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一種南瓜籽肽粉及其制備方法和用途

閱讀：840發(fā)布：2020-05-08

專利匯可以提供一種南瓜籽肽粉及其制備方法和用途專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及一種南瓜籽肽粉及其制備方法和用途，所述南瓜籽肽粉的肽含量在90wt％以上，其中90％以上南瓜籽肽的分子量小于1000Dalton。 脫脂 南瓜籽粕經(jīng)蛋白提取、酶解、純化、濃縮和干燥，得到南瓜籽肽。此南瓜籽肽粉具有較好的清除自由基活性，對神經(jīng)具有較好的保護(hù)作用的功效。本發(fā)明的方法操作簡便，高收率低成本，產(chǎn)品 質(zhì)量 穩(wěn)定，工藝綠色環(huán)保，適合大規(guī)模生產(chǎn)。，下面是一種南瓜籽肽粉及其制備方法和用途專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種南瓜籽肽粉，其特征在于：肽含量在70wt％以上，其中70％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；優(yōu)選地，75％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；優(yōu)選地，80％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；優(yōu)選地，85％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；優(yōu)選地，90％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；優(yōu)選地，95％以上南瓜籽肽的分子量小于700Dalton；
分子量Dalton分布
優(yōu)選地，
分子量Dalton分布
優(yōu)選地，
分子量Dalton分布
數(shù)均分子量范圍：20～1100，重均分子量范圍：45～1300；優(yōu)選地，數(shù)均分子量范圍：100～1000，重均分子量范圍：100～1200；優(yōu)選地，數(shù)均分子量范圍：200～900，重均分子量范圍：150～1100；優(yōu)選地，數(shù)均分子量范圍：300～800，重均分子量范圍：200～1000；優(yōu)選地，數(shù)均分子量范圍：400～700，重均分子量范圍：300～900；肽含量的檢測方法是參照GB/T?
22492-2008附錄B和GB/T?22729-2008所述的肽含量的測定方法進(jìn)行；肽相對分子量分布的測定方法是參照GB/T?22492-2008附錄A和GB/T?22729-2008附錄A所述的高效凝膠過濾色譜法(GPC)進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1所述的南瓜籽低聚肽粉的制備方法，其特征在于包括下述步驟：將南瓜籽脫脂，依次經(jīng)過蛋白質(zhì)提取、酶解、分離純化、濃縮和干燥后，得到南瓜籽肽粉；所述南瓜籽肽粉的制備原料為葫蘆科南瓜屬植物南瓜Cucurbita?moschata?Duch.的種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述的脫脂方法可以為溶劑法、冷榨、熱榨、超臨界提取法，優(yōu)選地使用冷榨脫脂法；所述的蛋白提取法為普通的堿提酸沉法以及高效逆流提取法，優(yōu)選地使用高效逆流提取法。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述的酶解所用的生物酶可以為中性蛋白酶(酶活力≥30萬u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力≥30萬u/g)、堿性蛋白酶(酶活力≥20萬u/g)、酸性蛋白酶、胃蛋白酶(酶活力≥50萬u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)、無花果蛋白酶(酶活力≥5萬u/g)、羅漢果蛋白酶(酶活力≥5萬u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用食品級的中性蛋白酶；所述酶的混合物的比例為1:1～1:
10。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述的純化方法可以為濾膜過濾法和樹脂分離法，優(yōu)選地使用濾膜過濾法；所述的濃縮方法可以為真空濃縮、常壓濃縮、膜濃縮法，優(yōu)選地使用真空濃縮法；所述的干燥方法可以為真空干燥、加熱干燥、晾干、風(fēng)干、冷凍干燥和噴霧干燥法，優(yōu)選地使用噴霧干燥法。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于包括下述步驟：
南瓜籽脫脂：將南瓜籽去殼，冷榨脫脂，得到脫脂南瓜籽粕；
蛋白質(zhì)提?。簩⒁欢棵撝蟮哪瞎献哑?，記錄為A，與水按重量比為1:5～1:15混合，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提??；A完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取0.5～2h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為3～5，靜置0.5～2h，棄去上清液，最后往沉淀物中加入體積比為1:10～1:30的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；
酶解：將上述南瓜籽蛋白液加熱至35～60℃，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入至少南瓜籽粕重量的0.1wt％以上的中性蛋白酶，攪拌酶解至少3h后，調(diào)整pH為2～6，煮沸滅活至少2min，得到蛋白酶解液。
分離純化：將蛋白酶解液使用孔徑為0.1～0.5μm的微濾膜處理后；
濃縮和干燥：在40～80℃下濃縮至固含為3～5wt％時，噴霧干燥，
進(jìn)口溫度為140～160℃，出口溫度為55～65℃，得到南瓜籽肽粉，產(chǎn)率20wt％以上。
7.一種南瓜籽肽粉，肽含量在70wt％以上，其中75％以上南瓜籽肽的分子量小于
700Dalton，其特征在于：通過權(quán)利要求2-6任一所述的方法制備所得；肽含量的檢測方法是參照GB/T?22492-2008附錄B和GB/T?22729-2008所述的肽含量的測定方法進(jìn)行；肽相對分子量分布的測定方法是參照GB/T?22492-2008附錄A和GB/T?22729-2008附錄A所述的高效凝膠過濾色譜法(GPC)進(jìn)行。
8.一種組合物，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的南瓜籽肽粉，和藥物或食品上可接受的助劑；優(yōu)選地，其劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液，以及液體、乳液、膏霜、粉、塊狀等化妝品劑型。
9.權(quán)利要求1所述的南瓜籽肽粉或權(quán)利要求8所述的組合物用于制備預(yù)防或治療自由基過多引起的癥狀的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用；用于制備預(yù)防、改善或者治療神經(jīng)相關(guān)疾病的食品、保健食品或者藥品的應(yīng)用；用于改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠質(zhì)量的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用；用于制備預(yù)防或治療緩解大腦或者運(yùn)動疲勞的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用；用于制備增強(qiáng)免疫力的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用；用于制備預(yù)防肌肉流失、修復(fù)肌肉損傷、增長肌肉組織的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用；用于制備調(diào)節(jié)腸道有益菌群、提高腸胃動力、促進(jìn)營養(yǎng)吸收的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。

說明書全文

一種南瓜籽肽粉及其制備方法和用途

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明涉及一種高純度、低分子量的南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品，其肽含量在90wt％以上，分子量小于1000Dalton在90％以上。本發(fā)明還涉及到南瓜籽蛋白的制備并酶解，生成南瓜籽小肽的制備方法，該肽粉可用作食品、保健食品或者藥品。

背景技術(shù)

[0002] 南瓜籽為葫蘆科南瓜屬植物南瓜Cucurbita?moschata?Duch.的種子，藥食兼用。中醫(yī)認(rèn)為南瓜籽具有下乳、驅(qū)蟲、利水、健脾、潤肺等功效，《滇南草本》中記載：“南瓜性溫、味甘無毒，入脾、胃二經(jīng)，能驅(qū)蟲解毒、化痰排膿、潤肺益氣，治便秘、哮喘、咳嗽等癥”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明南瓜籽具有降血糖、緩解高血壓、降膽固醇、抗氧化、抗炎、以及治療前列腺增生等功效。南瓜籽含有豐富的黃酮、多糖、胡蘿卜素、脂肪、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素。其中脂肪含量高達(dá)40wt％，含有油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、瓦克芩酸、芥酸等不飽和脂肪酸，占總脂肪酸的75wt％。此外，研究表明南瓜籽油中含有一種可以成為男性荷爾蒙的活性生物觸媒劑成分，能夠消除前列腺的初期腫脹，對泌尿系統(tǒng)及前列腺增生具有良好的治療和預(yù)防作用，作為一種保健油，已被確認(rèn)為首批中國老年保健協(xié)會推薦產(chǎn)品，并深受歡迎。隨著南瓜籽油產(chǎn)量的不斷增大，南瓜籽油加工的副產(chǎn)物-南瓜籽餅粕的綜合利用也亟待解決。南瓜籽餅粕大多被用作飼料或者被廢棄，不僅資源浪費(fèi)，而且造成環(huán)境污染。南瓜籽粕中含有高達(dá)40wt％蛋白質(zhì)，含有人體必需的8種氨基酸，含量超過FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)與WHO(世界衛(wèi)生組織)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，在必需氨基酸比例與人體所需氨基酸組成模式相似，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，其營養(yǎng)價值高，具有很高的開發(fā)潛力。目前對南瓜餅粕的開發(fā)利用，主要停留在南瓜蛋白的分離提取上，更加深入的研究較少。
[0003] 植物活性肽具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是當(dāng)前國際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。人體攝食蛋白質(zhì)經(jīng)消化道的酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，以游離氨基酸形式吸收的比例很小，活性肽能自主抑制對脂肪的吸收，并與脂肪發(fā)生作用，產(chǎn)生脂肪酶，能促進(jìn)脂肪的分解。同時活性肽比游離氨基酸消化更快、吸收更多，表明活性肽的生物效價和營養(yǎng)價值比游離氨基酸更高。當(dāng)前對于南瓜籽蛋白肽工業(yè)制備工藝的研究較少。專利CN?102197856?A公開了南瓜籽蛋白肽的制備方法，使用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)進(jìn)行脫脂，堿提酸沉提取蛋白質(zhì)，加入生物酶酶解后，離心后，直接使用4000Da超濾膜進(jìn)行過濾，經(jīng)濃縮冷凍干燥后得到南瓜籽蛋白肽。此專利公開的方法很難適用于大規(guī)模生產(chǎn)，原因?yàn)椋?.超臨界二氧化碳萃取技術(shù)成本高，工業(yè)生產(chǎn)不可行；2.酶解離心后直接使用超濾膜過濾，而不經(jīng)過粗過濾，容易造成膜阻塞，造成過濾速度慢，大量生產(chǎn)不可行；3.產(chǎn)品干燥方式為冷凍干燥，造價高；4.制備所得的南瓜籽蛋白肽的含量以及分子分布未確定，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量。專利CN?105639047?A將南瓜籽粕粉碎后，加水和生物酶而得，方法雖然簡便，但是沒有經(jīng)過除雜和肽的純化，含有較多的大分子蛋白，嚴(yán)格地說應(yīng)該是南瓜籽蛋白酶解液，不是南瓜籽蛋白肽。專利CN?105018557?A將南瓜籽粕粉碎后分散于水中，加水酶解后，直接經(jīng)1000Da超濾膜超濾，濃縮干燥后得到南瓜籽蛋白肽。有如下不足之處：1.南瓜籽粕的蛋白含量要求在50wt％以上，造成工藝的運(yùn)用有很大的局限性；2.產(chǎn)品經(jīng)1000Da超濾膜過濾，過濾時間長；3.產(chǎn)品收率低，不超過15wt％；4.產(chǎn)品肽含量和分子量分布的測定方法不明確。因此尋找一種工藝簡便、綠色環(huán)保、高收率、低成本的工業(yè)制備方法成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。本發(fā)明所述的制備工藝，具有操作簡便、收率高、成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，同時產(chǎn)品經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)所公布的肽含量和分子量分布的檢測方法進(jìn)行測定，是一種高純度、水溶性良好、澄清度高、具有多種生理活性的南瓜籽小肽。

發(fā)明內(nèi)容

[0004] 本發(fā)明的目的是提供了一種高純度、低分子量的南瓜籽肽粉。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供了一種高純度、低分子量的南瓜籽肽粉的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備預(yù)防或治療自由基過多引起的癥狀的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備預(yù)防、改善或者治療神經(jīng)相關(guān)疾病的食品、保健食品或者藥品的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備改善或治療記憶力衰退的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠質(zhì)量的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備預(yù)防或治療緩解大腦或者運(yùn)動疲勞的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備增強(qiáng)免疫力的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備提高脂肪代謝的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備預(yù)防肌肉流失、修復(fù)肌肉損傷、增長肌肉組織的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明南瓜籽肽粉用于制備調(diào)節(jié)腸道有益菌群、提高腸胃動力、促進(jìn)營養(yǎng)吸收、潤腸通便的食品、保健食品或藥品的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供了含有本發(fā)明南瓜籽肽粉的藥物和食品組合物。
[0016] 本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0017] 一種南瓜籽肽粉，其特征在于：肽含量在90wt％以上，其中90％以上南瓜籽肽的分子量小于1000Dalton。
[0018] 所述南瓜籽肽粉，其制備方法包括下述步驟：將南瓜籽脫脂，依次經(jīng)過蛋白提取、酶解、純化、濃縮和干燥后，得到南瓜籽肽。
[0019] 所述南瓜籽肽粉，其肽含量的檢測方法是參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T?22492-2008附錄B和GB/T?22729-2008所述的肽含量的測定方法進(jìn)行。
[0020] 所述南瓜籽肽粉，其肽相對分子量分布的測定方法是參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T?22492-2008附錄A和GB/T?22729-2008附錄A所述的高效凝膠過濾色譜法(GPC)進(jìn)行。
[0021] 所述南瓜籽肽粉的制備原料為葫蘆科南瓜屬植物南瓜Cucurbita?moschata?Duch.的種子。
[0022] 所述的脫脂方法可以為溶劑法、冷榨、熱榨、超臨界提取法，優(yōu)選地使用冷榨脫脂法。
[0023] 所述的蛋白提取法為普通的堿提酸沉法以及高效逆流提取法，優(yōu)選地使用高效逆流提取法。
[0024] 所述的酶解所用的生物酶可以為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、羅漢果蛋白酶中的一種或者它們的混合物。
[0025] 所述的純化方法可以為濾膜過濾法和樹脂分離法，優(yōu)選地使用濾膜過濾法。
[0026] 所述的濃縮方法可以為真空濃縮、常壓濃縮、膜濃縮法，優(yōu)選地使用真空濃縮法。
[0027] 所述的干燥方法可以為真空干燥、加熱干燥、晾干、風(fēng)干、冷凍干燥和噴霧干燥法。
[0028] 所述南瓜籽肽粉是通過下述方法制備得到的：
[0029] 南瓜籽預(yù)處理：將南瓜籽去殼，冷榨脫脂，得到脫脂南瓜籽粕；
[0030] 高效逆流提取法提取蛋白質(zhì)：將一定量脫脂后的南瓜籽粕，記錄為A，與水按重量比為1:5～1:15混合，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提?。籄完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至8～12于室溫提取0.5～2h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取0.5～2h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為3～5，靜置0.5～2h，棄去上清液，最后往沉淀物中加入體積比為1:10～1:30的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液。
[0031] 蛋白酶解：將上述南瓜籽蛋白液加熱至35～60℃，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入至少南瓜籽粕重量的0.1wt％以上的中性蛋白酶，攪拌酶解至少3h后，調(diào)整pH為2～6，煮沸滅活至少2min，得到蛋白酶解液。
[0032] 分離純化：將蛋白酶解液使用微濾膜處理后，在40～80℃下濃縮至固含為3～5wt％時，干燥后，得到南瓜籽肽粉，產(chǎn)率40wt％以上。
[0033] 一種組合物，其含有本發(fā)明所述的南瓜籽肽粉和，食品、藥物或化妝品食品上可接受的助劑。
[0034] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明可將所述的組合物制備成任意所述劑型，如素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液，以及液體、乳液、膏霜、粉、塊狀等化妝品劑型。
[0035] 本發(fā)明所述的南瓜籽肽粉用于制備預(yù)防或治療自由基過多引起的癥狀的食品、保健食品或藥品；用于制備預(yù)防、改善或者治療神經(jīng)相關(guān)疾病的食品、保健食品或者藥品；用于制備改善或治療記憶力衰退的食品、保健食品或藥品；用于改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠質(zhì)量的食品、保健食品或藥品；用于制備預(yù)防或治療緩解大腦或者運(yùn)動疲勞的食品、保健食品或藥品；用于制備增強(qiáng)免疫力的食品、保健食品或藥品；用于制備提高脂肪代謝的食品、保健食品或藥品；用于制備預(yù)防肌肉流失、修復(fù)肌肉損傷、增長肌肉組織的食品、保健食品或藥品；用于制備調(diào)節(jié)腸道有益菌群、提高腸胃動力、促進(jìn)營養(yǎng)吸收、潤腸通便的食品、保健食品或藥品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0036] (1)本發(fā)明將南瓜籽冷榨脫脂制備南瓜籽粕，發(fā)明人做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，與熱榨方法相比，冷榨后蛋白質(zhì)提取率高出5wt％左右，同時含量高出20wt％左右，與溶劑脫脂法相比，無溶劑殘留，對人體無害，工藝安全系數(shù)高。
[0037] (2)本發(fā)明使用高效逆流法提取南瓜籽蛋白，相比普通的堿提酸沉法，蛋白質(zhì)的提取率提高了10wt％以上，同時減少了用水量，節(jié)約生產(chǎn)成本。
[0038] (3)本發(fā)明僅使用蛋白復(fù)溶液進(jìn)行酶解，沒有將蛋白進(jìn)行干燥，這樣不僅減少了蛋白質(zhì)干燥時的損失，也簡化了制備工藝。
[0039] (4)本發(fā)明使用的蛋白酶均為食用酶，并且來源廣泛、成本低、添加量少。
[0040] (5)本發(fā)明僅用微濾膜進(jìn)行處理，沒有再使用超濾膜或者納濾膜再次純化，所得的南瓜籽肽粉，其分子量低，含量高，水溶性好，其水溶液澄清無雜質(zhì)，此外，微濾膜比超濾膜孔徑大很多，生產(chǎn)耗時短，更加適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0041] (6)本發(fā)明參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T?22492-2008附錄B和GB/T?22729-2008所述的肽含量和相對分子量分布的測定方法進(jìn)行檢測，此方法公認(rèn)度高。
附圖說明
[0042] 圖1：南瓜籽肽處理后斑馬魚腸道中的短乳桿菌生長的影響；
[0043] 圖2：南瓜籽肽對斑馬魚腦部巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響；
[0044] 圖3：南瓜籽肽對斑馬魚腦部吞噬墨汁巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響；
[0045] 圖4：南瓜籽肽處理后斑馬魚肌纖維H&E染色結(jié)果。實(shí)施例
[0046] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例所述方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。如無特別說明，實(shí)施例中用到的所有原料和溶劑均為市售產(chǎn)品。
[0047] 制備實(shí)施例1
[0048] 將南瓜籽冷榨脫油，得到脫脂南瓜籽粕，稱取100kg南瓜籽粕，記錄為A，加水1000L，調(diào)節(jié)pH至8.0～8.5于室溫提取1h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至8.0～8.5于室溫提取1h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提?。籄完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至8.0～8.5于室溫提取1h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取1h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為3.0～3.5，靜置0.5h，棄去上清液，最后往沉淀物中3000L的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；將南瓜籽蛋白液加熱至45℃，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入100g中性蛋白酶(酶活力為30萬u/g)，攪拌酶解3h后，煮沸滅活2min，得到蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.1μm的微濾膜進(jìn)行處理后，在70℃下濃縮至固含為3wt％時，噴霧干燥后，得到43kg南瓜籽肽粉(N-1)，產(chǎn)率43wt％。采用GB/T?22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為92.4％，小于1000Dalton分子量占95.0％。
[0049] 制備實(shí)施例2
[0050] 將南瓜籽冷榨脫油，得到脫脂南瓜籽粕，稱取100kg南瓜籽粕，記錄為A，加水500L，調(diào)節(jié)pH至11.0～11.5于室溫提取1h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至11.0～11.5于室溫提取1h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提?。籄完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至11.0～11.5于室溫提取1h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取1h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為4.0～4.5，靜置1h，棄去上清液，最后往沉淀物中2000L的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；將南瓜籽蛋白液加熱至45℃，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入100g木瓜蛋白酶(酶活力為40萬u/g)，攪拌酶解3h后，煮沸滅活5min，得到蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.5μm的微濾膜進(jìn)行處理后，在50℃下濃縮至固含為5wt％時，噴霧干燥后，得到45.4kg南瓜籽肽粉(N-2)，產(chǎn)率45.4wt％。采用GB/T?22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為90.1％，小于1000Dalton分子量占96.6％。
[0051] 制備實(shí)施例3
[0052] 將南瓜籽冷榨脫油，得到脫脂南瓜籽粕，稱取100kg南瓜籽粕，記錄為A，加水500L，調(diào)節(jié)pH至9.0～9.5于室溫提取0.5h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至9.0～9.5于室溫提取0.5h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提?。籄完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至9.0～9.5于室溫提取0.5h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取0.5h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為4.5～5.0，靜置2h，棄去上清液，最后往沉淀物中1000L的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；將南瓜籽蛋白液加熱至55℃，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入100g菠蘿蛋白酶(酶活力為30萬u/g)，攪拌酶解3h后，煮沸滅活5min，得到蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.5μm的微濾膜進(jìn)行處理后，在50℃下濃縮至固含為5wt％時，真空干燥后得到41.5kg南瓜籽肽粉(N-3)，產(chǎn)率41.5wt％。采用GB/T?22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為91.1％，小于1000Dalton分子量占95.4％。
[0053] 制備實(shí)施例4
[0054] 將南瓜籽冷榨脫油，得到脫脂南瓜籽粕，稱取100kg南瓜籽粕，記錄為A，加水1000L，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提??；A完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取0.5h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為4.0～4.5，靜置1h，棄去上清液，最后往沉淀物中3000L的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；將南瓜籽蛋白液加熱至50℃，將pH值調(diào)節(jié)至8.0～9.0，加入100g堿性蛋白酶(酶活力為20萬u/g)，攪拌酶解5h后，煮沸滅活
3min，得到蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為10μm的微濾膜進(jìn)行處理后，在50℃下濃縮至固含為3wt％時，冷凍干燥后得到43kg南瓜籽肽粉(N-4)，產(chǎn)率43wt％。采用GB/T?22492-
2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為92.3％，小于1000Dalton分子量占96.2％。
[0055] 制備實(shí)施例5
[0056] 將南瓜籽冷榨脫油，得到脫脂南瓜籽粕，稱取100kg南瓜籽粕，記錄為A，加水1000L，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；提取完成后，過濾，濾渣進(jìn)行二次提取，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為B，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次提??；A完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的南瓜籽粕，記錄為C，調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0于室溫提取0.5h；B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取0.5h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為4.0～4.5，靜置1h，棄去上清液，最后往沉淀物中2000L的水，攪拌均勻，得到南瓜籽蛋白液；將南瓜籽蛋白液加熱至45℃，將pH值調(diào)節(jié)至8.0～9.0，加入100g胰蛋白酶(酶活力為20萬u/g)，攪拌酶解4h后，煮沸滅活2min，得到蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為5μm的微濾膜進(jìn)行處理后，在60℃下濃縮至固含為5wt％時，冷凍干燥后得到43.4kg南瓜籽肽粉(N-5)，產(chǎn)率43.4wt％。采用GB/T?22492-
2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為90.6％，小于1000Dalton分子量占98.4％。
[0057] 生物活性實(shí)施例1(抗氧化作用評價)
[0058] 1.ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)
[0059] PBS緩沖液的配制：稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，十二水合磷酸氫二鈉3.62g，置于1000mL燒杯中，加入800mL蒸餾水，攪怑使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。
[0060] ABTS+貯存溶液的配制：精密稱取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸餾水，超聲5min，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精密稱取過硫酸鉀76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸餾水，超聲使其溶解，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確吸取352μL過硫酸鉀溶液加入至ABTS溶液中，搖勻，靜置過夜。
[0061] ABTS+工作溶液的配制：精確吸取貯存溶液1mL，加入65mL左右PBS緩沖液，搖勻。
[0062] 供試品溶液的配制：取南瓜籽肽粉(N-1)適量，精密稱定，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL?PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0063] 操作步驟：準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL?ABTS工作溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL?PBS緩沖液混合均勻；準(zhǔn)確吸取5mL?ABTS工作溶液和0.5mL?PBS緩沖液混合均勻，立即在734nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率：
[0064] IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
[0065] 其中，Ai表示待測溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
[0066] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0067] A0表示ABTS和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0068] 2.SRSA超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)
[0069] 0.1moL/L?PBS緩沖液(pH?7.4)的配制：稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸二氫鉀2.4g，三水合磷酸氫二鉀23.1g，置于1000mL燒杯中，加入600mL蒸餾水，攪怑使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。
[0070] 150μmoL/L?NBT溶液的配制：準(zhǔn)確稱取NBT?12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0071] 60μmoL/L?PMS溶液的配制：準(zhǔn)確稱取PMS?18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0072] 468μmoL/L?NADH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取NADH?33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0073] 供試品溶液的配制：取南瓜籽肽粉(N-1)適量，精密稱定，加水超聲溶解，混勻，待測。
[0074] 工作液的配制：取1mL?0.1moL/L?PBS緩沖液(pH?7.4)于容量瓶中，加入1mL?150μmoL/L?NBT溶液，加入2mL?468μmoL/L?NADH溶液，加入1mL?60μmoL/L?PMS溶液，攪拌均勻，25℃下反應(yīng)5min，與560nm波長處測定其吸光度值。
[0075] 操作步驟：準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL上述工作溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL蒸餾水混合均勻；準(zhǔn)確吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸餾水混合均勻，立即在560nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率：
[0076] IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
[0077] 其中，Ai表示待測溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
[0078] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0079] A0表示SRSA和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0080] 配制南瓜籽肽粉(N-1)濃度為500μg/mL和1000μg/mL，以維生素C為陽性對照(濃度為100μg/mL)，測試結(jié)果如表1所示：
[0081] 表1南瓜籽肽粉清除自由基測試結(jié)果
[0082]
[0083] 由表1可知，本發(fā)明方法所制備的南瓜籽肽對ABTS和SRSA自由基顯示了較好的清除作用，具有較好的抗氧化活性。
[0084] 生物活性實(shí)施例2(神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用評價)
[0085] 使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，細(xì)胞傳代時用0.125％的胰酶消化約50s，用含10％血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，加入新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻。以105個/mL的細(xì)胞密度傳代。每瓶細(xì)胞加入4mL含細(xì)胞的培養(yǎng)液。在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。PC12細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至融合狀態(tài)，采用0.125％胰蛋白酶溶液消化，并反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液，以含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋成1.0×105個/mL，每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板中，每組5-6個復(fù)孔，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h，成融合狀態(tài)。
[0086] 96孔板于各孔中以一定濃度梯度分別給予藥物100μL，培養(yǎng)24h后，MTT法檢測細(xì)胞活力。50mg?MTT溶解于10mL?PBS，0.22μm微孔濾膜過濾。臨用前稀釋到0.5mg/mL。各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每加入0.5mg/mL?MTT，37℃，5％CO2條件下孵育3h，除去MTT工作液，每孔加入150μL?DMSO溶解結(jié)晶，振搖10min，測定每孔的OD值(測定波長570nm，參比波長650nm)。以對照組OD值平均值為100％細(xì)胞活力，計(jì)算模型組和給藥組的細(xì)胞活力。
[0087] 實(shí)驗(yàn)分組：1)空白組(高糖DMEM)；2)模型組(高糖DMEM培養(yǎng)3h，再加入H2O2使其終濃度為100μM，刺激1h)；3)陽性藥(NAC)組：先加入含一定濃度(500μM)陽性藥NAC的高糖DMEM培養(yǎng)3h，再加100μM?H2O2刺激1h；4)給藥組：先加入含各濃度梯度藥物的高糖DMEM培養(yǎng)3h，再加100μM?H2O2刺激1h。上述各組于相同條件下培養(yǎng)，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用MTT法檢測細(xì)胞活力，測定結(jié)果如表2和表3所示。
[0088] 表2南瓜籽肽對正常PC12細(xì)胞活力的影響
[0089]
[0090] 注： n＝6，*p<0.05，與對照組比較
[0091] 表3南瓜籽肽對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的影響
[0092]
[0093] 注： n＝6，###p<0.001與對照組比較；*p<0.05，***p<0.001，與模型組比較[0094] 由表2可知，南瓜籽肽在濃度為1～500μg/mL時對PC12細(xì)胞沒有明顯毒性，而在濃度為300～500μg/mL時，對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用，有以上結(jié)果可知，南瓜籽肽對神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。
[0095] 生物活性實(shí)施例3(腸道菌群調(diào)節(jié)作用評價)
[0096] 使用CM-DiI標(biāo)記短乳桿菌，以6×106個/mL濃度短乳桿菌飼喂5dpf無菌野生型AB品系斑馬魚，建立斑馬魚腸道共生性細(xì)菌模型；將飼喂短乳桿菌的無菌斑馬魚放置35℃培養(yǎng)至6dpf。6dpf時，移除短乳桿菌并隨機(jī)分配至6孔板中，每孔30尾，每孔養(yǎng)魚水容量為3mL。用水溶南瓜籽肽粉(N-1)濃度為2000μg/mL，同時設(shè)置模型對照組和正常對照組。將各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)6h后，每個實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下采集圖片，計(jì)算斑馬魚腸道內(nèi)短乳桿菌熒光強(qiáng)度(S，該熒光強(qiáng)度表示腸道短乳桿菌數(shù)量)，以熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果評價南瓜籽肽粉對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。公式如下：公式如下：腸道菌群調(diào)節(jié)作用(％)＝(S供試品-S模型組)/S模型組×100％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析和T檢驗(yàn)，p<0.05表明具有顯著性差異，結(jié)果如表4所示。
[0097] 表4南瓜籽肽粉對腸道內(nèi)短乳桿菌調(diào)節(jié)作用(n＝10)
[0098]
[0099] 與模型對照組比較，**p<0.01；
[0100] 由表4可知，模型對照組斑馬魚腸道熒光強(qiáng)度為4189048像素，與正常對照組(1517330像素)比較p<0.001，表明腸道內(nèi)有短乳桿菌生存，模型建立成功。南瓜籽肽粉濃度為2000μg/mL時，斑馬魚腸道熒光強(qiáng)度為5390602像素，與模型對照組418904像素比較p<0.01，腸道菌群調(diào)節(jié)作用為29％。表明南瓜籽肽粉可以明顯促進(jìn)腸道內(nèi)短乳桿菌的生長，對腸道菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用。
[0101] 生物活性實(shí)施例4(改善睡眠作用評價)
[0102] 隨機(jī)選取受精后5天(5dpf)正常野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔(即每實(shí)驗(yàn)組)30尾，用水溶給予南瓜籽肽(N-1)42μg/mL，陽性對照藥奧沙西泮100μM濃度，同時設(shè)置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)容量為3mL。供試品處理24h后，將斑馬魚轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔(即每濃度組)1尾，除正常對照組外，其余實(shí)驗(yàn)組用PTZ(戊四唑)誘導(dǎo)斑馬魚建立失眠模型，每個實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚，應(yīng)用行為分析儀測定斑馬魚的失眠時間(T)和運(yùn)動距離(D)，以運(yùn)動距離和失眠時間評價供試品對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚失眠癥的鎮(zhèn)靜催眠作用。供試品對失眠癥斑馬魚的鎮(zhèn)靜作用和睡眠改善作用的計(jì)算公式如下：鎮(zhèn)靜作用(％)＝(D模型組-D供試品組)/(D模型組-D正常組)×100％；改善作用(％)＝(T模型組-T供試品組)/(T模型組-T正常組)×100％，用方差分析和Dunnett’s?T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和6所示。
[0103] 表5南瓜籽肽對斑馬魚鎮(zhèn)靜作用定量數(shù)據(jù)(n＝10)
[0104]
[0105] 與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
[0106] 由表5可知，模型對照組斑馬魚運(yùn)動距離(1552mm)與正常對照組(133mm)比較p<0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥奧沙西泮100μM濃度組斑馬魚運(yùn)動距離為432mm，與模型對照組比較p<0.001，鎮(zhèn)靜作用為79％，說明奧沙西泮對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚失眠具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。
[0107] 南瓜籽肽在濃度為42μg/mL時，斑馬魚運(yùn)動距離為988mm，鎮(zhèn)靜作用為40％，與模型對照組比較p<0.01，提示南瓜籽肽對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚失眠癥具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。
[0108] 表6南瓜籽肽對斑馬魚睡眠改善作用定量數(shù)據(jù)(n＝10)
[0109]
[0110] 與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001
[0111] 由表6可以看出，模型對照組斑馬魚失眠時間(44.4s)與正常對照組(5.8s)比較p<0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥奧沙西泮100μM濃度組斑馬魚失眠時間為19.6s，與模型對照組比較p<0.001，睡眠改善作用為64％，說明奧沙西泮對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚失眠具有明顯的改善作用。
[0112] 南瓜籽肽在濃度為42μg/mL時，斑馬魚失眠時間為26.1s，睡眠改善作用為47％，與模型對照組比較p<0.01，提示南瓜籽肽在42μg/mL濃度下對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚失眠癥具有明顯的睡眠改善作用。
[0113] 生物活性實(shí)施例5(增強(qiáng)肌纖維作用評價)
[0114] 隨機(jī)選取150尾受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔均處理30尾斑馬魚，用無水乙醇誘導(dǎo)斑馬魚建立酒精性肌損傷模型。分別水溶給予南瓜籽肽(N-1)濃度為125μg/mL，同時設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔藥液容量為3mL。除正常對照組外，其余實(shí)驗(yàn)組分別與無水乙醇共同處理30h。供試品處理結(jié)束后，對斑馬魚進(jìn)行H&E染色(固定-脫水-包埋-切片-染色)，并進(jìn)行病理學(xué)分析，如圖4所示。
[0115] 如圖4所示，正常對照組斑馬魚骨骼肌細(xì)胞呈均一長條狀，且橫紋清晰；模型對照組肌纖維松弛伴炎細(xì)胞浸潤，但無壞死。南瓜籽肽組肌纖維呈均一長條狀，橫紋清晰，且無肌炎或壞死，與正常對照組相似，提示在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，南瓜籽肽具有肌纖維保護(hù)作用。
[0116] 生物活性實(shí)施例6(增強(qiáng)免疫作用評價)
[0117] 1.對巨噬細(xì)胞減少癥的改善作用評價
[0118] 隨機(jī)選取150尾受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，靜脈竇注射酒石酸長春瑞濱建立斑馬魚巨噬細(xì)胞減少癥模型。用水溶給予南瓜籽肽濃度為31.25μg/mL濃度，同時設(shè)置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理30尾斑馬魚，每孔容量為3mL。各實(shí)驗(yàn)組均置于28℃培養(yǎng)箱孵育過夜，加入2.5μg/mL中性紅工作液對斑馬魚進(jìn)行活體染色，染色結(jié)束后每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚頭部巨噬細(xì)胞數(shù)量(N)，以巨噬細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評價供試品對巨噬細(xì)胞減少癥的改善作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示。巨噬細(xì)胞減少癥的改善作用計(jì)算公式為：巨噬細(xì)胞減少癥改善作用(％)＝(N供試品組-N模型對照組)/N模型對照組×100％，用T-test檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異，結(jié)果如表7所示。
[0119] 表7各實(shí)驗(yàn)組對斑馬魚巨噬細(xì)胞減少癥的改善作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝10)
[0120]
[0121]
[0122] 與模型對照組比較，***p<0.001
[0123] 由表7可知，模型對照組斑馬魚頭部巨噬細(xì)胞數(shù)量(25個)與正常對照組(47個)比較p<0.001，提示斑馬魚巨噬細(xì)胞減少癥模型構(gòu)建成功。南瓜籽肽組斑馬魚頭部巨噬細(xì)胞數(shù)量為43個，與模型對照組比較均p<0.001，改善作用為72％。提示在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，南瓜籽肽對斑馬魚巨噬細(xì)胞減少癥具有明顯的改善作用。
[0124] 2.對巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用評價
[0125] 隨機(jī)選取120尾受精后3天(3dpf)黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，靜脈注射墨汁建立斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能模型。用水溶給予南瓜籽肽濃度為31.25μg/mL，同時設(shè)置模型對照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理30尾斑馬魚，每孔容量為3mL。各組均置于28℃培養(yǎng)箱孵育過夜，加入2.5μg/mL中性紅工作液對斑馬魚進(jìn)行活體染色，染色后每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚頭部吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)量(N)，以吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評價供試品對巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示。巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用計(jì)算公式為：吞噬功能促進(jìn)作用(％)＝(N供試品組-N模型對照組)/N模型對照組×100％，用T-test檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異，結(jié)果如表8所示。
[0126] 表8南瓜籽肽對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝10)
[0127]
[0128] 與模型對照組比較，***p<0.001
[0129] 由表8可知，南瓜籽肽組斑馬魚頭部吞噬了墨汁信號的巨噬細(xì)胞數(shù)量均為22個，與模型對照組比較均p<0.001，吞噬功能促進(jìn)作用為38％，提示在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，南瓜籽肽對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能均具有明顯的促進(jìn)作用。
[0130] 生物活性實(shí)施例7(抗疲勞作用評價)
[0131] 隨機(jī)選取540尾受精后4天(4dpf)野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)30尾，用水溶給予南瓜籽肽(N-1)濃度為125μg/mL，陽性對照藥中華跌打丸1000μg/mL濃度，同時設(shè)置正常對照組(即養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)容量為3mL，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個平行濃度。預(yù)處理24h后，除正常對照組外，其余實(shí)驗(yàn)組均同時水溶給予亞硫酸鈉以誘發(fā)斑馬魚疲勞模型。供試品和亞硫酸鈉共同處理斑馬魚一段時間后，每個實(shí)驗(yàn)組將3個平行實(shí)驗(yàn)組中的斑馬魚匯集在一起(共90尾)，按照乳酸測定試劑盒說明書，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)間接測定斑馬魚體內(nèi)乳酸含量，定量評價南瓜籽肽對亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚體內(nèi)的乳酸含量的影響，并計(jì)算乳酸含量減少率。南瓜籽肽對斑馬魚體內(nèi)乳酸影響計(jì)算公式為：乳酸含量減少率(％)＝(C模型組-C供試品)/(C模型組-C正常對照組)×
100％，用T-test檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異，結(jié)果如表9所示。
[0132] 表9南瓜籽肽對斑馬魚體內(nèi)乳酸含量的評價結(jié)果
[0133]
[0134] 與模型對照組比較，**p<0.01，***p<0.001。
[0135] 由表9可知，模型對照組斑馬魚體內(nèi)乳酸含量(0.750mmol/gprot)與正常對照組(0.259mmol/gprot)比較p<0.001，提示模型建立成功；陽性對照藥中華跌打丸斑馬魚體內(nèi)乳酸含量為0.369mmol/gprot，與模型對照組比較p<0.001，其乳酸含量減少率為77.6％，提示中華跌打丸能顯著減少亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚體內(nèi)的乳酸含量。
[0136] 南瓜籽肽組斑馬魚體內(nèi)乳酸含量為0.488mmol/gprot，其乳酸含量減少率為53.4％，與模型對照組比較p<0.001，提示南瓜籽肽能顯著減少亞硫酸鈉誘發(fā)的疲勞斑馬魚的乳酸。
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