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包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體G3P氨基酸序列的多肽
閱讀：1002發(fā)布：2020-06-24
專利匯可以提供包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體G3P氨基酸序列的多肽專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及包含足以結(jié)合和/或解聚 淀粉 樣蛋白的絲狀 噬菌體 基因3蛋白(g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突變體和 片段 的多肽，其中已通過 氨 基酸取代修飾該g3p氨基酸序列，以當(dāng)在體內(nèi)使用時具有比對應(yīng)的野生型g3p氨基酸序列顯著更小的免疫原性。本發(fā)明的多肽保持它們結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的能 力 。本發(fā)明此外還涉及這些變體g3p-多肽在 治療 和/或 預(yù)防 與淀粉樣蛋白的錯誤折疊或聚集相關(guān)的 疾病 中的用途。，下面是包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體G3P氨基酸序列的多肽專利的具體信息內(nèi)容。
1.一種多肽，其包含起始氨基酸序列的變體，其中所述起始氨基酸序列選自：SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217，和具有以下修飾的一個或多個的任何上述氨基酸序列的突變體：氨基酸43-45處AAA對VVV的取代；取代C53W；氨基酸96-103的缺失；氨基酸212-214處AGA對QPP的取代；取代W181A、F190A和F194A；氨基酸1的缺失；和氨基酸1和2的缺失，其中：
(a)所述多肽結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白；
(b)所述多肽相較于包含所述起始氨基酸序列的對應(yīng)多肽具有減小的免疫原性；
(c)所述變體相較于所述起始氨基酸序列具有1至9個氨基酸取代，其中每一個氨基酸取代選自下文中所示的氨基酸取代的組：
和
(d)當(dāng)所述起始氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217時，1至9個氨基酸取代的任一個任選地另外選自下文中所示的氨基酸取代的組：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述起始氨基酸序列中的所述1至9個氨基酸取代的每一個選自下文中所示的氨基酸取代的組：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述起始氨基酸序列選自SEQ?ID?NO:
1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217和SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述變體氨基酸序列相對于起始氨基酸序列具有2至9個氨基酸取代，并且其中至少一個取代存在于包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸48-56的表位1；包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:
7的氨基酸135-143的表位2；和包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸
173-181的表位3的至少兩個中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述經(jīng)修飾的氨基酸序列僅具有2個氨基酸取代，并且其中所述取代選自下文中所示的二氨基酸取代的組：
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述變體氨基酸序列相對于所述起始氨基酸序列具有3至9個氨基酸取代，并且其中至少一個取代存在于包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸48-56的表位1；包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸135-143的表位2；和包含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸
173-181的表位3的每一個中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述變體氨基酸序列相較于所述起始氨基酸序列僅具有3個氨基酸取代，并且所述取代選自以下組的氨基酸取代的任一個：T56H、M135K和D178N；T56K、M135K和D178N；T56K、M135T和D178N；T56H、M135K和W181R；T56H、M135T和W181R；Y54K、M135T和K174R；Y54R、M135K和K174R；Y54R、M135T和K174R；T56H、M135K和K174R；以及T56H、M135T和K174R。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽，其基本上由通過肽接頭或直接地與所述變體氨基酸序列的C末端融合的人或人源化免疫球蛋白Fc多肽序列組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述免疫球蛋白Fc多肽序列為人IgG的Fc部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其中所述肽接頭和人IgG的Fc部分的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO:1的氨基酸218-488、SEQ?ID?NO:3的氨基酸218-486和SEQ?ID?NO:7的氨基酸
218-488。
11.一種由經(jīng)修飾的起始序列組成的多肽變體，其中所述起始序列選自SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7，并且所述修飾是兩個或三個氨基酸取代，所述多肽選自下文中所示的多肽的任一個：
多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
63 SEQ?ID?NO:3 Y54K M135K 無
64 SEQ?ID?NO:3 Y54K M135T 無
65 SEQ?ID?NO:3 Y54K R140Q 無
66 SEQ?ID?NO:3 Y54R M135K 無
67 SEQ?ID?NO:3 Y54R M135T 無
68 SEQ?ID?NO:3 Y54R R140Q 無
69 SEQ?ID?NO:3 T56H M135K 無
70 SEQ?ID?NO:3 T56H M135T 無
多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
71 SEQ?ID?NO:3 T56H R140Q 無
72 SEQ?ID?NO:3 T56K M135K 無
73 SEQ?ID?NO:3 T56K M135T 無
74 SEQ?ID?NO:3 T56K R140Q 無
75 SEQ?ID?NO:3 Y54K 無 D178N
76 SEQ?ID?NO:3 Y54K 無 W181H
77 SEQ?ID?NO:3 Y54K 無 W181R
78 SEQ?ID?NO:3 Y54K 無 K174R
79 SEQ?ID?NO:3 Y54R 無 D178N
80 SEQ?ID?NO:3 Y54R 無 W181H
81 SEQ?ID?NO:3 Y54R 無 W181R
82 SEQ?ID?NO:3 Y54R 無 K174R
83 SEQ?ID?NO:3 T56H D178N ?
84 SEQ?ID?NO:3 T56H 無 W181H
85 SEQ?ID?NO:3 T56H 無 W181R
86 SEQ?ID?NO:3 T56H 無 K174R
87 SEQ?ID?NO:3 T56K 無 D178N
88 SEQ?ID?NO:3 T56K 無 W181H
89 SEQ?ID?NO:3 T56K 無 W181R
90 SEQ?ID?NO:3 T56K 無 K174R
91 SEQ?ID?NO:3 無 M135K D178N
92 SEQ?ID?NO:3 無 M135K W181H
93 SEQ?ID?NO:3 無 M135K W181R
94 SEQ?ID?NO:3 無 M135K K174R
95 SEQ?ID?NO:3 無 M135T D178N
96 SEQ?ID?NO:3 無 M135T W181H
97 SEQ?ID?NO:3 無 M135T W181R
98 SEQ?ID?NO:3 無 M135T K174R
99 SEQ?ID?NO:3 無 R140Q D178N
100 SEQ?ID?NO:3 無 R140Q W181H
101 SEQ?ID?NO:3 無 R140Q W181R
102 SEQ?ID?NO:3 無 R140Q K174R
110 SEQ?ID?NO:7 T56H M135K D178N
111 SEQ?ID?NO:7 T56H M135K W181H
112 SEQ?ID?NO:7 T56H M135K W181R
113 SEQ?ID?NO:7 T56H M135K K174R
114 SEQ?ID?NO:7 T56H M135T D178N
115 SEQ?ID?NO:7 T56H M135T W181H
116 SEQ?ID?NO:7 T56H M135T W181R
117 SEQ?ID?NO:7 T56H M135T K174R
118 SEQ?ID?NO:7 T56K M135K D178N
119 SEQ?ID?NO:7 T56K M135K W181H
多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
120 SEQ?ID?NO:7 T56K M135K W181R
121 SEQ?ID?NO:7 T56K M135K K174R
122 SEQ?ID?NO:7 T56K M135T D178N
123 SEQ?ID?NO:7 T56K M135T W181H
124 SEQ?ID?NO:7 T56K M135T W181R
125 SEQ?ID?NO:7 T56K M135T K174R
126 SEQ?ID?NO:7 Y54K M135K K174R
127 SEQ?ID?NO:7 Y54K M135T K174R
128 SEQ?ID?NO:7 Y54R M135K K174R
129 SEQ?ID?NO:7 Y54R M135T K174R
130 SEQ?ID?NO:7 T56H 無 D178N
131 SEQ?ID?NO:7 T56H 無 W181H
132 SEQ?ID?NO:7 T56H 無 W181R
133 SEQ?ID?NO:7 T56H 無 K174R
134 SEQ?ID?NO:7 T56K 無 D178N
135 SEQ?ID?NO:7 T56K 無 W181H
136 SEQ?ID?NO:7 T56K 無 W181R
137 SEQ?ID?NO:7 T56K 無 K174R
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其選自多肽編號110、112、113、116、117、118、122、
127、128或129的任一個。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制用于向患者的血流中注射或輸注。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制用于向腦或CNS直接施用。
16.一種在有此需要的患者中減少淀粉樣蛋白或τ蛋白聚集物的方法，其包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述患者正表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白或τ蛋白聚合物的存在相關(guān)的神經(jīng)變性疾病的癥狀。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的方法，其中當(dāng)將生物標(biāo)志物florbetapir在正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)中用作成像劑時，所述患者對于所述生物標(biāo)志物呈陽性。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有神經(jīng)變性疾病，其選自阿爾茨海默病，其包括早發(fā)性阿爾茨海默病、遲發(fā)性阿爾茨海默病和癥狀發(fā)生前阿爾茨海默病、帕金森氏病、SAA淀粉樣變性、胱白酶抑制劑C、遺傳性冰島綜合癥、衰老、多發(fā)性骨髓瘤、朊病毒疾病，包括但不限于庫魯病、克雅氏病(CJD)、格斯特曼-施特勞斯納病(GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)、瘙癢病和牛海綿狀腦炎(BSE)；肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCA1、SCA3、SCA6或SCA7)、亨廷頓舞蹈癥、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥、脊髓和延髓性肌萎縮、遺傳性腦淀粉樣血管病、家族性淀粉樣變性、英國人/丹麥人癡呆、家族性腦病、肌萎縮側(cè)索硬化/帕金森-癡呆綜合征、嗜銀顆粒癡呆、皮質(zhì)基底節(jié)變性、拳擊員癡呆、彌散性神經(jīng)原纖維纏結(jié)鈣化、唐氏綜合征、格斯特曼-施特勞斯納病、哈勒沃登-施帕茨病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、尼曼-皮克病C型、非關(guān)島運(yùn)動神經(jīng)元疾病與神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮克氏病、腦炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白腦淀粉樣血管病、進(jìn)行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進(jìn)行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、僅纏結(jié)型癡呆、額顳葉退化(FTLD)和額顳葉癡呆(FTD)，包括具有以下臨床癥狀的一個或多個的患者：行為異常型FTD(bvFTD)、進(jìn)行非流利失語(PNFA)、與染色體17相關(guān)的額顳葉癡呆與帕金森、進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)和語義性癡呆(SD)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森氏病、阿爾茨海默病或亨廷頓舞蹈癥。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述患者患有選自克雅氏病、庫魯病、致命性家族性失眠癥或格斯特曼-施特勞斯納綜合征的朊病毒介導(dǎo)的疾病。
23.一種核酸序列，其編碼權(quán)利要求1-12所述的多肽的任一個。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸序列，其還編碼與所述多肽編碼序列融合且與所述多肽編碼序列框內(nèi)融合的哺乳動物信號序列。
25.一種載體，其包含權(quán)利要求23或24所述的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地連接于所述載體中的表達(dá)控制序列。
26.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求25所述的載體。
27.一種方法，其產(chǎn)生權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽，所述方法包括表達(dá)由權(quán)利要求23或24所述的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)；和分離所述表達(dá)的多肽的步驟。
28.一種方法，其產(chǎn)生權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽，所述方法包括在足以允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞；和分離所述表達(dá)的多肽的步驟。
包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體G3P氨基酸序列
的多肽
[0001] 本發(fā)明涉及多肽，所述多肽包含足以結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的絲狀噬菌體基因3蛋白(g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突變體和片段，其中g(shù)3p氨基酸序列已通過氨基酸取代被修飾來當(dāng)在體內(nèi)使用時具有比對應(yīng)的野生型g3p氨基酸序列顯著更小的免疫原性。本發(fā)明的多肽保留它們結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的能力。本發(fā)明還涉及這些經(jīng)修飾的g3p多肽用于治療和/或預(yù)防與淀粉樣蛋白的錯誤折疊或聚集相關(guān)的疾病的用途。
[0002] 已證明絲狀噬菌體g3p蛋白以及特別地包含g3p的N1-N2區(qū)的其多肽部分結(jié)合并解聚各種淀粉樣蛋白，諸如β-淀粉樣蛋白、τ蛋白和朊病毒蛋白。參見共同未決的PCT申請PCT/US2012/066793以及美國臨時申請US?61/801,349和US?61/801,849，所述每一個申請的公開內(nèi)容通過引用并入本文。也參見，R.Krishnan等，J.Mol.Biol.(2014)。盡管存在該功效，但預(yù)期包含g3p或其N1-N2區(qū)的多肽的全身性施用可引起有害的免疫答應(yīng)。然而，這些教導(dǎo)都未鑒定導(dǎo)致g3p的免疫原性性質(zhì)的特定T細(xì)胞表位或建議此處提供的減少或消除這些免疫原性性質(zhì)的特定修飾。
[0003] 許多重組或另外地非天然治療性蛋白質(zhì)或多肽的功效可受患者與所述治療性蛋白質(zhì)或多肽的不希望的免疫反應(yīng)限制。蛋白質(zhì)對免疫響應(yīng)的誘導(dǎo)的主要因素是蛋白質(zhì)內(nèi)的T細(xì)胞表位，即可通過在組織相容性復(fù)合物(MHC)II類分子上的呈遞刺激T細(xì)胞的活性的氨基酸序列的存在。T細(xì)胞表位通常被定義為具有結(jié)合MHC?II類分子的能力的任何氨基酸殘基序列。當(dāng)結(jié)合于MHC分子時，T細(xì)胞表位可被T細(xì)胞受體(TCR)識別，并可通過銜接T細(xì)胞受體以促進(jìn)T細(xì)胞響應(yīng)來引起T細(xì)胞的活化。然而，通常應(yīng)理解，結(jié)合MHC?II類分子的某些T細(xì)胞表位不刺激T細(xì)胞響應(yīng)，因?yàn)檫@些肽在向其施用所述蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)被識別為“自身的”。
[0004] 一些T細(xì)胞表位可在治療性蛋白質(zhì)或多肽在細(xì)胞內(nèi)降解過程中被作為肽釋放，隨后被MHC的分子呈遞以觸發(fā)T細(xì)胞的活化。對于由MHC?II類分子呈遞的肽，T細(xì)胞的此類活化則可通過直接刺激B細(xì)胞產(chǎn)生此類抗體來產(chǎn)生例如所述抗體響應(yīng)。
[0005] MHC?II類分子是一組在輔助T細(xì)胞選擇和活化中起著中心作用的高度多態(tài)的蛋白質(zhì)。人白細(xì)胞抗原組DR(HLA-DR)是該組蛋白質(zhì)的占優(yōu)勢的同種型。然而，同種型HLA-DQ和HLA-DP進(jìn)行相似的功能。在人中，已知DR同種型的約70種不同的同種異型，對于DQ，存在30種不同的同種異型以及對于DP，已知47種不同的同種異型。每一個個體具有2至4個DR等位基因，2個DQ和2個DP等位基因。
[0006] 個體中針對蛋白質(zhì)或多肽的免疫響應(yīng)嚴(yán)重受到T細(xì)胞表位識別影響，所述T細(xì)胞表位識別是該個體的HLA-DR同種異型的肽結(jié)合特異性的函數(shù)。為了在全球人口的背景中鑒定蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)的T細(xì)胞表位，期望考慮盡可能多樣的一組HLA-DR同種異型的結(jié)合性質(zhì)，從而覆蓋盡可能高的百分比的世界人口。
[0007] T細(xì)胞表位鑒定是表位消除的第一步驟。使得能夠檢測T細(xì)胞表位的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且公開于WO?98/52976、WO?00/34317、US2007/0269435；US?7,208,147、Kern等，Nature?Medicine4:975-978(1998)；和Kwok等，Trends?in?Immunology?22:583-588(2001)中。在這些方法中，通過在治療性蛋白質(zhì)或多肽的一級序列內(nèi)使用明智的氨基酸取代來除去預(yù)測的或鑒定的T細(xì)胞表位。雖然這些參考資料使得能夠進(jìn)行T細(xì)胞表位的假定鑒定，但避免對生物活性的負(fù)面影響的氨基酸取代的選擇不能被合理地預(yù)測。這僅可通過測試經(jīng)修飾的多肽的每一個的此類活性來測定。
[0008] 因此，可能期望檢查和減小g3p的N1-N2部分的免疫原性而不破壞其淀粉樣蛋白-結(jié)合/解聚性質(zhì)，以便可為了治療和/或診斷目的長期全身性施用包含N1-N2部分的多肽。本發(fā)明通過鑒定N1-N2序列內(nèi)的潛在T細(xì)胞表位來滿足該需要。本發(fā)明還鑒定了在這些潛在T細(xì)胞表位內(nèi)的特定氨基酸取代以產(chǎn)生變體N1-N2序列，所述變體N1-N2序列將減少或消除T細(xì)胞表位的免疫原性而不破壞變體N1-N2結(jié)合淀粉樣蛋白、阻止淀粉樣蛋白聚集和/或?qū)崿F(xiàn)淀粉樣蛋白斑的解聚的能力。
[0009] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了多肽，所述多肽包含N1-N2氨基酸序列的變體或其突變體或片段，由于一個或多個鑒定的T細(xì)胞表位內(nèi)的一個或多個氨基酸取代而具有減小的免疫原性。在一個方面，本發(fā)明提供了包含與人免疫球蛋白Fc區(qū)融合的變體N1-N2序列的融合蛋白。
[0010] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物，以及通過向患有與錯誤折疊和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊∫赘械氖茉囌呤┯么祟愃幬锝M合物來治療或預(yù)防此類疾病的方法。
[0011] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子，以及包含那些核酸分子的載體和具有此類載體的細(xì)胞。
[0012] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。具體地，此類方法使用所述核酸分子和/或具有包含此類核酸分子的載體的細(xì)胞。
[0014] 圖1顯示具有5個通過粗體和下劃線標(biāo)識的T細(xì)胞表位的N1-N2-hIgG1-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ?ID?NO:1)。氨基酸1-217構(gòu)成野生型g3p序列的N1-N2部分。氨基酸218-256代表由存在于M13噬菌體中的野生型g3p的富含甘氨酸的N2-C末端接頭組成的接頭區(qū)。
該區(qū)域通過陰影來標(biāo)識。氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子的多克隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。蛋白質(zhì)的IgG-Fc部分始于氨基酸262。
該區(qū)域通過陰影來標(biāo)識。氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子的多克隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。蛋白質(zhì)的IgG-Fc部分始于氨基酸262。
[0015] 圖2代表具有4個通過下劃線標(biāo)識的T細(xì)胞表位的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白(SEQ?ID?NO:2)的替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過刪除對應(yīng)于SEQ?ID?NO:1的氨基酸258至259的氨基酸來消除第五T細(xì)胞表位。
[0016] 圖3顯示具有3個通過粗體和下劃線標(biāo)識的T細(xì)胞表位的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白(SEQ?ID?NO:3)的另一個替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過V215A和G220E的取代(相較于SEQ?ID?NO:1)消除了第四T細(xì)胞表位，以及已通過刪除對應(yīng)于SEQ?ID?NO:1的氨基酸258和259的氨基酸消除了第五T細(xì)胞表位。
[0017] 圖4A顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ?ID?NO:1的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白的DNA序列(SEQ?ID?NO:4)。圖4B顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ?ID?NO:2的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白的DNA序列(SEQ?ID?NO:5)。
[0018] 圖5顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ?ID?NO:3的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白的DNA序列(SEQ?ID?NO:6)。
[0020] 圖7顯示具有3個通過粗體和下劃線標(biāo)識的T細(xì)胞表位的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白(SEQ?ID?NO:7)的另一個替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過V215G取代(如相較于SEQ?ID?NO:1)消除第四T細(xì)胞表位。
[0021] 圖8顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ?ID?NO:7的g3p-hIgG1-Fc融合蛋白的DNA序列(SEQ?ID?NO:8)。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 在本申請中，關(guān)于參照(未修飾的)氨基酸或核酸序列的術(shù)語“經(jīng)修飾的”(及其同源詞)是指含有一個或多個氨基酸取代或?qū)?yīng)的密碼子取代的序列。修飾不一定需要參照序列的物理操作。只要序列含有如相較于參照序列的此類取代，其就可被認(rèn)為是“經(jīng)修飾的”，無論其是如何合成的。術(shù)語“變體”是指已被修飾來相較于參照序列減小免疫原性的氨基酸或核酸序列。如本文中所用，“變體g3p”或“變體N1-N2”是指這樣的氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)，所述序列包含絲狀噬菌體g3p蛋白的N1-N2部分(例如，SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217)，或(b)結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的該氨基酸序列的突變體或片段(例如，SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217)，其中所述氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)已被修飾來相較于參照(未修飾的)氨基酸序列減小免疫原性；以及其中所述修飾由選自表1、表2、表6或表7的任一個中所示的氨基酸取代或?qū)?yīng)取代的組的1至9個選自氨基酸取代組成。如本文中所用，術(shù)語“對應(yīng)取代”意指當(dāng)將此類突變體或片段與SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217比對時，對應(yīng)于表1、表2、表6或表7中的等同氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1的突變體或氨基酸1-217的片段中的取代。
[0024] 結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的片段的實(shí)例包括，但不限于，包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-67的任何片段。結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的片段的突變體的實(shí)例包括，但不限于：(1)SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217；(2)在氨基酸43-45處具有AAA對VVV的取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:
3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(3)具有取代C53W的SEQ?ID?NO:1的氨基酸
1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(4)具有氨基酸96-103的缺失的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(5)在氨基酸212-214處具有AGA對QPP的取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(6)具有取代W181A、F190A和F194A的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-
217；(7)PCT/US2012/066793中公開的其它活性突變體和片段；(8)SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-
217；(9)SEQ?ID?NO:1的氨基酸2-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸2-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸
2-217；(10)SEQ?ID?NO:1的氨基酸3-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸3-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸3-217。
3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(3)具有取代C53W的SEQ?ID?NO:1的氨基酸
1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(4)具有氨基酸96-103的缺失的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(5)在氨基酸212-214處具有AGA對QPP的取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217；(6)具有取代W181A、F190A和F194A的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-
217；(7)PCT/US2012/066793中公開的其它活性突變體和片段；(8)SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-
217；(9)SEQ?ID?NO:1的氨基酸2-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸2-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸
2-217；(10)SEQ?ID?NO:1的氨基酸3-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸3-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸3-217。
[0025] 先前已顯示絲狀噬菌體g3p蛋白的N1-N2部分具有淀粉樣蛋白結(jié)合和解聚性質(zhì)(參見PCT/US2012/066793)。天然M13噬菌體的N1-N2部分由SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217代表。相同的N1-N2氨基酸序列也存在于fd和f1絲狀噬菌體中。應(yīng)當(dāng)理解，SEQ?ID?NO:1的氨基酸
218-256也是天然g3p序列的部分并且通常被稱為將g3p的N2區(qū)連接至g3p(CT)的C末端的富含甘氨酸的接頭，也稱為N3結(jié)構(gòu)域。SEQ?ID?NO:1的氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼SEQ?ID?NO:1的融合蛋白的核酸分子的多克隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。
218-256也是天然g3p序列的部分并且通常被稱為將g3p的N2區(qū)連接至g3p(CT)的C末端的富含甘氨酸的接頭，也稱為N3結(jié)構(gòu)域。SEQ?ID?NO:1的氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼SEQ?ID?NO:1的融合蛋白的核酸分子的多克隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。
[0026] 多肽
[0027] 因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含變體g3p或變體N1-N2的多肽。本發(fā)明的更具體的實(shí)施方案提供了包含選自SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217和SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的起始氨基酸序列的變體的多肽，其中：(a)所述多肽結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白；(b)所述多肽相較于包含起始氨基酸序列的對應(yīng)多肽具有減小的免疫原性；和(c)所述變體相較于所述起始氨基酸序列具有1至9個氨基酸取代，其中每一個氨基酸取代選自表1和表2中所示的氨基酸取代的組。如本文中所用，術(shù)語“包含起始氨基酸序列的對應(yīng)多肽”意指除取代外具有與包含所述起始氨基酸序列的多肽相同的氨基酸序列的多肽。
[0028] 表1.針對SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的去免疫化氨基酸取代。
[0029]
[0030] 表2.針對SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的替代性或另外的去免疫化氨基酸取代。
[0031]
[0033] 通過鑒定完全存在于N1-N2氨基酸序列內(nèi)的T細(xì)胞表位來導(dǎo)出表1和2中所示的氨基酸取代。這通過將N1-N2序列的不同重疊肽部分針對來自一個組群的最佳地代表HLA-DR同種異型的世界人口的社區(qū)供血者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行孵育以鑒定潛在T細(xì)胞表位來進(jìn)行。隨后將該信息經(jīng)歷針對已知T細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫的軟件分析以鑒定那些潛在表位內(nèi)的最佳氨基酸取代。這些方法詳細(xì)地描述于實(shí)施例中。
[0034] 在這些實(shí)施方案的一個方面，1-9個氨基酸取代選自表1中所示的那些氨基酸取代。在上文所示的實(shí)施方案的更具體方面，所述多肽包含僅具有特定的單氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體，其中所述取代選自表3中所示的取代之一：
[0035] 表3.SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217中的特定去免疫化單氨基酸取代
[0036]G48H G48K G48R G48S
G48T T51G T51H T51K
T51P T51R T51Q T51N
Y54G Y54H Y54K Y54P
Y54R T56G T56H T56K
T56P T56R M135A M135D
M135G M135H M135K M135N
M135R M135T R140A R140D
R140E R140G R140H R140Q
F141D F141E N143A N143G
S173G S173P M176G M176H
M176K M176N D178G D178N
D178Q D178S W181G W181H
W181K W181R S173K K174R
M176R D178T ? ?
G48T T51G T51H T51K
T51P T51R T51Q T51N
Y54G Y54H Y54K Y54P
Y54R T56G T56H T56K
T56P T56R M135A M135D
M135G M135H M135K M135N
M135R M135T R140A R140D
R140E R140G R140H R140Q
F141D F141E N143A N143G
S173G S173P M176G M176H
M176K M176N D178G D178N
D178Q D178S W181G W181H
W181K W181R S173K K174R
M176R D178T ? ?
[0037] 在一些實(shí)施方案中，多肽包含具有2-9個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體、或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體，其中所述取代存在于表位1、2和3的至少兩個中，并且其中所述取代選自表1和2中所示的那些表位。在更具體方面，SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體中的至少2個取代選自表1中所示的那些取代。在甚至更具體方面，所述多肽包含僅具有2個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體，其中所述取代選自表4中所示的任何特定的二氨基酸取代：
[0038] 表4.SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217中的特定的去免疫化的二氨基酸取代：
[0039]
[0040]
[0041] 在另一個實(shí)施方案中，所述多肽包含具有3-9個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體、或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體，其中至少一個氨基酸取代存在于表位1、2和3的每一個中，并且其中所述取代選自表1和表2中所示的取代。在更具體方面，SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體中的至少3個氨基酸取代選自表2中所示的取代。在甚至更具體方面，包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217的變體或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217的變體的多肽僅具有3個氨基酸取代，其中所述取代選自表5中所示的任何特定的三氨基酸取代。
[0042] 表5.SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-215、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1-217或SEQ?ID?NO:7的氨基酸1-217中的特定的去免疫化的三氨基酸取代：
[0043]
[0044]
[0045] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含g3p變體的多肽，其中1至9個取代之一是選自V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q或V215R的表位4中的取代。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體的多肽，其中1至9個取代之一是選自V215A、V215S、V215G、V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q或V215R的表位4中的取代。通過測試N1-N2序列的重疊潛在的T細(xì)胞表位肽部分，本申請人已確定SEQ?ID?NO:1中的V215是跨越SEQ?ID的氨基酸215-223(N2的末端至富含甘氨酸的接頭的一部分)的潛在T細(xì)胞表位(圖1中的表位4)的部分。表位4(參見SEQ?ID?NO:3)中的V215A和G220E取代不影響多肽結(jié)合淀粉樣蛋白的能力，但隨后的分析表明，當(dāng)與表位1、2和3的每一個中的表1和表2中指定的某些變化組合時，這些取代的一個或兩個降低所得多肽解聚淀粉樣蛋白的能力。相較于SEQ?ID?NO:1的表位4中單個V215G取代(參見SEQ?ID?NO:7)不影響多肽結(jié)合或解聚淀粉樣蛋白的能力。通過軟件和數(shù)據(jù)庫分析來預(yù)測這些表位4取代的每一個，以消除T細(xì)胞表位。類似地預(yù)測上文中所示的V215的每一個另外的取代以消除T細(xì)胞表位，同時對淀粉樣蛋白結(jié)合幾乎沒有或沒有影響。
[0046] 在更具體方面，包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有上文中所示的V215取代之一以及表1或表2中所示的1至8個氨基酸取代。在甚至更具體的實(shí)話方案中，所述1-8個氨基酸取代選自表1中所示的那些取代。在甚至更具體方面，所述多肽具有上文中所示的任一個V215取代，并且一個另外的單氨基酸取代選自表3中所示的那些取代。在更具體方面，包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有上文中所示的任一個V215取代和2-8個另外的氨基酸取代，其中另外的取代存在于表位1、2和3的至少兩個中，并且其中所述取代選自表1或表2中所示的那些取代。在甚至更具體的實(shí)施方案中，表位1、2和3的至少兩個中的所述至少一個取代選自表1中所示的取代。在甚至更具體的實(shí)施方案中，所述多肽具有上文中所示的V215取代之一，和表4中所示的特定的二氨基酸取代之一。
[0047] 在更具體方面，包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有上文中所示的任一個V215取代，和選自表1或表2中所示的那些取代的3-8個另外的氨基酸取代，其中表位1、2和3的每一個包含所述另外的取代之一。在甚至更具體的實(shí)施方案中，表位1、2和3的每一個中的取代選自表1中所示的那些取代。在更具體的實(shí)施方案中，所述多肽具有上文中所示的V215取代之一，和表5中所示的特定的三氨基酸取代之一。在甚至更具體的實(shí)施方案中，所述多肽具有V215G取代和選自以下取代的三氨基酸取代：T56H、M135K和D178N；T56K、M135K和D178N；T56K、M135T和D178N；T56H、M135K和W181R；T56H、M135T和W181R；Y54K、M135T和K174R；Y54R、M135K和K174R；Y54R、M135T和K174R；T56H、M135K和K174R；以及T56H、M135T和K174R。
[0048] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是基本上由通過肽接頭與變體g3p氨基酸序列的C末端融合或直接與變體g3p氨基酸序列的C末端融合的人或人源化免疫球蛋白Fc多肽序列組成的融合蛋白。如本文中所用，術(shù)語“肽接頭”是指一系列不會干擾多肽的功能的連續(xù)氨基酸。如上文中所示，在SEQ?ID?NO:1-3和7中，氨基酸218-256代表通常存在于M13g3p蛋白中的富含甘氨酸的接頭?？墒褂迷摻宇^或從而可在本發(fā)明的多肽中取代不同的接頭。或者，可將Fc多肽序列直接連接于編碼N2的最后一個氨基酸(例如，SEQ?ID?NO?1-3的氨基酸217)。接頭序列和/或其不存在的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮可用于本發(fā)明的多肽的重組表達(dá)的載體以及此類接頭可能賦予所述多肽的任何二級或三級結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。在本實(shí)施方案的一個方面，所述Fc多肽是人IgG的Fc部分。在更具體的方面，所述多肽是其中具有選自表1、表2、或下文中的表6或表7中所示的氨基酸取代的組的1至9個氨基酸殘基取代的SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體：
[0049] 表6.針對SEQ?ID?NO:1的氨基酸215-223的去免疫化氨基酸取代。
[0050]
[0051] 表7.針對SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸215-223的替代性和另外的去免疫化氨基酸取代。
[0052]
[0053] *V215A和G220E已在SEQ?ID?NO:3中被取代，以便SEQ?ID?NO:3的變體在這些氨基酸殘基上可不含其它取代。
[0054] **V215G取代已存在于SEQ?ID?NO:7中，以便SEQ?ID?NO:7的變體在這些氨基酸殘基上可不含其它取代。
[0055] 在甚至更具體方面，所述多肽是具有2-9個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體，其中所述取代之一是表6和表7中所示的取代；并且所這取代的至少一個是表1和表2中所示的取代。在更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體，并且具有2-9個氨基酸取代；表6中所示的取代的至少一個；和表1中所示的取代的至少一個。在另一個更具體方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體并且具有3-9個氨基酸取代，其中所述取代的至少一個選自表6和表7中所示的取代，并且其中表位1、2和3的至少兩個含有選自表1和表2中所示的取代的至少一個取代。在更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體并且具有表6中所示的取代的至少一個和選自表1中所示的取代的表位1、2和3的至少兩個中的至少一個取代。在另一個更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體并且具有4-9個氨基酸取代；表6和表7中所示的取代的至少一個；以及選自表1和表2中所示的取代的表位1、2和3的每一個中的至少一個取代。在更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體，并且具有表6中所示的取代的至少一個和選自表1中所示的那些取代的表位1、2和3的每一個中的至少一個取代。在另一個更具體的方面中，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體，并且具有表6中所示的取代的至少一個；和至少一個表3、表4或表5中分別所示的特定取代單氨基酸取代、二氨基酸取代或三氨基酸取代。在本實(shí)施方案的另一個更具體的方面中，所述多肽是SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的變體，并且僅具有表6中所示的氨基酸取代之一和選自分別在表3、表4或表5中所示的特定的單氨基酸取代、二氨基酸取代或三氨基酸取代的僅1個、2個或3個另外的氨基酸取代。
[0056] 在可替代實(shí)施方案中，所述多肽是SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體，并且具有選自表1和表2中所示的氨基酸取代的組的1至9個氨基酸取代。在更具體的方面，至少一個取代示于表1中。在另一個更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體，并且具有2-9個氨基酸取代和選自表1和2中所示的任何取代的表位1、2和3的至少兩個中的至少一個取代。在更具體的方面中，表位1、2和3的至少2個中的至少一個取代選自表1中所示的那些取代。在另一個更具體的方面，所述多肽是SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體并且具有3-9個氨基酸取代，其中至少一個取代存在于表位1、2和3中的每一個中，并且選自表1和表2中所示的任何取代。在更具體的方面，表位1、2和3的每一個中的所述至少一個取代選自表1中所示的那些取代。在甚至更具體的實(shí)施方案中，所述多肽是SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體并且具有選自分別在表3、表4或表5中所示的特定的單氨基酸取代、二氨基酸取代或三氨基酸取代的僅1個、2個或3個氨基酸取代。
[0057] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是僅具有選自表4中所示的任何特定的二氨基酸取代的2個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是僅具有選自表5中所示的任何特定的三氨基酸取代的3個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7的變體。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是僅具有選自表5中所示的任何特定的三氨基酸取代的3個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:7的變體。在另一個更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是僅具有選自任何以下組的特定的三氨基酸取代的3個氨基酸取代的SEQ?ID?NO:7的變體：T56H、M135K和D178N；T56K、M135K和D178N；T56K、M135T和D178N；T56H、M135K和W181R；T56H、M135T和W181R；Y54K、M135T和K174R；Y54R、M135K和K174R；Y54R、M135T和K174R；T56H、M135K和K174R；和T56H、M135T和K174R。
[0058] 核酸分子、序列、載體和宿主細(xì)胞
[0059] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼任何包含上述g3p變體的多肽或融合蛋白的核酸序列的分離的核酸分子。在該實(shí)施方案的一個方面，所述分離的核酸分子包含被1-9個密碼子取代修飾的SEQ?ID?NO:4的核苷酸64-714的變體，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于選自表1和表2中所示的取代和以下V215氨基酸取代的任一個的氨基酸取代：V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q和V215R。在這些實(shí)施方案的甚至更具體的方面，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和1至8個另外的密碼子取代來修飾，其中所述另外的密碼子取代的每一個被選擇來編碼表1中所示的氨基酸取代。在這些實(shí)施方案的更具體的方面，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和2至8個另外的密碼子取代來修飾，其中每一個另外的密碼子取代編碼表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3的至少兩個的每一個中。在更具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和3至8個另外的密碼子取代來修飾，其中每一個另外的密碼子取代編碼表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3的每一個中。在更具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼V215A氨基酸取代的一個密碼子取代和被選擇來編碼表3中所示的單氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代來修飾。在更具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼V215G氨基酸取代之一密碼子取代和被選擇來編碼表3中所示的單氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代來修飾。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215A氨基酸取代之一密碼子取代和被選擇來編碼表4中所示的特定的二氨基酸取代之一的2個另外的密碼子取代來修飾。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215G氨基酸取代之一密碼子取代和被選擇來編碼表4中所示的特定的二氨基酸取代之一的2個另外的密碼子取代來修飾。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代之一密碼子取代和被選擇來編碼表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代來修飾。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215G氨基酸取代之一密碼子取代和被選擇來編碼表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代來修飾。
[0060] 在其它實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含SEQ?ID?NO:4的核苷酸64-1530或SEQ?ID?NO:5的核苷酸64-1524的變體，其中所述序列通過1-9個密碼子取代來修飾，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于選自表1、表2中所示的取代的氨基酸取代和以下V215氨基酸取代的任一個：V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q和V215R。在更具體的實(shí)施方案中，每一個密碼子取代對應(yīng)于選自表1中所示的取代的氨基酸取代和上文中所示的V215取代的任一個。在更具體的實(shí)施方案中，所述變體核酸序列通過被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和1-8個另外的密碼子取代來修飾，其中所述另外的密碼子取代的每一個對應(yīng)于選自表1中所示的取代的氨基酸取代。在更具體的實(shí)施方案中，所述變體具有對應(yīng)于表3中所示的特定的單氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代。在更具體的實(shí)施方案中，SEQ?ID?NO:4的核苷酸64-1530或SEQ?ID?NO:5的核苷酸64-1524的變體具有修飾，所述修飾由被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和2-8個另外的密碼子取代組成，其中每一個另外的密碼子取代對應(yīng)于表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和
3的至少兩個的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表4中所示的特定的二氨基酸取代之一的2個另外的密碼子取代。在更具體的實(shí)施方案中，SEQ?ID?NO:4的核苷酸64-
1530或SEQ?ID?NO:5的核苷酸64-1524的任一個的變體具有由被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和3-8個另外的密碼子取代組成的修飾，其中每一個另外的密碼子取代對應(yīng)表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和
3的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代。
3的至少兩個的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表4中所示的特定的二氨基酸取代之一的2個另外的密碼子取代。在更具體的實(shí)施方案中，SEQ?ID?NO:4的核苷酸64-
1530或SEQ?ID?NO:5的核苷酸64-1524的任一個的變體具有由被選擇來編碼上文中所示的V215氨基酸取代的任一個的一個密碼子取代和3-8個另外的密碼子取代組成的修飾，其中每一個另外的密碼子取代對應(yīng)表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和
3的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代。
[0061] 在其它實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含SEQ?ID?NO:6的核苷酸64-1524或SEQ?ID?NO:8的核苷酸64-1524的變體，其中所述變體核酸序列通過1-9個密碼子取代來修飾，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于選自表1或表2中所示的取代的氨基酸取代。在更具體的實(shí)施方案中，每一個密碼子取代對應(yīng)于選自表1中所示的取代的氨基酸取代。在甚至更具體的實(shí)施方案中，所述變體具有對應(yīng)于表3中所示的特定的單氨基酸取代之一的一個密碼子取代。在更具體的實(shí)施方案中，SEQ?ID?NO:6的核苷酸64-1524或SEQ?ID?NO:8的核苷酸64-1524的變體通過2-8個密碼子取代來修飾，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3的至少2個的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表4中所示的特定的二氨基酸取代之一的2個另外的密碼子取代。在更具體的實(shí)施方案中，SEQ?ID?NO:6的核苷酸64-1524或SEQ?ID?NO:8的核苷酸64-1524的變體通過
3-8個密碼子取代來修飾，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代。在甚至更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于以下特定組的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代：T56H、M135K和D178N；
T56K、M135K和D178N；T56K、M135T和D178N；T56H、M135K和W181R；T56H、M135T和W181R；Y54K、M135T和K174R；Y54R、M135K和K174R；Y54R、M135T和K174R；T56H、M135K和K174R；和T56H、M135T和K174R。
3-8個密碼子取代來修飾，其中每一個密碼子取代對應(yīng)于表1中所示的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3的每一個中。在更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于表5中所示的特定的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代。在甚至更具體的方面，所述變體具有對應(yīng)于以下特定組的三氨基酸取代之一的3個另外的密碼子取代：T56H、M135K和D178N；
T56K、M135K和D178N；T56K、M135T和D178N；T56H、M135K和W181R；T56H、M135T和W181R；Y54K、M135T和K174R；Y54R、M135K和K174R；Y54R、M135T和K174R；T56H、M135K和K174R；和T56H、M135T和K174R。
[0062] 在本發(fā)明的核酸分子的其它實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含編碼與編碼變體g3p的核酸序列的5’末端同相且直接融合的信號序列的核酸序列。在這些實(shí)施方案的一個方面，編碼信號序列的核酸序列是SEQ?ID?NO:4的核苷酸1-63。
[0063] 本發(fā)明的核酸分子包括與上述核酸分子簡并的，但編碼與由任何上述核酸分子編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。
[0064] 對于重組產(chǎn)生，可將本發(fā)明的任何核酸分子插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，所述表達(dá)載體含有用于所述插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件，或在RNA病毒載體的情況下，用于復(fù)制和翻譯的必需元件。將編碼核酸插入合適讀框中的載體。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子和序列的載體。此類載體包括，但不限于，DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員使用載體與在其中進(jìn)行表達(dá)的選定的宿主細(xì)胞的相容性的眾所周知的知識來選擇在其中克隆本發(fā)明的核酸分子和序列的適當(dāng)?shù)妮d體。這可在任何哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞等中進(jìn)行。用于這些細(xì)胞類型的每一個類型的適當(dāng)?shù)妮d體在本領(lǐng)域中是公知的并且通常是商購可得的。
[0065] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有含有本發(fā)明的核酸分子或核酸序列的載體的宿主細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化或另外地獲得本發(fā)明的載體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。具有所述載體的細(xì)胞，當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)時，將產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。用于本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生的載體和細(xì)胞的特定實(shí)例示于下文中的實(shí)施例部分。
[0066] 藥物組合物
[0067] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含任選地與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起的包含變體g3p的任何多肽或融合蛋白?！八幬锝M合物”是指治療有效量的具有生理上合適的載體和/或賦形劑的如本文所述的組合物。藥物組合物不引起對生物體的顯著刺激。可互換使用的短語“生理上合適的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”是指不引起對生物體的顯著刺激并且不消除所施用的組合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。術(shù)語“賦形劑”是指被添加至藥物組合物以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分的施用的惰性物質(zhì)。實(shí)例(不限制)包括例如鹽水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和表面活性劑，包括，例如，聚山梨醇酯20。
[0068] 可使用一種或多種生理上可接受的包含賦形劑和輔助物質(zhì)的載體以常規(guī)方式配制用于根據(jù)本發(fā)明的使用的藥物組合物，所述載體促進(jìn)所述活性成分加工成可作為藥物使用的組合物。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選定的施用途徑和被遞送的組合物的性質(zhì)(例如，多核苷酸的大小和溶解度)。在這些實(shí)施方案的一個方面，將藥物組合物配制用于注射或輸注入患者的血流。在這些實(shí)施方案的另一個方面，將藥物組合物配制用于例如通過直接髓內(nèi)、硬膜內(nèi)或腦室內(nèi)注射對患者的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接施用。
[0069] 可將本文所述的組合物配制用于腸胃外施用，例如通過推注注射或連續(xù)輸注施用。用于腸胃外施用的藥物組合物包括呈水溶性形式的組合物的水溶液。另外，可將活性份的混懸劑配制為油性或基于水的注射混懸劑。合適的親脂溶劑或媒介物包括脂肪油諸如芝麻油或合成脂肪酸酯諸如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。含水注射混懸劑可含有增加混懸劑的粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述混懸劑還可含有合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分的溶解度以允許制備高度濃縮的溶液的試劑(例如，表面活性劑聚山梨醇酯(Tween?20))?；诘鞍踪|(zhì)的試劑諸如，例如，白蛋白可用于阻止本發(fā)明的多肽至遞送表面(即，IV包、導(dǎo)管、針等)的吸附。
[0070] 對于口服施用，可通過將活性化合物與本領(lǐng)域中公知的藥學(xué)上可接受的載體組合來容易地配制組合物。
[0071] 制劑可以以單位劑量形式存在，例如在小瓶、安瓿中或者在多劑量容器中提供并且任選地添加防腐劑。組合物可以是油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液或乳液，并且可含有配制劑諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。單劑量劑型可呈液體或固體形式?？稍跓o修飾的情況下向患者直接施用單劑量劑型或可在施用前稀釋或復(fù)溶所述單劑量劑型。在某些實(shí)施方案中，可以以推注形式(例如單次注射)、單次口服劑量(包括包含多個片劑、膠囊劑、丸劑等的口服劑量)施用單劑量劑型。在替代實(shí)施方案中，可在一段時間內(nèi)，諸如通過輸注或通過植入泵諸如ICV泵施用單劑量劑型。在后一個實(shí)施方案中，所述單劑量劑型可以是預(yù)先充有適當(dāng)量的包含變體g3p的多肽或融合蛋白的輸液袋或泵貯液池。或者，可在即將向患者施用時通過將適當(dāng)劑量的變體g3p與輸液袋或泵貯液池溶液混合來制備所述輸液袋或泵貯液池。
[0072] 本發(fā)明的另一個方面包括用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法。用于藥物的配制的技術(shù)可見于例如"Remington's?Pharmaceutical?Sciences,"Mack?Publishing?Co.,Easton,Pa.(最新版本)(其通過引用整體并入本文)中。
[0073] 適合在本發(fā)明的上下文中使用的藥物組合物包括其中以有效地實(shí)現(xiàn)期望的目的的量含有活性成分的組合物。
[0074] 特別地根據(jù)本文中提供的詳細(xì)公開內(nèi)容，治療或診斷有效量的測定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0075] 可個別地調(diào)整劑量量和間隔以提供足以治療或診斷特定腦疾病、病癥或病況的噬菌體展示媒介物的腦水平(最低有效濃度，MEC)。所述MEC將對于每一種制劑可變化，但可根據(jù)體外數(shù)據(jù)來估計(jì)。獲得MEC所必需的劑量將取決于個體特征。
[0076] 還可使用MEC值確定劑量間隔。應(yīng)當(dāng)使用方案來施用制劑，所述方案在10-90％的時間，優(yōu)選地30-90％和最優(yōu)選地50-90％的時間維持高于MEC的腦水平。
[0077] 取決于待治療的病況的嚴(yán)重度和響應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周或直至實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減少。
[0078] 待施用的組合物的量當(dāng)然將取決于待治療的或診斷的受試者、疾患的嚴(yán)重度、處方醫(yī)生的判斷等。
[0079] 如果需要，本發(fā)明的組合物可存在于包裝或分配器裝置諸如FDA批準(zhǔn)的試劑盒中，所述裝置可含有一種或多種包含活性成分的單位劑型。例如，包裝可包含金屬或塑料箔，諸如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可以附帶施用說明書。包裝或分配器還可附帶以管理藥物的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式存在的與容器相關(guān)聯(lián)的通告，所述通告反映由機(jī)構(gòu)對組合物的形式或人或獸醫(yī)學(xué)施用的批準(zhǔn)。例如，此類通告可以是由美國食品藥品監(jiān)督管理局對處方藥批準(zhǔn)的標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。還可制備包含于相容性藥用載體中配制的本發(fā)明的制劑的組合物，將其置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校?biāo)記以用于治療指定的病況，如同上文中進(jìn)一步描述的。
[0080] 應(yīng)理解，以上和以下描述僅僅是示例性和說明性的，并且不是對要求保護(hù)的本發(fā)明的限制。
[0081] 治療用途
[0082] 本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的任何多肽、核酸分子或組合物在治療蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病，包括但不限于牽涉fAβ42、fαsyn、fNM或ftau的任一個的那些疾病中的用途。
[0083] 在治療的上下文中，術(shù)語“患者”、“受試者”和“受者”可互換使用并且包括人以及其它哺乳動物。在一些實(shí)施方案中，患者是對于與蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物呈陽性的人。在一個實(shí)施方案中，患者表現(xiàn)β-淀粉樣蛋白沉積物，如利用florbetapir通過PET成像檢測到的。
[0084] 術(shù)語“治療”及其同源詞旨在指在表現(xiàn)疾病的一個或多個臨床癥狀的患者中減少、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展。“治療”還旨在指在表現(xiàn)疾病的一個或多個臨床癥狀的患者中減少、緩解或逆轉(zhuǎn)疾病的癥狀。在一個實(shí)施方案中，患者表現(xiàn)如利用florbetapir通過PET成像檢測到的β-淀粉樣蛋白沉積物，并且通過治療減少β-淀粉樣蛋白沉積物的數(shù)目。在一個實(shí)施方案中，患者表現(xiàn)如通過本發(fā)明的多肽或多肽組合物檢測到的β-淀粉樣蛋白沉積物，并且通過治療減少或維持β-淀粉樣蛋白沉積物的數(shù)目。在另一個實(shí)施方案中，患者表現(xiàn)如通過PET成像檢測到的任何類型的淀粉樣蛋白沉積物，并且通過治療改善患者的認(rèn)知功能?？赏ㄟ^McKhann等，Alzheimer’s&Dementia?7(3):263-9(2011)的方法和測試來測定認(rèn)知功能的改善。
[0085] “預(yù)防”與治療不同，并且是指在任何臨床癥狀發(fā)作之前向個體施用組合物。包括使用本發(fā)明的任何多肽或其組合物的預(yù)防。預(yù)防可涉及僅基于一個或多個遺傳標(biāo)志物，已知處于增加的發(fā)生疾病的風(fēng)險中或一定會發(fā)展疾病的個體。對于各種蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病，已鑒定了許多遺傳標(biāo)志物。例如，在人淀粉樣蛋白前體蛋白(hAPP)中具有Swedish突變、Indiana突變或London突變的一個或多個的個體處于增加的發(fā)展早發(fā)性阿爾茨海默病的風(fēng)險中，因此為進(jìn)行預(yù)防的候選者。同樣地，在亨廷頓基因中具有三核苷酸CAG重復(fù)的個體，特別地具有36或更多個重復(fù)的個體，將最終發(fā)展亨廷頓舞蹈癥并因此為進(jìn)行預(yù)防的候選者。
[0086] 術(shù)語“蛋白質(zhì)錯誤折疊”是指特征在于通過聚集蛋白(淀粉樣蛋白形成肽)，諸如，但不限于，β-淀粉樣蛋白、血清淀粉樣蛋白A、胱蛋白酶抑制劑C、IgGκ輕鏈或朊病毒蛋白形成淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)的疾病。已知與錯誤折疊的和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的疾病包括阿爾茨海默氏病(其包括早發(fā)性阿爾茨海默病、遲發(fā)性阿爾茨海默病和癥狀發(fā)生前阿爾茨海默病)、帕金森氏病、SAA淀粉樣變性、胱白酶抑制劑C、遺傳性冰島綜合癥、衰老、多發(fā)性骨髓瘤、朊病毒疾病，包括但不限于庫魯病、克雅氏病(CJD)、格斯特曼-施特勞斯納病(Gerstmann-Straussler-Scheinker?disease，GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)、瘙癢病和牛海綿狀腦炎(BSE)；肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷頓舞蹈癥、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥、脊髓和延髓性肌萎縮、遺傳性腦淀粉樣血管病、家族性淀粉樣變性、額顳葉癡呆癥、英國人/丹麥人癡呆、進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)和家族性腦病。本發(fā)明的多肽和組合物可用于治療“蛋白質(zhì)錯誤折疊”疾病。
[0087] 許多這類錯誤折疊的和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)疾病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中發(fā)生。在CNS中發(fā)生的疾病的一些實(shí)例是帕金森氏??；阿爾茨海默病；額顳葉癡呆(FTD)，包括具有以下臨床癥狀的患者：行為異常型FTD(bvFTD)、進(jìn)行非流利失語(PNFA)和語義性癡呆(SD)；額顳葉退化(FTLD)；和亨廷頓舞蹈癥。本發(fā)明的多肽和組合物可以用于治療特征在于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中發(fā)生的錯誤折疊和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)的疾病。
[0088] 蛋白質(zhì)的錯誤折疊和/或聚集還可在CNS外部發(fā)生。淀粉樣變性A(AA)(對于其前體蛋白為血清急性期載脂蛋白，SAA)和多發(fā)性骨髓瘤(前體蛋白免疫球蛋白輕和/或重鏈)是在CNS外部發(fā)生的兩個廣為人知的蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集的蛋白質(zhì)疾病。其它實(shí)例包括牽涉由如下蛋白形成的淀粉樣蛋白的疾病：α2-微球蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變[FAP]、家族性淀粉樣心肌病[FAC]和老年全身性淀粉樣變性[SSA])、(apo)血清AA、載脂蛋白AI、AII和AIV、鈣結(jié)合微絲蛋白(家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變的芬蘭人形式)、溶菌酶、血纖蛋白原、胱蛋白酶抑制劑C(腦淀粉樣血管病、遺傳性腦出血伴淀粉樣變，冰島人類型)、(前)降鈣素、胰島淀粉樣多肽(IAPP淀粉樣變)、心房鈉尿因子、催乳素、胰島素、乳凝集素(lactahedrin)、角質(zhì)-上皮蛋白、乳鐵蛋白、牙源性成釉細(xì)胞相關(guān)蛋白和精液凝固蛋白I。本發(fā)明的多肽和組合物可用于治療牽涉在CNS外部發(fā)生的蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集的疾病。
[0089] 神經(jīng)變性疾病還牽涉τ蛋白病變。綜述于Lee等，Annu.Rev.Neurosci.24:1121-159(2001)中。τ蛋白是在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突中表達(dá)的微管相關(guān)蛋白。涵蓋神經(jīng)退行性τ蛋白病變(有時稱為τ蛋白病變)。τ蛋白病變的實(shí)例包括阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化/帕金森-癡呆綜合征、嗜銀顆粒癡呆、皮質(zhì)基底節(jié)變性、克雅氏病、拳擊員癡呆、彌散性神經(jīng)原纖維纏結(jié)鈣化、唐氏綜合征、額顳癡呆，包括與染色體17相關(guān)的額顳葉癡呆與帕金森、格斯特曼-施特勞斯納病、哈勒沃登-施帕茨病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、尼曼-皮克病C型、非關(guān)島運(yùn)動神經(jīng)元疾病與神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮克氏病、腦炎后帕金森氏病、朊病毒蛋白腦淀粉樣血管病、進(jìn)行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進(jìn)行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎和僅纏結(jié)型癡呆。這些疾病的的一些也可包括纖維狀β淀粉樣蛋白肽沉積物。例如，阿耳茨海默病顯示β淀粉樣蛋白沉積物和τ蛋白病變。類似地，朊病毒介導(dǎo)的疾病諸如克雅氏病、朊病毒蛋白腦淀粉樣血管病以及格斯特曼-施特勞斯納綜合征也可具有τ蛋白病變。由此疾病為“τ蛋白病變”不應(yīng)被解釋為從其它神經(jīng)變性疾病的分類或分組排除疾病，其僅為了方便而提供。本發(fā)明的多肽和組合物可用于治療神經(jīng)變性疾病以及牽涉τ蛋白病變的疾病。
[0090] 在一個實(shí)施方案中，藥物組合物或制劑用于在表現(xiàn)與淀粉樣蛋白的存在相關(guān)的癥狀或?qū)τ谂c蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物諸如florbetapir(AV-45,Eli?Lilly)呈陽性的患者中減少淀粉樣蛋白的方法，其包括向所述患者施用有效量的如本文所述的藥物組合物或制劑。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接腦室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0091] 在一個實(shí)施方案中，藥物組合物或制劑用于在表現(xiàn)與淀粉樣蛋白的存在相關(guān)的癥狀或?qū)τ谂c蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物諸如florbetapir(AV-45,Eli?Lilly)呈陽性的患者中維持淀粉樣蛋白的水平的方法，其包括向所述患者施用有效量的如本文所述的藥物組合物或制劑。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接腦室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0092] 在一個實(shí)施方案中，藥物組合物或制劑用于在患者中解聚淀粉樣蛋白的方法，其包括向具有淀粉樣蛋白的患者施用有效量的如本文所述的藥物組合物或制劑。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接腦室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0093] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中引起β-淀粉樣蛋白沉積物解聚的方法，其包括將有效量的如本文所述的藥物組合物直接注射進(jìn)有此需要的患者的腦內(nèi)，從而在腦中引起β-淀粉樣蛋白沉積物的減少。在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中引起β-淀粉樣蛋白沉積物解聚的方法，其包括將有效量的如本文所述的藥物組合物靜脈內(nèi)注射遞送至有此需要的患者中，從而在腦中引起β-淀粉樣蛋白沉積物的減少。
[0094] 在一個實(shí)施方案中，藥物組合物或制劑用于在腦中減少淀粉樣蛋白形成的方法。在腦中減少淀粉樣蛋白形成可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接腦室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0095] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中促進(jìn)淀粉樣蛋白清除的方法。促進(jìn)淀粉樣蛋白清除可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接腦室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0096] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中抑制淀粉樣蛋白聚集的方法。在腦中抑制淀粉樣蛋白聚集可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0097] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中清除毒性淀粉樣蛋白寡聚物的方法。在腦中清除毒性淀粉樣蛋白寡聚物可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0098] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于在腦中阻止毒性淀粉樣蛋白寡聚物的形成的方法。在腦中阻止毒性淀粉樣蛋白寡聚物的形成可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。
[0099] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉樣蛋白損傷的方法。保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉樣蛋白損傷可預(yù)防、治療或減輕蛋白質(zhì)錯誤折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。在一個實(shí)施方案中，預(yù)防性地施予用于保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉樣蛋白損傷的本發(fā)明的藥物組合物或制劑。
[0100] 在一些實(shí)施方案中，患者對于與蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物呈陽性。在一個實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物為florbetapir(AV45,Eli?Lilly)。
[0101] 在一些實(shí)施方案中，患者正表現(xiàn)出與淀粉樣蛋白的存在相關(guān)的神經(jīng)變性疾病的癥狀。在各種實(shí)施方案中，所述淀粉樣蛋白是fAβ42、fαsyn、fNM或ftau的任一個。
[0102] 在某些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是帕金森氏病、阿爾茨海默病或亨廷頓舞蹈癥。在一個實(shí)施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病。在一個實(shí)施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病并且患者表現(xiàn)如通過成像劑florbetapir(AV-45,Eli?Lilly)檢測到的β-淀粉樣蛋白。
[0103] 在一些實(shí)施方案中，患者正表現(xiàn)出朊病毒介導(dǎo)的疾病的癥狀。
[0104] 在某些實(shí)施方案中，所述朊病毒介導(dǎo)的疾病選自克雅氏病、庫魯病、致命性家族性失眠癥或格斯特曼-施特勞斯納綜合征。
[0105] 在一些實(shí)施方案中，患者正表現(xiàn)出除阿爾茨海默病外的神經(jīng)退行性τ蛋白病變的癥狀。在某些實(shí)施方案中，待治療的疾病選自嗜銀顆粒癡呆、皮質(zhì)基底節(jié)變性、拳擊員癡呆、彌散性神經(jīng)原纖維纏結(jié)鈣化、唐氏綜合征、額顳癡呆，包括與染色體17相關(guān)的額顳葉癡呆與帕金森癥、哈勒沃登-施帕茨病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、尼曼-皮克病C型、非關(guān)島運(yùn)動神經(jīng)元疾病與神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮克病、腦炎后帕金森綜合征、進(jìn)行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進(jìn)行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎和僅纏結(jié)型癡呆。
[0106] 在另一個實(shí)施方案中，任何上述疾病病況可通過單獨(dú)地或與合適的載體(諸如，例如，脂質(zhì)納米顆粒、聚合物載體，或載體諸如病毒載體)結(jié)合地向患者直接施用(通過任何合適的途徑，諸如，例如，吸入和靜脈內(nèi)輸注)本發(fā)明的核酸分子(即，編碼顯示減小的免疫原性并且具有結(jié)合淀粉樣蛋白、解聚淀粉樣蛋白斑塊和/或阻止淀粉樣蛋白的聚集的變體g3p的核酸分子)來治療。適合用于該治療的編碼本發(fā)明的變體g3p的核酸分子可以是DNA或RNA。
[0107] 診斷學(xué)
[0108] 在本發(fā)明的另一個方面，本文所述的多肽和組合物用于與本文所述的各種疾病相關(guān)的診斷應(yīng)用。例如，當(dāng)在體內(nèi)或體外用作成像劑時，本發(fā)明的組合物的結(jié)合可以是所述蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病之一的診斷的部分。當(dāng)用作診斷劑時，本發(fā)明的多肽還可包含可檢測的標(biāo)記，或可另外地在體內(nèi)被檢測到?？墒褂糜糜跇?biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將各種標(biāo)記物附接于診斷組合物的淀粉樣蛋白結(jié)合組分。標(biāo)記物的實(shí)例包括熒光標(biāo)記物和放射性標(biāo)記物。存在多種可使用的放射性標(biāo)記物，但一般地所述標(biāo)記物通常選自放射性標(biāo)記物，包括，但不限于，18F、11C和123I。可使用公知的化學(xué)將這些和其它放射性同位素附接于蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，使用正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(PET)來檢測標(biāo)記物。然而，用于放射性同位素的檢測的任何其它合適的技術(shù)也可用于檢測放射性示蹤劑。
[0109] 可將本發(fā)明的多肽和組合物與對于β-淀粉樣蛋白是特異的成像劑諸如，例如F18-AV-45,Eli?Lilly組合地用作診斷成像劑。由于目前不存在用于非-β-淀粉樣蛋白聚集物的已知成像劑，因此本發(fā)明的診斷組合物與β-淀粉樣蛋白-特異性成像劑一起的使用將導(dǎo)致基于差示檢測的非-β-淀粉樣蛋白聚集物的檢測。因此，在一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的診斷組合物與β-淀粉樣蛋白成像劑組合地用作成像劑以檢測非-β-淀粉樣蛋白聚集物。
[0110] 在另一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的多肽或組合物用作診斷成像劑來檢測CNS(包括腦)中的β-淀粉樣蛋白。
[0111] 可使用針對治療性組合物所描述的相同途徑來施用本發(fā)明的診斷組合物。在一個實(shí)施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈注射或輸注。實(shí)施例
[0112] 實(shí)施例1：g3p中的CD4+T細(xì)胞表位的作圖
[0113] 合成87個跨越SEQ?ID?NO:1的氨基酸1-240的序列的重疊肽(15個氨基酸長，12個氨基酸重疊的)，并在T細(xì)胞表位作圖測定中測試來自人CD4+T細(xì)胞的響應(yīng)。在一式六份PBMC培養(yǎng)物中測試單個肽，并評估T細(xì)胞響應(yīng)以鑒定表位的定位以及它們的相對效力。
[0114] 利用Lymphoprep(Axis-shield,Dundee,UK)密度離心，按照由Addenbrooke醫(yī)院當(dāng)?shù)匮芯總惱砦瘑T會授權(quán)的批準(zhǔn)從英國國家輸血服務(wù)(Addenbrooke醫(yī)院，Cambridge,UK)獲得的健康社區(qū)供血者血沉棕黃層(來自24小時內(nèi)抽取的血液)分離PBMC(外周血單核細(xì)胞)。使用CD8+RosetteSepTM(StemCell?Technologies?Inc,London,UK)耗竭CD8+T細(xì)胞。通過使用基于HLA?SSP-PCR的組織分型試劑盒(Biotest,Solihull,UK)鑒定HLA-DR單元型來表征供體。還測定T細(xì)胞對對照新抗原蛋白(KLH蛋白(Pierce(Perbio),Cramlington,UK)和從IFV和EBV衍生的肽)的響應(yīng)。隨后冷凍PBMC，并將其貯存于液氮中直至需要。
[0115] 一個組群的55個供體被選擇用于測定，以最佳地代表在世界人口中表達(dá)的HLA-DR同種異型的數(shù)目和頻率。在該組群中表達(dá)的同種異型針對世界人口中表達(dá)的那些同種異型的分析顯示，獲得了>80％的覆蓋，并且所有主要的HLA-DR等位基因(在世界人口中以>5％的頻率表達(dá)的單個同種異型)得到良好代表。個體供體單元型以及世界人口與樣品群體中表達(dá)的MHC?II類單元型的頻率的比較的詳細(xì)內(nèi)容分別示于表8和圖3中。
[0116] 表8.供體詳細(xì)內(nèi)容和單元型
[0117]
[0118]
[0119] 將來自每一個供體的PBMC解凍，對其進(jìn)行計(jì)數(shù)，并評估活力。將細(xì)胞在室溫培養(yǎng)基(Invitrogen,Paisley,UK)中復(fù)蘇，隨后將細(xì)胞密度調(diào)整至2-3x106PBMC/ml(增殖細(xì)胞原液)。利用游離N末端胺和C末端羧酸以1-3mg的規(guī)模合成15個氨基酸長的肽。將肽溶解在DMSO中至10mM的濃度，并且在小孔中將制備的肽培養(yǎng)物原液于 培養(yǎng)基中稀釋至5μM的終濃度。對于每一種肽和每一個供體，在平底96孔板中建立一式六份培養(yǎng)物。也以一式六份測試陽性和陰性對照培養(yǎng)物。對于每一個供體，還包括3個對照(KLH蛋白和從IFV和EBV衍生的肽)。對于陽性對照，以2.5μg/ml的終濃度使用PHA(Sigma,Dorset,UK)。
[0120] 將培養(yǎng)物孵育總共6天，隨后向每一個孔添加0.75μCi?3[H]-胸苷(PerkinBeaconsfield,UK)。將培養(yǎng)于再孵育18小時，隨后使用TomTec?Mach?III細(xì)胞收集器將其收集至濾墊上。通過在Microplate?Beta計(jì)數(shù)器(Perkin Beaconsfield,UK)上以paralux低本底計(jì)數(shù)模式通過MeltilexTM(Perkin Beaconsfield,UK)閃爍計(jì)數(shù)來測定每一個孔的Cpm。
[0121] 對于數(shù)據(jù)的分析，使用等于或大于SI≥2.00的刺激指數(shù)(SI)的閾值(考慮邊界SI≥1.90-1.99響應(yīng))。陽性響應(yīng)通過以下統(tǒng)計(jì)和經(jīng)驗(yàn)閾值來定義：
[0122] 1.通過使用不成對雙樣本學(xué)生t檢驗(yàn)比較測試孔對比培養(yǎng)基對照孔的cpm產(chǎn)生的響應(yīng)的顯著性(p<0.05)。
[0123] 2.大于2.00的刺激指數(shù)(SI≥2.00)，其中SI＝測試孔的平均cpm/培養(yǎng)基對照孔的平均cpm。以該方式提供的數(shù)據(jù)被表示為SI≥2.00，p<0.05。
[0124] 另外，通過計(jì)算來自重復(fù)培養(yǎng)物的原始數(shù)據(jù)的CV和SD來評估批內(nèi)變化。以一式六份培養(yǎng)物(“非調(diào)整的數(shù)據(jù)”)設(shè)置增殖測定。為了確保批內(nèi)變化低，也在除去最大和最小cpm值之后分析數(shù)據(jù)(“調(diào)整的數(shù)據(jù)”)，并使用兩個數(shù)據(jù)集比較供體響應(yīng)的SI。通過對研究中的所有肽計(jì)算陽性響應(yīng)(上文中定義的)的平均頻率(加上SD以提供本底響應(yīng)率)來鑒定T細(xì)胞表位。誘導(dǎo)在調(diào)整和非調(diào)整的數(shù)據(jù)中高于本底響應(yīng)率的增殖響應(yīng)的任何肽都被認(rèn)為含有T細(xì)胞表位。當(dāng)兩個重疊肽誘導(dǎo)增殖響應(yīng)率時，T細(xì)胞表位被認(rèn)為存在于重疊區(qū)域。據(jù)此，在所測試的多肽中鑒定了以下T細(xì)胞表位：
[0125] 表位1：C?T?G?D?E?T?Q?C?Y?G?T?W(SEQ?ID?NO:1的氨基酸46-57)
[0126] 表位2：T?F?M?F?Q?N?N?R?F?R?N?R(SEQ?ID?NO:1的氨基酸133-144)
[0127] 表位3：S?S?K?A?M?Y?D?A?Y?W?N?G(SEQ?ID?NO:1的氨基酸194-205)
[0128] 表位4：P?V?N?A?G?G?G?S?G?G?G?S(SEQ?ID?NO:1的氨基酸214-225)
[0129] 表位5：S?G?S?G?A?M?V?R?S?D?K?T?H?T?C(SEQ?ID?NO:1的氨基酸253-267)[0130] 實(shí)施例2：通過計(jì)算機(jī)模擬分析進(jìn)行的T細(xì)胞表位4和5的突變的設(shè)計(jì)
[0131] 使用iTopeTM和TCEDTM計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，利用來自所述表位區(qū)的重疊9聚體分析在T細(xì)胞測定中呈陽性的肽的序列。[Perry等，Drugs?R?D?9(6):385-96(2008)]。針對MHC?II類等位基因(總共34個)的數(shù)據(jù)庫測試每一個9聚體，并基于與MHC?II類分子的擬合和相互作用對其進(jìn)行評分。另外，將每一個9聚體針對已知的CD4+T細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，以鑒定9聚體的序列與來自在先前的T細(xì)胞測定中刺激T細(xì)胞響應(yīng)的無關(guān)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫肽的序列之間的任何高序列同源性?；趤碜杂?jì)算機(jī)模擬分析的信息，鑒定了用于從所述鑒定的表位潛在除去CD4+T細(xì)胞表位活性的突變。
[0132] 表位5跨越富含Gly的天然N2-CT接頭的C末端、由用于產(chǎn)生SEQ?ID?NO:1的N1-N2人Ig?Fc融合蛋白的pFUSE載體的多克隆位點(diǎn)(“MCS”)編碼的氨基酸和人Ig?Fc區(qū)的N末端。計(jì)算機(jī)模擬分析將SEQ?ID?NO:1的M258和V259視為負(fù)責(zé)T細(xì)胞活性的P1錨?；谒鼈冊贜1-N2編碼區(qū)外部的定位，預(yù)期除去這兩個氨基酸不引起功能的喪失。這兩個氨基酸由MCS編碼。因此，使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋?，通過定點(diǎn)誘變來產(chǎn)生修飾MCS并且消除編碼SEQ?ID?NO:1的M258和V259的核苷酸的雙鏈DNA分子。隨后，使用MCS中的EcoRI和BglII限制性位點(diǎn)將所得的誘變的DNA序列重新克隆回pFUSE載體中。所得的成熟(不存在信號序列)融合蛋白省略了M258和V259。其氨基酸序列示于SEQ?ID?NO:2中并由SEQ?ID?NO:5編碼。該融合蛋白保持與SEQ?ID?NO:1融合蛋白相同的在下述測定中結(jié)合Abeta的能力。
[0133] 表位4與N2和天然富含Gly的接頭重疊。g3p蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(未顯示)表明，表位4位于遠(yuǎn)離淀粉樣蛋白結(jié)合區(qū)，從而可耐受氨基酸取代而不影響活性。被鑒定為P1錨的V215(SEQ?ID?NO:2)表面暴露，側(cè)鏈略微取向朝向蛋白質(zhì)核心。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析，表6和7中所示的V215的任何取代應(yīng)當(dāng)除去表位。另外，還應(yīng)當(dāng)容納如表6和7中所示的該表位內(nèi)的其它氨基酸的任何取代。使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铮ㄟ^定點(diǎn)誘變從SEQ?ID?NO:5衍生編碼包含V215A取代的N1-N2-Ig?Fc的核酸序列(SEQ?ID?NO:6)。所得的成熟融合蛋白(SEQ?ID?NO:3)在結(jié)合測定中顯示相較于具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的融合蛋白的增強(qiáng)的對Abeta的結(jié)合。將SEQ?ID?NO:6的核酸序列用作親代序列來生成包含表位1、2和3中的所有修飾的基因。
[0134] 實(shí)施例3：通過計(jì)算機(jī)模擬分析進(jìn)行的T細(xì)胞表位1、2和3的突變的設(shè)計(jì)
[0135] 表位1正好位于N1-N2的假定的Abeta結(jié)合部分的C末端。表位1的計(jì)算機(jī)模擬分析將SEQ?ID?NO:1的氨基酸48-56突出顯示為用于氨基酸取代和T細(xì)胞表位的去除的區(qū)域?；诂F(xiàn)存氨基酸的性質(zhì)、表面暴露和與g3p的淀粉樣蛋白結(jié)合區(qū)的相互作用(如根據(jù)g3p的X射線晶體結(jié)構(gòu)解釋的)將該9聚體內(nèi)的氨基酸靶向用于取代。具體地，將G48、T51、Y54和T56靶向利用表1中指定的變化進(jìn)行的取代。該區(qū)域中的其它潛在氨基酸取代示于表2中。
[0136] 表位2的iTopeTM分析將SEQ?ID?NO:1的氨基酸135-143指為用于減小或消除該表位的靶?；赬射線晶體結(jié)構(gòu)，SEQ?ID?NO:1的氨基酸136-139形成環(huán)區(qū)，該環(huán)區(qū)與N1-N2的鉸鏈區(qū)形成鍵，從而對于淀粉樣蛋白結(jié)合活性可以是重要的。對這些氨基酸的改變是不太優(yōu)選的，并且僅示于表2中。更優(yōu)選的改變是針對M135、R140、F141和N143，并且示于表1中。對該9個氨基酸的區(qū)域的其它潛在改變示于表2中。
[0137] SEQ?ID?NO:1的氨基酸173-182通過計(jì)算機(jī)模擬分析被鑒定為在表位3內(nèi)，作為用于取代的靶。表位3位于N2結(jié)構(gòu)域的α螺旋部分中，從而策略是避免引入疏水殘基和小的不帶電荷的極性殘基。另外，我們希望避免向該表位的C末端引入極性殘基、酸性殘基?；赬射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)，我們將S173、D174、M176、D178和W182靶向利用表1中指定的變化的取代。該區(qū)域內(nèi)的其它潛在氨基酸取代示于表2中。
[0138] 實(shí)施例4：具有減小的T細(xì)胞表位的N1-N2-人IgG?Fc多肽的產(chǎn)生
[0139] 制備各自編碼含有表3中所示的不同的單氨基酸取代的N1-N2-人IgG?Fc融合蛋白的58個不同的核酸分子。這通過使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋雽EQ?ID?NO:6進(jìn)行定點(diǎn)誘變以引入所需取代，隨后將PCR擴(kuò)增的誘變序列重新克隆入pFUSE-hIgG1-Fc2載體(Toulouse,France,Catalogue?No.pfuse-hg1fc2)來實(shí)現(xiàn)。
[0140] 使編碼這些“去免疫化的”Fc融合多肽的基因在單個pFUSE-hIgG1-Fc2載體中于FreeStyle?293-F細(xì)胞(Invitrogen,Paisley,Scotland,Catalogue#R790-07)中進(jìn)行瞬時表達(dá)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞在FreeStyle?293培養(yǎng)基(Invitrogen,Catalogue#12338)中稀釋至1×106/mL，從而確保>90％的活力。單獨(dú)地在Optimem(Invitrogen,Catalogue#31985)中稀釋質(zhì)粒DNA和聚乙烯亞胺(PEI)，并孵育5分鐘，隨后將PEI緩慢地添加至DNA，并將DNA/PEI混合物在室溫下孵育5分鐘。孵育后，將DNA/PEI混合物逐滴添加至293-F細(xì)胞，同時旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。將轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在以135rpm旋轉(zhuǎn)的定軌搖床平臺上于37℃、8％CO2中孵育6-7天，隨后收集它們。
[0141] 通過離心收集含有多肽的培養(yǎng)基，并使用10xPBS調(diào)整pH。通過在4℃旋轉(zhuǎn)過夜將蛋白質(zhì)結(jié)合于蛋白A瓊脂糖珠粒(Sigma,Dorset,UK)。用1xPBS洗滌珠粒2次，隨后將其轉(zhuǎn)移至SigmaPrep旋轉(zhuǎn)柱(Sigma)。使用0.1M甘氨酸pH3.0通過離心洗脫樣品，并在收集管中使用1/10體積的1M?Tris-HCl?pH8.0中和所述樣品。使用2ml?ZebaSpin柱(Pierce,Cramlington,UK,Catalogue#89890)將洗脫物緩沖液交換至1xPBS中。將樣品過濾滅菌，并測量每一個樣品的280nm處的吸光度。
[0142] 實(shí)施例5：去免疫化的多肽的ABeta結(jié)合分析
[0143] A.ABeta(Aβ)纖維的制備。將Aβ42(1mg,rPeptideA-1002-2)溶解在六氟異丙醇(HFIP，1mL)中，充分渦旋并于室溫下孵育2-18小時直至澄清溶液出現(xiàn)。將等分試樣(100μl，100μg)置于1.5mL?Eppendorf管中，并于真空(speed?Vac,Eppendorf,Concentrator?5301)下干燥2-3小時。將所得的單體重懸浮于20μL?DMSO中，用移液器吸取，并充分渦旋直至完全溶解。利用260μL的10mM?HCl溶液稀釋該溶液(終Aβ42濃度為80μM)，并渦旋20秒。將澄清溶液在37℃孵育(不振蕩)3天以允許聚集。為了在測定中的使用，將來自所得的原液的Aβ42纖維于PBS中稀釋50倍至1.6μM的終濃度。
[0144] B.ELISA板的制備。向96孔板(F96MAXISORP?NUNC-IMMUNO?PLATE；目錄號：442404,Lot?125436和128158；Denmark)的每一個孔添加200μL的1％BSA溶液。將板密封并在7℃孵育3小時。隨后用PBS(250μL/孔)洗滌板3次。我們向每一個孔添加50μL稀釋的Aβ42纖維溶液(1.6μM)，并在37℃無遮蓋孵育過夜，以完成干燥。將PBS(50μl/孔)添加對照孔(無Aβ42纖維)。隨后用水洗滌板2次，并用PBS(對于每一次洗滌，使用250μL/孔)洗滌1次。
[0145] C.ELISA測定。將50μL的不同濃度的每一種多肽(以及SEQ?IDNO:3的多肽)添加至每一個孔，以及非-Aβ42纖維涂覆的孔，并在37℃孵育1小時。隨后用PBS-T(0.05％的PBS中的Tween?20)洗滌板3次，并用PBS(對于每一次洗滌，使用250μL/孔)洗滌3次。我們隨后向每一個孔添加50μl的以1:2500(最終0.32μg/mL)稀釋于PBS-T+1％牛奶(DifcoTM脫脂牛奶，Becton,Dickinson?and?Company.USA，目錄號：232100，批號：7320448)中的綴合有HRP的山羊抗-人抗Fcγ(Jackson?Labs，目錄號109-035-008，批號：106617)并在37℃孵育40分鐘。隨后用PBS-T洗滌板6次，并用PBS(對于每一次洗滌，使用250μL/孔)洗滌2次。我們隨后添加
50μl/孔OPD溶液(15mg/7.5ml0.05M檸檬酸鹽緩沖液pH-5.5/3μl?H2O2)，并使其顯色3-6分鐘。我們隨后添加25μl/孔的4N?HCl溶液以終止反應(yīng)。讀取板在492nm和405nm處的吸光度。
從492nm吸光度扣除405nm吸光度，并將結(jié)果作為多肽的濃度的函數(shù)繪圖。隨后計(jì)算針于每一種去免疫化的多肽的結(jié)合的IC50，并將其與針于SEQ?ID?NO:3的多肽計(jì)算的IC50相比較。
結(jié)果示于以下的表9中。
50μl/孔OPD溶液(15mg/7.5ml0.05M檸檬酸鹽緩沖液pH-5.5/3μl?H2O2)，并使其顯色3-6分鐘。我們隨后添加25μl/孔的4N?HCl溶液以終止反應(yīng)。讀取板在492nm和405nm處的吸光度。
從492nm吸光度扣除405nm吸光度，并將結(jié)果作為多肽的濃度的函數(shù)繪圖。隨后計(jì)算針于每一種去免疫化的多肽的結(jié)合的IC50，并將其與針于SEQ?ID?NO:3的多肽計(jì)算的IC50相比較。
結(jié)果示于以下的表9中。
[0146] 表9.在表位1、2或3中具有單氨基酸取代的多肽相較于SEQ?ID?NO:3的多肽的ABeta結(jié)合IC50的相對變化
[0147]
[0148] *編號反映IC50(取代的多肽)/IC50(SEQ?ID?NO:3的多肽)。多個值反映結(jié)合測定中的一式二份測定。
[0149] 實(shí)施例6：全蛋白的CD4+T細(xì)胞響應(yīng)的分析
[0150] 為了分析來自本發(fā)明的任何多肽相較于SEQ?ID?NO:1的CD4+T細(xì)胞響應(yīng)，進(jìn)行全蛋白T細(xì)胞測定。從如實(shí)施例1中制備的20個健康人供體的血沉棕黃層分離PBMC。將PBMC在培養(yǎng)基中從冷凍復(fù)蘇，并使用Miltenyi?CD14微珠和LS柱(Miltenyi?Biotech,Oxford,UK)分離CD14+細(xì)胞。將單核細(xì)胞重懸浮于補(bǔ)充有1000U/ml?IL-4和1000U/ml?GM-CSF的 (“DC培養(yǎng)基”)中至4-6x106PBMC/ml，隨后將其分配在24孔板(2ml的終培養(yǎng)體積)中。在第2天通過更換一半體積的DC培養(yǎng)基來飼喂細(xì)胞。到第3天，單核細(xì)胞已分化至半成熟樹突細(xì)胞(DC)，用抗原(包括40ug/ml的測試多肽或40ug/ml的SEQ?ID?NO:1的多肽和
100μg/ml?KLH)或僅用培養(yǎng)基預(yù)孵育所述半成熟樹突細(xì)胞。用抗原孵育半成熟DC?24小時，隨后通過洗滌細(xì)胞細(xì)胞2次和將其重懸浮于補(bǔ)充有50ng/ml?TNF-α(Peprotech,London,UK)的DC培養(yǎng)基中來除去過量抗原。在第7天，通過更換一半體積的補(bǔ)充有50ng/ml?TNFα的DC培養(yǎng)基來飼喂DC，并且在第8天收集成熟DC。計(jì)數(shù)收集的成熟DC，并使用臺盼藍(lán)染料排除法來評估活力。隨后對DC進(jìn)行γ-輻照(4000拉德)，并將其以2x105個細(xì)胞/ml重懸浮于AIM-V培養(yǎng)基中，隨后在如下的T細(xì)胞增殖和ELISpot測定中用于分析。另外，在第8天，還制備新鮮的CD4+T細(xì)胞。為了純化CD4+T細(xì)胞，將PBMC在 培養(yǎng)基中復(fù)蘇，隨后使用Miltenyi?CD4微珠和LS柱(Miltenyi?Biotech,Oxford,UK)分離CD4+細(xì)胞并將其以2x106個細(xì)胞/ml重懸浮于 培養(yǎng)基中。
100μg/ml?KLH)或僅用培養(yǎng)基預(yù)孵育所述半成熟樹突細(xì)胞。用抗原孵育半成熟DC?24小時，隨后通過洗滌細(xì)胞細(xì)胞2次和將其重懸浮于補(bǔ)充有50ng/ml?TNF-α(Peprotech,London,UK)的DC培養(yǎng)基中來除去過量抗原。在第7天，通過更換一半體積的補(bǔ)充有50ng/ml?TNFα的DC培養(yǎng)基來飼喂DC，并且在第8天收集成熟DC。計(jì)數(shù)收集的成熟DC，并使用臺盼藍(lán)染料排除法來評估活力。隨后對DC進(jìn)行γ-輻照(4000拉德)，并將其以2x105個細(xì)胞/ml重懸浮于AIM-V培養(yǎng)基中，隨后在如下的T細(xì)胞增殖和ELISpot測定中用于分析。另外，在第8天，還制備新鮮的CD4+T細(xì)胞。為了純化CD4+T細(xì)胞，將PBMC在 培養(yǎng)基中復(fù)蘇，隨后使用Miltenyi?CD4微珠和LS柱(Miltenyi?Biotech,Oxford,UK)分離CD4+細(xì)胞并將其以2x106個細(xì)胞/ml重懸浮于 培養(yǎng)基中。
[0151] 在第8天，建立T細(xì)胞增殖測定，由此將1x105個自體CD4+T細(xì)胞添加至96孔U型底板中的載有1x104個抗原的DC(10:1的比率)，將 培養(yǎng)基添加至終體積200ul/孔。在第14天，在25ul 中用1uCi[3H](Perkin?Elmer,Beaconsfield,UK)/孔脈沖測定板6小時，隨后使用TomTec?Mach?III(Hamden?CT、USA)細(xì)胞收集器將其收集至濾墊(Perkin?Elmer)上。以一式六份培養(yǎng)物測試所有多肽。通過在1450Microbeta?Wallac?Trilux液體閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin?Elmer)上在paralux低本底計(jì)數(shù)中通過MeltilexTM(Perkin?Elmer)閃爍計(jì)數(shù)測定每一個孔的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)。將每一個抗原的每分鐘計(jì)數(shù)針對僅有 培養(yǎng)基的對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0152] 對于ELISpot測定，用100ul/孔的PBS中的IL-2捕獲抗體(R&D?Systems,Abingdon,UK)涂覆ELISpot板(Millipore,Watford,UK)。隨后在PBS中洗滌板2次，在封閉緩沖液(1％PBS中的BSA(Sigma))中孵育過夜，隨后在 培養(yǎng)基中洗滌。第8天，將1x105個自體CD4+T細(xì)胞添加至96孔ELISpot板中的載有1x104個抗原的DC(10:1的比率)。以一式六份培養(yǎng)物測試所有多肽制劑。對于每一個供體PBMC，還包括陰性對照(單獨(dú)的 培養(yǎng)基)、無細(xì)胞對照和PHA(10ug/ml)陽性對照。
[0153] 在進(jìn)一步的7天孵育期后，通過在dH2O和PBS中進(jìn)行3次連續(xù)洗滌，隨后添加100ul的PBS/1％BSA中的過濾的生物素化的檢測抗體(R&D?Systems,Abingdon,UK)來對ELISpot板進(jìn)行顯色。在于37℃孵育1.5小時后，將板在PBS中再洗滌3次，隨后添加100ul?PBS/1％BSA中的過濾的鏈霉抗生物素蛋白-AP(R&D?Systems)，進(jìn)行1小時(在室溫下孵育)。棄去鏈霉抗生物素蛋白-AP，并將板在PBS中洗滌4次。向每一個孔中添加BCIP/NBT(R&D?Systems)，并在室溫下孵育30分鐘。通過用dH2O洗滌孔和孔的背面3次終止斑點(diǎn)顯影。將干燥的板在ImmunoscanTM分析儀上進(jìn)行掃描，并使用ImmunoscanTM第4版軟件測定每孔斑點(diǎn)數(shù)(spw)。
[0154] 對于增殖和IL-2ELISpot測定，結(jié)果表達(dá)為刺激指數(shù)(SI)，所述刺激指數(shù)被定義為測試多肽相對僅有培養(yǎng)基的對照的cpm(增殖測定)或斑點(diǎn)(ELISpot測定)比率，對于陽性T細(xì)胞響應(yīng)，使用等于或大于2的SI的閾值(SI≥2.0)。
[0155] 實(shí)施例7：T細(xì)胞表位1、2和3的兩個或更多個中的雙和三突變的設(shè)計(jì)。
[0156] 基于結(jié)合測定的結(jié)果，在表位1、2和3處選擇以下取代以存在于相較于SEQ?ID?NO:3含有2個氨基酸取代的多肽中，每一個取代存在于不同的表位中。
[0157] 表10.包含兩個表位和三個表位修飾的變體的氨基酸取代。
[0158]表位 氨基酸 SEQ?ID?NO:3中的原始氨基酸 取代氨基酸
1 54 Y K、R
1 56 T H、K
2 135 M K、T
2 140 R Q
3 174 K R
3 178 D N
3 181 W H、R
1 54 Y K、R
1 56 T H、K
2 135 M K、T
2 140 R Q
3 174 K R
3 178 D N
3 181 W H、R
[0159] 通過使用適當(dāng)?shù)钠鹗糄NA的定點(diǎn)誘變(通常為編碼如實(shí)施例3中所示制備的兩個突變之一的DNA)來制備編碼具有2個表10中所示的氨基酸取代(各自在不同的表位中)的N1-N2人IG?Fc融合蛋白的DNA。將所得的編碼這些融合蛋白的DNA用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞且表達(dá)，并且如實(shí)施例4中所示純化所述融合蛋白，以及如實(shí)施例5中所示測試其結(jié)合。隨后基于對兩個氨基酸取代的多肽的結(jié)合測定的結(jié)果設(shè)計(jì)在表位1、2和3的每一個中具有一個取代的多肽。測試在表位1、2和3的每一個中具有一個取代的多肽的ABeta結(jié)合以及實(shí)施例6中所示的T細(xì)胞響應(yīng)。具體地，可通過取代如下表11中指定的SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:7中的某些氨基酸來產(chǎn)生以下雙表位變體和三表位變體。
[0160] 表11.本發(fā)明的雙表位變體和三表位變體多肽。
[0161]多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
63 SEQ?ID?NO：3 Y54K M135K ?
64 SEQ?ID?NO：3 Y54K M135T ?
65 SEQ?ID?NO：3 Y54K R140Q ?
66 SEQ?ID?NO：3 Y54R M135K ?
67 SEQ?ID?NO：3 Y54R M135T ?
68 SEQ?ID?NO：3 Y54R R140Q ?
69 SEQ?ID?NO：3 T56H M135K ?
70 SEQ?ID?NO：3 T56H M135T ?
63 SEQ?ID?NO：3 Y54K M135K ?
64 SEQ?ID?NO：3 Y54K M135T ?
65 SEQ?ID?NO：3 Y54K R140Q ?
66 SEQ?ID?NO：3 Y54R M135K ?
67 SEQ?ID?NO：3 Y54R M135T ?
68 SEQ?ID?NO：3 Y54R R140Q ?
69 SEQ?ID?NO：3 T56H M135K ?
70 SEQ?ID?NO：3 T56H M135T ?
[0162]多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
71 SEQ?ID?NO：3 T56H R140Q ?
72 SEQ?ID?NO：3 T56K M135K ?
73 SEQ?ID?NO：3 T56K M135T ?
74 SEQ?ID?NO：3 T56K R140Q ?
75 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? D178N
76 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? W181H
77 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? W181R
78 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? K174R
79 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? D178N
80 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? W181H
81 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? W181R
82 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? K174R
83 SEQ?ID?NO：3 T56H D178N ?
84 SEQ?ID?NO：3 T56H ? W181H
85 SEQ?ID?NO：3 T56H ? W181R
86 SEQ?ID?NO：3 T56H ? K174R
87 SEQ?ID?NO：3 T56K ? D178N
88 SEQ?ID?NO：3 T56K ? W181H
89 SEQ?ID?NO：3 T56K ? W181R
90 SEQ?ID?NO：3 T56K ? K174R
91 SEQ?ID?NO：3 ? M135K D178N
92 SEQ?ID?NO：3 ? M135K W181H
93 SEO?ID?NO：3 ? M135K W181R
94 SEQ?ID?NO：3 ? M135K K174R
95 SEQ?ID?NO：3 ? M135T D178N
96 SEQ?ID?NO：3 ? M135T W181H
97 SEQ?ID?NO：3 ? M135T W181R
98 SEQ?ID?NO：3 ? M135T K174R
99 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q D178N
100 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q W181H
101 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q W181R
102 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q K174R
110 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K D178N
111 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K W181H
112 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K W181R
113 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K K174R
114 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T D178N
115 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T W181H
116 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T W181R
71 SEQ?ID?NO：3 T56H R140Q ?
72 SEQ?ID?NO：3 T56K M135K ?
73 SEQ?ID?NO：3 T56K M135T ?
74 SEQ?ID?NO：3 T56K R140Q ?
75 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? D178N
76 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? W181H
77 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? W181R
78 SEQ?ID?NO：3 Y54K ? K174R
79 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? D178N
80 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? W181H
81 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? W181R
82 SEQ?ID?NO：3 Y54R ? K174R
83 SEQ?ID?NO：3 T56H D178N ?
84 SEQ?ID?NO：3 T56H ? W181H
85 SEQ?ID?NO：3 T56H ? W181R
86 SEQ?ID?NO：3 T56H ? K174R
87 SEQ?ID?NO：3 T56K ? D178N
88 SEQ?ID?NO：3 T56K ? W181H
89 SEQ?ID?NO：3 T56K ? W181R
90 SEQ?ID?NO：3 T56K ? K174R
91 SEQ?ID?NO：3 ? M135K D178N
92 SEQ?ID?NO：3 ? M135K W181H
93 SEO?ID?NO：3 ? M135K W181R
94 SEQ?ID?NO：3 ? M135K K174R
95 SEQ?ID?NO：3 ? M135T D178N
96 SEQ?ID?NO：3 ? M135T W181H
97 SEQ?ID?NO：3 ? M135T W181R
98 SEQ?ID?NO：3 ? M135T K174R
99 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q D178N
100 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q W181H
101 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q W181R
102 SEQ?ID?NO：3 ? R140Q K174R
110 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K D178N
111 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K W181H
112 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K W181R
113 SEQ?ID?NO：7 T56H M135K K174R
114 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T D178N
115 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T W181H
116 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T W181R
[0163]多肽編號 起始序列 表位1取代 表位2取代 表位3取代
117 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T K174R
118 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K D178N
119 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K W181H
120 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K W181R
121 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K K174R
122 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T D178N
123 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T W181H
124 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T W181R
125 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T K174R
126 SEQ?ID?NO：7 Y54K M135K K174R
127 SEQ?ID?NO：7 Y54K M135T K174R
128 SEQ?ID?NO：7 Y54R M135K K174R
129 SEQ?ID?NO：7 Y54R M135T K174R
130 SEQ?ID?NO：7 T56H ? D178N
131 SEQ?ID?NO：7 T56H ? W181H
132 SEQ?ID?NO：7 T56H ? W181R
133 SEQ?ID?NO：7 T56H ? K174R
134 SEQ?ID?NO：7 T56K ? D178N
135 SEQ?ID?NO：7 T56K ? W181H
136 SEQ?ID?NO：7 T56K ? W181R
137 SEQ?ID?NO：7 T56K ? K174R
117 SEQ?ID?NO：7 T56H M135T K174R
118 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K D178N
119 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K W181H
120 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K W181R
121 SEQ?ID?NO：7 T56K M135K K174R
122 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T D178N
123 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T W181H
124 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T W181R
125 SEQ?ID?NO：7 T56K M135T K174R
126 SEQ?ID?NO：7 Y54K M135K K174R
127 SEQ?ID?NO：7 Y54K M135T K174R
128 SEQ?ID?NO：7 Y54R M135K K174R
129 SEQ?ID?NO：7 Y54R M135T K174R
130 SEQ?ID?NO：7 T56H ? D178N
131 SEQ?ID?NO：7 T56H ? W181H
132 SEQ?ID?NO：7 T56H ? W181R
133 SEQ?ID?NO：7 T56H ? K174R
134 SEQ?ID?NO：7 T56K ? D178N
135 SEQ?ID?NO：7 T56K ? W181H
136 SEQ?ID?NO：7 T56K ? W181R
137 SEQ?ID?NO：7 T56K ? K174R
[0164] 使用實(shí)施例5中所示的ELISA測定法測定上文中指定的多肽的對β-淀粉樣蛋白的結(jié)合。結(jié)果示于表12和13中。相對結(jié)合值反映IC50(SEQ?ID?NO：3的多肽)/IC50(所測試的多肽)(例如，值越低，則所述多肽相較于SEQ?ID?NO：3的多肽的結(jié)合越大)。多個值反映該結(jié)合測定中的一式兩份測試。
[0165] 表12.SEQ?ID?NO：3的多肽相對本發(fā)明的示例性多肽的相對結(jié)合值。
[0166]
[0167]
[0168] 表13.SEQ?ID?NO:7的多肽相對本發(fā)明的示例性多肽的相對結(jié)合值。
[0169]
[0170] 實(shí)施例8：酸酸纖維素過濾阻滯測定
[0171] 本測定用于監(jiān)測淀粉樣蛋白纖維的去穩(wěn)定化(解聚)或至非-淀粉樣蛋白形成性或可溶性聚集物的重塑。所述測定主要從Chang,E.和Kuret,J.,Anal?Biochem?373,330-6,(2008)和Wanker,E.E.等，Methods?Enzymol?309,375-86,(1999)改造而來。具體地，在37℃用不同濃度(1nM至2μM)的本發(fā)明的變體融合多肽預(yù)孵育2.5μM的fAβ淀粉樣蛋白纖維的制劑3天。孵育后，稀釋具有和不具有融合多肽的纖維，并將其點(diǎn)在真空印跡上的酸酸纖維素膜上。用PBS充分洗滌膜，并用對于Aβ的N末端是特異的抗體探測1小時。將綴合有HRP的第二Ab用于定量保留在膜上的纖維狀聚集物。使用光密度掃描儀分析和數(shù)字化斑點(diǎn)顏色。基于每一個斑點(diǎn)的信號強(qiáng)度相對添加至每一個斑點(diǎn)的融合多肽的濃度計(jì)算EC50(半最大有效濃度)。
[0172] 當(dāng)在本測定中測試SEQ?ID?NO:3的多肽時，EC50經(jīng)測定大于2μM，表明該多肽具有低解聚活性。也在本測定中測試SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:7的多肽，并且每一種多肽顯示100nM的EC50，這表明顯著的解聚活性?；谠摻Y(jié)果，使用SEQ?ID?NO:7的多肽作為待修飾的起始氨基酸序列來產(chǎn)生在多肽102后的所有隨后編號的多肽，包括所有在表位1、2和3的每一個中含有去免疫化取代的變體多肽。所測試的多肽的EC50值示于下面的表14中。
[0173] 表14.本發(fā)明的示例性變體多肽的fAβ淀粉樣蛋白纖維解聚活性。
[0174]
[0175] *nd＝多肽的濃度范圍未被測試來測定EC50。在所測試的最高濃度上，這些多肽未表現(xiàn)顯著的EC50。
[0176] 如可從上述實(shí)施例看到的，本發(fā)明的變體多肽全都顯示如通過ELISA測定法測定的對Aβ的結(jié)合。大多數(shù)所測試的變體多肽也顯示如通過斑點(diǎn)印跡測定法測定的Aβ的解聚。
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