2的外邊緣上的殘基結合細菌性菌毛。Deng&Perham,2002。N2的該初始結合會通過“打開”N1-N2復合物而“解鎖”g3p，從而允許N1然后結合共受體TolA。在g3p的N1-N2片段中，在其中N2展開的初始解鎖步驟的熱轉變發(fā)生在48.1℃的解鏈溫度(TM)。該過程的一部分涉及在Gln212-Pro213肽鍵處的異構化。Pro213轉化在解鎖狀態(tài)是反式的。在發(fā)生于TM60.2℃的第二步之前，N1保持穩(wěn)定折疊。綜述見Eckert&Schmid,2007。
[0012] 已經(jīng)使用N1-N2片段中的突變來研究不同突變體的穩(wěn)定性和侵染性。Eckert&Schmid,2007。一種變體(被命名為“3A”)會損害菌毛結合和降低N2結構域的穩(wěn)定性。由于該突變，TM下降至42.6℃。3A攜帶下述突變：W181A、F190A和F194A。N2的另一種突變體G153D會使N2失穩(wěn)，從而使TM下降至44.4℃。Q129H突變體會穩(wěn)定化N2，從而使TM增加至51.4℃。IY變體含有在鉸鏈中的突變T101I和D209Y，并增加N1-N2片段的穩(wěn)定性(TM＝56.5℃)。IHY含有突變T101I、Q129H和D209Y(TM＝60.1℃)。IIHY含有突變
T13I、T101I、Q129H和D209Y(TM＝61.8℃)。Q129Y和T13I突變都是起穩(wěn)定作用的，添加這些突變會進一步增加解鏈溫度TM。噬菌體侵染性隨著g3p內(nèi)的結構域相互作用的強度而相反地變化。Eckert&Schmid,2007。N2結構域的刪除(噬菌體fd(ΔN2))會通過除去N2
結構域對TolA的N1結合的阻斷作用而增加侵染性。出處同上。
T13I、T101I、Q129H和D209Y(TM＝61.8℃)。Q129Y和T13I突變都是起穩(wěn)定作用的，添加這些突變會進一步增加解鏈溫度TM。噬菌體侵染性隨著g3p內(nèi)的結構域相互作用的強度而相反地變化。Eckert&Schmid,2007。N2結構域的刪除(噬菌體fd(ΔN2))會通過除去N2
結構域對TolA的N1結合的阻斷作用而增加侵染性。出處同上。
發(fā)明內(nèi)容
[0013] 本發(fā)明部分地基于下述發(fā)現(xiàn)：g3p也以類似于噬菌體感染細菌的過程的方式介導絲狀噬菌體與淀粉樣蛋白的結合。美國專利號7,867,487假定，在該專利中報道的噬菌體在解聚淀粉樣蛋白中的治療效果的根本機制是，噬菌體的長、薄結構可能使它沿著淀粉樣蛋白纖維構造。另外，有人提議，在g8p(主要外殼蛋白)中存在的高α螺旋含量可能干擾淀粉樣蛋白的β折疊結構。該機制與所述專利的以下報道相一致：納摩爾量的噬菌體可以解聚微摩爾量的β-淀粉樣蛋白，這可以提示，噬菌體的高拷貝組分(即，g8p)在介導該效應。它也與US20110182948中的以下報道相一致：煙草花葉病毒(其具有與絲狀噬菌體類似的結構)可以造成解聚。因而，該早期工作提示，完整結構(具有許多α螺旋的長絲)對于治療效果而言是重要的，或者，如果特定外殼蛋白是重要的，那么在噬菌體外殼上高度呈現(xiàn)該蛋白，諸如g8p。該早期工作都沒有提供噬菌體的分離組分(相對于完整噬菌體)可以結合淀粉樣蛋白和/或造成它的解聚的任何暗示。此外，從未存在絲狀噬菌體的次要外殼蛋白在它的結合和解聚淀粉樣蛋白的能力中起作用的任何暗示。
[0014] 但是，本公開內(nèi)容提供了替代性的(盡管不一定相互排斥的)作用機理的證據(jù)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，噬菌體g3p會直接地結合淀粉樣蛋白纖維，并且噬菌體介導的解聚依賴于該初始結合步驟。發(fā)明人的g3p負責絲狀噬菌體介導的淀粉樣蛋白結合的認識提供了噬菌體治療效果的機制，以及提供了新類型的治療劑和診斷劑的基礎。
[0015] 本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將在下面的描述中部分地闡述，并且將從所述描述部分地明白，或者可以通過本發(fā)明的實踐來獲知。借助于在所附權利要求中特別指出的要素和組合，將會實現(xiàn)和達到本發(fā)明的目的和優(yōu)點。
[0017] 圖1呈現(xiàn)了g3p的N1和N2結構域的帶結構和鉸鏈。
[0018] 圖2A-2C呈現(xiàn)了得自不同來源的g3p的比對。圖2A是得自噬菌體M13(SEQ IDNO:1)、Fd(SEQ ID NO:2)和F1(SEQ ID NO:3)的g3p的比對，包括共有序列(SEQ ID NO:4)。
Fig2B顯示了得自噬菌體I2-2(SEQ ID NO:5)和Ike(SEQ ID NO:6)的g3p的比對，以及在I2-2和Ike之間的共有序列(SEQ ID NO:7)。圖2C呈現(xiàn)了得自噬菌體If的g3p的氨基酸
序列(SEQ ID NO:8)。
Fig2B顯示了得自噬菌體I2-2(SEQ ID NO:5)和Ike(SEQ ID NO:6)的g3p的比對，以及在I2-2和Ike之間的共有序列(SEQ ID NO:7)。圖2C呈現(xiàn)了得自噬菌體If的g3p的氨基酸
序列(SEQ ID NO:8)。
[0019] 圖3A呈現(xiàn)了噬菌體結合的表面等離子體共振(SPR)研究。使用流過生物傳感器14
芯片的10 噬菌體/mL，對比了與Aβ纖絲的結合和與Aβ單體的結合。圖3B顯示了從圖
3A所示的SPR數(shù)據(jù)計算出的Ka、Kd和KD。
芯片的10 噬菌體/mL，對比了與Aβ纖絲的結合和與Aβ單體的結合。圖3B顯示了從圖
3A所示的SPR數(shù)據(jù)計算出的Ka、Kd和KD。
[0020] 圖4A和4B呈現(xiàn)了結合研究。圖4A顯示了2種噬菌體劑量(1011/mL和1012/mL)的直接結合測定，其中逐漸增加fAβ42的摩爾量。圖4B是結合競爭研究，并提供了用于確定M13結合的KD的替代方式。使用了構建體1。
[0021] 圖5顯示了在淀粉樣蛋白纖維結合競爭測定中使用熱變性的(框-90℃保持10分鐘)相對于天然構象(圓圈)M13(構建體1)的結合競爭結果。
[0022] 圖6顯示了硫代黃素T(ThT)熒光測定，其使用在有或沒有2種濃度的M13噬菌體(構建體1)存在下溫育的fAβ42。
[0023] 圖7A和7B顯示了在ThT解聚測定中改變各個測定參數(shù)的作用。圖7A呈現(xiàn)了在有2種鹽濃度(0.15M和1.5M)存在下的解聚百分比。圖7B呈現(xiàn)了在2種溫度(4℃和37℃)
下剩余的fAβ的百分比。使用了構建體1。
下剩余的fAβ的百分比。使用了構建體1。
[0024] 圖8A和8B描繪了使用fAβ42的M13-淀粉樣蛋白結合測定。在圖8A中，使用保持3小時的18℃至58℃的溫育溫度，報告了M13結合。圖8B顯示了在37℃相對于50℃的
溫育的結合動力學。
溫育的結合動力學。
[0025] 圖9A-9C顯示了g3p的蛋白水解除去對噬菌體-淀粉樣蛋白相互作用的影響。使用蛋白酶Arg C從M13噬菌體切掉g3p(M13Δg3p)。圖9A呈現(xiàn)了使用M13Δg3p噬菌體相對于天然(與ArgC處理的噬菌體相同地處理，但是沒有蛋白酶處理)噬菌體的Aβ結合競爭研究的結果。圖9B顯示了與天然噬菌體相比，Arg C處理對M13Δg3p噬菌體的侵染性的影響。圖9C在解聚測定中對比了ArgC處理的噬菌體和天然噬菌體。
[0026] 圖10A和10B呈現(xiàn)了使用g3p的N1-N2片段作為標記的M13與fAβ42的結合的競爭劑的結合競爭測定的結果，所述N1-N2片段在本文中被稱作重組可溶性
N1N2(rs-g3p(N1N2)；“構建體3”)、M13Δg3p(Arg C處理的)和M13。圖10B顯示了所述競爭測定的重復。
N1N2(rs-g3p(N1N2)；“構建體3”)、M13Δg3p(Arg C處理的)和M13。圖10B顯示了所述競爭測定的重復。
[0027] 圖11呈現(xiàn)了噬菌體fd、IIHY、AAA和M13的競爭數(shù)據(jù)。將噬菌體fd、AAA和IIHY在50℃預活化1.5小時，然后對比活化的和非活化的Fd、AAA和IIHY在37℃溫育45分鐘中與標記的M13競爭結合Aβ的能力。
[0028] 圖12A顯示了rs-g3p(N1N2)(構建體3)的示意圖。圖12B呈現(xiàn)了rs-g3p(N1N2)的離子交換特性。圖12C顯示了使用Sephacryl S-300和rs-g3p(N1N2)的凝膠過濾測定
的結果。圖12D顯示了rs-g3p(N1N2)以及g3p和g8p對照的蛋白質(zhì)印跡。M13噬菌體在泳
道1和2中泳動作為陽性對照，并用多克隆抗-M13抗體(其檢測g8p和g3p)檢測。純化
的rs-g3p在泳道3和4中泳動，并用相同的多克隆抗-M13抗體檢測。
的結果。圖12D顯示了rs-g3p(N1N2)以及g3p和g8p對照的蛋白質(zhì)印跡。M13噬菌體在泳
道1和2中泳動作為陽性對照，并用多克隆抗-M13抗體(其檢測g8p和g3p)檢測。純化
的rs-g3p在泳道3和4中泳動，并用相同的多克隆抗-M13抗體檢測。
[0029] 圖13呈現(xiàn)了使用rs-g3p(N1N2)(構建體3)的SPR數(shù)據(jù)。rs-g3p(N1N2)以約160nM的KD有效地結合fAβ42，但是不會結合單體。
[0030] 圖14呈現(xiàn)了用于測量在給定樣品中存在的淀粉樣蛋白的ThT熒光測定。將10μM Aβ42單體在有或沒有5種濃度的rs-g3p(N1N2)(構建體3)存在下在37℃溫育3天。通過定量結合的ThT熒光，測量在3天結束時形成的纖維的量。IC50是大約20nM，從而指示rs-g3p(N1N2)有效地抑制Aβ42纖維的形成。該圖也指示，結合是劑量依賴性的。
[0031] 圖15A顯示了在有或沒有rs-g3p(N1N2)(構建體3)存在下溫育fAβ42的透射電子顯微鏡檢查(TEM)結果。圖15B顯示了ThT熒光測定的結果，其中使用在37℃溫育7天
的Aβ42和2μM rs-g3p(N1N2)(構建體3)。rs-g3p(N1N2)會阻斷fAβ42的形成。
的Aβ42和2μM rs-g3p(N1N2)(構建體3)。rs-g3p(N1N2)會阻斷fAβ42的形成。
[0032] 圖16證實，rs-g3p(N1N2)(構建體3)有效地抑制α-突觸核蛋白纖維的形成。通過在37℃在300rpm攪拌4天，裝配25μMα-突觸核蛋白(參見，條1)。該圖上的條2描-13
繪了在37℃搖動3天的α-突觸核蛋白單體+1x10 五聚體M13噬菌體。條2所示的結果
指示，五聚體M13會阻斷α-突觸核蛋白纖維的裝配。該圖上的條3描繪了α-突觸核蛋
白單體+83nM rsg3p單體。條3所示的結果指示，單體在抑制α-突觸核蛋白纖維形成方面的有效性低于五聚體M13。條4是顯示在時間0的α突觸核蛋白單體的陰性對照。在條
5中，顯示了在沒有α-突觸核蛋白纖維的情況下的g3p單體，以確定g3p是否結合pTAA和隔離染料從而免于結合纖維。條5所示的結果指示，g3p不會結合pTAA。
繪了在37℃搖動3天的α-突觸核蛋白單體+1x10 五聚體M13噬菌體。條2所示的結果
指示，五聚體M13會阻斷α-突觸核蛋白纖維的裝配。該圖上的條3描繪了α-突觸核蛋
白單體+83nM rsg3p單體。條3所示的結果指示，單體在抑制α-突觸核蛋白纖維形成方面的有效性低于五聚體M13。條4是顯示在時間0的α突觸核蛋白單體的陰性對照。在條
5中，顯示了在沒有α-突觸核蛋白纖維的情況下的g3p單體，以確定g3p是否結合pTAA和隔離染料從而免于結合纖維。條5所示的結果指示，g3p不會結合pTAA。
[0033] 圖17呈現(xiàn)了rs-g3p(N1N2)(構建體3)、M13(構建體2)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構建體4)和IgG4-Fc陰性對照的競爭結合數(shù)據(jù)。
[0034] 圖18呈現(xiàn)了對比M13(構建體2；正方形)、rs-g3p(N1N2)(構建體3；三角形)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構建體4；倒轉三角形)和重組IgG4-Fc陰性對照(菱形)的競爭結合數(shù)據(jù)。
[0035] 圖19顯示了對比5種濃度的Aβ42纖維加或減2種濃度的M13(構建體2)、800nM rs-g3p(N1N2)(構建體3)和3種濃度的rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構建體4)的過濾器截留測定。
[0036] 圖20呈現(xiàn)了rs-g3p(N1N2)(構建體3；“單體”)和抗生蛋白鏈菌素綴合的rs-g3p(N1N2)(“SA[g3pN1N2]n＝2-4”；“SA-g3p”；“四聚體”)的競爭結合數(shù)據(jù)。對比了rs-g3p(N1N2)和SA-g3p在37℃溫育3小時過程中與標記的M13競爭結合Aβ的能力。
[0037] 圖21顯示了對比5種濃度的fAβ42加或減2種濃度的rs-g3p(N1N2)(構建體3；“單體”)和2種濃度的SA-g3p(“四聚體”)的過濾器截留測定。
[0038] 圖22A和22B顯示了在時間0(圖22A)和與SA-g3p一起溫育3天后(圖22B)的fAβ42的TEM。
[0039] 圖23顯示了一種rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構建體“構建體4”的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。從“構建體1”(SEQ ID NO:10)的N1N2區(qū)域衍生出“構建體4”的N1N2區(qū)域。
[0040] 圖24顯示了另一種rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構建體“構建體5”的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。從“構建體2”(SEQ ID NO:12)的N1N2區(qū)域衍生出“構建體5”的N1N2區(qū)域。
[0041] 圖25顯示了一種rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc構建體“構建體6”的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。從“構建體2”的N1N2區(qū)域衍生出“構建體6”的N1N2區(qū)域。
[0042] 圖26顯示了得自fd(SEQ ID NO:14)、f1(SEQ ID NO:15)、M13(SEQ ID NO:16)、Ike(SEQ ID NO:17)、I2-2(SEQ ID NO:18)和If1(SEQ ID NO:19)的N2的氨基酸序列比對。星號“*”指示具有單個完全保守殘基的位置。冒號“:”指示在Gonnet PAM250矩陣中具有大于0.5的評分的、具有強類似性質(zhì)的基團之間的保守。句點“.”指示在Gonnet PAM250矩陣中具有等于或小于0.5的評分的、具有弱類似性質(zhì)的基團之間的保守。
[0043] 圖27A顯示了構建體3的示意圖。圖27B顯示了構建體3的g3p部分的DNA序列(SEQ ID NO:23)。圖27C顯示了構建體3的g3p部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
[0044] 圖28顯示了測試2種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白在阿爾茨海默氏病的轉基因小鼠模型中減少淀粉樣蛋白β的能力的實驗的結果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)都顯著地降低阿爾茨海默氏病小鼠的海馬中的淀粉樣蛋白β的水平。
[0045] 圖29顯示了測試2種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白在阿爾茨海默氏病的轉基因小鼠模型中減少淀粉樣蛋白β的能力的實驗的結果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)都能夠顯著地降低阿爾茨海默氏病小鼠的大腦皮質(zhì)中的淀粉樣蛋白β的水平。
[0046] 圖30顯示了rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)對Aβ42的裝配抑制。圖30A顯示了在沒有SDS的情況下制備的“天然”瓊脂糖凝膠。將樣品在不含SDS的TEA緩沖液中泳動，且不沸騰。結果指示，構建體6能夠抑制fAβ42的裝配。圖30B呈現(xiàn)了用于測量存在于給定樣品中的淀粉樣蛋白的ThT熒光測定。將10μM Aβ42單體在有或沒有2種濃度的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)存在下在37℃溫育1天。通過定量結合的ThT熒
光，測量在第1天結束時形成的纖維的量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)有效地抑制Aβ42纖維的形成。該圖也指示，構建體6對纖維形成的抑制是劑量依賴性的。
光，測量在第1天結束時形成的纖維的量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)有效地抑制Aβ42纖維的形成。該圖也指示，構建體6對纖維形成的抑制是劑量依賴性的。
[0047] 圖31呈現(xiàn)了代表性的圓二色性數(shù)據(jù)，其表明Aβ42裝配被rs-g3p(N1N2)(構建體3)抑制。圓二色性會測量要評估的Aβ纖維的α-螺旋和β-折疊含量。圖31A顯示了在
T＝0、T＝24小時和T＝48小時，Aβ42的橢圓性與波長的關系。圖31B顯示了在T＝
0、T＝24小時和T＝48小時，Aβ42+構建體3的橢圓性與波長的關系。圖31C顯示了代
表性的ThT測定，其中通過定量結合的ThT熒光，測量在24-48小時之間形成的纖維的量。
構建體3有效地抑制Aβ42纖維的形成。圖31D顯示了在T＝0、T＝24小時和T＝48小
時，構建體3的橢圓性與波長的關系。這些數(shù)據(jù)一起證實了構建體3的抑制Aβ42裝配的能力。
T＝0、T＝24小時和T＝48小時，Aβ42的橢圓性與波長的關系。圖31B顯示了在T＝
0、T＝24小時和T＝48小時，Aβ42+構建體3的橢圓性與波長的關系。圖31C顯示了代
表性的ThT測定，其中通過定量結合的ThT熒光，測量在24-48小時之間形成的纖維的量。
構建體3有效地抑制Aβ42纖維的形成。圖31D顯示了在T＝0、T＝24小時和T＝48小
時，構建體3的橢圓性與波長的關系。這些數(shù)據(jù)一起證實了構建體3的抑制Aβ42裝配的能力。
[0048] 圖32呈現(xiàn)了表明M13(構建體2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)會阻斷寡聚體誘導的N2a細胞毒性的代表性數(shù)據(jù)。參見，例如，Stine等人(2003)J.Biol.
Chem.278(13):11612-11622和 Stine 等 人 (2011)Erik D.Roberson( 編 )Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology, 第 670
卷:13-32。在處理之前，通過血清饑餓48小時，使N2a細胞分化。將Aβ42寡聚體(2uM)與構建體2和構建體6一起在37℃預溫育3小時，然后加給N2a細胞。時間0(“TO”)復
合物不進行預溫育。溫育24小時以后，監(jiān)測腺苷酸激酶(“AK”)釋放。向培養(yǎng)基中的AK釋放指示細胞死亡/裂解。如Stine等人,2011所述，制備Aβ42寡聚體。結果指示，M13和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc是有毒寡聚體的有效抑制劑。
Chem.278(13):11612-11622和 Stine 等 人 (2011)Erik D.Roberson( 編 )Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology, 第 670
卷:13-32。在處理之前，通過血清饑餓48小時，使N2a細胞分化。將Aβ42寡聚體(2uM)與構建體2和構建體6一起在37℃預溫育3小時，然后加給N2a細胞。時間0(“TO”)復
合物不進行預溫育。溫育24小時以后，監(jiān)測腺苷酸激酶(“AK”)釋放。向培養(yǎng)基中的AK釋放指示細胞死亡/裂解。如Stine等人,2011所述，制備Aβ42寡聚體。結果指示，M13和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc是有毒寡聚體的有效抑制劑。
[0049] 圖33顯示的過濾器截留測定對比了6種濃度的Aβ42纖維加或減1x1012/mlM13(構建體2)；80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構建體(構建體5)；和80nm和
800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)。將Aβ42纖維與構建體2、5和6一起在37℃
溫育3天，然后進行過濾器截留。用mAb 6E10(1:15000)探測過濾器，所述mAb6E10識別被
14
捕集在過濾器上的Aβ42纖維。800nM構建體5或構建體6等于5x10 /ml分子摩爾濃度
的構建體2。結果指示，構建體2、5和6有效地解聚β-淀粉樣蛋白纖維。
800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)。將Aβ42纖維與構建體2、5和6一起在37℃
溫育3天，然后進行過濾器截留。用mAb 6E10(1:15000)探測過濾器，所述mAb6E10識別被
14
捕集在過濾器上的Aβ42纖維。800nM構建體5或構建體6等于5x10 /ml分子摩爾濃度
的構建體2。結果指示，構建體2、5和6有效地解聚β-淀粉樣蛋白纖維。
[0050] 圖34A和34B呈現(xiàn)了用于測量與ftau一起預溫育3小時以后與fAβ42結合的M13(構建體2)的量的代表性測定。在有或沒有4種濃度的ftau存在下，將5μM的與
構建體2結合的Aβ42單體在37℃溫育3小時。由于fAβ:M13-Alexa488會沉淀，但是
ftau:M13-Alexa488不會沉淀，測量來自沉淀物的熒光的損失指示，ftau競爭fAβ結合。
在這里，通過定量沉淀的結合競爭反應中的Alexa488熒光，測量在3小時結束時形成的M13-fAβ的量。結果指示，ftau能夠與M13-Alexa488(構建體2)競爭結合fAβ42。
構建體2結合的Aβ42單體在37℃溫育3小時。由于fAβ:M13-Alexa488會沉淀，但是
ftau:M13-Alexa488不會沉淀，測量來自沉淀物的熒光的損失指示，ftau競爭fAβ結合。
在這里，通過定量沉淀的結合競爭反應中的Alexa488熒光，測量在3小時結束時形成的M13-fAβ的量。結果指示，ftau能夠與M13-Alexa488(構建體2)競爭結合fAβ42。
[0051] 圖35顯示了測試rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體4)的結合ftau的能力的一種代表性的SPR測定的結果。結果指示，構建體4有效地結合ftau。
[0052] 圖36顯示了rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)的解聚ftau的能力。通過將40uM的tau的微管結合重復區(qū)域(“MTBR”)稀釋進50mM超氧化物歧化酶(“Sod”)中，
制備Tau纖維。將不同濃度的構建體6和制備的ftau在乙酸鹽緩沖液(pH7.0)中在37℃
溫育72小時。在有5倍過量的ThT存在下，記錄ThT熒光。圖36A呈現(xiàn)了代表性的ThT測
定的結果，所述測定顯示了構建體6的解聚ftau的能力。圖36B顯示了另一個代表性的實驗，其證實了構建體6的解聚tau的能力。圖36A和36B也表明，構建體6對ftau的解聚
是劑量依賴性的。
制備Tau纖維。將不同濃度的構建體6和制備的ftau在乙酸鹽緩沖液(pH7.0)中在37℃
溫育72小時。在有5倍過量的ThT存在下，記錄ThT熒光。圖36A呈現(xiàn)了代表性的ThT測
定的結果，所述測定顯示了構建體6的解聚ftau的能力。圖36B顯示了另一個代表性的實驗，其證實了構建體6的解聚tau的能力。圖36A和36B也表明，構建體6對ftau的解聚
是劑量依賴性的。
[0053] 圖37呈現(xiàn)了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)和rs-g3p(N1N2)(構建體3)隨時間對Aβ聚集的抑制的代表性實驗。將Aβ42溶解在DMSO中，并在含有NaN3的PBS中稀釋。在有或沒有不同濃度的構建體3和構建體6存在下，Aβ42在37℃聚集。通過ThT熒光，測量Aβ42的聚集。圖37A顯示了樣品的SDS PAGE。圖37B顯示了得自一個代表性實驗的結果。圖37C顯示了得自另一個代表性實驗的結果。圖37D總結了結果。
[0054] 圖38A和圖38B呈現(xiàn)了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)的阻斷PrP向PrP-Sc轉變的能力的實驗的結果。對構建體6和IgG細胞裂解物進行超速離心以分離可
溶性的(上清液)和不溶性的(沉淀物)PrP物質(zhì)。用抗-PrP單克隆抗體(6D11)，使PrP
物質(zhì)生化地顯影。在有IgG存在下，PrP分配在可溶性級分和不溶性級分中。在有構建體6存在下，存在有限的不溶性的PrP。數(shù)據(jù)代表n＝4。
溶性的(上清液)和不溶性的(沉淀物)PrP物質(zhì)。用抗-PrP單克隆抗體(6D11)，使PrP
物質(zhì)生化地顯影。在有IgG存在下，PrP分配在可溶性級分和不溶性級分中。在有構建體6存在下，存在有限的不溶性的PrP。數(shù)據(jù)代表n＝4。
[0055] 圖39A和圖39B呈現(xiàn)了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)在朊病毒病的細Sc
胞培養(yǎng)模型中減少PrP 的積累和聚集的能力的實驗的結果。圖39A顯示了在用構建體6
Sc
和IgG處理以后，生化地分辨的未消化的和PK-消化的N2a22L 細胞裂解物。在用遞增濃Sc
度的構建體6處理的細胞中，明顯觀察到PrP 水平的顯著下降。用～0.08ug/ml構建體6Sc Sc
的處理實現(xiàn)了PrP 水平的大約50％下降。用10ug/ml構建體6的處理使PrP 水平下降
Sc Sc
至5.725％，p<0.0001。在用1ug/ml鼠IgG處理的N2A22L 細胞中沒有觀察到PrP 水平
的顯著變化。對于圖39B，隨后將X-射線膠片數(shù)字化，并初步標準化為得自相同通道的IgGSc
處理的N2a22L 細胞中的作用(其被視作100％)。然后相對于同樣印跡的未消化的裂解
Sc
物，分析得自PK-消化的印跡的密度測定數(shù)據(jù)，并表達為變化百分比PrP /PrPc。數(shù)據(jù)代表n＝4。
胞培養(yǎng)模型中減少PrP 的積累和聚集的能力的實驗的結果。圖39A顯示了在用構建體6
Sc
和IgG處理以后，生化地分辨的未消化的和PK-消化的N2a22L 細胞裂解物。在用遞增濃Sc
度的構建體6處理的細胞中，明顯觀察到PrP 水平的顯著下降。用～0.08ug/ml構建體6Sc Sc
的處理實現(xiàn)了PrP 水平的大約50％下降。用10ug/ml構建體6的處理使PrP 水平下降
Sc Sc
至5.725％，p<0.0001。在用1ug/ml鼠IgG處理的N2A22L 細胞中沒有觀察到PrP 水平
的顯著變化。對于圖39B，隨后將X-射線膠片數(shù)字化，并初步標準化為得自相同通道的IgGSc
處理的N2a22L 細胞中的作用(其被視作100％)。然后相對于同樣印跡的未消化的裂解
Sc
物，分析得自PK-消化的印跡的密度測定數(shù)據(jù)，并表達為變化百分比PrP /PrPc。數(shù)據(jù)代表n＝4。
具體實施方式
[0056] 本發(fā)明部分地基于發(fā)明人對基因3蛋白(“g3p”，也被稱作“p3”或“pIII”)在介導淀粉樣蛋白結合和淀粉樣蛋白聚集體的解聚中的作用的認識。本發(fā)明也基于發(fā)明人鑒別出的與淀粉樣蛋白結合所需的g3p的最小序列。
[0057] 因而，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含從g3p衍生出的最小共有淀粉樣蛋白結合序列的分子，尤其是多肽。在這些實施方案的一個方面，所述分子是可溶性的。在這些實施方案的另一個方面，所述分子解聚淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白斑塊)和/或阻止所述淀粉樣蛋白的聚集。在這些實施方案的另一個方面，所述分子是融合蛋白。在這些實施方案的一個更具體的方面，所述分子是額外包含免疫球蛋白鏈的氨基酸序列的融合蛋白。在這些實施方案的一個甚至更具體的方面，所述分子是額外包含免疫球蛋白G(例如，IgG)或免疫球蛋白M(例如，IgM)鏈的氨基酸序列的融合蛋白。在這些實施方案的另一個方面，所述分子包含g3p的N2結構域。在這些實施方案的一個更具體的方面，所述分子包含g3p的N1-N2結構域。在這些實施方案的另一個方面，所述分子包含全長g3p。在另一個方面，所述分子是作為任意前述分子的片段、突變體或變體的多肽。
[0058] 在其它方面，本發(fā)明提供了結合TolA的分子，諸如TolA抑制劑分子，尤其是多肽，其包含最小共有淀粉樣蛋白結合序列。本發(fā)明的TolA結合分子和/或TolA抑制劑會結合、解聚、分解淀粉樣蛋白和阻止淀粉樣蛋白聚集。所述TolA結合分子和/或TolA抑制劑分子包括融合蛋白。在某些實施方案中，所述TolA結合分子和/或TolA抑制劑分子是大腸菌素或大腸菌素的淀粉樣蛋白結合片段。在某些實施方案中，所述大腸菌素是A組大腸菌素。參見，例如，Cascales等人,Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2007)71(1):158-229。本發(fā)明的TolA結合分子和TolA抑制劑分子是用于減少與疾病有關的淀粉樣蛋白負載的有用治療劑，所述疾病為諸如全身性和周圍性淀粉樣蛋白疾病、神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性Tau病變和傳播性海綿狀腦病(朊病毒相關的疾病)。也包括那些組合物用于預防與這些疾病有關的淀粉樣蛋白負載的積累的用途，以及那些組合物作為診斷劑用于檢測淀粉樣蛋白和從而診斷這樣的疾病的用途。
[0059] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了絲狀噬菌體，其已經(jīng)被修飾以與野生型噬菌體相比過表達g3p，以表達g3p的淀粉樣蛋白結合片段、g3p的結合淀粉樣蛋白的突變體或變體形式、或包含g3p的結合淀粉樣蛋白的融合蛋白。
[0060] 本發(fā)明提供了任意前述分子或噬菌體的物質(zhì)組合物和/或藥物組合物，以及它們的結合、解聚淀粉樣蛋白和阻止淀粉樣蛋白聚集的用途，和它們的檢測淀粉樣沉著物并診斷以淀粉樣蛋白為特征的疾病和障礙的用途。
[0061] 定義
[0062] 術語“g3p”當單獨使用或在術語諸如“g3p衍生的”中使用時，表示任意野生型或重組絲狀噬菌體g3p蛋白(包括g3p的片段、變體和突變體)。該術語不應解釋為限于任何特定絲狀噬菌體g3p。作為例子，術語“g3p”包括SEQ ID NO:1和圖2中所示的有關蛋白。
[0063] 術語“絲狀噬菌體”包括野生型絲狀噬菌體和重組絲狀噬菌體。在本申請中，“絲狀噬菌體”也可以被稱作“噬菌體(bacteriophage)”、“噬菌體(phage)”或“M13”。
[0064] 本文中使用的術語“野生型絲狀噬菌體”表示：在自然界中發(fā)現(xiàn)的絲狀噬菌體，在任意核苷酸或氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中指定為“野生型”的絲狀噬菌體，商購可得的且被表征為“野生型”的絲狀噬菌體，和通過傳代已經(jīng)獲得相對于任意前述絲狀噬菌體的非重組突變的絲狀噬菌體。
[0065] 術語“結構域”是指多肽(包括蛋白)的具有一些獨特物理特征或作用的區(qū)域，包括例如由多肽鏈的一段組成的獨立折疊的結構。結構域可以含有多肽的獨特物理特征的序列，或者它可以含有保留它的結合特征的物理特征的片段(即，它可以結合第二結構域)。一個結構域可以與另一個結構域結合。換而言之，第一結構域可以天然地結合第二結構域。
例如，g3p N2結構域會結合性菌毛，g3p N1結構域會結合TolA。
例如，g3p N2結構域會結合性菌毛，g3p N1結構域會結合TolA。
[0066] 本文中使用的術語“淀粉樣蛋白”、“淀粉樣蛋白纖絲”和“淀粉樣蛋白纖維”是三級結構的一般術語，所述三級結構通過幾種不同蛋白中的任意蛋白的聚集而形成，且由垂直于纖維軸線堆疊的β折疊的有序排列組成。Sunde等人,J.Mol.Biol.(1997)273:729-39。一種示例性的淀粉樣蛋白是在阿爾茨海默氏病中形成的淀粉樣蛋白-β的聚集體，其由β-淀粉樣肽“βA”組成，所述βA是從人淀粉樣蛋白前體蛋白(hAPP)切出的39-43氨基酸內(nèi)部片段。存在短形式(諸如Aβ40)和長形式(諸如更纖維原性的Aβ異形體Aβ42)。其它示例性的淀粉樣蛋白包括錯誤折疊的α-突觸核蛋白(與帕金森病有關)、huntingtin(與Sc
亨廷頓病有關)、tau(與阿爾茨海默氏病有關)和朊病毒蛋白的異常構象PrP 。其它例子提供在說明書中，并且是本領域技術人員已知的(參見，例如，Aguzzi(2010),和Eichner和Radford,Mol.Cell(2011)43:8-18)。因而，除非指明蛋白或肽，否則術語“淀粉樣蛋白”、“淀粉樣蛋白纖絲”或“淀粉樣蛋白纖維”的應用不應解釋為限于任何特定蛋白或疾病。
亨廷頓病有關)、tau(與阿爾茨海默氏病有關)和朊病毒蛋白的異常構象PrP 。其它例子提供在說明書中，并且是本領域技術人員已知的(參見，例如，Aguzzi(2010),和Eichner和Radford,Mol.Cell(2011)43:8-18)。因而，除非指明蛋白或肽，否則術語“淀粉樣蛋白”、“淀粉樣蛋白纖絲”或“淀粉樣蛋白纖維”的應用不應解釋為限于任何特定蛋白或疾病。
[0067] 術語“β淀粉樣肽”與“β-淀粉樣肽”、“βAP”、“βA”和“Aβ”同義。所有這些術語表示從人淀粉樣蛋白前體蛋白(hAPP)衍生出的形成淀粉樣蛋白的肽。
[0068] “結合淀粉樣蛋白纖絲”或“結合淀粉樣蛋白”的噬菌體、蛋白、融合蛋白、融合蛋白結構域、或前述物質(zhì)的突變體、片段或變體是在淀粉樣蛋白結合測定中為陽性的個體。使用直接結合測定諸如表面等離子體共振(SPR)，可以在體外檢測淀粉樣蛋白結合，在該情況-8 -9 -10 -11下，它通常以至少10 M、10 M、10 M或10 M的Kd結合淀粉樣蛋白?？商鎿Q地，使用在實施例中描述的fAβ42結合測定，可以檢測淀粉樣蛋白結合。g3p的結合淀粉樣蛋白的片段、變體和突變體也可以如下鑒別：當注射進任意蛋白錯誤折疊疾病的轉基因小鼠模型中時，它們共同局部化至淀粉樣蛋白。
[0069] 被描述為“解聚”或“介導解聚”的本發(fā)明的任意產(chǎn)品或組合物會減少已經(jīng)形成的聚集體。通過過濾器截留測定，可以測量解聚。Wanker等人,Methods
Enzymol(1999)309:375-86。過濾器截留測定在本文中進行了描述，且可以用于檢測聚集體和監(jiān)測由本發(fā)明的組合物介導的解聚。將解聚檢測為淀粉樣蛋白在過濾器上的截留減少，這通過在有遞增濃度的解聚劑存在下的染色減少來證實。
Enzymol(1999)309:375-86。過濾器截留測定在本文中進行了描述，且可以用于檢測聚集體和監(jiān)測由本發(fā)明的組合物介導的解聚。將解聚檢測為淀粉樣蛋白在過濾器上的截留減少，這通過在有遞增濃度的解聚劑存在下的染色減少來證實。
[0070] 本文中使用的“減少淀粉樣蛋白”的組合物會實現(xiàn)下述一項或多項：抑制淀粉樣蛋白形成，造成淀粉樣蛋白解聚，促進淀粉樣蛋白清除，抑制淀粉樣蛋白聚集，阻斷和/或阻止有毒淀粉樣蛋白寡聚體的形成，和/或促進有毒淀粉樣蛋白寡聚體的清除。
[0071] 被描述為“保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷”的本發(fā)明的任意產(chǎn)品或組合物會阻止新淀粉樣蛋白的積累和/或阻止有毒淀粉樣蛋白寡聚體的形成?？梢灶A防性地施用被描述為“保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷”的本發(fā)明的產(chǎn)品或組合物。通過本文描述的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物細胞毒性測定，可以測量產(chǎn)品或組合物是否保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷。
[0072] 本文中使用的“PrP蛋白”、“PrP”和“朊病毒”表示，能夠在適當條件下誘導c引起蛋白錯誤折疊疾病的聚集體的形成的多肽。例如，正常細胞的朊病毒蛋白(PrP)
Sc
在這樣的條件下被轉化成對應的羊瘙癢癥異形體(PrP )，后者會引起疾病例如、但不
限于：牛海綿狀腦病(BSE)或瘋牛病、貓海綿狀腦病、庫魯病(kuru)、克雅病(CJD)、
Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)和致死性家族性失眠癥(FFI)。
Sc
在這樣的條件下被轉化成對應的羊瘙癢癥異形體(PrP )，后者會引起疾病例如、但不
限于：牛海綿狀腦病(BSE)或瘋牛病、貓海綿狀腦病、庫魯病(kuru)、克雅病(CJD)、
Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)和致死性家族性失眠癥(FFI)。
[0073] 本文中與噬菌體、蛋白、多肽或氨基酸序列結合使用的術語“變體”(例如，g3p變體或g3p的淀粉樣蛋白結合片段的變體)表示，與參比物相比，含有至少一個氨基酸差異(置換、插入或缺失)的對應物質(zhì)。在某些實施方案中，與參照序列相比，“變體”具有高氨基酸序列同源性和/或保守的氨基酸置換、缺失和/或插入。在某些實施方案中，與參照序列相比，變體具有不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸差異?！氨Ｊ刂脫Q”表示第一種氨基酸被第二種氨基酸替換，所述第二種氨基酸基本上不改變g3p蛋白或g3p的淀粉樣蛋白結合片段的化學、物理和/或功能性質(zhì)(例如，g3p蛋白或淀粉樣蛋白結合片段保留相同的電荷、結構、極性、疏水性/親水性，和/或保持功能諸如識別、結合和/或減少淀粉樣蛋白的能力)。這樣的保守氨基酸修飾是基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]到不同前述特征的示例性保守置換是本領域技術人員眾所周知的，且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
[0074] 術語“突變體”(例如，“突變體g3p”或“結合淀粉樣蛋白的突變體片段”)表示這樣的蛋白：其在一個或多個氨基酸處被突變，以便調(diào)節(jié)它的治療或診斷效力。在某些實施方案中，突變體含有在已知與淀粉樣蛋白相互作用的氨基酸處的置換、缺失和/或插入。在其它實施方案中，突變體含有在特定氨基酸處的置換、缺失和/或插入，所述特定氨基酸是在野生型g3p或其淀粉樣蛋白結合片段中存在的保守氨基酸。在某些實施方案中，與參照序列相比，突變體具有不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸差異。在某些實施方案中，所述氨基酸置換是保守置換。除了“變體”通常在性質(zhì)上是非重組的、而“突變體”通常是重組的以外，術語“變體”和“突變體”在本文中可互換地使用。
[0075] 本文中使用的術語“高嚴謹性”包括，技術人員基于例如DNA的長度容易地確定的條件。通常，這樣的條件定義在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版.第1卷,第1.101-104頁,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，且包括使用：用于硝酸纖維素過濾器的預洗滌溶液5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(PH8.0)，50％甲酰胺、6X SSC在42℃的雜交條件(或其它類似的雜交溶液，諸如Stark氏溶液，在
50％甲酰胺中，在42℃)，和在大約68℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗滌。技術人員會認識到，根據(jù)諸如探針長度等因素，可以在必要時調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。
50％甲酰胺中，在42℃)，和在大約68℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗滌。技術人員會認識到，根據(jù)諸如探針長度等因素，可以在必要時調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。
[0076] 本文中使用的術語“中等嚴謹性”包括，本領域普通技術人員基于例如DNA的長度可以容易地確定的條件?；A條件闡述在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版.第1卷,第1.101-104頁,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，且包括使用：用于硝酸纖維素過濾器的預洗滌溶液5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，50％甲酰胺、6X SSC在42℃的雜交條件(或其它類似的雜交溶液，諸如Stark氏溶液，在50％甲酰胺中，在42℃)，和60℃、0.5X SSC、0.1％SDS的洗滌條件。
[0077] 術語“高序列同源性”是指，使用已知的計算機程序(諸如Best?t程序)測得的與參照序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同源性。
[0078] “融合蛋白”是包含包含至少2個多肽結構域的非天然存在的蛋白。
[0079] “g3p融合蛋白”包含與第二結構域連接的g3p蛋白。
[0080] “N1-N2融合蛋白”(也被稱作“N1N2融合蛋白”)包含與第二結構域連接的g3p蛋白的N1和N2結構域(或任一種的突變體、片段或變體)，但是不包含N3/CT結構域。N1N2融合蛋白可以包含或不包含鉸鏈區(qū)。
[0081] “N2融合蛋白”包含與第二結構域連接的g3p蛋白的N2結構域(或N2的突變體、片段或變體)，但是既不包含N1結構域也不包含N3/CT結構域。N2融合蛋白可以包含或不包含鉸鏈區(qū)。
[0082] 本文中使用的“構建體1”衍生自野生型M13(參見，Genbank文件：NC_003287.2,版本GI:56718463。與野生型M13相比，在構建體1中，Ser378(AGC)被改變?yōu)镚ly(GGC)，且Ile87(ATT)被改變?yōu)锳sn(AAC))。構建體1包含SEQ ID NO:10的核酸。
[0083] “構建體2”是野生型M13分離物(GenBank JX412914.1)。構建體2包含SEQ ID NO:12的核酸。
[0084] “構建體3”是包含g3p的N1和N2結構域的重組可溶性g3p片段(rs-g3p(N1N2))，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸。
[0085] “構建體4”是重組可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸?！皹嫿w4”的N1N2區(qū)域衍生自“構建體1”的N1N2區(qū)域。
[0086] “構建體5”是重組可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸?！皹嫿w5”的N1N2區(qū)域衍生自“構建體2”的N1N2區(qū)域。
[0087] “構建體6”是重組可溶性g3p片段IgG1Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸?！皹嫿w6”的N1N2區(qū)域衍生自“構建體2”的N1N2區(qū)域。
[0088] g3p的來源
[0089] 絲狀噬菌體是一組感染革蘭氏陰性細菌(例如，大腸桿菌(E.coli))的相關病毒。參見，例如，Rasched and Oberer,Microbiology Reviews(1986)Dec:401-427。絲狀噬菌體的例子包括、但不限于：Ff家族的噬菌體(即，至少M13、f1和fd)和I-家族的噬菌體(即，至少I22、Ike、If1)。
[0090] 所有天然存在的絲狀噬菌體含有g3p作為次要外殼蛋白，其存在于每個噬菌體的3-5個拷貝中。因而，在本發(fā)明的一個方面，從任何天然存在的絲狀噬菌體得到分離的g3p。
還可以生產(chǎn)重組形式的g3p。重組g3p可以對應于得自任何天然存在的絲狀噬菌體的野生型g3p。因而，本發(fā)明也包括分離的重組g3p。
還可以生產(chǎn)重組形式的g3p。重組g3p可以對應于得自任何天然存在的絲狀噬菌體的野生型g3p。因而，本發(fā)明也包括分離的重組g3p。
[0091] 在SEQ ID NO:1中呈現(xiàn)了得自噬菌體M13的g3p的一個例子。除非另外清楚地指明，描述的任何g3p突變是參照在下面以清潔和注解形式顯示的SEQ ID NO:1：
[0092] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVVVCTGDE TQCYGTWVPI
[0093] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN[0094] 121PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY[0095] 181WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE[0096] 241GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID[0097] 301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNNFRQYLPSLPQ SVECRPFVFS[0098] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0099] 注解的SEQ ID NO:1
[0100] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVVVCTGDE TQCYGTWVPI
[0101] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN[0102] 121 PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY[0103] 181 WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE[0104] 241 GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID[0105] 301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNN FRQYLPSLPQ SVECRPFVFS[0106] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0107] 表1-注解的SEQ ID NO:1的表解
[0108]
[0109] SEQ ID NO:1是除去了18氨基酸信號肽的GenBank NP-510891.1，因而氨基酸編號是針對成熟g3p。在任何表達構建體中通常包括信號肽，并且在本發(fā)明的不同實施方案的范圍內(nèi)包括包含信號肽的未成熟g3p，除非上下文澄清將它明確地排除。提供SEQ ID NO:1僅作為參照序列。它絕不意圖限制本發(fā)明。
[0110] 得自多個來源的g3p的序列是已知的。Ff家族的噬菌體的示例性g3p氨基酸序列包括在UniProt登錄號P69169(噬菌體f1)、P03661(噬菌體fd)和P69168(噬菌體m13)中發(fā)現(xiàn)的那些序列。I-家族的噬菌體的示例性g3p氨基酸序列包括P15415(噬菌體I22)、P03663(噬菌體Ike)和O80297(噬菌體If1)。在圖2中呈現(xiàn)了幾個g3p序列的比對。
[0111] 在本發(fā)明中有用的g3p還包括g3p的片段、突變體和/或變體?？梢詤⒖既Lg3p或參考g3p的片段來描述突變體或變體。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括任何全長或片段g3p，包括它們的保留結合淀粉樣蛋白的能力的突變體和/或變體，無論它們的解聚淀粉樣蛋白的能力如何。本發(fā)明也包括“包含”這樣的g3p的任何蛋白。同樣地，也包括“包括”、“具有”這樣的g3p或“由其組成”、“基本上由其組成”的蛋白。
[0112] g3p的淀粉樣蛋白結合片段和淀粉樣蛋白解聚片段
[0113] 如提及的，g3p具有2個氨基端結構域N1和N2(其相互作用以形成N1-N2復合物)和一個羧基端結構域N3(也稱為“CT”)。在Ff噬菌體中，N1結構域包含成熟g3p的殘基1-67，且N2結構域包含殘基87-217。殘基87-123形成鉸鏈，其允許在N1和N2之間的打開和關閉。有時，認為鉸鏈是N2的一部分，而在其它情況下，將它視作單獨的元件。N1和N2也通過柔性的富含甘氨酸的接頭序列連接。在N1內(nèi)，2個二硫橋存在于Cys7和Cys36之間以及Cys46和Cys53之間。在N2中，單個二硫橋存在于Cys188和Cys201之間。N3/CT結
構域包含殘基257-406。Hollinger,1999；Marvin,1998。在羧基端結構域中，二硫橋存在于Cys354和Cys371之間。Marvin,1998。在g3p中不存在結構域間二硫橋。
構域包含殘基257-406。Hollinger,1999；Marvin,1998。在羧基端結構域中，二硫橋存在于Cys354和Cys371之間。Marvin,1998。在g3p中不存在結構域間二硫橋。
[0114] g3p的淀粉樣蛋白結合片段的非限制性例子包括：具有鉸鏈(例如，至少SEQ ID NO:1的殘基87-217)或沒有鉸鏈(例如，至少SEQ ID NO:1的殘基124-217)的N2結構域；和具有或沒有插入接頭序列(例如，具有或沒有SEQ ID NO:1的殘基68-86)且具有或沒有鉸鏈的N1-N2結構域(例如，至少SEQ ID NO:1的殘基1-67和87-217)。在任意前述實施
例中，N2或N1N2片段可以是在野生型絲狀噬菌體或重組N2或N1N2中發(fā)現(xiàn)的N2或N1N2。
在任意前述實施例中，N2或N1N2片段可以是野生型絲狀噬菌體序列的突變體或變體。
例中，N2或N1N2片段可以是在野生型絲狀噬菌體或重組N2或N1N2中發(fā)現(xiàn)的N2或N1N2。
在任意前述實施例中，N2或N1N2片段可以是野生型絲狀噬菌體序列的突變體或變體。
[0115] 有用的g3p的淀粉樣蛋白結合片段包括g3p的任意片段，包括保留結合淀粉樣蛋白的能力的N2和N1N2片段，無論所述片段的解聚淀粉樣蛋白的能力。本發(fā)明包括“包含”這樣的淀粉樣蛋白結合片段(或其突變體或變體)的任何蛋白。同樣地，也包括“包括”、“具有”所述g3p片段或變體或“由其組成”、“基本上由其組成”的蛋白。
[0116] N2和N2多肽突變體和變體
[0117] 在圖26中顯示了得自fd、f1、M13、Ike、I2-2和If1的N2的一級結構比對。fd的氨基酸顯示在SEQ ID NO:14中；f1的氨基酸顯示在SEQ ID NO:15中；M13的氨基酸顯示在SEQ ID NO:16中；Ike的氨基酸顯示在SEQ ID NO:17中；I2-2的氨基酸顯示在SEQ ID NO:18中；且If1的氨基酸顯示在SEQ ID NO:19中。使用該圖和比對作為指導，本發(fā)明的一個實施方案包括N2多肽、N2多肽突變體和N2多肽變體，其包含SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19的氨基酸，包括它們的任意淀粉樣蛋白結合片段。
[0118] 在其它實施方案中，所述N2多肽是這樣的N2多肽突變體或變體：其保留它的結合淀粉樣蛋白的能力，且當與SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的任一個的氨基酸序列比對時，具有包含不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸差異的氨基酸序列。在圖26中，星號“*”指示具有單個完全保守殘基的位置。冒號“:”指示在Gonnet PAM250矩陣中具有大于0.5的評分的、具有強類似性質(zhì)的基團之間的保守。句點“.”指示在Gonnet PAM250矩陣中具有等于或小于0.5的評分的、具有弱類似性質(zhì)的基團之間的保守。在這些實施方案的某些方面，所述N2多肽突變體或變體不包含在圖26中用“*”指示的任意位置處的氨基酸差異。在更具體的方面，所述N2多肽突變體或變體不包含用“*”指示的任意位置處的氨基酸差異，并且包含在圖26中用“:”指示的每個位置處的、與SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的至少一個相同的氨基酸。在甚至更具體的方面，所述N2多肽突變體或變體不包含用“*”指示的任意位置處的氨基酸差異，并且包含在圖26中用“:”指示的每個位置和用“.”指示的每個位置處的、與SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的至少一個相同的氨基酸。
[0119] 在其它實施方案中，通過指定與SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19的氨基酸相似性百分比來描述N2多肽變體，仍然具有所述N2多肽變體結合淀粉樣蛋白的條件。在這些實施方案中，所述N2多肽與SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19所示的參照序列的氨基酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0120] 在其它實施方案中，通過指定與SEQ ID NO:1的N2區(qū)域的氨基酸相似性百分比來描述N2多肽變體，仍然具有所述N2多肽變體結合淀粉樣蛋白的條件。在這些實施方案中，所述N2多肽與SEQ ID NO:1的N2區(qū)域具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0121] 在其它實施方案中，通過二級或三級結構來描述N2多肽。已知的是，fd-N2和If1-N2結構域使用它們的表面的同源部分來結合大腸桿菌的性菌毛上的相同位點。Lorenz等人,J Mol Biol.405:989-1003(2011)，例如，990。介導N2與性菌毛的結合的氨基酸殘基以及二級和三級結構也介導N2與淀粉樣蛋白的結合。因而，對于N2與性菌毛的結合而言關鍵性的氨基酸殘基以及二級和三級結構對于N2-淀粉樣蛋白結合而言也是關鍵性的。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括這樣的N2多肽變體：其包含在N2-性菌毛結合區(qū)域中維持二級和三級結構所需的氨基酸。
[0122] N1N2和N1N2多肽突變體和變體
[0123] fd、f1和M13的一級結構比對顯示為圖2A，Ike、I2-2和If1的一級結構比對顯示為圖2B。使用該比對作為指導，本發(fā)明的一個實施方案包括這樣的N1N2多肽、多肽突變體或多肽變體：其包含在fd、f1和M13之間或者在I2-2、Ide和If1之間保守的氨基酸，所述保守參考圖2的序列來鑒別。在其它實施方案中，所述N1N2多肽是這樣的N1N2多肽突變體或變體：其保留它的結合淀粉樣蛋白的能力，且當與SEQ ID NO:1、2、3、5或6中的任一個的氨基酸序列比對時，其氨基酸序列包含不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸差異。
[0124] 在其它實施方案中，通過指定與SEQ ID NO:1的N1N2區(qū)域的氨基酸相似性百分比來描述N1N2多肽、突變體或變體，仍然具有所述N1N2多肽變體結合淀粉樣蛋白的條件。在這些實施方案中，所述N1N2多肽變體與SEQ ID NO:1的N1和N2區(qū)域具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0125] 融合蛋白
[0126] 在一個方面，本發(fā)明涉及融合蛋白。所述融合蛋白包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段、TolA結合分子或TolA抑制劑。完全包括包含突變體或變體g3p或g3p片段的融合蛋白。所述融合蛋白與它通常不結合的至少一個額外蛋白或蛋白結構域連接、融合、綴合、偶聯(lián)或結合。在一個實施方案中，所述融合蛋白是g3p融合蛋白，其包含與第二結構域連接的g3p蛋白。在另一個實施方案中，所述融合蛋白是與第二結構域連接的g3p蛋白的淀粉樣蛋白結合片段。在另一個實施方案中，所述融合蛋白是N1N2融合蛋白，其包含g3p蛋白的N1和N2結構域，但是不包含CT結構域。在另一個實施方案中，所述融合蛋白是N2融合蛋白，其包含g3p蛋白的N2結構域，但是既不包含N1結構域也不包含CT結構域。如指出的，本發(fā)明的某些方面涉及突變的或變化的g3p蛋白或其淀粉樣蛋白結合片段，并且涉及結合淀粉樣蛋白纖維的突變的或變化的N1N2或N2結構域。因而，包含這些突變或變化形式的融合蛋白也是本發(fā)明的一部分。
[0127] g3p或淀粉樣蛋白結合片段和融合配偶體多肽可以是連續(xù)氨基酸序列的一部分，其中所述融合配偶體多肽直接地或通過短肽接頭連接至g3p或淀粉樣蛋白結合片段多肽的N末端或C末端。在這樣的情況下，g3p或其淀粉樣蛋白結合片段和融合配偶體多肽可以從編碼g3p或其淀粉樣蛋白結合片段和融合配偶體多肽的編碼序列翻譯為單個多肽。
[0128] 在某些實施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白恒定區(qū)作為第二結構域。已經(jīng)描述了這樣的融合蛋白：其包含與目標蛋白或其片段連接的免疫球蛋白恒定區(qū)(參見，例如，美國專利號5,480,981和5,808,029；Gascoigne等人.1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936；Capon等人.1989,Nature337:525；Traunecker等人.1989,Nature339:68；Zettmeissl 等 人.1990,DNA Cell Biol.USA9:347；Byrn 等 人 .1990,Nature344:667；
Watson等人.1990,J.Cell.Biol.110:2221；Watson等人.1991,Nature349:164；Aruffo等人.1990,Cell61:1303；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.173:721；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.174:561；Stamenkovic等人,1991,Cell66:1133；Ashkenazi等人.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535；Lesslauer等人.1991,Eur.J.Immunol.27:2883；Peppel等人.1991,J.Exp.Med.174:1483；Bennett等人.1991,J.Biol.Chem.266:23060；Kurschner等 人 .1992,J.Biol.Chem.267:9354；Chalupny 等 人 .1992,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA89:10360；Ridgway 和 Gorman,1991,J.Cell.Biol.115,Abstract No.1448；Zheng 等人.1995,J.Immun.154:5590)。這些分子通常具有與連接的目標分子有關的生物活性以及效應子功能，或與免疫球蛋白恒定區(qū)有關的某種其它期望的特征(例如，生物穩(wěn)定性、細胞分泌)。
Watson等人.1990,J.Cell.Biol.110:2221；Watson等人.1991,Nature349:164；Aruffo等人.1990,Cell61:1303；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.173:721；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.174:561；Stamenkovic等人,1991,Cell66:1133；Ashkenazi等人.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535；Lesslauer等人.1991,Eur.J.Immunol.27:2883；Peppel等人.1991,J.Exp.Med.174:1483；Bennett等人.1991,J.Biol.Chem.266:23060；Kurschner等 人 .1992,J.Biol.Chem.267:9354；Chalupny 等 人 .1992,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA89:10360；Ridgway 和 Gorman,1991,J.Cell.Biol.115,Abstract No.1448；Zheng 等人.1995,J.Immun.154:5590)。這些分子通常具有與連接的目標分子有關的生物活性以及效應子功能，或與免疫球蛋白恒定區(qū)有關的某種其它期望的特征(例如，生物穩(wěn)定性、細胞分泌)。
[0129] 在某些實施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白恒定區(qū)的Fc片段?？梢陨虡I(yè)購得Fc表達盒。Fc片段可以包含免疫球蛋白的CH2和CH3結構域以及免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。Fc片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一個具體實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)的該部分是IgG1的Fc片段。在另一個實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)的該部分是IgG4的Fc片段。在另一個實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)的該部分是IgM的Fc片段。
[0130] 因而，在一個實施方案中，使用標準的分子生物學技術，將重組可溶性g3p或淀粉樣蛋白結合片段與免疫球蛋白Fc結構域融合。重組可溶性g3p或淀粉樣蛋白結合片段可以是突變的或變化的。例如，可以將g3p的淀粉樣蛋白結合片段(諸如N1N2結構域或N2結構域)克隆進IgGFc融合表達載體中。示例性的IgGFc融合載體包括，例如，可從InvivoGen得到的pFUSE-Fc載體之一。在某些實施方案中，得到的二價(例如，g3p(N1N2)-IgGFc或g3p(N2)-IgGFc融合蛋白將具有比重組可溶性g3p更高的結合淀粉樣蛋白的親合力，因為它現(xiàn)在是二價的。
[0131] 在其它實施方案中，所述融合蛋白包含與g3p或g3p的淀粉樣蛋白結合片段連接的非-Fc蛋白。
[0132] 在其它實施方案中，所述融合蛋白包含至少2個g3p多肽或其淀粉樣蛋白結合片段。在其它實施方案中，所述融合蛋白包含3個或更多個g3p多肽或其淀粉樣蛋白結合片段。在其它實施方案中，所述融合蛋白包含5個g3p多肽或其淀粉樣蛋白結合片段。這樣的二聚體的和多聚體的融合蛋白會提供更高的親合力相互作用，因為它們包括超過一個g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。
[0133] 在其它實施方案中，所述融合蛋白包含白蛋白。參見例如，F(xiàn)leer的美國專利號6,686,179。
[0134] 在所有情況下，所述融合蛋白中的g3p或g3p的淀粉樣蛋白結合片段包括其突變體和變體。
[0135] 一般而言，所述融合蛋白至少象對應的未連接的g3p或其g3p片段一樣有效地結合淀粉樣蛋白。在適用時，所述融合蛋白至少象對應的未連接的g3p或其片段一樣有效地介導淀粉樣蛋白的解聚、促進淀粉樣蛋白清除、抑制淀粉樣蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚體的形成。在某些實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且至少象包含SEQ ID NO:1的重組可溶性g3p一樣有效地介導淀粉樣蛋白的解聚、促進淀粉樣蛋白清除、抑制淀粉樣蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚體的形成。在其它實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且至少象噬菌體M13一樣有效地介導淀粉樣蛋白的解聚、促進淀粉樣蛋白清除、抑制淀粉樣蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚體的形成。在其它實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且比噬菌體M13更有效地介導淀粉樣蛋白的解聚、促進淀粉樣蛋白清除、抑制淀粉樣蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚體的形成。在某些實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且至少象噬菌體M13一樣有效地減少蛋白錯誤折疊疾病中的淀粉樣蛋白。在其它實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且比噬菌體M13更有效地減少蛋白錯誤折疊疾病中的淀粉樣蛋白。在其它實施方案中，所述融合蛋白結合淀粉樣蛋白且至少象噬菌體M13一樣有效地或比噬菌體M13更有效地阻止淀粉樣蛋白形成。
[0136] 使用本領域眾所周知的技術，可以合成融合蛋白。例如，可以在細胞中重組地合成本發(fā)明的融合蛋白(參見，例如，Sambrook等人.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y. 和 Ausubel 等 人 .1989,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.)?？商鎿Q地，使用已知的合成方法諸如固相合成，可以合成本發(fā)明的融合蛋白。合成技術是本領域眾所周知的(參見，例如，Merri?eld,1973,Chemical Polypeptides,(Katsoyannis和Panayotis編)第335-61頁；Merri?eld1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等人.1985,Biochem.Intl.10:394；Finn等人.1976,The Proteins(3d ed.)2:105；Erikson等人.1976,The Proteins(第3版)2:257；美國專利號3,941,763?？商鎿Q地，最終的構建體可以基本上具有與重組生產(chǎn)的融合蛋白相同的功能，但是簡單地使用非重組技術(諸如連接化學)來生產(chǎn)。使用關于g3p表達和g3p突變描述的相同一般方
法，可以制備融合蛋白的組分。
Interscience,N.Y.)?？商鎿Q地，使用已知的合成方法諸如固相合成，可以合成本發(fā)明的融合蛋白。合成技術是本領域眾所周知的(參見，例如，Merri?eld,1973,Chemical Polypeptides,(Katsoyannis和Panayotis編)第335-61頁；Merri?eld1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等人.1985,Biochem.Intl.10:394；Finn等人.1976,The Proteins(3d ed.)2:105；Erikson等人.1976,The Proteins(第3版)2:257；美國專利號3,941,763?？商鎿Q地，最終的構建體可以基本上具有與重組生產(chǎn)的融合蛋白相同的功能，但是簡單地使用非重組技術(諸如連接化學)來生產(chǎn)。使用關于g3p表達和g3p突變描述的相同一般方
法，可以制備融合蛋白的組分。
[0137] 在某些實施方案中，可以將g3p或淀粉樣蛋白結合片段(或其突變體或變體形式)與標志物序列融合，所述標志物序列為諸如促進融合的多肽(單獨地或此外與另一種蛋白融合或摻入載體分子)的純化的肽。標志物氨基酸序列可以是六組氨酸肽，諸如在pQE載體(Qiagen,Mississauga,Ontario,加拿大)中提供的標簽，以及其它，其中的許多是商購可得的。例如，如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)86:821-824中所述，六組氨酸會提供融合蛋白的方便純化?？捎糜诩兓牧硪环N肽標簽，即血凝素(HA)標簽，對應于從流感HA蛋白衍生出的表位(Wilson等人,(1984)Cell37:767)。
[0138] 過表達g3p的噬菌體
[0139] 在另一個方面，本發(fā)明涉及噬菌體，其經(jīng)過修飾以使由該噬菌體表達的g3p的拷貝數(shù)增加至超過在野生型絲狀噬菌體中常見的3-5個拷貝。在一個實施方案中，表達增加的g3p數(shù)目的噬菌體可以選自天然存在的變體。在另一個實施方案中，使用重組技術來增加g3p的拷貝數(shù)。
[0140] 在某些實施方案中，編碼g3p或g3p的淀粉樣蛋白結合片段(包括其突變體或變體)的野生型序列可以用于替代編碼另一種噬菌體外殼蛋白的基因之一。取決于替代的噬菌體基因，g3p的數(shù)目可以增加至6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、500、1000個或甚至接近3000個拷貝(例如，如果使用基因3編碼序列來替代基因8編碼序列或與基因8編碼序列的末端融合)。
[0141] 為了生產(chǎn)表達g3p的額外拷貝的噬菌體，如在說明書別處所述克隆g3p編碼序列(或其突變體或變體形式)。然后可以使用g3p編碼序列(或其突變體或變體形式)來替代另一個噬菌體基因并表達(如果必要的話，與輔助噬菌體結合)。
[0142] 可替換地，在某些實施方案中，將g3p編碼序列(或其突變體或變體形式)與另一個噬菌體基因的編碼序列在框架內(nèi)融合，使用或不用插入“間隔區(qū)”序列。制備與另一種蛋白或肽“融合”的噬菌體蛋白的方法是噬菌體展示領域眾所周知的，且可以以與例如抗原或抗體鏈相同的方式“展示”g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。例如Scott&Smith,Science(1990)249:386-90；Devlin等人,Science(1990)249:404-06。當僅期望g3p片段的表達時，所述片段(或其突變體或變體形式)的編碼序列可以連接至其它基因，使得存在于g3p中的天然Ser/Gly接頭序列之一充當接頭。在某些實施方案中，僅N2或N1N2結構域(或其突
變體或變體形式)的編碼序列與其它基因在框架內(nèi)融合。
變體或變體形式)的編碼序列與其它基因在框架內(nèi)融合。
[0143] 突變體G3P和淀粉樣蛋白結合片段
[0144] 在另一個方面，本發(fā)明涉及突變體g3p蛋白及其結合淀粉樣蛋白的突變體片段。包含突變體g3p蛋白和淀粉樣蛋白結合片段的融合蛋白和噬菌體也是本發(fā)明的一部分?？梢陨a(chǎn)突變體g3p及其結合淀粉樣蛋白的突變體片段，或針對促進在本申請中描述的藥物組合物的治療效果的性能進行選擇。例如，可以重組地突變或以其它方式選擇g3p或其淀粉樣蛋白結合片段，以具有相對于M13的g3p的下述性能中的一種或多種：增加的對淀粉樣蛋白結合的親和力、減少的鉸鏈TM、增加的親合力(親合力與親和力的差別在于，在g3p包含超過一個淀粉樣蛋白結合位點的情況下，親合力用于描述所有可得到的淀粉樣蛋白結合的總和)、增加的解聚淀粉樣蛋白聚集體的能力、或增加的阻止淀粉樣蛋白纖絲聚集的能力?？商鎿Q地，或額外地，突變體g3p或其突變體淀粉樣蛋白片段可以包含在說明書別處描述的其它有用的性能。
[0145] 通過噬菌體誘變或通過重組技術，諸如基于PCR的定位誘變或隨機誘變，可以生產(chǎn)突變體g3p蛋白。
[0146] 在某些實施方案中，如下生產(chǎn)具有較高親和力的突變體：誘變處理M13，然后在與嚴謹洗滌條件偶聯(lián)的淀粉樣蛋白親和柱上選擇噬菌體。選定的噬菌體的結合、洗滌、洗脫、然后繁殖的成功循環(huán)會富集對淀粉樣蛋白具有高結合親和力的那些噬菌體。使用淀粉樣蛋白淘選實現(xiàn)噬菌體群體的親和力增加以后，選擇和分析具有高親和力的各個克隆。以此方式，在隨機誘變以后可以針對高親和力結合來選擇噬菌體突變體。
[0147] 使用重組技術也可以誘變處理g3p或其任意淀粉樣蛋白結合片段(例如，N1N2結構域或N2結構域)。例如，使用基于PCR的誘變策略，可以突變?nèi)绫疚闹兴龅臄y帶g3p或其淀粉樣蛋白結合片段(例如，N1N2或N2)的載體。然后表達編碼的突變蛋白，并如所述評估突變體的淀粉樣蛋白結合和親和力。
[0148] 也可以從突變體g3p衍生出突變體g3p的淀粉樣蛋白結合片段。例如，通過突變g3p和/或選擇具有合乎需要的性能的突變的g3p，然后從其得到期望的淀粉樣蛋白結合片段，例如，通過蛋白酶解和隨后的純化。
[0149] 針對增加的淀粉樣蛋白結合親和力、結合的溫度敏感性的變化等篩選攜帶突變體g3p的噬菌體，可以用于鑒別噬菌體以進一步表征該噬菌體的g3p。針對性能(諸如結合的溫度敏感性)的篩選可以利用淀粉樣蛋白親和柱，其中以溫度依賴性的方式進行結合、洗滌或洗脫步驟中的一個或多個。
[0150] 在某些實施方案中，所述突變體g3p或g3p淀粉樣蛋白結合片段結合淀粉樣蛋白的親和力是得自M13的對應的未突變的g3p或g3p片段的結合的至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500倍或甚至1000倍。在其它實施方案中，所述突變體g3p或g3p淀粉樣蛋白結合片段保留的淀粉樣蛋白結合的強度是得自M13的對應的未突變的g3p或淀粉樣蛋白結合g3p片段的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％。在某些實施方案中，顯示出比對應的未突變形式更低的淀粉樣蛋白結合親和力的突變體g3p或淀粉樣蛋白結合片段也具有其它合乎需要的生物學(例如，更大的解聚淀粉樣蛋白的能力；更大的阻止淀粉樣蛋白纖絲聚集的能力)或藥學(例如，更大的代謝穩(wěn)定性、有利的藥代動力學分布、更大的溶解度)性質(zhì)，所述性質(zhì)與對應的未突變形式相比改善。如在實施例中所述，通過表面等離子體共振或在競爭性ELISA中可以評估淀粉樣蛋白結合。
96％、97％、98％或99％。在某些實施方案中，顯示出比對應的未突變形式更低的淀粉樣蛋白結合親和力的突變體g3p或淀粉樣蛋白結合片段也具有其它合乎需要的生物學(例如，更大的解聚淀粉樣蛋白的能力；更大的阻止淀粉樣蛋白纖絲聚集的能力)或藥學(例如，更大的代謝穩(wěn)定性、有利的藥代動力學分布、更大的溶解度)性質(zhì)，所述性質(zhì)與對應的未突變形式相比改善。如在實施例中所述，通過表面等離子體共振或在競爭性ELISA中可以評估淀粉樣蛋白結合。
[0151] 在某些實施方案中，通過使用與M13g3p的雜交來篩選DNA文庫以選擇有關的在高嚴謹性或中等嚴謹性條件下與M13g3p雜交的DNA，可以鑒別g3p的變體和/或突變體。
[0152] 在某些實施方案中，突變的g3p是與成熟的M13g3p蛋白(SEQ ID NO:1)相差至少一個氨基酸殘基、但是仍然結合淀粉樣蛋白的、重組生產(chǎn)的g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。在某些實施方案中，通過提供M13g3p在成熟蛋白的特定殘基處的氨基酸和在該殘基處的替代氨基酸，指定各個點突變。例如，“F194A”是指在成熟M13序列的位置194處的苯丙氨酸已經(jīng)被改變?yōu)楸彼?。在其它實施方案中，通過指定與SEQ ID NO:1的氨基酸相似性百分比來描述突變的g3p，仍然具有突變的g3p結合淀粉樣蛋白纖絲的條件。在這些實施方案中，突變的g3p與SEQ ID NO:1的全長具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在涉及突變的g3p的淀粉樣蛋白結合片段的那些實施方案中，所述突變的淀粉樣蛋白結合片段與SEQ ID NO:1的對應片段的全長具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在涉及突變的g3p的淀粉樣蛋白結合片段的那些實施方案中，所述突變的淀粉樣蛋白結合片段與SEQ ID NO:1的對應片段的全長具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0153] 作為實用內(nèi)容，使用已知的計算機程序(諸如Best?t程序)，可以常規(guī)地確定任何特定多肽是否與SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。當使用Best?t或其它序列比對程序來確定特定序列是否與根據(jù)本發(fā)明的參照序列具有例如95％同一性時，當然這樣設定參數(shù)，使得在與查詢序列同源的參照氨基酸序列部分的全長上計算同一性百分比。
[0154] 在不同方面的某些實施方案中，突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段不包括在特定氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之間是保守的。在其它實施方案中，所述突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之間是保守的。在其它實施方案中，所述突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段包括至多在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，
[0155] 所述氨基酸殘基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之間不是保守的。在另一個實施方案中，所述突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段包括至多在0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在I22、Ike和If1中的一個或多個之間不是保守的。在其它實施方案中，所述突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之間不是保守的。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個突變位于N1結構域內(nèi)。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或
10個突變位于N2結構域內(nèi)。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變位于N2結構域內(nèi)，且不是在鉸鏈區(qū)內(nèi)。
6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在I22、Ike和If1中的一個或多個之間不是保守的。在其它實施方案中，所述突變體g3p和其淀粉樣蛋白結合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基處的突變，所述氨基酸殘基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之間不是保守的。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個突變位于N1結構域內(nèi)。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或
10個突變位于N2結構域內(nèi)。在某些實施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變位于N2結構域內(nèi)，且不是在鉸鏈區(qū)內(nèi)。
[0156] 定位誘變可以靶向已知對于g3p、N1N2或N2結構域的穩(wěn)定性而言重要的殘基。例如，以前已經(jīng)證實，在以下位置處的丙氨酸替換突變不會顯著影響噬菌體與性菌毛的結合：D94和T95；E115；N122；L125；E126和E127；E127和E128；Q129；Q145；T154和T156；Q157；
T159和D160；K163和T164；Y166；和E196和D197,Deng&Perham,2002。因此，這些位置允許突變，并且在這些位置中的一個或多個處的突變可以增強本發(fā)明的g3p和g3p淀粉樣蛋白結合片段的淀粉樣蛋白結合能力或者對所述能力具有中性影響。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明包括在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197(相對于SEQ ID NO:1)中的一個或多個處突變的g3p或g3p淀粉樣蛋白結合片段。在某些實施方案中，在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中的一個或多個處的突變不排它地是對丙氨酸的突變。
T159和D160；K163和T164；Y166；和E196和D197,Deng&Perham,2002。因此，這些位置允許突變，并且在這些位置中的一個或多個處的突變可以增強本發(fā)明的g3p和g3p淀粉樣蛋白結合片段的淀粉樣蛋白結合能力或者對所述能力具有中性影響。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明包括在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197(相對于SEQ ID NO:1)中的一個或多個處突變的g3p或g3p淀粉樣蛋白結合片段。在某些實施方案中，在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中的一個或多個處的突變不排它地是對丙氨酸的突變。
[0157] 以前已經(jīng)證實，在以下位置處的丙氨酸替換突變會減少與性菌毛的結合：F194；F190和H191；K184,R186,和D187；R142和R144，Deng&Perham,2002。因而，在某些實施方案中，突變選自不包括一個或多個下述殘基的突變：R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194(相對于SEQ ID NO:1的編號)。但是，用非丙氨酸殘基替換R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194可能增加淀粉樣蛋白結合。因而，在一個實施方案中，所述突變是在R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194中的一個或多個處的非丙氨酸突變。在一個實施方案中，所述突變是在F194處的非丙氨酸突變。在另一個實施方案中，所述突變是在F190和H191處的非丙氨酸突變。在另一個實施方案中，所述突變是在K184、R186和D187處的非丙氨酸突變。在另一個實施方案中，所述突變是在W181處的非丙氨酸突變。在另一個實施方案中，所述突變是在R142和R144處的非丙氨酸突變。在某些實施方案中，所述突變非排它地是以下的一個、一些或全部：T13I、T101I、Q129H、G153D、W181A、F190A、F194A和D209Y。
[0158] 在某些實施方案中，所述突變是在一個或多個殘基處，所述殘基位于N2結構域的表面上，所述表面是g3p的結合性菌毛的部分。在一個實施方案中，所述突變是在一個或多個殘基處，所述殘基位于N2結構域的外邊緣上。在其它實施方案中，所述突變是在一個或多個殘基處，所述殘基位于N1結構域的表面上，所述表面是g3p的結合TolA的部分。在一個實施方案中，所述突變是在一個或多個殘基處，所述殘基位于N1結構域的外邊緣上。在另一個實施方案中，所述突變是在g3p的一個或多個溶劑可接近的殘基處。在另一個實施方案中，所述突變將Pro213處的順/反平衡轉換為大于50％、60％、70％、80％、90％或
95％反式。因而，在某些實施方案中，所述g3p是在Pro213處具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％反式的順/反平衡的突變的g3p。
95％反式。因而，在某些實施方案中，所述g3p是在Pro213處具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％反式的順/反平衡的突變的g3p。
[0159] 在某些實施方案中，所述g3p突變體或其淀粉樣蛋白結合片段不包括在結構上保守的殘基處的突變。在結構上保守的殘基的例子包括這樣的殘基：盡管存在潛在序列插入，其參與提供Ff和I-家族成員的結構域結構。
[0160] 在某些實施方案中，產(chǎn)生的任何突變保持淀粉樣蛋白結合。在其它實施方案中，所述突變不會替換脯氨酸殘基。
[0161] 在某些實施方案中，產(chǎn)生的任何突變保持淀粉樣蛋白結合且不會替換半胱氨酸殘基。在某些實施方案中，所述突變保持全部、至少1個、至少2個、至少3個或所有4個在g3p內(nèi)存在的二硫橋。因而，在一個實施方案中，任何突變保持N1中在Cys7和Cys36之間以及在Cys46和Cys53之間的2個二硫橋。在另一個實施方案中，任何突變保持N1中在Cys7和Cys36之間以及在Cys46和Cys53之間的二硫橋中的任一個，但是不是2個。在一
個實施方案中，保持在Cys188和Cys201之間的二硫橋。在某些實施方案中，保持在Cys7和Cys36之間、在Cys46和Cys53之間、以及在Cys188和Cys201之間的二硫橋中的每一個。
在一個實施方案中，所述突變保持在Cys354和Cys371之間的二硫橋。在某些實施方案中，所述突變保持在Cys7和Cys36之間、在Cys46和Cys53之間、在Cys188和Cys201之間、以及在Cys354和Cys371之間的二硫橋。
個實施方案中，保持在Cys188和Cys201之間的二硫橋。在某些實施方案中，保持在Cys7和Cys36之間、在Cys46和Cys53之間、以及在Cys188和Cys201之間的二硫橋中的每一個。
在一個實施方案中，所述突變保持在Cys354和Cys371之間的二硫橋。在某些實施方案中，所述突變保持在Cys7和Cys36之間、在Cys46和Cys53之間、在Cys188和Cys201之間、以及在Cys354和Cys371之間的二硫橋。
[0162] 在某些實施方案中，產(chǎn)生的任何突變保持淀粉樣蛋白結合并降低N1N2的解鏈溫度(TM)。使用在實施例中描述的任意方法，可以測量TM。預見到降低N1N2的TM的突變體會表現(xiàn)出更好的與Aβ的結合、在更大程度上抑制Aβ裝配、和在解聚測定中至少象M13的g3p一樣有效。因此，預見到這樣的突變體、以及包含這些突變體的融合蛋白和噬菌體在治療一種或多種蛋白錯誤折疊疾病時分別至少象M13中的對應序列、其融合蛋白和完整M13一樣治療上有效。
[0163] 也可以設計突變體以包括靶向序列。可以將這樣的靶向序列插入在N1N2之間、或在N2和N2融合蛋白的另一個結構域之間的柔性接頭區(qū)域中。靶向核定位序列(NLS)在亨廷頓病中可能是有益的。靶向核內(nèi)體在帕金森病中可能是有益的。
[0164] 除了靶向細胞中的特定區(qū)域以外，可以使用靶向序列靶向不同種類的淀粉樣蛋白。成核序列(Nucleating sequence)可以增加親和力和將突變體蛋白導向特定淀粉樣蛋白?？梢灾苽浒男蛄械钠渌蛔凅w，所述肽序列是疏水的，以致于它們自己沉淀。例如，可以將多個AVVAI序列添加至g3p和/或其淀粉樣蛋白結合片段(例如，N2和N1N2)和/或它們的融合蛋白以產(chǎn)生具有增強的、多個結合序列的嵌合蛋白。結合淀粉樣蛋白且可以摻入包含g3p、N2和N1N2和/或它們的融合蛋白的突變體或嵌合蛋白中的肽的一些例子
是，基于在Sato,Biochemistry(2006)45:5503-16中描述的GxFxGxF(SEQ ID NO:21)框架和在Tjernberg等人,J.Biol.Chem.(1996)271:8545-48中描述的KLVFF(SEQ ID NO:22)
肽的肽抑制劑。其它靶向部分是已知的，且也可以用在本發(fā)明中。參見，例如，Sciarretta等人,Methods in Enzymology(2006)413:273-312。
是，基于在Sato,Biochemistry(2006)45:5503-16中描述的GxFxGxF(SEQ ID NO:21)框架和在Tjernberg等人,J.Biol.Chem.(1996)271:8545-48中描述的KLVFF(SEQ ID NO:22)
肽的肽抑制劑。其它靶向部分是已知的，且也可以用在本發(fā)明中。參見，例如，Sciarretta等人,Methods in Enzymology(2006)413:273-312。
[0165] 淀粉樣蛋白結合展示媒介物和載體
[0166] 在本發(fā)明的另一個方面，g3p和其淀粉樣蛋白結合片段(包括前述任一種的突變體和變體)(包括、但不限于N1N2結構域和N2結構域、以及分子、多肽和包含它們的融合蛋白)可以與其它有機或甚至無機載體組合，所述載體提供保持淀粉樣蛋白結合的分子支架，但是提供額外特征。
[0167] 在某些實施方案中，所述g3p或其淀粉樣蛋白結合片段或g3p融合蛋白和所述載體通過非重組方式共價地連接，例如，除了肽鍵以外的化學連接。可以使用任意合適的化學交聯(lián)劑。也可以使用將多肽與其它分子(例如，載體)共價連接的任何已知方法。在某些實施方案中，所述g3p或其淀粉樣蛋白結合片段或g3p融合蛋白和所述載體可以通過接頭融合，所述接頭包含至少一個氨基酸或化學部分。
[0168] 在某些實施方案中，非共價地連接所述g3p或其淀粉樣蛋白結合片段或g3p融合蛋白和所述載體。在某些這樣的實施方案中，可以使用例如結合對連接它們。示例性的結合對包括、但不限于：生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、抗體和它的抗原等。
[0169] 載體的例子包括、但不限于：病毒顆粒(包括噬菌體，參見下文)，其中g3p蛋白或其淀粉樣蛋白結合片段(其不是病毒的天然部分)作為病毒結構的一部分摻入；聚合物，無論天然的、合成的還是混合的；聚合物-外殼結構，諸如珠子(包括表面衍生化的珠子)；聚氨基酸、核酸；和脂質(zhì)體。所述載體可以直接地或間接地連接至g3p或淀粉樣蛋白結合片段。取決于載體，可以使用中間連接來提供載體和淀粉樣蛋白結合結構域之間的適當間距。
[0170] 聚氨基酸可以是載體蛋白。這樣的聚氨基酸可以選自血清白蛋白(諸如HSA)、另外的抗體或其部分(例如Fc區(qū))、胎球蛋白A、胎球蛋白B、亮氨酸拉鏈核因子紅系衍生物-2(NFE2)、神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈、四連接素或其它聚氨基酸(例如，賴氨酸)。聚氨基酸的連接位置可以是在N末端或C末端或二者之間的其它位置，且也可以通過化學接頭部分連接至g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。
[0171] 在某些實施方案中，載體包括具有寡聚化結構域的分子。當?shù)鞍谆蚱淦蔚墓δ苤皇墙Y合時，寡聚化會提供功能優(yōu)點，包括多價、增加的結合強度和不同結構域的組合功能。這些特征在天然蛋白中觀察到，并且也可以通過蛋白質(zhì)工程引入。因此，本發(fā)明也提供了包含寡聚化結構域(例如，二聚化結構域)的g3p和淀粉樣蛋白結合片段(包括其突變體和變體)諸如N1N2結構域和N2結構域。合適的寡聚化結構域包括卷曲螺旋結構域，包括α-螺旋卷曲螺旋結構域；膠原結構域；膠原-樣結構域和二聚體的免疫球蛋白結構域。
本發(fā)明的合適的卷曲螺旋多肽融合配偶體包括四連接素卷曲螺旋結構域，軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白的卷曲螺旋結構域；血管生成素卷曲螺旋結構域；和亮氨酸拉鏈結構域。當使用膠原或膠原-樣寡聚化結構域時，它們可以包含例如在以下物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的那些：膠原、結合甘露糖的凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂聯(lián)素、纖維膠凝蛋白、膠固素、巨噬細胞清道夫受體和emilin。盡管這些結構域中的一些可以作為融合蛋白摻入，在許多實施方案中，它們非重組地連接至g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段，例如，通過共價鍵合。
本發(fā)明的合適的卷曲螺旋多肽融合配偶體包括四連接素卷曲螺旋結構域，軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白的卷曲螺旋結構域；血管生成素卷曲螺旋結構域；和亮氨酸拉鏈結構域。當使用膠原或膠原-樣寡聚化結構域時，它們可以包含例如在以下物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的那些：膠原、結合甘露糖的凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂聯(lián)素、纖維膠凝蛋白、膠固素、巨噬細胞清道夫受體和emilin。盡管這些結構域中的一些可以作為融合蛋白摻入，在許多實施方案中，它們非重組地連接至g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段，例如，通過共價鍵合。
[0172] 另外，本發(fā)明提供了與聚合物連接的g3p或其淀粉樣蛋白結合片段或g3p融合蛋白。就治療性產(chǎn)品或組合物的制備而言，在本發(fā)明中采用的聚合物是藥學上可接受的。
[0173] 考慮到對多肽的功能或抗原結構域的影響，通常將聚合物連接至g3p或其淀粉樣蛋白結合片段。一般而言，可以在用于使蛋白與活化的聚合物分子反應的任意合適條件下進行化學衍生化。可以用于將聚合物連接至活性部分的活化基團包括砜、馬來酰亞胺、巰基、硫醇、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶(azidirine)、環(huán)氧乙烷、和5-吡啶基。
[0174] 合適的、臨床上可接受的、水溶性的聚合物包括、但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、單甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、聚-1,3,6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(同聚物或無規(guī)共聚物)、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇同聚物(PPG)和其它聚氧化烯(polyakylene oxide)、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(POG)(例如，甘油)和其它聚氧乙基化的多元醇、聚氧乙基化的山梨糖醇或聚氧乙基化的葡萄糖、結腸酸或其它碳水化合物聚合物，蔗聚糖或葡聚糖及其混合物。
[0175] 本發(fā)明的PEG部分可以是支鏈或直鏈聚合物。在一個實施方案中，中，本發(fā)明預見到包括單-或聚-(例如，2-4個)PEG部分的化學衍生化的多肽。通過本領域已知的任意聚乙二醇化反應，可以實現(xiàn)聚乙二醇化。用于制備聚乙二醇化的蛋白產(chǎn)物的方法通常是本領域已知的。最佳反應條件將根據(jù)個例來確定，取決于已知的參數(shù)和期望的結果。
[0176] 本領域技術人員可得到許多PEG連接方法，例如，EP 0 401 384；Malik等人,Exp.Hematol.,(1992)20:1028-1035；Francis,Focus on Growth Factors,3:4-10(1992)；EP 0154 316；EP 0 401384；WO 92/16221；WO 95/34326；和在本文中引用的與聚乙二醇化有關的其它出版物。
[0177] 當將g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段(以及它們的突變體和變體，和包含前述任一種的化合物、多肽和融合蛋白)聚乙二醇化時，可以通過化學衍生化g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段來連接PEG。在其它實施方案中，可以將適合用于PEG分子修飾的氨基酸殘基重組地引入g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段中。
[0178] 通過與反應性聚乙二醇分子的?；磻蚧蛲榛磻梢詧?zhí)行聚乙二醇化。因而，本發(fā)明的蛋白產(chǎn)物包括聚乙二醇化的蛋白，其中PEG基團經(jīng)由?；蛲榛B接。這樣的產(chǎn)物可以是單-聚乙二醇化的或多-聚乙二醇化的(例如，含2-6個或2-5個PEG基
團的那些)。合適的活化的PEG酯的一個例子是與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯化的PEG。
團的那些)。合適的活化的PEG酯的一個例子是與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯化的PEG。
[0179] 通過烷基化進行的聚乙二醇化通常包括在有還原劑存在下使PEG的末端醛衍生物與多肽反應。就還原性烷基化反應而言，選擇的聚合物應當具有單個反應性醛基。一種示例性的反應性PEG醛是水穩(wěn)定的聚乙二醇丙醛，或其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物，參見例如，美國專利號5,252,714。
[0180] 在某些實施方案中，將g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段表達為噬菌體的一部分，并通過從噬菌體顆粒分離它來制備g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段。但是，一般而言，使用重組技術來制備g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段(包括其突變體和變體)。一般而言，在與載體組合之前，分離得到的蛋白。
[0181] 在某些實施方案中，所述展示媒介物是噬菌體。在這些實施方案中，將編碼g3p蛋白、N1N2結構域、N2結構域和其它淀粉樣蛋白結合片段(包括所有前述的突變體和變體)的基因摻入噬菌體基因組中，并作為噬菌體的一部分來表達。例如，在一個實施方案中，使用與M13噬菌體的g3p相比具有更高淀粉樣蛋白結合親和力的突變體g3p蛋白來替代M13噬菌體的野生型g3p。得到的噬菌體因而也具有比野生型M13改善的結合。但是，描述的任意g3p或淀粉樣蛋白結合片段可以摻入噬菌體中。在這些實施方案中，野生型基因3可以被本發(fā)明的g3p完全替換?？商鎿Q地，如關于具有增加的g3p拷貝數(shù)的噬菌體所討論的，可以將重組分子與編碼噬菌體外殼蛋白(包括野生型g3p)的基因融合，并以類似于噬菌體展示文庫中的抗原和抗體鏈的方式在噬菌體上展示?？梢孕揎椚我饨z狀噬菌體以表達本發(fā)明的g3p，包括、但不限于M13、fd、f1、I22、Ike或If1。在某些實施方案中，可以與經(jīng)修飾的噬菌體結合使用輔助噬菌體。
[0182] 重組技術
[0183] 一般而言，使用常規(guī)重組DNA技術，諸如g3p基因的克隆、直接DNA合成或通過使用例如M13序列作為探針從文庫分離對應DNA，制備編碼g3p蛋白或其淀粉樣蛋白結合片段(以及它們的突變體和變體，和包含前述任一種的化合物、多肽和融合蛋白)的DNA(參見，例如，Sambrook等人.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y. 和 Ausubel 等 人 .1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.)。
[0184] 就重組生產(chǎn)而言，將編碼g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的核酸序列插入適當?shù)谋磉_載體中，所述表達載體含有插入的編碼序列的轉錄和翻譯所必需的元件，或者在RNA病毒載體的情況下，復制和翻譯所必需的元件。將編碼核酸插入載體內(nèi)的適當讀碼框中。
[0185] 因此，本發(fā)明提供了載體，其包含編碼g3p或其淀粉樣蛋白結合片段(包括其突變體和變體)的多核苷酸。也提供了這樣的載體，其包含編碼g3p或g3p-融合分子的多核苷酸。這樣的載體包括、但不限于：DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。
[0186] 在某些實施方案中，選擇為在CHO或CHO-衍生的細胞中表達多肽而優(yōu)化的載體。示例性的這類載體描述在，例如，Running Deer等人,Biotechnol.Prog.
(2004)20:880-889。
(2004)20:880-889。
[0187] 在某些實施方案中，為g3p、其淀粉樣蛋白結合片段和/或g3p融合分子在動物(包括人類)中的體內(nèi)表達而選擇載體。在某些這樣的實施方案中，所述多肽的表達是在以組織特異性方式起作用的啟動子的控制下。
[0188] 將表達載體轉染或共轉染進表達所述多肽的合適靶細胞中。非限制性的示例性轉染方法描述在，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根據(jù)本領域已知的方法，可以將核酸瞬時地或穩(wěn)定地轉染進期望的宿主細胞中。多種宿主表達載體系統(tǒng)可以用于表達本文描述的蛋白，包括原核或真核細胞。這些包括、但不限于：用含有適當編碼序列的重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA表達載體轉化的微生物諸如細菌(例如，大腸桿菌)；用含有適當編碼序列的重組酵母或真菌表達載體轉化的酵母或絲狀真菌；用含有適當編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)感染的或用含有適當編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)，包括哺乳動物細胞(例如，CHO、Cos、HeLa細胞)。還可以在浮萍中重組地生產(chǎn)蛋白。參見，例如，美國專利8,022,270。
[0189] 在轉化中使用的載體經(jīng)常含有用于鑒別轉化體的選擇標記。在細菌系統(tǒng)中，這可以包括抗生素抗性基因諸如氨芐西林或卡那霉素。用于培養(yǎng)的哺乳動物細胞的選擇標記包括賦予對藥物(諸如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的基因。所述選擇標記
可以是可擴增的選擇標記。一種可擴增的選擇標記是DHFR基因。另一種可擴增的標志
物是DHFRr cDNA(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、(1983)80:2495)。
Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)綜述了選擇標記，選擇標記的選擇完全在本領域的普通技術水平內(nèi)。
可以是可擴增的選擇標記。一種可擴增的選擇標記是DHFR基因。另一種可擴增的標志
物是DHFRr cDNA(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、(1983)80:2495)。
Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)綜述了選擇標記，選擇標記的選擇完全在本領域的普通技術水平內(nèi)。
[0190] 表達系統(tǒng)的表達元件在它們的強度和特異性方面存在差異。取決于使用的宿主/載體系統(tǒng)，許多合適的轉錄和翻譯元件(包括組成型和誘導型啟動子)中的任一種可以用在表達載體中。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用誘導型啟動子諸如pL噬菌體λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等；當在昆蟲細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用啟動子諸如桿狀病毒多角體啟動子；當在植物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用源自植物細胞基因組(例如，熱激啟動子；RUBISCO小亞基的啟動子；葉綠素a/b結合蛋白的啟動子)或源自植物病毒(例如，CaMV的35S RNA啟動子；TMV的外殼蛋白啟動子)的啟動子；當在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用源自哺乳動物細胞基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)的啟動子；當制備含有表達產(chǎn)物的多個拷貝的細胞系時，可以與適當?shù)倪x擇標記一起使用基于SV40、BPV和EBV的載體。
[0191] 在使用植物表達載體的情況下，編碼本發(fā)明的線性或非環(huán)化形式的表達產(chǎn)物的序列的表達可以由許多啟動子中的任一種驅動。例如，可以使用病毒啟動子諸
如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等人,Nature(1984)310:511-514)或
TMV的外殼蛋白啟動子(Takamatsu等人,EMBO J.(1987)6:307-311)；可替換地，可以
使用植物啟動子諸如RUBISCO的小亞基(Coruzzi等人,EMBO J.(1984)3:1671-1680；
Broglie等人,Science(1984)224:838-843)或熱激啟動子，例如，大豆hsp17.5-E或
hsp17.3-B(Gurley等 人 ,Mol.Cell.Biol.(1986)6:559-565)。 使 用 Ti 質(zhì) 粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔等，可以將這些構建體引入植物細胞中。關于這樣的技術的綜述，參見，例如，Weissbach&Weissbach1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII, 第 421-463 頁； 和
Grierson&Corey1988,Plant Molecular Biology,第2版,Blackie,London,第7-9章。
如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等人,Nature(1984)310:511-514)或
TMV的外殼蛋白啟動子(Takamatsu等人,EMBO J.(1987)6:307-311)；可替換地，可以
使用植物啟動子諸如RUBISCO的小亞基(Coruzzi等人,EMBO J.(1984)3:1671-1680；
Broglie等人,Science(1984)224:838-843)或熱激啟動子，例如，大豆hsp17.5-E或
hsp17.3-B(Gurley等 人 ,Mol.Cell.Biol.(1986)6:559-565)。 使 用 Ti 質(zhì) 粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔等，可以將這些構建體引入植物細胞中。關于這樣的技術的綜述，參見，例如，Weissbach&Weissbach1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII, 第 421-463 頁； 和
Grierson&Corey1988,Plant Molecular Biology,第2版,Blackie,London,第7-9章。
[0192] 在一個可以用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的昆蟲表達系統(tǒng)中，使用苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病病毒(AcNPV)作為載體來表達外源基因。在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中培養(yǎng)該病毒?？梢詫⒕幋a序列克隆進該病毒的非必需區(qū)域(例如，多角體基因)中，并置于AcNPV啟動子(例如，多角體啟動子)控
制下。編碼序列的成功插入會導致多角體基因的滅活和未閉合重組病毒(即缺乏由多角體基因編碼的蛋白性外殼的病毒)的產(chǎn)生。然后使用這些重組病毒感染草地貪夜蛾細胞，在其中表達插入的基因(參見，例如，Smith等人,J.Virol.(1983)46:584；美國專利號
4,215,051)。該表達系統(tǒng)的其它例子可以參見：Ausubel等人編.1989,Current Protocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience。
制下。編碼序列的成功插入會導致多角體基因的滅活和未閉合重組病毒(即缺乏由多角體基因編碼的蛋白性外殼的病毒)的產(chǎn)生。然后使用這些重組病毒感染草地貪夜蛾細胞，在其中表達插入的基因(參見，例如，Smith等人,J.Virol.(1983)46:584；美國專利號
4,215,051)。該表達系統(tǒng)的其它例子可以參見：Ausubel等人編.1989,Current Protocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience。
[0193] 在哺乳動物宿主細胞中，可以使用多種基于病毒的表達系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達載體的情況下，可以將編碼序列連接至腺病毒轉錄/翻譯控制復合物，例如晚期啟動子和三聯(lián)前導序列。然后，通過體外或體內(nèi)重組，可以將該融合基因插入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域(例如，區(qū)域E1或E3)中的插入將產(chǎn)生可在受感染宿主中存活并能表達肽的重組病毒(參見，例如，Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81:3655)?？商鎿Q地，可以使用牛痘7.5K啟動子(參見，例如，Mackett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:7415；Mackett等人,J.Virol.(1984)49:857；Panicali等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:4927)。其它病毒表達系統(tǒng)包括腺伴隨病毒和慢病毒。
[0194] 在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有DNA構建體的宿主細胞。本文中使用的術語“適當?shù)纳L培養(yǎng)基”是指含有細胞生長所需的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。使用本領域中的常規(guī)技術，可以從培養(yǎng)基中分離本發(fā)明的重組生產(chǎn)的蛋白。
[0195] 體外測定
[0196] 在某些實施方案中，使用硫代黃素T熒光(ThT)測定，可以監(jiān)測淀粉樣蛋白的解聚。
[0197] 在某些實施方案中，通過監(jiān)測在有或沒有本發(fā)明組合物存在下的去污劑增溶來試驗解聚。例如，可以用本發(fā)明組合物處理聚集的α-突觸核蛋白。使聚集的α-突觸核蛋白解聚的組合物會造成α-突觸核蛋白纖維在去污劑(諸如SDS)中比未處理的纖維更快地溶解。通過在聚集過程中摻入一定比例的標記的(例如，用Cy5)α-突觸核蛋白單體，可以監(jiān)測淀粉樣蛋白纖維向可溶形式的這種轉化。
[0198] 在某些實施方案中，通過神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物細胞毒性測定，試驗阻止有毒淀粉樣蛋白寡聚體的形成。在該測定中，將分化的N2a神經(jīng)母細胞瘤細胞或等效細胞與Aβ42寡聚體共溫育。所述寡聚體結合膜并造成膜微擾和細胞溶質(zhì)酶向培養(yǎng)基中的泄漏。與高濃度的寡聚體一起長時間溫育會殺死細胞。當在與細胞一起溫育之前用噬菌體或g3p預處理寡聚體時，所述寡聚體是至少更低毒性的，且有時是無毒的。通過測量腺苷酸激酶(在膜微擾以后由神經(jīng)元細胞釋放的一種示例性的細胞溶質(zhì)酶)的釋放，可以定量該中和效應。
[0199] 在某些實施方案中，本發(fā)明組合物會在蛋白錯誤折疊循環(huán)擴增(PMCA)測定中抑制可溶性的朊病毒蛋白轉化成蛋白水解酶K抗性的構象異構體。Wang等
人,Science,(2010)327:1132-35。在該測定中，在有或沒有本發(fā)明組合物存在下，將重組PrP與脂質(zhì)POPG和RNA混合。然后對該材料進行多個(例如，48個)30秒聲處理的循環(huán)，隨后溫育29.5分鐘。然后使用反應混合物的一部分接種另一個底物試管，并重復所述循環(huán)。
針對蛋白水解酶K抗性材料的存在(其指示PrP的傳染形式)，試驗每個循環(huán)。在有本發(fā)明組合物存在下蛋白水解酶K抗性材料的減少指示，所述組合物抑制PK抗性的構象異構體的形成。
人,Science,(2010)327:1132-35。在該測定中，在有或沒有本發(fā)明組合物存在下，將重組PrP與脂質(zhì)POPG和RNA混合。然后對該材料進行多個(例如，48個)30秒聲處理的循環(huán)，隨后溫育29.5分鐘。然后使用反應混合物的一部分接種另一個底物試管，并重復所述循環(huán)。
針對蛋白水解酶K抗性材料的存在(其指示PrP的傳染形式)，試驗每個循環(huán)。在有本發(fā)明組合物存在下蛋白水解酶K抗性材料的減少指示，所述組合物抑制PK抗性的構象異構體的形成。
[0200] 如上面所指出的，還可以在過濾器截留測定中檢測淀粉樣蛋白形式的某些朊病毒蛋白，諸如酵母朊病毒蛋白NM。因此，在某些實施方案中，取決于朊病毒蛋白，可以在過濾器截留測定中試驗本發(fā)明組合物的解聚朊病毒蛋白聚集體的能力。
[0201] 體內(nèi)功能測定
[0202] 除了可以在體外測定中證實的活性(諸如增加的對淀粉樣蛋白的結合親和力或TM的減小)以外，本發(fā)明的組合物也可以在幾種體內(nèi)測定之一中減少淀粉樣蛋白。一種用于確定體內(nèi)淀粉樣蛋白減少的方法使用正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)，其中在處理之前和之后使用成像劑florbetapir(F18-AV-45,Eli Lilly)，以對比β-淀粉樣蛋白的數(shù)目和/或分布。當然，隨著額外生物標志物被鑒別出，它們也可以用于測量淀粉樣蛋白的減少。
[0203] 另一種確定組合物是否會減少體內(nèi)淀粉樣蛋白的方法使用hAPP小鼠模型。Rockenstein,J Neurosci Res.(2001)66(4):573-82。這些小鼠在早期年齡(3-4個月)發(fā)展出高水平的β-淀粉樣蛋白?？梢匀缦麓_定組合物的減少淀粉樣蛋白的能力：給小鼠注射本發(fā)明組合物，然后將那些小鼠中的淀粉樣蛋白水平與未注射的對照進行對比。也可能僅將組合物注射進hAPP小鼠的一個半球中，從而允許在相同小鼠的注射的半球和未注射的半球之間對比淀粉樣蛋白水平。
[0204] 在另一個實施例中，在以下文獻描述的阿爾茨海默氏病(TgAD)的轉基因小鼠模型中試驗本發(fā)明的組合物：US2011/0142803,Hsiao等人,Science(1996)274:99-102,或Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38。簡而言之，攻擊野生型以及轉基因小鼠。為了評估本發(fā)明組合物的充當解聚劑的潛力，將組合物顱內(nèi)地注射給轉基因小鼠(Taconic,APPSWE(2576),10月齡)。例如，對于包含噬菌體的組合物，歷時10分鐘將2.5μl14
絲狀噬菌體溶液(10 噬菌體/ml)注射(前囟點-2.8mm,外側2.5mm,腹側2.5mm)至一個
半球，同時向對側施加磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為對照。然后在不同的時間點處死經(jīng)治療的小鼠，將腦在4％低聚甲醛中后固定過夜，并使用切片機切片。進行硫代黃素-S(ThS)染色，以評價淀粉樣蛋白負載。用Mayer氏蘇木精將切片染色以淬滅核自發(fā)熒光，并在洗滌以后，施加ThS溶液(1％)3分鐘。使用1％乙酸進行分化20min，在洗滌以后，干燥載玻片，并用抗衰老固定介質(zhì)固定。使用LEICA Qwin程序，計算淀粉樣蛋白負載。可替換地，可以用抗-淀粉樣蛋白抗體評估淀粉樣蛋白負載。
絲狀噬菌體溶液(10 噬菌體/ml)注射(前囟點-2.8mm,外側2.5mm,腹側2.5mm)至一個
半球，同時向對側施加磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為對照。然后在不同的時間點處死經(jīng)治療的小鼠，將腦在4％低聚甲醛中后固定過夜，并使用切片機切片。進行硫代黃素-S(ThS)染色，以評價淀粉樣蛋白負載。用Mayer氏蘇木精將切片染色以淬滅核自發(fā)熒光，并在洗滌以后，施加ThS溶液(1％)3分鐘。使用1％乙酸進行分化20min，在洗滌以后，干燥載玻片，并用抗衰老固定介質(zhì)固定。使用LEICA Qwin程序，計算淀粉樣蛋白負載。可替換地，可以用抗-淀粉樣蛋白抗體評估淀粉樣蛋白負載。
[0205] 還可以測量放射性的(例如，I125)或熒光地標記的組合物或未標記的組合物(包括絲狀噬菌體)的生物分布，以證實組合物在體內(nèi)結合淀粉樣蛋白。例如，當組合物包含噬菌體時，可以放射性地或熒光地標記絲狀噬菌體。將BALB/c小鼠分組。然后每只小鼠歷時12
1小時鼻內(nèi)地接受100μl噬菌體(1.25x10 噬菌體)。在使用4％低聚甲醛施用賁門內(nèi)灌
注以后1小時，處死第一組小鼠。在治療后3小時，處死第二組，并在24小時后處死最后一組。灌注以后，取出腦以及周圍器官，并測量標記。可替換地，使用類似的方法，可以評估未標記的組合物或噬菌體的結合，但是用識別淀粉樣蛋白的染色劑和識別組合物或噬菌體的染色劑將腦切片共染色。
1小時鼻內(nèi)地接受100μl噬菌體(1.25x10 噬菌體)。在使用4％低聚甲醛施用賁門內(nèi)灌
注以后1小時，處死第一組小鼠。在治療后3小時，處死第二組，并在24小時后處死最后一組。灌注以后，取出腦以及周圍器官，并測量標記。可替換地，使用類似的方法，可以評估未標記的組合物或噬菌體的結合，但是用識別淀粉樣蛋白的染色劑和識別組合物或噬菌體的染色劑將腦切片共染色。
[0206] 還使用絲狀噬菌體的鼻內(nèi)施用來完全評價包含本發(fā)明提供的噬菌體(諸如包含突變體g3p或g3p的淀粉樣蛋白結合片段的噬菌體，或與野生型噬菌體相比具有增加
的g3p數(shù)目的噬菌體)的組合物。例如，將噬菌體鼻內(nèi)地施用給SWE/APP2576轉基因小
鼠(Taconic,10月齡)，即阿爾茨海默氏病的小鼠模型。每2周施用20微升噬菌體溶液
12
(5x10 /ml)持續(xù)4-12個月，并評價認知功能。治療階段以后，進行新物體識別試驗以研究噬菌體治療對記憶改善的影響。在第一天，將小鼠暴露于2個新物體持續(xù)20分鐘。次日，替換一個物體，并試驗小鼠的探究該新物體的好奇心。如下計算每只小鼠的識別指數(shù)：將它在新物體附近花費的時間除以在2個物體附近花費的總時間。因而，超過0.5的值指示識別舊物體和在新物體附近花費更多的時間來進行它的研究。
的g3p數(shù)目的噬菌體)的組合物。例如，將噬菌體鼻內(nèi)地施用給SWE/APP2576轉基因小
鼠(Taconic,10月齡)，即阿爾茨海默氏病的小鼠模型。每2周施用20微升噬菌體溶液
12
(5x10 /ml)持續(xù)4-12個月，并評價認知功能。治療階段以后，進行新物體識別試驗以研究噬菌體治療對記憶改善的影響。在第一天，將小鼠暴露于2個新物體持續(xù)20分鐘。次日，替換一個物體，并試驗小鼠的探究該新物體的好奇心。如下計算每只小鼠的識別指數(shù)：將它在新物體附近花費的時間除以在2個物體附近花費的總時間。因而，超過0.5的值指示識別舊物體和在新物體附近花費更多的時間來進行它的研究。
[0207] 蛋白錯誤折疊疾病的其它轉基因模型也可以用于證實，本發(fā)明組合物會減少淀粉樣蛋白。非限制性例子包括：“D系”α-突觸核蛋白小鼠(一種帕金森病模型,Masliah等人,Science(2000)287:1265-1269)；Tg2576小鼠(一種阿爾茨海默氏病模型,Hsiao等人,Science(1996)274:99-102和Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38在9)；用于帕金森病研究的不同 小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)；和可
得自JSW Lifescience的小鼠和大鼠模型，包括用于帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病的那些。
得自JSW Lifescience的小鼠和大鼠模型，包括用于帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病的那些。
[0208] 預見到其中已經(jīng)使g3p為無活性的噬菌體在這些測定中是無活性的，而野生型噬菌體會共同局部化至淀粉樣蛋白、減少淀粉樣蛋白負載、阻止淀粉樣蛋白形成和/或除去有毒寡聚體，并導致認知功能的改善。因而可以相對于這些陰性和陽性對照試驗本發(fā)明提供的包含g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的噬菌體的體內(nèi)活性。
[0209] 藥物組合物
[0210] 在另一個方面，本發(fā)明提供了藥學上可接受的組合物，其包含本發(fā)明的任意上述試劑(即，(a)g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體；(b)化合物、多肽和融合蛋白，其包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體；(c)絲狀噬菌體，其攜帶與野生型噬菌體相比增加的g3p拷貝數(shù)；(d)結合淀粉樣蛋白的展示媒介物，其攜帶：g3p，g3p的淀粉樣蛋白結合片段，其突變體或變體，或者包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體的化合物、多肽和融合蛋白；或(e)經(jīng)修飾的絲狀噬菌體，其攜帶g3p的變體、g3p的淀粉樣蛋白結合片段(不是作為展示的g3p蛋白的一部分)、這樣的結合片段的突變體或變體、或者包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體的融合蛋白或其它異源多肽)。
[0211] “藥物組合物”表示治療有效量的如本文中所述的組合物和生理學上合適的載體和/或賦形劑。藥物組合物不會造成對生物體的顯著刺激。短語“生理上可接受的載體”和“藥學上可接受的載體”可以互換使用，表示不會造成對生物體的顯著刺激且不會廢除施用的組合物的生物活性和性能的載體或稀釋劑。
[0212] 術語“賦形劑”表示，加入到藥物組合物中以進一步促進活性成分的施用的惰性物質(zhì)。例子包括、但不限于，例如，鹽水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和不同類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和表面活性劑，包括例如聚山梨酯20。
[0213] 使用一種或多種生理上可接受的載體(包含賦形劑和助劑)，可以以常規(guī)方式配制用于根據(jù)本發(fā)明的用途的藥物組合物，所述載體促進將所述活性成分加工成在藥學上可以使用的組合物。適當?shù)闹苿┤Q于選擇的施用途徑和遞送的組合物的性質(zhì)(例如，蛋白相對于噬菌體)。
[0214] 本發(fā)明的藥物組合物的合適施用途徑可以包括，例如，透粘膜遞送，特別是經(jīng)鼻遞送；胃腸外遞送，包括肌肉內(nèi)、皮下、骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射；口服；或直腸遞送。
[0215] 在某些實施方案中，以局部方式而不是全身方式施用藥物組合物，例如，通過將藥物組合物直接注射進患者的腦中。在某些實施方案中，所述注射技術是避開血腦屏障的任意技術，例如，通過直接骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)或心室內(nèi)注射。
[0216] 對于注射，本發(fā)明的活性成分可以配制在水溶液中，優(yōu)選地在生理上相容的緩沖液(諸如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液)中。對于透粘膜施用，在所述制劑中使用適合要透過的屏障的穿透劑。所述穿透劑在本領域內(nèi)是公知的。
[0217] 在某些實施方案中，通過鼻內(nèi)給藥來施用本發(fā)明的藥物組合物。已經(jīng)報道，鼻內(nèi)遞送能使病毒和大分子直接進入腦脊液(CSF)或CNS中。Mathison等人,1998；Chou等人,1997；Draghia等人,1995。
[0218] 對于通過鼻內(nèi)途徑的施用，以氣溶膠噴霧的形式從加壓包裝或噴霧器借助于合適的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)方便地遞送組合物。在加壓氣溶膠的情況下，通過提供閥來遞送計量的量，可以確定劑量單元?？梢耘渲圃诜峙淦髦惺褂玫哪z囊和藥盒(例如由明膠制成)，其含有所述化合物和合適的粉末基質(zhì)(諸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0219] 使用嗅覺受體神經(jīng)元作為遞送點，也可以將在本文中描述為藥物組合物組分的各種蛋白遞送至腦。例如，經(jīng)由嗅覺受體神經(jīng)元，可以遞送包含編碼那些蛋白中的任一種的基因的腺病毒載體。Draghia等人,1995。
[0220] 可以配制本文描述的組合物用于胃腸外施用，例如，通過快速推注或連續(xù)輸注。用于胃腸外施用的藥物組合物包括水溶形式的組合物的水溶液。另外，可以將活性成分的混懸液制備為油性的或基于水的注射混懸液。合適的親脂溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可以含有增加該混懸液的粘性的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述混懸液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或試劑(例如，表面活性劑諸如聚山梨酯(吐溫20))，其增加活性成分的溶解度以允許制備高度濃縮的溶液。基于蛋白的試劑(例如，白蛋白)可以用于阻止M13向遞送表面(即，IV袋、導管、針頭等)的吸附。
[0221] 對于口服施用，通過將活性化合物與本領域眾所周知的藥學上可接受的載體相組合，可以容易地配制組合物。
[0222] 制劑可以以單位劑型形式存在，例如，在管形瓶、安瓿中或在多劑量容器中，任選地含有添加的防腐劑。所述組合物可以是在油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液，并且可以含有配制試劑諸如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。單個劑型可以呈液體或固體形式。可以將單個劑型不經(jīng)修改地直接施用給患者，或者可以在施用之前稀釋或重構。在某些實施方案中，可以以推注形式(例如，單次注射、單次口服劑量，包括包含多個片劑、膠囊、丸劑等的口服劑量)施用單個劑型。在替代實施方案中，可以在一段時間內(nèi)施用單個劑型，諸如通過輸注，或經(jīng)由植入泵，諸如ICV泵。在后一種實施方案中，所述單個劑型可以是預裝了指定數(shù)目的絲狀噬菌體的輸注袋或泵蓄池?？商鎿Q地，可以在即將施用給患者之前，通過將單次劑量的絲狀噬菌體與輸注袋或泵蓄池溶液混合來準備所述輸注袋或泵蓄池。
[0223] 本發(fā)明的另一個方面包括用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法。用于配制藥物的技術可以參見，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版，其通過引用整體并入本文。
[0224] 適合用在本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物包括這樣的組合物，其中含有有效地達到預期目的的量的活性成分。
[0225] 治療或診斷有效量的確定完全在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)，特別是考慮到本文中提供的詳細公開內(nèi)容。
[0226] 可以個別地調(diào)節(jié)給藥量和間隔，以提供足以治療或診斷特定腦疾病、障礙或病癥的噬菌體展示媒介物的腦水平(最低有效濃度,MEC)。所述MEC將隨每種制劑而變化，但是可以從體外數(shù)據(jù)估測。達到MEC所必需的劑量將取決于個體特征。
[0227] 給藥間隔也可以使用MEC值來確定。應當使用特定方案來施用制劑，所述方案維持高于MEC的腦水平持續(xù)10-90％的時間，優(yōu)選30-90％，且最優(yōu)選50-90％。
[0228] 取決于要治療的病癥的嚴重程度和應答性，給藥可以是單次或多次給藥，療程持續(xù)幾天至幾周，或直到實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)的減輕。
[0229] 要施用的組合物的量當然取決于被治療或診斷的受試者、痛苦的嚴重程度、處方醫(yī)師的判斷等。
[0230] 如果需要的話，本發(fā)明的組合物可以存在于包裝或分配器裝置(諸如FDA批準的試劑盒)中，其可以含有一個或多個包含活性成分的單位劑型。所述包裝可以包含例如金屬或塑料箔，諸如泡罩包。所述包裝或分配器裝置可以伴有施用說明書。所述包裝或分配器還可以包納與容器結合的公告，所述公告采用管理藥物的制備、使用或銷售的政府機構指定的形式，所述公告反映了所述機構對所述組合物的形式或人或獸施用的批準。例如，這樣的公告可以是由美國食品和藥品管理局關于處方藥物批準的標記，或是批準的產(chǎn)品插頁。也可以制備包含在相容藥用載體中配制的本發(fā)明制劑的組合物，將其放置在適當?shù)娜萜髦校⑶覙擞浻糜谥付ú“Y的治療，如同上文更詳細所述那樣。
[0231] 應當理解，前面的和下面的描述僅僅是示例性的和解釋性的，且不限制要求保護的發(fā)明。
[0232] 治療用途
[0233] 如指出的，絲狀噬菌體M13和有關的絲狀噬菌體已經(jīng)在蛋白錯誤折疊疾病的動物模型中表現(xiàn)出效應。參見美國專利公開US 2011/0142803，通過引用整體并入本文。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，絲狀噬菌體具有解聚在腦中已經(jīng)形成的淀粉樣蛋白的能力。預見到淀粉樣蛋白的除去會減輕以腦中錯誤折疊的和/或聚集的蛋白為特征的多種疾病、減慢所述疾病的進展、或甚至逆轉與所述疾病有關的征狀。參見，例如，WO2006083795和WO2010060073，通過引用整體并入本文。
[0234] 此外，已經(jīng)證實M13會解聚至少4種不同的淀粉樣蛋白纖維：淀粉樣蛋白-β1-42纖維(fAβ42)、α-突觸核蛋白纖維(fαsyn)、酵母朊病毒NM纖維(fNM)和tau纖維(ftau)。
[0235] 因此，本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的任意組合物在治療蛋白錯誤折疊疾病(包括、但不限于，涉及fAβ42、fαsyn、fNM或ftau中的任一種的那些疾病)中的用途，所述組合物為諸如包含g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段(包括所有前述物質(zhì)的突變體或變體)的那些，或包含以上任一種的g3p融合蛋白、展示媒介物或噬菌體。
[0236] 在治療的上下文中，術語“患者”、“受試者”和“受體”互換使用，且包括人類以及其它哺乳動物。在某些實施方案中，患者是與蛋白錯誤折疊疾病有關的生物標志物陽性的人。在一個實施方案中，所述患者表現(xiàn)出β-淀粉樣沉著物，如通過使用florbetapir的PET成像所檢測出。
[0237] 術語“治療”意圖表示，在表現(xiàn)出疾病的一種或多種臨床征狀的患者中，減輕、減慢或逆轉疾病的進展?！爸委煛币惨鈭D表示，在表現(xiàn)出疾病的一種或多種臨床征狀的患者中，減輕、減慢或逆轉疾病的征狀。在一個實施方案中，所述患者表現(xiàn)出β-淀粉樣沉著物(如通過使用florbetapir的PET成像所檢測出)，并且所述治療會減少β-淀粉樣沉著物的數(shù)目。在一個實施方案中，所述患者表現(xiàn)出β-淀粉樣沉著物(如通過本發(fā)明的g3p組合物所檢測出)，并且所述治療會減少或維持β-淀粉樣沉著物的數(shù)目。在另一個實施方案中，所述患者表現(xiàn)出任意類型的淀粉樣沉著物(如通過PET成像所檢測出)，并且所述治療會改善所述患者的認知功能。通過McKhann等人,Alzheimer’s&Dementia(2011)May；7(3):263-9的方法和試驗，可以測定認知功能的改善。
[0238] “預防”不同于治療，且表示在任何臨床征狀發(fā)作之前給個體施用組合物。包括使用本發(fā)明的任意g3p和/或TolA組合物的預防。預防可能涉及已知處于高疾病風險中的個體或確定會發(fā)展疾病的個體(僅僅基于一種或多種遺傳標記)。已經(jīng)為不同的蛋白錯誤折疊疾病鑒別出許多遺傳標記。例如，具有人淀粉樣蛋白前體蛋白(hAPP)的瑞典突變、印第安納突變或倫敦突變中的一種或多種的個體，處于增加的發(fā)展早發(fā)型阿爾茨海默氏病的風險中，且所以是預防的候選人。同樣地，具有亨廷頓基因中的三核苷酸CAG重復的個體，特別是具有36個或更多個重復的那些個體，將最終發(fā)展亨廷頓病，且所以是預防的候選人。
[0239] 在某些實施方案中，將蛋白或片段直接用作治療劑。在這些實施方案中，將g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段(包括前述任一種的突變體或變體)直接摻入藥物組合物或制劑中。在其它實施方案中，g3p、N1N2結構域、N2結構域或其它淀粉樣蛋白結合片段(包括前述任一種的突變體或變體)是融合蛋白或展示媒介物(諸如噬菌體)的一部分，且在這些實施方案中，將所述融合蛋白或展示媒介物摻入本發(fā)明的藥物組合物或制劑中。在其它實施方案中，所述組合物包含含有g3p或其淀粉樣蛋白結合片段的噬菌體，其比野生型M13噬菌體的g3p更有效地降低或維持淀粉樣蛋白的水平。在某些實施方案中，所述比M13更有效地降低或維持淀粉樣蛋白的水平的噬菌體表達g3p的超過5個拷貝。
[0240] 術語“蛋白錯誤折疊”表示，以通過聚集蛋白(形成淀粉樣蛋白的肽)而形成淀粉樣蛋白為特征的疾病，所述淀粉樣蛋白為例如，但不限于，β-淀粉樣蛋白、血清淀粉樣蛋白A、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、IgGκ輕鏈或朊病毒蛋白。已知與錯誤折疊的和/或聚集的淀粉樣蛋白有關的疾病包括阿爾茨海默氏病(包括早發(fā)型阿爾茨海默氏病、遲發(fā)型阿爾茨海默氏病和癥狀發(fā)生前的阿爾茨海默氏病)、帕金森病、SAA淀粉樣變性、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、遺傳性冰島綜合征、年老、多發(fā)性骨髓瘤、朊病毒疾病，包括、但不限于庫魯病(kuru)、克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)、羊瘙癢癥和牛海綿狀腦炎(BSE)；肌萎縮性側索硬化(ALS)、脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷頓病、齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮、脊髓延髓肌肉萎縮癥、遺傳性腦淀粉樣蛋白血管病、家族性淀粉樣變性、額顳葉癡呆、英國/丹麥癡呆和家族性腦病。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療“蛋白錯誤折疊”疾病。
[0241] 這些錯誤折疊的和/或聚集的淀粉樣蛋白疾病中的許多發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中。發(fā)生在CNS中的疾病的一些例子是：帕金森?。话柎暮Ｄ喜?；額顳葉癡呆(FTD)，包括具有下述臨床綜合征的那些患者：行為變體FTD(bvFTD)、進展性非流利型失語癥(PNFA)和詞義性癡呆(SD)；額顳葉退化(FTLD)；和亨廷頓病。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的以錯誤折疊的和/或聚集的淀粉樣蛋白為特征的疾病。
[0242] 蛋白的錯誤折疊和/或聚集也可能發(fā)生在CNS以外。淀粉樣變性A(AA)(其中前體蛋白是血清急性期載脂蛋白，SAA)和多發(fā)性骨髓瘤(前體蛋白免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈)是2種廣泛已知的發(fā)生在CNS以外的蛋白錯誤折疊和/或聚集的蛋白疾病。其它例子
包括涉及由以下物質(zhì)形成的淀粉樣蛋白的疾?。害?-微球蛋白、轉甲狀腺素蛋白(家族性淀粉樣變性病的多神經(jīng)病[FAP]、家族性淀粉樣變性病的心肌病[FAC]和老年性全身性淀粉樣變性[SSA])、(脫輔基)血清AA、載脂蛋白AI、AII和AIV、鈣結合微絲蛋白(家族性淀粉樣變性病的多神經(jīng)病的芬蘭形式)、溶菌酶、纖維蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(腦淀粉樣蛋白血管病、冰島型遺傳性腦出血伴淀粉樣變性)、(原)降鈣素、胰島淀粉樣多肽(IAPP淀粉樣變性)、心鈉素、催乳素、胰島素、乳粘素、角質(zhì)上皮素、乳鐵蛋白、牙源性成釉質(zhì)細胞相關蛋白和精液凝固蛋白I。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療發(fā)生在CNS以外的涉及蛋白的錯誤折疊和/或聚集的疾病。
包括涉及由以下物質(zhì)形成的淀粉樣蛋白的疾?。害?-微球蛋白、轉甲狀腺素蛋白(家族性淀粉樣變性病的多神經(jīng)病[FAP]、家族性淀粉樣變性病的心肌病[FAC]和老年性全身性淀粉樣變性[SSA])、(脫輔基)血清AA、載脂蛋白AI、AII和AIV、鈣結合微絲蛋白(家族性淀粉樣變性病的多神經(jīng)病的芬蘭形式)、溶菌酶、纖維蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(腦淀粉樣蛋白血管病、冰島型遺傳性腦出血伴淀粉樣變性)、(原)降鈣素、胰島淀粉樣多肽(IAPP淀粉樣變性)、心鈉素、催乳素、胰島素、乳粘素、角質(zhì)上皮素、乳鐵蛋白、牙源性成釉質(zhì)細胞相關蛋白和精液凝固蛋白I。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療發(fā)生在CNS以外的涉及蛋白的錯誤折疊和/或聚集的疾病。
[0243] 神經(jīng)變性疾病也可能涉及tau病變(綜述見Lee等人(2001)Annu.Rev.Neurosci.24:1121-159)。Tau蛋白是在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突中表達的微管相關蛋白。包括神經(jīng)變性Tau病變(有時被稱作Tau病變)。Tau病變的例子包括阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化/帕金森-癡呆復合征、嗜銀顆粒性癡呆、皮質(zhì)基底變性、克雅病、拳擊員癡呆、伴發(fā)鈣化的彌漫性神經(jīng)原纖維纏結、唐氏綜合征、額顳葉癡呆(包括連鎖于17號染色體的伴帕金森癥的額顳葉癡呆)、 病、哈-斯二
氏病、肌強直性營養(yǎng)不良、C型Niemann-Pick病、伴發(fā)神經(jīng)原纖維纏結的非關島型運動神經(jīng)元病、皮克病、腦炎后帕金森癥、朊病毒蛋白腦淀粉樣蛋白血管病、進行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎和僅纏結性癡呆。這些疾病中的一些還可以包括纖絲狀淀粉樣蛋白β肽的沉著物。例如，阿爾茨海默氏病表現(xiàn)出淀粉樣蛋白β沉著物和tau病變。類似地，朊病毒介導的疾病諸如克雅病、朊病毒蛋白腦淀粉樣蛋白血管病和綜合征也可能具有tau病變。因而，疾病是“Tau病變”
的指示不應當解釋為排除來自其它神經(jīng)變性疾病分類或分組的疾病，其僅僅為了方便而提供。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療神經(jīng)變性疾病以及涉及tau病變的疾病。
氏病、肌強直性營養(yǎng)不良、C型Niemann-Pick病、伴發(fā)神經(jīng)原纖維纏結的非關島型運動神經(jīng)元病、皮克病、腦炎后帕金森癥、朊病毒蛋白腦淀粉樣蛋白血管病、進行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎和僅纏結性癡呆。這些疾病中的一些還可以包括纖絲狀淀粉樣蛋白β肽的沉著物。例如，阿爾茨海默氏病表現(xiàn)出淀粉樣蛋白β沉著物和tau病變。類似地，朊病毒介導的疾病諸如克雅病、朊病毒蛋白腦淀粉樣蛋白血管病和綜合征也可能具有tau病變。因而，疾病是“Tau病變”
的指示不應當解釋為排除來自其它神經(jīng)變性疾病分類或分組的疾病，其僅僅為了方便而提供。本發(fā)明的g3p組合物可以用于治療神經(jīng)變性疾病以及涉及tau病變的疾病。
[0244] 在一個實施方案中，藥物組合物或制劑是用在減少患者中的淀粉樣蛋白的方法中，所述患者表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白的存在有關的征狀，或者是與蛋白錯誤折疊疾病有關的生物標志物(諸如florbetapir(AV-45,Eli Lilly))陽性的，所述方法包括：給所述患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或制劑。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0245] 在一個實施方案中，藥物組合物或制劑是用在維持患者中的淀粉樣蛋白水平的方法中，所述患者表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白的存在有關的征狀，或者是與蛋白錯誤折疊疾病有關的生物標志物(諸如florbetapir(AV-45,Eli Lilly))陽性的，所述方法包括：給所述患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或制劑。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0246] 在一個實施方案中，藥物組合物或制劑是用在解聚患者中的淀粉樣蛋白的方法中，所述方法包括：給具有淀粉樣蛋白的患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或制劑。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0247] 在一個實施方案中，藥物組合物或制劑是用在造成腦中的β-淀粉樣沉著物解聚的方法中，所述方法包括：將有效量的如本文中所述的藥物組合物直接注射進有此需要的患者的腦中，由此造成腦中-淀粉樣沉著物的減少。
[0248] 在一個實施方案中，藥物組合物或制劑是用在減少腦中淀粉樣蛋白形成的方法中。減少腦中淀粉樣蛋白形成可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0249] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑是用在促進腦中的淀粉樣蛋白清除的方法中。促進淀粉樣蛋白清除可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0250] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑是用在抑制腦中淀粉樣蛋白聚集的方法中。抑制腦中淀粉樣蛋白聚集可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0251] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑是用在清除腦中有毒淀粉樣蛋白寡聚體的方法中。清除腦中有毒淀粉樣蛋白寡聚體可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0252] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑是用在預防有毒淀粉樣蛋白寡聚體在腦中形成的方法中。預防有毒寡聚體在腦中形成可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。
[0253] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑是用在保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷的方法中。保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷可以預防、治療或減輕蛋白錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的征狀或嚴重程度。在一個實施方案中，所述施用途徑選自鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)注射、實質(zhì)內(nèi)注射或鼻內(nèi)遞送。在一個實施方案中，預防性地施用用于保護神經(jīng)元免于淀粉樣蛋白損傷的本發(fā)明的藥物組合物或制劑。
[0254] 在某些實施方案中，所述患者是與蛋白錯誤折疊和/或聚集疾病有關的生物標志物陽性的。在一個實施方案中，所述生物標志物是florbetapir(AV45,Eli Lilly)。
[0255] 在某些實施方案中，所述患者正在表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白的存在有關的神經(jīng)變性疾病的征狀。在不同的實施方案中，所述淀粉樣蛋白是fAβ42、fαsyn、fNM或ftau中的任一種。
[0256] 在某些實施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病、阿爾茨海默氏病或亨廷頓病。在一個實施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。在一個實施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病，且所述患者表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白，如通過成像劑florbetapir(AV-45,Eli Lilly)所檢測出。
[0257] 在某些實施方案中，所述患者正在表現(xiàn)出朊病毒介導的疾病的征狀。
[0258] 在某些實施方案中，所述朊病毒介導的疾病選自：克雅病、庫魯病(kuru)、致死性家族性失眠癥或 綜合征。
[0259] 在某些實施方案中，所述患者正在表現(xiàn)出除了阿爾茨海默氏病以外的神經(jīng)變性Tau病變的征狀。在某些實施方案中，要治療的疾病選自：嗜銀顆粒性癡呆、皮質(zhì)基底變性、拳擊員癡呆、伴發(fā)鈣化的彌漫性神經(jīng)原纖維纏結、唐氏綜合征、額顳葉癡呆(包括連鎖于17號染色體的伴帕金森癥的額顳葉癡呆)、哈-斯二氏病、肌強直性營養(yǎng)不良、C型Niemann-Pick病、伴發(fā)神經(jīng)原纖維纏結的非關島型運動神經(jīng)元病、皮克病、腦炎后帕金森癥、進行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎和僅纏結性癡呆。
[0260] 診斷
[0261] 在本發(fā)明的另一個方面，本文描述的g3p和TolA組合物(包括g3p融合蛋白)被用于與本文描述的不同疾病有關的診斷應用中。例如，當在體內(nèi)或在體外用作成像劑時，本發(fā)明組合物的結合可以是描述的蛋白錯誤折疊疾病之一的診斷的一部分。
[0262] 包括診斷劑(另外在本文中被稱作診斷組合物)，且其可以包含本發(fā)明的上述試劑中的任一種(即，(a)g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體；(b)化合物、多肽和融合蛋白，其包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體；(c)絲狀噬菌體，其攜帶與野生型噬菌體相比增加的g3p拷貝數(shù)；(d)結合淀粉樣蛋白的展示媒介物，其攜帶：g3p，g3p的淀粉樣蛋白結合片段，其突變體或變體，或者包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體的化合物、多肽和融合蛋白；或(e)經(jīng)修飾的絲狀噬菌體，其攜帶g3p的變體、g3p的淀粉樣蛋白結合片段(不是作為展示的g3p蛋白的一部分)、這樣的結合片段的突變體或變體、或者包含g3p、g3p的淀粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體的融合蛋白或其它異源多肽)。診斷劑可以進一步包含可檢測標記，或者可以以其它方式在體內(nèi)檢測出。
[0263] 在某些實施方案中，本發(fā)明組合物，諸如包含可溶性g3p或淀粉樣蛋白結合片段(包括其突變體和變體)或g3p融合蛋白的組合物，被用作淀粉樣蛋白成像劑。所述成像劑可以檢測淀粉樣蛋白和診斷與淀粉樣蛋白有關的疾病。因為本發(fā)明的組合物會結合淀粉樣蛋白(不論纖維的類型)，它們是有利的，因為它們可以將任意淀粉樣蛋白聚集體(Aβ、tau、α-突觸核蛋白等)成像—都用單一成像劑。目前，對于CNS中的tau或α突觸核蛋白聚集體而言，沒有可接受的成像劑/方法。并且盡管存在針對β-淀粉樣蛋白的成像劑，仍然需要這樣的額外試劑：其可以提供改善的認知功能和成像結果之間的關聯(lián)，和/或更好地預測哪個患者將惡化還是保持穩(wěn)定。關于綜述，參見Resnick&Sojkova,Alzheimer’s Res Ther.(2011)3(1):3。
[0264] 本發(fā)明的診斷組合物可以與對β-淀粉樣蛋白特異性的成像劑(例如，F(xiàn)18-AV-45,Eli Lilly)聯(lián)合地用作成像劑。由于目前沒有針對非-β-淀粉樣蛋白聚集體的已知成像劑，本發(fā)明的診斷組合物與β-淀粉樣蛋白-特異性的成像劑一起的應用，會導致基于示差檢測對非-β-淀粉樣蛋白聚集體的檢測。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明的診斷組合物與β-淀粉樣蛋白成像劑聯(lián)合用作成像劑來檢測非-β-淀粉樣蛋白聚集體。
[0265] 在另一個實施方案中，將本發(fā)明的診斷組合物用作成像劑來檢測CNS(包括腦)中的β-淀粉樣蛋白。
[0266] 本發(fā)明的診斷組合物通常要求，當用作成像劑時，淀粉樣蛋白結合組分連接至一種或多種可檢測標記。使用用于標記蛋白的標準技術，可以將不同的標記連接至診斷組合物的淀粉樣蛋白結合組分。標記的例子包括熒光標記和放射性標記。可以使用多種放射性18 11 123
標記，但是一般而言，所述標記經(jīng)常選自放射性標記，包括、但不限于，F(xiàn)、C和 I。使用眾所周知的化學方法，可以將這些和其它放射性同位素連接至蛋白。在一個實施方案中，使用正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)，檢測所述標記。但是，用于檢測放射性同位素的任意其它合適的技術也可以用于檢測放射性示蹤劑。
標記，但是一般而言，所述標記經(jīng)常選自放射性標記，包括、但不限于，F(xiàn)、C和 I。使用眾所周知的化學方法，可以將這些和其它放射性同位素連接至蛋白。在一個實施方案中，使用正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)，檢測所述標記。但是，用于檢測放射性同位素的任意其它合適的技術也可以用于檢測放射性示蹤劑。
[0267] 使用關于治療組合物描述的相同途徑，可以施用本發(fā)明的診斷組合物。在一個實施方案中，將鞘內(nèi)施用用作施用診斷組合物的途徑。在另一個實施方案中，將靜脈內(nèi)施用用作施用診斷組合物的途徑。
[0268] 實施例
[0269] 盡管經(jīng)證實的絲狀噬菌體作為結合劑和抗聚集劑的治療效果在任何特定作用機理上不是偶然的，對所述機理的理解允許設計具有更大治療效果的噬菌體。另外，它充當制備額外抗聚集劑的基礎。
[0270] 如以前指出的，已經(jīng)證實M13會結合和解聚至少4種不同的淀粉樣蛋白纖維：淀粉樣蛋白-β1-42纖維(fAβ42)、α-突觸核蛋白纖維(fαsyn)、酵母朊病毒NM纖維(fNM)和tau纖維(ftau)。構成這些淀粉樣蛋白纖維的4種蛋白具有無關的一級氨基酸序列，但是所有4種都錯誤折疊成規(guī)范的淀粉樣蛋白折疊。Eichner&Radford,2011。M13的結合和介導這些中的每一種的解聚的能力指示，M13會識別結構基序諸如交叉-β折疊構象或構象特征諸如疏水槽，它們二者是所有淀粉樣蛋白纖維的確定特征。
[0271] 但是淀粉樣蛋白解聚不是所有噬菌體的一般性質(zhì)。例如，在結構上不同的二十面體噬菌體T7不會介導fAβ42的解聚，即使當將T7與fAβ42一起在37℃溫育3天時。即使在M13將超過70％的共溫育的淀粉樣蛋白纖維解離的濃度，噬菌體T7不會顯示出任何解離活性。相比而言，噬菌體fd與M13類似地結合和解聚fAβ42，與M13相比，所述噬菌體fd在它的g8p中攜帶帶負電荷的氨基酸(并因此在給定g8p的拷貝數(shù)下展示出比M13
多2800個的負電荷/噬菌體)。這些初步研究與以下發(fā)現(xiàn)一起提示，噬菌體的形狀可能對于它的淀粉樣蛋白纖維-解離活性而言是關鍵性的：淀粉樣蛋白解聚也可以由煙草花葉病毒(TMV)大腸桿菌菌毛和T4的尾管介導，它們都還具有螺旋柱形狀和重復單元(參見US
2011/0182948)。
多2800個的負電荷/噬菌體)。這些初步研究與以下發(fā)現(xiàn)一起提示，噬菌體的形狀可能對于它的淀粉樣蛋白纖維-解離活性而言是關鍵性的：淀粉樣蛋白解聚也可以由煙草花葉病毒(TMV)大腸桿菌菌毛和T4的尾管介導，它們都還具有螺旋柱形狀和重復單元(參見US
2011/0182948)。
[0272] 但是，下述實施例描述了報道的絲狀噬菌體的結合和抗聚集性質(zhì)的替代性的(盡管非相互排斥的)機制?；谶@些實施例和它們所支持的作用機理，與新淀粉樣蛋白-結合劑一起提供了改進了噬菌體，其具有改善的與淀粉樣蛋白的結合。
[0273] 實施例1:M13噬菌體優(yōu)先結合Aβ纖絲
[0274] 通過表面等離子體共振(SPR)確定M13與Aβ纖絲(相對于Aβ單體)結合.
[0275] M13噬菌體優(yōu)先結合Aβ纖絲；它不會結合Aβ單體。在圖3中報道了表面等離14
子體共振研究，其使用流過具有固定化的fAβ的生物傳感器芯片的10 個噬菌體/mL。圖
3表明，M13結合的KD是約4nM，其與單克隆抗體的結合相當。該高親和力相互作用指示，在噬菌體和淀粉樣蛋白纖維之間發(fā)生特異性結合過程。
子體共振研究，其使用流過具有固定化的fAβ的生物傳感器芯片的10 個噬菌體/mL。圖
3表明，M13結合的KD是約4nM，其與單克隆抗體的結合相當。該高親和力相互作用指示，在噬菌體和淀粉樣蛋白纖維之間發(fā)生特異性結合過程。
[0276] 實施例2：M13與Ab纖絲的結合是劑量依賴性的
[0277] M13與fAβ42的結合也是劑量依賴性的。在圖4A中，對比了2種噬菌體劑量與遞增摩爾量的fAβ42的結合。在該M13-淀粉樣蛋白纖維結合測定中，將M13-Alexa488與Aβ(fAβ)混合2-3小時以允許形成復合物，然后通過在7500rpm離心10分鐘來沉淀復合物。在沉淀物中的熒光與結合至淀粉樣蛋白上的M13成比例。該測定會提供噬菌體與fAβ的結合的定量量度，并提供用于評估其它試劑與噬菌體競爭結合的能力的系統(tǒng)。圖4B表明，M13結合競爭的KD類似于使用表面等離子體共振觀察到的結合的KD。
[0278] 實施例3：M13與Aβ纖絲的結合需要天然構象
[0280] 實施例4：溫度與M13-淀粉樣蛋白相互作用有關
[0281] M13有效地解聚淀粉樣蛋白纖維。圖6顯示了使用fAβ的硫代黃素T(ThT)熒光測定。在有M13存在下，fAβ42解聚。
[0282] 圖7A表明，使ThT熒光中的鹽濃度改變10倍(從0.15至1.5M)僅會導致解聚的fAβ的百分比的2-3倍差異。這指示，疏水相互作用會引起觀察到的大多數(shù)解聚。
[0283] 與鹽濃度的相對微小的影響相比，圖7B表明，使溫度從4℃改變至37℃會導致解聚的8-10倍差異。
[0284] 這些結果指示，M13解聚依賴于在較高溫度更有活性并且在測定中對鹽的作用相對不敏感的蛋白，從而暗示疏水相互作用。噬菌體g3p適合該描述。它的N1和N2結構域通過柔性的富含甘氨酸的接頭連接，所述接頭在N2與細菌性菌毛結合以后“打開”。N1然后可用于結合細菌共受體，作為感染過程的一部分。預見到，在解聚測定中增加溫度會“打開”g3p的N2和N1結構域。
[0285] 盡管在高溫滅活M13(90℃,10分鐘,參見圖5)會廢除結合，但是在M13-淀粉樣蛋白結合測定中增加溫育溫度對結合具有積極作用。圖8A表明，使溫度從18℃增加至58℃會導致逐漸更好的結合，一直到接近鉸鏈解折疊TM約50℃，在該點，結合開始下降。該最佳結合溫度與g3p中的N1-N2解折疊的溫度(所謂的解鏈溫度，或TM)一致，其為48.1℃。使溫育溫度增加至50℃(相對于37℃)也會導致M13與fAβ42的更快速結合。圖8B。
[0286] 實施例5：M13-β-淀粉樣蛋白相互作用需要g3p
[0287] 為了直接試驗M13-β-淀粉樣蛋白相互作用是否需要g3p，通過使用ArgC的蛋白水解處理從噬菌體除去g3p(M13Δg3p)，并針對Aβ結合將M13Δg3p噬菌體與重折疊的噬菌體進行對比。使用ArgC(一種芽孢桿菌屬蛋白酶)的處理會選擇性地從噬菌體除去g3p亞基。結果呈現(xiàn)在圖9A中。重折疊的M13在競爭結合測定中仍然與野生型M13競爭，盡管在降低的水平。但是，即使15倍的M13Δg3p也較差地(如果有的話)與野生型M13競爭。與野生型M13競爭的這種無能與M13Δg3p噬菌體的侵染性損失一致。圖9B。ArgC處理也造成解聚活性的喪失。圖9C。
[0288] 如果g3p以類似于它在感染中的作用的方式介導結合，那么對于感染而言重要的N1和N2結構域應當也會與M13競爭結合。為了試驗這方面，制備了重組可溶性
N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“構建體3”)，并在競爭測定中試驗。如在圖10A和10B中所示，M13與標記的M13競爭對fAβ42的結合，但是M13Δg3p不會。相比而言，rs-g3p(N1N2)能夠與M13競爭，從而指示g3p的N1和N2結構域對于β-淀粉樣蛋白結合而言是足夠的。在競爭測定的重復中得到了類似的結果。圖10B。
N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“構建體3”)，并在競爭測定中試驗。如在圖10A和10B中所示，M13與標記的M13競爭對fAβ42的結合，但是M13Δg3p不會。相比而言，rs-g3p(N1N2)能夠與M13競爭，從而指示g3p的N1和N2結構域對于β-淀粉樣蛋白結合而言是足夠的。在競爭測定的重復中得到了類似的結果。圖10B。
[0289] 實施例6：g3p鉸鏈解折疊突變會調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白結合
[0290] 影響g3p的N1和N2結構域之間的鉸鏈的打開能力的突變應當也會影響攜帶那些突變的噬菌體的與野生型M13競爭對Aβ的結合的能力。Eckert&Schmid,2007描述了幾種被用于試驗該假設的變體噬菌體。變體“AAA”(也被稱作“3A”)會損害菌毛結合并降低N2結構域的穩(wěn)定性。AAA攜帶g3p中的下述突變：W181A、F190A和F194A。IIHY含有突變T13I、T101I、Q129H和D209Y，它們會穩(wěn)定化N2結構域和增加TM。
[0291] 評估了以下噬菌體的結合競爭：fd，其在N1和N2結構域中具有與M13g3p相同的氨基酸序列(圖2)；IIHY，其具有比M13和AAA更高的鉸鏈Tm。將噬菌體fd、AAA和IIHY在50℃預活化1.5小時，然后針對它們的與標記的M13競爭的能力來對比活化的和非活化的Fd、AAA和IIHY。圖11呈現(xiàn)了結果。當通過加熱來活化時，野生型fd是更好的競爭劑。
相比而言，加熱對IIHY(其具有較高的鉸鏈Tm)幾乎沒有影響。在有或沒有熱預處理下，AAA(與M13相比，其具有降低的N2結構域穩(wěn)定性)是更好的競爭劑。
相比而言，加熱對IIHY(其具有較高的鉸鏈Tm)幾乎沒有影響。在有或沒有熱預處理下，AAA(與M13相比，其具有降低的N2結構域穩(wěn)定性)是更好的競爭劑。
[0292] 這些數(shù)據(jù)支持以下結論：M13與β-淀粉樣蛋白的相互作用是經(jīng)由與M13感染細菌的機制類似的機制。首先，它們指示，疏水相互作用對于M13-β-淀粉樣蛋白相互作用而言是重要的。其次，M13結合和解聚活性的溫度依賴性反映了N1-N2鉸鏈解折疊Tm。第三，g3p的選擇性蛋白酶解會廢除M13-β-淀粉樣蛋白相互作用。
[0293] 實施例7：g3p片段選擇性地和有效地結合淀粉樣蛋白，但是不會結合單體
[0294] 為了評估g3p片段是否保留結合淀粉樣蛋白的能力，制備了包含N1和N2的g3p片段，并通過表面等離子體共振(SPR)評估它的結合Aβ纖絲(相對于Aβ單體)的能力。
結果指示，rs-g3p(N1N2)優(yōu)先結合Aβ纖絲；它不會結合Aβ單體。在圖13報告了使用
4μM rs-g3p(N1N2)的表面等離子體共振研究，該圖也顯示了rs-g3p(N1N2)結合的KD為約
160nM。該高親和力相互作用指示，特異性結合過程發(fā)生在rs-g3p(N1N2)和淀粉樣蛋白纖維之間。
結果指示，rs-g3p(N1N2)優(yōu)先結合Aβ纖絲；它不會結合Aβ單體。在圖13報告了使用
4μM rs-g3p(N1N2)的表面等離子體共振研究，該圖也顯示了rs-g3p(N1N2)結合的KD為約
160nM。該高親和力相互作用指示，特異性結合過程發(fā)生在rs-g3p(N1N2)和淀粉樣蛋白纖維之間。
[0295] 通過SPR評估了額外構建體。下表總結了結果。
[0296]
[0297]
[0298] 實施例8：g3p片段有效地解聚Aβ42纖維
[0299] 為了試驗g3p片段是否可以解聚淀粉樣蛋白纖維，在ThT熒光測定中試驗了rs-g3p(N1N2)的降解預形成的fAβ42纖絲的能力。結果指示，rs-g3p(N1N2)有效地解聚fAβ42。圖14A顯示了該實驗的結果，即rs-g3p(N1N2)以劑量依賴性的方式解聚fAβ42。
圖14B表明IC50為大約20nM。
圖14B表明IC50為大約20nM。
[0300] 在一個單獨的實驗中，將Aβ42在有或沒有2μM濃度的rs-g3p(N1N2)存在下在37℃溫育7天，并通過透射電子顯微術評估Aβ42纖維的完整性。圖15A顯示了該實驗的結果，即rs-g3p(N1N2)解聚Aβ42纖維。圖15B報告了在這些相同樣品上的ThT測定的結果。Rs-g3p(N1N2)在該ThT測定中降解預形成的Aβ42纖維。
[0301] 實 施 例 9：rs-g3p(N1N2) 會 阻 斷 α- 突 觸 核 蛋 白 和 Aβ 裝 配 且rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc會阻斷裝配和抑制Aβ的聚集
[0302] 為了確定g3p是否可以阻斷α-突觸核蛋白纖維裝配，并且也為了確定價(即，g3p的拷貝數(shù))是否起作用，進行了測試五聚體g3p(5個g3p拷貝)和單體g3p(1個g3p拷貝)的阻斷α-突觸核蛋白活性的測定。結果表明，g3p會阻斷α-突觸核蛋白纖維裝配，并且在該活性方面，五聚體g3p比單體g3p更有效。參見圖16。
[0303] 還評估了rs-g3p(N1N2)(構建體3)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)的抑制Aβ42裝配的能力。如在圖30和圖31中所示，構建體3和構建體6能夠以劑量依賴性的方式抑制fAβ42的裝配。如在圖37中所示，構建體3和構建體6能夠抑制fAβ42聚集。
[0304] 實施例10：rs-g3p(N1N2)-Ig融合蛋白結合和解聚Aβ
[0305] 為了評估g3p價是否在g3p結合淀粉樣蛋白的效能中起作用，制備了關于rs-g3p(N1N2)二價的Ig融合蛋白(“rs-g3p(N1N2)-Ig融合體”)，并與五價M13對比了它的結合Aβ纖維的能力。如在圖17中所示，rs-g3p(N1N2)-Ig融合體以與M13類似的親和力并且比單獨的rs-g3p(N1N2)更有效地結合Aβ，從而指示g3p的價可能是重要的。在競爭測定的重復中得到了類似的結果。圖18。在圖18中，正方形代表構建體2(M13)；三角形代表構建體3(rs-g3p(N1N2))；倒轉三角形代表構建體4(rs-g3p(N1N2)-Ig融合體)；且菱形代表r-IgG4Fc陰性對照。
[0306] 為了評估價是否也在解聚中起作用，在過濾器截留測定中對比了二價rs-g3p(N1N2)-Ig融合體(“構建體4”)和五價M13。圖19。結果指示，二價rs-g3p(N1N2)-Ig融合體和五價M13都有效地解聚β-淀粉樣蛋白纖維。也指示價對于解聚效能而言可能是重要的，如1.7nM五價M13以與40nMrs-g3p(N1N2)-Ig融合體類似的水平減少聚集體的能力所指示的。圖19。
[0307] 在一個類似的測定中，在過濾器截留測定中針對它們的解聚Aβ42纖維的能力測12
定了1x10 /ml M13(構建體2)、80nm和800nMrs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體5)、和80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)。構建體2、5和6有效地解聚β-淀粉樣蛋
白纖維。圖33。
定了1x10 /ml M13(構建體2)、80nm和800nMrs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體5)、和80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)。構建體2、5和6有效地解聚β-淀粉樣蛋
白纖維。圖33。
[0308] 實施例11:四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]蛋白結合和解聚fAβ
[0309] 為了進一步評估價對g3p的結合和解聚淀粉樣蛋白的能力的作用，通過在有NiSO4存在下組合rs-g3p(N1N2)與生物素-Lys-NTA，制備了四聚體抗生蛋白鏈菌素綴合的g3p(N1N2)。使用MWCO 3KDa膜，除去多余的配體。加入抗生蛋白鏈菌素，并使用MWCO
100 KDa膜除去多余的rs-g3p(N1N2)-生物素。得到的g3p構建體抗生蛋白鏈菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]具有4個rs-g3p(N1N2)部分。在結合測定中將抗生蛋白鏈菌素-[生物
素-g3p(N1N2)]與rs-g3p(N1N2)(“構建體3”)進行了對比。圖20。四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]比單體rs-g3p(N1N2)更有效地結合fAβ，從而提供了價對于結合效能而言是重要的進一步指示。圖20。但是，即使單體rs-g3p(N1N2)也以治療上可接受的水平結合fAβ。
100 KDa膜除去多余的rs-g3p(N1N2)-生物素。得到的g3p構建體抗生蛋白鏈菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]具有4個rs-g3p(N1N2)部分。在結合測定中將抗生蛋白鏈菌素-[生物
素-g3p(N1N2)]與rs-g3p(N1N2)(“構建體3”)進行了對比。圖20。四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]比單體rs-g3p(N1N2)更有效地結合fAβ，從而提供了價對于結合效能而言是重要的進一步指示。圖20。但是，即使單體rs-g3p(N1N2)也以治療上可接受的水平結合fAβ。
[0310] 為了評估價是否也在解聚中起作用，在過濾器截留測定中將單體rs-g3p(N1N2)與四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]進行了對比。圖21。結果指示，單體rs-g3p(N1N2)和四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]有效地解聚fAβ纖
維。也指示價對于解聚效能而言可能是重要的，如360nM四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]的廢除多達200ngfAβ聚集體的優(yōu)越能力(相對于2.5μM單體
rs-g3p(N1N2)對Aβ的解聚的減少)所指示。圖21，例如將第2行與第4行進行對比。
維。也指示價對于解聚效能而言可能是重要的，如360nM四聚體抗生蛋白鏈菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]的廢除多達200ngfAβ聚集體的優(yōu)越能力(相對于2.5μM單體
rs-g3p(N1N2)對Aβ的解聚的減少)所指示。圖21，例如將第2行與第4行進行對比。
[0311] 還通過TEM評估了抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]對Aβ的解聚。溫育3天以后，抗生蛋白鏈菌素-[生物素-g3p(N1N2)]完全解聚fAβ42。圖22。
[0312] 實施例12：N1N2-Ig融合蛋白顯著地減少阿爾茨海默氏病的鼠模型中的Aβ
[0313] 使用眾所周知的用于研究阿爾茨海默氏病的小鼠模型(Hsiao等人,Science(1996)274:99-102；Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38)，將雄性Tg2576小鼠飼養(yǎng)至大于500天，在兩側向海馬中注射(2μL/注射)N1N2-Ig融合體
的2種不同制劑(在7.8μg/注射的構建體5和在8.2μg/注射的構建體6)或鹽水(作
為陰性對照)，并在第7天處死。收獲腦組織，切片，并使用抗-淀粉樣蛋白β單克隆抗體(82E1；目錄號MBS490005-IJ10323，得自MyBioSource)染色用于斑塊負荷定量。如在圖28中所示，與鹽水治療的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白顯著減少在海馬中測得的斑塊負荷。如在圖29中所示，與鹽水治療的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白顯著減少在大腦皮質(zhì)中測得的斑塊負荷。
的2種不同制劑(在7.8μg/注射的構建體5和在8.2μg/注射的構建體6)或鹽水(作
為陰性對照)，并在第7天處死。收獲腦組織，切片，并使用抗-淀粉樣蛋白β單克隆抗體(82E1；目錄號MBS490005-IJ10323，得自MyBioSource)染色用于斑塊負荷定量。如在圖28中所示，與鹽水治療的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白顯著減少在海馬中測得的斑塊負荷。如在圖29中所示，與鹽水治療的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白顯著減少在大腦皮質(zhì)中測得的斑塊負荷。
[0314] 實施例13：N1N2-Ig融合蛋白會阻斷Aβ寡聚體誘導的細胞毒性
[0315] Aβ寡聚體會造成某些有毒酶在神經(jīng)元細胞中的釋放。可以測定酶以確定化合物是否可以抑制Aβ寡聚體誘導的細胞毒性。圖32呈現(xiàn)的代表性數(shù)據(jù)表明，M13(構建體2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構建體6)會阻斷寡聚體誘導的對N2a細胞的毒性。因此，g3p片段是Aβ寡聚體誘導的細胞毒性的有效抑制劑。
[0316] 實施例14：N1N2-Ig融合蛋白結合和解聚tau
[0317] 為了評估g3p片段是否結合tau，制備了包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白，并通過表面等離子體共振(SPR)評估了它的結合ftau的能力。圖35顯示了一種代表性的SPR測定的結果，其表明rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構建體4)有效地結合ftau。
[0318] 為了試驗g3p片段是否可以解聚tau，針對它的降解預形成的ftau的能力，在ThT熒光測定中試驗了包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白。結果指示，N1N2-Ig融合蛋白有效地解聚ftau。參見，圖36A和圖36B。
[0319] 實施例15:N1N2-Ig融合蛋白在朊病毒病的細胞培養(yǎng)模型(N2a22LSc)中抑制PrPScSc積累、聚集和PrP 形成。
[0320] 朊病毒病的特征在于正常細胞的朊病毒蛋白(PrPc)轉化為蛋白酶抗性的病理學Sc Sc c Sc形式PrP ?；诘鞍酌缚剐?，將PrP 與PrP 區(qū)分開：蛋白酶部分地降解PrP 以形成蛋白Sc
酶抗性的C-端核心片段(PrPres)，后者具有19-21kDa分子量的未糖基化形式。PrP 的抑制、逆轉和減少構成治療幾種變性疾病的可行治療方案。
酶抗性的C-端核心片段(PrPres)，后者具有19-21kDa分子量的未糖基化形式。PrP 的抑制、逆轉和減少構成治療幾種變性疾病的可行治療方案。
[0321] 為了確定包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白(構建體6)在朊病毒病的體外模Sc
型中是否干擾病理學朊病毒構象異構體(PrP )的形成，并且為了驗證在有或沒有構建體6Sc
存在下N2a22L 細胞中的PrP的解聚或可溶性變化，將細胞在沒有或有1ug/ml構建體6或IgG存在下培養(yǎng)24h并收獲在裂解緩沖液中。將100μg總蛋白在Beckman Optima TL超
速離心機中在TLA100.1轉子中在55,000rpm在4℃超速離心90min。對25μl溶解的沉淀
物和上清液的樣品進行SDS-PAGE和使用抗-PrP抗體6D11mAb的下游分析。增加的去污劑Sc
不溶解性領先于PrP 或PrP突變體對蛋白水解酶K(PK)抗性的獲取，因此評估了構建體6Sc
的改變PrP可溶性的能力。與IgG處理的N2a22L 細胞相比，構建體6處理過的細胞表現(xiàn)
出顯著減少的量的聚集的/不溶性的PrP。參見圖38A和圖38B。
型中是否干擾病理學朊病毒構象異構體(PrP )的形成，并且為了驗證在有或沒有構建體6Sc
存在下N2a22L 細胞中的PrP的解聚或可溶性變化，將細胞在沒有或有1ug/ml構建體6或IgG存在下培養(yǎng)24h并收獲在裂解緩沖液中。將100μg總蛋白在Beckman Optima TL超
速離心機中在TLA100.1轉子中在55,000rpm在4℃超速離心90min。對25μl溶解的沉淀
物和上清液的樣品進行SDS-PAGE和使用抗-PrP抗體6D11mAb的下游分析。增加的去污劑Sc
不溶解性領先于PrP 或PrP突變體對蛋白水解酶K(PK)抗性的獲取，因此評估了構建體6Sc
的改變PrP可溶性的能力。與IgG處理的N2a22L 細胞相比，構建體6處理過的細胞表現(xiàn)
出顯著減少的量的聚集的/不溶性的PrP。參見圖38A和圖38B。
[0322] 對 于 圖 38A和 38B，如 以 前 所 述 (Pankiewicz等 人 ,Eur.J.Neurosci.Sc(2006)23:2635-2647)制備N2a22L 細胞。簡而言之，將用小鼠適應的22L朊病毒菌株感染的最終生病的CD-1小鼠的腦在無菌條件下通過聲處理在冷磷酸鹽緩沖鹽水和5％葡萄糖中勻漿化(10％重量/體積)。為了感染，將腦勻漿物在Opti-MEM中進一步稀釋至2％，
2
并以1mL/10-cm 孔加入到亞匯合的6-孔平板(Corning,Acton,MA,USA)中。5h以后，加
入1mL常規(guī)MEM，并將細胞在有傳染性腦勻漿物存在下溫育額外12h。洗滌細胞，并加入標
2
準的MEM生長培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)至匯合，然后拆分成1:2稀釋物，并轉移至25-cm 燒瓶(Corning)。每4天1:2拆分在燒瓶之一內(nèi)培養(yǎng)的細胞以得到后代，而將在其它燒瓶中培養(yǎng)Sc
的細胞收獲和均質(zhì)化以監(jiān)測PrP 的水平?；谙惹暗难芯浚瑑H在第一代和第二代中檢測出Sc
接種物衍生出的PrP 的存在，所以將第4代(P4)細胞用于所有后續(xù)研究。將細胞在勻漿化緩沖液(由50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM Na3VO4、
1mMNaF、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸鹽、1％NP-40、0.25％脫氧膽酸鈉、0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、1mM亮抑酶肽、1mM胃酶抑素A、1mM)組成，或對于PK消化而言不含PMSF)中在4℃裂解5min，并通過在4℃在10,000g離心10min除去不溶物。對于細胞分級分離，將
100μg蛋白在55,000rpm離心90min，此后將沉淀物重構在開始體積中。生化地分辨和表征20％的沉淀物和上清液。
2
并以1mL/10-cm 孔加入到亞匯合的6-孔平板(Corning,Acton,MA,USA)中。5h以后，加
入1mL常規(guī)MEM，并將細胞在有傳染性腦勻漿物存在下溫育額外12h。洗滌細胞，并加入標
2
準的MEM生長培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)至匯合，然后拆分成1:2稀釋物，并轉移至25-cm 燒瓶(Corning)。每4天1:2拆分在燒瓶之一內(nèi)培養(yǎng)的細胞以得到后代，而將在其它燒瓶中培養(yǎng)Sc
的細胞收獲和均質(zhì)化以監(jiān)測PrP 的水平?；谙惹暗难芯浚瑑H在第一代和第二代中檢測出Sc
接種物衍生出的PrP 的存在，所以將第4代(P4)細胞用于所有后續(xù)研究。將細胞在勻漿化緩沖液(由50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM Na3VO4、
1mMNaF、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸鹽、1％NP-40、0.25％脫氧膽酸鈉、0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、1mM亮抑酶肽、1mM胃酶抑素A、1mM)組成，或對于PK消化而言不含PMSF)中在4℃裂解5min，并通過在4℃在10,000g離心10min除去不溶物。對于細胞分級分離，將
100μg蛋白在55,000rpm離心90min，此后將沉淀物重構在開始體積中。生化地分辨和表征20％的沉淀物和上清液。
[0323] 為了確定構建體6是否劑量依賴性地改變PrPSc的繁殖(通過解聚或改變它Sc
的物理化學性質(zhì))，將N2a22L 細胞在沒有或有遞增濃度的構建體6或IgG存在下培養(yǎng)
24h，并收獲在裂解緩沖液中。將經(jīng)過和沒有經(jīng)過PK處理的裂解的細胞的等分試樣進行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗體6D11和6H4mAb進行下游分析。評估得自對照IgG和構建
體6處理過的細胞的、生化地分辨的PK消化的和未消化的裂解物的PrP免疫反應性。處
Sc
理包括：N2a22L +10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、Sc
0.012μg/ml和0.004μg/ml構建體6、或N2a22L +1μg/ml mIgG。
的物理化學性質(zhì))，將N2a22L 細胞在沒有或有遞增濃度的構建體6或IgG存在下培養(yǎng)
24h，并收獲在裂解緩沖液中。將經(jīng)過和沒有經(jīng)過PK處理的裂解的細胞的等分試樣進行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗體6D11和6H4mAb進行下游分析。評估得自對照IgG和構建
體6處理過的細胞的、生化地分辨的PK消化的和未消化的裂解物的PrP免疫反應性。處
Sc
理包括：N2a22L +10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、Sc
0.012μg/ml和0.004μg/ml構建體6、或N2a22L +1μg/ml mIgG。
[0324] 結果指示在有構建體6存在下PrPSc的顯著劑量依賴性的下降，與1ug/mlIgG相Sc比，在有0.08ug/ml構建體6存在下產(chǎn)生了少50％的PrP 。參見圖39A和圖39B。重復的
實驗證實了這些結果。
實驗證實了這些結果。
[0325] 為了評估PrP的蛋白水解酶K(PK)抗性的構象異構體，根據(jù)以前的方法(Perrier等人,J.Neurochem(2004)84:454-463,Pankiewicz等人,2006)，將裂解的細胞的等分試樣用PK(1μg/μg)1:50稀釋液在37℃處理30min。溫育以后，通過加入PMSF至4mM，停止消化。
[0326] 使用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)，確定蛋白濃度。在樣品緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.8)、10％SDS、5mMβ-巰基乙醇、50％甘油、0.02％考馬斯藍G250)中稀釋樣品，并煮沸5min。在還原條件下通過SDS-PAGE分辨經(jīng)加工的樣品。
[0327] 使 用 抗-PrP 單 克 隆 抗 體 6D11(參 見 Sadowski等 人 ,Neurobiol Dis.(2009)34(2):267-278)和6H4(參見Cordes等人,J Immunol Methods(2008)337:106-120)以及抗-肌動蛋白來表征樣品。使用辣根過氧化物酶-綴合的抗-小鼠IgG(GEHealthcare UK Limited,Buckinghamshire,UK)檢測抗原-抗體復合物，并使用ECL系統(tǒng)(GE Healthcare UK Limited)按照生產(chǎn)商的說明書顯影。通過膠片的密度計分析(Image J,NIH)，進行蛋白帶的定量。
[0328] 在圖38A和38B和圖39A和39B中顯示的結果一起證實了g3p片段Ig融合蛋白Sc
的在體外直接抑制PrP 形成的能力。
的在體外直接抑制PrP 形成的能力。
| 標題 | 發(fā)布/更新時間 | 閱讀量 |
|---|---|---|
| N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的用途 | 2020-05-22 | 739 |
| 一種短肽抑制劑及其用途 | 2020-05-23 | 694 |
| 鉤吻素子治療淀粉樣蛋白沉積和/或tau病變相關性疾病或病癥的用途 | 2020-05-27 | 394 |
| 朊病毒體外抑制劑 | 2020-05-26 | 536 |
| 測量心臟迷走神經(jīng)張力的裝置和方法 | 2020-05-25 | 783 |
| 白皮杉醇在制備治療朊病毒引起疾病藥物中的用途 | 2020-05-21 | 228 |
| 牛海綿狀腦病檢查的預處理方法以及檢查的預處理系統(tǒng) | 2020-05-11 | 342 |
| 噬菌體的P3融合蛋白作為淀粉樣蛋白結合劑的用途 | 2020-05-26 | 637 |
| 間苯三酚類衍生物及其在治療神經(jīng)退行性疾病中的用途 | 2020-05-18 | 495 |
| 1,1’-(1,6-二氧代-1,6-己二基)雙-D-脯氨酸的前藥 | 2020-05-24 | 881 |
高效檢索全球專利專利匯是專利免費檢索,專利查詢,專利分析-國家發(fā)明專利查詢檢索分析平臺，是提供專利分析，專利查詢，專利檢索等數(shù)據(jù)服務功能的知識產(chǎn)權數(shù)據(jù)服務商。
我們的產(chǎn)品包含105個國家的1.26億組數(shù)據(jù)，免費查、免費專利分析。
分析報告
專利匯分析報告產(chǎn)品可以對行業(yè)情報數(shù)據(jù)進行梳理分析，涉及維度包括行業(yè)專利基本狀況分析、地域分析、技術分析、發(fā)明人分析、申請人分析、專利權人分析、失效分析、核心專利分析、法律分析、研發(fā)重點分析、企業(yè)專利處境分析、技術處境分析、專利壽命分析、企業(yè)定位分析、引證分析等超過60個分析角度，系統(tǒng)通過AI智能系統(tǒng)對圖表進行解讀，只需1分鐘，一鍵生成行業(yè)專利分析報告。
QQ群二維碼
意見反饋
意見反饋