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一種新的吡嗪衍生物及其制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用

閱讀：876發(fā)布：2020-06-17

專利匯可以提供一種新的吡嗪衍生物及其制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用專利檢索，專利查詢，專利分析的服務(wù)。并且本 發(fā)明 涉及一種吡嗪類衍 生物 及其制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用。這些吡嗪衍生物能夠清除自由基，抑制 鈣 離子超載，具有細胞保護作用，可用于 預(yù)防 或 治療 心腦 血管 疾病 和神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)疾病。，下面是一種新的吡嗪衍生物及其制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，所述吡嗪類衍生物具有如下通式I的結(jié)構(gòu)：
其中：
R1，R2，R3，R4相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，硝酮基團或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；
其中R’，R”各自獨立地為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R1，R2，R3，R4不能同時為氫，甲基或硝酮基；
R1和R3不能同時為硝酮基，R2和R4不能同時為硝酮基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中R2和R4為甲基，從而所述吡嗪類衍生物具有如下通式II的結(jié)構(gòu)：
其中：
R1，R3相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，硝酮基團或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；R’，R”為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R1，R3不能同時為氫，甲基或硝酮基。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中R3為甲基或硝酮基，從而所述吡嗪類衍生物具有如下通式III或IV的結(jié)構(gòu)：
其中：
R1選自飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；R’，R”為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R1不能為氫，甲基或硝酮基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中所述吡嗪類衍生物具有下面之一的結(jié)構(gòu)：
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中所述吡嗪類衍生物具有如下通式V的結(jié)構(gòu)：
其中：
R5，R6，R7，R8相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R9，R10相同或不同，各自獨立地選自氫，R”’COO，R”’CONH；其中R”’為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10不能同時為氫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中所述吡嗪類衍生物具有如下通式VI或VII或VIII的結(jié)構(gòu)：
其中：
R9，R10相同或不同，各自獨立地選自氫，R”’COO，R”’CONH；其中R”’為飽和或不保護的烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
R9，R10不能同時為氫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽，其中所述吡嗪類衍生物具有下面之一的結(jié)構(gòu)：
8.一種制備權(quán)利要求1-7任一項所述吡嗪類衍生物的合成方法，其步驟包括：
川芎嗪先與NBS反應(yīng)得到川芎嗪單溴代物即中間體I，或者
川芎嗪經(jīng)活性二氧化錳氧化得到對位取代的川芎嗪二醛衍生物，所述川芎嗪二醛衍生物經(jīng)選擇性的還原、溴代、醛基保護后制得對位取代的川芎嗪衍生物即中間體II；
所述中間體I或所述中間體II分別進一步反應(yīng)各自得到所述吡嗪類衍生物。
9.權(quán)利要求8所述的合成方法，其步驟進一步包括：
所述中間體I或所述中間體II各自與磷酸三乙酯反應(yīng)分別得到中間體III或中間體IV；
所述川芎嗪二醛衍生物與乙二醇反應(yīng)，選擇性的保護其中的一個醛基，所得化合物分別與所述中間體III或所述中間體IV反應(yīng)得到各自的川芎嗪的偶合物；所述偶合物在酸性條件下脫去保護基后與叔丁基羥胺反應(yīng)得到所述吡嗪類衍生物。
10.權(quán)利要求8所述的合成方法，其步驟進一步包括：
所述川芎嗪二醛衍生物經(jīng)選擇性的還原其中一個或兩個醛基得到單羥基衍生物或雙羥基衍生物；
所述單羥基衍生物或所述雙羥基衍生物各自與三溴化磷反應(yīng)分別得到單溴代衍生物或二溴代衍生物；
所述單溴代衍生物與不同的羧酸縮合后與叔丁基羥胺反應(yīng)，或者所述二溴代衍生物與不同的羧酸或羧酸鈉反應(yīng)，得到所述吡嗪類衍生物。
11.一種藥用組合物，其包括有效劑量根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的吡嗪類衍生物作為藥用活性成分，以及藥學上可接受的載體和賦形劑。
12.一種權(quán)利要求1-7任一項所述的吡嗪類衍生物或其藥用組合物在制備藥物方面的用途，其中，所述藥物用于預(yù)防或治療的疾病為心腦血管疾病、與谷氨酸受體相關(guān)的疾病、氧化應(yīng)激損傷/自由基相關(guān)的疾病、神經(jīng)退行性疾病或炎癥感染性疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述心腦血管疾病為腦中風、創(chuàng)傷、缺氧缺血腦損傷、腦溢血、缺血性心臟病、心絞痛、血管栓塞、動脈粥樣硬化、腦中風后遺癥、急性心肌梗塞、心肺側(cè)流、呼吸窘迫綜合癥心臟缺血或再灌注、中毒性休克綜合癥、成人呼吸窘迫綜合癥、惡病質(zhì)、心肌炎、冠心病或心臟病。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述與谷氨酸受體相關(guān)的疾病為阿爾茨海默病，帕金森病，亨廷頓舞蹈癥，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，重癥肌無力，青光眼，老年癡呆，甲狀腺功能亢進、高血壓、支氣管哮喘、IV型高脂蛋白血癥或腎功能衰竭。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述與氧化應(yīng)激損傷/自由基相關(guān)的疾病為腦中風、腦創(chuàng)傷、癲癇、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、缺氧缺血腦損傷、腦溢血，癡呆癥、缺血性心臟病，血管栓塞，動脈粥樣硬化，高膽固醇血癥，肺氣腫，白內(nèi)障，糖尿病，急性胰腺炎，酒精引起的肝臟疾病，腎臟傷害或癌癥。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病為腦缺血，帕金森病，阿爾茨海默病，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，共濟失調(diào)毛細血管擴張癥，牛海綿狀腦病，克雅二氏病，亨廷頓舞蹈癥，小腦萎縮癥，多發(fā)性硬化癥，原發(fā)性側(cè)索硬化或脊髓性肌萎縮癥。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述用途，其中所述炎癥感染性疾病為炎性腸病，糖尿病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，肝硬化，異體排斥，腦脊髓炎，腦膜炎，腹膜炎，血管炎，淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎，脈絡(luò)叢腦膜炎，腎小球腎炎，全身性紅斑狼瘡，胃腸蠕動絮亂，肥胖癥，饑餓癥，肝炎，腎衰竭類疾病，心肺側(cè)流，呼吸窘迫綜合癥，心臟缺血或再灌注，中毒性休克綜合癥，成人呼吸窘迫綜合癥，惡病質(zhì)，心肌炎，動脈粥樣硬化，冠心病，突發(fā)性心臟類心臟，糖尿病性視網(wǎng)膜病，眼色素層炎，青光眼，瞼炎，瞼板腺囊炎，過敏性眼病，角膜潰瘍，角膜炎，白內(nèi)障或老年性黃斑退行性改變和視神經(jīng)炎類眼科疾病。

說明書全文

一種新的吡嗪衍生物及其制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種吡嗪類衍生物或其藥學上可接受的鹽，也涉及該吡嗪類衍生物的制備方法，還涉及該吡嗪類衍生物或其組合物在制藥或醫(yī)療方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

[0002] 四甲基吡嗪(川芎嗪，TMP)是從中藥川芎中分離的一種生物堿，臨床用于治療冠心病、心絞痛和缺血性腦血管病(包括腦血栓、腦栓塞)等。TMP藥理活性很多。首先，TMP抗凝作用明顯。TMP可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)蛋白及其mRNA在內(nèi)皮細胞的表達(Song,et al.Chinese Medical J.2000,113:136)，低劑量時能抑制磷脂肌醇的分解和血栓素A2(TXA2)的形成，高劑量時通過結(jié)合糖蛋白IIb/IIIb抑制血小板聚集(Shen,et al.Thromb Res.1997,88:259)。TMP也可以直接溶栓。大鼠動脈和靜脈血栓模型皆證明TMP具有抗血栓作用(Liu and Sylvester,Thromb Res.1990,58:129)，2+
其抗血栓作用可能與TMP抑制血小板活性有關(guān)，包括抑制胞內(nèi)Ca 活性，抑制磷酸二酯酶活性，提高胞內(nèi)cAMP水平以及減少血小板表面糖蛋白IIb/IIIa的暴露等(Liu and Sylvester,Thromb Res.1994,75:51)。
[0003] 更重要的是TMP具有明顯的神經(jīng)細胞保護作用。TMP能顯著改善MCAo引起的大鼠腦細胞缺血損傷，清除人中性粒細胞產(chǎn)生的自由基。TMP還通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達減少細胞凋亡從而保護神經(jīng)細胞(Hsiao,et al.Planta Med.2006,72:411-417.；Kao,et al.Neurochem Int.2006,48:166)。TMP同時也是一種鈣通道阻滯劑，能促進鉀通道開放，抑制鈣離子內(nèi)流，抑制自由基生成，超氧化物岐化酶(SOD)活性增強，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)(Zhu,et al.Eur.J.Pharamacol.2005,510:187)。
[0004] 丹參素(DSS)為中藥丹參的主要活性成分之一，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療心血管病、改善心功能、冠脈循環(huán)、抗凝血、改善微循環(huán)等疾病，此外還具有抗炎、抗腫瘤、抗腦血栓和保肝等活性。鄰二酚羥基及α-羥基羧酸的結(jié)構(gòu)，使丹參素極易氧化變質(zhì)，不易保管與貯藏。丹參素結(jié)構(gòu)中的極性基團，能夠和葡萄糖醛酸等鍵合隨尿液排出體外，故其體內(nèi)的半衰期非常短，生物利用度僅為9.53-14.18％，需要反復(fù)給藥，限制了臨床應(yīng)用(王庭芳，藥學實踐雜志，29(2)：83-87，2011)。
[0005] 咖啡酸(Caffeic acid)屬于多羥基苯乙烯酸類化合物，在西紅柿、胡蘿卜、草莓、藍莓、谷類等多種植物性食物以及中草藥中廣泛存在?？Х人峋哂锌寡?、抗菌、抗病毒、升高白細胞及血小板等多種藥理作用，因而可以用于與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、病毒感染等相關(guān)的多種疾病，如心血管疾病、腦組織損傷、人免疫缺陷病毒(HIV)感染的預(yù)防和治療以及白細胞減少癥和血小板減少癥(Prasad N R,et al.J Photochem Photobiol B,2009,95(3):196-203)?？Х人犭m具有較好的藥理作用，但也非常容易發(fā)生氧化變質(zhì)，不便保管和貯藏。其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和羧基，能夠以葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合物等隨尿液排出體外(Gumbinger H G,et al.Planta Med,1993,59(6):491-493)，在體內(nèi)的半衰期也非常短，需反復(fù)給藥，限制了臨床應(yīng)用。
[0006] 氧化應(yīng)激是指當機體在遭受各種有害刺激時，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化程度超出氧化物的清除能力，從而致使組織損傷。氧化應(yīng)激在多種疾病發(fā)病過程和老化過程中扮演著非常重要的角色。活性氧的累積能夠引起核酸斷裂、酶鈍化、多聚糖解聚、脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致組織損傷甚至死亡(Yan et al.Free Radic Biol Med.2013,62:90-101)。由于氧化應(yīng)激使機體處于易損狀態(tài)，同時也可以增強致病因素的毒性作用，可導(dǎo)致基因突變(Beck MA.Proe Nutr Soe.1999,58(3):707-711)。目前認為氧化應(yīng)激與包括帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病都密切相關(guān)。
[0007] 常見的危害最大的心腦血管疾病通常包括冠心病與腦中風。這類疾病都是由于動脈血管狹窄，供血不足而引起的。動脈血管內(nèi)膜的破損、脂質(zhì)沉積，血小板、纖維蛋白沉積在脂質(zhì)斑塊上積聚，造成血管壁增厚、血管管腔變窄，導(dǎo)致動脈血管內(nèi)壁粥樣硬化。硬化斑塊形成血栓，堵塞血管，引發(fā)缺血性心臟病或者缺血性腦血管病。如果血流在20-40分鐘內(nèi)沒有得到恢復(fù)，就會造成心肌細胞或者腦細胞的不可逆轉(zhuǎn)死亡。在缺血時，一部分電- -子從線粒體氧化呼吸鏈脫離，轉(zhuǎn)移給氧分子形成超氧負離子(O2·)。O2·非?；顫?，進一-
步通過酶催化或金屬催化與其它分子反應(yīng)生成次級ROS，包括·OH，ROO·，H2O2，ONOO等自由基(Miller et al.Free Radic.Biol.Med.1990,8:95-108.；Valko et al.Curr.Med.Chem.2005,12:1161-1208)。這些自由基能導(dǎo)致線粒體膜、細胞膜等生物膜失穩(wěn)，引起蛋白質(zhì)變性，造成DNA損傷，引起細胞凋亡(Siems et al.Life Sci.1995,57:785-789.；
Stadtman.Curr.Med.Chem.2004,11:1105-1112)。
[0008] 神經(jīng)退行性疾病是指大腦或脊髓的神經(jīng)元漸行性的不可逆轉(zhuǎn)的喪失的一種疾病狀態(tài)。由于神經(jīng)元或其髓鞘的不可逆喪失導(dǎo)致功能障礙。常見的神經(jīng)退行性疾病包括腦缺血，帕金森病，阿爾茨海默病，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥等。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理異常復(fù)雜，神經(jīng)元的損傷與多種因素如氧化應(yīng)激、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等多種因素有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

[0009] 本發(fā)明提供了一種吡嗪衍生物及其藥學上可接受的鹽，該類化合物具有很強的神經(jīng)保護能力。
[0010] 本發(fā)明提供了所述吡嗪衍生物的制備方法。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述吡嗪衍生物及其藥用組合物在治療疾病和制備相應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
[0012] 在一方面，本發(fā)明所提供了一種吡嗪衍生物及其藥學上可接受的鹽，所述吡嗪衍生物具有下面通式I的結(jié)構(gòu)：
[0013]
[0014] 其中：
[0015] R1，R2，R3，R4相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，硝酮基團或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；其中R’，R”各自獨立地為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0016] R1，R2，R3，R4不能同時為氫，甲基或硝酮基；
[0017] R1和R3不能同時為硝酮基，R2和R4不能同時為硝酮基。
[0018] 根據(jù)通式I所述的吡嗪類衍生物，優(yōu)選地，其中R2和R4為甲基，從而具有如下通式II的結(jié)構(gòu)：
[0019]
[0020] 其中：
[0021] R1，R3相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，硝酮基團或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；R’，R”為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0022] R1，R3不能同時為氫，甲基或硝酮基。
[0023] 根據(jù)通式II所述的吡嗪類衍生物，進一步優(yōu)選地，其中R3為甲基或硝酮基，從而具有通式III或IV的結(jié)構(gòu)：
[0024]
[0025] 其中：
[0026] R1選自飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基，或選自R’COO，R’COOCH(R”)，R’CH＝CH，R’CONH，R’CONH(R”)；R’，R”為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0027] R1不能為氫，甲基或硝酮基。
[0028] 進一步，根據(jù)通式I所述的吡嗪類衍生物，優(yōu)選的化合物還具有通式V的結(jié)構(gòu)：
[0029]
[0030] 其中：
[0031] R5，R6，R7，R8相同或不同，各自獨立地為氫，飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0032] R9，R10相同或不同，各自獨立地選自氫，R”’COO，R”’CONH；其中R”’為飽和或不飽和的烷基、環(huán)烷基取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0033] R5，R6，R7，R8，R9，R10不能同時為氫。
[0034] 根據(jù)通式V所述的吡嗪類衍生物，進一步優(yōu)選的化合物具有通式VI或VII或VIII的結(jié)構(gòu)：
[0035]
[0036] 其中：
[0037] R9，R10相同或不同，各自獨立地選自氫，R”’COO，R”’CONH；R”’為飽和或不保護的烷基，取代或未取代的芳基、芳雜基；
[0038] R9，R10不能同時為氫。
[0039] 另外，本發(fā)明所提供的吡嗪衍生物及其藥學上可接受的鹽能夠形成一種藥用組合物，包括有效治療劑量的吡嗪類衍生物作為藥用活性成分，以及藥學上可接受的載體和賦形劑。
[0040] 在另一方面，本發(fā)明提供了所述吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽的合成方法，其步驟包括：
[0041] 川芎嗪先與NBS反應(yīng)得到川芎嗪單溴代物即中間體I，或者
[0042] 川芎嗪經(jīng)活性二氧化錳氧化得到對位取代的川芎嗪二醛衍生物，所述川芎嗪二醛衍生物經(jīng)選擇性的還原、溴代、醛基保護后制得對位取代的川芎嗪衍生物即中間體II；
[0043] 所述中間體I或所述中間體II分別進一步反應(yīng)各自得到所述吡嗪類衍生物。
[0044] 根據(jù)一些具體實施方式，上述合成方法，可進一步包括：
[0045] 所述中間體I或所述中間體II各自與磷酸三乙酯反應(yīng)分別得到中間體III或中間體IV；
[0046] 所述川芎嗪二醛衍生物與乙二醇反應(yīng)，選擇性的保護其中的一個醛基，所得化合物分別與所述中間體III或所述中間體IV反應(yīng)得到各自的川芎嗪的偶合物，所述偶合物在酸性條件下脫去保護基后與叔丁基羥胺反應(yīng)得到所述吡嗪類衍生物。
[0047] 根據(jù)一些實施方式，上述合成方法中在制得川芎嗪二醛衍生物后，也可進一步包括：
[0048] 所述川芎嗪二醛衍生物經(jīng)選擇性的還原其中一個或兩個醛基得到單羥基衍生物或雙羥基衍生物；
[0049] 所述單羥基衍生物或所述雙羥基衍生物各自與三溴化磷反應(yīng)分別得到單溴代衍生物或二溴代衍生物；
[0050] 所述單溴代衍生物與不同的羧酸縮合后與叔丁基羥胺反應(yīng)，或者所述二溴代衍生物與不同的羧酸或羧酸鈉反應(yīng)，得到所述吡嗪類衍生物。
[0051] 更進一步，本發(fā)明所提供的吡嗪類衍生物具有較強的自由基清除作用和細胞保護作用，可以用于制備藥物，用于預(yù)防或治療神經(jīng)損傷，自由基過量導(dǎo)致的疾病。所述藥物可包含提供給患者服用的有效治療劑量的具有前述結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學可接受的鹽。
[0052] 以下定義用以闡明和界定該發(fā)明中所用到的各種術(shù)語的含義以及范圍。
[0053] 本文所用的術(shù)語“烷基”是指飽和或不飽和的直鏈、支鏈或環(huán)形的多至10個碳原子的烷基碳鏈。直鏈烷基包括如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支鏈烷基包括如異丙基、仲丁基、異丁基、叔丁基、新戊基。環(huán)烷基包括如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。不飽和烷基包括如含有雙鍵、共軛雙鍵、三鍵的烷基碳鏈。烷基可被一個或多個取代基取代，取代基的非限定性例子包括NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、硝酮基、芳基和雜芳基。術(shù)語“烷基”也指未取代或取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀的含有多至10個碳原子的在鏈上含有至少一個雜原子(例如氮、氧或硫)的烷基。上述直鏈烷基包括，例如，CH2CH2OCH3、CH2CH2N(CH3)2和CH2CH2SCH3。支鏈基團包括，例如，CH2CH(OCH3)CH3、CH2CH(N(CH3)2)CH3和CH2CH(OCH3)CH3。上述環(huán)狀基團包括，例如六元環(huán)CH(CH2CH2)2O、CH(CH2CH2)2NCH3和CH(CH2CH2)2S及相應(yīng)的五元環(huán)等。上述烷基可被一個或多個取代基取代。上述取代基的非限定性例子包括NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、芳基和雜芳基。
[0054] 本文所用的術(shù)語“芳基”是指取代或未被取代的芳香化合物、碳環(huán)基團和芳雜基。芳基是單環(huán)或者是多環(huán)稠合化合物。例如，苯基是單環(huán)芳基。萘基是具有多環(huán)稠合的芳基的例子。芳基可以被一個或多個取代基取代，取代基的非限制性的例子包括NH2、NO2、N(CH3)2、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCH3、CO2H、CO2CH3、CN、硝酮基、芳基和芳雜基。
[0055] 芳雜基涉及到取代的或非取代的單環(huán)或多環(huán)的基團，環(huán)內(nèi)至少包括一個雜原子，譬如氮、氧以及硫。舉例來說，典型的雜環(huán)基團包括一個或多個氮原子譬如四唑基、吡咯基、吡啶基(如4-吡啶基，3-吡啶基，2-吡啶基等)、噠嗪基、吲哚基、喹啉基(如2-喹啉基，3-喹啉基等)、咪唑基、異喹啉基，吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、吡啶酮基或噠嗪基；典型的含一個氧原子的雜環(huán)基團包括2-呋喃基，3-呋喃基或苯并呋喃基；典型的硫雜原子基團包括噻吩基、苯并噻吩基；典型的混合雜原子基團包括呋吖基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基和吩噻噁基。雜環(huán)基團能被一個或多個取代基取代。這些取代基包括NH2、NO2、O-烷基、NH-烷基、N(烷基)2、NHC(O)-烷基、ONO2、F、Cl、Br、I、OH、OCF3、OSO2CH3、CO2H、CO2-烷基、CN、硝酮基、以及芳基和多芳基。這些情況同時包括環(huán)內(nèi)雜原子被氧化，譬如形成N-氧化物、酮或砜。
[0056] 硝酮基是指N上含有不同取代基的亞胺的氮氧化合物，這些取代基包括不同的烷基、環(huán)烷基、芳基以及芳雜基。
[0057] 本文使用的術(shù)語“藥學上可接受的”指的是在化合物如鹽或賦形劑中不具有不能接受的毒性。藥學上可接受的鹽包括無機陰離子，例如氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、亞硫酸根、硝酸根、亞硝酸根、磷酸根、磷酸氫根等。有機陰離子包括乙酸根、丙酸根、肉桂酸根、苯甲磺酸根、檸檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根等。藥學上可接受的賦形劑在后文有描述，參見E.W.Martin,in Remington’s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Companyth(1995),Philadelphia,PA,19 ed。
[0058] 本發(fā)明中涉及的新化合物包括前述結(jié)構(gòu)式I所示化合物。結(jié)構(gòu)式I中涉及的吡- -嗪類衍生物一方面能夠清除自由基包括超氧陰離子(O2·)，過氧硝酸根(ONOO)和羥自由基(·OH)，另一方面可以保護神經(jīng)元，因此，它們可用來預(yù)防和治療心腦血管疾病，包括腦中風、創(chuàng)傷、缺氧缺血腦損傷、腦溢血、缺血性心臟病、心絞痛、血管栓塞、動脈粥樣硬化、腦中風后遺癥、急性心肌梗塞、心肺側(cè)流、呼吸窘迫綜合癥心臟缺血或再灌注、中毒性休克綜合癥、成人呼吸窘迫綜合癥、惡病質(zhì)、心肌炎、冠心病或心臟??；與谷氨酸受體相關(guān)的疾病，包括阿爾茨海默病，帕金森病，亨廷頓舞蹈癥，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，重癥肌無力，青光眼，老年癡呆，甲狀腺功能亢進、高血壓、支氣管哮喘、IV型高脂蛋白血癥或腎功能衰竭；與氧化應(yīng)激損傷/自由基相關(guān)的疾病，包括腦中風、腦創(chuàng)傷、癲癇、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、缺氧缺血腦損傷、腦溢血，癡呆癥、缺血性心臟病，血管栓塞，動脈粥樣硬化，高膽固醇血癥，肺氣腫，白內(nèi)障，糖尿病，急性胰腺炎，酒精引起的肝臟疾病，腎臟傷害或癌癥；神經(jīng)退行性疾病，包括腦缺血，帕金森病，阿爾茨海默病，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，共濟失調(diào)毛細血管擴張癥，牛海綿狀腦病，克雅二氏病，亨廷頓舞蹈癥，小腦萎縮癥，多發(fā)性硬化癥，原發(fā)性側(cè)索硬化或脊髓性肌萎縮癥；炎癥感染性疾病，包括炎性腸病，糖尿病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，肝硬化，異體排斥，腦脊髓炎，腦膜炎，腹膜炎，血管炎，淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎，脈絡(luò)叢腦膜炎，腎小球腎炎，全身性紅斑狼瘡，胃腸蠕動絮亂，肥胖癥，饑餓癥，肝炎，腎衰竭類疾病，心肺側(cè)流，呼吸窘迫綜合癥，心臟缺血或再灌注，中毒性休克綜合癥，成人呼吸窘迫綜合癥，惡病質(zhì)，心肌炎，動脈粥樣硬化，冠心病，突發(fā)性心臟類心臟，糖尿病性視網(wǎng)膜病，眼色素層炎，青光眼，瞼炎，瞼板腺囊炎，過敏性眼病，角膜潰瘍，角膜炎，白內(nèi)障或老年性黃斑退行性改變和視神經(jīng)炎類眼科疾病。
[0059] 本發(fā)明涉及的吡嗪類衍生物，可以以一種藥學可接受的鹽或藥物復(fù)合物的形式對病人給藥。某個復(fù)合物需與適當載體或賦形劑混合形成藥物組合物從而保證達到有效治療劑。“有效治療劑量”是指達到治療效果所必須的劑量。
[0060] 此類吡嗪衍生物可以制成多種劑型，包括固體劑型，半固體劑型，液體制劑和氣霧劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company(1995),Philadethlphia,PA,19 ed)。這幾類劑型中的具體劑型包括片劑、丸劑、糖錠劑、顆粒劑、凝膠劑、膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑以及噴霧劑。這些劑型既能用于局部或全身給藥又能用于速釋或緩續(xù)給藥，此類藥物的給藥方式有很多種，除了上述方式，還有口腔給藥、面頰給藥、直腸給藥、腹膜給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮表給藥、皮下給藥和氣管內(nèi)給藥等。
[0061] 此類吡嗪衍生物生物注射給藥時，可以用水溶性或脂溶性的溶劑將此類化合物配制成溶液劑，懸濁劑和乳劑。脂溶性溶劑具體包括植物油及類似油類，合成脂肪酸甘油酯，高級脂肪酸酯以及乙二醇酯(roylene glycol)這類化合物更易溶于Hank’s溶液，Ringer’s溶液或者生理鹽水。
[0062] 此類吡嗪衍生物口服給藥時，可以采用常用技術(shù)將其與藥學可接受的賦形劑制成復(fù)合物。這些賦形劑可以將這些化合物制成多種可以被病人劑型，如片劑、丸劑、混懸劑、凝膠劑等?？诜苿┑呐渲朴卸喾N方法，如先把化合物和固體賦形劑混勻，充分研磨混合物，添加適當?shù)妮o料，加工處理成顆粒?？梢杂糜谥瞥煽诜┬偷妮o料包括：糖類如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素類如玉米淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃薯膠、甲基纖維素、羥甲基纖維素(ydroxyproylmethyl-cellulose)甲基纖維素納、聚乙烯吡咯酮等。
[0063] 本發(fā)明涉及的吡嗪衍生物也可以制成噴霧劑，此種劑型是通過一個加壓器和一個噴霧器或者一個干粉吸入裝置而實現(xiàn)的?？梢杂米鲊娚淦骼锖线m的噴射劑如二氯二氟甲烷、氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和二甲醚等。氣霧劑給藥的劑量可以通過噴射器的閥門來調(diào)節(jié)。
[0064] 本發(fā)明涉及的各種劑型都關(guān)系到所涉及化合物的有效治療劑量。該類化合物的有效治療劑量取決于接受治療的病人。在決定適宜的劑量時，病人的體重、病情、服藥方式以及處方醫(yī)師的主觀判斷因素都要納入考慮。該類多重作用機制的化合物及其衍生物的治療有效量應(yīng)該由有能力和豐富經(jīng)驗的處方醫(yī)師決定。
[0065] 本發(fā)明通過針對吡嗪的化學修飾提供了具有新的結(jié)構(gòu)的吡嗪衍生物及其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明所提供的吡嗪衍生物具有多重作用機理(清除自由基和細胞保護作用)，同時增強了穩(wěn)定性，使藥物固有的母核結(jié)構(gòu)不會破壞，維持了其活性部位的完整性，提高了療效。這些化合物是值得開發(fā)的用于預(yù)防和治療由自由基過量產(chǎn)生導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，感染性疾病，代謝系統(tǒng)疾病，心、腦血管系統(tǒng)疾病以及退行性老化疾病的新藥。
[0066] 本發(fā)明所述新的吡嗪類衍生物及其藥學上可接受的鹽具有鮮明的特色和優(yōu)勢：
[0067] 根據(jù)藥物拼合原理，將四甲基吡嗪(川芎嗪)與其它中藥活性成分拼合，所得新的化合物生物活性遠遠高于中藥活性成分。
[0068] 通過硝酮基團的引入，增強了新的吡嗪類衍生物的清除自由基的能力，新吡嗪衍生物清除自由基的能力遠遠強于中藥活性成分。
[0069] 通過酯鍵旁邊取代基的引入增強了化合物的穩(wěn)定性，克服了某些酯類化合物在體內(nèi)不穩(wěn)定的缺陷。附圖說明
[0070] 圖1.描述化合物TMP、咖啡酸、阿魏酸及丹參素的化學結(jié)構(gòu)；
[0071] 圖2.描述化合物IND-003，IND-004，IND-006的合成；
[0072] 圖3.描述化合物IND-008的合成；
[0073] 圖4.描述化合物IND-010的合成；
[0074] 圖5.描述化合物IND-011，IND-012，IND-013，IND-014的合成；
[0075] 圖6.描述化合物IND-021，IND-022，IND-023的合成；
[0076] 圖7.顯示吡嗪衍生物對IAA誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的保護作用；
[0077] 圖8.顯示吡嗪衍生物對t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用；
[0078] 圖9.顯示吡嗪衍生物對DPPH·的清除能力；
[0079] 圖10.顯示吡嗪衍生物對羥基自由基(·OH)的清除能力；
[0080] 圖11.顯示吡嗪衍生物對超氧陰離子(O2·-)的清除能力；
[0081] 圖12.顯示吡嗪衍生物對過氧亞硝基(ONOO-)的清除能力；
[0082] 圖13.顯示IND-012對永久性腦缺血大鼠模型術(shù)前和術(shù)后體重影響；
[0083] 圖14.顯示IND-012對永久性腦缺血模型大鼠行為學改善作用；
[0084] 圖15.顯示IND-012對大鼠永久性腦缺血模型腦水腫程度的影響；
[0085] 圖16.顯示IND-023對IAA誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用；
[0086] 圖17.顯示IND-023對A/R誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用；
[0087] 圖18.顯示IND-023對t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用；
[0088] 圖19.顯示IND-023對SD大鼠心肌梗死模型中的保護作用。

具體實施方式

[0089] 下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，這些實施例僅僅是說明性的，因此不應(yīng)將其解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
[0090] 實施例1、化合物IND-003的合成(圖2)
[0091] 將 TMP(13.6g,100.0mmol) 溶 于 300mL 的 水 中， 分 批 加 入KMnO4(31.6g,200.0mmol)，加熱至50℃，反應(yīng)10h。反應(yīng)完全后，冷卻，乙酸乙酯萃取，棄去有機相，水相用10％的鹽酸調(diào)PH值至3，再用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。
+
得到黃色固體3,5,6-三甲基吡嗪-2-羧酸(化合物1)(9.6g,57.8％)。ESI-MS:[M+H]m/z167.0。
[0092] 將 TMP(15g,110.3mmol) 溶 于 250mL 的 四 氯 化 碳 中，分 別 加 入NBS(20g,112.4mmol)，催化量的過氧苯甲酰，加熱至80℃,反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:+
石油醚＝1:9)，得到淺白色固體TMP-Br(12.6g,53.2％)。ESI-MS:[M+H]m/z 217.0。
1
H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:4.67(s,2H),2.53(s,6H),2.41(s,3H)。
[0093] 將化 合 物1(0.4g,2.4mmol)溶 于10mL的N,N-二 甲 基甲 酰 胺中，分 別加 入TMP-Br(0.43g,2.0mmol)，碳 酸 鉀 (0.42g,3.0mmol)，室 溫 反 應(yīng)3h。 反 應(yīng) 完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸 乙酯:石油 醚＝1:2)，得 到淺白 色固體IND-003(0.41g,68.7 ％)
+ 1
。ESI-MS:[M+H] m/z 301.3。 H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:5.51(s,2H),2.75(
13
s,3H),2.61(s,3H),2.57(d,J ＝ 1.9Hz,6H),2.52(s,3H),2.50(s,3H)。 C-N
MR:165.66,154.68,151.36,151.23,149.38,149.06, 148.76,144.37,65.81,22.56,22.2
4,21.71,21.57, 21.45,20.63。Anal.(C16H20N4O2)C,H,C；found C 64.16％,H 7.019％,N
18.56％；requires:C 63.98％,H 6.71％,N 18.65％。
[0094] 實施例2、化合物IND-004的合成(圖2)
[0095] 將咖啡 酸(0.36g,2mmol)溶于10mL的N,N- 二甲基 甲酰胺 中，分別 加入K2CO3(0.31g,2.4mmol)，TMP-Br(0.43g,2mmol)，室溫攪拌2h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙+
酯:石油醚＝1:1)，得到白色固體化合物IND-004(0.36g,57％)。ESI-MS:[M+H]m/
1
z 315.23。 H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:9.62(s,1H),9.16(s,1H),7.50(d,J ＝
15.9Hz,1H),7.05(d,J ＝ 1.8Hz,1H),7.01(dd,J ＝ 8.1,1.8Hz,1H),6.76(d,J ＝
8.1Hz,1H),6.32(d,J ＝ 15.9Hz,1H),5.24(s,2H),2.48(s,3H),2.44(s,3H),2.42(s,3H)
13
。 C-NMR:166.72,151.27,149.06,149.00,148.90,146.20, 146.03,145.34,125.90,122.
00,116.18,115.39, 113.83,64.86,21.69,21.47,20.58。Anal.(C17H18N2O4)C,H,C；found C
64.92％,H 5.714％,N 8.83％；requires:C64.96％,H 5.77％,N 8.91％。
[0096] 實施例3、化合物IND-006的合成(圖2)
[0097] 將(E)-3-(3,4-二 乙酰 氧 基苯 基)丙 烯酸(0.53g,2mmol) 溶于10mL 的N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入K2CO3(0.31g,2.4mmol)，TMP-Br(0.43g,2mmol)，室溫攪拌2h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到白色固體化合物IND-006(0.60g,75+ 1
％ )。ESI-MS:[M+H] m/z 399.28。 H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:7.65(d,J ＝
15.9Hz,1H),7.40(dd,J ＝ 8.4,2.1Hz,1H),7.35(d,J ＝ 2.1Hz,1H),7.21(d,J ＝
8.4Hz,1H),6.43(d,J ＝ 15.9Hz,1H),5.53(s,2H),2.57(s,3H),2.52(s,6H),2.30(s,6H)
13
。 C-NMR:168.06,167.98,166.17,151.43,149.14,144.72, 143.60,143.57,142.43,13
3.12,126.44,123.96, 122.82,118.58,65.29,21.70,21.46,20.66,20.61,20.56.Anal.(C21H22N2O6)C,H,C；found C 63.46％,H 5.630％,N 6.88％；requires:C 63.31％,H 5.57％,N 7.03％。
[0098] 實施例4、化合物IND-008的合成(圖3)
[0099] 將TMP(25g,183.8mmol)溶于250mL的1,4-二氧六環(huán)中，加入二氧 化硒(40.8g,367.6mmol)，加熱至110℃，反應(yīng)6h。反應(yīng)完全后，過濾反應(yīng)液，向濾液中加入適量的硅膠，減壓蒸干溶劑，柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:15)，得到褐黃色固體+
3,6-二甲基吡嗪-2,5-二甲醛(化合物2)(11.4g,37.9％)。ESI-MS:[M+H]m/z 165.0。
1
H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.22(s,2H),2.92(s,6H)。
[0100] 將上述所得化合物2(5g,30.5mmol)溶于50mL的甲苯中，分別加入乙二醇(1.89g,30.5mmol)，催化量的對甲苯磺酸，加熱至80℃，反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干甲苯，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙+
酯:石油醚＝1:5)，得到黃色的固體化合物3(3.15g,49.6％)。ESI-MS:[M+H]m/z 209.0。
1
H-NMR:(300MHz,DMSO)δ:10.08(s,1H),5.96(s,1H),4.13(m,4H),2.72(s,3H),2.63(s,
3H)
[0101] 將化合物TMP-Br(1.86g,8.8mmol)溶于30mL的甲苯中，加入亞磷酸三乙酯(2.8g,17.6mmol)，加熱至110℃，反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，減壓蒸干甲苯，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑，得到無色的油狀物化合物+
4(1.72g,72.9％)。ESI-MS:[M+H]m/z 273.1。
[0102] 將化合物4(1.2g,4.4mmol)溶于20mL的二氯甲烷中，分別加入化合物3(0.92g,4.4mmol)，甲醇鈉(0.72g,13.4mmol)，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干有機溶劑。不經(jīng)純化直接進行下一步反應(yīng)。
+
ESI-MS:[M+H]m/z 327.10。
[0103] 將上述所得化合物溶于20mL的混合液(Con.HCl:H2O:THF＝2:6:7)中，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干部分有機溶劑，再加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，得到黃色固體化合物60.67g。
+
ESI-MS:[M+H]m/z 283.20。
[0104] 將 化 合 物6(0.5g,1.8mmol) 溶 于10mL 的 乙 醇 中，加 入 叔 丁 基 羥 氨(0.32g,3.55mmol)，室溫反應(yīng)4h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干有機溶劑，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙
+
酯:石 油 醚 ＝1:10)，得 到 黃 色 固 體IND-008(0.21g,33 ％)。ESI-MS:[M+H]m/
1
z 354.30。 H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:8.05(d,J ＝ 15.0Hz,1H),7.98(d,J ＝
1
15.0Hz,1H),7.86(s,1H),2.71(d,J ＝ 6.6Hz,6H),2.57(s,6H),2.54(s,3H),1.66(s,9H).
3
C-NMR:150.86,150.70,149.41,148.34,147.76,147.94, 144.94,144.63,142.37,130.13,
128.20,127.3,28.23, 25.29,21.92,21.85,21.06,20.99。Anal.(C20H27N5O)C,H,C；found C
67.83％,H 7.628％,N 19.32％；requires:C67.96％,H 7.70％,N 19.81％。
[0105] 實施例5、化合物IND-010的合成(圖4)
[0106] 將化合物2(5g,30.5mmol)溶于80mL的1,2-二氯乙烷中，分批加入三乙酰氧基硼氫化鈉(5.2g,24.4mmol)，室溫反應(yīng)約4h。反應(yīng)完全后，過濾反應(yīng)液，向濾液中加入適量的硅膠，減壓蒸干溶劑，柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得到白色固體化合物+ 17(2.1g,41.2％)。ESI-MS:[M+H]m/z 167.1。H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:10.08(s,1H),
5.43(m,1H),4.67(d,J＝5.7Hz,1H),2.73(s,3H),2.61(s,3H)。
[0107] 將化合物7(1.56g,9.41mmol)溶于20mL的二氯甲烷中，加入三溴化磷(0.85g,3.14mmol)，低溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干+
燥，減壓蒸干有機溶劑。不經(jīng)純化可直接進行下一步反應(yīng)。ESI-MS:[M+H]m/z230.9。
[0108] 將上述所得化合物8溶于20mL的甲苯中，分別加入乙二醇(0.58g,9.41mmol)，催化量的對甲苯磺酸，加熱至80℃，反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干甲苯，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:5)，+ 1得到淺黃色的固體化合物91.25g。ESI-MS:[M+H]m/z 272.02。H-NMR:(300MHz,CDCl3)
13
δ:5.96(s,1H),4.56(s,2H),4.20(m,4H),2.64(s,3H),2.63(s,3H)。 C-N
MR:150.07,149.40,149.04,148.07,103.15,65.66,31.15,20.88,20.56。
[0109] 將化合物9(1.25g,4.6mmol)溶于20mL的甲苯中，加入亞磷酸三乙酯(1.52g,9.2mmol)，加熱至110℃，反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，減壓蒸干甲苯，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(甲醇:二氯甲烷＝1:10)，得到+ 1
淺白色固體化合物10(1.1g,72.9％)。ESI-MS:[M+H]m/z 331.48。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:5.99(s,1H),4.27(m,4H),4.11(m,4H),3.76(d,J＝ 11.1Hz,2H),2.66(s,3H),2.46(s,3H),1.36(m,6H)。
[0110] 將化合物10(1.1g,3.3mmol)溶于20mL的二氯甲烷中，分別加入化合物3(0.69g,3.3mmol)，甲醇鈉(0.54g,9.9mmol)，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干有機溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石+
油醚＝1:3)，得到黃色固體化合物11(0.90g,64.3％)。ESI-MS:[M+H]m/z 384.18。
1
H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:7.95(s,2H),5.83(s,2H),4.18(m,4H),4.02(m,4H),2.63(s,
6H),2.59(s,6H).
[0111] 將化合物11(0.8g,1.8mmol)溶于20mL的混合液(Con.HCl:H2O:THF＝2:6:7)中，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干部分有機溶劑，再加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，得到黃色固體化合物+ 112(0.54g,87.1％)。ESI-MS:[M+H]m/z 296.13。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.20(s,2H),8.24(s,2H),2.91(s,6H),2.84(s,6H)。
[0112] 將化 合物 12(0.54g,1.8mmol)溶于 10mL的乙 醇中，加 入叔 丁基 羥 氨(0.32g,3.55mmol)，室溫反應(yīng)4h。反應(yīng)完全后，減壓蒸干有機溶劑，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，得到+ 1黃色固體IND-010(0.17g,22％)。ESI-MS:[M+H]m/z 439.18。H-NMR:(300MHz,CDCl3)
13
δ:8.06(s,2H),7.87(s,2H),2.73(s,6H),2.58(s,6H),1.67(s,18H)。 C-N
MR:151.97,148.15,146.61,142.77,129.41,128.15,71.53,28.24,21.92,21.08.
[0113] 實施例6、化合物IND-011的合成(圖5)
[0114] 將阿魏酸(化合物13)(0.5g,2.6mmol)溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入5-(溴甲基)-3,6-二甲基吡嗪-2-甲醛(化合物8)(0.53g,2.33mmol)，碳酸鉀(0.58g,4.2mmol)，室溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得到淺白色固體化合物1
15(0.39g,43.4％)。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.34(s,1H),7.64(d,J＝115.9Hz,1H),7.03(m,1H),6.91(m,1H),6.34(d,J＝ 15.9Hz,1H),5.35(s,2H),3.90(s,3H),2.61(s,3H),2.51(s,3H)。
[0115] 將化 合物 15(0.39g,1.12mmol)溶于 5mL的乙 醇中，加 入叔 丁基 羥 氨(0.20g,2.24mmol)，室溫反應(yīng)4h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到淺白色固+ 1
體 IND-011(0.20g,43.8 ％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 413.20。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:7.87(s,1H),7.66(d,J ＝ 15.9Hz,1H),7.13(m,2H),6.92(d,J ＝ 8.2Hz,1H),6.34(d,J＝ 15.9Hz,1H),5.37(s,2H),3.93(s,3H),2.62(s,3H),2.53(s,3H),1.66(s,9H).Anal.(C22H27N3O5)C,H,C；found C 63.73％,H 6.604 ％,N 9.99％；requires:C 63.91 ％,H
6.58％,N 10.16％。
[0116] 實施例7、化合物IND-012的合成(圖5)
[0117] 將咖啡酸(0.47g,2.62mmol)溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入5-(溴甲基)-3,6-二甲基吡嗪-2-甲醛(化合物8)(0.5g,2.19mmol)，碳酸氫鈉(0.28g,3.3mmol)，室溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到淺白色固體化合物16(0.62g,72+ 1％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 329.16。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.18(s,1H),7.54(d,J＝ 15.9Hz,1H),7.00(d,J ＝ 1.6Hz,1H),6.89(dd,J ＝ 8.2,1.7Hz,1H),6.81(d,J ＝
13
8.2Hz,1H),6.20(d,J ＝ 15.9Hz,1H),5.39(s,2H),2.83(s,3H),2.70(s,3H)。 C-NMR:194.48,166.62,152.25,150.98,150.23,149.08, 146.53,146.04,143.06,125.85,122.
09,116.17, 115.42,113.56,64.18,28.07,21.65,20.69。Anal.(C17H16N2O5)C,H,C；found C
61.87％,H4.98％,N 8.33％；requires:C 62.19％,H 4.91％,N 8.53％。
[0118] 將化 合物 16(0.45g,1.37mmol)溶于 5mL的乙 醇中，加 入叔 丁基 羥 氨(0.24g,2.74mmol)，室溫反應(yīng)4h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到淺白色固+ 1
體 IND-012(0.45g,44.8 ％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 400.20。H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:8.05(s,1H),7.53(d,J ＝ 15.9Hz,1H),7.07(d,J ＝ 2.1Hz,1H),7.04(dd,J ＝
8.1,1.8Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.34(d,J＝15.9Hz,1H),5.32(s,2H),2.53(s,3H
13
),2.35(s,3H),1.53(s,9H)。 C-NMR:166.69,150.01,149.09,148.80,147.65,146.36, 146.06,144.18,128.30,125.87,122.08,116.18, 115.39,113.69,71.10,64.65,28.07,21.20,.
20.52。Anal.(C21H25N3O5H2O)C,H,C；found C 60.55％,H 6.521％,N 9.59％；requires:C
60.42％,H6.52％,N 10.07％。
[0119] 實施例8、化合物IND-013的合成(圖5)
[0120] 將阿魏酸(2g,10.3mmol)溶于30mL的乙酸酐中，加入催化量的二甲氨基吡啶，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，加入20mL水，室溫攪拌1h，再用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。不經(jīng)純化可直接進行下一步。
[0121] 將(E)-3-(4-乙酰氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酸(化合17)(0.37g,1.58mmol)溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入化合物8(0.3g,1.31mmol)，碳酸鉀(0.28g,2.0mmol)，室溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃
取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)
+
，得 到 淺 白 色 固 體 化 合 物 19(0.26g,52.8 ％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 385.00
1
。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.10(s,1H),7.72(d,J ＝ 16.0Hz,1H),7.56(d,J ＝
1.7Hz,1H),7.33(dd,J ＝ 8.2,1.7Hz,1H),7.14(d,J ＝ 8.1Hz,1H),6.84(d,J ＝
13
16.0Hz,1H),5.46(s,2H),3.82(s,3H),2.71(s,3H),2.65(s,3H),2.27(s,3H)。 C-NMR:194.46,168.84,166.31,152.02,151.65,151.00, 150.24,145.26,143.15,141.62,133.
39,123.71, 122.33,118.11,112.48,64.40,56.49,21.63,20.88,20.67。Anal.(C20H20N2O6)C,H,C；found C 62.88％,H 5.273％,N 7.27％；requires:C 62.49％,H 5.24％,N 7.29％。
[0122] 將化 合物 19(0.26g,0.68mmol)溶于 5mL的乙 醇中，加 入叔 丁基 羥 氨(0.12g,1.36mmol)，室溫反應(yīng)4h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到淺白色+ 1
固 體 IND-013(0.10g,33 ％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 455.21。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:7.86(s,1H),7.67(s,J＝15.9Hz,1H),7.12(m,2H),7.06(d,J＝8.0Hz,1H),6.44(d,J＝
16.0Hz,1H),5.37(s,2H),3.87(s,3H),2.62(s,3H),2.53(s,3H),2.33(s,3H),1.65(s,9H)。
13
C-NMR:168.74,166.27,151.39,150.30,148.90,147.23, 144.98,143.64,141.56,133.19,
127.81,123.29, 121.30,117.46,111.30,71.55,65.06,55.93,28.19,21.54,20.67,20.60。
Anal.(C24H29N3O6)C,H,C；found C 62.94％,H 6.314％,N 9.22％；requires:C 63.28％,H
6.42％,N 9.23％。
[0123] 實施例9、化合物IND-014的合成(圖5)
[0124] 將咖啡酸(2g,11.1mmol)溶于30mL的乙酸酐中，加入催化量的二甲氨基吡啶，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，加入20mL水，室溫攪拌1h，再用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。不經(jīng)純化可直接進行下一步。
[0125] 將(E)-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(化合物18)(1.1g,4.15mmol)溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入化合物8(0.95g,4.15mmol)，碳酸鉀(1.14g,8.30mmol)，室溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:2)，得到淺白色固體化合物20(0.8g,47％)。+ 1
ESI-MS:[M+H]m/z 413.15。 H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:10.20(s,1H),8.02(s,1H),7.7
0(d,J ＝ 16.0Hz,1H),7.42(dd,J ＝ 8.4,2Hz,1H),7.38(d,J ＝ 2.0Hz,1H),7.24(d,J ＝
8.4Hz,1H),6.48(d,J＝ 16.0Hz,1H),5.42(s,2H),2.97(s,3H),2.89(s,3H),2.85(s,3H),2.70(s,3H),2.31(d,J＝1.0Hz,6H).
[0126] 將 化 合 物20(0.45g,1.09mmol) 溶 于5mL 的 乙 醇 中，加 入 叔 丁 基 羥氨(0.98g,1.09mmol)，室溫反應(yīng)4h。 反應(yīng)完全后，加入 適量的水，乙酸乙 酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚
+
＝ 1:1)，得 到 淺 白 色 固 體 IND-014(0.45g,85 ％ )。ESI-MS:[M+H]m/z 484.08
1
。 H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:7.85(s,1H),7.64(d,J ＝ 15.9Hz,1H),7.39(dd,J
＝ 8.4,1.8Hz,1H),7.35(d,J ＝ 1.5Hz,1H),6.21(d,J ＝ 8.4Hz,1H),6.42(d,J ＝
13
15.9Hz,1H),5.35(s,2H),2.53(s,3H),2.50(s,3H),2.29(s,6H),1.63(s,9H)。 C-NMR:168.05,167.95,166.03,150.75,148.86,147.17, 143.75,143.65,143.58,142.44,133.
06,127.88, 126.51,123.97,122.84,118.39,71.54,65.08,28.16,21.50,20.66,20.60,20.
55。Anal.(C25H29N3O7)C,H,C；found C 62.37％,H 6.086％,N 8.71％；requires:C 62.10％,H 6.05％,N 8.69％。
[0127] 實施例10、化合物IND-021的合成(圖6)
[0128] 將3,6-二甲基吡嗪-2,5-二甲醛(化合物2)(5g,30.5mmol)溶于50mL的1,2-二氯乙烷中，分批加入硼氫化鈉(2.3g,60.1mmol)，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，過濾反應(yīng)液，向濾液中加入適量的硅膠，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得到+ 1淺黃固體化合物21(3.1g,60.8％)。ESI-MS:[M+H]m/z 169.1。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:4.73(d,J＝4.2Hz,4H),4.25(m,2H),2.47(s,6H)。
[0129] 將化合物21(1.86g,5.6mmol)溶于10mL的二氯甲烷中，加入三溴化磷(1.5g,5.6mmol)，低溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干有機溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:15)，得到淺黃+ 1
固 體 化 合 物 221.8g(54.5 ％)。ESI-MS:[M+H]m/z 394.80。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:4.55(s,4H),2.42(s,6H)。
[0130] 將咖 啡 酸(0.12g,0.68mmol)溶 于5mL的N,N-二 甲 基甲 酰 胺中，加 入NaHCO3(54mg,0.68mmol)，室溫攪拌15min，再加入化合物22(0.10g,0.34mmol)，室溫攪拌48h。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分+
離(二氯甲烷/甲醇＝15:1)，得到白色固體化合物IND-021(58mg,34％)。ESI-MS:[M+H]m/
1
z 493.03。 H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:9.60(s,2H),9.12(s,2H),7.53(d,J ＝
15.9Hz,2H),7.07(d,J ＝ 1.8Hz,2H),7.01(dd,J ＝ 8.1,2.1Hz,2H),6.76(d,J
13
＝ 8.1Hz,2H),6.34(d,J ＝ 15.9Hz,2H),5.31(s,4H),2.52(s,6H)。 C-N
MR:166.69,149.33,149.03,147.95,146.34,146.03, 125.90,122.05,116.18,115.43,11
3.73,64.60,20.71。Anal.(C16H20N4O2)C,H,C；found C 64.16％,H 7.019％,N 18.56％；
requires:C 63.98％,H6.71％,N 18.65％。
[0131] 實施例11、化合物IND-022的合成(圖6)
[0132] 將(E)-3-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(0.18g,0.64mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入NaHCO3(63mg,0.75mmol)，室溫攪拌15min，再加入化合物
22(0.10g,0.34mmol)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)完全后，加入適量的水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑。柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到白色固體化合物+ 1
IND-026(60mg,32％)。ESI-MS:[M+H]m/z 660.98。H-NMR:(300MHz,CDCl3)δ:7.69(d,J＝ 15.9Hz,2H),7.42(dd,J ＝ 8.4,1.8Hz,2H),7.37(d,J ＝ 1.8Hz,2H),7.24(d,J ＝
13
8.4Hz,2H),6.45(d,J＝15.9Hz,2H),5.38(s,4H),2.63(s,6H),2.3(d,J＝1.2Hz,12H)。C-NMR:168.14,168.05,166.13,149.67,147.48,143.81, 143.65,142.44,133.08,126.55,124.
.02,122.88, 118.38,65.01,20.72,20.72。Anal.(C34H32N2O120.5H2O)C,H,C；found C60.97％,H 5.076％,N 4.01％；requires:C 60.98％,H 4.97％,N 4.18％。
[0133] 實施例12、化合物IND-023的合成(圖6)
[0134] 取丹參素鈉(9g,41.1mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺40mL攪拌溶解，然后加入化合物22(4g,13.7mmol)，室溫下反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后加入100mL水洗，然后用乙酸乙酯萃取3次(200mL x 3)，合并有機層，用飽和氯化鈉洗兩次(150mL x 2)，減壓濃縮，濃縮液硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱分離純化(CH2Cl2:CH3OH＝15:1)，得到白色固體化合1
物 IND-023(2.0g,28 ％ )。H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ:8.69(s,4H),6.64-6.53(m,4H),6.42(dd,J ＝ 8.0,2.0Hz,2H),5.56(d,J ＝ 6.1Hz,2H),5.20(s,4H),4.20(dt,J ＝
7.6,5.4Hz,2H),2.82(dd,J＝13.8,5.1Hz,2H),2.67(dd,J＝13.8,7.8Hz,2H),2.43(s,3H)
13
。 C-NMR:173.76,149.43,147.58,145.22,144.16,128.67, 120.45,117.22,115.66,72.13,64.75,20.49。
[0135] 實施例13、吡嗪衍生物對IAA誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的保護作用(圖7)
[0136] PC12細胞接種在96孔板上，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，24h后加入100μLIAA(30μM)誘導(dǎo)2h。2h后吸走培養(yǎng)基，加入的各化合物培養(yǎng)24h。細胞培養(yǎng)24h后，每孔加入11.1μL MTT，4h后用酶標儀于570nm處測定吸光度值。結(jié)果如圖所示：吡嗪嗪衍生物對IAA誘導(dǎo)的PC12細胞損傷有顯著的保護作用。
[0137] 實施例14、吡嗪衍生物對t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用(圖8)
[0138] 將H9c2細胞以1×104個/孔密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，而后以無血清DMEM稀釋t-BHP，并置換培養(yǎng)板中原培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h，而后加入11.1μL MTT(5mg/mL)再培養(yǎng)4h。4h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，在搖床上震蕩溶解均勻后于BioTek酶標儀上570nm波長處測量吸光度值，計算細胞存活度。以相對于空白組50％左右細胞死亡率的t-BHP濃度作為后續(xù)實驗的細胞造模濃度。
[0139] 實施例15、吡嗪衍生物對DPPH·的清除能力(圖9)
[0140] 在96孔板中分別加入100μL各濃度的樣品溶液(樣品組)或者100μL甲醇(空白對照組)，然后迅速加入100μL 100μM的DPPH甲醇溶液(終濃度為50μM)，每個樣品濃度3個復(fù)孔，將溶液振蕩均勻后，在室溫下避光放置1h，然后在酶標儀上于517nm波長下測定其吸光度值，通過下列公式計算樣品對DPPH的清除率。
[0141] Clearance(％)＝(Actrl-Asample)/Asample×100
[0142] 實施例16、吡嗪衍生物對羥基自由基(·OH)的清除能力(圖10)
[0143] 在48孔板中依次加入50μL濃度為1.0mM的p-NDA，300μL H2O(Ctrl組)或者300μL樣品液(樣品組)。然后使用Biotek酶標儀上的兩個分液器分別加入125μL濃度為1.0mM的H2O2以及125μL濃度為2.0mM的FeSO4溶液，總體積為600μL，振板后在孔模式下于440nm波長下測量反應(yīng)體系在100s內(nèi)吸光度的變化值，通過下列公式計算樣品對羥自由基的清除率。
[0144] Clearance(％)＝[1-(A0-At)/A0]×100
[0145] 實施例17、吡嗪衍生物對超氧陰離子(O2·-)的清除能力(圖11)
[0146] 在48孔板中依次加入250μL濃度為50mM的Tris-HCl，300μL H2O(Ctrl組)或者300μL樣品液(樣品組)。然后使用Biotek酶標儀上的分液器加入50μL濃度為2.0mM鄰苯三酚，總體積為600μL，振板后在孔模式下于320nm波長下，每隔30s測定一次吸光值，連續(xù)測量300s。通過吸光度值的變化，通過下列公式計算樣品對超氧陰離子的清除率。
[0147] Clearance(％)＝[1-(dA/dt-dAt/dt)/dA/dt]×100
[0148] 實施例18、吡嗪衍生物對過氧亞硝基(ONOO-)的清除能力(圖12)
[0149] 首先在光度計量管依次加入150μL PBS，250μL PBS(空白對照)或者各濃度的樣品溶液，最后加入50μL濃度為1.0mM的Luminol溶液及50μL的3mg/mL SIN-1溶液激發(fā)反應(yīng)，總體積為500μL。37℃條件下，每100s記錄發(fā)光值，連續(xù)記錄2000s。
[0150] Clearance(％)＝(Actrl-Asample)/Asample×100
[0151] 實施例19、吡嗪衍生物IND-012在SD大鼠永久性腦缺血模型中的保護作用(圖13-圖15)
[0152] SD大鼠2.5％異氟烷吸入麻醉后固定。在頸部正中切口，首先暴露右側(cè)頸總動脈和頸外動脈，分別分離結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，將硅膠包埋的線栓小心的從頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，直至大腦中動脈的起始處，插入深度為17-18mm，線栓插入后用血流儀測定腦局部血流量變化，以栓塞后血流量較基礎(chǔ)值下降60％以上作為模型成功的標準。整個實驗過程中，大鼠放于37℃恒溫手術(shù)臺上保溫，大鼠蘇醒后放入原飼養(yǎng)籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。大腦中動脈栓塞后3h和6h各腹腔注射一次IND-012，給藥劑量30mg/kg，溶劑15％乙醇+45％丙二醇+40％生理鹽水。造模24h后，采用戊巴比妥鈉進行麻醉，然后斷頭取腦切片(每個腦組織切7片，每片厚度2mm)，TTC染色，分別計算腦梗死面積與腦水腫面積。手術(shù)前及手術(shù)后24h稱量動物體重，記錄動物體重變化。
[0153] 實施例21、化合物IND-023對IAA誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用(圖16)
[0154] H9c2細胞接種在96孔板上，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，24h后加入100μL IND-023各相應(yīng)濃度，藥物預(yù)保護1h，后IAA(50μM)誘導(dǎo)4h后，加入MTT，4h后用酶標儀于490nm處測定吸光度值。結(jié)果如圖所示：IND-023對IAA誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷有顯著的保護作用。
[0155] 實施例22、化合物IND-023對A/R誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用(圖17)
[0156] H9c2細胞接種在96孔板上，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，24hh后開始缺氧，用KRB緩沖液作為缺氧液，給藥組用KRB稀釋IND-023至相應(yīng)濃度，模型組只加KRB溶液，每孔加入50μL，放入缺氧盒，培養(yǎng)12h，空白組用無血清高糖DMEM換掉原來的培養(yǎng)基，放入正常培養(yǎng)箱。缺氧結(jié)束后，模型組換作不含血清的高糖DMEM，給藥物組用高糖DMEM稀釋藥物至相應(yīng)濃度，每孔加入100μL，置于正常培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4h。復(fù)氧結(jié)束后，去掉原來的培養(yǎng)基，加入MTT，4h后在490nm下測OD值，計算細胞存活率。結(jié)果如圖所示：IND-023對A/R誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷有顯著的保護作用。
[0157] 實施例23、化合物IND-023對t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的保護作用(圖18)[0158] 將H9c2細胞以1×104個/孔密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，IND-023預(yù)保護1h，而后以無血清高糖DMEM稀釋t-BHP 150μM誘導(dǎo)12h，而后加入MTT(5mg/mL)再培養(yǎng)4h。4h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，在搖床上震蕩溶解均勻后于BioTek酶標儀上490nm波長處測量吸光度值，計算細胞存活度。結(jié)果如圖所示：IND-023對t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷有顯著的保護作用。
[0159] 實施例20、化合物IND-023在SD大鼠心肌梗死模型中的保護作用(圖19)
[0160] 雄性SD大鼠采用2.5％異氟烷吸入麻醉后固定。經(jīng)氣管切開連接大鼠呼吸機，然后在胸骨左側(cè)0.5cm處沿第2肋間和第4肋間切口，鈍性分離分離皮下組織和肌肉，在第4肋間用血管鉗撐開胸腔，暴露心臟，小心撕開心包膜暴露心臟，經(jīng)左心耳下緣2mm-3mm處用8號無創(chuàng)縫合針結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以結(jié)扎后II導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段抬高作為模型造模成功的標志。整個實驗過程中，大鼠放于37℃恒溫手術(shù)臺上保溫，大鼠蘇醒后放入原飼養(yǎng)籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。大鼠造模成功后15min經(jīng)尾靜脈單次注射給予20mg/kg的IND-023，溶劑5％乙醇+5％聚乙二醇+90％生理鹽水。造模24h后，采用異氟烷吸入麻醉，經(jīng)尾靜脈注射給予
1mL 2％的TTC染液，3min后開胸取出心臟，去除右心房、右心室和左心耳后放于-20℃冷凍
10min，分別稱量整個左心室的重量和左心室心肌梗死區(qū)心肌組織的重量，以左心室心肌梗死區(qū)心肌組織的重量/左心室的重量*100作為心肌梗死指標。
[0161] 本文對一些具體的實施例進行了詳細的描述，然而這只是作為對發(fā)明目的實例說明，而不限制下述權(quán)利要求書的范圍。應(yīng)當理解，對本文所述具體方案的不同取代、改變和修飾都不偏離本發(fā)明權(quán)利要求所定義的內(nèi)涵和外延，從而應(yīng)當屬于本申請所要求保護的發(fā)明范圍。
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