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無朊病毒的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物

相關(guān)申請交叉引用本申請要求對2000年3月24日申請的美國臨時專利申請系列號60/191,772的優(yōu)先權(quán)，在此引用作為參考。

發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因和克隆的有蹄類動物，特別是含有基因缺失或破壞的牛，特別是朊病毒基因缺失或破壞的牛。不表達朊病毒的?？赡懿灰谆茧貌《鞠嚓P(guān)疾病，如牛海綿狀腦病(BSE)，或瘋牛病，因此是生產(chǎn)人用治療劑和其它產(chǎn)品的優(yōu)選來源。生產(chǎn)受保護不會感染和傳播朊病毒相關(guān)疾病的牛品系將防止這類疾病向人類的可能的擴散。

發(fā)明背景基于朊病毒的疾病朊病毒疾病是致死的神經(jīng)變性疾病，可傳播給人類和其它哺乳動物6。最眾所周知的形式是羊瘙癢病、牛海綿狀腦病(BSE)或瘋牛病和人類的克-雅氏病。在1987年以前，認為海綿狀腦病非常少見，只限于綿羊。到二十世紀(jì)九十年代，有越來越多的?；加蠦SE，主要是在英國。另外，在動物園動物、貂、鹿和家貓中也檢出了海綿狀腦病6。

BSE在1986年首先在英國發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在有一些報道稱，在英國有超過55％的牛感染BSE7。報道病例數(shù)的快速增長可能與二十世紀(jì)七十年代后期牛肉食品中含有感染的牛和綿羊骨頭和肉制品有關(guān)，這是一種食用牛肉習(xí)慣8。在控制實驗中，BSE能通過腦內(nèi)注射或直接食用感染的組織傳播給牛、小鼠、綿羊、山羊、豬和猴8-13。

已經(jīng)明確了幾種人類朊病毒疾病。在新幾內(nèi)亞高地人(ForeHighlander)中發(fā)現(xiàn)的庫魯病的特征在于喪失協(xié)調(diào)性(共濟失調(diào))，以后通常成為癡呆。這可能是通過儀式上的食人肉傳播，在那里該部落通過食用死者的腦子為死者舉行葬禮。相反，CJD在世界范圍內(nèi)發(fā)生，一般表現(xiàn)為癡呆。它通常偶發(fā)，發(fā)病率為百萬分之一，一般感染60歲左右的老人。約10-15％的病例是遺傳的，一些病例是在治療其它疾病時無意引起的。例如，角膜移植、腦中植入硬膜或電極和在重組產(chǎn)生之前注射人生長激素可傳播CJD。另外兩種人類疾病是Gerstmann-Straussler-Scheinker病和致死性家族性失眠癥，它們通常都是遺傳性的，一般在中年發(fā)病47。

在二十世紀(jì)九十年代，發(fā)現(xiàn)了克-雅氏病的一種變型(vCJD)。這種人類變型中蛋白酶抗性朊病毒蛋白的形式不同于遺傳性CJD，但與自然傳播的和實驗誘導(dǎo)的BSE相同14。因此，假定vCJD是人類食用污染的牛肉或其它牛制品被傳染的結(jié)果14。BSE也通過食用污染的食物傳播給家貓15，16。在英國已經(jīng)有超過100萬的感染母牛進入了食物鏈，建議必須控制進入美國和其它國5家，以防止這種致死性疾病的擴散。迄今為止，已經(jīng)有48名英國人死于vCJD，有新的證據(jù)表明CJD的這種變型與BSE相同。

PrP基因和蛋白質(zhì)BSE和其它基于朊病毒的疾病的傳染物是一種稱為PrP的細胞蛋白質(zhì)。PrP是一種在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達的細胞膜相關(guān)糖蛋白17，18。在瘙癢病、BSE和CJD中，蛋白酶敏感的PrP蛋白通常變?yōu)榈鞍酌缚剐缘?。這顯然是通過蛋白質(zhì)構(gòu)象改變發(fā)生的，主要由α螺旋組成的正常細胞形式變?yōu)橹饕搔抡郫B組成的疾病形式47。由于某些PrP突變可能更容易地發(fā)生這種構(gòu)象改變。例如，在人類CJD的一種遺傳形式中，Pro102突變?yōu)長eu。當(dāng)向轉(zhuǎn)基因小鼠中引入這種突變時，這些動物發(fā)展為CNS退化和淀粉樣PrP斑塊19-21。

還不清楚一種或所有細胞朊病毒是如何突然轉(zhuǎn)換構(gòu)象的，但一種假說是，具有β折疊構(gòu)象的疾病朊病毒以某種方式誘導(dǎo)α螺旋朊病毒，也變?yōu)棣抡郫B構(gòu)象。例如，已經(jīng)證明，當(dāng)細胞和瘙癢病朊病毒在試管中混合時，細胞朊病毒轉(zhuǎn)變?yōu)轲W病朊病毒47。曾經(jīng)假定朊病毒基因的某些突變使產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更易于變?yōu)棣抡郫B構(gòu)象。一個分子自發(fā)轉(zhuǎn)變大概要花費一定的時間，而疾病朊病毒積累并損傷腦子引起綜合征需要更長的時間47。此外，也可能存在影響轉(zhuǎn)化可能性的其它因子或蛋白質(zhì)。例如，已經(jīng)證明某些細菌和酵母伴侶蛋白能使得向β折疊形式的轉(zhuǎn)化更加有效48。

PrP的基因稱為PRNP，位于人類的染色體20上22，23。對于人類，該基因包含三個外顯子，mRNA約2.4kb。PRNP的第三個外顯子含有完整的蛋白質(zhì)編碼域，編碼25kDa的蛋白質(zhì)。在遺傳性朊病毒疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人PRNP基因中的20個不同突變6。在偶發(fā)的CJD中，未發(fā)現(xiàn)PrP蛋白中有編碼突變，但是所有患者的位點129處的甲硫氨酸殘基都是純合的。這可能表明，這種多態(tài)性傾向于感染某些朊病毒株。來自CJD新變型株(vCJD)的朊病毒顆粒具有不同于其它人類朊病毒同種型，但類似于BSE朊病毒的糖基化模型，與偶發(fā)性CJD類似，在殘基位點129處沒有蛋白質(zhì)編碼突變14。這些數(shù)據(jù)符合CJD的新變型株來源于BSE向人類傳播的假說。

基于朊病毒的疾病的預(yù)防和控制所有基于朊病毒的腦病都沒有確知的治愈方法。因此，世界衛(wèi)生組織和其它國內(nèi)和國際聯(lián)盟采取了控制該疾病在家畜和人類中擴散的方針。1988年，所有牛類材料被禁止用于食用24。到1989年，海綿狀腦病顧問委員會(SEAC)建議，應(yīng)丟棄所有牛的腦、脾、胸腺、扁桃體和腸，而臨床病牛應(yīng)當(dāng)焚化。然而遺憾的是，據(jù)SEAC所說，對于防止BSE從感染的肉制品向人類擴散，這些方針采取得太遲了。

已顯示只有一種藥物能控制動物中朊病毒引起的神經(jīng)退化的發(fā)病。在使用兩性霉素B的控制研究中，該藥物延遲了感染瘙癢病的倉鼠中PrPac的積累25。其它化合物，包括多硫酸戊聚糖和剛果紅，能防止細胞培養(yǎng)物中PrPac的積累，但未對動物模型檢測26。

在基于朊病毒的疾病的預(yù)防和控制領(lǐng)域的研究表明，一個拷貝的正常PRNP基因是對該疾病的易感性和傳播所必需的。兩個拷貝PRNP基因定向缺失的小鼠對腦內(nèi)接種瘙癢病朊病毒有抗性27，49-51。因此，該疾病需要合成內(nèi)源朊病毒來積累足以導(dǎo)致神經(jīng)退化綜合征的疾病朊病毒。PrP敲除小鼠具有正常的行為、正常的發(fā)育，并且能夠繁殖，提示PrP不是生存力或生育力所必需的27。這些數(shù)據(jù)表明，生產(chǎn)缺乏PRNP基因的動物可以阻止基于朊病毒的疾病由家畜向人類或其它動物的擴散。

牛海綿狀腦病(BSE)或人類相應(yīng)疾病克-雅氏病(CJD)沒有確知的治愈方法。朊病毒(PrP)基因的一種改變形式和一種內(nèi)源PrP基因是感染所必需的。大家公認感染的母牛向人類傳播這種疾病如CJD。一種鼠模型證實，PrP基因的去除可預(yù)防瘙癢病。我們設(shè)法在遺傳修飾的牛中根除BSE的易感性。我們計劃克隆PrP基因定向缺失的小牛。具體目標(biāo)是：I)設(shè)計并構(gòu)建一種基因靶向載體；II)用該載體在牛胎成纖維細胞中進行同源重組，并鑒定在PrP基因的一個等位基因上具有無效突變的基因靶向細胞；III)使用目標(biāo)II產(chǎn)生的基因靶向細胞，通過核移植產(chǎn)生PrP雜合敲除(KO)牛胎；IV)基因型克隆胎牛并分離PrP雜合KO胎成纖維細胞；V)在PrP雜合KO胎成纖維細胞中進行同源重組，鑒定在PrP基因的兩個等位基因上都具有無效突變的基因靶向細胞；VI)產(chǎn)生PrP純合KO小牛。無朊病毒轉(zhuǎn)基因牛將用作藥品、化妝品、人類治療劑和食品的來源。

發(fā)明概述本發(fā)明公開了具有基因缺失的第一種轉(zhuǎn)基因牛。特別是，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因和克隆的有蹄類動物，它們在一條或兩條染色體上具有內(nèi)源朊病毒基因的缺失或破壞，使得有蹄類動物對基于朊病毒的疾病如瘙癢病和牛海綿狀腦病(BSE)敏感性降低或沒有敏感性。缺失的構(gòu)建方法一般是將一種異源DNA同源重組到朊病毒基因座中，使得全部或部分蛋白質(zhì)編碼區(qū)被替換或缺失。為了生產(chǎn)治療用重組蛋白質(zhì)，便于組織的異種移植，研究基于朊病毒的疾病，本發(fā)明的有蹄類動物還可含有與朊病毒基因座無關(guān)的異源轉(zhuǎn)基因。

附圖簡述圖1。顯示根據(jù)保藏號D26150和D26151的牛PrP基因的推斷的結(jié)構(gòu)40。其它動物和人類的朊病毒基因包含三個外顯子，第三個外顯子含有完整的編碼區(qū)。

圖2。(A)提出的靶向載體1-4的結(jié)構(gòu)。每種靶向載體的5’側(cè)翼區(qū)都使用內(nèi)含子1和外顯子2的部分，3’側(cè)翼區(qū)使用外顯子3的非翻譯區(qū)。所有內(nèi)含子2和外顯子3的所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)都缺失。(B)提出的靶向載體5-8的結(jié)構(gòu)。每種靶向載體的5’側(cè)翼區(qū)都使用內(nèi)含子2的部分和外顯子3的部分，包括外顯子3剪接受體位點。3’側(cè)翼區(qū)與載體1-4相同，只含有外顯子3的非翻譯區(qū)。外顯子3的大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼區(qū)缺失，只留該蛋白質(zhì)的3個氨基酸。

圖3。朊病毒mRNA在牛胚胎成纖維細胞(BEF)細胞中的表達。從BEF細胞和GT1-7細胞(一種下丘腦轉(zhuǎn)化細胞系)中分離10微克RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用來自人PrP?cDNA的1kb?Sst片段探針雜交。溴化乙錠染色的核糖體RNA證實每種樣品都等量。

圖4。牛PRNP基因的Southern分析。等量的BEF基因組DNA用所述酶消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用人PRNP?cDNA探針雜交。

圖5顯示一種靶向載體和重組PrP基因的結(jié)構(gòu)。

圖6顯示用于PrP克隆的PCR產(chǎn)物。

圖7顯示pPNT和pPRP轉(zhuǎn)染的BFF細胞在電穿孔中的細胞存活率。

圖8顯示另一個實驗的結(jié)果，其中用pPNT轉(zhuǎn)染BFF細胞。

圖9顯示含pPRP的BFF細胞的電穿孔。

圖10顯示未轉(zhuǎn)染的BFF細胞的G418處理。

圖11顯示pPNT轉(zhuǎn)染的BFF細胞的G418處理。

圖12顯示牛PrP的基因組DNA組構(gòu)，并且圖解顯示了基因打靶策略。上圖顯示牛PrP基因由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，橫跨20kb的區(qū)域[40]。外顯子1和2分別為53bp和98bp，轉(zhuǎn)錄為5’UTR，外顯子3含有10bp?5’UTR、795bp編碼區(qū)和約3.3kb?3’UTR的序列。內(nèi)含子1和2約2.4kb和14kb。中圖顯示該靶向載體含有內(nèi)含子2序列的一部分(至少7kb)、基本PrP編碼序列完全缺失并被替換為無啟動子的新霉素抗性基因的外顯子3，和外顯子3的部分下游基因組序列。新霉素抗性基因的表達受內(nèi)源PrP啟動子及其調(diào)節(jié)元件控制。下圖顯示同源重組后靶向的牛PrP等位基因。影線盒是外顯子；空心盒中含有基因名稱，ATP起點用顏色識別。

發(fā)明詳述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，特別是具有定向基因缺失的牛。具體而言，本發(fā)明涉及具有朊病毒基因純合或雜合缺失或破壞的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。對于具有純合缺失或破壞的轉(zhuǎn)基因牛，這種缺失或破壞阻止了功能性內(nèi)源朊病毒蛋白的表達，其中功能性內(nèi)源朊病毒蛋白表達的缺乏使牛對朊病毒相關(guān)疾病不敏感。對于朊病毒缺失或破壞雜合的轉(zhuǎn)基因牛，這種缺失或破壞使牛由于朊病毒蛋白表達降低而對朊病毒相關(guān)疾病的敏感性降低。具體而言，這種牛對牛海綿狀腦病(BSE)或瘋牛病不敏感或敏感性降低。然而，朊病毒基因的缺失或破壞將分別使動物對任何朊病毒相關(guān)疾病不敏感或敏感性降低。

本發(fā)明的朊病毒缺失或破壞優(yōu)選地通過異源DNA向朊病毒基因座中同源重組產(chǎn)生。該異源DNA優(yōu)選地含有一種選擇性標(biāo)記，以便于鑒定和分離含有這種缺失或破壞的細胞。然而，任何異源DNA都可用于同源重組。同樣，在利用同源重組選擇和分離含有缺失或破壞的細胞后，可以用第二種異源DNA交換選擇性標(biāo)記。此外，在產(chǎn)生同源重組細胞后也可排除或刪除異源DNA。

當(dāng)異源DNA含有選擇性標(biāo)記時，優(yōu)選地是新霉素抗性基因。該選擇性標(biāo)記可與在牛細胞中起作用的啟動子(如PGK啟動子)有效連接。此外，如果用于產(chǎn)生缺失或破壞的靶向構(gòu)建體重組到朊病毒基因座中，使得選擇性標(biāo)記基因從朊病毒基因啟動子表達，選擇性基因最初也可以是不含啟動子的。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物也可以含有與朊病毒基因座無關(guān)的異源基因。例如，第二種異源基因可與乳腺特異性啟動子有效連接，從而能在轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的奶中生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)。對于牛，這是生產(chǎn)用于治療人類疾病的重組治療性蛋白質(zhì)的一種合適方法，它具有一個優(yōu)點，即用來生產(chǎn)蛋白質(zhì)的牛不含朊病毒，從而降低了傳播海綿狀腦病的危險。因此，本發(fā)明也包括一種利用這類轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)重組蛋白的方法。

能導(dǎo)入本發(fā)明的有蹄類動物中的第二種異源基因的另一個實例是突變朊病毒基因。已經(jīng)鑒定了來自不同種的朊病毒基因的幾個等位基因，它們使得對朊病毒相關(guān)疾病的敏感性提高。本發(fā)明的有蹄類動物，它們含有內(nèi)源朊病毒基因純合缺失或破壞，突變等位基因是轉(zhuǎn)基因，它們是研究這些動物中朊病毒相關(guān)疾病進展的理想工具，而沒有來自該基因其它等位基因編碼的朊病毒的干擾。而且，建立這類轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的克隆系還有另一個優(yōu)點——具有等基因背景，對于研究可能涉及其它蛋白質(zhì)的復(fù)雜疾病過程這是特別理想的。

因此，本發(fā)明也包括具有相同基因型的克隆轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。利用核移植技術(shù)克隆牛的技術(shù)在美國專利5,945,577和6,147,276中已有詳述，在此引用作為參考?？寺〉霓D(zhuǎn)基因有蹄類動物也可能攜帶與朊病毒基因座無關(guān)的異源基因。

建立轉(zhuǎn)基因哺乳動物的克隆系具有不必為研究疾病進展產(chǎn)生等基因背景的優(yōu)點。這些技術(shù)允許同時生產(chǎn)幾種動物；這些技術(shù)允許性選擇起始(founder)動物；可能不需要動物的完整生殖，從而加速了轉(zhuǎn)基因系的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的克隆轉(zhuǎn)基因牛包括此處所述有蹄類動物的每種變異。

就此而言，本發(fā)明也不只包括一種克隆的轉(zhuǎn)基因牛，而是涉及全都具有相同基因型的轉(zhuǎn)基因牛的“系”。正因為遺傳學(xué)均相同的細胞系是有利的，所以遺傳學(xué)相同的哺乳動物系對于可靠性、均一性等是有利的。試圖研究試劑對遺傳學(xué)均不同的細胞群體的作用。均一的細胞群體使人們能夠做出關(guān)于整個哺乳動物群體的合理預(yù)測和有根據(jù)的結(jié)論，而不需考慮遺傳多樣性的影響。

因此，本發(fā)明包括一種應(yīng)用轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，特別是克隆的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，它們在內(nèi)源朊病毒基因和異源突變朊病毒基因中具有純合缺失或破壞，用于篩選或評價可用于治療或預(yù)防海綿狀腦病的藥劑。這種方法包括(1)在所述朊病毒相關(guān)海綿狀腦病發(fā)展之前或之后，對所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物施用一種推斷的治療劑；(2)監(jiān)測該有蹄類動物，以確定有關(guān)朊病毒相關(guān)海綿狀腦病是否被預(yù)防或治療。將要篩選的藥劑可包括反義核酸、化學(xué)制劑、抗體或抑制突變朊病毒基因表達的其它蛋白質(zhì)配體，細胞朊病毒向疾病特異性朊病毒開始的轉(zhuǎn)化，或者細胞朊病毒通過與疾病特異性朊病毒相互作用的轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物也可作為異種移植的組織和細胞的來源。例如，這些動物能用作治療帕金森氏癥和亨廷頓氏病的胎神經(jīng)元的來源。用于帕金森氏癥的一種產(chǎn)品已經(jīng)在臨床前模型中得到證明。該研究顯示，來自克隆牛的胎神經(jīng)元能移植到逆轉(zhuǎn)帕金森氏綜合征的帕金森氏癥大鼠中28。因而能用轉(zhuǎn)基因牛的神經(jīng)元治療人類神經(jīng)退化疾病。能將胎神經(jīng)元植入這些病人的患腦中，導(dǎo)致綜合征的一定的緩解29-31。本領(lǐng)域中的一種爭論是人胎在移植中的用途。同樣，人角膜移植和硬膜移植在超過60個人中引起傳染性CJD6。為了避免傳染性海綿狀腦病的可能性，用于移植的胎組織應(yīng)當(dāng)來自無PrP的有蹄類動物胚胎。

因此，本發(fā)明包括一種使用來自轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的胎組織或細胞的異種移植方法，該方法包括：(1)通過交配或克隆技術(shù)，產(chǎn)生內(nèi)源朊病毒基因純合缺失或破壞的轉(zhuǎn)基因胎；(2)從該胎中分離目的組織或細胞；(3)將胎組織或細胞移植到受體哺乳動物中。優(yōu)選地，該細胞是用于治療帕金森氏癥和亨廷頓氏病的胎神經(jīng)元細胞。此外，也可用胎角膜組織代替損傷的人角膜。用作組織來源的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物也可含有一種異源DNA或第二種基因缺失或破壞，用于防止移植排斥。

就此而言，本發(fā)明也包括攜帶至少一種與朊病毒基因座無關(guān)的其它缺失或破壞的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。這些動物也可包含與朊病毒破壞無關(guān)的異源DNA，尤其可用于突變朊病毒基因為轉(zhuǎn)基因的有蹄類動物，因為這些哺乳動物可用來研究其它基因缺失對朊病毒相關(guān)疾病過程的影響。

無朊病毒牛也能用來提高牛源產(chǎn)品的安全性指標(biāo)，如牛血清白蛋白(用作許多人用藥品的載體，用于實驗室研究)和胎牛血清(用于實驗室的細胞培養(yǎng))。此外，在農(nóng)業(yè)工業(yè)上也能用無朊病毒牛確保對消費者安全的肉制品和家畜。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛的方法已經(jīng)生產(chǎn)了幾只存活的轉(zhuǎn)基因小牛，用生產(chǎn)不能傳播或感染BSE的未來的轉(zhuǎn)基因系補充該技術(shù)是有利的。

本發(fā)明也包括用于分離和表征有蹄類動物朊病毒基因、特別是牛朊病毒基因的核酸構(gòu)建體，以及用于構(gòu)建靶向DNA分子、靶向構(gòu)建體和質(zhì)粒衍生物的構(gòu)建體。具體而言，本發(fā)明包括一種分離的DNA分子，它含有與選擇性標(biāo)記基因編碼區(qū)或報道基因編碼區(qū)有效連接的牛朊病毒基因啟動子的至少一部分。短語“牛啟動子的至少一部分”是指DNA分子含有足夠的啟動子區(qū)，以便在包含于含有來自或鄰近牛朊病毒基因座的第二種牛DNA序列的靶向構(gòu)建體中時，有利于同源重組。然而，也包括含有與選擇性標(biāo)記基因或報道基因有效連接的啟動子功能部分的DNA分子，它可用于監(jiān)測由朊病毒基因啟動子的體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄，例如，由轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)機制引起的轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選地，選擇性標(biāo)記是新霉素抗性基因。靶向構(gòu)建體也可含有胸苷激酶基因，它允許正選擇和負選擇同源重組子。也包括含有本發(fā)明的分離DNA分子的質(zhì)粒載體，其中優(yōu)選的質(zhì)粒載體是含有pUC主鏈的質(zhì)粒，如pBluescript(Stratagene)或pCR-Topo?II(Invitrogen)。

一般而言，本發(fā)明包括能特異和功能性缺失或破壞有蹄類動物朊病毒基因表達的DNA靶向分子，其中通過向朊病毒基因座中同源重組發(fā)生這種破壞。在這種情況下，靶向構(gòu)建體的一個臂不必是朊病毒基因啟動子，只要該靶向構(gòu)建體使同源重組子不能表達內(nèi)源基因即可。實際上，靶向分子可包含一種選擇性標(biāo)記基因，它與能在有蹄類動物或牛細胞中起作用的任一啟動子有效連接，但優(yōu)選地使用PGK啟動子。這些分子也可任選地含有胸苷激酶基因，用于通過同源重組之外的方法負選擇摻入靶向分子的細胞。因為外顯子3中含有該基因的完整編碼區(qū)，本發(fā)明的靶向分子優(yōu)選地促進至少朊病毒基因外顯子3的缺失或破壞。也包括含有DNA靶向分子的質(zhì)粒載體。

本發(fā)明也包括利用本發(fā)明的靶向DNA分子生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法。具體而言，生產(chǎn)朊病毒基因缺失或破壞雜合的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法包括下列步驟：(1)從有蹄類動物細胞中分離基因組DNA；(2)從該基因組DNA中分離朊病毒等位基因；(3)確定從?；蚪MDNA中分離的有蹄類動物朊病毒等位基因的限制酶切圖譜和內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)；(4)為構(gòu)建靶向DNA分子，亞克隆該朊病毒等位基因的片段；(5)構(gòu)建一種能通過同源重組破壞或缺失朊病毒等位基因的靶向DNA分子；(6)轉(zhuǎn)染該有蹄類動物細胞，使得同源重組子得到分離；(7)將轉(zhuǎn)染細胞(含有同源重組到朊病毒等位基因中的靶向分子)的核轉(zhuǎn)移到去核成熟有蹄類動物卵母細胞的細胞質(zhì)中；(8)培養(yǎng)該卵母細胞形成胚泡；(9)轉(zhuǎn)移該胚泡至受體哺乳動物，使根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物出生。然后通過繁殖異源轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，或者通過用初級成纖維細胞靶向其它等位基因的缺失，獲得純合轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。此外，也可在初始成纖維細胞中分離純合缺失或破壞。

應(yīng)當(dāng)注意，利用核移植技術(shù)最容易實施生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，這是因為利用易于繁殖的細胞系可分離同源重組子這一事實，然后可將這些重組子的核轉(zhuǎn)移到一個去核卵母細胞中。然而，應(yīng)當(dāng)明白，也可利用直接向胚胎干細胞中轉(zhuǎn)染靶向構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因哺乳動物。

用于分離基因組DNA和朊病毒基因座的細胞一般是初級成纖維細胞。對于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因牛，這些細胞優(yōu)選地來源于胎成纖維細胞，如BEF細胞。然而，用于分離基因組DNA和生產(chǎn)供體核的細胞也可以是成人成纖維細胞，其可行性在美國專利號5,945,577中得到證實，在此引用作為參考。

定義術(shù)語有蹄類動物包括馬、牛、綿羊、山羊、鹿和其它任何有蹄的哺乳動物。

術(shù)語“破壞”是指朊病毒基因的缺失部分可以替換為異源DNA，使該基因破壞，而“缺失”包括不同時插入異源DNA的缺失。本發(fā)明的缺失不需包括完整的朊病毒基因，構(gòu)建缺失或破壞，使功能朊病毒蛋白質(zhì)不表達，并且不產(chǎn)生異常的變異蛋白質(zhì)，即截短。實際上，Shmerling等人(1998)制備了表達近氨基端缺失的PrP的敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)某些截短的衍生物早在出生后1-3個月內(nèi)即可導(dǎo)致嚴重的共濟失調(diào)和死亡1。

術(shù)語“朊病毒相關(guān)疾病”包括瘙癢病、牛海綿狀腦病或瘋牛病，和有蹄類動物易感的其它任何類型的基于朊病毒的神經(jīng)退化疾病。包括由于有蹄類動物接觸來自其它任何哺乳動物或人的傳染性朊病毒引起的任何種間疾病。

術(shù)語“選擇性標(biāo)記”一般是指由于其表達能在不表達該基因的細胞中特異性選擇表達該基因的細胞的任何基因。然而，該術(shù)語也可包括通過目視篩選試驗、顏色指示試驗等篩選的標(biāo)記，只要該標(biāo)記與轉(zhuǎn)染方案聯(lián)合使用能鑒定和篩選同源重組子即可。

術(shù)語“與朊病毒基因座無關(guān)”僅僅是指第二種異源DNA與朊病毒基因座處的敲除無關(guān)并且不是它所必需的。然而，因為該異源DNA存在并且獨立表達，它也可位于同源重組的區(qū)域內(nèi)，只要它不破壞同源重組子的選擇、選擇性標(biāo)記的表達等。

術(shù)語“有效連接”是指DNA片段連接在一起，使得其中一個的表達依賴于另一個的作用。

術(shù)語“來源于”是指起源于，并且不包括背離本發(fā)明的精神和關(guān)鍵的任何衍生。

本發(fā)明的范圍通過下列代表性實驗說明。

實驗概述本發(fā)明包括牛PrP基因(PRNP)的分離、靶向載體的構(gòu)建、供體細胞的轉(zhuǎn)染、供體核向去核卵母細胞的核移植、卵母細胞向受體母體的轉(zhuǎn)移。核移植技術(shù)在美國專利號5,945,577中有詳述，在此引用作為參考。其它技術(shù)包括：1.牛PrP基因的克隆和表征此處使用的初級成纖維細胞(BEF細胞)以前曾用于生產(chǎn)克隆的轉(zhuǎn)基因牛4。從這些細胞中分離基因組DNA，用來生產(chǎn)BEF基因組文庫。根據(jù)由其它牛PRNP基因序列預(yù)測的推斷牛PrP結(jié)構(gòu)，確定等基因(BEF)PrP基因(PRNP)的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)。

2.用于牛PrP基因的靶向載體的構(gòu)建提出了用于PrP基因的8個不同的靶向載體。載體2、3、6、7是正-負選擇靶向載體，含有一個由PGK啟動子驅(qū)動的正選擇性標(biāo)記(新霉素)，和一個由單純皰疹病毒(HSV)啟動子驅(qū)動的負選擇性標(biāo)記(胸苷激酶)，以及來自等基因牛PRNP基因的側(cè)翼DNA(見圖2A和圖2B)。靶向載體1和5含有由HSV啟動子驅(qū)動的胸苷激酶作為負選擇性標(biāo)記，和一個由HSV啟動子驅(qū)動的無啟動子正選擇性標(biāo)記，和一個無啟動子正選擇標(biāo)記(新霉素)，以及來自等基因牛PRNP基因的側(cè)翼DNA。靶向載體的正確整合導(dǎo)致由內(nèi)源PrP啟動子驅(qū)動的neo轉(zhuǎn)錄。靶向載體4和8只允許正選擇，含有無啟動子正選擇性標(biāo)記(新霉素)以及來自等基因牛PRNP基因的側(cè)翼DNA。Neo基因的表達由內(nèi)源牛PRNP啟動子驅(qū)動。

3.靶向效率的優(yōu)化藥物篩選和電穿孔的最佳條件用對照載體和最終靶向載體確定。假如在正常二倍體細胞中同源重組率較低，則確保高轉(zhuǎn)染率和有效的藥物篩選條件是必要的步驟，以分離含PRNP定向缺失的稀有細胞。

實驗方法延伸(長)聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用表1所示引物組和EXPANDO?20kB?Plus?PCR系統(tǒng)(Boehringer?Mannheim)，按照使用說明，由BEF基因組DNA擴增PRNP基因。用PCR克隆試劑盒(Invitrogen)將擴增的DNA亞克隆到pCR-XL-Topo?II載體中。

表1.用于克隆牛PRNP基因的引物

文庫篩查和雜交利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使噬菌體DNA與全長人PrP?cDNA(ATCC)37的2.5kb?EcoRI32P-隨機引物標(biāo)記探針雜交。

噬菌體制備和噬菌體DNA純化為了制備噬菌體DNA，使用噬菌體純化制備試劑盒(Promega)。這些試劑盒將噬菌體DNA的純化時間由1天縮短為1小時，成本合適，并取消了傳統(tǒng)方法中有毒的酚/氯仿抽提。

牛成纖維細胞的生產(chǎn)、保存和電穿孔按照標(biāo)準(zhǔn)胎成纖維細胞制備方法38從55天的Holstein雄性胎牛中生產(chǎn)牛成纖維細胞(BEF)。由這一個胎制備大量細胞，過去曾成功用于生產(chǎn)克隆的轉(zhuǎn)基因牛。成纖維細胞在37℃和5％?CO2下保存于聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中。當(dāng)細胞達到80％鋪滿時以1∶10傳代。這些初級細胞具有28-30個小時的細胞周期，在衰老前經(jīng)歷大約30次群體倍增。

活躍生長的細胞(80％鋪滿)用于電穿孔。通過胰蛋白酶消化收集細胞，以5×106細胞/500μl冰預(yù)冷PBS的密度重懸浮。降500μl等份細胞置于電洗脫池中，其中加有溶于無菌水的20μg?DNA。通過拍打輕輕混合細胞和DNA，在冰上溫育10分鐘。溫育10分鐘后，再次輕輕重懸浮細胞，然后用表1所示參數(shù)電穿孔。最佳參數(shù)將由這些實驗確定。脈沖后，該池再在冰上溫育10分鐘。在無菌條件下，我們從池中取出細胞，重懸浮于10ml上述培養(yǎng)基中，平板接種于10100mm2聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿上總共10ml的培養(yǎng)基中。細胞在37℃和5％?CO2下溫育過夜。

牛細胞和DNA用來制備靶向構(gòu)建體的牛PRNP?DNA應(yīng)當(dāng)來源于將要轉(zhuǎn)染的相同細胞。在鼠基因組靶向?qū)嶒炛?，用等基因DNA(由與將要靶向的細胞相同的種/株克隆的基因)制備的置換載體使有效靶向率提高了2.5倍39。與小鼠不同，牛沒有近交系，因此PrP基因必須從將要用于靶向?qū)嶒灥恼嬲ゼ毎锌寺?，以提高重組頻率。因而用BEF基因組DNA構(gòu)建基因組文庫。為了克隆的DNA片段的亞克隆和操作，選擇λFIX?II文庫，因為它接受了DNA的大片段(9-23kb)，含有多個側(cè)翼限制酶切位點。

牛PrP基因的鑒定100萬噬斑形成單位(pfu)接種宿主細菌株XL-1?blue(Stratagene)，使之生長12-16小時，或直到出現(xiàn)裂解的噬斑。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)36將噬菌體顆粒轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，并與含有全長人PrP?cDNA(ATCC目錄號#6594637)的2.5kb?EcoRI片段雜交。人PrP?cDNA與?；蛴写蠹s80％的同源性(用保藏號AB001468，牛PrP?cDNA進行Blast搜索比較)。

挑取第一輪克隆產(chǎn)生的陽性噬斑，重新平板接種，并與人朊病毒探針重新雜交。在液體培養(yǎng)基中擴增第三輪克隆產(chǎn)生的陽性噬斑，如方法部分所述純化。噬菌體DNA如本申請中方法部分所述純化。

牛朊病毒基因的結(jié)構(gòu)表征非等基因牛PrP基因(意思是，不是來自BEF細胞)已經(jīng)從黃牛(Bos?taurus)中克隆，推斷的圖譜可從GenBank獲得(保藏號#D26150、D26151)40。等基因牛PrP基因的大多數(shù)圖譜能通過簡單地限制酶消化噬菌體并使這些消化物與人PrP?cDNA的不同外顯子雜交獲得。如上所述，為了用靶向載體獲得最佳重組頻率，對來自細胞的牛PrP基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)作圖是必要的。建議靶向載體破壞含有該基因所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)的外顯子3的表達或缺失外顯子3。因此，對等基因牛PrP基因內(nèi)的外顯子3的確切位置和限制性內(nèi)切核酸酶圖譜作圖是必要的。

圖1顯示根據(jù)保藏號D26150和D26151的牛PrP基因的推斷的圖譜40。其它動物和人的朊病毒基因含有三個外顯子，第三個外顯子含有PrP蛋白的完整編碼區(qū)?？梢杂脕碜酝怙@子1-3和限制性消化物的不同探針組合對等基因牛PrP基因的內(nèi)含子和外顯子大小作圖。

限制性內(nèi)切核酸酶消化和作圖將顯示向質(zhì)粒載體中亞克隆PrP基因的合適區(qū)域。純化這些DNA片段，并連接到pBluescript質(zhì)粒(Stratagene)中。這些質(zhì)粒能用于外顯子的序列分析和PrP基因各區(qū)域的精確作圖。

等基因牛PrP基因的序列分析對三個外顯子的位置作圖后，即可測定這些區(qū)域的短片段的序列，以證實其身份。這些序列數(shù)據(jù)使人們能確定基因區(qū)域，獲知從基因組文庫中分離的噬菌體克隆間的任何差異，它們可顯示等位基因的差異。

為了對朊病毒基因測序，用ABI熒光羅丹明測序試劑盒，和質(zhì)粒載體的通用引物或為內(nèi)部區(qū)域設(shè)計的引物，測序含有外顯子1-3的亞克隆的PrP基因片段。這些序列結(jié)果用于在開始靶向載體之前證實牛PrP基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的位置作圖。已知確切缺失對于這種靶向構(gòu)建體是最重要的，由于兩個原因得到證實。第一，本發(fā)明的牛將是含有任何基因定向缺失的第一種牛。我們希望能證實基因組內(nèi)缺失的確切位置，并且能對這些牛的任何后代中的缺失精確作圖。第二，由于我們刪除的基因的性質(zhì)，必須確認刪除的序列含有朊病毒蛋白的編碼區(qū)，利用該技術(shù)生產(chǎn)的牛中沒有任何蛋白質(zhì)編碼區(qū)。

正-負型靶向載體最常用的選擇性標(biāo)記基因是新霉素抗性基因，或“neo”。該基因?qū)①x予攜帶靶向構(gòu)建體的細胞G418抗性。胸苷激酶基因?qū)⒂糜谠诒?a href='/zhuanli/list-21453-1.html' target='_blank'>氧鳥苷(gancyclovir)存在下進行負選擇。這使我們能選擇非同源插入靶向載體的細胞。在鼠胚胎干細胞中，在G418和丙氧鳥苷存在下雙選擇比單獨G418選擇有高200倍的同源重組子富集41。據(jù)報道，人二倍體成纖維細胞的雙選擇只引起同源重組子的2-3倍富集42。由于以下所述的原因，我們感到甚至這種中度的提高也可導(dǎo)致靶向?qū)嶒灥淖罱K成功。

靶向載體的最終設(shè)計取決于限制分析。由于PrP蛋白編碼區(qū)本身完全包含于外顯子3中，應(yīng)當(dāng)構(gòu)建靶向載體，以刪除或破壞該基因的所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)。在小鼠中去除蛋白質(zhì)編碼區(qū)成功地消除了朊病毒傳染和傳播27，49-51。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的典型靶向載體圖譜，以及靶向載體插入后的PrP基因結(jié)構(gòu)。

Capecchi表示，為了在胚胎干細胞中有效靶向，載體必須含有長度至少為1kb的側(cè)翼同源DNA序列。同源序列增長兩倍可使hprt基因座的靶向頻率提高20倍41。因此，建議在定向缺失的任一側(cè)有至少1kb的同源序列，最可能地是來自位于新霉素基因任一側(cè)的PrP基因的非編碼區(qū)。

本發(fā)明的neo基因來源于pPNT質(zhì)粒(Heiner?Westphal惠贈)43，由PGK啟動子驅(qū)動。TK基因來自于HSV-TK質(zhì)粒44。PGK-neo基因和HSV-TK基因都曾經(jīng)亞克隆到pBluscript-SK(Stratagene)中，產(chǎn)生其它的克隆位點(Good，未發(fā)表)。完整靶向構(gòu)建體的質(zhì)粒骨架是pBluscript-SK載體(Stratagene)。限制酶切位點的約束和PRNP基因內(nèi)的片段大小決定了極限側(cè)翼大小、缺失大小和使用的PRNP基因的區(qū)域。我們的經(jīng)驗提示，為一個基因的兩個不同區(qū)域制備兩個不同的靶向載體通常是有利的。

無啟動子的neo基因靶向載體3年前John?Sedivy博士的實驗室報道了利用正常非嚙齒類動物二倍體細胞成功實現(xiàn)了靶向?qū)嶒?2。這種靶向?qū)嶒炇褂靡环N無啟動子的neo靶向載體，其構(gòu)建方法使得當(dāng)適當(dāng)插入時由內(nèi)源靶向基因的啟動子驅(qū)動。該技術(shù)顯然導(dǎo)致同源重組子100-200倍富集。

使用該方法的一個問題是高PrP內(nèi)源PrP表達是實現(xiàn)充分新霉素表達必須的。PrP在鼠胚胎成纖維細胞中表達45。對分離自BEF細胞的RNA的Northern分析證實，這些細胞中也存在PrP?mRNA(圖3)。其水平比下丘腦細胞系GT1-7約低50％，但似乎足以支持無啟動子的構(gòu)建體。

圖2A和圖2B顯示了幾種無啟動子的neo構(gòu)建體的圖譜。靶向載體的最終設(shè)計取決于對牛PrP基因的限制分析。通過PCR擴增pGEM-neo-poly?A質(zhì)粒，產(chǎn)生了一種新的新霉素盒質(zhì)粒，它含有無啟動子的新霉素基因。設(shè)計可識別新霉素基因5’端的一條引物(Tk-Bam：5’GCC?AAT?ATG?GGA?TCG?GCC?ATT?GAA?C-3’)，與T7啟動子載體引物一起在標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增程序中使用。將1.4kb片段亞克隆到PCR-Topo?II載體中。為了確保新霉素盒與PrP蛋白(包括ATG密碼子)符合閱讀框地放置，由pNEO載體(Pharmacia?Biotech)亞克隆無啟動子的新霉素抗性基因，保留neo基因5’的一個剪接位點，在PRNP的第三個外顯子內(nèi)。將至少1kb的側(cè)翼DNA序列插入neo盒的任一側(cè)，在構(gòu)建體的3’端插入TK基因，用于在丙氧鳥苷存在下負選擇。

使用無啟動子的neo構(gòu)建體有利于在PRNP基因內(nèi)產(chǎn)生定向缺失的目的，因為只有該構(gòu)建體正確整合到PRNP基因中才能導(dǎo)致neo抗性基因的合成和G418抗性。另外，在正確靶向的載體中將丟失TK基因，導(dǎo)致丙氧鳥苷抗性。在使用傳統(tǒng)正-負靶向載體的靶向?qū)嶒炛?，大多?shù)G418抗性/TK抗性菌落由基因組中的隨機插入產(chǎn)生。無啟動子型構(gòu)建體只能使靠近活性啟動子的隨機整合對G418有抗性。因此，由于存在較少的總G418菌落，無啟動子的靶向載體使人們能在一次實驗中篩選每一個G418陽性菌落，而不是200個隨機選擇的菌落，如ES細胞靶向中所做。例如對于人二倍體成纖維細胞，這種策略產(chǎn)生20個G418抗性菌落和4個同源重組子——靶向頻率為20％42。

BEF細胞中靶向效率的優(yōu)化確定BEF細胞的最佳電穿孔條件有幾篇報道表明，除了胚胎干細胞以外，大多數(shù)正常哺乳動物細胞中的同源重組較低42，46。盡管在我們的實驗室中對BEF細胞進行了電穿孔并生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因牛4，但為了獲得含有朊病毒基因破壞或缺失的稀有同源重組子，優(yōu)化轉(zhuǎn)染率是必要的。

為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的優(yōu)化，BEF細胞生長至亞鋪滿，用胰蛋白酶消化，與20μg線性化pPNT載體一起或不含DNA，重懸浮于0.5ml不含Ca+2/Mg+2的PBS中。該質(zhì)粒含有在磷酸甘油激酶啟動子(PGK)控制下的突變新霉素抗性基因43。利用表1所示條件電穿孔BEF細胞，然后如方法所述以5×105細胞/100mm2組織培養(yǎng)板的密度平板接種。列出的值是Invitrogen電穿孔裝置的預(yù)設(shè)值。表2.BEF細胞電穿孔條件的優(yōu)化

實驗應(yīng)當(dāng)進行兩次，每一點有6平板電穿孔細胞。所有6個平板都在37℃和5％?CO2下在無藥物培養(yǎng)基中生長過夜。早晨用胰蛋白酶消化三個平板，計數(shù)，確定細胞存活率。將其余三個平板中的培養(yǎng)基更換為含G418(400μg/ml)的培養(yǎng)基。每日早晨更換這些平板中的培養(yǎng)基，保持藥物水平恒定。在5-10天后，當(dāng)平板上出現(xiàn)可見菌落時，用亞甲基藍染色，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。用三個平板的平均值確定每種電穿孔條件的轉(zhuǎn)染率。每種電穿孔條件在兩個分別的實驗中嘗試。

這些實驗用來確定具有最大細胞存活率的BEF細胞的最大DNA轉(zhuǎn)染參數(shù)。在開始同源重組實驗之前應(yīng)當(dāng)優(yōu)化這些數(shù)值，以提高在轉(zhuǎn)染細胞群體中發(fā)現(xiàn)這些稀有事件的效率。一個合理的目的是提高轉(zhuǎn)染率，達到每次轉(zhuǎn)染至少1000-1500個G418抗性菌落(1000-1500個G418抗性菌落/3×106個轉(zhuǎn)染細胞＝每3000個細胞中1個轉(zhuǎn)染細胞)。我們估計，甚至在每1000個抗性細胞1個同源重組子的相對較低的同源靶向頻率下，我們在1×107個細胞的轉(zhuǎn)染群體中應(yīng)能發(fā)現(xiàn)2-4個同源重組子：1×107個轉(zhuǎn)染細胞＝3333個G418抗性細胞＝3.3個同源重組子3000個中1個抗性細胞1000個抗性細胞中1個同源重組子每次電穿孔這一數(shù)字(每次電穿孔3.3個同源重組子)相當(dāng)于300萬個轉(zhuǎn)染細胞中1個的靶向效率，比人二倍體成纖維細胞的頻率低30倍42。因此，即使BEF細胞中同源重組頻率低于正常人成纖維細胞，這些條件也能使我們在每次實驗中回收至少1-2個靶向細胞。

利用pPNT載體確定最佳參數(shù)后，應(yīng)當(dāng)用這些參數(shù)優(yōu)化靶向載體的靶向頻率。由于靶向載體可能大于檢測質(zhì)粒，這可能影響轉(zhuǎn)染效率。

確定BEF細胞中的有效藥物濃度在開始實際靶向?qū)嶒炛?，需要確定新霉素(G418)和丙氧鳥苷的最高濃度，它們是殺死非轉(zhuǎn)染細胞所必需的，而對正確靶向的細胞沒有毒性。我們實驗室以前的工作確定，400μg/ml新霉素足以殺死不含新霉素的BEF細胞，而使含有轉(zhuǎn)染的新霉素基因的BEF細胞快速增殖4。因為我們提出的正-負選擇靶向需要在丙氧鳥苷和G418存在下篩選數(shù)天，我們建立了一條篩選曲線，來檢測能在這些實驗中使用的丙氧鳥苷與G418的范圍。

另外，其他人的工作也顯示，對于人和大鼠二倍體成纖維細胞，只在向培養(yǎng)物中加入1-10mg/ml的G418時才能實現(xiàn)有效篩選42，46。這能比通常用于BEF細胞的高10倍。因此，為了提高同源重組子的頻率，首先應(yīng)當(dāng)確定這些細胞中是否能使用更高水平的藥物。

為了回答這個問題，以5×105細胞/10ml培養(yǎng)基的密度接種未轉(zhuǎn)染的BEF細胞，并溫育過夜。次日早晨，將培養(yǎng)基更換為含有藥物的培養(yǎng)基，濃度如表2所示。每一藥物濃度使用兩個細胞平板。G418篩選持續(xù)可達10天，或者直到完全殺死每個平板上的未轉(zhuǎn)染細胞。丙氧鳥苷篩選持續(xù)4天，計算百分存活率。

表3.未轉(zhuǎn)染BEF細胞的G418和丙氧鳥苷處理

TK基因?qū)⒈貘B苷轉(zhuǎn)化為毒性核苷酸類似物。正常細胞和缺乏正確靶向的PrP基因的細胞應(yīng)當(dāng)對這種藥物有抗性。據(jù)我們所知，這種藥物尚未用于BEF細胞，這些試驗使我們能確定細胞可以承受、在不含TK基因時沒有大量毒性的最高丙氧鳥苷水平。BEF細胞的新霉素敏感性和丙氧鳥苷抗性的優(yōu)化將提高靶向頻率，并允許在轉(zhuǎn)染子庫中發(fā)現(xiàn)稀有的同源重組子。

轉(zhuǎn)染的BEF細胞的篩選利用含有新霉素抗性基因以及胸苷激酶基因的pPNT載體，用如上確定的最佳條件電穿孔細胞43。在電穿孔后，細胞以5×105細胞/10ml培養(yǎng)基的密度接種，并溫育過夜。次日早晨，將培養(yǎng)基更換為含有藥物的培養(yǎng)基，濃度如表3所示。每個藥物濃度使用兩平板細胞。

單獨或與G418組合的丙氧鳥苷篩選持續(xù)4天，培養(yǎng)基每24小時更換一次，以確保所有時間上培養(yǎng)基中的藥物高濃度。4天后，培養(yǎng)基更換為單獨的G418，或者不含根據(jù)本表的藥物，篩選再繼續(xù)6天，或者直到個別菌落可見。此時，從平板上除去培養(yǎng)基，用PBS漂洗平板一次，細胞菌落用亞甲基藍染色。計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)，確定每種藥物的細胞死亡/生長曲線。

表2和表3中為兩條生長/死亡曲線選擇的新霉素濃度基于已知可有效殺傷未轉(zhuǎn)染BEF細胞的最低新霉素濃度，高兩個對數(shù)，這是用于正常人成纖維細胞的G418的中間范圍42。丙氧鳥苷從未用于BEF細胞。因此，所選的丙氧鳥苷的濃度基于靶向?qū)嶒炛袑κ笈咛ジ杉毎行У臐舛鹊囊话?1μM)，藥物提高2個對數(shù)。

根據(jù)對正常大鼠二倍體細胞的研究，G418水平能提高到20mg/ml，而正常neo基因轉(zhuǎn)染的細胞只有80％被殺死46。因此，我們預(yù)期用pPNT新霉素構(gòu)建體能將BEF細胞中的G418濃度由300μg/ml(這是現(xiàn)在使用的最高含量)提高到至少1mg/ml。如在大鼠二倍體成纖維細胞中所證實的，含有突變新霉素基因(如pPNT載體中所見43)的細胞更有效地靶向46。因此，高G418與突變新霉素基因的組合最適于有效回收同源重組的BEF細胞。

表4.pPNT轉(zhuǎn)染的BEF細胞的G418和丙氧鳥苷處理

就正常和破壞的PRNP基因，對BEF基因組DNA的Southern分析應(yīng)用相關(guān)限制酶緩沖液，5μg正常或轉(zhuǎn)染的BEF基因組DNA用選擇的限制酶消化8-24小時。消化的DNA在標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液中在1％瓊脂糖凝膠上分離，用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，1989)轉(zhuǎn)移到固體載體膜(硝酸纖維素或尼龍膜)上。膜上的DNA與來自插入的轉(zhuǎn)基因和選擇性標(biāo)記的探針雜交。圖4顯示了對正常BEF?PRNP基因的Southern分析。對靶向的BEF或其它有蹄類動物PRNP基因的Southern分析將揭示內(nèi)源PRNP基因的結(jié)構(gòu)改變，包括較小或較大的雜交PRNP片段，和外源轉(zhuǎn)基因和選擇性標(biāo)記的存在。

實施例牛成纖維細胞的生產(chǎn)和保存ACT按照標(biāo)準(zhǔn)胎成纖維細胞制備方法由55天Holstein雄性胎牛生產(chǎn)牛胎成纖維細胞(BEF)。由一個胎制備大量細胞，用于生產(chǎn)克隆的轉(zhuǎn)基因牛。成纖維細胞在37℃和5％?CO2下保存于聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中。當(dāng)細胞達到80％鋪滿時以1∶10傳代。這些初級細胞具有28-30個小時的細胞周期，在衰老前經(jīng)歷大約30次群體倍增。

牛PrP基因的克隆最初的計劃用于在大基因組序列中獲得朊病毒基因，并且為了中斷蛋白質(zhì)生產(chǎn)摻入選擇性標(biāo)記。從牛胎成纖維細胞中提取高分子量的基因組DNA。通過向噬菌體載體中隨機插入該基因組DNA的限制片段并包裝成病毒顆粒，制備λFIX?11基因組文庫(Stratagene)。自由擴增產(chǎn)物(8×109噬斑形成單位/ml)用來感染大腸桿菌并平板接種分離的噬斑。印跡的噬斑用來自質(zhì)粒pMPRP3(ATCC)、含有小鼠朊病毒DNA序列的放射標(biāo)記的2.4kb?EcoRI?DNA片段探針雜交。為了覆蓋完整的基因組，篩查足量的噬斑。富集含有推斷的牛PrP基因序列的噬斑，重新接種，再次探針雜交，以純化并證實它們與小鼠PrP基因的序列匹配。在三次獨立篩查噬斑的嘗試中，獲得并檢測了幾個初始信號。都不含能用來構(gòu)建靶向載體的PrP序列。

為了獲得構(gòu)建靶向構(gòu)建體所需的基因，進行PCR擴增。引物根據(jù)GenBank?AB001468和D26150的序列制備。PCR擴增位于插入或缺失點任一側(cè)(稱作臂)的約2kb序列。應(yīng)用有義引物“A”(GCAGAGCTGAGCGTCTTC)和反義引物“B”(CAGC’fCAAGTTGGATTTGTGTC)，通過擴展PCR系統(tǒng)(Boehringer?Mannheim)擴增含有內(nèi)含子I和外顯子2一部分的序列的5’上游臂。PCR產(chǎn)物是2.4kb的DNA片段(圖5)，它用TOPO?XLPCR試劑盒(Invitrogen)克隆，并在馬薩諸塞州大學(xué)的DNA測序機構(gòu)測序。

最初應(yīng)用引物C和D的工作未能產(chǎn)生希望的產(chǎn)物。需要另一組引物直接從?；蚪MDNA中擴增外顯子3序列。用有義引物PrP?Is(GGGCAACC-I’TCCTGTTTTCATTATC)和反義引物PrP?1a(CCATACACTGCACAAA-fACATTTTCGC)克隆2.129kb?PCR產(chǎn)物(圖6)。

靶向載體的構(gòu)建裝配克隆的序列，建立靶向載體。構(gòu)建開始于PrP3的克隆#3，該質(zhì)粒在載體pCR-XL?TOPO(Invitrogen)中含有編碼序列外顯子3，3’臂。將克隆的構(gòu)建體的5’臂轉(zhuǎn)移到3’臂上游的SstI片段。使用引物TK-Bam(GCCAATATGGGATCGGCCATTGAAC)和T7測序引物(TAATACGACTCATATAGGG)經(jīng)PCR修飾neo選擇(新霉素G418抗性)盒，以在5’端添加一個BamHI位點，以便更容易地亞克隆。該PCR產(chǎn)物PGK-neo插入BamHI片段的3’與5’臂之間。最終構(gòu)建體通過MluI和NotI消化線性化，純化該片段用于轉(zhuǎn)染。當(dāng)與基因組DNA重組時，該構(gòu)建體用于中斷外顯子2的序列缺失部分，使外顯子3中的編碼序列不產(chǎn)生基因產(chǎn)物(圖5)。然而這未獲成功?；叵肫饋?，該載體有幾個主要問題：(1)它不是無啟動子的neo；(2)該載體具有極短的左-右基因組臂，只含2.3kb的內(nèi)含子1、具有自身啟動子的neo和2.2kb的外顯子3；(3)該載體中完全不含14kb的內(nèi)含子2基因組DNA，實際導(dǎo)致1.5kb的缺失。

在這些研究中使用三個構(gòu)建體：EGFP-N1(Clontech)、pPNT和如上所述制備的pPRP載體。確定牛胎成纖維細胞轉(zhuǎn)染效率的預(yù)電穿孔實驗用含有綠色熒光蛋白和新霉素抗性基因的EGFP-NI載體(Clontech)進行。在我們實驗室以前的實驗中，已經(jīng)用EGFP質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染BFF細胞。使用這種載體能通過熒光顯微鏡檢容易地檢測轉(zhuǎn)染的細胞。轉(zhuǎn)染的BFF細胞和抗性菌落在紫外線下發(fā)出綠色熒光。表I說明了在檢測BFF細胞的電穿孔條件時EGFP載體的應(yīng)用。在第二次EGFP轉(zhuǎn)染和隨后用PPNT載體轉(zhuǎn)染時改變電穿孔參數(shù)。我們實驗室在400伏特和250μF電容下進行了成功的BFF細胞轉(zhuǎn)染。在K.D.Wells等人進行的一個類似實驗中(1998年LETS會議摘要)，在0、200、300、400或500伏特和500μF電容下轉(zhuǎn)染BFF細胞，誘導(dǎo)DNA攝取。在400和500伏特時獲得最大轉(zhuǎn)染。電穿孔參數(shù)集中于450-650伏，400伏特被認為是基線電壓。通過以50伏特的增量提高電壓檢測了更高的電壓。

通過在不同濃度遺傳霉素(G418，400-3000μg/ml)下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的牛胎成纖維細胞測試藥物篩選。在我們的研究中，對于牛胎成纖維細胞，400μg/ml?G418?10天是最佳藥物篩選條件，產(chǎn)生穩(wěn)定的新霉素抗性菌落。

電穿孔牛胎成纖維細胞在含15％?FBS(Hyclone)的DMEM-高葡萄糖培養(yǎng)基(Gibco/BRL)中生長至80％鋪滿。用1×胰蛋白酶/EGTA(Gibco/BRL)收集細胞，然后在室溫下以1200轉(zhuǎn)/分離心7分鐘形成沉淀。洗滌細胞，以5×106細胞/0.5ml的密度重懸浮于無Ca+2/Mg+2的Dulbecco’s?PBS中。在每次電穿孔實驗中，將500pi等份重懸浮細胞和25μl無菌水中的20μg線性DNA轉(zhuǎn)移到0.4cm寬間隙的電穿孔池(Biorad)中。輕輕拍打電穿孔池混合細胞和DNA，然后在冰上溫育10分鐘。溫育后，再次輕輕混合細胞和DNA，然后用Invitrogen?II電穿孔儀以表5所示參數(shù)電穿孔：表5.BFF細胞電穿孔條件的優(yōu)化

在電穿孔后將電穿孔池放回冰上10分鐘。在接種電穿孔細胞之前，向每個池中加入100μl不含Ca+2/Mg+2的DPBS，輕輕混合細胞。在無菌條件下，向6個20×100mm2聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿的每一個中加入10ml含15％?FBS的DMEM-高葡萄糖。從池中取出100μl等份電穿孔細胞，平板接種于6個組織培養(yǎng)皿的每一個上。所有6個平板的細胞都在37℃和5％?CO2空氣下在無藥物培養(yǎng)基中生長過夜。次日早晨經(jīng)胰蛋白酶消化收集3個平板的轉(zhuǎn)染細胞，進行細胞計數(shù)，確定細胞存活率。通過更換培養(yǎng)基并向每個平板中加入400μg/ml遺傳霉素(G418)，對其余3個平板開始藥物篩選。細胞然后在G418選擇下在37℃和5％?CO2下生長10天。每天更換這些平板中的培養(yǎng)基，以保持用于藥物篩選的恒定G418水平。G418篩選10天后，出現(xiàn)可見菌落，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。用三個平板的平均菌落計數(shù)確定每種電穿孔條件的轉(zhuǎn)染效率。每種電穿孔條件在兩次分別的實驗中檢測。

在用pPNT載體轉(zhuǎn)染牛胎成纖維細胞之前，用含有綠色熒光蛋白和新霉素抗性基因的EGFP-N1載體(Clontech)進行預(yù)電穿孔實驗。在我們實驗室以前的實驗中，已經(jīng)用EGFP質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染BFF細胞。使用這種載體能通過熒光顯微鏡檢容易地檢測轉(zhuǎn)染的細胞。轉(zhuǎn)染的BFF細胞和抗性菌落在紫外線下發(fā)出綠色熒光。表1說明了在檢測BFF細胞的電穿孔條件時使用EGFP載體。在第二次EGFP轉(zhuǎn)染和隨后的pPNT載體轉(zhuǎn)染時改變電穿孔參數(shù)。我們實驗室在400伏特和250μF電容下進行了成功的BFF細胞轉(zhuǎn)染。在K.D.Wells等人進行的一個類似實驗中，在0、200、300、400或500伏特和500μF電容下轉(zhuǎn)染BFF細胞，誘導(dǎo)DNA攝取。在400和500伏特時獲得最大轉(zhuǎn)染。

電穿孔參數(shù)集中于450-650伏，400伏特被認為是基線電壓。通過以50伏特的增量提高電壓測試了更高的電壓。

表6.應(yīng)用EGFP和pPNT的BFF細胞的電穿孔參數(shù)

利用表6所示電穿孔參數(shù)，用pPNT對BFF細胞進行第二組轉(zhuǎn)染。pPRP靶向載體的轉(zhuǎn)染使用相同的電穿孔條件。

未轉(zhuǎn)染的BFF細胞的檢測篩選未轉(zhuǎn)染的牛胎成纖維細胞以5×106細胞/10ml含15％?FBS的DMEM-高葡萄糖培養(yǎng)基的密度接種于20×100mm2聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿上。細胞在37℃和5％?CO2下生長過夜。次日早晨更換培養(yǎng)基，應(yīng)用遺傳霉素(G418)開始藥物篩選。

表7包括檢測的藥物濃度。G418選擇進行10天，這段時間內(nèi)未轉(zhuǎn)染的細胞被全部殺死。每種藥物濃度使用兩個平板的BFF，在第0、3、7、10天對這些平板進行細胞計數(shù)。我們實驗室以前的工作已經(jīng)確定400μg/ml新霉素足以殺傷不含新霉素的BFF細胞，而使含有轉(zhuǎn)染新霉素基因的BFF細胞快速增殖。因此，對于該實驗，以400μg/ml遺傳霉素(G418)開始藥物篩選，檢測600、800、100μg的升高的藥物濃度。

表7.未轉(zhuǎn)染的BFF細胞的遺傳霉素(G418)處理

用未轉(zhuǎn)染的牛胎成纖維細胞制作第二條死亡率曲線，藥物篩選開始于400μg/ml?G418，升高到600、800、100μg的濃度進行檢測。表8包括所檢測的藥物濃度。

表8.未轉(zhuǎn)染的BFF細胞的遺傳霉素(G418)處理

轉(zhuǎn)染的BFF細胞的檢測篩選用含有新霉素抗性基因和胸苷激酶基因的pPNT載體轉(zhuǎn)染BFF細胞。在450伏特和250μF電容下電穿孔細胞，誘導(dǎo)DNA攝取。在電穿孔后，由非休眠胎成纖維細胞生產(chǎn)的克隆轉(zhuǎn)基因小牛的細胞以5×106細胞/10ml培養(yǎng)基/100mm2平板的密度接種，并在37℃和5％?CO2空氣下溫育過夜。次日早晨，更換培養(yǎng)基并用G418開始藥物篩選。測試的藥物濃度在表8中列出。遺傳霉素選擇持續(xù)12天，這時抗性菌落可見。每個藥物濃度使用兩平板BFF，在第0、4、7、12天對這些平板的細胞進行細胞計數(shù)。如前所述，藥物篩選開始于400μg/ml?G418，并測試升高的遺傳霉素濃度。表7和表9中為兩條生長/殺傷曲線選擇的新霉素濃度基于已知可有效殺死未轉(zhuǎn)染BEF細胞的最低新霉素濃度，高兩個對數(shù)，這是用于正常人成纖維細胞的G418的中間范圍。

表9.pPNT轉(zhuǎn)染的BFF細胞的遺傳霉素(G418)處理

電穿孔結(jié)果在不含DNA的未轉(zhuǎn)染牛胎成纖維細胞的電穿孔中未出現(xiàn)自發(fā)抗性菌落。隨著測試電壓的升高，細胞存活率S形降低。細胞在1、100、300、450、600、800伏特和0-500μF電容下電穿孔。在100伏特時細胞存活率為89％，在800伏特時，細胞存活率顯著降低到1.2％。表6說明用400μg/ml遺傳霉素(G418)藥物篩選10天后，三個平板的總細胞計數(shù)和平均細胞計數(shù)。在沒有抗性菌落時不能計算該實驗的轉(zhuǎn)染效率。

表10.未轉(zhuǎn)染的BFF細胞的電穿孔

用幾種DNA構(gòu)建體EGFP-NI(Clontech)、pPNT和pPRP對轉(zhuǎn)染的BFF細胞進行電穿孔作為一系列實驗。在第一個電穿孔實驗中使用EGFP構(gòu)建體，因為在我們的實驗室中以前曾經(jīng)用它成功轉(zhuǎn)染BFF細胞。該構(gòu)建體含有新霉素抗性基因和綠色熒光蛋白，能在熒光顯微鏡下容易地檢測轉(zhuǎn)染的BFF細胞。轉(zhuǎn)染的BFF細胞在紫外線下發(fā)綠色熒光。細胞在0、100、300、450、600、800伏特和0-500μF電容下轉(zhuǎn)染。如以前未轉(zhuǎn)染BFF細胞所見，細胞存活率隨電穿孔電壓升高而降低。表11顯示了藥物篩選10天后三個平板的細胞總數(shù)和平均細胞計數(shù)。

表11.EGFP轉(zhuǎn)染的BFF細胞的電穿孔

在600伏特、250μF電容時發(fā)生最大轉(zhuǎn)染，每個培養(yǎng)板上平均出現(xiàn)14個抗性菌落。該電壓時的細胞存活率只有8.9％，而這些細胞在每個培養(yǎng)板上產(chǎn)生最大數(shù)量的菌落。在電穿孔實驗中報道了類似的結(jié)果。如其他人所述，隨著電壓升高，細胞存活率以S形方式降低，反之，隨著電壓升高，存活的轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量S形增加40。在下一次電穿孔實驗中同時進行雙份轉(zhuǎn)染。用EGFP和pPNT構(gòu)建體轉(zhuǎn)染BFF細胞。根據(jù)我們以前的實驗中獲得的最大轉(zhuǎn)染(600伏特)，這些轉(zhuǎn)染使用更集中的電穿孔條件范圍。成功轉(zhuǎn)染通常在400伏特下進行，K.D.Wells等人在400和500伏特時獲得BFF細胞的最大轉(zhuǎn)染40。因此，在0、450、550、600、650伏特下轉(zhuǎn)染細胞，以獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。對于EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的BFF，在600伏特、250μF時發(fā)生最大轉(zhuǎn)染；每個培養(yǎng)板平均有15個抗性菌落。在pPNT轉(zhuǎn)染中獲得類似的結(jié)果。如前所述，隨著電穿孔電壓升高，細胞存活率降低，而轉(zhuǎn)染效率提高。

隨后的電穿孔實驗使用450-650伏特的電壓范圍和250μF電容。再次同時分開進行兩次轉(zhuǎn)染：用pPNT第二次轉(zhuǎn)染BFF細胞和用靶構(gòu)建體pPRP第一次轉(zhuǎn)染。對于pPNT載體，在600伏特和250μF電容時獲得最大轉(zhuǎn)染。對于pPNT轉(zhuǎn)染，每個培養(yǎng)板獲得平均28個抗性菌落。對于靶載體pPRP，在略高的電壓650伏特和250μF時獲得最大轉(zhuǎn)染。對于pPRP轉(zhuǎn)染每個培養(yǎng)板記錄12個抗性菌落。在這些較高的電穿孔電壓下，細胞存活率降低和轉(zhuǎn)染效率升高的S形模式是明顯的。這些結(jié)果包含于圖7-9中。

使用如上所述相同的電壓和電容，在第二次實驗中重復(fù)pPRP對BFF細胞的轉(zhuǎn)染。在600伏特和250μF時再次獲得最大轉(zhuǎn)染。這種重復(fù)轉(zhuǎn)染獲得的抗性菌落數(shù)量與以前pPRP實驗中獲得的相當(dāng)。

藥物篩選的優(yōu)化未轉(zhuǎn)染的牛胎成纖維細胞在不同濃度的遺傳霉素(G418)下生長。我們實驗室的轉(zhuǎn)染實驗通常使用400μg/ml的G418濃度，發(fā)現(xiàn)該藥物濃度足以殺死不含新霉素的BFF細胞，而使新霉素基因轉(zhuǎn)染的BFF細胞快速生長。因此，400μg/ml的G418濃度被認為是該實驗的起點，并測試了升高的藥物濃度。在第一次實驗中，測試了寬范圍的藥物濃度：400、1000和3000μg/ml?G418(表12)。在400μg/ml?G418時，未轉(zhuǎn)染的BFF細胞在藥物篩選開始后繼續(xù)旺盛生長3天。在1000μg/ml?G418下，未轉(zhuǎn)染的BFF細胞以降低的速度生長相同時間。在3000μg/ml?G418下藥物篩選3天內(nèi)，BFF細胞死亡(圖11)。殺死未轉(zhuǎn)染的BFF細胞需要用400μg/ml?G418藥物篩選10天。每個藥物濃度使用兩個培養(yǎng)板的細胞，以每一時間間隔進行細胞計數(shù)。表12包括不同時間內(nèi)檢測的每個G418濃度的平均細胞計數(shù)。表12.未轉(zhuǎn)染的I3hF細胞的G418藥物篩選

對于未轉(zhuǎn)染BFF細胞的第二條殺傷曲線，藥物濃度范圍集中于400-1000μg/ml?G418。藥物篩選開始后前幾天，在較高藥物濃度(600、800、1000μg/ml)下細胞增殖速率降低。G418處理7天后，在800μg?G418時出現(xiàn)BFF細胞的總死亡率，在600μg?G418時只有少量未轉(zhuǎn)染細胞存活。根據(jù)這兩條殺傷曲線顯然可知，在藥物篩選中有大約3天的滯后。在這段時間內(nèi)，隨著G418濃度升高，BFF細胞以降低的速率持續(xù)生長。

用pPNT構(gòu)建體轉(zhuǎn)染牛胎成纖維細胞，并進行藥物篩選12天。測試了寬范圍的藥物濃度：400、1000、3000μg/ml?G418。對于測試的任何濃度，在藥物篩選12天后不發(fā)生死亡。在這些較高的藥物濃度下，BFF細胞以降低的速度繼續(xù)生長(圖10和圖11)。表13包括在12天內(nèi)收集的兩個BFF培養(yǎng)板的平均細胞計數(shù)。由于難以獲得丙氧鳥苷，未用這種藥物進行BFF細胞的檢測篩選。

表13.pPNT轉(zhuǎn)染的BFF細胞的G418處理

結(jié)論本實驗的目的在于克隆牛朊病毒基因(PrP)的基因組序列，以產(chǎn)生靶向載體，并優(yōu)化牛胎成纖維細胞的電穿孔和藥物篩選的條件。產(chǎn)生的靶向載體并不成功，主要是因為：(1)它不是無啟動子的neo；(2)該載體具有極短的左-右基因組臂，只含2.3kb的內(nèi)含子1、具有自身啟動子的neo和2.2kb的外顯子；和/或(3)該載體中完全不含14kb的內(nèi)含子2基因組DNA，導(dǎo)致實際1.5kb的缺失。因此，發(fā)展了一種用于構(gòu)建靶向載體的備選策略，它應(yīng)當(dāng)能解決這些問題，如實施例2所詳述。

實施例2用于從?；蚪MDNA文庫中分離PrP基因的DNA探針的產(chǎn)生設(shè)計PCR引物(5’引物：ATGGTGAAAAGCCACATAG；3’引物：TATCCTACTATGAGAAAAAT)，使PCR產(chǎn)物的DNA序列對應(yīng)于作為PrP外顯子3一部分的PrP開放閱讀框。PCR產(chǎn)物的預(yù)測大小為794bp。

篩查基因組DNA文庫和PrP基因組DNA的鑒定用非同位素洋地黃毒苷-dUTP(Roche?Molecular?Biochemicals)標(biāo)記的794bp?PrP探針篩查已經(jīng)建立的?；蚪MDNA文庫。我們已經(jīng)用這種標(biāo)記系統(tǒng)成功克隆了兩個基因組DNA。利用部分DNA測序證實鑒定的PrP基因組DNA，并作圖，用于隨后基因靶向載體的構(gòu)建。

基因靶向載體的構(gòu)建需要一個大約10kb的PrP基因組DNA作為靶向DNA片段的左臂和右臂進行同源重組。從外顯子3中刪除完整PrP編碼序列(795bp)，替換為無啟動子新霉素抗性基因。我們希望分離牛PrP基因組DNA片段，它是圖12所示的區(qū)域。

設(shè)計用于基因分型PrP靶向的BEF和動物的一種探針在分離PrP基因組DNA片段、作圖并證明滿足構(gòu)建靶向載體的需要后，確定用靶向載體中不含的0.5-1.0kb?PrP基因組DNA作為探針用于基因分型基因靶向的等位基因。該探針用非同位素洋地黃毒苷-dUTP(Roche?Molecular?Biochemicals)標(biāo)記，在Southern印跡分析中檢測部分消化的野生型基因組DNA。我們已經(jīng)用這種標(biāo)記方法成功進行了Southern印跡分析。

必要時，可對基因組DNA文庫進行數(shù)輪篩查，因為為了分離覆蓋構(gòu)建靶向載體所需的基因組區(qū)域的DNA片段，可能需要篩查?；蚪MDNA文庫數(shù)次。

無啟動子靶向載體的用途(目的I)，用于在牛胎成纖維細胞中進行同源重組，以確定在PrP基因一個等位基因上有無效突變的基因靶向細胞ACT按照標(biāo)準(zhǔn)胎成纖維細胞制備方法由35-40天的Holstein雄性胎牛制備牛胚胎成纖維細胞(BEF)。由這一胚胎制備大量細胞。過去已經(jīng)用類似制備的細胞成功生產(chǎn)了克隆的轉(zhuǎn)基因牛。成纖維細胞在37℃和5％?CO2下保存于聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中。當(dāng)細胞達到80％鋪滿時以1∶10傳代。這些初級細胞具有28-30個小時的細胞周期，在衰老前經(jīng)歷大約30次群體倍增。

PrP基因靶向構(gòu)建體向BFF中的導(dǎo)入通過胰蛋白酶消化收集總共1×1011個BEF(80％鋪滿)，以5×106細胞/450μl冰預(yù)冷PBS的密度重懸浮。進行雙份電穿孔。每次電穿孔，在電洗脫池中將50μl?PBS中的28-50μg?DNA靶向構(gòu)建體與450μl重懸浮的BFF混合，在冰上溫育10分鐘。溫育10分鐘后，再次輕輕重懸浮細胞，然后用600伏特和250μF的參數(shù)電穿孔(Invitrogen?II電穿孔儀)。脈沖后，池在冰上再溫育10分鐘。轉(zhuǎn)移電穿孔的BFF，重懸浮于10ml上述培養(yǎng)基中，并以5×105細胞/皿的密度接種于10個100mm2聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿上。在37℃和5％?CO2孵箱中溫育這些細胞。

PrP基因靶向的BFF在含G418選擇性培養(yǎng)基中的培養(yǎng)電穿孔后，在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，向轉(zhuǎn)染的BEF中加入含有400μg/ml?G418的選擇性培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染的BEF在選擇性培養(yǎng)基中保存約10天，或者直到形成存活的菌落。如果向培養(yǎng)基中補充較高濃度的G418，為了篩選雜合細胞或可能的純合細胞，相應(yīng)調(diào)節(jié)G418的濃度。

篩選后存活的BEF菌落的擴增和基因分型用克隆環(huán)分別分離存活的BEF菌落，在選擇性培養(yǎng)基中擴增。每個存活菌落需要雙份培養(yǎng)物。一組用于提取基因分型所需的基因組DNA，另一組凍存作為保存液。用PCR方法獲得用于基因打靶的存活菌落的基因分型，作為初篩，隨后是Southern印跡分析。

利用基因靶向細胞通過核移植產(chǎn)生PrP雜合敲除(KO)牛胎基因打靶是一種為了分離由單個細胞通過多次倍增產(chǎn)生的靶向細胞菌落，需要用抗生素進行細胞選擇的技術(shù)。由于我們計劃用初級細胞系研究，到克隆細胞系出現(xiàn)時，除細胞擴增外幾乎沒有任何群體倍增。在1998年和2000年，我們發(fā)表的工作證實了體細胞核移植使細胞系完全復(fù)原的能力。這一特征使我們能進行純合基因打靶，第一次使用來自自然產(chǎn)生的胎的初級細胞，第二次使用來自克隆胎的初級細胞。

以前對牛體細胞核移植的研究證實，該技術(shù)不僅可以用來自胎和成年動物的初級細胞重復(fù)，而且也可用轉(zhuǎn)基因系重復(fù)。在我們的實驗室中，我們能通過以相當(dāng)高的效率克隆，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。40％-50％的受體母牛(每只母牛兩個胚泡)懷孕。然而這個總體效率不能反映細胞系之間的差異。我們發(fā)現(xiàn)不是所有的克隆系(盡管它們來自同一基因組)都能保持相同的效率水平(根據(jù)健康胎的生產(chǎn)確定)。

我們?nèi)缓笥?0個不同細胞系產(chǎn)生雄性胎。系1是來自與靶向細胞系相同的基因組的非轉(zhuǎn)基因胎成纖維細胞。系2-10是PrP純合KO細胞。測算發(fā)育至胚泡階段的效率，以及妊娠30-35天時的妊娠率，和形成40天健康胎的能力。

每個細胞系產(chǎn)生的胚胎(胚泡)數(shù)量為50，移植到25只母牛中。由于這一研究的工作量不能使我們在一天內(nèi)進行全部實驗，我們將每個細胞系分為3個不同的重復(fù)(一天一個)，使所有不同處理隨機化。

預(yù)期結(jié)果：根據(jù)我們以前使用轉(zhuǎn)基因細胞的工作，我們預(yù)期獲得不能引起妊娠的細胞系，以及能以40％-50％的速率和80％-90％健康胎牛產(chǎn)量引起妊娠的細胞系。如果有一種以上的細胞系產(chǎn)生健康胎牛，我們將選擇能最有效地產(chǎn)生第二輪基因打靶的5個。

然而，所有細胞系的妊娠率可能低于平均值。這時我們將從包括不同品種的不同基因型中預(yù)先篩選細胞系。

卵子的提取和成熟在屠宰場回收卵巢，置于PBS(34℃)中，在8小時內(nèi)帶回實驗室。用18G針頭無菌吸出每個直徑超過2mm的卵泡。卵母細胞的尋找在改良Tyrode培養(yǎng)基(TL?Hepes)中進行。將含有均勻細胞質(zhì)、相當(dāng)大卵周間隙和完整丘細胞的卵母細胞置于成熟培養(yǎng)基M199(GIBCO)、10％?FCS、5μl/ml?bFSH(Nobly)、5μl/ml?bLH(Nobly)和10μl/ml?Pen-strep(Sigma)中，38.5℃和5％?CO2下22小時。預(yù)期置于成熟培養(yǎng)基中的卵有70-80％能達到中期II階段。

供體細胞的制備如下從35-40天的胎牛中分離細胞系。在無菌條件下，棄去胎的肝、腸和頭。仔細切碎胎的其余部分，置于含有0.08％胰蛋白酶(Difco)和0.02％?EDTA(Sigma)的DPBS溶液中。在37℃下溫育30分鐘后，棄去上清液，將沉淀重懸浮于胰蛋白酶-EDTA/DPBS中。溫育30分鐘后，取出上清液，以300g離心10分鐘。將沉淀重懸浮于培養(yǎng)基(DMEM+15％?FCS，4μl/ml抗生素-抗真菌劑，28μl/ml?2-巰基乙醇，0.3mg/ml?L-谷氨酰胺)中，并接種于聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿(Corning25010)中。傳代2次后，培養(yǎng)液中有大部分成纖維細胞樣細胞。這些細胞將用作對照或用于進一步的基因打靶實驗。

卵子的去核成熟18小時后，中期II卵母細胞置于礦物油(Sigma)下的一滴100μl的TL?HECM-Hepes中。卵母細胞的去核(染色體的提取)用直徑25μm的斜面玻璃吸管進行。通過在紫外線下將預(yù)先培養(yǎng)15分鐘的卵母細胞暴露于1μg/ml在TL?HECM-Hepes中的二苯甲亞胺(Hoechst?33342，Sigma)中，評價去核。

細胞轉(zhuǎn)移用別處所述的搖落(shake-off)法選擇G1(增殖)期的供體細胞。簡言之，在含有15％?FCS的培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)細胞至50-60％鋪滿。在細胞轉(zhuǎn)移前幾分鐘，以速度3振蕩培養(yǎng)板30-60秒。隨后收集培養(yǎng)基，以300g離心10分鐘。然后將沉淀重懸浮于Hecm?Hepes培養(yǎng)基中，細胞用于核移植。利用20微米內(nèi)徑的玻璃吸管，裝運一個細胞，將其置于卵子的卵周間隙中。

細胞融合根據(jù)以前所述的條件，在成熟23小時后，去核的卵子和供體細胞將與卵子的細胞質(zhì)融合。簡言之，在0.3M甘露醇(Sigma)中，利用2.5kB-cm的電脈沖，使去核的卵子與供體細胞電融合和10-15微秒。

核移植單位(NTU)的激活現(xiàn)在稱為NTU的融合胚胎將在細胞融合2小時后化學(xué)激活，所使用的化學(xué)激活方案包括將NTU置于含10微摩爾離子霉素的培養(yǎng)基中，隨后在環(huán)己亞胺和松胞菌素B中溫育8小時。

胚胎培養(yǎng)在激活后和激活后的前72小時期間，胚胎在含有小鼠胚胎成纖維細胞(MF)飼養(yǎng)層和含6mg/ml?BSA的ACM培養(yǎng)基的500μl孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。第4天，將胚胎轉(zhuǎn)移到含小鼠成纖維細胞(MF)飼養(yǎng)層和含6mg/ml?BSA和10％?FCS的ACM培養(yǎng)基的500μl孔培養(yǎng)板中，直到胚泡期(激活后第7天或第8天)。

胚胎移植和妊娠檢查胚胎移植如別處所述進行。簡言之，在發(fā)情期6-7天后，將兩個胚泡等級7-1或7-2(IETS分類)非手術(shù)置于子宮角中，與黃體同側(cè)。通過子宮頸導(dǎo)管進入子宮角。妊娠檢查在胚胎移植35天后通過直腸超聲進行。存在心跳將表明健康的妊娠。

胎的獲取聽到心跳后，即通過剖腹手術(shù)在胚胎移植40天后取出胚胎。從子宮中取出胚胎，不需取出胚盤囊，置于含有PBS和抗生素50ml試管中，在4℃下送達實驗室。

小牛分娩在預(yù)產(chǎn)期(280-285天)之前三周，將受體母牛帶到圈中，24小時監(jiān)視任何早產(chǎn)跡象。分娩前一周和C切前24小時，對受體母牛髓內(nèi)IM注射地塞米松，以引發(fā)小牛肺的成熟。次日，進行C-切。出生后，對小牛施用表面活性劑，不斷監(jiān)視直到所有生命體征穩(wěn)定?？梢允褂冒褪肯镜某跞椋谟^察到第一次吸吮反射后即喂飼小牛。

基因型克隆的胎和分離PrP雜合KO胎成纖維細胞基因分型克隆的胎從克隆的牛胎組織中提取基因組DNA，使用與基因分型用于產(chǎn)生克隆胎的基因靶向BEF相同的探針，通過Southern印跡分析進行基因分型。

具有PrP雜合敲除的低傳代胎成纖維細胞的分離BEF的初級培養(yǎng)物只有有限數(shù)量的細胞群體倍增。在BEF的同源重組過程中將使用這些倍增時間的幾個。在鑒定具有PrP雜合敲除的BEF時，它們可能接近衰老，不適于一輪同源重組。我們預(yù)期必須從具有PrP雜合敲除的克隆胎中分離新的BEF，這些BEF將用于第二輪基因打靶，以獲得如前所述的PrP純合敲除BEF。

分離和保存PrP雜合敲除胎成纖維細胞的方法與前所述基本相同，不同之處在于PrP雜合敲除胎將是這些細胞的來源。

PrP雜合KO胎成纖維細胞的同源重組和鑒定在PrP基因兩條等位基因上具有無效突變的基因靶向細胞該方法與前所述基本相同，不同之處在于：(1)PrP雜合敲除BFF用于第二輪基因打靶，(2)優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基中的G418濃度，以支持具有PrP雜合敲除的細胞的存活率。在正常情況下，培養(yǎng)基中的G418濃度需要是篩選PrP雜合敲除細胞的濃度的兩倍，即，800μg/ml。

缺陷和預(yù)期困難在含高濃度G418的選擇性培養(yǎng)基上只有少于所需的菌落存活。為了確保在篩選后獲得足夠的菌落，進行三組或四組電穿孔。根據(jù)我們在其它敲除實驗中的經(jīng)驗，在第二輪基因打靶中獲得PrP純合敲除細胞可能有困難，因為如果使用相同的靶向載體則效率極低。原因還不清楚，(1)相同的靶向載體，與PrP雜合敲除細胞的靶向等位基因沒有錯配，可能傾向于與靶向等位基因重組；(2)使用相同選擇性標(biāo)記將不能區(qū)別雜合和純合敲除細胞。為了克服這種可能的困難，我們構(gòu)建了一種基因靶向載體，它含有一種不同的選擇性標(biāo)記，即潮霉素，用于第二輪基因打靶。

用PrP純合KO細胞通過核移植產(chǎn)生PrP純合KO小牛原則上，我們將重復(fù)如前所述的實驗設(shè)計，但應(yīng)用6個細胞系，1個對照和5個靶向細胞系。確定發(fā)育至胚泡期的效率，以及妊娠30-35天時的妊娠率，和生產(chǎn)健康新生小牛的能力。每個細胞系產(chǎn)生的胚胎(胚泡)數(shù)量將是50，轉(zhuǎn)移到25只母牛中。由于這一研究的工作量不能使我們在一天內(nèi)進行全部實驗，我們將每個細胞系分為3個不同的重復(fù)(一天一個)，使所有不同處理隨機化。

預(yù)期結(jié)果：當(dāng)每個受體母牛移植兩個胚胎時，總?cè)焉锫逝c常規(guī)人工授精隨后胚胎移植所產(chǎn)生的胚胎相同。然而由于尚不清楚的原因，克隆胎的流產(chǎn)率顯著提高。妊娠50-90天和220-280天時，被診斷為受孕的半數(shù)母牛流產(chǎn)。在我們使用KO細胞系的研究中，我們預(yù)期產(chǎn)生健康小牛的效率在不同細胞系中變化極大。總效率應(yīng)為10-15％(移植的母牛/出生的健康小牛)。

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