黃酮類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用
閱讀：1023發(fā)布：2020-12-01
專利匯可以提供黃酮類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 提供了黃 酮 類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可調(diào)節(jié)各T淋巴細(xì)胞亞群的比例，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)效應(yīng)，進(jìn)而用于 治療 相關(guān)病理損傷。具體而言，可下調(diào)CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞亞群、CD4+IL-17+Th17細(xì)胞亞群及CD4+CD3e+CD62L+Th0細(xì)胞亞群的比例，上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群的比例。白楊素能夠維持EAU小鼠血 視網(wǎng)膜 屏障完整性，抑制巨噬細(xì)胞浸潤，抑制眼內(nèi) 炎癥 反應(yīng)。同時(shí)能夠抑制視網(wǎng)膜STAT1、STAT3及其磷 酸化 蛋白表達(dá)量?；邳S酮類化合物的以上新性質(zhì)，可應(yīng)用其治療以T細(xì)胞各亞群比例失衡為效應(yīng)的多種 疾病 。，下面是黃酮類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用專利的具體信息內(nèi)容。
1.式(1)化合物用于制備哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物的應(yīng)用，
其中：
R1是氫或羥基；R2是氫、羥基或甲氧基；R3是氫或羥基；R4是氫或羥基；R5是氫或羥基；R6是氫或羥基；R7是氫或羥基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物是白楊素、芹菜素、木犀草素、黃芩素或野黃芩素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物是槲皮素、楊梅黃酮或山奈酚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是降低CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞亞群或CD4+IL-17+Th17細(xì)胞亞群或CD4+CD3e+CD62L+Th0細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是提升CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th1分泌IFN-γ或抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th17分泌IL-17A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th1分泌IFN-γ或抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th17分泌IL-17A，是通過抑制STAT1途徑或抑制STAT3途徑實(shí)現(xiàn)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物還抑制巨噬細(xì)胞浸潤至哺乳動(dòng)物玻璃體或視網(wǎng)膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物是以T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)為治療通路的自身免疫疾病治療藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述自身免疫疾病是葡萄膜炎。
黃酮類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及物質(zhì)的新的醫(yī)藥用途，具體涉及黃酮類化合物在制備T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
[0002] 黃酮類化合物泛指具有兩個(gè)芳環(huán)通過三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，狹義而言是指基本母核具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一系列化合物。現(xiàn)有技術(shù)中研究表明，狹義的黃酮類化合物或黃酮醇具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎癥反應(yīng)、抗過敏、抗氧化應(yīng)激及心血管保護(hù)作用等，因此被用作為腫瘤及一些炎癥性疾病的治療。盡管具有如此廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，但此類物質(zhì)的抗炎作用機(jī)制尚未明確，近年來有研究表明，部分黃酮類化合物可能通過NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其抗炎癥的生物學(xué)效應(yīng)。作為NF-κB抑制劑，通過下調(diào)NF-κB通路調(diào)控下的多種炎癥因子發(fā)揮抗炎作用。另外，部分黃酮類化合物作為植物組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)，能夠調(diào)節(jié)植物組蛋白去乙?；?HDAC)的活性，而后者在體內(nèi)能夠移除組蛋白的乙?；瘹埢菇M蛋白DNA構(gòu)像更加穩(wěn)定，抑制組蛋白DNA的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的增殖、凋亡、移行、分化中起重要作用。HDACi已被美國食品藥品管理局證明具有抗腫瘤作用，而越來越多的研究表明，HDACi具有抗炎癥作用，而這種作用有可能是通過促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。
[0003] T細(xì)胞是相當(dāng)復(fù)雜的不均一體、在體內(nèi)不斷更新、在同一時(shí)間可以存在不同發(fā)育階段或功能的亞群，但分類原則較為多樣。按免疫應(yīng)答中的功能不同，可將T細(xì)胞分成若干亞群，一致公認(rèn)的有：輔助性T細(xì)胞，抑制性T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞，遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細(xì)胞，放大T細(xì)胞，記憶T細(xì)胞等。由于具有不同的功能特征，因此T細(xì)胞各亞群在人體內(nèi)的比例狀態(tài)影響著免疫系統(tǒng)的效應(yīng)，T細(xì)胞亞群的失衡往往導(dǎo)致可見的癥狀，相應(yīng)的，存在諸多以T細(xì)胞亞群失衡為機(jī)理的疾病，因此，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞各亞群的比例狀態(tài)成為此類疾病重要的治療靶點(diǎn)。
[0004] 葡萄膜炎是眼科常見的致盲眼病之一。按照病因可分為感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎。其中，非感染性葡萄膜炎被認(rèn)為是一類自身免疫性眼病?，F(xiàn)有技術(shù)中對(duì)葡萄膜炎的治療方法主要為散瞳、抗炎和免疫治療，其中散瞳和抗炎主 要是針對(duì)癥狀所采取的治療手段，而免疫治療更側(cè)重于去除病因?，F(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)葡萄膜炎的免疫治療藥物主要為免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤通過競爭性的抑制腺嘌呤和鳥嘌呤，從而抑制DNA合成及RNA轉(zhuǎn)錄，減少外周T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞數(shù)量，抑制免疫淋巴反應(yīng)，而環(huán)磷酰胺對(duì)于靜止期和分裂期的淋巴細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性作用，從而抑制免疫反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容
[0005] 本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供黃酮類化合物的一種新用途；
[0006] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供可用于T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)的新藥物；
[0007] 本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是緩解因th1細(xì)胞分泌IFN-γ，IFN-γ激活并募集巨噬細(xì)胞所造成的病理損傷。
[0008] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是緩解因th17細(xì)胞分泌IL-17A、IL-1β，IL-17A、IL-1β激活并募集巨噬細(xì)胞所造成的病理損傷。
[0009] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是促進(jìn)因Treg細(xì)胞分泌TGF-β、IL-10，TGF-β、IL-10起到抗炎作用的效應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是緩解因巨噬細(xì)胞的浸潤對(duì)眼部組織所造成的炎性損傷。
[0011] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄膜炎的治療。
[0012] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0015] 其中：
[0016] R1是氫或羥基；R2是氫、羥基或甲氧基；R3是氫或羥基；R4是氫或羥基；R5是氫或羥基；R6是氫或羥基；R7是氫或羥基。
[0017] 優(yōu)選的，所述化合物黃酮類化合物；進(jìn)一步優(yōu)選的，是白楊素、芹菜素、木 犀草素、黃芩素或野黃芩素；更優(yōu)的是白楊素。
[0018] 優(yōu)選的，所述化合物是黃酮醇類化合物；進(jìn)一步優(yōu)選的，是槲皮素、楊梅黃酮或山奈酚。
[0019] 優(yōu)選的，所述化合物是金合歡素或香葉木素。
[0020] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是降低CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例。
[0021] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是是降低CD4+IL-17+Th17細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例。
[0022] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是是降低CD4+CD3e+CD62L+Th0細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述降低作用是通過抑制抗原呈遞細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)的；更優(yōu)的，所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
[0023] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是提升CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群在T淋巴細(xì)胞中的比例。
[0024] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)CD4+Th0細(xì)胞的分化。
[0025] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th1分泌IFN-γ；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th1分泌IFN-γ，是通過抑制STAT1途徑或抑制STAT3途徑或抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
[0026] 優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)是抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th17分泌IL-17A；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述抑制輔助T淋巴細(xì)胞Th17分泌IL-17A，是通過抑制STAT1途徑或抑制STAT3途徑或抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
[0027] 優(yōu)選的，所述藥物還抑制巨噬細(xì)胞浸潤至哺乳動(dòng)物玻璃體或視網(wǎng)膜。
[0028] 優(yōu)選的，所述藥物還維持哺乳動(dòng)物血-視網(wǎng)膜屏障完整性或維持哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜血管完整性。
[0029] 優(yōu)選的，所述藥物還降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-1β或TNF-α的表達(dá)量。
[0030] 優(yōu)選的，所述藥物還提升哺乳動(dòng)物體內(nèi)TGF-β的表達(dá)量。
[0031] 在以上任一項(xiàng)技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)藥物是以T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)為治療通路的自身免疫疾病治療藥物；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述自身免疫疾病是葡萄膜炎。所述治療通路是指藥理作用的目標(biāo)，通過對(duì) 該目標(biāo)的改善進(jìn)而對(duì)該疾病起到治療作用。
[0032] 在以上任一項(xiàng)技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物是嚙齒目動(dòng)物或靈長目動(dòng)物；更優(yōu)的，是人或小鼠。
[0033] 優(yōu)選的，所述藥物的應(yīng)用方法是口服給藥；在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步執(zhí)行以下優(yōu)選：給藥劑量是25mg/kg·d；給藥持續(xù)時(shí)間是15～30d。
[0034] 在以上技術(shù)方案中，涉及新用途的物質(zhì)主要選自黃酮類、黃酮醇類，包括但不限于如下表1中列出的典型化合物。
[0035] 表1本發(fā)明效果較佳的典型化合物信息
[0036]
[0037]
[0038] 此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以圣草酚、柚皮素等為代表的二氫黃酮類化合物、以大豆黃素、染料木素等為代表異黃酮類化合物對(duì)上述淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)作用也有效果，因此也可用作為相應(yīng)藥物的制備。
[0039] 本發(fā)明創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可調(diào)節(jié)各T淋巴細(xì)胞亞群的比例，從而+ +調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)效應(yīng)，進(jìn)而用于治療相關(guān)病理損傷。具體而言，可下調(diào)CD4IFN-γTh1+ + + + +
細(xì)胞亞群、CD4IL-17Th17細(xì)胞亞群及CD4CD3eCD62LTh0細(xì)胞亞群的比例，上調(diào)+ + +
CD4CD25Foxp3Treg細(xì)胞亞群的比例。白楊素能夠維持EAU小鼠血視網(wǎng)膜屏障完整性，抑制巨噬細(xì)胞浸潤，抑制眼內(nèi)炎癥反應(yīng)。同時(shí)能夠抑 制視網(wǎng)膜STAT1、STAT3及其磷酸化蛋白表達(dá)量，抑制NF-κBp65的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其抗炎癥作用是通過抑制STAT1、STAT3途徑及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
細(xì)胞亞群、CD4IL-17Th17細(xì)胞亞群及CD4CD3eCD62LTh0細(xì)胞亞群的比例，上調(diào)+ + +
CD4CD25Foxp3Treg細(xì)胞亞群的比例。白楊素能夠維持EAU小鼠血視網(wǎng)膜屏障完整性，抑制巨噬細(xì)胞浸潤，抑制眼內(nèi)炎癥反應(yīng)。同時(shí)能夠抑 制視網(wǎng)膜STAT1、STAT3及其磷酸化蛋白表達(dá)量，抑制NF-κBp65的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其抗炎癥作用是通過抑制STAT1、STAT3途徑及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
[0040] 基于黃酮類化合物的以上新性質(zhì)，可應(yīng)用其治療以T細(xì)胞各亞群比例失衡為效應(yīng)的多種疾病，其中又以葡萄膜炎治療效果較佳。
[0041] 在優(yōu)選技術(shù)方案中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在黃酮母核基礎(chǔ)上，在其R5、R7位置羥基取代的產(chǎn)物具有更優(yōu)的治療效果；而R4位置羥基取代所得到的黃芩素、野黃芩素具有療效但體內(nèi)代謝特性與其他黃酮類化合物不盡相同；在R2位置以甲氧基取代能夠提升療效。此外本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他黃酮類化合物，白楊素具有最優(yōu)的治療效果。附圖說明
[0042] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠眼底圖像；其中A部分為對(duì)照組小鼠眼底表現(xiàn)，B部分為白楊素治療組小鼠眼底表現(xiàn)。
[0043] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠臨床評(píng)分結(jié)果。
[0044] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜HE染色圖像；其中A部分為對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜切片HE染色圖像，B部分為白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜切片HE染色圖像。
[0045] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠組織學(xué)評(píng)分結(jié)果。
[0046] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片；其中A部分為對(duì)照組小鼠結(jié)果，B部分為白楊素治療組小鼠結(jié)果。
[0047] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。
[0048] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。
[0049] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠免疫組織化學(xué)染色圖像；其中A部分為對(duì)照組小鼠結(jié)果，B部分為白楊素治療組小鼠結(jié)果。
[0050] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠免疫熒光染色圖像，其中A部分為對(duì)照組小鼠結(jié)果，B部分為白楊素治療組小鼠結(jié)果。
[0051] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜iNOS蛋白 及mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。
[0052] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色圖像；其中A部分為對(duì)照組小鼠結(jié)果，B部分為白楊素治療組小鼠結(jié)果。
[0053] 圖12是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠輔助T淋巴細(xì)胞亞群分布情況圖。
[0054] 圖13是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠炎性因子mRNA表達(dá)量檢測結(jié)果。
[0055] 圖14是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜炎性因子蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果。
[0056] 圖15是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜p65蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果。
[0057] 圖16是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)照組小鼠和白楊素治療組小鼠視網(wǎng)膜STAT通路蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
[0058] 以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0059] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0060] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
[0061] 1小鼠EAU(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎，Experimental autoimmune uveoretinitis)模型的建立
[0062] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選取及飼養(yǎng)
[0063] 6-8周齡雌性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠48只，體重15-20g。全部小鼠飼養(yǎng)于標(biāo) 準(zhǔn)化無特定病原體動(dòng)物(SPF)級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水攝食，室溫為(22±2)℃，相對(duì)濕度為40％-60％。適應(yīng)性飼養(yǎng)2-7d后用于實(shí)驗(yàn)。
[0064] 1.2EAU小鼠模型制作原理
[0065] IRBP1-20多肽通過誘發(fā)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，損傷小鼠視網(wǎng)膜組織，引起實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。
[0066] 1.3EAU小鼠模型的制備
[0067] 皮下注射乳化的IRBP1-20于模型組小鼠一側(cè)后足掌墊、雙側(cè)尾根及后臀部，共注射抗原300μg，同時(shí)腹腔內(nèi)注射百日咳菌液1μg破壞小鼠的全身免疫耐受，以增強(qiáng)免疫效果，免疫當(dāng)天記作第0天(day 0)。
[0068] 2白楊素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的治療作用及藥理研究
[0069] 本節(jié)中以第一節(jié)制備的EAU小鼠模型作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象驗(yàn)證白楊素對(duì)其治療效果，并考查其藥理作用機(jī)制。
[0070] 2.1實(shí)驗(yàn)方法
[0071] 2.1.1EAU小鼠的飼養(yǎng)條件
[0072] 飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化無特定病原體動(dòng)物(SPF)級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，室溫為(22±2)℃，相對(duì)濕度為40％-60％。
[0073] 2.1.2給藥方式和具體途徑
[0074] 自免疫造模前3天(day-3)開始以25mg/kg·day的劑量每日連續(xù)對(duì)白楊素組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，直至免疫造模后第21天(day 21)。由于白楊素為有機(jī)化合物，溶于有機(jī)溶劑DMSO而不溶于PBS，故白楊素以10μlDMSO+140μlPBS溶解，對(duì)照組采用同樣的方式以空白溶媒10μlDMSO+140μlPBS灌胃處理。
[0075] 2.1.3白楊素對(duì)小鼠EAU病變臨床治療效果觀察
[0076] 于免疫后第12天(day 12)起每日連續(xù)觀察對(duì)照組及白楊素組小鼠眼底損傷情況，方法為：復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，使用雙目間接檢眼鏡，輔助+90D前置鏡暗室檢查。
[0077] 于免疫后第21天(day 21)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行小鼠眼底損傷的臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。由兩位眼科醫(yī)師共同對(duì)所有小鼠雙側(cè)眼底損傷情況進(jìn)行隨機(jī)雙盲打分。
[0078] 表2C57BL/6J小鼠EAU模型臨床評(píng)分
[0079]
[0080] 2.1.4小鼠眼底圖像采集
[0081] 于免疫后第21天(day 21)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行眼底圖像采集。用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳、鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，角膜表面涂以醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，上覆蓋玻片消除角膜曲率的影響。以0度耳鏡窺入眼底，計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)采集眼底圖像。
[0082] 2.1.5視網(wǎng)膜切片的HE染色及組織病理學(xué)評(píng)分
[0083] 2.1.5.1視網(wǎng)膜切片的HE染色
[0084] 2.1.5.1.1取材
[0085] 免疫后第21天(day 21)處死小鼠，完整取出小鼠眼球。
[0086] 2.1.5.1.2石蠟切片制備
[0088] (2)脫水：眼球依次浸入75％酒精、85％酒精、95％酒精Ⅰ、95％酒精Ⅱ、95％酒精Ⅲ、無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ、無水酒精Ⅲ。
[0089] (3)透明：眼球依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
[0090] (4)浸蠟：將眼球放入預(yù)熱的包埋盒中(含部分熔化的石蠟)，繼續(xù)加入熔化的石蠟至組織全部浸沒。
[0091] (5)冷卻：將包埋盒置入4℃冰箱中充分冷卻后取出。
[0092] (6)將包埋好的蠟塊，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5μm，制成石蠟切片。
[0093] 2.1.5.1.3HE染色
[0095] (2)蘇木精染色5min，自來水洗lmin；
[0096] (3)1％鹽酸酒精分化30s，自來水洗lmin，PBS返藍(lán)30s，自來水洗lmin；
[0097] (4)伊紅染色2min；自來水洗3min；
[0098] (5)梯度酒精脫水，二甲苯透明；
[0099] (6)中性樹脂膠封片，光鏡下觀察并拍照。
[0100] 2.1.5.2組織病理學(xué)評(píng)分
[0101] 分別取對(duì)照組和白楊素組小鼠眼球的HE染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜及玻璃體腔的組織結(jié)構(gòu)、炎性細(xì)胞浸潤情況，并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。由兩位眼科病理學(xué)醫(yī)師共同對(duì)兩組小鼠眼球切片分別進(jìn)行隨機(jī)雙盲打分。
[0102] 表3C57BL/6J小鼠EAU模型組織病理學(xué)評(píng)分
[0103]
[0104] 2.1.6伊文思藍(lán)(EB)血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片
[0105] 于免疫后第21天(day 21)將EAU對(duì)照組和白楊素組分別取4只小鼠，進(jìn)行EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片。
[0106] (1)麻醉：稱重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉；
[0107] (2)EB注射：29G針頭穿刺入尾靜脈內(nèi)注射2％EB 100μl，循環(huán)2小時(shí)；
[0108] (3)固定：處死小鼠，摘取眼球，置于濃度為4％多聚甲醛溶液中固定3小時(shí)；
[0109] (4)剝離視網(wǎng)膜：在手術(shù)顯微鏡下用角鞏膜剪于眼球角鞏膜緣后約0.5mm處剪開，除去角膜、虹膜，娩出晶狀體和玻璃體。將視網(wǎng)膜以視盤為中心放射狀剪開4刀，置于載玻片上，用顯微有齒鑷小心將鞏膜翻轉(zhuǎn)，完整分離出視網(wǎng)膜，平鋪于載玻片上；
[0110] (5)封片：滴少許封片劑后以蓋玻片封片；
[0111] (6)照相：立即置于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察、照相。
[0112] 2.1.7視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色
[0113] 2.1.7.1取材
[0114] 免疫后第21天(day 21)處死小鼠，完整取出小鼠眼球。
[0115] 2.1.7.2石蠟切片制備
[0116] (1)10％甲醛+5％冰乙酸溶液固定眼球，過夜，生理鹽水沖洗眼球；
[0117] (2)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、冷卻(方法同第一部分)。
[0118] (3)將包埋好的蠟塊，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5μm，制成石蠟切片。
[0119] 2.1.7.3免疫組織化學(xué)染色
[0121] (2)二甲苯脫臘(二甲苯Ⅰ10分鐘、二甲苯Ⅱ10分鐘)，梯度酒精水化(100％乙醇Ⅰ5分鐘、100％乙醇Ⅱ5分鐘、95％乙醇10分鐘、80％乙醇10分鐘)，自來水洗1min，蒸餾水洗1min；
[0123] (4)將切片置于3％H2O2，水平震蕩5min，蒸餾水洗5min
[0124] (5)加入5％BSA封閉液，室溫孵育1h，甩掉封閉液；
[0125] (6)滴加50μl一抗F4/80抗體(1：200稀釋)，置于濕盒中4℃孵育過夜，0.1％PBST水平震蕩洗3次，5min/次；
[0126] (7)滴加50μl生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗大鼠抗體)(1：200稀釋)，室溫下孵育1h，0.1％PBST水平震蕩洗3次，5min/次；
[0127] (8)滴加50μl辣根過氧化物酶-生物素偶聯(lián)的三抗，室溫下孵育2h，0.1％PBST水平震蕩洗3次，5min/次；
[0128] (9)DAB顯色：1ml蒸餾水加A、B、C液各一滴，現(xiàn)用現(xiàn)配；將配好的DAB 顯色液滴加到切片上覆蓋全部組織，鏡下觀察以特異性著色良好背景不出現(xiàn)著色為標(biāo)準(zhǔn)，自來水沖洗終止顯色；
[0129] (10)蘇木精復(fù)染1min，0.5％鹽酸酒精分化，視復(fù)染深淺而定，氨水返藍(lán)；
[0130] (11)梯度酒精脫水(80％乙醇1分鐘、95％乙醇5分鐘、100％乙醇Ⅰ5分鐘、100％乙醇Ⅱ10分鐘)，二甲苯透明(二甲苯Ⅰ10分鐘、二甲苯Ⅱ10分鐘)；
[0131] (12)中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。光學(xué)顯微鏡下F4/80陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿染色為深棕色。
[0132] 2.1.8視網(wǎng)膜免疫熒光染色
[0133] 2.1.8.1取材及冰凍切片制備
[0134] (1)免疫后第21天(day 21)處死小鼠，完整取出小鼠眼球；
[0135] (2)立即將小鼠眼球于液氮中冷凍10-15秒，以O(shè)CT包埋；
[0136] (3)立即將OCT包埋的小鼠眼球冷凍于-80℃超低溫冰箱，15分鐘后取出。
[0137] (4)將冷凍包埋好的組織用冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5μm，制成冰凍切片，切片暫時(shí)冷凍于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
[0138] 2.1.8.2免疫熒光染色
[0139] (1)冰凍切片室溫復(fù)溫30分鐘；
[0140] (2)冰丙酮固定8min，4℃PBS洗3次×5分鐘
[0141] (3)3％BSA室溫封閉30分鐘
[0142] (4)滴加一抗F4/80抗體(用一抗稀釋液1:200稀釋)和iNOS抗體(用一抗稀釋液1:200稀釋)雙染4℃過夜，4℃PBS洗3次×5分鐘；
[0143] (5)滴加Alexa Fluor 488驢抗小鼠熒光二抗和Alexa Fluor 594驢抗兔熒光二抗(1:200稀釋)室溫避光孵育1小時(shí)，4℃PBS洗3次×5分鐘；
[0144] (6)DAPI染核1分鐘，4℃PBS洗3次×5分鐘。
[0145] (7)Vectashield medium封片。熒光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。
[0146] 2.1.9小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)
[0147] 于免疫后第21天(day21)檢測治療組小鼠和PBS對(duì)照組脾臟Th17細(xì)胞、Th1細(xì)+胞占單個(gè)核細(xì)胞比例，Treg細(xì)胞、Th0細(xì)胞分別占CD4T淋巴細(xì)胞的比例，每組各取5只小鼠。
[0148] 2.1.9.1小鼠脾臟單細(xì)胞懸液的制備
[0149] (1)小鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸入75％的酒精中10分鐘，小鼠取右側(cè)臥位，逐層剖開腹腔，充分暴露脾臟，無菌條件下取出脾臟放入含有1％BSA的無菌培養(yǎng)皿中,小心去除筋膜與脂肪組織,并用剪刀將脾臟分割成小碎塊(1-2mm)；
[0150] (2)無菌50ml離心管上放置一無菌的40μm無菌尼龍網(wǎng)，將分割完成的脾臟組織置入其上，無菌滴管滴入1％BSA；
[0152] (4)將離心管置于離心機(jī)中，調(diào)整離心條件：25℃，1200rpm，離心5min，輕輕棄去上清；
[0153] (5)加入5-6ml紅細(xì)胞裂解液并緩慢搖動(dòng)使細(xì)胞重懸；
[0154] (6)室內(nèi)靜置4-5min，待紅細(xì)胞裂解完成，加入10ml無菌PBS終止細(xì)胞裂解；
[0155] (7)加入10ml 1％BSA后離心，25℃，1200rpm，離心l0min，棄上清，加入l0ml 1％BSA，輕晃離心管，重懸細(xì)胞；
[0156] (8)靜置2-3min后，25℃，1200rpm，離心l0min，棄上清，加入700μl 1％BSA，重懸細(xì)胞；
[0157] (9)取10μl單細(xì)胞懸液，行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0158] (10)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml。
[0159] 2.1.9.2小鼠脾臟Th1和Th17細(xì)胞的流式檢測
[0160] 2.1.9.2.1刺激Th1和Th17細(xì)胞因子分泌
[0161] (1)取無菌24孔板，每孔加100μl上述脾臟單細(xì)胞懸液，900μl配好的培養(yǎng)基，0.5μl 1mg/ml PMA(終濃度為500ng/ml)，0.5μl 1mg/ml離子霉素(終濃度為500ng/ml)，
1μl BFA(1μg/ml)，輕輕混勻，37℃無菌溫箱培養(yǎng)4h。
1μl BFA(1μg/ml)，輕輕混勻，37℃無菌溫箱培養(yǎng)4h。
[0162] (2)取出24孔板，輕輕混勻孔內(nèi)液體，吸出至相應(yīng)流式管中。
[0163] (3)將裝有細(xì)胞懸液的流式管置于離心機(jī)中離心：25℃，2000rpm，3min，棄上清。
[0164] (4)加2ml PBS重懸細(xì)胞，25℃離心2000rpm，3min，棄上清。
[0165] 2.1.9.2.2Th1和Th17細(xì)胞胞外染色
[0166] (1)流式管標(biāo)號(hào)，加入小鼠FITC-CD4抗體，輕輕敲打混勻，室溫避光孵育15min；
[0167] (2)加入1mlPBS混勻，2000rpm，25℃，離心5min，棄上清；
[0168] (3)再次加入1mlPBS重懸，2000rpm，25℃，離心5min，棄上清。
[0169] 2.1.9.2.3胞內(nèi)染色
[0170] (1)各流式管中加入500μl破膜劑，室溫避光破膜20min；
[0171] (2)25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0172] (3)各流式管中加入1ml破膜buffer(1×)，重懸細(xì)胞，25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0173] (4)用于Th1細(xì)胞染色的流式管中加入1μl小鼠PE-IL-17抗體，用于Th17細(xì)胞染色的流式管中加入1μl小鼠PE-IFN-γ抗體，輕輕敲打混勻，室溫避光孵育20min；
[0174] (5)加入1ml PBS溶液，重懸細(xì)胞，置于離心機(jī)中離心，條件：25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0175] (6)重復(fù)上一步驟；
[0176] (7)加入500μl 4％甲醛溶液固定細(xì)胞，4℃避光保存過夜；
[0177] (8)25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0178] (9)加入500μl鞘液重懸細(xì)胞，濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測分析。
[0179] 2.1.9.3小鼠脾臟Treg細(xì)胞的流式檢測
[0180] 2.1.9.3.1細(xì)胞表面染色
[0181] 取制備好的脾臟單細(xì)胞懸液100μl置于流式管中，標(biāo)號(hào)，依次加入小鼠FITC-CD4抗體2μl，小鼠Percp-Cy5.5-CD25抗體3μl，輕輕敲打混勻，常溫避光孵育15分鐘。
[0183] (1)上述各流式管中加入1ml破膜劑，室溫避光破膜30分鐘；
[0184] (2)各流式管中加入1ml破膜buffer(1×)，室溫避光10分鐘；
[0185] (3)各流式管置于離心機(jī)中25℃，1500rpm，離心5min，棄上清；
[0186] (4)各流式管中加入小鼠PE-Foxp3抗體3μl，室溫避光孵育30分鐘；
[0187] (5)加入1ml PBS溶液，重懸細(xì)胞，25℃，1500rpm，離心5min，棄上清；
[0188] (6)重復(fù)上一步驟；
[0189] (7)加入500μl 4％甲醛溶液固定細(xì)胞，4℃避光保存過夜；
[0190] (8)25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0191] (9)加入500μl鞘液重懸細(xì)胞，濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測分析。
[0192] 2.1.9.4小鼠脾臟Th0細(xì)胞的流式檢測
[0193] 2.1.9.4.1細(xì)胞表面染色
[0194] (1)取制備好的脾臟單細(xì)胞懸液100μl置于流式管中，標(biāo)號(hào)，依次加入小鼠FITC-CD4抗體2μl，小鼠Percp-Cy5.5-CD3e抗體3μl，小鼠PE-CD62L抗體3μl，輕輕敲打混勻，常溫避光孵育15分鐘；
[0195] (2)加入1ml PBS溶液，重懸細(xì)胞，25℃，1500rpm，離心5min，棄上清；
[0196] (3)重復(fù)上一步驟；
[0197] (4)加入500μl 4％甲醛溶液固定細(xì)胞，4℃避光保存過夜；
[0198] (5)25℃，350g，離心5min，棄上清；
[0199] (6)加入500μl鞘液重懸細(xì)胞，濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測分析。
[0200] 2.1.10視網(wǎng)膜TUNEL染色
[0201] 2.1.10.1取材及冰凍切片制備
[0202] (1)免疫后第21天(day 21)處死小鼠，完整取出小鼠眼球；
[0203] (2)立即將小鼠眼球于液氮中冷凍10-15秒，以O(shè)CT包埋；
[0204] (3)立即將OCT包埋的小鼠眼球冷凍于-80℃超低溫冰箱，15分鐘后取出。
[0205] (4)將冷凍包埋好的組織用冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5μm，制成冰凍切片，切片暫時(shí)冷凍于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
[0206] 2.1.10.2取材及冰凍切片制備
[0207] (1)冰凍切片室溫復(fù)溫30分鐘；
[0208] (2)冰丙酮固定8min，4℃PBS洗3次×5分鐘
[0209] (3)3％BSA室溫封閉30分鐘
[0210] (4)滴加TUNEL反應(yīng)混合液室溫孵育1h，4℃PBS洗3次×5分鐘；
[0211] (5)DAPI染核1分鐘，4℃PBS洗3次×5分鐘。
[0212] (7)Vectashield medium封片。熒光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。
[0213] 2.1.11qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜組織IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、p65及iNOS的mRNA表達(dá)量
[0214] 2.1.11.1小鼠視網(wǎng)膜組織的采集
[0215] (1)術(shù)前準(zhǔn)備
[0217] 2)手術(shù)器械消毒：手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌半小時(shí)，放入烘箱風(fēng)干備用。
[0218] (2)取樣方法
[0219] 1)麻醉：稱重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉
[0220] 2)麻醉后10min，將小鼠側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)上，顯微鑷固定小鼠眼球，剪除眼球周圍組織置于生理鹽水中沖洗3遍。在顯微鏡下去除角膜、晶狀體和玻璃體，用顯微鑷分離視網(wǎng)膜組織，置于RNase-free的凍存管中液氮冷凍備用。
[0221] 2.1.11.2Trizol法提取視網(wǎng)膜組織總RNA
[0222] (1)取出視網(wǎng)膜組織稱重后，預(yù)冷的PBS洗滌2次，每次5min。
[0223] (2)視網(wǎng)膜組織超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，每100mg組織加入1ml Trizol。室溫放置5min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管中；
[0224] (3)加入0.2ml氯仿(氯仿：Trizol＝1:5)，劇烈振蕩15s(禁用渦旋)，室溫放置10min，12000rpm 4℃離心15min，樣品分為三層，取上層水相于新的1.5ml Eppendorf管中；
[0225] (4)加入0.5ml的異丙醇(異丙醇：Trizol＝1:2)，室溫放置10min，12000rpm4℃離心10min，棄上清；
[0226] (5)加入1ml 75％乙醇(用DEPC處理水配置)(乙醇：Trizol＝1:1)，渦旋混合，7500rpm 4℃離心5min，棄上清；
[0227] (6)讓沉淀的RNA在室溫下通風(fēng)櫥中風(fēng)干；
[0228] (7)Eppendorf管中根據(jù)沉淀量加入適量DEPC水溶解沉淀；
[0229] 2.1.11.3測定樣本總RNA的純度和濃度
[0230] (1)調(diào)零：取100μl DEPC處理水加于紫外分光光度計(jì)的比色管中，進(jìn)行調(diào)零；
[0231] (2)測定樣本RNA含量：取2μl樣本RNA+98μl DEPC處理水加入比色管中，讀取RNA濃度值；
[0232] (3)樣本RNA濃度計(jì)算：RNA樣本濃度(μg/ml)＝OD 260×40μg/ml×50；
[0233] (4)樣本RNA純度計(jì)算：OD 260/OD 280比值檢測RNA純度，比值在1.8～2.0范圍內(nèi)說明純度較好；
[0234] (5)電泳：取樣本RNA 5μl加于瓊脂糖凝膠上樣孔內(nèi)，130V恒壓電泳10min。凝膠成像儀上觀察結(jié)果，可見三條帶即28s、18s、5s，條帶清晰表示RNA完整。
[0235] 2.1.11.4逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0236] (1)配制反應(yīng)體系(見表4)：
[0237] 表4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
[0238]
[0239] (2)反應(yīng)條件：42℃孵育30min，85℃加熱5min，4℃冷卻。
[0240] (3)逆轉(zhuǎn)錄：將各組份按反應(yīng)體系所示加入0.2ml RNase-free的微離心管中，放入PCR儀，按照反應(yīng)條件設(shè)定程序，開始運(yùn)行。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后取出樣本儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
[0241] 2.1.11.5qRT-PCR
[0242] (1)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成針對(duì)小鼠的Occludin、ZO-1及β-actin的特異性引物(見表5)
[0243] 表5qRT-PCR引物設(shè)計(jì)
[0244]
[0245]
[0246] (2)配制反應(yīng)體系(見表6)：
[0247] 表6qRT-PCR反應(yīng)體系
[0248]
[0249] 每個(gè)樣本的每個(gè)待測基因設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0250] (3)qRT-PCR：將反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃30s，變性94℃5s，退火57℃10s，延伸72℃10s，循環(huán)次數(shù)40。
[0251] (4)反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)生成的Ct值及熔解曲線，整理并分析數(shù)據(jù)，繪制柱狀圖。分析方法如下：-ΔΔCt
[0252] Folds＝2
[0253] ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)
[0254] Ct1：處理樣本待測基因的臨界循環(huán)數(shù)
[0255] Ct2：處理樣本持家基因(β-actin)的臨界循環(huán)數(shù)
[0256] Ct3：對(duì)照樣本待測基因的臨界循環(huán)數(shù)
[0257] Ct4：對(duì)照樣本持家基因(β-actin)的臨界循環(huán)數(shù)
[0258] 2.1.12Western blot檢測小鼠視網(wǎng)膜組織IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、p65及iNOS的表達(dá)量
[0259] 2.1.12.1小鼠視網(wǎng)膜組織的采集
[0260] (1)術(shù)前準(zhǔn)備
[0261] 1)手術(shù)室消毒：紫外線燈照射30min，通風(fēng)15min；
[0262] 2)手術(shù)器械消毒：手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌半小時(shí)，放入烘箱風(fēng)干備用。
[0263] (2)取樣方法
[0264] 1)麻醉：稱重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉
[0265] 2)麻醉后10min，將小鼠側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)上，顯微鑷固定小鼠眼球，剪除眼球周圍組織置于生理鹽水中沖洗3遍。在顯微鏡下去除角膜、晶狀體和玻璃體，用顯微鑷分離視網(wǎng)膜組織。組織冷凍于液氮中備用。
[0266] 2.1.12.2小鼠視網(wǎng)膜組織總蛋白的提取
[0267] (1)取100mg視網(wǎng)膜組織加入1ml預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液和2μlPMSF，磷酸酶抑制劑，冰上勻漿、超聲裂解90sec。
[0268] (2)冰上靜置裂解30min，靜置過程中每5min用移液器吹打10次。
[0269] (3)4℃13000rpm離心20min，移取上清分裝于干凈的EP管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/div>
[0270] 2.1.12.3Western blot
[0271] (1)蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理：
[0272] 樣品蛋白與4×SDS加樣緩沖液按3：1(v/v)混勻，100℃水浴變性10min，12,000rpm離心5min，去除雜質(zhì)。
[0274] 1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0275] 2)根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑A：B為50：1的比例配制BCA試劑工作液，充分混勻；
[0276] 3)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min；
[0277] 4)完全溶解的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10μl加PBS稀釋至100μl，使終濃度為 0.5mg/ml；
[0278] 5)將標(biāo)準(zhǔn)品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl依次加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20μl；
[0279] 6)加2μl樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS到20μl；
[0280] 7)酶標(biāo)儀測定A562；
[0281] 8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度；
[0282] (3)SDS-PAGE電泳膠的配制：
[0283] 1)安裝制膠用玻璃板；
[0284] 2)配10％分離膠，混勻后將膠灌注于兩玻璃板間至分離膠液面距離短玻璃板上沿約1.5cm處；
[0285] 3)在分離膠上注入一層雙蒸水，室溫下放置30min；
[0286] 4)分離膠與雙蒸水間出現(xiàn)一條明顯的界限時(shí)，倒去雙蒸水，用濾紙吸干殘留水分；
[0287] 5)配制濃縮膠，混勻后將膠直接灌注于分離膠上，立即插入干凈的梳子，室溫下放置30min。
[0288] (4)SDS－PAGE電泳：
[0289] 1)等濃縮膠充分聚合時(shí)，將支架和膠放入電泳槽中，再加入電泳緩沖液，拔去梳子；
[0290] 2)取出蛋白Marker和蛋白樣品，向孔內(nèi)加蛋白Marker 3μl和蛋白樣品10μl；
[0291] 3)蛋白樣品在濃縮膠上加電壓80V，持續(xù)約30min，使蛋白樣品緩慢通過濃縮膠，再將電壓調(diào)至120V，持續(xù)約60min，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)，停止電泳。
[0292] (5)轉(zhuǎn)膜：
[0293] 1)將凝膠取下并浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，依據(jù)預(yù)染蛋白Marker的標(biāo)記保留需要的凝膠部分，切去右上角作標(biāo)記；
[0294] 2)裁剪與凝膠相同大小的PVDF膜1張，于無水甲醇中激活15s，雙蒸水中處理2min，然后浸于轉(zhuǎn)膜液中平衡5min；Whatman濾紙6張，轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡大于30s；
[0296] 4)蓋上轉(zhuǎn)膜儀，紅對(duì)紅、黑對(duì)黑連接電源；
[0297] 5)冰浴中轉(zhuǎn)膜：電壓調(diào)至80V，持續(xù)60min；
[0298] 6)關(guān)閉轉(zhuǎn)膜儀，取出PVDF膜，減去一角作正反面標(biāo)記，再用TBS-T漂洗。
[0299] (6)封閉：
[0301] (7)一抗孵育：
[0302] 小鼠抗IFN-γ抗體(1:500稀釋)、兔抗IL-17A抗體(1:1000稀釋)、兔抗IL-1β抗體(1:2000稀釋)、兔抗IL-6抗體(1:1000稀釋)、兔抗TNF-α抗體(1:1000稀釋)、兔抗IL-10抗體(1:500稀釋)、兔抗TGF-β抗體(1:250稀釋)、兔抗p65抗體(1:1000稀釋)、小鼠抗iNOS抗體(1:500稀釋)、兔抗STAT1抗體(1:1000稀釋)、兔抗p-STAT1抗體(1:250稀釋)、鼠抗STAT3抗體(1:5000稀釋)、鼠抗p-STAT3抗體(1:2000稀釋)、兔抗ZO-1抗體(1:200稀釋)、兔抗Occludin抗體(1:250稀釋)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(1:1000稀釋)4℃搖床孵育過夜。TBS-T沖洗5min×3次。
[0303] (8)二抗孵育：
[0304] 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:10000-1:5000稀釋)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1:5000稀釋)37℃搖床孵育1h。TBS-T沖洗5min×3次。
[0305] (9)顯色：
[0306] 1)取ECL發(fā)光試劑盒中的A和B溶液等體積混合避光備用；
[0307] 2)在膜的蛋白面滴加ECL混合液；
[0308] 3)應(yīng)用Bio-Rad公司ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)顯像。
[0309] (10)目的條帶的定量分析：
[0310] 應(yīng)用Image J分析軟件測定每一個(gè)目的條帶及其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-actin的灰度值。按照相對(duì)灰度值＝目的條帶灰度值/同一樣品β-actin的灰度值計(jì)算每個(gè)樣品相應(yīng)指標(biāo)的相對(duì)灰度值，代表目的蛋白的表達(dá)水平。利用統(tǒng)計(jì)軟件分析各組相對(duì)灰度值，以去除蛋白質(zhì)不均勻降解所造成的誤差。
[0311] 2.1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0312] 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間臨床評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分、流式細(xì)胞術(shù)測得Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞百分比，Treg細(xì)胞、Th0細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比，視網(wǎng)膜兩種緊密連接蛋白Western blot的相對(duì)灰度值及qRT-PCR計(jì)算所得Folds值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和白楊素組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。認(rèn)為P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0313] 2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0314] 2.2.1白楊素干預(yù)下的小鼠EAU模型眼底表現(xiàn)
[0315] 自小鼠免疫后的第12天起連續(xù)觀察對(duì)照組及白楊素組所有小鼠眼底的發(fā)病情況，并于免疫后第21天對(duì)小鼠進(jìn)行眼底圖片采集。圖像顯示對(duì)照組小鼠有明顯的視網(wǎng)膜炎性滲出、血管炎及視乳頭水腫(圖1A)，而白楊素組小鼠眼底未發(fā)現(xiàn)明顯滲出、水腫或炎性病變(圖1B)。白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠眼底炎癥表現(xiàn)輕。
[0316] 白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠眼底炎癥表現(xiàn)輕。免疫后第21天對(duì)小鼠進(jìn)行眼底圖像采集。圖1A顯示，對(duì)照組小鼠眼底表現(xiàn)，可見明顯的視網(wǎng)膜炎性滲出，視網(wǎng)膜血管炎，視乳頭水腫；圖1B顯示白楊素組小鼠眼底表現(xiàn)，視網(wǎng)膜未見明顯滲出，血管走形正常，視乳頭界限清楚
[0317] 2.2.2白楊素干預(yù)下的小鼠EAU模型臨床評(píng)分
[0318] 依據(jù)小鼠EAU模型臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)于免疫后第21天對(duì)兩組小鼠眼底情況進(jìn)行臨床評(píng)分(n＝6)。如圖2所示，白楊素組與對(duì)照組相比，臨床評(píng)分顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.33±0.41vs.2.67±1.51,t＝-3.664,P＝0.004<0.01)。
[0319] 2.2.3視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查HE染色
[0320] HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠玻璃體腔大量炎性細(xì)胞滲出，視網(wǎng)膜可見嚴(yán)重血管炎，光感受器細(xì)胞層可見炎性細(xì)胞浸潤(圖3A)；白楊素組玻璃體腔未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、形態(tài)正常，光感受器細(xì)胞層未見炎性細(xì)胞浸潤(圖3B)。
[0321] 如圖3A所示，對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜切片HE染色。玻璃體腔大量炎性細(xì)胞滲出(如紅色箭頭所示)，視網(wǎng)膜可見嚴(yán)重血管炎(如黑色箭頭所示)，光感受器細(xì)胞層可見炎性細(xì)胞浸潤(如白色星號(hào)所示)。如圖3B所示，白楊素組小鼠視網(wǎng) 膜切片HE染色。玻璃體腔未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、形態(tài)正常，光感受器細(xì)胞層未見炎性細(xì)胞浸潤
[0322] 2.2.4小鼠EAU模型的組織病理學(xué)評(píng)分
[0323] 依據(jù)小鼠EAU模型臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜HE染色切片進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分(n＝6)。如圖4所示，白楊素組與對(duì)照組相比，組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.25±0.27vs.1.83±0.75,t＝4.842,P＝0.001<0.01)。
[0324] 2.2.5EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果
[0325] 對(duì)對(duì)照組和白楊素組小鼠分別進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片，以評(píng)價(jià)白楊素對(duì)視網(wǎng)膜血管通透性及BRB完整性的作用。結(jié)果顯示：對(duì)照組可見EB廣泛而彌撒地自視網(wǎng)膜血管向外滲出(圖5A)，而白楊素組小鼠的視網(wǎng)膜血管走形正常，未見明顯染料自血管滲出(圖5B)。
[0326] 如圖5A所示，對(duì)照組小鼠經(jīng)伊文思藍(lán)血管灌注循環(huán)2小時(shí)后，大量熒光染料自視網(wǎng)膜血管向外滲出。如圖5B所示，白楊素組小鼠未見明顯伊文思藍(lán)染料外滲。
[0327] 2.2.6視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Western blot檢測結(jié)果
[0328] 利用Western blot的方法檢測視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)量，結(jié)果表明，白楊素組與對(duì)照組相比，Occludin和ZO-1表達(dá)量明顯增多。用Image J軟件分析條帶灰度值，Occludin和ZO-1與內(nèi)參蛋白β-actin的相對(duì)表達(dá)量白楊素組較對(duì)照組顯著升高(0.5097±0.0458vs.0.3747±0.0499,t＝-3.448,P＝0.026<0.05；0.4975±0.0093vs.0.4685±0.0080,t＝-4.103,P＝0.015<0.05)(圖6)。
[0329] 2.2.7視網(wǎng)膜緊密連接蛋白qRT-PCR檢測結(jié)果
[0330] 用qRT-PCR的方法從基因水平檢測視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)量，-ΔΔCt并以2 的方法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，白楊素組緊密連接蛋白Occludin mRNA相對(duì)于內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)量較對(duì)照組升高(2.9432±0.8356vs.1.0057±0.1302,t＝-3.986,P＝0.016<0.05)；白楊素組ZO-1mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高(11.7364±4.6293vs.1.04
80±0.3778,t＝-3.968,P＝0.017<0.05)(圖7)。
80±0.3778,t＝-3.968,P＝0.017<0.05)(圖7)。
[0331] 2.2.8視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
[0332] 為了評(píng)價(jià)白楊素對(duì)小鼠EAU模型巨噬細(xì)胞浸潤的影響，利用大鼠F4/80抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞，進(jìn)行眼球切片的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠玻璃 體腔及視網(wǎng)膜可見大量F4/80陽性細(xì)胞浸潤(圖8A)，白楊素組小鼠玻璃體腔及視網(wǎng)膜也可見F4/80陽性細(xì)胞浸潤，但較對(duì)照組小鼠明顯數(shù)量降低(圖8B)。
[0333] 如圖8所示，F(xiàn)4/80陽性細(xì)胞表現(xiàn)為特異性棕色著色。圖8A中對(duì)照組小鼠免疫組織化學(xué)染色，玻璃體腔內(nèi)及視網(wǎng)膜可見大量F4/80陽性細(xì)胞浸潤(如黑色箭頭所示)。圖8B中白楊素組小鼠免疫組織化學(xué)染色，玻璃體腔內(nèi)及視網(wǎng)膜可見F4/80陽性細(xì)胞浸潤(如黑色箭頭所示)。白楊素組較對(duì)照組陽性細(xì)胞量降低。
[0334] 2.2.9視網(wǎng)膜免疫熒光染色結(jié)果
[0335] 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)白楊素對(duì)小鼠EAU模型有活性的巨噬細(xì)胞浸潤情況，對(duì)兩組小鼠眼球切片進(jìn)行F4/80和iNOS的雙重免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠眼球切片可見大量雙陽細(xì)胞(圖9A)，表示大量有活性的巨噬細(xì)胞浸潤，而白楊素組雙陽細(xì)胞很難發(fā)現(xiàn)(圖9B)。
[0336] 如圖9所示，綠色熒光為F4/80陽性細(xì)胞，紅色熒光為iNOS陽性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI，雙陽細(xì)胞表現(xiàn)為橘紅色。圖9A中，對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜免疫熒光染色，睫狀體處可見大量F4/80和iNOS雙陽細(xì)胞。圖9B中，白楊素組小鼠視網(wǎng)膜免疫熒光染色，未發(fā)現(xiàn)明顯雙陽細(xì)胞。
[0337] 2.2.10Western blot及qRT-PCR檢測視網(wǎng)膜iNOS蛋白表達(dá)量結(jié)果
[0338] 為評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜表達(dá)iNOS量，利用Western blot的方法檢測小鼠視網(wǎng)膜iNOS蛋白含量，并用qRT-PCR的方法從基因水平驗(yàn)證iNOS表達(dá)量的變化。
[0339] 如圖10所示，白楊素組小鼠視網(wǎng)膜iNOS的蛋白相對(duì)表達(dá)量及mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(0.4729±0.0606vs.0.7514±0.0624,t＝5.548,P＝0.005<0.01；0.1836±0.1022vs.1.0004±0.0359,t＝13.057,P＝0.000<0.01；**,P<0.01)[0340] 2.2.11小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色檢測結(jié)果
[0341] TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠凋亡的視網(wǎng)膜細(xì)胞較多(圖11A)，而白楊素組小鼠凋亡的視網(wǎng)膜細(xì)胞較少(圖11B)。
[0342] 如圖11所示，TUNEL染色中，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為TUNEL反應(yīng)混合液(紅色熒光)及DAPI(藍(lán)色熒光)復(fù)染的紫色熒光著色細(xì)胞。圖11A中，對(duì)照組小鼠可見大量凋亡視網(wǎng)膜細(xì)胞。圖11B中，白楊素組小鼠凋亡視網(wǎng)膜細(xì)胞較少
[0343] 2.2.12流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟輔助T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果
[0344] 流式細(xì)胞術(shù)是一種可以從功能水平上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析的新興檢測手段。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)對(duì)照組和白楊素組小鼠脾臟輔助T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定量分析，探討白楊素對(duì)EAU小鼠脾臟輔助T淋巴細(xì)胞亞群的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示白楊素組小鼠Th1細(xì)+胞、Th17細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞群比例較對(duì)照組小鼠降低(圖12A、B)，Treg細(xì)胞占CD4T淋巴+
細(xì)胞比例增加(圖12C)，Th0細(xì)胞占CD4T淋巴細(xì)胞比例降低(圖12D)。
細(xì)胞比例增加(圖12C)，Th0細(xì)胞占CD4T淋巴細(xì)胞比例降低(圖12D)。
[0345] 如圖12所示，A.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4、IFN-γ標(biāo)記小鼠脾臟Th1細(xì)胞群，白楊素組較對(duì)照組顯著降低(0.4112±0.1296％vs.0.9072±0.2480％,t＝3.963,P＝0.004<0.01)B.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4、IL-17標(biāo)記小鼠脾臟Th17細(xì)胞群，白楊素組較對(duì)照組顯著降低(0.2748±0.0449％vs.0.9098±0.1347％,t＝9.997,P＝0.000<0.01)C.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4、CD25、Foxp3標(biāo)記小鼠脾臟Treg細(xì)胞群，白楊素組較對(duì)照組顯著增加(19.3800±2.1970％vs.15.2400±1.9347％,t＝-3.162,P＝0.013<0.05)D.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4、CD3、CD62L標(biāo)記小鼠脾臟Th0細(xì)胞群，白楊素組較對(duì)照組顯著降低(27.8200±3.0874％vs.14.6200±3.7332％,t＝6.093,P＝0.000<0.01)
[0346] 2.2.13小鼠視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)量qRT-PCR檢測結(jié)果
[0347] 為了檢測白楊素對(duì)小鼠視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)的治療作用，利用qRT-PCR的方法從基因水平檢測了小鼠視網(wǎng)膜炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，白楊素組小鼠視網(wǎng)膜促炎因子IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著性降低(圖13)，抗炎因子TGF-β的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著性升高(圖13)，抗炎因子IL-10的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖中未示)。
[0348] 如圖13所示，白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜IFN-γ(0.4933±0.0934vs.1.0086±0.1652,t＝4.704,P＝0.009<0.01)、IL-17A(0.2601±0.0311vs.1.0006±0.0436,t＝23.938,P＝0.000<0.01)、IL-6(0.1751±0.0298vs.1.0075±0.1542,t＝9.182,P＝
0.009<0.01)、TNF-α(0.3172±0.0646vs.1.0087±0.1666,t＝6.701,P＝0.003<0.01)、IL-1β(0.4645±0.0505vs.1.0132±0.1934,t＝4.754,P＝0.009<0.01)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低；TGF-β(1.2379±0.0684vs.1.0024±0.0839,t＝-3.769,P＝0.020<0.05)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(**,P<0.01；*,P<0.05)
0.009<0.01)、TNF-α(0.3172±0.0646vs.1.0087±0.1666,t＝6.701,P＝0.003<0.01)、IL-1β(0.4645±0.0505vs.1.0132±0.1934,t＝4.754,P＝0.009<0.01)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低；TGF-β(1.2379±0.0684vs.1.0024±0.0839,t＝-3.769,P＝0.020<0.05)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(**,P<0.01；*,P<0.05)
[0349] 2.2.14小鼠視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)量Western blot檢測結(jié)果
[0350] 為了進(jìn)一步證明白楊素對(duì)小鼠視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)的治療作用，利用Western blot的方法從蛋白水平檢測了小鼠視網(wǎng)膜炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表達(dá)量。結(jié)果顯示，白楊素組小鼠視網(wǎng)膜促炎因子IFN-γ、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α的相對(duì)蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著性降低(圖14)，抗炎因子TGF-β的相對(duì)蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著性升高(圖14)，抗炎因子IL-10的相對(duì)蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖中未示)。
[0351] 如圖14所示，白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜IFN-γ(0.3800±0.0035vs.0.6105±0.0020,t ＝ 98.172,P ＝ 0.000<0.01)、IL-17A(0.6172±0.0130vs.1.0130±0.0187,t ＝ 30.095,P ＝ 0.000<0.01)、IL-1β(0.3611±0.0261vs.0.4726±0.0328,t ＝
4.609,P ＝ 0.010<0.01)、IL-6(0.7772±0.0070vs.0.8815±0.0032,t ＝ 23.515,P ＝
0.000<0.01)、TNF-α(1.4845±0.0332vs.1.9057±0.0289,t＝16.573,P＝0.000<0.01)的相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著降低；TGF-β(0.5322±0.0258vs.0.6051±0.0258,t＝--3.460,P＝0.026<0.05)的相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著增加(**,P<0.01；*,P<0.05)
4.609,P ＝ 0.010<0.01)、IL-6(0.7772±0.0070vs.0.8815±0.0032,t ＝ 23.515,P ＝
0.000<0.01)、TNF-α(1.4845±0.0332vs.1.9057±0.0289,t＝16.573,P＝0.000<0.01)的相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著降低；TGF-β(0.5322±0.0258vs.0.6051±0.0258,t＝--3.460,P＝0.026<0.05)的相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著增加(**,P<0.01；*,P<0.05)
[0352] 2.2.15小鼠視網(wǎng)膜p65表達(dá)量Western blot及qRT-PCR檢測結(jié)果
[0353] 用Western blot和qRT-PCR的方法分別從蛋白水平和基因水平評(píng)價(jià)對(duì)照組和白楊素組小鼠視網(wǎng)膜p65表達(dá)量。Western blot和qRT-PCR的結(jié)果均表明，白楊素組與對(duì)照組相比較小鼠視網(wǎng)膜p65表達(dá)量顯著性降低(圖15)。
[0354] 如圖15所示，白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量及mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(0.7095±0.0167vs.0.9344±0.0102,t＝19.872,P＝ 0.000<0.01；0.3163±0.0279vs.1.0029±0.0952,t ＝ 11.991,P ＝ 0.000<0.01；**,P<0.01)
[0355] 2.2.16小鼠視網(wǎng)膜STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3表達(dá)量Western blot檢測結(jié)果
[0356] 用Western blot的方法分別從蛋白水平和基因水平評(píng)價(jià)對(duì)照組和白楊素組小鼠視網(wǎng)膜STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3表達(dá)量。Western blot的結(jié)果均表明，白楊素組與對(duì)照組相比較小鼠視網(wǎng)膜STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3表達(dá)量顯著性降低。
[0357] 如圖16 所示，白楊素組小鼠較對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜 STAT1(0.3392±0.0537vs.0.6506±0.0271,t＝8.965,P＝0.001<0.01)、STAT3(0.2729±0.02
92vs.0.5465±0.0486,t＝8.358,P＝0.001<0.01)、p-STAT1(0.3123±0.0070vs.0.3940±0.0282,t＝4.864,P＝0.031<0.05)、p-STAT3(0.3703±0.0520vs.0.7307±0.1213,t＝
4.730,P＝0.009<0.01)表達(dá)量顯著性降低(*,P<0.05；**,P<0.01)
92vs.0.5465±0.0486,t＝8.358,P＝0.001<0.01)、p-STAT1(0.3123±0.0070vs.0.3940±0.0282,t＝4.864,P＝0.031<0.05)、p-STAT3(0.3703±0.0520vs.0.7307±0.1213,t＝
4.730,P＝0.009<0.01)表達(dá)量顯著性降低(*,P<0.05；**,P<0.01)
[0358] 本發(fā)明對(duì)兩組小鼠脾細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果表明白楊素能夠降低+ + + + + + +CD4IFN-γTh1細(xì)胞及CD4IL17Th17細(xì)胞比例，增加CD4CD25Foxp3Treg細(xì)胞比例，提示+
白楊素能夠調(diào)節(jié)CD4Th0細(xì)胞的分化，調(diào)整輔助T淋巴細(xì)胞亞群比例的不平衡。此外，實(shí)驗(yàn)+
數(shù)據(jù)還表明，白楊素組小鼠脾細(xì)胞CD4Th0細(xì)胞比例降低，這提示了白楊素抑制原始T淋巴+ +
細(xì)胞向CD4Th0細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的信息。這種降低EAU小鼠脾細(xì)胞CD4Th0細(xì)胞比例的作用可能通過抑制抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)的增殖和功能實(shí)現(xiàn)的。
白楊素能夠調(diào)節(jié)CD4Th0細(xì)胞的分化，調(diào)整輔助T淋巴細(xì)胞亞群比例的不平衡。此外，實(shí)驗(yàn)+
數(shù)據(jù)還表明，白楊素組小鼠脾細(xì)胞CD4Th0細(xì)胞比例降低，這提示了白楊素抑制原始T淋巴+ +
細(xì)胞向CD4Th0細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的信息。這種降低EAU小鼠脾細(xì)胞CD4Th0細(xì)胞比例的作用可能通過抑制抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)的增殖和功能實(shí)現(xiàn)的。
[0359] 此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了白楊素對(duì)血視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用。血視網(wǎng)膜屏障對(duì)抑制免疫細(xì)胞進(jìn)入眼內(nèi)，實(shí)現(xiàn)眼的器官免疫豁免具有重要作用。緊密連接蛋白Occludin及ZO-1是血視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，緊密連接蛋白的低表達(dá)增大血管的通透性，導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障的破壞，是視網(wǎng)膜炎癥性疾病，包括EAU，炎癥細(xì)胞募集的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白楊素能夠維持視網(wǎng)膜血管的通透性，保護(hù)血視網(wǎng)膜屏障的完整性不受破壞。伊文思藍(lán)血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片實(shí)驗(yàn)中白楊素處理組伊文思藍(lán)熒光滲漏減少，緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)量升高。
[0360] 巨噬細(xì)胞是EAU導(dǎo)致組織損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞之一。當(dāng)血視網(wǎng)膜屏障遭到破壞后，巨噬細(xì)胞被募集到視網(wǎng)膜，攻擊眼內(nèi)組織，引起眼內(nèi)組織損傷。本發(fā)明檢測了小鼠視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白楊素能夠抑制巨噬細(xì)胞浸潤至玻璃體及視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜免疫熒光染色顯示經(jīng)白楊素治療后，分泌iNOS的有活性的巨噬細(xì)胞被抑制。Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示白楊素下調(diào)iNOS表達(dá)量。
[0361] 由于黃酮類化合物白楊素具有抗腫瘤活性，能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞生長，為明確其對(duì)EAU小鼠視網(wǎng)膜炎性浸潤的抑制作用是否通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡引起，本發(fā)明利用TUNEL法對(duì)小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評(píng)估。結(jié) 果表明，白楊素并不能促進(jìn)EAU小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，其對(duì)EAU的治療作用并非通過促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡引起。
[0362] 前炎癥因子IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-1β及TNF-α能夠促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的募集、激活及發(fā)揮作用，引起眼內(nèi)炎癥反應(yīng)。然而，TGF-β和IL-10是抗炎因子，能夠抑制炎癥反應(yīng)。本發(fā)明在mRNA和蛋白兩個(gè)水平上測定了細(xì)胞因子的表達(dá)量。結(jié)果顯示，白楊素能夠抑制IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)量，促進(jìn)TGF-β的表達(dá)。因此，足以證明白楊素能夠抑制眼內(nèi)的炎癥反應(yīng)。
[0363] 如前文所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白楊素能夠抑制EAU小鼠脾臟Th1、Th17細(xì)胞比例，抑制IFN-γ和IL-17A的表達(dá)量。由于作為JAK-STAT途徑相應(yīng)激活因子的IFN-γ、IL-6、TNF-α表達(dá)受到抑制，因此進(jìn)而抑制STAT1、STAT3及其相應(yīng)磷酸化蛋白p-STAT1、p-STAT3的表達(dá)，抑制STAT1、STAT3途徑及NF-κB途徑，從而抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞Th1、Th17細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-17A。
[0364] 綜合上述發(fā)明內(nèi)容，可以證明口服白楊素對(duì)小鼠EAU模型具有治療作用，它能夠調(diào)節(jié)輔助T淋巴細(xì)胞亞群的不平衡，維持血視網(wǎng)膜屏障的完整性，抑制眼內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤，抑制眼內(nèi)炎癥反應(yīng)。白楊素的抗炎癥作用是通過抑制STAT1、STAT3途徑及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
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